Controle da Expressão Gênica - Graduação · como sequências que não são traduzidas...
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Aula de Bioquímica II
Tema:
Controle da Expressão Gênica
Prof. Dr. Júlio César BorgesDepto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: [email protected]
Controle da Expressão Gênica
Todas as células de um contêm as mesmas informações depositadas no genoma
O Gene é expresso quando ele é transcrito em mRNA ���� Principal ponto de controle
Circuitos regulatórios guiam o desenvolvimento de eucariotos multicelulares e envolvem diversos tipos de mecanismos regulatórios
A expressão de uma proteína pode ser:
Constitutiva: Constantemente expressa
Induzida: Expressa quando necessária
Controle da Expressão Gênica
Processos que afetam a concentração do produto gênico: pontos potenciais de controle
Gene: É um segmento de DNA que leva à produção de um transcrito de RNA e inclui regiões que
antecedem e que seguem a região transcrita, bem como sequências que não são traduzidas (íntrons)
que se intercalam aos segmentos codificadores individuais (éxons), que são traduzidos.
���� Inclui elementos reguladores, o promotor e oterminador da transcrição
� A iniciação da transcrição (1) é o principal mecanismo, pelo menos o mais bem documentado ���� regulação sincronizada
���� O processamento pós-transcricional (2) e a estabilidade do mRNA (3) são muito importantes, principalmente em eucariotos
Controle da Expressão Gênica
Esquema geral simplificado do promotor de genes de eucariotos
Existem elementos regulatórios a milhares de bases a upstream do promotor
Em procariotos
A identidade da sequência consenso do
promotor dita a “força” da transcrição pela
frequência do recrutamento da RNApol
���� Existe modulação adicional por proteínas
Região promotora do gene da PEP-carboxiquinase
���� Alta complexidade da regulação deste gene.
���� Ajuste fino proporcional a importância do processo
Controle da Expressão Gênica
As informações para o controle da expressão gênica estão no DNA
Regulação negativa
Dependente de Repressores
- Inibem a expressão gênica por bloquear o acesso da RNApol ao
promotor
- Dependem da presença do Efetor (sinal molecular)
Tipo característico em procariotos
Elementos operador próximos ao promotor
Controle da Expressão Gênica
As informações para o controle da expressão gênica estão no DNA
Regulação positiva
Dependente de Ativadores
� Induz a expressão Gênica
- Dependem da presença do Efetor (sinal molecular)
Tipo característico em eucariotos
A Expressão Gênica é regulada por proteínas
���� Proteínas específicas reconhecem sequências específicas de DNA
� Possuem domínios de interação com DNA e de interação com outras proteínas
- Normalmente dímeros ���� reconhecer sequências palindrômicas ���� simétricas
� o papel dos Sulcos maior (mais específico) e menor (menos específico) no DNA
Alta especificidadeKA das proteínas regulatórias pelas
sequências-alvo é 4-6 ordens de grandeza maior do que para outras sequências
- Sequências específicas de DNA ���� superfície específica para formação de ligações de H
Domínios de Ligação ao DNA
-Formam estruturas autônomas separadas do restante da proteína
- Estruturas capazes de interagir estreita e
especificamente com o DNA-alvo
- Relativamente pequenos (60-90 resíduos)
- projetam-se na superfície das proteínas
- Conectadas ao restante da proteína por
regiões flexíveis
���� O Domínio Hélice-volta-hélice está presente
em muitas proteínas ligadores de DNA
- Apresentam-se como “dímeros” de forma a
reconhecer a sequência palindrômica no DNA
- Forma um eixo de simetria com DNA
���� Reconhecimento por uma fita beta
Hélice-alça-hélice
Homeodomínios
Zinc Fingers
Leu
Resíduos básicosInteração com o Pi
Zíper de Leucina
Domínios de Ligação ao DNA
Organização dimérica (exceto o zinc finger)
Controle da expressão em Procariotos
Procariotos produzem proteínas relacionadas a processos interdependentes de forma
agrupada
- Mecanismo geral simples para coordenar a regulação de genes inter-relacionados
� Sistema óperon: unidade básica de transcrição
- Operador ���� sequência de DNA próximo ao promotor
� mRNA policistrônico:
� 1 promotor ���� 1 mRNA ���� várias proteínas traduzidas
- Cada sequência codificadora tem seu próprio motivo Shine-Dalguarno
- Existem exemplos deste sistema em eucariotos ���� exceção
Controle da expressão em Procariotos
Procariotos induzem a expressão de enzimas conforme a disponibilidade de fonte de
energia
β-galactosidade é uma importante ferramenta biotecnológica ���� atua sobre galactosídios alternativos
Controle da expressão em procariotos
A indução da expressão da β-galactosidase ���� induz a expressão de 2 outras enzimas
- Galactosídeo permease: transporte de lactose pela membrana
- Tiogalactosídeo transacetilase: desintoxicação de outras moléculas transportadas pela
permease
���� Indução conjunta de enzimas para adaptação a um novo ambiente:
���� Mecanismo comum de indução.
���� Modelo do óperon: Explica a regulação paralela de diferentes proteínas
-Formado por:
- um gene regulador: codifica uma proteína repressora
- uma sequência operadora: alvo da proteína repressora
- genes estruturais: produtos da expressão do óperon
P: sequência promotor
lacI: gene proteína repressora
O: operadores: sítio de ligação da proteína repressora
lacZ: gene da β-galactosidade
lacY: gene da permease
lacA: gene da tio-transacetilase
lacZ, lacY e lacA formam um mRNA policistrônico ou
poligênico
operon Lac
Conjunto de genes envolvidos na regulação e expressão das proteínas envolvidas no
metabolismo de Lactose.
Estrutura tetramérica
Cada monômero possui um domínio hélice-volta-hélice que reconhece a sequência operadora
- Ocasiona a formação do loop de DNA
Proteína repressora Lac
� Permanece fortemente ligado à sequência operadora na ausência de Lactose
- KA 1x106 vezes maior pela sequência operadora do que por outra sequência
� Impede a transcrição por impedir que a RNApol desenrole o DNA localmente
Proteína repressora Lac
� O ligante da Proteína repressora Lac é um produto secundário da β-galactosidase
� 1,6-alolactose: INDUTOR
- A lactose não interage com a Proteína repressora Lac
Indutores
α-D-galactopiranosil-(1����4)-D-glicopiranose
α-D-galactopiranosil-(1����6)-D-glicopiranose
Óperon Lac
1) Na ausência de Lactose, não existe 1,6-alolactose e portanto a Proteína repressora Lac
permanece ligada à sequência operadora impedindo a transcrição do DNA
2) Na presença de Lactose, parte desta é convertida a 1,6-alolactose que se liga à Proteína
Repressora Lac e reduz a afinidade desta pela sequência operadora. Com a saída da
Proteína repressora Lac da sequência operadora os genes estruturais podem ser transcritos
na forma de um mRNA policistrônico ou poligênico
���� Mesmo na ausência de lactose, existe transcrição basal dos genes estruturais
lacImRNA
Repressor lacI ligado ao operador bloqueia a
transcrição dos genes lacZ, lacY e lacA
lacImRNA
lac mRNA (policistrônico)
β-galactosidase
Permease
Transacetilase
[Glicose] alta ���� [AMPc] baixa e lactose ausente
Controle da Expressão Gênica em procariotosComutação de reguladores
Ativação da expressão gênica por AMPcAMPc (coativador) ���� indução conjunta de enzimas catabólicas
CRP liga-se ao operador do operon Lac a -51 do Promotor
e “recruta” a RNApol� Atuam em vários óperons
AMPc liga-se à cAMPreceptor Protein – CRP
[Glicose] baixa ���� [AMPc] alto e lactose ausente
[Glicose] alta ���� [AMPc] baixo e lactose presente
���� Ativação fraca
[Glicose] baixa ���� [AMPc] alto e lactose presente
���� Ativação forte
Efeito coordenado entre repressor/ativador
���� Regulons: rede de óperons com reguladores
comuns
Controle da Expressão Gênica em procariotos
Em procariotos, muitos óperons funcionam de forma análoga ao óperon Lac
Ex: óperon Pur
Controla o metabolismo de Purinas
A proteína Repressor Pur liga-se à sequência operadora na presença de um ligante:
���� co-repressor
O genoma de E. coli contêm mais de 20
sequências operadora para a proteína
repressora Pur
Regulon
���� Permite a regulação paralela de todos
os passos metabólicos da síntese de
purinas
Controle da Expressão Gênica em procariotosA estratégia dos atenuadores
- Comum nos óperons para síntese aminoácidos
O óperon trp controla a síntese de Triptofano
Altos níveis de Trp reprime o óperon- Ligação do Trp a proteína repressora induz
ligação ao operador
Atenuação do óperon trp- Ocorre na síntese do mRNA
- Formação de grampos de mRNA auto complementares
Se a [Trp] ↑ síntese rápido do peptídeo líder���� Formação alça 3-4 ���� fim da transcrição
Se a [Trp] ↓ síntese lenta do peptídeo líder���� Formação alça 2-3 ���� transcrição continua
Controle da Expressão Gênica em procariotosOutros mecanismos, inclui-se a autoindução em biofilmes: quorum sensing
Feedback de tradução de óperons de proteínas ribossomais
- Visa regular a concentração das proteínas ribossomais e rRNA
���� A proteína ribossomal inibe a tradução de seu próprio mRNA� A medida que o respectivo rRNA é sintetizado, a proteína ribossomal dissocia-se de seu
mRNA e liga ao rRNA- Maior afinidade pelo rRNA
Controle da traduçãoResposta estringente
- Depende da disponibilidade de aminoácidos
- Ausência de aminoácidos- Recrutamento do fator estringente
- Síntese de ppGpp- Inibição da RNApol
Controle da Expressão Gênica em procariotosPapel de pequenos RNAs ���� sRNA
Alguns mRNAs bacterianos são regulados por sRNA em cis ou em trans
trans: outro sRNAregula a tradução de
um dado mRNAFunção dependente da proteína Hfq ���� facilita
formação de duplex RNA-RNA
cis: parte do próprio mRNA regula a própria
tradução- Riboswitches: Aptâmeros
naturais de RNA dependentes de ligantes- Ligantes identificados:
TPP, cobalamina, FMN, Lys, Gly, purinas e adoMet (S-
adenosilmetionina).
Indução
RepressãoMecanismo de splicing em eucariotos
Controle da Expressão Gênica em procariotosControle por recombinação
Recombinação regula a expressão de diferentes proteínas do flagelo (FljB e FliC) a cada 1000 gerações
Mecanismo de escape do sistema imune
���� Sistema óperon- Recombinase Hin inverte posição do promotor (e gene para a hin) para a FljB
- Sem expressão da proteína repressora FljA ���� expressão da FliC
Controle da Expressão Gênica em Eucariotos
� O tamanho do genoma
� Diversidade Celular
- Impõem mais complexidade para atingir especificidade.
���� Transcrição e tradução NÃO são processos acoplados.
� Os genes de uma mesma via não estão organizados em óperons.
- Existem somente algumas exceções
���� Transcrição basal não observada ���� transcrição está inativa para a maioria dos genes
- Regulação positiva ���� requer Ativadores sempre
- Regulação negativa ���� necessitaria de grande número de repressores presentes na célula
em quantidade ���� há poucos exemplos em eucariotos
Papeis dos ativadores ou fatores de transcrição
1) Montagem do complexo de transcrição basal com os TFII
2) Outras proteínas regulatórias específicas se unem a este complexo basal
- Ligam-se à sequências “Enhancer” - Potenciadores
� São proteínas modulares e multiméricas
– Domínio de Ligação ao DNA e Domínio Ativador
Remodelamento da Cromatina
O DNA de eucariotos se apresenta ligado à proteínas formando os Nucleossomos
- As regiões do DNA que estão sendo transcritas estão menos compactadas
- Heterocromatina ���� fortemente condensada: não disponível para transcrição
- Eucromatina ���� Parcialmente disponível para a transcrição
���� A regulação negativa em eucariotos seria redundante com os nucleossomos
Remodelamento da Cromatina
A acetilação das histonas contribuem para a ativação da transcrição
- Histonas acetilases (HAT) acetilam a Lys da cauda N-Terminal das Histonas
1) Reduz a afinidade da Histona pelo DNA ���� afrouxa o nucleossoma
2) Recrutamento de outros componentes da maquinaria de transcrição
3) Iniciação da remodelagem da cromatina
Reversão executada por
Histonas desacetilases
���� repressão da transcrição por compactação da
cromatina
���� Regiões do DNA que estão mais ou menos compactadas são
tecidos específicas
���� Existem proteínas remodeladoras do DNA tecido específicas
que regulam os conjuntos de genes que deverão ser
transcritos e os que devem ser “silenciados”.
���� O DNA é metilado por Metilases específicas no C5 da C
- 70% das 5’-CG-3’ estão metiladas
- A metila projeta-se para o sulco maior bloqueando interações
- As 5’-CG-3’ próximas ao 5’ dos genes ativos são
hipometiladas
Remodelamento da Cromatina
Em levedura, os genes necessários para o metabolismo de galactose são ativados pela
proteína GAL4.
- Reconhece a sequência: 5’-CGG(N)11CCG-3’ ���� 4.000 pontos no DNA de levedura
- Somente 10 deles são identificados pela GAL4 ���� 99,75% estão bloqueados
Controle da Expressão Gênica em Eucariotos
As informações para o controle da expressão gênica estão no DNA
Envolve interação, direta ou indireta, de ativadores/repressores e a RNApol em eucariotos
� Requerimento de:- elementos potenciadores (enhancers) a longa
distância do promotor
- Regulador de arquitetura para dobrar o DNA (alças ou looping)
- Coativador aumenta a taxa de recrutamento/ativação da RNApol
���� Repressor pode atuar bloqueando a ação do coativador
���� Controle combinatório- Depende do subconjunto de proteínas produzidas
naquele tipo celular- Heteroligômeros e heterocomplexos
Controle da Expressão Gênica em Eucariotos
Controle combinatório
���� Dependendo do conjunto de proteínas ���� diferentes efeitos
���� Número reduzido de proteínas reguladoras ���� maior especificidade� reconhecem sequências assimétricas
� Ex: 2 famílias de reguladores com 3 membros cadaFormam Homodímeros e heterodímeros ���� 36 possíveis combinações
Acentuadores ou potenciadores
- sequências específicas “acima” do promotor que funcionam como pontos de ligação
específicos para proteínas ativadoras ou repressoras.
- Podem estar a milhares de pares de base à 5’ do promotor
- Dependem da presença das proteínas ligadoras específicas
- Podem ajudar a expor o DNA para RNApol II
- Podem ajudar a montagem do complexo basal de
transcrição
Acentuador da creatina quinase regulando a expressão
da β-galactosidade
Regulação gênica em eucariotos
Requer ação combinada de diversos agentes
���� UAS: upstream activator sequences: Sequências ativadoras a montante
Pode ser a jusante também
���� Reguladores da arquitetura: proteínas HMG
���� Remodelamento da cromatina
���� Coativadores: Ativadores ou repressores ���� interação com o Mediador
���� Fatores basais de transcrição
Regulação gênica positiva em eucariotos
Coreografia da ativação da transcrição
Eventos em cascata ���� variável para diferentes genes
���� Processo dependente de moléculas efetoras e reversível
~ 50 membros no genoma humano
Atuam como dímeros ���� reconhecem elementos simétricos
Agonistas
Antagonistas
Expressão gênica regulada por hormônios
Receptores Nucleares
Os receptores para hormônios estereoidais atuam induzindo a transcrição
- Proteínas modulares ���� domínio de ligação ao DNA e domínio de ligação ao hormônio
Ex: Estrogênio e testosterona
Expressão gênica regulada por hormônios
Receptores Nucleares
Os Receptores de hormônios nucleares regulam a transcrição por recrutar Co-ativatores ou
mediadores para o complexo de transcrição
Expressão gênica regulada por hormônios
���� Ação hormônios esteroides, tireoidianos e retinoide
- Livre transito pela membrana plasmática
���� Presença de sequências HRE: elementos de resposta hormonal específicos
Regulação por repressão da Tradução
Transcrição e tradução são processos desacoplados ���� edição do mRNA e transporte para o citoplasma
Envolve o armazenamento de mRNAs inativos no citoplasma
1) Fatores de iniciação da tradução são sujeitos a fosforilação ���� inibe
2) Proteínas repressoras ligam-se à região 3’ não traduzida (3’UTR - untranslated region)
- Bloqueia a iniciação da tradução
3) Sítio de ação da regulação gênica regulada por RNA
Silenciamento gênico
O papel do microRNA – miRNA ���� 60% dos genes humanos
Produção transitória ���� chamados como pequenos RNAs temporais (stRNA)
Eucariotos superiores (nematódeos, mosca, plantas e mamíferos)
Fazem parte de noncoding RNA (ncRNA) ���� incluem snRNA, tRNA, rRNA, snoRNA
- Mamíferos codificam mais ncRNA do que mRNA
- O miRNA interage com o mRNA na 3’UTR ����degradação ou inibição da tradução
- Controla o desenvolvimento do organismo
- Controle de infecções virais em plantas
� Possuem ~70 nt auto-complementares ���� duplex RNA-RNA ���� grampos
� Clivagem pela endonuclease DICER ou DROSHA
� Interação do fragmento com o mRNA alvo em duplex RNA-RNA ���� inibição da tradução ou
degradação
- Base da técnica de RNA de interferência (siRNA)
- Aplicação no controle de infecções virais