“Control de calidad en biobancos” - researchgate.net · PROCESADO DE MUESTRAS/ALMACENADO Puntos...
Transcript of “Control de calidad en biobancos” - researchgate.net · PROCESADO DE MUESTRAS/ALMACENADO Puntos...
See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/281645280
Control de calidad en cultivos celulares.
Research · September 2015
DOI: 10.13140/RG.2.1.3226.4163
CITATIONS
0READS
666
1 author:
Some of the authors of this publication are also working on these related projects:
Biobanking formation area View project
Biosecurity and biocontention formation area View project
Javier Garcia Palomo
Banco Nacional de ADN Carlos III
13 PUBLICATIONS 33 CITATIONS
SEE PROFILE
All content following this page was uploaded by Javier Garcia Palomo on 11 September 2015.
The user has requested enhancement of the downloaded file.
www.bancoadn.org
F. JAVIER GARCÍA PALOMO
Banco Nacional de ADN Carlos III, Universidad de Salamanca
Salamanca, 1 al 3 julio 2013
“Control de calidad en biobancos”
“Control de calidad de líneas celulares”
Es un cultivo in-vitro de células que consigue la “supervivencia indefinida” y que puede se congelada y recuperada un número
teóricamente infinito de veces.
• NO DEBE suponer una “pérdida” de la capacidad replicativa en cultivo.
• DEBE poder producir más células iguales a la original con la mínima pérdida de su identidad genética y/o funcionalidad.
• DEBE mantenerse libre de contaminación por microrganismos u otras células.
Carcinogenesis vol.26 no.5 pp.867--874, 2005
Líneas celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
• Conseguir gran cantidades de ADN y ARN de una muestra o asegurar muestras únicas o “irremplazables”.
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
• Reponer los “almacenes” de ADN genómico, cuando estos se han degradado, consumido,…, sin tener que recurrir de nuevo al donante. • Utilizar las células inmortalizadas como base para la investigación (testado de fármacos, desarrollo de vacunas,búsqueda de dianas terapeúticas,…)
Líneas celulares
Transfiriendo y/o modificando la dotación/expresión genética de aquellos genes implicados en muerte celular y/o proliferación. Para ello se pueden
utilizar método “naturales” (EBV) y métodos de ingeniería genética (vectores virales).
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Líneas celulares
INFECCIÓN DIRECTA con EBV (SÓLO linfocitos B humanos).
INDUCCIÓN VIRAL mediante la introducción en las células de combinaciones de genes clonados (SV40, Herpes Virus Humano, telomerasa,…, )
REPROGRAMACIÓN de RNAi mediante siRNA (short interfering RNAs) o con miRNA (micro RNAs), sobre genes como Oct4, Sox2, c-Myc, Nanog,…
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Líneas celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
El valor de un cultivo reside en:
Estabilidad genética adecuada al uso que se le va a dar Inexistencia de microrganismos contaminantes. Pureza de la línea establecida (autenticidad e identidad).
Day 15
Líneas celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
1. Establecer y comprender de los factores más relevantes que pueden afectar al sistema in-vitro.
2. Asegurar la calidad y reproducibilidad de materiales y métodos utilizados.
3. Generar documentación asociada. 4. Establecer y mantenimiento de medidas adecuadas de
protección individual y medioambientales. 5. Satisfacer de cualquier marco legal, regulación o principios
éticos aplicables. 6. Dotar de educación y entrenamiento adecuado a todo el
personal implicado, para conseguir alta calidad de producto y mantener niveles de bioseguridad adecuados.
Control de calidad en cultivo celular
Adaptado de: Coecke, S. et al. “Guidance on Good Cell Culture practice”. Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice. ATLA 33,261-287, 2005
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Control de calidad en cultivo celular
EXTRACCIÓN SEPARACIÓN de PBMC
EXPANSIÓN Explotación: reposición de almacenes, investigación
CRIOPRESERVACIÓN
DESCONGELACIÓN Y/O CULTIVO
Estudio del sistema
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Control de calidad en cultivo celular
PROCESADO DE MUESTRAS/ALMACENADO
Puntos de posible CONTROL PROCESOS •Tipo de anticoagulante •Temperatura de almacenamiento durante el transporte. •Volumen de muestra •Características de la muestra
•Nº de células recuperadas en FICOLL •Condiciones de almacenamiento en LN2
•Cultivos: nº de PBMC iniciales •Control del Banco celular escalonado •Control de stocks virales •Control de medios de cultivo
INMORTALIZACIÓN
RECEPCION DE MUESTRAS
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Control de calidad en cultivos celulares
SEPARACIÓN de PBMC Ficoll, nº de células recuperadas
1. Volumen de sangre de partida 2. Tipo de anticoagulante 3. Temperatura de almacenamiento previo y de trabajo. 4. Recuperación final.
DIAS DESPUÉS DE
LA EXTRACCIÓN
ANTICOAGULANTE Y MODO DE ALMACENAMIENTO
ACD EDTA 4ºC AMBIENTE TOTAL
0-7 DÍAS 85% 58% 68% 67% 68%
8-14 DÍAS 56% 24% 31% 0% 31%
>15 DÍAS 0% 0% 0% 0% 0%
0
2.000.000
4.000.000
6.000.000
8.000.000
10.000.000
12.000.000
14.000.000
16.000.000
18.000.000Células/ml vial
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Control de calidad en cultivos celulares
Tipo de muestra recibida
Sexo Hombres 33% (4/12)
Mujeres 33% (5/15)
Edad
<20 años 25% (2/8)
20-40 años 40% (4/10)
>50 años 22% (2/9)
Nonagenarios (*) 10/50 (20%) PBMC Congelados
3/3 (100%) PBMC fresco
Volumen < 3 ml 38% (3/8)
3 – 5’9 ml 33% (4/12)
6 + 29% (2/8)
En negrita: de “Establishment of Stably EBV Transformed Cell Lines from Residual Clinical Blood Samples for use in performance evaluation and Quality Assurance in molecular genetic testing”, Susan H. Bernacki et al. Journal of molecular diagnostics, vol. 5, nov 2003. (*) En rojo: datos obtenidos de cultivos de Banco Nacional de ADN Carlos III en 2011
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Criopreservación
1. Crioprotector: ensayo de toxicidad 2. Rampa de congelación elegida: Criomed©,
Mr.Frosty™, Coolcell®,… 3. Condiciones de almacenamiento. 4. Método de recuperación (rampa de
calentamiento, dilución de crioprotectores,…)
Para nuevas líneas
Control de calidad en cultivos celulares
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 7
Muestra 8
% Recuperado5. Tasa de recuperación: ¿es suficiente?
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Inmortalización
1. Número de células al inicio del cultivo:
Linfocitos B son ±8-10% de PBMC Densidad en cultivo: 300.000-900.000 cel/ml Inicio de cultivo con 1,5ml
Recuperación mínima necesaria > 4,5 millones de PBMC
2. Plásmidos, stocks virales,…, comerciales o de fabricación
propia: testado in-vitro.
+
Control de calidad en cultivos celulares
Expansión del cultivo
1. Número de células de partida: recuperadas de LN2 o cultivo continuo. 2. Tipo de línea celular:
Línea finita: senescencia a 70-80 pases (ej. líneas fibroblatoides) Línea celular contínua: alcanzan los 160 pases sin alteración genética aparente (ej.
lineas linfoblastoides, SH5Y-SY, HL-60,..). Stem-cells: líneas continuas , pero que pueden evolucionar hacia otras estirpes (ej. cel.
embionarias, líneas germinales, cel. madre,….). 3. Densidad celular durante el cultivo: Métodos de conteo celular:
Tinción vital, en cámara de recuento (Trypan blue, Evans blue,…) Espectrofotométrico (absorbancia a 600nm, Neutral red assay,…) ELISA (reducción de MTT) FACS (Ioduro de propidio/anexina V)
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Control de calidad en cultivos celulares
Expansión del cultivo Viabilidad celular durante el cultivo
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Control de calidad en cultivos celulares
Marcaje mediante Ioduro de propidio/anexina V-FITC (Immunostep Cat. Nº ANXVKF-
100T y citómetro FACSaria B&D) Muestras con 30 días de cultivo
bna-19755
29 %
bna-17300
33 %
IP
+ -
Anexina + Muertas Necr.
- Apopt. Vivas
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Cultivo continuo y envejecimiento
El cultivo continuo de células : • Acumula cambios genéticos • Aumenta la posibilidad de contaminación con bacterias, hongos e incluso otras células (contaminación cruzada) • Para LCL se ha establecido un máximo de 150 pases antes de perder la diploidía y quedar invalidadas (*).
El resultado: Pérdida de importantes características genotípicas y/o fenotípicas, que comprometen su reproducibilidad y posible uso final.
Una solución es generar Bancos celulares escalonados, para asegurar la utilización cultivos con pocos pases
Control de calidad en cultivos celulares
(*) L. Sie, S. Loong and E.K. Tan .”Utility of Lymphoblastoid Cell lines”, Mini-review. Journal of Neuroscience research 87:1953-1959, 2009
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Banco celular escalonado en dos niveles para LCL
Control de calidad en cultivos celulares
PBMC de Ficoll
Inmortalización Viales
congelados Línea celular congelada: Master cell
bank
Expansión de LCL
Working cell bank
ADN para biobanco
Indefinido Pase 1 a 50 Indefinido Pase 50 a 100
Pase 100 a 150
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Control de stocks virales: banco celular escalonado para B95-8
Control de calidad en cultivos celulares
• Variabilidad en titulación lote a lote: mejor producir lotes grandes.
• Celulas productoras: testado funcional y micoplasma antes de “banking”: banco celular escalonado, para producción viral.
Recepción de la línea
productora B95-8
Congelación de 3-5 viales
Cultivo
TEST MICOPLASMA ABANDONAR PROCEDIMIENTO POSITIVO
RESUCITACIÓN DE UN VIAL
CREACIÓN DE BANCO MAESTRO
(10-100 VIALES)
CONTROLES MICROBIANO,
AUTENTIFICACIÓN,,…
POSITIVO
RESUCITACIÓN DE UN VIAL
CREACIÓN DE BANCO
DE TRABAJO (20-200 VIALES)
NEGATIVO
PRODUCCIÓN VIRAL
NEGATIVO
Medio de cultivo: componentes
Medio basal
Para inmortalización con EBV: RPMI 1640 con glutamina y HEPES
• Medio de composición definida: aa., vitaminas, azúcares, elementos traza y sales, para simular un medio “natural”.
• Sirve como fuente de C y N a las células. • Contiene Glu:
Fuente de ATP, que es rápidamente consumido (3 días) Se descompone en 5 días a 37ºC, pero depende de pH y temperatura
también. • Sales, aminoácidos y HEPES ayudan en el tamponamiento de pH • Solo necesita testado de esterilidad por el usuario (métodos)
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Medio de cultivo: componentes
Suero Bovino Fetal (SBF)
• Mezcla compleja (>10.000 componentes) • Fuente de hormonas, factores de crecimiento, lípidos,… • Se utiliza tanto en cultivo como en criopreservación • Elevada variabilidad en composición lote a lote, entre
fabricantes,.. • Fuente también de contaminación: micoplasma, BSE,… • Necesitará testado de funcionalidad por el usuario
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Stacey, G. “Fundamental Issues for cell-line Banks in Biotechnology and regulatory affairs”. Cell Biology, 2004
Medio de cultivo: componentes
Suero Bovino Fetal (SBF): TESTADO
• Utilizar muestras certificadas (Low Endotoxin Level) de varios fabricantes. • Realice test funcional en condiciones equivalentes . • Seleccione/reserve el mejor lote para el trabajo de varios años.
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Densidad celular (abs a 600nm) Fabricante Lote Linea A Linea B Linea C Linea D Linea E VWR S098789 0,590 0,070 0,030 0,230 0,410 Biowest 35K890-2 0,030 0,500 0,060 0,370 0,430 Bio-Whitacker 3SB9800 0,570 0,300 0,420 0,410 0,320 Sigma A0434-23 0,300 0,290 0,020 0,350 0,400 Lonza BE12F-102 0,060 0,150 0,600 0,020 0,020
Puntuación Resultado Fabricante Lote Linea A Linea B Linea C Linea D Linea E VWR S098789 1 5 4 4 2 16 Biowest 35K890-2 5 1 3 2 0 11 Bio-Whitacker 3SB9800 2 2 2 1 4 11 Sigma A0434-23 3 3 5 3 3 17 Lonza BE12F-102 4 4 1 5 5 19
Medio de cultivo: componentes
Antibióticos
• Protegen el cultivo de contaminación: bacterias, virus y hongos. • Protegen al operador frente a posibles microorganismos patógenos
presentes en la muestra inicial o procedentes de SBF. • Se degradan/consumen en 3 días a 37ºC. • No se deberían utilizar de rutina en cultivos, para así poner de
manifiesto posibles contaminaciones en las muestras procesadas. • No deben nunca ser sustituto de buenas técnicas asépticas
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Medio de cultivo: pureza
Micoplasmas
• Son los procariotas más pequeños (0,3 micras), ubicuos y habituales en cultivos. • En cultivo, encontramos cinco especies principales: M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M.
fermentans y Acholeplasma laidlawii. • Sus efectos son más insidiosos que el de las bacterias, induciendo cambios
irreversibles en los cultivos: • Tasas de crecimiento alteradas • Cambios morfológicos • Aberraciones cromosómicos • Alteraciones en el metabolismo de aminoácidos y ácidos nucléicos
• Se detectan fácilmente mediante PCR y debería ser una rutina de laboratorio para líneas celulares (o al menos para productoras de partículas virales para inmortalización).
• Difíciles de erradicar, pues algunos traspasan los filtros de 0,22 micras
Adaptado de “www.bionique.com/mycoplasma-resources/faq/what-are-mycoplasmas.html”
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Micoplasma: detección por PCR
Ladder Ladder
Realice test de micoplasma en muestras antes de ponerlas en servicio El cultivo debería estar activo unos días antes de realizar el test
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Autentificación
• Perfiles genéticos de muestras de cultivos, frente a patrón genético de ADN extraído bien de papel FTA o bien células mononucleadas.
• Se utiliza PCR múltiple con 5
marcadores de STR, y a veces marcador de sexo como 6º comparador.
Patrón A Patrón B
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Toda línea celular debe poseer registros lo más completos posibles, para poder seguir, reevaluar o mejorar el proceso y
pueden incluir: • Procedencia de la línea:
Identificación de muestra (anonimizada) Fecha de obtención Cuestionario de salud y pruebas diagnósticas relevantes (HIV, hepatitis,…), si
procede. Fecha de inmortalización. Viales generados y en reserva
• Pruebas de cultivo realizadas: Conteo antes de congelación Conteo al inicio del cultivo y adicionales. Calendario de eventos del cultivo Pruebas diagnósticas: autentificación, micoplasma, viabilidad,…
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Información de entrada
Información de proceso
Cuestionario de salud
Hemograma
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Información de procesado
Calendario de eventos
DIA 1 8 15 22 29 36 43 50 57 64 70 77 84
Inmortalización (2 crioviales)
Inicio en placa con
2 pocillos 1,5ml totales
en cada
Añadir 1 ml
Cambio a dos F-25
añadiendo 2ml (destruir
placa)
Añadir 2 ml Añadir 3,5 ml
Cambio F-75 y añadir 8ml
(Trasvasar ambos F25 y destruir F25)
Añadir 15 ml Alicuotar 1º Asp.20ml para 2 criov./
Disp.10ml
Alicuotar todo (2 criov.) y CERRAR
Volúmenes…... 1,5 + 1,5 2,5 + 2,5 5 + 5 7 + 7 10 + 10 28 40 30 35 ml
Inmortalización (1 criovial)
Inicio en placa en 1 pocillo con
1,5ml
Añadir 1 ml
Duplicar pocillo
(traspasar 1,2 ml y rellenar hasta
2,5 ml)
Cambio F-25 cada pocillo (+2,5ml)
Añadir 2 ml Añadir 3,5 ml
Cambio F-75 y añadir 8ml
(Trasvasar ambos F25 y destruir F25)
Añadir 10 ml Alicuotar 1º; Asp.20ml para 2 criov./
Disp.10ml
Alicuotar todo (2 criov.) y CERRAR
Volúmenes…... 1,5 2,5 2,5 + 2,5 5 + 5 7 + 7 10 + 10 28 38 30 ml
Inmortalización con extracción de ADN
(1 criovial)
Inicio en placa en 1 pocillo con
1,5ml
Añadir 1 ml Duplicar pocillo
(traspasar 1,2 ml y rellenar hasta
2,5 ml)
Cambio F-25 cada pocillo (+2,5ml)
Añadir 2 ml Añadir 3,5 ml
Cambio F-75 y añadir 8ml
(Trasvasar cada F25 a F75 y destruir F25)
Añadir 10 ml Añadir 15 ml
Alicuotar 1º:
Asp.15+15ml para 2 criov./ Disp.10+10ml
Alicuotar 2º:
Asp.10+10ml para 2 criov./ Disp.10+10ml
Añadir 15 ml RETIRAR TODO PARA
EXTRACCIÓN ADN
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
IDENTIFICACIÓN DE PROCESOS CON POSIBLE RIESGO
BIOLÓGICO
DISEÑO DE MEDIDAS PARA EL CONTROL DEL RIESGO BIOLÓGICO
IMPLEMENTACIÓN DE MEDIDAS A TRES NIVELES DE ACTUACIÓN
PRACTICAS DE LABORATORIO (PNT´s Y GLP´s)
INSTALACIONES EQUIPOS DE PROTECCIÓN
(E.P.I.)
Evaluación contínua
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Gestión del riesgo
• Utilizar instalaciones BSL2 al menos para el cultivo con seguridad biológica. • Mantener prácticas de nivel BSL3 durante la producción y purificación viral. • Compartimentación temporal y/o física de los distintos tipos de líneas celulares. • Personal entrenado/cualificado, conocedor de los riesgos potenciales. • Programas específicos para desinfección, mantenimiento y validación de salas y de equipos. • Programas de inactivación de TODOS los residuos. DIRECTIVA 2009/41/EC del Parlamento y del Consejo de 6 de mayo de 2009 sobre el uso confinado de microrganismos modificados genéticamente
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Control medioambiental
Si no se dispone de zonas de “ambiente controlado” (salas de cultivos, salas blancas, salas NSB3,…) deberíamos realizar controles periódicos de la calidad microbiológica de nuestras cabinas de seguridad e incubadores.
Materiales Desinfectante (propano-AF, Perasafe,…). No utilice en las superficies metálicas compuestos que contengan cloro o derivados. Placas petri con agar-Saboreaud o similar (crecimiento bacteriano y fungico). Incubador
Metodología Limpiar cabinas (tambien debajo de rejilla) con trapo exento de fibras y “barriendo” partículas y desinfectar apropiadamente Encender UV durante 30 minutos c√on flujo encendido. Pasado el tiempo, colocar abiertas 5 placas: una en cada esquina y una en el centro: 30 minutos- 1 hora. (dos para incubadores y √(area) para una sala). Recoger placas e incubar 72 horas a 33ºc.
Criterios de aceptación y rechazo No debe aparecer más de una colonia en cada placa (al menos en cabinas). En el caso de aparecer más, proceder a esterilización con HPV, formol u otro esterilizante adecuado.
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Consentimiento informado
Control de calidad en cultivos celulares
Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca
Formación contínua y SOP´s
• Todo el personal implicado realiza cursos para el trabajo en condiciones BSL2+.
• Todo personal de nueva incorporación es formado en técnicas de cultivo y Buenas Practicas de Laboratorio (BPL)
• Todo el personal asiste a seminarios sobre seguridad biológica tanto internos como externos.
• Todos los protocolos de trabajo están escritos y son de conocimiento obligado
• El responsable del área asiste a cursos de formación específica sobre bioseguridad, grupos de trabajo y participa en grupos de discusión relacionados (AEBIOS, ABSA, EBSA, CDC, NIH,…) para mantener el nivel de formación necesaria y poder transmitirla.
www.bancoadn.org
PREGUNTAS
View publication statsView publication stats