Màster de Biodiversitat

CONSERVACIÓ D’ESPÈCIES VEGETALS EN PERILL CRÍTIC A L’ARXIPÈLAG DE

LES SALVATGES

Manuel Pomar Cloquell

Directora:

Roser Vilatersana Lluch

Institut Botànic de Barcelona - CSIC

Tutor:

José Manuel Blanco Moreno

Facultat de Biologia - UB

Setembre 2014

ÍNDEX

ABSTRACT- RESUM

1. INTRODUCCIÓ I OBJECTIUS

2. MATERIAL I MÈTODES

2.1. Mostreig

2.2. Métodes moleculars

2.3. Anàlisi de les dades

3. RESULTATS

3.1. Demografia

3.2. Dades morfològiques

3.3. Dades genètiques

4. DISCUSSIÓ

5. CONCLUSIONS

6. AGRAÏMENTS

7. BIBLIOGRAFIA

ANNEXOS

1

ABSTRACT – RESUM

The Selvagem Pequena is one of the two main islands in the Macaronesian archipelago of the

Savage Islands (Ilhas Selvagens). The absence of introduced species, an exception amongst

the rest of Macaronesian islands, has preserved a unique system where we can find the narrow

endemic Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. Its demographic structure has been studied and

we have used AFLP markers in order to shed light on the genetic relationships between

individuals and to infer possible conservation strategies. This study revealed that the individuals

sampled form a single population of different age classes structured in four lineages or genetic

clusters with a high degree of gene flow and proven reproductive capacity. It has also been

found that the number of individuals is higher than previously expected (97 reproductively

individuals). Its current IUCN classification is hereby discussded according to the results of this

study.

KEYWORDS: AFLP, Asparagus nesiotes subsp. nesiotes, conservation, endemism,

Macaronesian archipelago, Selvagem Pequena

La Salvatge Petita és una de les dues illes principals de l’arxipèlag macaronèsic de les

Salvatges (Ilhas Selvagens). L’absència d’espècies introduïdes, una excepció entre la resta

d’illes de la Macaronèsia, ha preservat un sistema únic on hi podem trobar l’endemisme com

Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. D’aquest tàxon s’ha estudiat la demografia i s’ha explorat

la seva variabilitat genètica mitjançant marcadors AFLP, amb l’intenció de determinar les

relacions genètiques entre individus i per a inferir possibles estratègies de conservació. Aquest

estudi ha revelat que els individus mostrejats conformen una única població amb diferents

classes d’edat estructurada en quatre llinatges principals que presenten un alt grau de flux

genètic entre ells i bona capacitat reproductiva. També s’ha trobat que el nombre total

d’individus (97 individus reproductors) és major de l’esperat. Amb els estudis realitzats també

s’avalua la seva categoria UICN.

PARAULES CLAU: AFLP, Asparagus nesiotes subsp. nesiotes, conservació, endemisme,

Macaronèsia, Salvatge Petita,

1. INTRODUCCIÓ I OBJECTIUS

La Macaronèsia és una regió biogeogràfica fo

Atlàntic: les Açores, Madeira, les Salvatges, les Canàries i Cap Verd, que

comparteixen un conjunt d'elements florístics i faunístics a més de ser tots d

volcànic (Fernández-Palacios

enclavament continental situat al sud

al., 2008) (Fig. 1).

Fig. 1. La Macaronèsia d’acord amb Médail & Quézel (1999)

La Macaronèsia representa un sistema

relicta d’Europa i el nord d’Àfrica,

continent a finals del Neogen

de la Macaronèsia, essent illes oceàniques,

d'espècies provinents del continent

d'aquestes un cop establertes. L’heterogeneïtat en la composició d'espècies entre illes

es veu accentuada pel diferent grau d'aïllament i l'edat de

1997). Cal destacar la importànc

conservació de biodiversitat en

com a punts on se'n genera

d'endemismes (Cowie & Holland, 2006

2

I OBJECTIUS

és una regió biogeogràfica formada per cinc arxipèlags de l'o

, Madeira, les Salvatges, les Canàries i Cap Verd, que

comparteixen un conjunt d'elements florístics i faunístics a més de ser tots d

Palacios et al., 2011). Alguns autors hi inclouen també un

enclavament continental situat al sud-oest del Marroc (Médail & Quézel, 1999;

. La Macaronèsia d’acord amb Médail & Quézel (1999).

Macaronèsia representa un sistema insular que destaca per la presència de flora

d’Europa i el nord d’Àfrica, supervivent de les extincions que es donaren al

gen (Vargas, 2007). La composició de la flora

de la Macaronèsia, essent illes oceàniques, prové de la colonització i establ

d'espècies provinents del continent en diferents temps geològics i de l'evolució

d'aquestes un cop establertes. L’heterogeneïtat en la composició d'espècies entre illes

es veu accentuada pel diferent grau d'aïllament i l'edat de formació de cada illa (Cronk,

importància d’aquestes illes no només com a punts de

conservació de biodiversitat en quant a presència de paleoendemismes sinó també

com a punts on se'n genera in situ de nova, essent sistemes d'altíssima densitat

Cowie & Holland, 2006).

rmada per cinc arxipèlags de l'oceà

, Madeira, les Salvatges, les Canàries i Cap Verd, que

comparteixen un conjunt d'elements florístics i faunístics a més de ser tots d'origen

Alguns autors hi inclouen també un

Médail & Quézel, 1999; Kim et

er la presència de flora

supervivent de les extincions que es donaren al

e la flora dels arxipèlags

prové de la colonització i establiment

en diferents temps geològics i de l'evolució

d'aquestes un cop establertes. L’heterogeneïtat en la composició d'espècies entre illes

ormació de cada illa (Cronk,

com a punts de

quant a presència de paleoendemismes sinó també

sistemes d'altíssima densitat

3

L’origen d'aquesta regió biogeogràfica el trobem en els diferents esdeveniments de

caràcter volcànic que s'han donat al llarg dels darrers 70 milions d’anys (Ma). Aquests

han donat lloc a diversos grups d'illes, moltes d'aquestes sota l'actual nivell del mar,

destí que sol ser el típic en les dinàmiques geològiques de les illes volcàniques

(Fernández-Palacios et al., 2011).

D'aquests arxipèlags macaronèsics, el de les illes Salvatges (Ilhas Selvagens) és el

d’origen més antic, aproximadament 27 Ma (Geldmacher et al., 2001) i es troba en les

darreres fases de l'ontogènia de les illes volcàniques, caracteritzada per una topografia

d'altiplà i finalment una fase terminal de desaparició per l'efecte de l'erosió i els canvis

en el nivell del mar (Fernández-Palacios et al., 2011).

Aquest petit arxipèlag pertany administrativament a la regió autònoma de Madeira

(Portugal), tot i que geològicament forma part de la província volcànica de les

Canàries. L'arxipèlag de les Salvatges està constituït de dues illes principals, la

Salvatge Gran (Selvagem Grande) i la Salvatge Petita (Selvagem Pequena) així com

nombrosos illots i farallons, destacant l'Ilheu de Fora, veí de la Salvatge Petita (Fig. 2).

Fig. 2. Arxipèlag de les Salvatges. Les dues illes principals es troben a una distància d’uns 20 km.

4

Les illes es troben situades a mig camí entre Madeira i les Canàries, estant a 280 Km

de la primera i a 165 km de les segones i ja apareixen als mapes portolans del segle

XIV com l'Atles Català de Cresques però no varen ser visitades fins el segle XV i, tot i

així, despertaren poc interès per ésser considerades inhabitables. Més endavant, la

Salvatge Gran sí que fou explotada i habitada de manera puntual per mariners i

pescadors dels arxipèlags veïns, essent conegudes sobretot per les colònies de virot

de les Açores (Calonectris diomedea subsp. borealis), que foren caçats regularment

fins l'any 1967 per a la producció d'oli, però també per la presència de líquens que es

recol·lectaven per a la fabricació de tints (Ritsema, 2010).

Aquesta intermitent presència humana propicià la introducció d'espècies invasores tant

vegetals com animals, moltes d’elles com a aliment pels visitants ocasionals, que

afectaren profundament a la composició d'espècies original. Ja al segle XV hi foren

introduïdes cabres i conills així com indirectament també ratolins que reduïren molt la

flora nativa, provocant extincions o sovint només permetent-ne la supervivència als

racons més inaccessibles. Les cabres s'extingiren al segle XIX mentre que els conills

mantingueren la seva presència fins el 2003, any des del qual no se n’han registrat

observacions (Serviço do Parque Natural da Madeira, 2004). En quant a plantes

introduïdes, el cas més notable és el de Nicotiana glauca, cultivada i després

naturalitzada al segle XIX i de la qual se'n fan programes d’eradicació actualment

(Serviço do Parque Natural da Madeira, 2004).

Contràriament, la Salvatge Petita, molt més petita i hostil per a l'establiment humà va

romandre inalterada. Això ha permès que arribi fins als nostres dies un ecosistema

intacte i de composició única.

Actualment aquest arxipèlag té l'estatus de Reserva Natural Integral des del 1971 i es

troba classificat dins el pla d'ordenament del territori de l'ens autonòmic com Área de

Uso Proibido i estant administrativament dins el municipi de Funchal hi apareixen al

Pla Director Municipal com no edificables. La seva protecció recau sobre la Secretaria

Regional do Ambiente e dos Recursos Naturais per mitjà del Serviço do Parque

Natural da Madeira. Les visites estan estrictament regulades, requereixen un permís

especial i no és permès pernoctar-hi.

La Marinha de Guerra Portuguesa hi té presència com a encarregada de vetllar del

manteniment la Zona Econòmica Exclusiva (ZEE) portuguesa i porta a terme les

connexions entre illes.

L’àrea de treball d'aquest estudi es centra exclusivament en la Salvatge Petita (Fig. 3).

Amb una superfície d'unes 20 hectàrees, aquesta illa i el seu subarxipèlag són una

formació volcànica en la fase final de la seva ontogènia.

5

L'illa està formada per aglomerats piroclàstics de lapil·li (Geldmacher et al., 2001) i

presenta una topologia de plana coberta de sorres calcàries amb la única elevació

rocosa del Pico do Veado (49 m). Al contrari que la seva veïna major, la Salvatge

Petita només manté presència humana d'abril a novembre per guardes del parc que hi

fan torns de tres setmanes. Tota l’illa es troba sotmesa a una forta erosió i a una

pujada del nivell del mar, els efectes de la qual es veuen cada cop més accentuats

(Moreira, 1991).

En aquesta illa hi trobem nou dels onze endemismes propis de les illes Salvatges, dos

dels quals només presents a la Salvatge Petita (Hansen & Sunding, 1993) i un exclusiu

de la illa de Fora (subarxipèlag de la Salvatge Petita).

Fig. 3. Ortofoto de la Salvatge Petita (GeoPortal do LNEG - Laboratório Nacional de Energia e Geologia).

Aquest treball es troba integrat dins el projecte “Conservation of the critically

endangered endemic flora of the Selvagens Islands, Atlantic Ocean”, finançat pel

Mohammed Bin Zayed Species Conservation Fund i que es centra en l'estudi dels tres

endemismes exclusius de la Salvatge Petita: Argyranthemum thalassophilum

Humphries, Asparagus nesiotes Svent. subsp. nesiotes i Euphorbia anachoreta Svent.,

i amb un nombre d'efectius menor de 250 individus per al primer i de menys de 50 per

als dos darrers (Martín et al., 2008). Aquest estudi es centra en Asparagus nesiotes

subsp. nesiotes.

6

A la Macaronèsia hi podem trobar 14 representants del gènere Asparagus L.

(Asparagaceae; APG II, 2003) dels quals 12 són endemismes d’aquesta regió

biogeogràfica (Hansen & Sunding, 1993). Trobem en aquest gènere tant espècies

hermafrodites com dioiques (Lee et al., 1997) però totes són perennes, presentant un

rizoma subterrani proveït de tubercles radicals que produeixen tiges aèries, herbàcies

o llenyoses. Així doncs, una de les característiques d’aquest gènere, així com de

moltes monocotiledònies, és la capacitat per a generar clons. D’aquesta manera,

diferenciem entre genets i ramets, essent els primers definits com aquells individus

provinents d’un zigot i els segons aquells provinents de la fragmentació de parts

vegetatives d’un genet original o planta mare. No obstant, no cal descartar la presència

de mutacions somàtiques dins les espècies clonals (Scrosati, 2001). El pes de la

reproducció asexual en el conjunt de les poblacions pot variar bastant entre les

diferents espècies. La pol·linització d’aquest gènere és totalment entomòfila (Delaplane

et al., 2000) i en illes oceàniques s’ha observat que la dispersió de les llavors la porten

a terme tant sargantanes com ocells, a més d’aus rapinyaires com a dispersadors

secundaris (Nogales et al., 2007).

Asparagus nesiotes subsp. nesiotes és endèmica del subarxipèlag de la Salvatge

Petita (Marrero & Ramos, 1989). Forma mates densament ramificades de tiges

volubles, és hermafrodita i presenta nombre cromosòmic 2n = 6x = 60 (Bramwell et al.,

1976) (Fig. 4). La subespècie A. nesiotes subsp. purpurensis Marrero Rodr. & A.

Ramos la trobem en canvi amb una distribució fragmentada a les illes de

Fuerteventura, Lanzarote i la Graciosa i està inclosa al Libro Rojo de la Flora vascular

de España amb la categoria UICN En Perill (EN) (Santos Guerra et al., 2013).

La tècnica dels marcadors moleculars AFLP (Amplified Fragment Lenght

Polymorphisms ) està àmpliament usada per a avaluar la diversitat genètica d’espècies

clonals (Escaravage et al., 1998; Albert et al., 2003) i en projectes de conservació en

poblacions d’illes (Kim et al., 2004). Aquesta tècnica es basa en l'amplificació de

marcadors per PCR i va ser descrita per primera vegada per Vos et al. (1995). El seu

protocol d’execució inclou 5 passos principals: a) restricció del DNA i lligació dels

adaptadors als fragments de restricció, b) amplificació preselectiva amb PCR d’una

submostra dels fragments, c) amplificació selectiva , d) separació per electroforesi dels

fragments de DNA amplificats, i e) anàlisi i interpretació de les dades (Paun &

Schönswetter, 2012).

Respecte a altres tècniques, els marcadors AFLP ofereixen diversos avantatges,

principalment el fet de ser un mètode relativament econòmic, senzill, ràpid i fiable per a

generar un gran nombre de marcadors genètics informatius. El fet de detectar molta

variabilitat el fa molt adequat per a estudis a nivell subespecífic i

restricció té l’avantatge de permetre una alta repetibilitat dels resultats. Tampoc

requereix cap coneixement previ de l’estructura i organit

d’això, són especialment útil

dels marcadors codominants

marcadors codominants tan

verificar-se l’homologia dels marcadors

per a inferir relacions a nivells taxonòmics superiors (Mueller & Wolfenberger, 1999).

Fig. 4. Detalls d’Asparagus nesiotes

7

variabilitat el fa molt adequat per a estudis a nivell subespecífic i l’ús

restricció té l’avantatge de permetre una alta repetibilitat dels resultats. Tampoc

requereix cap coneixement previ de l’estructura i organització del genoma.

útils en estudis d’espècies poliploides ja que

marcadors codominants desapareixen, degut a que en aquests casos

tan sols poden discernir entre presència/absència

els marcadors, fa que aquesta tècnica sigui menys adequada

per a inferir relacions a nivells taxonòmics superiors (Mueller & Wolfenberger, 1999).

Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. (A). Flors. (B). Fruits. (C). Individu juvenil

de mesures morfològiques.

l’ús d’enzims de

restricció té l’avantatge de permetre una alta repetibilitat dels resultats. Tampoc

zació del genoma. A més

poliploides ja que els avantatges

aquests casos, els

entre presència/absència. Al no

menys adequada

per a inferir relacions a nivells taxonòmics superiors (Mueller & Wolfenberger, 1999).

Individu juvenil. (D). Presa

8

Els objectius d’aquest treball són:

• Determinar l’estat demogràfic de la població d’Asparagus nesiotes subsp.

nesiotes.

• Avaluar la diversitat genètica d’aquest tàxon.

• Determinar el pes que té la clonalitat en el tàxon.

• Estudiar l’existència de subpoblacions genèticament diferenciades.

• Avaluar la categoria d’amenaça segons els criteris de la UICN.

• Establir criteris per a la seva conservació.

2. MATERIAL I MÈTODES

2.1. Mostreig

Es va estudiar l’única població existent de A. nesiotes subsp. nesiotes de la Salvatge

Petita. Es comptaren el nombre d’individus de la població, considerant com a individu

(genet) cadascuna de les mates individualitzades. Cada individu es va georreferenciar

amb GPS (Garmin, Legend Cx) i es van prendre algunes mesures morfològiques:

alçada de la mata, dimensió horitzontal màxima i nombre de branques (considerades

cadascuna com a ramets). De cada individu es prengueren mostres de fulles i es

conservaren en sobres amb gel de sílice amb un codi d’identificació.

2.2. Mètodes moleculars

Extracció d’ADN : L’extracció d’ADN es va realitzar als laboratoris de l’Institut Botànic

de Barcelona utilitzant el protocol de CTAB (Doyle & Doyle, 1987) amb la

modificacions de Tel-Zur et al. (1999). El material es triturà amb esferes de plom dins

eppendorfs de 2 ml durant 3 minuts amb un triturador Retsch®. Les mostres passaren

per tres cicles de rentats de sorbitol a 4ºC, cada una d’elles incloïa un vòrtex i una

centrifugació de 3 minuts a 13000 rpm i decantat del sobrenedant. S’afegeiren 700 µl

del buffer d’extracció CTAB i es deixà incubar a 65ºC durant 30 minuts. Després d’això

es varen afegir 500 µl de cloroform-isoamilalcohol (24:1) i es centrifugà. Es va retirar la

fase superior (transparent) i es passà a un altre eppendorf amb tancament de

seguretat. S’hi varen afegir 350 µl d’isopropanol i es deixaren les mostres 5 minuts a

l’ultracongelador (-70ºC). Una vegada descongelat es centrifugà durant 3 minuts a

9

13000 rpm i es decantà el sobrenedant amb pipetes Pasteur de plàstic (una per

mostra). S’hi afegí 1ml d’etanol (70%) i es tornà a centrifugar. Es tornà a decantar amb

molta cura el sobrenedant, tenint en compte la fragilitat del pellet en la mostra

purificada. L’excés d’etanol es deixà eixugar dins una bomba de buit. Completat això,

es va resuspendre amb 50 µl de TE-buffer i 2,5 µl de RNAsa (1mg/ml) i es deixà

incubar a 37ºC almenys durant 30 minuts.

El contingut en ADN de les extraccions es va determinat per espectrofotometria amb

NanoDrop 1000 v.3.7.1 (Thermo Fisher Scientific). La concentració mínima requerida

per extracció era de 30 ng/µl. Segons els resultats obtinguts, s’ajustà la concentració

les mostres per a obtenir una quantitat mínima de de 250 ng, l’establerta per a aplicar

la tècnica d’AFLP.

Marcadors AFLP : La fase de Restricció es va portar a terme amb un volum total de 10

µl per mostra (5 µl ADN i 5 µl còctel de reactius). Per a cada mostra, els volums de

reactius varen ser de 3,6 µl d’H20, 1,0 µl d’EcoRl buffer, 0,1 µl de sèrum d’albúmina

bovina (BSA, New England BioLabs) a 1mg/ml. Els fragments d’ADN es varen digerir

amb els enzims de restricció 2,8 U Msel (New England BioLabs) i 10 U de EcoRl

(Roche) i s’incubaren 3 hores a 37ºC.

Per a la lligació el volum de reacció per mostra va ser de 12,5 µl (7,5 µl d’ADN

procedent de la restricció i 5 µl del còctel de reactius). El còctel de reactius va incloure

1,3 µl d’H20, 1,1 µl de X10 T4 buffer, 0,5 µl de BSA a 1mg/ml, 1 U Ligasa T4 (Roche) i

els adaptadors de Msel (10 µM) i EcoRl (50 µM). Es va incubar durant 16 hores a

16ºC. Després d’aquesta fase es realitzà una comprovació de l’acció dels enzims

mitjançant una electroforesi amb un gel d’agarosa a l’1% usant SYBR safe DNA gel

stain (Molecular Probes Inc.). Una vegada comprovat es diluïren les mostres a 1/10.

Per a la fase preselectiva el volum total per mostra va ser 12,5 µl (2,5 µl de la lligació

diluïda i 10µl de còctel de reactius). Els reactius del còctel varen ser 6,82 µl d’H20, 1,25

µl de Taq buffer (Applied Biosystems), 0,75 µl de MgCl2, 0,63 µl de dNTP (10 mM),

0,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems) i 0,25 µl de cada un dels primers preselectius

EcoRI-A i MseI-C (10 µM els dos). Es va fer un segon gel de verificació i després

d’aquesta fase es diluïren les mostres a 1/10.

Per a la fase selectiva el volum total per mostra va ser de 13 µl (2 µl de mostra del

preselectiu diluït i 11 µl del còctel de reactius). Es varen fer servir eppendorfs

semiopacs per a evitar la degradació dels primers EcoRI fotosensibles, marcats amb el

fluorocrom VIC® (Applied Biosystems). El contingut del còctel de reactius va ser 6,45

µl d’ H20, 1,25 µl de buffer TaqGold (Applied Biosystems), 0,75 µl de MgCl2, 1 µl dNTP

10

(10mM), 1 µl BSA (1mg/ml), 1 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) i els primers 0,1

µl de EcoRI-AXX(10 µM) i 0,25 µl MseI-CXX (10 µM).

Els productes d’amplificació selectiva junt amb 0,5 µl de l’estàndard de mida

GeneScan 500 LIZ van se analitzats per la Unitat de Genòmica del Parque Científico

de Madrid usant un seqüènciador automàtic ABI 3730 (Applied Biosystems). Després

de provar 30 parells de primers selectius amb 8 mostres, es varen escollir dos parells

(EcoRI-AGA/MseI-CTC i EcoRI-AGA/MseI-CTA) per realitzar l’estudi donat que eren

els més reproductibles i fàcils d’analitzar. Controls negatius es varen realitzar en totes

les diferents fases del procés d’AFLP per detectar contaminacions exògenes.

2.3. Anàlisi de les dades

Mapatge : Utilitzant el software ESRI ArcMap v.10.0® (ESRI, 2011) es va representar

la distribució de l’espècie sobre el mapa de corbes de nivell proporcionat pel Serviço

do Parque Natural da Madeira i per la Direção Regional de Florestas e Conservação

da Natureza da Madeira utilitzant les dades recollides al camp amb GPS. Els mapes

obtinguts es van editar posteriorment amb Adobe Illustrator 10®. Amb el visualitzador

de mapes online del GeoPortal del Laboratorio Nacional de Energia e Geologia s’han

descarregat les ortoimatges utilitzades. Els mapes descriptius de la regió

macaronèsica s’han editat a partir de les imatges obtingudes des d’aquest portal.

Anàlisis morfològiques : S’han realitzat models de regressió lineals entre els parells

de caràcters morfològics estudiats usant el programa R v.2.15.0 (R Development Core

Team, 2012) i el paquet DEDUCER v.1.7.9 (Fellows, 2012). Usant les tres mesures

morfològiques s’ha construït una Anàlisi de Components Principals (PCA) amb el

programa R, l’entorn R-Commander v.1.9-5 (Fox, 2005) i el paquet FactoMineR v.1.24

( Lê et al., 2008).

Anàlisis moleculars : L’anàlisi de les dades es portà a terme utilitzant el software

GeneMarker® v.1.85 (SoftGenetics) utilitzant els fragments entre 64 i 500 pb. Aquest

programa permet estandarditzar un patró en les mostres a partir del qual guiar-se en

les anàlisis dels AFLP i determinar els polimorfismes observats. El criteri de valoració

pot establir-se depenent del soroll de fons de les mostres. El resultat final és una

matriu de presència/absència que es pot exportar. S’han seguit les recomanacions de

Bonin et al. (2007) i s’han realitzat repeticions de mostres i les bandes ambigües i no

reproduïbles s’han extret de la matriu binària.

11

Aquesta matriu binària obtinguda s’ha analitzat de diferents maneres i amb programes

diversos. Per a adaptar el format de la matriu als programes que ho requerien s’ha

utilitzat el paquet AFLPdat (Ehrich, 2006) usant el programa R.

Per a explorar les relacions dins el dataset s’ha realitzat una anàlisi de coordenades

principals (PCoA) usant la distància euclídia binària mitjançant el mòdul d’anàlisi

multivariant Ginkgo (Bouxin, 2005) del paquet B-VegAna (De Cáceres et al., 2003).

També s’ha explorat amb UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic

Mean) usant el coeficient de similitud de Dice (Dice, 1945) usant el programa

NTSYSpc v.2.02j (Rohlf, 1997). Per a representar l’agrupament de les dades i

distancies relatives entre parell d’individus simultàniament s’ha utilitzat l’algoritme

Neighbor-Net (Bryant & Moulton, 2004), implementat al programa SPLITSTREE4 v4.10

(Huson & Bryant, 2006) utilitzant la distància no corregida (p) entre tots els parells de

dades.

S’ha realitzat un test de Mantel (Mantel, 1967) per avaluar l’existència de correlació

entre la matriu de distàncies genètiques Dice i la matriu de distàncies geogràfiques

usant el programa NTSYSpc. La matriu de distàncies geogràfiques s’ha calculat amb

el programa Geographic Distance Matrix Generator v.1.2.3 (Ersts, 2011).

Paral·lelament s’ha analitzat l’estructura genètica de la població amb BAPS v.6.0

(Bayesian Analysis of Population Structure; Corander et al., 2008) escollint les opcions

de population mixture i clustering of individuals. S’han corregut 10 rèpliques per

cadascuna de les sis simulacions provades, de K=2 a K=8. La millor K es va escollir

amb la que presenta el major valor de log marginal likelihood [log (ml)]. Per tal de

mesurar la diferenciació genètica entre les subpoblacions (geogràfiques o resultants

de BAPS), s’han realitzat les anàlisis de variància molecular (AMOVA; Excoffier et al.,

1992) usant el programa ARLEQUIN v.3.5.1.2. (Excoffier et al., 2005) basant-se en les

distàncies euclidianes entre mostres i 1000 permutacions.

Per avaluar la contribució de la clonalitat en la diversitat genètica d’A. nesiotes subsp.

nesiotes s’han usat els programes GENOTYPE v.1.2 i GENODIVE v.1.1 (Meirmans &

Van Tienderen, 2004). Amb el primer s’ha obtingut el nombre de genotips (genets) i el

histograma amb la distribució de la freqüència de les distàncies entre parells assumint

el model d’infinits al·lels (IAM) per a la matriu originada amb els marcadors AFLP.

Aquesta mesura de distància determina quin és el nombre de mutacions necessàries

per a transformar el genotip d’un individu en el genotip d’un altre sumant tots els loci.

El programa GENODIVE calcula els índex de clonalitat i proporciona una mesura

d’uniformitat genotípica (E). Aquesta mesura és un indicador de com els genotips

estan distribuïts a la població,quan E=1 tots els genotips tenen la mateixa freqüència.

La variabilitat genètica s’ha mesurat amb l’aproximació Bayesiana utilitzant el

12

programa HICKORY v.1.1 (Holsinger & Lewis, 2003) que te l’avantatge de no assumir

l’equilibri de Hardy-Weinberg.

El desequilibri de lligament es va inferit utilitzant l’índex d’associació modificat (��� )

independent del nombre de loci estudiats a través del programa MULTILOCUS v.1.2

(Agapow & Burt, 2001). Aquest índex té un valor esperat de 0 quan els loci no

presenten associació, com s’esperaria en panmixi. La significació de (��� ) s’ha testat

1000 vegades a l’atzar comparant el valor observat amb la hipòtesi nul·la

d’aparellament a l’atzar.

3. RESULTATS

3.1. Demografia

La població d’Asparagus nesiotes subsp. nesiotes de la Salvatge Petita consta de 97

individus repartits en tres àrees principals. Les dues més importants es troben als

vessants est (45 individus) i oest (50 individus) del Pico do Veado mentre que una

tercera es situa a l’extrem sud-oest de l’illa i consta de només 2 individus (Fig. 5). Els

individus es troben en bon estat i amb capacitat reproductora. Es comptabilitzen

individus de totes les classes d’edat i s’observa que les mates es distribueixen

exclusivament sobre sòls rocosos.

3.2. Dades morfològiques

Les dades recollides mostren una gran varietat de mides (Fig. 6): el nombre de ramets

oscil·la entre 1 i 378 amb una mitjana de 31,2 ; llargada màxima de branques entre 10 i

870 cm amb una mitjana de 272,6 cm i la alçada de la mata oscil·la entre 8 i 420 cm

amb una mitjana de 59,2 cm. Les mesures morfològiques estan lleugerament

correlacionades (llargada/alçada; r = 0,2605 , p < 0,001; llargada/nº ramets: r = 0,1583,

p < 0,001; alçada/nº ramets: r = 0.2425, p < 0,001).

La PCA de les tres dades morfològiques estudiades es troba representada en la Fig. 7,

diferenciant-se els individus distribuïts al vessants est i oest del Pico do Veado,

observant-se que els individus al costat est tenen una lleugera tendencia a presentar

un nombre menor de ramets.

13

Fig. 5. Distribució de dels individus d’A. nesiotes subsp. nesiotes sobre el mapa de corbes de nivell de la

Salvatge Petita.

Fig. 6. Histogrames per a les mesures morfològiques. (A). Nombre de ramets. (B). Llargada màxima de

branques. (C). Alçada de la mata.

14

Fig. 7. Representació gràfica del PCA de les mesures morfològiques realitzades en els individus de la

població de A. nesiotes subsp. nesiotes diferenciats segons la vessant. (A). Representació gràfica dels

individus segons les dues vessants. (B). Representació gràfica de les variables .

3.3. Dades genètiques

Amb els 93 individus analitzats genèticament s’ha obtingut una matriu binària de 99

loci dels quals el 78% són polimòrfics. Els nombre de loci trobats per individu varia de

47 (individu A017) a 91 (individu A105).

La relació entre els individus de la població es troba representada gràficament en la

Fig. 8 (Neighbor-Net) i Annexos 1 i 2 (PCoA i UPGMA respectivament). No s’ha trobat

correlació entre les distancies genètiques i geogràfiques (r = 0,049, p = 0,778).

L’anàlisi BAPS mostra que l’agrupació dels individus òptima es la de quatre clústers

(log (ml) = -2860,2303; P = 1) (Figs. 8 i 9). Els clústers 1, 2, 3 i 4 es composen de 30,

14, 39 i 10 individus respectivament. En la representació gràfica dels quatre clústers

sobre el mapa de corbes de nivell de l’illa trobem aquests dispersos en les tres

subpoblacions (Fig. 9). Aquesta agrupació dels individus per clústers ha estat

contrastada amb el resultat de l’Neighbor-Net (Fig. 8).

Les anàlisis d’AMOVA realitzades han donat com a resultat que la variabilitat genètica

entre les subpoblacions segons criteris geogràfics és molt baixa (< 2%), mentre que

entre els clúster de BAPS es del 29% (Taula 1).

15

Fig. 8. Diagrama Neighbor-Net aplicat a la matriu binària d’AFLP. S’ha representat a la mateixa figura els

diferents clústers obtinguts amb BAPS

16

Taula 1. Resultats de l’AMOVA basant-nos en les agrupacions d’individus segons el resultat de BAPS i

distribucions geogràfiques. El valor p s’ha estimat després de 1023 permutacions. ns: no significatiu.

Els estudis de la clonalitat, mostren l’absència de clons dins de la població d’A.

nesiotes subsp. nesiotes segons el mostreig realitzat ja que s’ha troben 93 genets i en

l’histograma de la distribució de la freqüència de les distàncies entre parells amb el

model IAM, s’observa l’absència de comparacions amb zero o pocs canvis, reflectint

l’absència de clonalitat en les mostres (Fig. 10). Els coeficients de clonalitat mostren

un nombre de genotips igual al nombre d’individus i un grau d’uniformitat clonal

(eveness) molt alt (E = 1) ja que tots els genotips estan presents amb la freqüència

d’1.

Segons les agrupacions geogràfiques, les mesures de variabilitat genètica bayesiana

de la població com de les subpoblacions es de 0,29; mentre que amb l’agrupació dels

individus seguint els clústers de BAPS la diversitat genètica varia de 0,22 a 0,28 (Taula

2). S’ha detectat una petita part de desequilibri de lligament a la població d’ A. nesiotes

subsp. nesiotes (��� = 0,028; p < 0,001). Amb les subpoblacions Est i Oest els resultats

han estat significatius tot i que també molt baixos (Taula 3).

Font de variació d.f. Suma de

quadrats Components

variància Percentatge de

variació Valor p F ST

BAPS

Entre clústers 3 242,62 3,41 29,01 0,000 0,29

Dins clústers 89 742,85 8,35 70,99

Est-Oest

Entre subpoblacions 1 18,15 0,16 1,50 0,042 0,01

Dins subpoblacions

91 967,31 10,63 98,50

Est-Oest-Sud

Entre subpoblacions 2 27,90 0,14 1,27 0,083 ns 0,01

Dins subpoblacions

90 957,56 10,64 98,73

Fig. 9. Representació gràfica sobre el mapa de corbes de nivell de la distribució espacial dels individus

Fig. 10. Histograma representant el nombre de canvis per parell de comparacions

17

Fig. 9. Representació gràfica sobre el mapa de corbes de nivell de la distribució espacial dels individus segons els clústers obtinguts per BAPS.

Fig. 10. Histograma representant el nombre de canvis per parell de comparacions

Fig. 9. Representació gràfica sobre el mapa de corbes de nivell de la distribució espacial dels individus

entre individus.

18

Població/Grup Mitjana 2,5% 97,5%

Est/Oest * * *

hs[Est] 0,290 (0,011) 0,272 0,312

Hs[Oest] 0,293 (0,013) 0,270 0,317

Hs 0,292 (0,011) 0,272 0,314

Ht 0,294 (0,011) 0,273 0,315

Est/Oest/Sud * * *

hs[Est] 0,290 (0,010) 0,271 0,311

hs[Oest] 0,294 (0,012) 0,272 0,317

hs[Sud] 0,289 (0,012) 0,267 0,313

Hs 0,291 (0,011) 0,271 0,313

Ht 0,293 (0,011) 0,274 0,315

BAPS * * *

hs[1] 0,230 (0,008) 0,213 0,244

hs[2] 0,252 (0,010) 0,233 0,272

hs[3] 0,280 (0,008) 0,263 0,295

hs[4] 0,216 (0,010) 0,195 0,237

Hs 0,244 (0,005) 0,233 0,244

Ht 0,301(0,005) 0,291 0,301

Taula 2. Diversitat genètica Bayesiana basada en la variació d’AFLP d’Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. Entre parèntesi es mostra la desviació estàndard. El 2,5% i 97,5% mostren l’interval de

confiança. hs indica la diversitat genètica en termes d’heterozigositat mitjana en panmixi per a cada població o grup. Hs és la mitjana de les hs i Ht és l’heterozigositat panmíctica basada en la mitjana de

freqüències al·lèliques

�� �

Subpoblació Est 0,029 <0,001

Subpoblació Oest 0,026 <0,001

Població sencera 0,028 <0,001

Taula 3. Desequilibri de lligament trobat en la població i les subpoblacions geogràfiques d’Asparagus

nesiotes subsp. nesiotes.

19

4. DISCUSSIÓ

El resultat del recompte d’individus de l’única població d’ A. nesiotes subsp. nesiotes a

la Salvatge Petita (97 individus) resultà ser el doble del que s’havia determinat

prèviament (menys de 50 individus; veure Annex 3; Jardim et al., 2008). A més d’això,

hi trobem representants de totes les classes d’edat, des de plàntules, individus

juvenils, individus reproductors amb abundants flors i/o fruits, i individus senescents

però molt vigorosos (Fig. 4a-d). Si relacionem les característiques morfològiques

estudiades amb l’edat, es a dir, si considerem que al incrementar l’edat del individu

s’incrementa el nombre de ramets i de mida de la mata o de les branques, ens trobem

amb una població madura però amb molta regeneració ja que hi ha molts individus en

les primeres classes dels histogrames morfològics (Fig. 6). Els individus més

senescents, el més gran format per una mata de més de dos metres d’alçada i amb

més de 300 ramets (exclòs de la representació gràfica del PCA, Fig. 7) es troben al

vessant oest del Pico do Veado, degut possiblement a la orografia (Fig. 5) i, també, per

trobar-se més al resguard dels vents (Pérez de Paz & Acebes Ginovés, 1978).

La divisió genètica de la població en tres subpoblacions seguint criteris geogràfics (est,

oest, sud) no es veu reforçada per les anàlisi AMOVA realitzades (Taula 1) ja que

aquestes divisions expressen menys del 2% de la variabilitat trobada en tota la

població. No obstant, l’anàlisi BAPS divideix la població en 4 grups genètics o clústers

(Fig. 8). Aquests grups es troben distribuïts en tota l’àrea de distribució del tàxon (Fig.

9), fet que es veu recolzat per l’absència d’aïllament per distància entre els individus

mostrada pel test de Mantel. Per tant, es tracta d’una població no fragmentada que

presenta flux genètic entre les subpoblacions geogràfiques i, que tant, el rang d’acció

dels pol·linitzadors com dels agents dispersants de llavors no es veuen afectats per la

presencia del Pico do Veado.

Tot i tractar-se d’un tàxon amb capacitat per a generar clons i que la reproducció

asexual té un pes important en aquest gènere, els resultats del treball ens mostren que

tots els individus analitzats (93 en total) corresponen a genets. És a dir, cada mata

estudiada correspon a un individu genèticament diferent al altre. Tant les mutacions

somàtiques com errors en les anàlisis d’AFLP podrien afavorir la manca de detecció de

clons, no obstant, això es poc probable ja que les comparacions entre genotips indica

un mínim de sis canvis (Fig. 10). El tipus de sòl sobre el que creix A. nesiotes subsp.

nesiotes és un factor important que afavoreix els resultats trobats, ja els substrat rocós

no és el més adequat per a la reproducció i proliferació clonal a llarga distància.

20

L’alta variabilitat genètica observada en aquesta població (Taula 3) contrasta amb el

que succeeix en casos similars d’endemismes insulars on la diversitat és molt baixa i

sovint acompanyada de molt poc flux gènic (Crawford et al., 2001; Houliston et al.,

2012) ja que les poblacions amb baix nombre d’individus són més susceptibles a la

pèrdua i reorganització de la variabilitat per deriva genètica (Ellstrand & Ellam, 1993). I

a més, una població amb un nombre molt baix d’individus pot sofrir també pèrdua de

variació per fluctuacions degudes a factors externs atzarosos (Ellstrand et al., 1993).

Hi ha pocs estudis de variabilitat genètica en el gènere Asparagus (Sica et al., 2005;

Vijay et al., 2009) i en molts casos són difícilment comparables ja que utilitzen diferents

marcadors genètics i/o diferents paràmetres per a calcular aquesta variabilitat. De

totes maneres, comparant els nostres resultats amb l’estudi del tetraploide A.

acutifolius L. en diferents zones d’Itàlia, realitzat per Sica et al. (2005), veiem que, tot i

ser del mateix gènere, la variabilitat trobada en aquesta espècies és bastant més baixa

(Hs = 0,162) que la trobada en A. nesiotes subsp. nesiotes (Hs = 0,291). No obstant, a

l’hora d’explorar aquests resultats obtinguts de variabilitat genètica en aquest tàxon,

cal tenir en compte el fet de que A. nesiotes subsp. nesiotes és un hexaploide i que en

les espècies que presenten aquest alt grau de ploïdia s’hi tendeix a observar una

variabilitat genètica més elevada (Soltis & Soltis, 2000). Aquesta alta variabilitat

trobada en una població petita, com es l’estudiada, podria explicar-se també per una

major retenció de la variació observada en aquest tipus de poblacions i que

ocasionalment pateixen nivells d’estrès moderat quan se les compara amb altres

poblacions d’igual mida en ambients més benignes (Lesica & Allendorf, 1992).

Els valors de diversitat genètica (Hs) trobada en A. nesiotes subsp. nesiotes són

similars als mostrats en la metaanàlisi de Nybom (2004), també amb marcadors

dominants, per a un seguit de trets vitals com són la forma de vida perenne i de llarga

durada (Hs = 0,25), l’endemicitat (Hs = 0,20) i la dispersió de llavors per ingesta (Hs =

0,24).

El grau de desequilibri per lligament es àmpliament usat per avaluar especies clonals

(Agapow & Burt, 2001) i també per estimar diferents escenaris evolutius com pot ser,

la presència de colls d’ampolla (Frankham et al., 2003). En les nostres anàlisis trobem

un lleuger desequilibri per lligament que no sembla ser causats ni per la presència de

reproducció asexual ni per la presència de recents colls d’ampolla, sinó que

probablement és degut al baix nombre d’individus de la població (Frankham et al.,

2003). Donat l’alt nivell de variabilitat genètica i la baixa quantitat de desequilibri per

lligament trobat en A. nesiotes subsp. nesiotes, es pot dir que el tàxon no està

genèticament depauperat.

21

Pel que fa a les amenaces a les quals s’enfronten les poblacions aïllades de

característiques similars al tàxon estudiat, hi trobem la deriva genètica, l’envelliment i

pèrdua de vigor, l’activitat humana i factors ambientals estocàstics (Lesica & Allendorf,

1992). Segons els resultats trobats en el present treball les dues primeres amenaces

enumerades no semblen afectar directament a la població d’A. nesiotes subsp.

nesiotes ja que encara que la presència d’individus senescents és bastant abundant

(Fig. 6), no representen una majoria i en tot cas queda clara la seva capacitat

reproductiva i robustesa. En quant a les activitats humanes que es puguin dur a terme

a la Selvagem Pequena, la potencialment més perjudicial pel tàxon són les derivades

de les visites incontrolades a l’àrea protegida de les Salvatges Petita. Cal remarcar

que la Salvatge Petita només està habitada pels guardes del parc durant sis mesos a

l’any, coincidint amb la temporada alta (Serviço do Parque Natural da Madeira, 2004) i

que correspon amb el període en el qual l’estat de la mar permet la connexió amb

Madeira i amb la resta de l’arxipèlag. La resta de l’any, tot i que l’onatge sol fer

impossible el desembarcament a l’illa, s’hi han registrat visites furtives.

Però tot i que en termes biològics l’espècie pugui semblar viable, les poblacions petites

tenen més probabilitat de veure’s abocades a l’extinció degut a fluctuacions ambientals

estocàstiques (Goodman,1987). El seu aïllament, l’escàs nombre d’individus i les

característiques geològiques de l’illa la posen en una situació especialment fràgil a

factors ambientals estocàstics com poden ser esllavissades, incendis provocats per

llamps i, fins i tot, s’ha d’incloure el risc de tsunamis dins la llista d’amenaces (Løvholt

et al., 2008). De totes maneres, el factor ambiental que suposa el risc principal a la

Salvatge Petita i també a la població d’A. nesiotes subsp nesiotes és la pujada del

nivell del mar i, amb aquesta, l’increment de l’erosió que pateix i que gradualment

redueix la superfície emergida de l’illa (Moreira, 1991; Courchamp et al., 2014). Dins

aquest sistema insular, A. nesiotes subsp. nesiotes hi juga un paper important

començant pel fet que és una font d’aliment per als rèptils de l’illa que, alhora, són els

principals dispersadors de llavors (Nogales et al., 2007). A banda d’això les espesses

mates creixen sobre elles mateixes formant concavitats que serveixen de refugi i de

lloc de cria per a Calonectris diomedea subsp. borealis, que forma una important

colònia a l’arxipèlag (López-Pujol et al., 2013).

Actualment la IUCN Red List of Threatened Species inclou Asparagus nesiotes a nivell

específic com espècie EN PERILL [EN B2ab(ii,v)] (Santos Guerra et al., 2013). En

aquesta fitxa s’inclouen tant les poblacions de Fuerteventura, Lanzarote, la Graciosa

22

(corresponents a A. nesiotes subsp. purpurensis) com les de la Salvatge Petita

(corresponent a A. nesiotes subsp. nesiotes). Al mateix temps, la subspècie endèmica

de les Canàries està també catalogada com EN PERILL [EN B2ab(ii,iii,iv)] (Santana et

al., 2004). La singularitat d’ A. nesiotes subsp.nesiotes i el fet que actualment hi ha una

absència total de flux gènic entre els dos tàxons fa recomanable la catalogació apart

de l’estat actual d’A. nesiotes subsp. nesiotes.

Els criteris de la UICN per a establir les diferents categories d’amenaça dels taxons

son referents a tendència demogràfica, reducció de l’àrea de distribució o nombre total

d’individus (UICN, 2012). En la bibliografia consultada es parla sempre d’A. nesiotes

subsp. nesiotes com a tàxon raríssim (Sventenius, 1968), amb nombre reduït

d’exemplars (Pérez de Paz & Acebes Ginovés, 1978) o de menys de 50 individus i

formant una població estable (Jardim et al., 2008). Per tant, no es disposen de dades

per inferir que hi hagi una tendència demogràfica a la baixa, ni en nombre d’individus

ni en l’àrea que ocupa. Per tot això, amb les dades que disposem després de realitzar

aquest estudi, i seguint els criteris de la UICN, es pot establir que aquest tàxon no

entra dins classificació de PERILL CRITIC (CR) ja que només compleix un dels

subapartats del criteri B, referent a la distribució geogràfica: àrea d’ocupació menor a

10 km² i coneguda a una sola localitat (criteri Ba) (UICN, 2012). Amb les dades de les

quals disposem, la classificació UICN per a Asparagus nesiotes subsp.nesiotes és de

EN PERILL (EN) segons el criteri D: mida de la població estimada en menys de 250

individus madurs [EN D].

Per una altra banda, si tenim en compte que la subpoblació sud és clarament sensible

a factors d’estocasticitat ambiental donat el seu baix nombre d’individus veiem que el

tàxon es troba al llindar de la classificació CR d’acord amb el criteri de reducció d’àrea,

es requereix un seguiment de la població a mig o llarg termini per avaluar possibles

canvis en la classificació IUCN.

Amb els resultats demogràfics i genètics obtinguts amb aquest treball, juntament amb

les observacions realitzades al camp, ens permeten suggerir una sèrie de mesures per

la de la conservació del tàxon: (a) conservació de llavor ex situ en un banc de

germoplasma del major nombre d’individus possibles donada l’alta variabilitat genètica

observada, assegurant--se de incloure en el mostreig llavors dels 4 clúster genètics,

seria apropiat realitzar la conservació d’un segon estoc de llavors en un segon banc de

germoplasma com a mesura de seguretat; (b) realitzar un seguiment de l’evolució

demogràfica de la població, i (c) reforçar el control de la presència humana a l’illa.

23

5. CONCLUSIONS

• El cens d’Asparagus nesiotes subsp. nesiotes és de 97 individus reproductors a

la Salvatge Petita que conformen una única població.

• Els individus es distribueixen geogràficament en tres grups principals, als

vessants est i oest del Pico do Veado (45 i 50 individus respectivament) i un

grup de dos individus al sud de l’illa.

• Hi ha una alta variabilitat genètica, tots els individus estudiats són genets

diferents i no s’observa clonalitat.

• Els resultats de BAPS indiquen que la població es troba estructurada en quatre

clústers genètics sense segregació geogràfica.

• Les amenaces per a aquest tàxon són fonamentalment degudes a

l’estocasticitat ambiental i les activitats humanes.

• La classificació UICN per a A. nesiotes subsp. nesiotes segons els resultats

obtinguts és de EN PERILL segons el criteri D [EN D].

• Les mesures recomanades de conservació inclouen la preservació ex situ del

germoplasma en banc de llavors, seguiment demogràfic i control de visites a

l’illa

6. AGRAÏMENTS

En primer lloc vull donar les gràcies a la meva directora, Roser Vilatersana, per

tot el que he après amb ella, per la seva santa paciència i per no desesperar

massa amb mi. Sense ella aquest treball no hagués estat possible. També vull

agrair el suport rebut per part del jefe Jordi López i del Sergi Massó en la

realització d’aquest treball així com a les companyes de despatx i penúries, la

Sònia i la Deborah. Agrair també a l’Alfonso i la Núria i a la resta del personal

de l’IBB que m’han ajudat quan ho necessitava i pel bon tracte rebut. Dono

també les gràcies al meu tutor, José Blanco per la seva ajuda i la fe dipositada ,

al Jordi Carreras per l’ajuda amb ArcMap i a Sara Isabel Correia Freitas

(Serviço do Parque Natural da Madeira) i Nuno da Conceicao Gouveis Serralha

(Direção Regional de Florestas e Conservação da Natureza – Madeira) per

elaborar el mapa de corbes de nivel de les illes Salvatges. Agraïment especial

a la meva família pel seu suport constant i als amics que m’han fet costat quan

24

ho necessitava. No vull acabar sense agrair l’ajuda espiritual del Padre Pio i de

San Benito Menni així com del les relíquies paganes que hagin pogut intervenir

en que aquest treball arribés a bon port.

7. BIBLIOGRAFIA

Agapow, P. & Burt, A. (2001). Indices of multilocus linkage disequilibrium. Molecular

Ecology Notes 1: 101–102.

Albert, T.; Raspé, O. & Jacquemart, A. L. (2003). Clonal structure in Vaccinium

myrtillus L. revealed by RAPD and AFLP markers. International Journal of Plant

Sciences 164: 649–655.

APG II (2003). An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the

orders and families of flowering plants: APG II. Botanical Journal of the Linnean

Society 141: 399–436.

Bonin, A.; Ehrich, D. & Manel, S. (2007). Statistical analysis of amplified fragment

length polymorphism data: a toolbox for molecular ecologists and evolutionists.

Molecular Ecology 16: 3737–3758.

Bouxin, G. (2005). Ginkgo, a multivariate analysis package. Journal of Vegetation

Science 16: 355–359.

Bramwell, D.; Pérez de Paz, J. & Ortega, J. (1976). Studies in the flora of Macaronesia:

some chromosome numbers of flowering plants. Botánica Macaronésica 1: 9–16.

Bryant, D. & Moulton, V. (2004). Neighbor-net: an agglomerative method for the

construction of phylogenetic networks. Molecular Biology and Evolution 21: 255–265.

Corander, J.; Marttinen, P.; Sirén, J. & Tang, J. (2008). Enhanced Bayesian modelling

in BAPS software for learning genetic structures of populations. BMC Bioinformatics 9:

539.

25

Courchamp, F.; Hoffmann, B. D.; Russell, J. C.; Leclerc, C. & Bellard, C. (2014).

Climate change, sea-level rise, and conservation: keeping island biodiversity afloat.

Trends in Ecology and Evolution 29: 127–130.

Cowie, R. H. & Holland B. S. (2006). Dispersal is fundamental to biogeography and the

evolution of biodiversity on oceanic islands. Journal of Biogeography 33: 193–198.

Crawford, D. J.; Ruiz, E.; Stuessy, T. F.; Tepe, E.; Aqeveque, P.; Gonzalez, F.; Jensen;

R. J.; Anderson, G. J.; Bernardello, G.; Baeza, C. M.; Swenson, U. & Silva, M. (2001).

Allozyme diversity in endemic flowering plant species of the Juan Fernandez

Archipelago, Chile: ecological and historical factors with implications for conservation.

American Journal of Botany 88: 2195–2203.

Cronk, Q. C. B. (1997). Islands: stability, diversity, conservation. Biodiversity and

Conservation 6: 477–493.

De Cáceres, M.; Font, X.; García, R. & Oliva, F. (2003). VegAna, un paquete de

programas para la gestión y análisis de datos ecológicos. In: VII Congreso Nacional de

la Asociación Española de Ecología Terrestre, pp. 1484–1497. Barcelona.

Delaplane, K. S.; Mayer, D. R. & Mayer, D. F. (2000). Crop pollination by bees. Cabi

Publishing. Wallingford.

Dice, L. R. (1945). Measures of the amount of ecologic association between species.

Ecology 26: 297–302.

Doyle, J. J. & Doyle, J. L. (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:

13–15

Ehrich, D. (2006). AFLPdat: a collection of R functions for convenient handling of AFLP

data. Molecular Ecology Notes 6: 603–604.

Ellstrand, N. C. & Elam, D. R. (1993). Population genetic consequences of small

population size: implications for plant conservation. Annual Review of Ecology and

Systematics 24: 217–242.

26

Ersts, P. J. (2011) Geographic Distance Matrix Generator (version 1.2.3). American

Museum of Natural History, Center for Biodiversity and Conservation. New York.

Escaravage, N.; Questiau, S.; Pornon, A.; Doche, B. & Taberlet, P. (1998). Clonal

diversity in a Rhododendron ferrugineum L.(Ericaceae) population inferred from AFLP

markers. Molecular Ecology 7: 975–982.

ESRI (2011). ESRI ArcGIS Desktop: Release 10. Environmental Systems Research

Institute. Redlands.

Excoffier, L.; Laval, G. & Schneider, S. (2005). Arlequin (version 3.0): an integrated

software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics

Online 1: 47.

Excoffier, L.; Smouse, P. E. & Quattro, J. M. (1992). Analysis of molecular variance

inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human

mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: 479–491.

Fellows, I. (2012). Deducer: A data analysis GUI for R. Journal of Statistical Software

49: 1–15.

Fernández–Palacios, J. M.; de Nascimento, L.; Otto, R.; Delgado, J. D.; García-del-

Rey, E.; Arévalo, J. R. & Whittaker, R. J. (2011). A reconstruction of Palaeo-

Macaronesia, with particular reference to the long-term biogeography of the Atlantic

island laurel forests. Journal of Biogeography 38: 226–246.

Fox, J. (2005). The R commander: A basic–statistics graphical user interface to R.

Journal of Statistical Software 14: 1–42.

Frankham, R.; Ballou; J. D.; Briscoe, D. A. (2003). Introduction to conservation

genetics. Cambridge University Press. Cambridge.

Geldmacher, J.; Hoernle, K.; van den Bogaard, P.; Zankl, G. & Garbe-Schönberg, D.

(2001). Earlier history of the ≥ 70-Ma-old Canary hotspot based on the temporal and

geochemical evolution of the Selvagen Archipelago and neighboring seamounts in the

eastern North Atlantic. Journal of Volcanology and Geothermal Research 111: 55–87.

27

Goodman, D. (1987). Consideration of stochastic demography in the design and

management of biological reserves. Natural Resource Modelling 1: 205–223

Hansen, A. & Sunding, P. (1993). Flora of Macaronesia. Checklist of vascular plants. 4.

Revised edition. Sommerfeltia 17: 1–297.

Holsinger, K. E. & Lewis, P. O. (2003). HICKORY: A package for analysis of population

genetic data v1. 0. Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of

Connecticut. Storrs.

Houliston, G. J.; Dawson, M. I.; De Lange, P. J. & Heenan, P. B. (2012). Using AFLP

markers to inform population management of the endemic Chatham Island toetoe,

Austroderia turbaria (Poaceae). Pacific Conservation Biology 18: 33—40

Huson, D. H., & Bryant, D. (2006). Application of phylogenetic networks in evolutionary

studies. Molecular Biology and Evolution 23: 254–267.

Jardim, F.; Fernandes, F. & Carvalho, J. A. (2008). Asparagus nesiotes Svent. subsp.

nesiotes. In: Martín, J. L., Arechavaleta, M., Borges, P. A. V. & Faria, B. (eds.). Top

100. Las 100 especies amenazadas prioritarias de gestión en la región europea

biogeográfica de la Macaronesia, pp. 216–217. Consejería de Medio Ambiente y

Ordenación Territorial, Gobierno de Canarias. Las Palmas de Gran Canaria.

Kim, S. C.; Lee, C. & Santos-Guerra, A. (2005). Genetic analysis and conservation of

the endangered Canary Island woody sow-thistle, Sonchus gandogeri (Asteraceae).

Journal of Plant Research 118: 147–153.

Kim, S. C.; McGowen, M. R.; Lubinsky, P.; Barber, J. C.; Mort, M. E. & Santos-Guerra,

A. (2008). Timing and tempo of early and successive adaptive radiations in

Macaronesia. PLoS One 3: e2139.

Lê, S.; Josse, J. & Husson, F. (2008). FactoMineR: an R package for multivariate

analysis. Journal of Statistical Software 25: 1–18.

Lee, Y.; Kanno, Y. & Kameya, T. (1997). Phylogenetic relationships in the genus

Asparagus based on the restriction enzyme analysis of the chloroplast DNA. Breeding

Science 47: 375–378.

28

Lesica, P. & Allendorf, F. W. (1992). Are small populations of plants worth preserving?

Conservation Biology 6: 135–139.

López-Pujol, J.; Vilatersana, R. & Carvalho, J. A. (2013). E-Opinió núm. 29: Crònica

(il·lustrada) d’un viatge al paradís: expedició a les Illes Salvatges. Portal de biologia de

la conservació de plantes. Laboratori de Botànica, Facultat de Farmàcia, Universitat de

Barcelona. Barcelona. Consultat juliol 2014, a http://hdl.handle.net/2445/46386

Løvholt, F.; Pedersen, G. & Gisler, G. (2008). Oceanic propagation of a potential

tsunami from the La Palma Island. Journal of Geophysical Research: Oceans 113:

C09026.

Mantel, N. (1967). The detection of disease clustering and a generalized regression

approach. Cancer Research 27: 209–220.

Marrero, A. & Ramos, A. (1989). Chorologic-taxonomic comment of Asparagus

nesiotes Svent. (Liliaceae). Botánica Macaronésica 18: 5–26.

Martín, J. L.; Arechavaleta, M.; Borges, P. A. V. & Faria, B. (2008). Top 100. Las 100

especies amenazadas prioritarias de gestión en la región europea biogeográfica de la

Macaronesia. Consejería de Medio Ambiente y Ordenación Territorial, Gobierno de

Canarias. Las Palmas de Gran Canaria.

Médail, F. & Quézel, P. (1999). The phytogeographical significance of SW Morocco

compared to the Canary Islands. Plant Ecology 140: 221–244.

Meirmans, P. G. & Van Tienderen, P. H. (2004). GENOTYPE and GENODIVE: two

programs for the analysis of genetic diversity of asexual organisms. Molecular Ecology

Notes 4: 792–794.

Moreira, M. E. (1991). A elevação do nível do ocenao no litoral das Ilhas Selvagens.

Finisterra: Revista Portuguesa de Geografia 26: 140–149.

Mueller, U. G. & Wolfenbarge, L. L. (1999). AFLP genotyping and fingerprinting. Trends

in Ecology & Evolution 14: 389–394.

29

Nogales, M.; Padilla, D. P.; Nieves, C.; Illera, J. C., & Traveset, A. (2007). Secondary

seed dispersal systems, frugivorous lizards and predatory birds in insular volcanic

badlands. Journal of Ecology, 95: 1394–1403.

Nybom, H. (2004). Comparison of different nuclear DNA markers for estimating

intraspecific genetic diversity in plants. Molecular Ecology, 13: 1143–1155.

Paun, O. & Schönswetter, P. (2012). Amplified fragment length polymorphism: an

invaluable fingerprinting technique for genomic, transcriptomic, and epigenetic studies.

In: Sucher, N. J., Hennell, J. R. & Carles, M. C. (eds.). Plant DNA Fingerprinting and

Barcoding – Methods and Protocols, pp. 75–87. Humana Press. New York.

Pérez de Paz, P. L. & Acebes Ginovés, J. R. (1978). Las Islas Salvajes: Contribución

al conocimiento de su flora y vegetación. In: Contribución al estudio de la historia

natural de las Islas Salvajes. Mueso de Ciencias Naturales del Excmo. Cabildo Insular

de Sta. Cruz de Tenerife. Santa Cruz de Tenerife.

R Development Core Team (2012). R: A language and environment for statistical

computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna.

Ritsema, A. (2010). The Selvagens, forgotten Atlantic Islands. Lulu.com. Deventler.

Rohlf, F. J. (1997) NTSYS–Pc. Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System,

v. 1.80. Exeter Software. New York.

Santana, I.; Scholz, S. & Naranjo, J. (2004). Asparagus nesiotes subsp. purpurensis

Marrero Rodr. et Ramos. In: Bañares, A.; Blanca, G.; Güemes, J., Moreno, J. C. &

Ortíz, S. (eds.) Atlas y libro rojo de la flora vascular amenazada de España, pp. 612–

613. Dirección General para la Biodiversidad, Publicaciones del O. A. P. N. Madrid.

Santos Guerra, A.; Draper, D.; Magos, J.; Duarte, M. C.; Tavares, M. & Carvalho, M.

(2013). Asparagus nesiotes. In: The IUCN Red List of Threatened Species. Version

2014.2. Consultat el 2 de setembre 2014, a http://www.iucnredlist.org/details/176453/0.

Scrosati, R. (2002). An updated definition of genet applicable to clonal seaweeds,

bryophytes, and vascular plants. Basic and Applied Ecology 3: 97–99.

30

Serviço do Parque Natural da Madeira (2004). As Ilhas Selvagens. Serviço do Parque

Natural da Madeira, Funchal.

Sica, M.; Gamba, G.; Montieri, S.; Gaudio, L. & Aceto, S. (2005). ISSR markers show

differentiation among Italian populations of Asparagus acutifolius L. BMC Genetics 6:

17.

Soltis, P. S. & Soltis, D. E. (2000). The role of genetic and genomic attributes in the

success of polyploids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America 97: 7051–7057.

Sventenius, E. R. (1968). Plantae Macaronesienses novae vel minus cognitae. I. In:

Separatum Indices Seminum Horti Acclimatationis Plantarum Arautapensis, pp. 43-60.

Santa Cruz de Tenerife.

Tel-Zur, N.; Abbo, S.; Myslabodski, D. & Mizrahi, Y. (1999). Modified CTAB procedure

for DNA isolation from epiphytic cacti of the genera Hylocereus and Selenicereus

(Cactaceae). Plant Molecular Biology Reporter 17: 249–254.

UICN (2012). Categorías y Criterios de la Lista Roja de la UICN. Versión 3.1. Segona

edició. Comisión de la Supervivencia de Especies de la UICN, Unión Internacional

para la Conservación de la Naturaleza. Gland & Cambridge.

Vargas, P. (2007). Are Macaronesian islands refugia of relict plant lineages?: a

molecular survey. In: Weiss, S. & Ferrand, N. (eds). Phylogeography of Southern

European refugia, pp. 297–314. Springer. Dordrecht.

Vijay, N.; Sairkar, P.; Silawat, N.; Garg, R. K. & Mehrotra, N. N. (2009). Genetic

variability in Asparagus racemosus (Willd.) from Madhya Pradesh, India by random

amplified polymorphic DNA. African Journal of Biotechnology 8: 3135–3140.

Vos, P.; Hogers, R.; Bleeker, M.; Reijans, M.; Van de Lee, T.; Hornes, M. & Zabeau, M.

(1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23:

4407–4414.

ANNEXOS:

1. Representacions del PCoA obtingut amb Ginkgo (De Cáceres et al., 2003)

2. Cladograma obtingut amb UPGMA mitjançant NTSYSpc v.2.02j (Rohlf, 1997)

3. Fitxa per a Asparagus nesiotes subsp. nesiotes a Martin et al. (2008)

Annex 1:

Representació del PCoA per a les variables 1 i 2

Representació del PCoA per a les variables 1 i 3

Coefficient

0.800.84

0.880.92

0.96

A001

A123

A097

A002

A007

A031

A074

A141

A048

A112

A006

A083n

A009

A126

A096

A051

A063

A107

A138

A116

A004

A079n

A093

A139

A131

A095n

A115

A078n

A003

A086

A022

A005

A053

A057

A010

A035

A140

A060

A021

A094

A065

A067

A011

A089

A134

A013

A082

A104

A129

A105

A106

A108

A125

A120

A136

A071

A109

A072

A121

A130

A084

A085

A119

A058

A044

A073

A049

A111

A062

A066

A132

A114

A113

A008

A033

A027

A101

A028

A064

A088

A061n

A137

A017

A025

A124

A030

A032

A024

A117

A036

A081n

A092

A075n

Annex 2

CA

NA

RIA

S

Distribución Distribuição

Subespecie endémica de Salvaje Pequeña.

Subespécie endémica da Selvagem Pequena.

Hábitat Habitat

Matorrales termomediterráneos pre-desérticos.

Matos termo-mediterrânicos pré-desérticos.

Factores y riesgos naturales que pueden agravar su situaciónFactores e riscos naturais que podem agravar a sua situação

Sequías. Tempestades y vendavales.

Secas. Tempestades e vendavais.

Factores limitantes para la recuperación de la especieFactores limitantes para a recuperação da espécie

Baja densidad poblacional. Aislamiento de subpoblaciones/indivi-

duos. Procesos de endogamia o empobrecimiento genético. Baja

tasa de crecimiento poblacional. Super�cie de hábitat reducida.

Baixa densidade populacional. Isolamento de subpopulações/indiví-

duos. Processos de endogamia ou empobrecimento genético. Baixa

taxa de crescimento populacional. Superfície de habitat reduzida.

Acciones de conservación propuestasAcções de conservação propostas

Campañas de concienciación social. Mantenimiento y conservación

del hábitat. (Re)introducción de nuevas (sub)poblaciones.

Campanhas de consciencialização social. Manutenção e conservação

do habitat. (Re)introdução de novas (sub)populações.

Estudios e investigacionesEstudos e investigação

Biología y ecología. Genética. Dinámica de poblaciones.

Biologia e Ecologia. Genética. Dinâmica de populações.

Estatus de protección Estatuto de protecção

Directiva Hábitat: -

Directiva Habitats: -

Convenio de Berna: -

Convenção de Berna: -

El Hierro La Palma La Gomera Tenerife Gran Canaria Fuerteventura Lanzarote

216216

Distribución mundialDistribuição mundial

Endemismo de Madeira

Endemismo da Madeira

Singularidad genéticaSingularidade genética

Endemismo insular

Endemismo insular

Tamaño poblacional (individuos)Tamanho populacional (indivíduos)

< 50 50 - 250 250 - 1.000 > 1.000

Evolución poblacionalEvolução populacional

Tamaño: Estable Tamanho: Estável

Área distrib.: Estable Área distrib.: Estável

Tendencia poblacionalTendência populacional

Tamaño: Estable Tamanho: Estável

Área distrib.: Estable Área distrib.: Estável

División Divisão Spermatophyta

Clase Classe Liliopsida

Orden Ordem Liliales

Familia Família Liliaceae

Autor R. Jardim, F. Fernandes & J. A. Carvalho

Asparagus nesiotes Svent. subsp. nesiotes