Consenso Arrays

Consenso para la Implementacin de los Arrays [CGH y SNP-arrays] en la Gentica Clnica

2012 del contenido: Instituto Roche. Eucalipto, 33. 28016-Madrid www.institutoroche.es 2012 de esta edicin: Drug Farma, S. L. Antonio Lpez, 249 1. planta. 28041-Madrid

Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicacin puede ser reproducida, almacenada o transmitida en cualquier forma ni por cualquier procedimiento electrnico, mecnico, de fotocopia de registro o de otro tipo, sin el permiso previo de los autores.

ISBN: 978-84-15010-13-5D. L.: M-10474-2012

3GRUPO DE TRABAJO

COORDINADORES

Juan C. Cigudosa GarcaJefe de Citogentica Molecular,

Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO). CIBERER-

Centro de Investigacin Biomdica en Red de Enfermedades Raras. Madrid

Pablo Lapunzina BadaDirector-Coordinador del Instituto

de Gentica Mdica y Molecular (INGEMM). IDIPaz-Hospital Universitario La Paz-CIBERER-

Centro de Investigacin Biomdica en Red de Enfermedades Raras. Madrid

MIEMBROS DEL GRUPO

Guillermo Antiolo GilJefe de Servicio de Obstetricia y Ginecologa.

Director de la Unidad de Gestin Clnica de Gentica, Reproduccin y Medicina Fetal. Profesor Titular de Ginecologa y Obstetricia. Unidad de Gestin

Clnica de Gentica, Reproduccin y Medicina Fetal. Hospital Universitario Virgen del Roco. Sevilla

Carmen Ayuso GarcaJefa de Servicio de Gentica, Instituto

de Investigacin Sanitaria Fundacin Jimnez Daz. CIBERER ISCIII. Madrid

Pilar Nicols JimnezInvestigadora Permanente, Ctedra Interuniversitaria

de Derecho y Genoma Humano. Universidad de Deusto / Euskal Herriko Uniberstitate. Bilbao

Francisco Palau MartnezProfesor de Investigacin, Unidad de Gentica y Medicina Molecular. Instituto de Biomedicina de Valencia, CSIC. Director Cientfi co, CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER). Valencia

Alberto Plaja Rustein Responsable de Citogentica Molecular, Programa

de Medicina Molecular. Hospital Universitari Vall dHebron. Institut de Recerca (VHIR).

Universitat Autnoma de Barcelona. Barcelona

Manuel de la Puente AndrsDirector Gerente, Hospital Universitario

de Fuenlabrada. Fuenlabrada

Feliciano J. Ramos FuentesCatedrtico de Pediatra, Unidad de Gentica Clnica, Hospital Clnico Universitario Lozano Blesa. Facultad de Medicina, Universidad

de Zaragoza. Zaragoza

Pedro Serrano AguilarJefe de Servicio de Evaluacin y Planifi cacin. Jefe de Grupo y Coordinador del Programa

de Evaluacin de Servicios de Salud en CIBERESP. Servicio de Evaluacin

del Servicio Canario de la Salud, Consejera de Sanidad del Gobierno de Canarias. CIBER Epidemiologa y Salud Pblica (CIBERESP). Santa Cruz de Tenerife

Isabel Tejada MnguezResponsable del Laboratorio de Gentica

Molecular, Servicio de Bioqumica. Responsable de la Unidad de Gentica del Instituto

BIO-CRUCES. Hospital de Cruces. Barakaldo

4ASESOR EXTERNO

ngel Carracedo lvarezDirector de la Fundacin Pblica Gallega de Medicina Genmica-Servicio Gallego de Salud.

CIBERER-Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela

EXPERTOS INVITADOS A LA CONFERENCIA DE CONSENSO

Llus Armengol i DulcetDirector Cientfico, Qgenomics. Barcelona

Mara Jos Calasanz AbinzanoCatedrtica de Gentica / Directora del Servicio de Anlisis Genticos UN. Servicio de Anlisis

Genticos / Departamento de Gentica Universidad de Navarra (UN). Pamplona

Daniel Callejo VelascoEvaluacin Econmica de Tecnologas Sanitarias. Unidad de Evaluacin de Tecnologas Sanitarias

(UETS) Agencia Lan Entralgo. Consejera de Sanidad de la Comunidad de Madrid. Madrid

Joaqun Dopazo BlzquezDirector de Departamento, Departamento de Bioinformtica, Centro de Investigacin

Prncipe Felipe. Valencia

Montserrat Mil RecasensJefa de Seccin de Gentica Molecular,

Servicio de Bioqumica y Gentica Molecular, Hospital Clnic de Barcelona. Barcelona

Miguel Moreno MuozProfesor Ayudante Doctor, Departamento

de Filosofa II. Universidad de Granada. Granada

Julin Nevado BlancoResponsable del rea de Genmica

Estructural y Funcional, INGEMM (Instituto de Gentica Mdica y Molecular)-

IdiPAZ (Hospital Universitario La Paz. Imsalud). Universidad Autnoma

de Madrid, CIBERER. Madrid

Sergio Romeo MalandaProfesor Ayudante Doctor de Derecho Penal, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria.

Las Palmas de Gran Canaria

Javier Snchez CaroResponsable del rea de Biotica y Derecho

Sanitario, Consejera de Sanidad. Comunidad de Madrid. Madrid

Javier Suela RubioDirector Tcnico, NIMGenetics. Madrid

Miguel Urioste AzcorraInvestigador Gentica Humana,

Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO). Investigador, Centro de Investigacin Biomdica

en Red de Enfermedades Raras (CIBERER). Madrid

COLABORADORES

Lidia Garca PrezTcnica de Investigacin, Fundacin

Canaria de Investigacin y Salud FUNCIS; CIBER Epidemiologa y Salud Pblica (CIBERESP). Santa Cruz de Tenerife

Juan Manuel Ramos Goi Tcnico de Investigacin, Fundacin

Canaria de Investigacin y Salud FUNCIS; CIBER Epidemiologa y Salud Pblica (CIBERESP). Santa Cruz de Tenerife

5Los CGH-arrays (Comparative Genomic Hybridization Arrays) y los SNP-arrays (Single Nucleotide Polymorphism Arrays) son potentes e innovadoras tecnologas cuya implanta-cin est permitiendo un cambio extraordinario en el diagnstico de distintas patologas, especialmente en el mbito del diagnstico prenatal y en el diagnstico e investigacin del retraso mental.

La incorporacin de estos nuevos recursos diagnsticos es ya una realidad en nuestro entorno, ms an cuando ya se empieza a conocer que son ms informativos en tr-minos de resolucin (casi diez veces ms) que las tecnologas convencionales y que actualmente ya son coste-efi cientes. Gracias a estos nuevos test no solo se conseguirn mejores diagnsticos (ms efectivos y tempranos) en los sndromes posnatales, sino que tambin se favorecer el diagnstico de patologas que no se detectaban anteriormente en Medicina Prenatal.

En estos momentos se est comenzando a implementar estos recursos en la rutina cl-nica, aunque no sin ciertos obstculos. Las difi cultades derivan fundamentalmente del cambio de paradigma que supone su implementacin y, en parte, del coste que lleva aparejado el cambio de tecnologa. Adems, hasta ahora exista un vaco cientfi co y legal en lo que respecta a la recomendacin y la regulacin, respectivamente, del uso de las tecnologas de microarrays en Espaa.

De ah el inters y la necesidad de mejorar el conocimiento, difusin y generalizacin de estas tecnologas de diagnstico genmico, un objetivo que se ha pretendido cubrir con la creacin de un grupo multidisciplinar de expertos. As surgi el Grupo para el Consen-so para la Implementacin de los Arrays [CGH y SNP-arrays] en la Gentica Clnica, que ha sido promovido por el Instituto Roche.

El Grupo naci a partir de una idea original del Dr. Juan C. Cigudosa, jefe del Laboratorio de Citogentica Molecular del Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO) y del equipo del Instituto Roche, a la que se sum inmediatamente el Dr. Pablo D. Lapun-zina, coordinador responsable del Instituto de Gentica Mdica y Molecular del Hospital Universitario La Paz (Madrid). Dando un paso ms, este Grupo de Trabajo se plante como principal actividad la redaccin de un documento que analizase objetivamente las evidencias existentes en este mbito desde el punto de vista cientfi co, tecnolgico y de coste-efectividad y que consensuase los puntos de incertidumbre a travs de la expe-

PRESENTACIN

6Consenso para la Implementacin de los Arrays [CGH y SNP-arrays] en la Gentica Clnica

riencia propia de los miembros del Grupo y de otros expertos que han participado en los grupos de discusin. Fruto de este trabajo es este documento que pretende aportar una visin comn y unas recomendaciones tiles sobre la utilizacin de los CGH-arrays y SNP-arrays en el diagnstico prenatal y en el diagnstico e investigacin clnica en sndromes posnatales.

El objetivo general de este proyecto ha sido confeccionar un documento sobre el uso, aplicacin e implementacin de esta tecnologa en medicina, que sirva para orientar a los profesionales en el buen uso de la misma, en las indicaciones correctas y con los contro-les de calidad apropiados. Esto tambin repercutir en un mejor diagnstico y tratamiento de los pacientes, lo que sin duda contribuir a mejorar la situacin de las familias.

Sin lugar a dudas, se ha efectuado un enorme y provechoso esfuerzo por discutir los pros y los contras de estas tecnologas, de su aplicacin clnica; por evaluar el impacto sociosanitario de estas aplicaciones, y por estudiar las posibles repercusiones ticas y jurdicas derivadas de incorporar estas tecnologas genmicas al arsenal de recursos de diagnstico gentico y clnico. As ha sido posible elaborar un conjunto de recomenda-ciones sobre estos temas que, estoy convencido, sern extraordinariamente tiles tanto para el personal sanitario y asistencial como para los responsables de la gestin sanitaria que regula esa atencin.

El trabajo del Grupo y el documento de consenso que se ha redactado abordan distin-tos aspectos de crucial importancia, como la evaluacin tecnolgica y de laboratorio, la aplicabilidad clnica, el marco legal y tico, la epidemiologa del retraso mental y la orga-nizacin de la atencin sanitaria de estas enfermedades, y la evaluacin econmica. De indudable valor son las recomendaciones finales que formulan los expertos y que tienen por objeto facilitar y optimizar la aplicacin clnica de los CGH-arrays en el diagnstico gentico; de esta forma se sintetizan consejos prcticos que deben seguir los servicios o centros de gentica que ofrezcan tecnologas genmicas.

Junto a los doctores Juan Cruz Cigudosa y Pablo Lapunzina, forman actualmente parte del Grupo para el Consenso relevantes cientficos, clnicos y profesionales de otras reas afines que, con su experiencia, nimo, esfuerzo y dedicacin han hecho posible este magno proyecto. Destaca especialmente la labor que ha llevado a cabo como asesor ex-terno ngel Carracedo, director de la Fundacin Pblica Gallega de Medicina Genmica-Servicio Gallego de Salud CIBERER-Universidad de Santiago de Compostela.

A todos ellos y al resto de personas que han colaborado en la puesta en marcha del Grupo para el Consenso y en la elaboracin de este documento de consenso les doy mi ms sincera enhorabuena y mi agradecimiento personal. Tan solo su calidad personal supera su excelencia profesional.

Jaime del BarrioDirector General del Instituto Roche

7NDICE

INTRODUCCIN 13Justifi cacin del proyecto 13

Objetivo 13

METODOLOGA 15

1. REA DE EVALUACIN TECNOLGICA Y DE LABORATORIO 17 1.1. Incorporacin de la genmica al diagnstico gentico:

de la hibridacin genmica comparada a los microarrays de CGH 17

1.2. Tipos y funcionalidad de los array-CGH 20 1.2.1. Microarrays de BAC 20 1.2.2. Microarrays de oligonucletidos 21 1.2.3. Microarrays de SNP 23 1.3. Situacin actual de la tecnologa: diseos disponibles,

fabricacin interna, obtencin de marcado CE (conformidad europea) 23

1.3.1. Los microarrays de fabricacin propia 23 1.3.2. Los microarrays de fabricacin industrial (comerciales) 24 1.3.3. Los microarrays de diseo original y fabricacin comercial

(microarrays personalizados o customizados) 24

1.3.4. La resolucin terica y real de un microarray 24 1.3.5. Marcaje CE para el empleo de los arrays-CGH en diagnstico clnico 26 1.4. Anlisis funcional de tecnologa 27 1.4.1. Ventajas y benefi cios de los microarrays 27 1.4.2. Comparativa con otros mtodos: cariotipo, FISH, qF-PCR, SKY

(cariotipo espectral multicolor), MLPA 28

8Consenso para la Implementacin de los Arrays [CGH y SNP-arrays] en la Gentica Clnica

1.4.2.1. Cariotipo 28 1.4.2.2. FISH 29 1.4.2.3. FISH y qF-PCR para estudio de aneuploidas 29 1.4.2.4. SKY o M-FISH (multi-FISH) 30 1.4.2.5. MLPA 30 1.4.3. Limitaciones del array-CGH 30 1.4.4. Beneficios y usos potenciales 32 1.5. Requerimientos tcnicos y de funcionamiento profesional para la realizacin

de experimentos genmicos y su aplicacin al diagnstico 33

1.5.1. Requerimientos tcnicos y profesionales 33 1.5.2. Requerimientos legales 34 1.5.2.1. Licencia de Actividad Sanitaria 34 1.5.2.2. Acreditacin UNE-EN-ISO 15189 34 1.5.2.3. Controles de calidad externos e intercomparaciones 35 1.6. Recomendaciones tcnicas y profesionales 35 1.7. Bibliografa 37

2. REA DE APLICACIN CLNICA 41 2.1. Introduccin 41 2.2. Indicaciones ms comunes de uso de los arrays-CGH 42 2.2.1. Poblacin de pacientes en la que aplicar los arrays-CGH 42 2.2.1.1. Retraso mental, trastornos del aprendizaje, autismo

y discapacidad intelectual 42

2.2.1.2. Retraso mental o discapacidad intelectual grave o severa (RMS) 43 2.2.1.3. Retraso mental leve/moderado (RMLM) 44 2.2.1.4. Etiologa del RM/DI 44 2.2.1.5. Causas genticas de RM/DI 44 2.2.1.6. Sndromes genticos clnicamente reconocibles 45 2.2.1.7. Pacientes con trastornos de la fertilidad, esterilidad

y/o con abortos reiterados 45

2.2.1.8. Pacientes con talla baja 47 2.2.1.9. Pacientes con patologas especficas: personalizacin de arrays 47 2.2.2. Diagnstico prenatal 47 2.2.3. Hemato-Oncologa 49 2.2.4. Diagnstico preimplantacional, clulas mesenquimales y terapia celular 50 2.3. Protocolo mnimo de evaluacin de un paciente antes de la realizacin

de un array-CGH 51

ndice

9

2.3.1. Gentica clnica posnatal 51 2.3.1.1. Pacientes con retraso mental, trastornos del espectro autista

y/o anomalas congnitas mltiples 51

2.3.1.2. Sndromes genticos clnicamente reconocibles 52 2.3.1.3. Pacientes con trastornos de la fertilidad, esterilidad

y/o con abortos frecuentes 52

2.3.1.4. Pacientes con talla baja 53 2.3.1.5. Pacientes con patologas especficas o dentro de un grupo

especfico de patologas 53

2.3.2. Diagnstico prenatal 53 2.3.3. Onco-Hematologa 53 2.3.4. Diagnstico preimplantacional, clulas mesenquimales y terapia celular 54 2.4. Bases de datos 54 2.4.1. Bases de datos de utilidad para el anlisis e interpretacin

de los arrays-CGH: OMIM, UCSC, Decipher 54

2.4.1.1. OMIM 54 2.4.1.2. UCSC 54 2.4.1.3. Decipher 55 2.4.2. Bases de datos de variantes genmicas 55 2.4.2.1. Database of Genomic Variants 55 2.4.2.2. Ensembl 56 2.4.2.3. Genecards and GeneReviews 56 2.4.3. Desarrollo de una base de datos de CNV a travs

de los Institutos Nacionales de la Salud de los EE. UU. 56

2.5. Nomenclatura de los arrays. Variantes normales y patognicas. Plataformas de arrays-CGH para el uso clnico-asistencial 58

2.5.1. Evaluacin de la patogenicidad de una CNV 58 2.5.1.1. Duplicaciones segmentarias 58 2.5.1.2. Clasificacin de las variantes en los arrays-CGH 58 2.5.2. Nomenclatura de los arrays-CGH. Sistema ISCN 60 2.5.2.1. Algunos ejemplos sobre informes 60 2.5.3. Los informes de arrays 61 2.5.3.1. Informacin mnima que debe contener un informe clnico de arrays 61 2.5.3.2. Ejemplo de informe tipo de un array-CGH 61 2.5.4. Comparacin de plataformas de uso clnico de los arrays-CGH 61 2.5.5. Recomendaciones para la cobertura de los arrays-CGH y su resolucin 63 2.5.6. Impacto de los reordenamientos equilibrados y del mosaicismo

de bajo porcentaje en la sensibilidad clnica de los arrays-CGH 64

10


2.6. Impacto clnico inmediato y a largo plazo de la implementacin de los arrays-CGH 65

2.6.1. Resultados comparativos entre el cariotipo y los arrays-CGH 65 2.6.2. Impacto en el diagnstico clnico inmediato de los arrays-CGH 66 2.7. Recomendaciones clnicas 69 2.8. Bibliografa 70

3. MARCO LEGAL Y TICO 77 3.1. Introduccin: razones para una atencin especial desde

el punto de vista jurdico y tico a la tecnologa de los microarrays de CGH 77

3.1.1. La dificultad en la interpretacin de los resultados de las pruebas 77 3.1.2. Marco general tico y legal 78 3.2. Implicaciones para los profesionales y los pacientes. Principios generales 81

3.2.1. Garantas de equidad en el acceso a los anlisis mediante microarrays de CGH 81

3.2.2. Garantas en el proceso de informacin y asesoramiento 81 3.2.3. Garantas en la custodia y gestin de los datos genticos

personales obtenidos 82

3.3. Rgimen normativo 82 3.3.1. Diagnstico e investigacin 82 3.3.2. El proceso del consejo gentico. Importancia particular

en el diagnstico con microarrays de CGH 85

3.3.3. Criterios de calidad de los centros 86 3.3.4. Los profesionales implicados 87 3.3.5. Contenido mnimo de la informacin que debe recibir el paciente

antes del estudio 88

3.4. Cuestiones particulares 89 3.4.1. Diagnstico preimplantatorio 89 3.4.2. Diagnstico prenatal. LIB y Ley Orgnica 2/2010, de 3 de marzo,

de salud sexual y reproductiva y de la interrupcin voluntaria del embarazo 91

3.4.3. Diagnstico de menores 92 3.4.4. Diagnstico de personas sin capacidad para consentir 93 3.4.5. Utilizacin de muestras y datos de fallecidos 94 3.5. Recomendaciones legales y ticas 95 3.6. Bibliografa 97

ndice

11

4. EPIDEMIOLOGA Y SALUD PBLICA. DESARROLLO, APROBACIN, FINANCIACIN, ORGANIZACIN Y USO DE LAS PRUEBAS DE DIAGNSTICO GENTICO DESDE LA PERSPECTIVA DE SALUD PBLICA 101

4.1. Introduccin 101 4.2. Epidemiologa del retraso mental o discapacidad intelectual (RM/DI)

y otras condiciones asociadas 102

4.2.1. Definiciones y criterios diagnsticos 102 4.2.2. Bsqueda de informacin y limitaciones de los hallazgos 103 4.2.3. Prevalencia global del RM/DI 103 4.2.4. El RM/DI en los trastornos del espectro autista 104 4.3. Incorporacin y financiacin de las pruebas de diagnstico y anlisis gentico 105

4.4. Planificacin de los nuevos Servicios de Diagnstico Gentico Molecular 108 4.5. El problema de las instituciones en Espaa 110 4.6. Polticas regulatorias sobre las pruebas genticas en Espaa

y en la Unin Europea (UE) 111

4.7. Instrumentos para guiar las decisiones polticas y clnicas 114 4.8. Aspectos ticos de la epidemiologa gentica 115 4.9. Aspectos sociales y familiares relacionados con las pruebas

de diagnstico gentico 117

4.10. Recomendaciones 118 4.11. Bibliografa 119

5. REA DE EVALUACIN ECONMICA: REVISIN SISTEMTICA DE COSTE-EFECTIVIDAD 123

5.1. Introduccin 123 5.2. Revisin sistemtica de evaluaciones econmicas 124 5.2.1. Material y mtodo 124 5.2.2. Resultados 125 5.2.3. Otras revisiones de evaluaciones econmicas identificadas 131 5.3. Consideraciones metodolgicas para la evaluacin econmica

de las tecnologas basadas en microarrays de CGH 132

5.3.1. La eleccin de la medida de resultado 132 5.3.2. Los costes 134 5.3.3. Otras cuestiones metodolgicas 134 5.4. Conclusiones y recomendaciones 135 5.5. Bibliografa 136

12


6. APLICACIN AL ESTUDIO DE COSTES EN UN MBITO HOSPITALARIO 141

6.1. Introduccin. Razones para realizar un estudio de costes 141 6.2. Campo de aplicacin del estudio 142 6.2.1. Campo de aplicacin de los arrays-CGH 142 6.2.2. Tipo de arrays-CGH 142 6.2.3. Costes de personal y amortizacin del aparataje 143 6.2.4. Tasas de deteccin y tcnicas de confirmacin requeridas 143 6.3. Evaluacin del coste econmico de las tcnicas de citogentica

convencional, FISH, MLPA y array-CGH 144

6.3.1. Citogentica convencional 145 6.3.2. FISH 146 6.3.3. MLPA 147 6.3.4. Arrays-CGH 148 6.4. Conclusiones 149 6.5. Recomendaciones 152 6.6. Bibliografa 152

RECOMENDACIONES SOBRE EL USO CLNICO DE LOS ARRAYS-CGH 155

ANEXO I. ACREDITACIN DE CENTROS, SERVICIOS Y ESTABLECIMIENTOS SANITARIOS 163

NDICE DE TRMINOS 167

NDICE DE ABREVIATURAS 177

13

JUSTIFICACIN DEL PROYECTO

Los microarrays de CGH (arrays-CGH) y los microarrays de SNP (SNP arrays) constitu-yen una nueva tecnologa con un potencial tal que los expertos creen inevitable que se constituya en una herramienta clave en el diagnstico de distintas patologas en un amplio espectro de reas clnicas.

La tecnologa de array-CGH permite detectar cambios en el nmero de copias a travs de todo el genoma con alta resolucin y con rapidez, y puede, adems, ser implementada de forma automatizada en plataformas de alto rendimiento.

Una aplicacin importante de esta tecnologa es la investigacin de amplifi caciones, de-leciones y reordenamientos cromosmicos, que pueden ser factores etiolgicos en el retraso mental, en la discapacidad intelectual y/o en el trastorno del aprendizaje, condi-ciones que representan un problema importante de salud pblica, y en los que la etio-loga sigue siendo desconocida en una gran proporcin de casos. Adems, son una herramienta de gran utilidad en el estudio de trastornos del espectro autista y/o anomalas congnitas mltiples.

Dadas las caractersticas y el potencial de esta nueva tecnologa, se ha constituido un Grupo de Trabajo para evaluar y consensuar la aplicacin de estas herramientas gen-micas en el diagnstico prenatal y en el diagnstico e investigacin clnica en sndromes posnatales.

OBJETIVO

El objetivo general de este proyecto es confeccionar un documento sobre el uso, apli-cacin e implementacin de los arrays-CGH y los SNP arrays en el mbito clnico que sirva para orientar a los profesionales en su uso adecuado, y en el establecimiento de las indicaciones correctas y de los controles de calidad apropiados.

Este objetivo tambin repercutir en un mejor diagnstico y tratamiento de los pacientes, lo que sin duda contribuir a mejorar la situacin de las familias, a llegar a un diagnstico de su enfermedad, a mejorar el acceso a la educacin cuando hay necesidades espe-ciales y a tener acceso a grupos de soporte y, fi nalmente, a llevar a cabo una planifi cacin reproductiva.

INTRODUCCIN

14


Objetivos especficos

1. Anlisis de la tecnologa en los distintos mbitos de aplicacin. Ventajas y limitacio-nes de la tcnica, comparacin con otros mtodos diagnsticos y entre diferentes plataformas. Anlisis de la situacin actual de los laboratorios que disponen de dicha tcnica y requerimientos mnimos consensuados (espacio, personal, plataformas, clones, expertise). Control de calidad (directrices ECA-European Cytogeneticists Association).

2. Anlisis de la situacin actual de la prctica clnica y de los protocolos en distintos centros. Recomendaciones para su uso en las diferentes situaciones e indicaciones (prenatal/posnatal, sndromes conocidos y en investigacin). Propuesta de circuito paciente y protocolos. Bases de datos: recomendaciones de utilizacin y propuesta para estandarizar caractersticas fenotpicas. Consejo gentico.

3. Marco legal y tico de su potencial aplicacin tanto en diagnstico prenatal como en sndromes posnatales.

4. Epidemiologa y Salud Pblica. Anlisis desde el punto de vista de salud pblica. Evaluacin, regulacin y financiacin de las nuevas pruebas de diagnstico gentico y las posibles alternativas organizativas y de acreditacin.

5. Evaluacin econmica de la tecnologa. Revisin de las pruebas de coste efectividad de los arrays-CGH como tecnologa alternativa al diagnstico gentico y anlisis de las particularidades de la evaluacin econmica en este campo.

6. Aplicacin al estudio de costes en un mbito hospitalario. Evolucin del incremento de costes derivado de la sustitucin del cariotipo convencional y otras pruebas com-plementarias, y anlisis de si el incremento de diagnsticos justifica su utilizacin.

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Partiendo de los objetivos de este documento, la metodologa de elaboracin se plante siguiendo las normas y directrices propias de este tipo de documentos, es decir, trabajo multidisciplinario, coordinado, repartido por reas y consensuado en reunin de expertos (conferencia de consenso).

El trabajo se inici con dos reuniones, una de los coordinadores para establecer las lneas generales del proyecto, y posteriormente otra de estos con el grupo de trabajo en la que se establecieron cinco bloques temticos o mesas de trabajo, responsabilizndose del desa-rrollo de cada uno de los temas los miembros de dicho grupo de trabajo y algunos colabo-radores invitados a participar en razn de su experiencia en aspectos concretos a abordar.

Los temas, elaborados a partir de la revisin de la literatura y la experiencia profesional de los expertos, se circularon y discutieron entre todo el grupo, y el resultado fi nal de esta labor fue la documentacin que se present para el consenso.

A continuacin, se propuso una seleccin de expertos, y de cara a la reunin de con-senso se constituyeron tres grupos de trabajo que habran de discutir las ponencias y elaborar las correspondientes conclusiones: Grupo 1: Tecnologa y legislacin. Grupo 2: Clnica. Grupo 3: Salud pblica, economa y planifi cacin.

Cada uno de estos grupos estaba formado por, al menos, un miembro del grupo de tra-bajo y expertos invitados de las diferentes reas a abordar. Para facilitar su participacin, todos los asistentes a la reunin de consenso recibieron, previamente a la reunin, la documentacin elaborada por el comit.

La reunin de consenso (Madrid, 28 de junio 2011) se estructur en tres partes: Sesin plenaria, cuyo objetivo era realizar una breve presentacin de los aspectos fun-

damentales de cada uno de los temas. Grupos de trabajo: discusin de los temas y establecimiento de conclusiones. Sesin plenaria: presentacin y discusin de las conclusiones de cada grupo.

De esta manera, durante la reunin todos los participantes pudieron contribuir activamen-te a la discusin y al consenso defi nitivo basado en el trabajo de las ponencias.

Tras este proceso, los coordinadores revisaron el documento generado y este se someti de nuevo a los miembros del comit de expertos y a un revisor externo para su redaccin fi nal, versin que constituye el contenido de esta gua.

METODOLOGA

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1. REA DE EVALUACIN TECNOLGICA Y DE LABORATORIO

1.1. IncorporacIn de la GenmIca al dIaGnstIco GentIco: de la HIbrIdacIn GenmIca comparada a los microarrays de cGH

En los ltimos aos las herramientas de anlisis gentico han sufrido una revolucin tc-nica comparable a la incorporacin del microscopio en los laboratorios. Han aparecido sistemas de anlisis genmico masivo que permiten analizar en un solo experimento el estado de miles de genes. Es decir, estudiar ahora la relacin gen-enfermedad no se basa en analizar un nico gen candidato y sus efectos, sino en analizar el comportamien-to de miles de genes de forma simultnea. Estos sistemas, denominados genricamente como matrices, arrays, microarrays o biochips, estn cambiando nuestra forma de plan-tear problemas y extraer conclusiones de los experimentos y anlisis, ya que nos ofrecen una foto compleja del conjunto del genoma. Este conjunto de datos sobre el fenotipo (los caracteres que vemos) y el genotipo (la disposicin exacta del contenido gentico), analizados de forma sistemtica mediante herramientas de anlisis masivo, constituye el cuerpo esencial de lo que denominamos Genmica. La Genmica, por tanto, intenta proporcionar a los investigadores en biologa el equivalente a la tabla peridica de los ele-mentos, es decir, un inventario de todos los genes que contribuyen y se coordinan para explicar la existencia y funcionalidad de cualquier ser vivo. Para ser efectivo, este inven-tario tiene que estar asociado a un sistema de clasificacin que identifique subconjuntos de genes que actan de forma coordinada para conformar el fenotipo del individuo.

Sin duda, la mayor contribucin de los estudios con microarrays reside en la taxono-ma de las enfermedades. Clasificar un determinado fenotipo (un sntoma, un conjunto de sntomas en forma de sndrome, un tumor especfico, etc.) con nombre y apellidos, de la forma menos ambigua posible, permite ajustar el diagnstico y el tratamiento casi de forma individual, lo que es la base, la piedra angular, de la medicina individualizada. Sin embargo, realizar una filiacin o llegar de manera adecuada al diagnstico de un caso real depende de muchas variables: las circunstancias de recogida de la muestra (hospital, laboratorio), el rigor en la descripcin inicial de todas las condiciones (anamnesis, datos de laboratorio), la disponibilidad de herramientas de diagnstico adecuadas y, por ltimo, la experiencia del profesional. Conjugar to-dos estos elementos tendra que tener como final el desarrollo de una clasificacin de las enfermedades que pretenda ser universal y efectiva.

El diagnstico gentico, basado fundamentalmente en la citogentica y en la genti-ca molecular, es una pieza fundamental en la prctica clnica asistencial moderna. As, por ejemplo, las alteraciones genticas que ocurren en forma de prdida o ganancia de material gentico (deleciones y duplicaciones o amplificaciones, respectivamente),

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localizadas en regiones concretas en el genoma, son una posible causa de mltiples enfermedades, como el cncer (1) o los sndromes con discapacidad intelectual y las malformaciones (2), entre muchos otros. Estas alteraciones son analizadas de una mane-ra rutinaria en los laboratorios de gentica clnica, utilizando para ello tcnicas convencio-nales, como el cariotipo (3), la hibridacin in situ fluorescente (FISH, del ingls fluorescent in situ hybridization) (4) o tcnicas de biologa molecular como la amplificacin de sondas por multiplex dependiente del ligando de ADN (MLPA, del ingls multiple ligand-specific probe amplification) (5).

En las ltimas tres dcadas se han desarrollado sistemas de deteccin de alteraciones en el nmero de copias de cido desoxirribonucleico (ADN) presentes en una muestra problema a lo largo de todo su genoma mediante la tcnica de hibridacin genmica comparada (CGH, por sus siglas en ingls de comparative genomic hybridization) (6). La CGH, que se basa en la hibridacin competitiva de dos ADN (el ADN problema y el ADN control normal) marcados con distintos fluorocromos, detectaba esos cambios sobre cromosomas normales que se utilizaban como molde para la hibridacin. En resumen, se marcaba el ADN del problema con un fluorocromo (tradicionalmente ver-de) y un ADN normal, o control, con un fluorocromo diferente (tradicionalmente rojo). Ambos ADN se mezclaban en cantidades equimolares y se realizaba una hibridacin in situ sobre cromosomas metafsicos normales. Ambos ADN competan por hibridar en los mismos lugares cromosmicos. En condiciones normales (por ejemplo un caso problema sin alteraciones genticas), como la cantidad de ADN marcado en rojo (con-trol) y verde (problema) era la misma, el resultado final eran cromosomas marcados en color amarillo por contener una mezcla en proporcin 1:1 de ambos fluorocromos (rojo + verde = amarillo). En condiciones patolgicas, si el caso problema contena alguna ganancia cromosmica, la cantidad de ADN del caso disponible para hibridar era ma-yor, y la hibridacin de esa zona resultara en una mayor proporcin de fluorocromo del ADN problema (verde). Al contrario, si el caso problema contena una delecin (prdida), la regin delecionada aparecera en rojo, ya que habra ms cantidad de ADN normal (rojo) para hibridar en esa regin cromosmica. La CGH permita, por tanto, la detec-cin de ganancias y prdidas de regiones cromosmicas en todo el genoma del caso problema por la comparacin de las intensidades de las seales de hibridacin.

La CGH ha contribuido significativamente al conocimiento actual de las alteraciones ge-nmicas en varias patologas, y de forma relevante en Oncologa. Adems de definir patrones de ganancias y prdidas especficas de tumor, proporciona informacin para la identificacin de nuevos genes implicados en el cncer. Esta tcnica se ha utilizado sobre todo para detectar alteraciones cromosmicas en tumores slidos, en los que la obtencin de metafases presenta muchas dificultades tcnicas. Todas las alteraciones cromosmicas, ganancias y prdidas, descritas en cncer por CGH se pueden con-sultar en la base de datos actualizada de la Universidad de Helsinki (http://www.helsinki.fi/~lgl_www/CMG.html).

A pesar de sus numerosas ventajas, la CGH tiene algunos inconvenientes de gran cala-do. Por ejemplo, la sensibilidad de esta tcnica depende del grado de complejidad clonal

rea de evaluacin tecnolgica y de laboratorio

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presente en la muestra. Un mosaico gentico, situacin en la que en la misma muestra coexisten poblaciones celulares de diferente composicin genmica, es difcil de analizar mediante CGH. La poblacin clonal debe suponer, al menos, un 30% de la poblacin total para que los cambios sean detectables. En esa situacin, no detecta diferentes clones celulares, sino que proporciona un valor medio de ganancias y prdidas. Otra desventaja es que la CGH solo detecta cambios de dosis gnica y no detecta transloca-ciones cromosmicas u otros reordenamientos equilibrados. Por ltimo, la CGH sobre los cromosomas tiene su mayor desventaja en su limitada capacidad de resolucin. Al fin y al cabo, el lmite de resolucin es definido por el binomio cromosoma y microscopio, por lo que las alteraciones genticas que impliquen regiones del genoma de tamao inferior a 3-5 megabases no se detectan (7).

La solucin al problema de la baja resolucin de la CGH vino de la incorporacin de la tecnologa genmica a los laboratorios de citogentica molecular. As, mediante los mi-croarrays, la hibridacin competitiva de los ADN de la muestra problema ms el control pas de realizarse sobre cromosomas a realizarse sobre segmentos de ADN de tamao mucho menor que un cromosoma. Estos fragmentos (a los que denominamos sondas) tienen coordenadas precisas (sabemos dnde estn en el genoma) y su secuencia es conocida, lo que permite aumentar la resolucin de la tecnologa hasta miles de veces la correspondiente a un cariotipo convencional. Inicialmente, estas plataformas estaban im-presas en los propios laboratorios, utilizando para ello sondas basadas en cromosomas artificiales bacterianos (BAC, del ingls bacterial artificial chromosome). La primera des-cripcin la hicieron Solinas-Toldo y col. en 1997 (8) y la denominaron CGH basada en ma-triz, y Pinkel y col. en 1998 y la llamaron array-CGH (9). A pesar de tratarse de una tecno-loga desarrollada de forma no industrial, enseguida aparecieron publicaciones sobre su utilidad clnica. La primera publicacin sobre el tema aparece en 2002. En ella, Veltman y cols. (10) describen la utilizacin del array-CGH en regiones subtelomricas. Resaltan las ventajas de la tcnica: permite analizar en una sola reaccin 77 sondas subtelomricas a partir de solo 500 ng de ADN genmico del paciente. En este artculo los autores prevn un profundo impacto del array-CGH subtelomrico en el diagnstico y el consejo gen-tico de pacientes con retraso mental; pronostican que, en el futuro, con esta tcnica se llevar a cabo un anlisis genmico de nmero de copias en una sola reaccin, con una resolucin sin precedentes y haciendo posible la identificacin de genes causantes de enfermedad. Ms tarde, el grupo de Schoumans y col. (11) utilizaron el array-CGH en 10 casos de alteraciones cromosmicas crpticas ya diagnosticados con FISH para confir-mar la robustez de la tcnica. Ellos emplearon arrays de BAC con una resolucin de 1 Mb y concluyeron que, cuando se introduzca esta tcnica en laboratorios de rutina, se podra diagnosticar nuevos desequilibrios y se describirn nuevos sndromes. Adems, tambin indican que para detectar alteraciones ms pequeas ser necesario mejorar los arrays. Este tipo de arrays de BAC de 1 Mb de resolucin ha sido empleado con profusin en el diagnstico gentico de retraso mental y sndromes polimalformativos.

En el ao 2005 apareci el primer array-CGH comercial de oligonucletidos que realiza-ba una cobertura completa del genoma con 44.000 puntos, a una resolucin media de aproximadamente 45 kilobases. Este primer array, desarrollado por la compaa Agilent (12),

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supuso un cambio global en el trabajo en la genmica de los arrays; de una tcnica artesa-nal, con protocolos poco definidos y cristales impresos en forma casera en escaso nmero, se pasaba a una produccin altamente tecnolgica de miles de cristales por ao y a un protocolo sencillo y estandarizado, con criterios de calidad validados internacionalmente.

Como se recoge en el conjunto de este documento, el array-CGH se utiliza ya en la clnica, especialmente en las reas de estudio gentico posnatal (en el diagnstico de pacientes con retraso mental, psicomotor o dismorfias). El uso del array-CGH ha sido y est siendo especialmente til en tres situaciones diferentes: por una parte, para caracterizar un sndro-me desconocido cuya alteracin gentica es crptica para el cariotipo. Por otra parte, para descartar formas ms agresivas de ciertos sndromes asociadas a deleciones cromosmi-cas. Por ltimo, sirve para la identificacin precisa de marcadores extracromosmicos, que no podemos conocer mediante tcnicas de citogentica convencional (13-15).

1.2. tIpos y funcIonalIdad de los array-cGH

Por razones histricas, los microarrays que se incorporaron en primer lugar a la investi-gacin biomdica y que, por tanto, son los de uso ms frecuente y extendido fueron los microarrays de cADN, empleados casi exclusivamente en estudios sobre anlisis masivo o global de la expresin gentica de los organismos (16). Esta monografa est orientada a la prctica clnica y el diagnstico gentico por lo que, a fin de simplificar y unificar el mensaje, los microarrays de expresin se excluyen de la descripcin. De hecho, aunque la determinacin de los perfiles de transcripcin fuera la aplicacin inicial y ms conoci-da de los biochips de ADN, el formato microarray tambin se est utilizando de manera eficaz, al menos, en otros dos tipos de experimentos: los microarrays de ADN genmico diseados para el estudio de las alteraciones en el nmero de copias de ADN (copy number variations o CNV) presentes en la muestra a estudio, y los microarrays disea-dos para la deteccin masiva y simultnea en una muestra problema del genotipo que presenta cientos de miles de polimorfismos de un nico nucletido (single nucleotide polymorphisms o SNP).

1.2.1. microarrays de bac

Los microarrays de BAC fueron el primer sistema empleado de arrays-CGH para la inves-tigacin y la clnica. En esencia, un BAC es una fragmento de ADN bicatenario y circular de una longitud media de 150 Kb, que se mantiene y propaga, como un ADN husped, en un clon bacteriano. Para obtener el ADN del BAC, el cultivo se produce como cual-quier otro cultivo bacteriano, se extrae ADN a partir del cultivo y, tras purificarlo, se puede mantener para su uso posterior. En este tipo de microarrays, cada sonda o molde que se coloca (tambin llamado impresin) en el soporte fsico (cristal o porta) es ADN obte-nido de un nico BAC. Si el microarray es un diseo del propio investigador, este puede decidir, a tenor de sus necesidades, si quiere tener ms o menos resolucin, si quiere cubrir una(s) zona(s) especfica(s) del genoma o si, por ejemplo, quiere cubrir el genoma en su totalidad.


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Los primeros arrays de BAC que estuvieron disponibles incluan unos 3.000 clones y tenan una resolucin de 1 Mb. Posteriormente, los sistemas de impresin de arrays-CGH de BAC se mejoraron, alcanzando un mximo de resolucin de 30.000 clones, con una cobertura casi completa del genoma (17, 18). En general, se fabricaban en centros de investigacin y el proceso industrial dependa bastante de factores no controlables (localizacin inexacta de los BAC en el mapa genmico, contaminacio-nes cruzadas, recombinaciones, etc.). Si los arrays de BAC son producidos por el investigador, aunque el coste de los materiales es ms econmico, finalmente este precio se equilibra, ya que los controles de calidad son ms caros y consumen ms tiempo de anlisis. En la Tabla 1.1. se comparan los tres tipos fundamentales de mi-croarrays de CGH.

1.2.2. microarrays de oligonucletidos

Como se ha mencionado anteriormente, los microarrays de oligonucletidos fueron una evolucin de la tecnologa de arrays-CGH. Los oligonucletidos son molculas que con-tienen unos 60-80 pares de bases sintetizados de forma exclusiva para su inclusin en el microarray, y pueden contener variantes tipo SNP (microarray de SNP) (19, 20). Estos segmentos de ADN tienen unas secuencias genmicas de localizacin definida en el genoma y con un contenido gentico conocido. Este primer array de oligonucletidos, destinado a detectar CNV y realizado por la compaa Agilent en 2004 (12), supuso un cambio global en el trabajo en la genmica de los arrays: de una tcnica casera, con protocolos poco definidos y con cristales impresos en escaso nmero, se pasaba a una produccin altamente tecnolgica de miles de cristales por ao y a un protocolo sencillo y estandarizado, con criterios de calidad validados internacionalmente. Los arrays de oligos se sintetizan de manera robotizada in situ, fijan el contenido en GC y la temperatura de fusin, por lo que se facilita una hibridacin uniforme.

Como aparece recogido en la Tabla 1.1., las ventajas de los arrays de oligonucletidos frente a los arrays de BAC son numerosas y tienen su base en la posibilidad de incluir cientos de miles de sondas en un solo ensayo, potenciando enormemente su reso-lucin a la hora de definir con exactitud los lmites de las alteraciones genmicas y a la hora de detectar cambios de menos de 100-150 Kb (lmite funcional de los arrays de BAC). Otras dos grandes ventajas desde el punto de vista cientfico son que las compaas que producen los arrays tiene una ingente cantidad de sondas posibles (de hecho, tiene una cobertura que permite cubrir por completo la secuencia del genoma) por lo que, a la hora de disear una plataforma, los lmites de cobertura y re-solucin son muy generosos; y, por ltimo, que los oligonucletidos que se incluyen en el array son de secuencia conocida, por lo que, al describir la alteracin, se puede indicar la implicacin de un locus determinado (un gen o parte del mismo). Este hecho permite realizar un diagnstico ms eficaz y un consejo gentico (si es requerido) con mejores elementos y ms completo.

En general, se admite que los arrays basados en oligonucletidos tienen una capacidad diagnstica mayor que los arrays basados en BAC (14,83% frente a 9,76%) (21, 22).

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tabla 1.1. Resumen de caractersticas de los tres tipos de plataformas genmicas

Tipo de array Objetivo Ventajas Desventajas

CGH de BAC

Detecta ganancias y prdidas en las re-giones del genoma cubiertas por el array

1. No muy dependiente de desarrollos de soft-ware

2. Validacin muy acce-sible por FISH a partir de los clones BAC al-terados

1. Poca resolucin en los l-mites fsicos y genticos de la alteracin

2. Disponibilidad limitada de sondas para un diseo de alta cobertura

3. Resolucin limitada para cambios de menos de 100 Kb

4. El mtodo de produccin introduce variables intrnsecas

5. Los cambios se delimitan por regiones y no por secuen-cias anotadas

CGH

de oligonucletidos

Detecta ganancias y prdidas de regiones del genoma

1. Permite conocer el contenido y secuencias genticas implicadas: lmites definidos de los puntos de rotura, genes implicados, etc.

2. La produccin es masiva, industrial, so-metida a controles de calidad rigurosos

3. La flexibilidad en el diseo es muy superior

1. Al aumentar el nmero de sondas, aumenta el ruido del ensayo y hay que extremar los controles de calidad

2. El exceso de informacin complica la lectura e interpre-tacin

3. El software de anlisis es determinante

SNP array

Detecta el genotipo (secuencia) de los marcadores polimr-ficos incluidos en el array

Detecta ganancias y prdidas de regiones del genoma

1. Aplica todas las del apartado de oligos

2. Permite conocer los genotipos y realizar ha-plotipos en estudios fa-miliares

3. Detecta las regiones con prdidas de hete-rocigosidad para diag-nstico de isodisoma uniparental y bloques de homocigosidad en indi-viduos consanguneos

1. Es menos sensible que el array de oligos para detectar los cambios en nmero de copias

2. Es ms dependiente del desarrollo de software para su interpretacin


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1.2.3. microarrays de snp

Inicialmente descritos en el ao 2000 por Mei y colaboradores (19), son una variante de los arrays de oligonucletidos diseados para contener variantes tipo SNP. Este tipo de arrays tiene todas las ventajas de los arrays de oligonucletidos (vase Tabla 1.1.). Es decir, son capaces de identificar cualquier desequilibrio (aneuploida, delecin, duplicacin) de los loci representados en el microarray pero, adems, estn diseados para detectar, en una muestra problema, la presencia o ausencia de un determinado SNP. Por tanto, estos arrays permiten conocer simultneamente la secuencia de cientos de miles (con frecuencia ms de un milln) de variantes gnicas presentes en la muestra. Como consecuencia, esto nos permite reconocer el origen parental de cada copia y detectar disomas uniparentales y prdidas de heterocigosidad (LOH, loss of heterozygosity). Los microarrays diseados para el genotipado masivo de SNP han sido los ltimos en aparecer en el campo de la gen-mica aplicada, pero su desarrollo tiene muchos visos de ser imparable. Quizs la mayor desventaja de estos arrays para un uso completamente generalizado que desplace al resto de tipos de microarrays es que, aunque pueden ser empleados para detectar CNV, su eficacia en esta tarea es algo menor que la de los arrays de BAC o de oligonucletidos, ya que los datos de fluorescencia (al menos en las primeras plataformas) tienen algo menos de fuerza. Los microarrays de SNP ofrecen una gran ventaja respecto a las pruebas genticas empleadas hasta ahora para determinar el genotipo de una serie de marcadores: es una prueba global, que no selecciona previamente los genes a estudiar sino que realiza un es-caneo general del genoma en busca de genotipos de inters. Esta aproximacin global del genoma supone el paso de la Farmacogentica a la Farmacogenmica. El espaciamiento de SNP en algunos formatos (

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forma que incidan en el resultado, como la fluorescencia residual, el tamao de spot, etc., controles que las plataformas comerciales ya han realizado previamente en su proceso de fabricacin y que son anteriores a su puesta en el mercado. Otro gran problema de las plataformas de produccin propia es que carecen de universalidad: una plataforma comercial puede ser usada, con el mismo diseo y producida casi al mismo tiempo, por cientos o miles de facultativos, con lo que se conocen mucho mejor los detalles de su diseo, su uso, su efectividad y su reproducibilidad, entre otros aspectos. Una plataforma propia necesita garantizar todas esas asunciones, por lo que, a pesar de que el coste en materiales de fabricacin puede ser menor, la adecuacin a un uso generalizado (o con fines diagnsticos) incrementa enormemente su coste final.

1.3.2. los microarrays de fabricacin industrial (comerciales)

Existen diversas compaas que fabrican y distribuyen actualmente herramientas de tec-nologa genmica (entre las que se encuentran los microarrays). En la Tabla 1.2. se reco-gen algunas de ellas y se describen en orden alfabtico algunos de sus productos ms representativos. Para evitar entrar en excesivos tecnicismos, se ha elaborado un pequeo glosario de los mismos, dividiendo los tipos de plataforma entre diseos de tipo general, cuando son arrays que mapean con una misma resolucin todo el genoma, y diseos dirigidos, cuando estn enfocados y optimizados especialmente para estudiar regiones de inters y/o relacionadas con ciertas patologas (tales como subtelmeros o regiones de sndromes genticos bien caracterizados y recogidos en la base de datos OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim). Este listado est actuali-zado a fecha 10 de diciembre de 2011.

1.3.3. los microarrays de diseo original y fabricacin comercial (microarrays personalizados o customizados)

Es importante sealar que diversas casas comerciales (tanto las de oligonucletidos, como Agilent Technologies o Nimblegen, como las de SNP, como Affymetrix) ofrecen la posibilidad de producir, a peticin de un investigador, microarrays que incluyan diseos propios individualizados, generados a partir de un repositorio de sondas propiedad de la compaa. Esta estrategia permite beneficiarse de todos los controles de calidad insta-lados y en funcionamiento en la compaa, pero aplicados al diseo que el investigador haya decidido para usos cientficos o mdicos concretos. Con esto se salvan, por una parte, los problemas de las producciones propias, pero permite generar diseos propios ms eficaces en determinadas circunstancias y, probablemente, ms interesantes para la investigacin que se pretende realizar (ya sea de aplicacin clnica o bsica).

1.3.4. la resolucin terica y real de un microarray

La capacidad o poder de resolucin de un array para detectar la presencia de una alte-racin en el nmero de copias de ADN en una muestra es directamente proporcional al nmero de sondas que se incluyen en el microarray para la regin del genoma que se considere. Las casas comerciales habitualmente dan una idea de la resolucin terica de


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un array y lo indican como el nmero de kilobases que hay entre una sonda y la siguiente al localizar ambas sobre la secuencia completa y continua del genoma.

Tericamente, por tanto, si la seal de hibridacin que emite una sonda est alterada (duplicada o disminuida), se debera asumir que la regin del genoma que est localizada alrededor de esa sonda presenta un cambio en el nmero de copia; esto es, se trata de una CNV o una CNA (copy number alteration). La realidad, sin embargo, no es as. Debido a que una nica sonda puede generar un cierto margen de ruido experimental en su hibridacin, no puede decirse que si una nica sonda est duplicada o delecionada existe una regin de CNV. Para poder asignar la variacin de nmero de copia a una regin concreta se necesita un sistema de anlisis robus-to de estadstica aplicada a la genmica (una aplicacin bioinformtica) que: 1) detecte el sentido

tabla 1.2. Listado resumido y actualizado a diciembre de 2011 de empresas producto-ras de plataformas de arrays-CGH

Compaa Tipo de plataforma Formatos

Affymetrix

SNP, general Genechip 250k for cytogenetics

Oligo+SNP, generalSNP Array 6.0 (1.8M, 50/50 SNP/non SNP)SNP Array 2.7M (400k SNP, 2.3 non SNP)

Agilent

Oligo, general 60k, 180k, 400k, 1M

Oligo, dirigido ISCA v2: 44k, 60k,105k,180k

Oligo+SNP, general CNV+LOH 180k, 400k

Bluegnome

BAC, dirigidoCytochip V3 (5.000 BAC)24 sure (para diagnstico preimplantacional)

Oligo, dirigidoCytochip oligo ISCA 44k, 60k, 180kCytochip oligo 105k

IlluminaSNP, general

HumanOmni 2.5M, 1.5M, 1MHuman 1M, 660kHuman OmniExpress (700k)

SNP, dirigido HumanCytoSNP (~300k)

NimblegenOligo, general 72k, 135k, 385k, 720k, 1.4M, 2.1M, 4.2M

Oligo, dirigido CGX3 (720k), CGX6 (315k), CGX12 (135k)

OGTOligo, dirigido

Cytosure ISCA: 44k, 180k, v2 60kCytosure v2 Syndrome plus 105k

Oligo+SNP, dirigido Cytosure ISCA 180k UPD

Perkin Elmer BAC, dirigidoConstitutional Chip3.0 (600 BAC)Constitutional Chip4.0 (5.200 BAC)

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del cambio de fluorescencia (hacia la ganancia o hacia la prdida) en varias sondas consecuti-vas con el mismo sentido; 2) defina los lmites de ese grupo de sondas alteradas hacia el mismo sentido; y 3) asigne, con una significacin estadstica medible, la existencia de una duplicacin o una delecin a una regin genmica. El nmero de sondas necesarias para definir y aceptar la presencia de una alteracin en una regin de lmites definidos no est totalmente estandarizado, y depende del tipo de array-CGH, as como del conservadurismo del laboratorio emisor del resultado. Se trata de un elemento crtico. Se acepta que el nmero de sondas mnimo debe oscilar entre 2 (mayor presencia de falsos positivos) y 5 (ms conservador). Adems, no todas las sondas se encuentran espacialmente a la resolucin terica fijada: existen regiones con ma-yor densidad que otras (las zonas pericentromricas, por ejemplo, al tener menos contenido en eucromatina, tienen una menor presencia de sondas). Por ello, la resolucin real de los arrays de CGH es menor de la que tericamente se les atribuye en las casas comerciales.

A modo de ejemplo, suponiendo que se realiza un ensayo con un array con una reso-lucin media terica de una sonda cada 45 kilobases (como por ejemplo un array-CGH Agilent Technologies de 60K sondas), la capacidad mnima de deteccin de ese array, siendo conservadores (es decir, solo aceptando cambios con un mnimo de 5 sondas alteradas en el mismo sentido), sera de aproximadamente 200 kb a lo largo de todo el genoma. No se recomendara este array, por tanto, para la deteccin de CNV de menor tamao, ya que podran ser invisibles a la tecnologa.

Por otra parte, es importante tener en cuenta la resolucin de un array-CGH a la hora de utilizarlo para un determinado diagnstico. Por ejemplo, capacidades de deteccin de re-giones inferiores a 100 kb incrementan el nmero de polimorfismos de cambio de nmero de copia en un diagnstico, dificultando su anlisis. Otro ejemplo: suponiendo que se bus-ca una alteracin estructural de gran tamao, pongamos de 2 megabases, en el mismo ejemplo anterior, utilizar un array de muy alta resolucin (por ejemplo de varios millones de sondas) dificultara este tipo de estudios. Por otra parte, buscar un gen unitario con un array de BAC o un array de baja resolucin sera ms complicado, de manera que se necesita-ran arrays de mayor resolucin para ese efecto.

Por ltimo, otro aspecto relevante a la hora de implementar la estrategia de array-CGH de for-ma rutinaria es la eleccin de la estrategia diagnstica correcta. Existen diferentes mtodos o estrategias de hibridacin: 1) la inversin del marcaje (conocida como Dye swap en la literatura anglosajona), que consiste en repetir la hibridacin de cada paciente pero cambiando el color del marcaje; 2) tradas de pacientes o hibridacin de cada paciente de la trada en dos colo-res y la hibridacin enfrentada a los otros dos miembros de la trada; 3) hibridacin paciente/control, la ms frecuente; y 4) hibridacin paciente/paciente. Cada estrategia tiene ventajas e inconvenientes pero cada una, a su vez, tiene un coste diferente y este criterio econmico es importante a la hora de plantear la sustitucin del cariotipo de forma general.

1.3.5. marcaje ce para el empleo de los arrays-cGH en diagnstico clnico

Existe un gran debate acerca de si los arrays-CGH son reactivos de laboratorio que puedan ser homologados y empleados de forma generalizada para el diagnstico clnico.


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A modo informativo, es un producto sanitario para diagnstico in vitro, segn la directiva europea 98/79/EC, cualquier producto sanitario que consista en un reactivo, producto reactivo, calibrador, material de control, estuche de instrumental y materiales, instrumen-to, aparato, equipo o sistema, utilizado solo o en asociacin con otros, destinado por el fabricante a ser utilizado in vitro para el estudio de muestras procedentes del cuerpo humano, incluidas las donaciones de sangre y tejidos, solo o principalmente con el fin de proporcionar informacin: Relativa a un estado fisiolgico o patolgico. Relativa a una anomala congnita. Para determinar la seguridad y compatibilidad con receptores potenciales. Para supervisar medidas teraputicas.

Asumir esta definicin significa que los arrays-CGH deben ser considerados como pro-ducto sanitario y, como tales, deben cumplir una serie de requisitos. As, si un laboratorio emplea un array-CGH para realizar un test gentico debe asegurarse que dicho array ostente la marca CE de conformidad. La marca CE es una marca europea para ciertos grupos de servicios o productos industriales entre los que se encuentran los productos sanitarios (y por ello los arrays-CGH). Se apoya en la directiva 93/68/EEC. De hecho, si el array-CGH empleado es comercial, el laboratorio que lo use ha de tener en cuenta que, para poder utilizarlo con fines diagnsticos, debe ostentar la marca CE. Hay que tener presente que la marca CE no es indicativa de la calidad del producto.

La evaluacin de conformidad la realizan los Organismos Notificados que son, en gene-ral, entidades de certificacin (por ejemplo: DNV, SGS, TV) o bien autoridades sanita-rias. En Espaa, segn el Real Decreto 1715/2010 de 17 de diciembre, la nica entidad autorizada para realizar esta tarea es la Entidad Nacional de Acreditacin (ENAC).

En la actualidad (fecha de bsqueda de estos anteriormente citada), ningn array comer-cial de tipo general fabricado por ninguna compaa tiene certificado CE-IVD (in vitro diag-nostic), por lo que todas estas plataformas estn inicialmente indicadas para uso expe-rimental, no diagnstico. Aunque este campo evoluciona velozmente y podrn aparecer en el futuro, esta salvedad debe ser indicada explcitamente en el informe de diagnstico gentico que haya empleado los arrays-CGH para su elaboracin.

1.4. anlIsIs funcIonal de tecnoloGa

1.4.1. Ventajas y beneficios de los microarrays

Las ventajas del array-CGH como tecnologa son muchas y novedosas. Por una parte, el array-CGH emplea como material biolgico de ensayo el ADN de la muestra. Este ADN puede provenir de cualquier tipo de fuente como, por ejemplo, saliva, sangre, otro tipo de fluidos, tejidos slidos, cultivos celulares, material fijado para estudios citogenticos o parafinas, entre otros muchos. Quizs la mayor ventaja es que, al emplear ADN, no ne-cesita, como el cariotipo, clulas vivas para establecer cultivos celulares, por lo que los

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requerimientos de material son menos exigentes. No es necesario trasladar el ADN en fro ni se necesitan condiciones de esterilidad para el cultivo celular.

Por otra parte, el array-CGH es, en definitiva, un sistema de anlisis global del genoma a una resolucin determinada. Los requerimientos tcnicos y las reacciones del ensayo son automatizables y escalables: extraccin del ADN, hibridaciones en placa, etc. Esta automatizacin de los procesos, as como la aplicacin de herramientas informticas, permiten un anlisis con menos sesgos que la interpretacin de un cariotipo, rebajan la subjetividad de interpretacin de alteraciones, y hacen posible llegar a identificar los ge-nes afectados. La robotizacin tambin permitir convertir esta tcnica en una estrategia de alto rendimiento (high-throughput).

Otra gran ventaja del array-CGH es el factor tiempo, ya que permite obtener una gran cantidad de informacin en un tiempo relativamente corto. Experimentalmente, la gran mayora de los arrays-CGH pueden realizarse, desde la entrada de una muestra hasta el final de la ejecucin experimental, en un tiempo de entre 48 y 72 horas, dependiendo siempre de la complejidad y de la resolucin del array-CGH.

1.4.2. comparativa con otros mtodos: cariotipo, fIsH, qf-pcr (reaccin en cadena de la polimerasa), sKy (cariotipo espectral multicolor), mlpa

1.4.2.1. cariotipoEl array-CGH es una tcnica que en muchas ocasiones puede sustituir al cariotipo conven-cional como herramienta de deteccin global de duplicaciones, deleciones y alteraciones numricas no poliploides. El cariotipo es una tcnica econmica, robusta y fiable que ha sido la herramienta esencial de trabajo en el diagnstico gentico y, por ende, en la gen-tica mdica. Desde el punto de vista legal y de la prctica clnica, se considera la prueba gold standard del diagnstico citogentico, sobre todo para diagnstico prenatal. Tiene como principal ventaja que es un anlisis global del genoma sin asunciones apriorsticas (no es una prueba dirigida a un gen o a un cromosoma especfico). Tiene una resolucin microscpica (es, decir, algo baja), la deteccin de alteraciones requiere que los reordena-mientos impliquen regiones grandes del genoma (citobandas; es decir, aproximadamente regiones de 3 a 5 megabases). Esta resolucin permite identificar perfectamente trisomas, monosomas, cambios de ploida y reordenamientos estructurales tales como inversiones, translocaciones, deleciones o duplicaciones, siempre que superen ese tamao mnimo.

A diferencia del cariotipo, el array-CGH no puede detectar alteraciones que no impliquen un cambio de nmero de copia, como son las translocaciones o inversiones cromosmicas equilibradas, en las que los reordenamientos no suponen prdidas ni ganancias de material gentico. Sin embargo, es mucho ms eficaz para detectar deleciones o duplicaciones que pueden estar asociadas a dichos reordenamientos al eliminar la complejidad observacional.

Como se ha indicado brevemente antes, la gran limitacin del cariotipo, aparte de su resolu-cin y de su subjetividad (experiencia del observador), es la incapacidad de realizar anlisis alguno en ausencia de divisin celular. Un cariotipo analiza metafases cromosmicas, y es


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necesario que las clulas a analizar estn en continua divisin. Esto puede alterar el por-centaje de clonalidad de determinadas patologas; el array-CGH no requiere divisin celular, con lo que se analiza cualquier clula de la muestra, independientemente de su capacidad divisoria. Por otra parte, el cariotipo estndar estudia a la vez 20 metafases de un mismo cultivo celular a analizar, mientras que el array-CGH informa del contenido genmico de miles o millones de clulas a la vez. En cuanto a la deteccin de clones presentes en bajo porcentaje, se fija un mnimo de deteccin en el cariotipo de 2-3 metafases totales del estu-dio, es decir, un 10-15% del cultivo. El array-CGH solo podr detectar poblaciones clonales ms evidentes, las que suponen en torno a un 30% del total de la muestra a analizar.

1.4.2.2. fIsHLa FISH, una tcnica iniciada por Lenguaer y cols. (23), es un mtodo capaz de detectar, mediante el uso de un microscopio de fluorescencia, la hibridacin de una sonda de ADN marcada con un fluorocromo determinado que reconoce una secuencia de ADN. Esa secuencia puede ser locus especfica (un gen determinado, una regin genmica), centromrica (especfica o pancentromrica), telomrica (igual que la centromrica) o de painting cromosmico (que pinta un cromosoma completo).

La FISH presenta como ventajas la posibilidad de ser utilizada en las metafases, con lo que puede asociarse la fluorescencia de un determinado locus con una localizacin cromosmica, algo muy til en, por ejemplo, las translocaciones. Tambin puede verse en las interfases, y combinarse en hasta cinco canales de color simultneos, y puede detectar en una misma hibridacin una combinacin de cinco locus, centrmeros, tel-meros o cromosomas determinados.

El array-CGH, al ser una tcnica global, pero con miles de sondas a lo largo de todo el ge-noma, es, a efectos prcticos, una FISH en mayor detalle. Permite detectar duplicaciones y deleciones de material gentico de una manera ms completa que la FISH, en cuanto a que la FISH solo va a detectar una alteracin del tamao de la sonda a analizar, de ma-nera que no puede recibir una imagen completa del genoma. Por otra parte, la FISH tiene la ventaja de que puede detectar alteraciones que no implican un cambio de nmero de copia, tales como translocaciones o inversiones, y permite detectar poliploidas (indetec-tables mediante arrays-CGH). Adems, la FISH es un sistema de cuantificacin absoluta (una seal equivale a una dosis de copia del locus) y es extremadamente sensible en casos de mosaicismo (puede detectar mosaicos del 10% o mayores).

1.4.2.3. fIsH y qf-pcr para estudio de aneuploidasA pesar de que son dos tcnicas distintas (la FISH proviene de la citogentica, la qF-PCR de la biologa molecular), ambas se engloban en la misma seccin debido a que su uso en gentica mdica es bastante similar: la deteccin de aneuploidas en el diagnstico prenatal.

La qF-PCR (24) es una tcnica basada en el uso de varios microsatlites de determinados cromosomas para conocer el nmero de copias de los mismos. Actualmente se utiliza de manera rutinaria para detectar aneuploidas prenatales en hasta cinco cromosomas, como 13, 18, 21, X e Y, de la misma manera que una FISH de aneuploidas. Sin embargo,

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el qF-PCR es ms econmico y no depende tanto de la observacin y de la experiencia del facultativo para emitir un resultado.

El array-CGH tiene como ventaja la capacidad de detectar no solo 5 aneuploidas, sino toda la informacin genmica determinada de una muestra. Sin embargo, la ventaja de la qF-PCR es una mayor facilidad de trabajo, unos menores requerimientos de cantidad de ADN de partida (a partir de lquido amnitico, por ejemplo) y la capacidad de deteccin de poliploidas (indetectables para el array-CGH).

1.4.2.4. sKy o m-fIsH (multi-fIsH)El SKY, es una tcnica iniciada por Schrck en los aos 90 (25), basada en la asociacin de un espectro de colores a un cariotipo, lo que permite identificar los pares cromos-micos con una serie de patrones espectrales, que un software transforma en colores nicos para cada par.

Esta tecnologa permite identificar con la resolucin del cariotipo poliploidas, reordena-mientos complejos y otras alteraciones genticas con una simple variacin de color. El cariotipo espectral multicolor es una tcnica poco extendida de manera sistemtica en la gentica mdica debido a su complejidad, tanto experimental como de anlisis, a su elevado precio y a la indicacin de uso en casos complejos, difciles de determinar mediante otras tcnicas citogenticas. Como en el caso del cariotipo, la gran desventaja del SKY es la necesidad de un cultivo citogentico y la obtencin de una resolucin limi-tada. Igualmente, no se conocen en detalle las citobandas afectas (sobre todo en SKY complejos), as como los genes implicados. Sin embargo, es muy eficaz para identificar reordenamientos complejos, as como para caracterizar clones con grandes variaciones numricas entre cromosomas.

1.4.2.5. mlpa La tcnica MLPA, inicialmente descrita por Schouten y cols. en 2002 (26), es un sistema de PCR multiplex que permite detectar a la vez la informacin del cambio de nmero de copia de varias secuencias (un mximo de decenas) determinadas en una muestra al compararlas con un control sano.

Existen muchas variedades de MLPA, desde las que rastrean deleciones de un intrn en un gen (por ejemplo BRCA) a paneles subtelomricos o de enfermedades neurolgicas. La gran ventaja de la MLPA es su relativo bajo coste y su facilidad de manejo frente a otras tecnologas especficas de locus, como la FISH. Sin embargo, a efectos de cobertura, un panel de MLPA no puede competir con el anlisis global de arrays-CGH, especialmente en los casos clnicos sin sospecha clnica clara (donde pueden llegar a usarse 3 paneles diferentes de MLPA, incrementando el coste y el tiempo de anlisis).

1.4.3. limitaciones del array-cGH

El array-CGH no es una tcnica perfecta y no est exento de limitaciones. En la Tabla 1.3. se recoge una comparativa de las limitaciones de las diferentes tcnicas de anlisis gen-


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ticos. Aunque se han ido comentando continuamente a lo largo del captulo, se enuncian de nuevo aqu en forma de lista: El array-CGH es incapaz de detectar si hay diferentes poblaciones clonales que puedan

estar presentes dentro de una misma muestra. Es decir, no permite identificar el estado clonal de la misma. Esto es especialmente preocupante en poblaciones con bajos mosaicismos, donde ser imposible detectar cambios que representen menos de un 20-30% de la poblacin total. Esta limitacin es dependiente de las condiciones de anlisis establecidas y de la sensibilidad del operador en detectarlos que previamente habr validado las herramientas con este propsito.

El array-CGH, asimismo, solo detecta cambios de dosis gnica y no detecta translo-caciones cromosmicas u otros reordenamientos equilibrados como las inversiones.

Mediante arrays-CGH es imposible detectar poliploidas, ya que son cambios glo-bales de material gentico, indetectables mediante sistemas de normalizacin de sondas.

La cantidad de ADN necesaria para realizar un array-CGH es superior a la necesaria para otras tcnicas moleculares, como por ejemplo la amplificacin en cadena de la polimerasa o PCR. Adicionalmente, este ADN debe ser de una calidad adecuada para poder generar un resultado analizable (la misma calidad exigible a cualquier otra tcnica molecular): no contener protenas ni fenoles, no estar fragmentado, etc.).

Los arrays-CGH de alta densidad pueden descubrir un gran nmero de CNV, sin impacto clnico claro, que pueden dificultar el anlisis y/o la interpretacin de los resultados.

tabla 1.3. Comparacin de las capacidades de algunas tcnicas genticas para detec-tar los diferentes tipos de alteraciones+ til - no til

Polip

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Aneu

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gosi

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Cariotipo + + + + + + -

M-FISH/SKY + + + + + + -

array-CGH - + - + + +/- -

aSNP - + - + + +/- +

FISH interfase + + - + + + -

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1.4.4. beneficios y usos potenciales

El array-CGH ya tiene unos usos rutinarios en el estudio gentico posnatal para tres situaciones: retraso mental o patologa no filiada (cariotipo normal) para descartar sndro-mes de delecin, ms graves que sus formas mutacionales, y para la identificacin de elementos complejos en el cariotipo, tales como cromosomas derivativos o marcadores extracromosmicos de naturaleza desconocida.

En el mbito de la gentica posnatal, el uso del array-CGH es ya una prioridad, y no una segunda opinin, en el diagnstico rutinario, especialmente en los casos sin una sospecha sindrmica clara. No en vano un array-CGH es una alternativa ms econ-mica, en cuanto a tiempo y dinero, que realizar un cariotipo sumado a dos diagnsticos complementarios especficos de locus (como MLPA o FISH). A efectos de deteccin de las alteraciones, el uso de arrays-CGH incrementa, al menos en un 10%, la capacidad de deteccin de alteraciones en los casos con dismorfias o retraso mental y cariotipo normal (27).

Otro uso potencial y casi inmediato del array-CGH es su uso en el diagnstico prenatal (28). La aplicacin de la FISH en el diagnstico prenatal ha permitido la deteccin rpida, en apenas 24 horas, de las aneuploidas ms frecuentes (13, 18, 21, X e Y). Actualmente, la aplicacin de los arrays-CGH en el diagnstico prenatal se lleva a cabo tan solo en unos pocos laboratorios en todo el mundo, por qu se da esta situacin? La interpretacin de los arrays-CGH ha de hacerse en el contexto de la estructura cromosmica. La presen-cia de CNV sin significado clnico hace difcil en ocasiones la diferenciacin entre estos y aquellos que pudieran ser patognicos. Sin embargo, es previsible que, segn la velocidad con que las bases de datos vayan creciendo, esta diferenciacin ser posible en un corto periodo de tiempo, permitiendo un diagnstico seguro y fiable. Segn el American College of Obstetrics and Gynecology, en 2009 la utilizacin de los arrays-CGH en el diagnstico prenatal se ve limitada por una serie de factores entre los que se encuentran la deteccin de CNV de significado clnico incierto, la imposibilidad de detectar reordenamientos equi-librados y un mayor coste econmico que el anlisis citogentico convencional. Desde entonces los costes de ambos mtodos se han ido acercando. En cualquier caso, antes de reemplazar una tcnica por otra, estas deben coexistir y son complementarias unas de otras hasta su total validacin y, en su caso, su reemplazo. De la misma forma, hace 20 aos se crea que el FISH, SKY y dems tcnicas de citogentica molecular reemplazaran al cariotipo, coexistiendo todava en el diagnstico citogentico clnico.

Recientes estudios ponen de manifiesto la utilidad de los arrays-CGH en el diagnstico prenatal en los casos en los que se identifican anomalas ecogrficas y cariotipo normal (28, 29). En estos casos se identifica un porcentaje, alrededor del 2%, de fetos con anomalas, cariotipo normal y alteraciones en el nmero de CNV. Es importante destacar que, aun con datos preliminares, la ampliacin de estos estudios permitir identificar qu anomalas fetales estn asociadas a variaciones en los CNV.

Desde el punto de vista teraputico, el array-CGH es un perfecto control de calidad de estabilidad celular, con lo que su uso como herramienta de anlisis de viabilidad en en-


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sayos con terapia celular tiene un potencial claro. En la literatura cientfica, esta propuesta ha sido validada recientemente (30). En cuanto a la actividad asistencial, el trabajo en este campo es reducido, por lo que no puede establecerse una recomendacin especfica de uso general.

Por ltimo, en el campo de la Oncologa, especialmente familiar, diseos especficos de arrays-CGH para detectar microdeleciones en genes supresores de tumores conoci-dos permitira filiar mejor las familias con patologa. Relacionado con la Oncologa, otro campo de aplicacin para los arrays-CGH es la caracterizacin de los procesos onco-hematolgicos. El anlisis del cariotipo proporciona informacin muy til en el diagnstico de muchas enfermedades hematolgicas. Sin embargo, dadas las limitaciones de la tcnica, hay cambios que no son identificables. An as y por ahora, el cariotipo sigue considerndose el gold standard en el anlisis gentico hematolgico. El anlisis citoge-ntico se viene utilizando como mtodo de rutina en las enfermedades hematolgicas, en las que la presencia de ciertas anomalas (translocaciones, trisomas, etc.) es de gran importancia en el diagnstico, el pronstico y el tratamiento. Son, adems, si hay ano-malas concretas, un mtodo para el seguimiento de la enfermedad mnima residual y de las posibles recadas, e igualmente permite definir en entidades recurrentes las regiones cromosmicas crticas implicadas. Sin embargo, las limitaciones intrnsecas tanto de la tcnica, del tipo de muestra, como de las complicaciones derivadas de interpretar sub-jetivamente cariotipos muy complejos motivan que no se detecten muchas alteraciones cromosmicas. Por ello, el array-CGH se contempla, cada vez ms, como una alternativa seria y, de momento, complementaria al cariotipo convencional. Esta sugerencia tiene su respaldo cientfico en numerosas publicaciones (7), algunas recientes (31-33).

1.5. requerImIentos tcnIcos y de funcIonamIento profesIonal para la realIzacIn de experImentos GenmIcos y su aplIcacIn al dIaGnstIco

1.5.1. requerimientos tcnicos y profesionales

Parece razonable asumir que la aplicacin clnica de los arrays-CGH al diagnstico gen-tico tendr que cumplir los mismos requerimientos que cualquier otra tecnologa aplicada al mismo fin. Desafortunadamente, en el Estado espaol no existe una especialidad sani-taria de Gentica, por lo que tampoco existe un consejo nacional de la especialidad ni un cuerpo normativo que especifique cmo se lleva a cabo esta actividad. A pesar de ello, el diagnstico gentico constituye una actividad clnica creciente en muchos hospitales de las redes sanitarias pblica y privada, y hay profesionales que trabajan en este campo y llevan a cabo estos diagnsticos.

Una informacin detallada de esta actividad se puede obtener fcilmente de los numerosos informes que la Asociacin Espaola de Gentica Humana tiene disponibles en su pgina web (www.aegh.org). Sin ser exhaustiva, la encuesta de actividad ms reciente (datos del ao 2005) revela que a esta asociacin pertenecen 56 centros de diagnstico gentico,

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que la actividad la desarrollan 589 profesionales y que, al margen de determinaciones bio-qumicas, en Espaa se realizaron y registraron ese ao ms de 150.000 test genticos. Es probable que, en la actualidad, esta actividad alcance los 500.000 test anuales.

Establecida la dimensin aproximada del diagnstico gentico en Espaa, y reconociendo que no hay especialidad sanitaria especfica, la pregunta natural es qu tipo de normativa rige los requisitos tcnicos y profesionales que tiene que cumplir un laboratorio de diag-nstico gentico para realizar su actividad? La respuesta no es fcil. La legislacin est fragmentada y, en la prctica, los laboratorios de gentica se presentan al pblico y a los reguladores de la actividad sanitaria asociados al grupo de actividades clnicas de labora-torio, como Anlisis Clnicos, Anatoma Patolgica o Hematologa. Esta asociacin se mate-rializa en dos formas: 1) en forma de unidad, seccin, servicios o unidades centralizadas de mbito autonmico cuando forman parte de la cartera de servicios de hospitales pblicos o privados de tercer nivel o de las comunidades autnomas; y 2) de forma independiente como laboratorios privados de atencin al pblico general.

1.5.2. requerimientos legales

Dado que este documento de consenso est orientado a la aplicacin de los arrays de CGH al diagnstico gentico, adems de los requerimientos tcnicos mencionados, se plantean requerimientos adicionales para el desarrollo de la actividad diagnstica. Entre ellos estn la obtencin de la Licencia de Actividad Sanitaria y la Acreditacin UNE-EN-ISO 15189.

1.5.2.1. licencia de actividad sanitariaLa legislacin de este tema corresponde a las respectivas Consejeras de Sanidad de las CC. AA. Por ejemplo, la normativa en vigor en la Comunidad de Madrid sobre las condiciones que son necesarias para realizar esta actividad est recogida en la Orden 2096/2006, de 30 de noviembre, de la Consejera de Sanidad y Consumo, por la que se regulan los requisitos tcnico-sanitarios y de apertura y funciona-miento de los centros de diagnstico analtico en dicha comunidad. Esta orden establece las condiciones y requisitos tcnicos mnimos que deben cumplir los centros de diagnstico analtico, sus reas dependientes o vinculadas y las unida-des perifricas de obtencin de muestras, tanto pblicos como privados, ubicados en el territorio de la Comunidad de Madrid. Entre los centros afectados por la ley se encuentran las Unidades de Gentica.

1.5.2.2. acreditacin une-en-Iso 15189Se trata de una norma internacional, basada en las Normas Internacionales ISO, que proporciona los requisitos relativos a la competencia y la calidad que son propios de los laboratorios clnicos. Esta norma entiende que los servicios del laboratorio clnico son esenciales para la asistencia al paciente y, por tanto, se tiene que disponer de unas normas de calidad para satisfacer las necesidades de los pacientes y del personal clni-co responsable de la asistencia de dichos pacientes. Los servicios incluyen los acuer-dos de peticin, la preparacin e identificacin del paciente, la toma de muestras, el


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transporte, el almacenamiento, el procesado y el anlisis de las muestras clnicas, junto con la consiguiente validacin, interpretacin, comunicacin y asesoramiento, adems de las consideraciones de seguimiento y tica en el trabajo en el laboratorio clnico. En un futuro cercano, esta acreditacin ser el requisito de actividad de laboratorio para su implementacin en todo el territorio nacional e internacional, como ocurre en otros pases europeos.

1.5.2.3. controles de calidad externos e intercomparacionesAmbas normativas recogen de forma especfica el requisito imprescindible de realizar este tipo de controles para obtener la licencia.

La norma UNE-EN-ISO 15189, ms explcita, determina que el laboratorio debe parti-cipar en comparaciones entre laboratorios organizadas en el marco de programas de evaluacin externa de la calidad. En la medida de lo posible, estos programas deberan proporcionar ensayos con relevancia clnica que simulen las muestras del paciente y ten-gan el efecto de verificar el proceso completo de anlisis, incluyendo los procedimientos preanalticos y postanalticos.

En el caso que nos ocupa, la tecnologa de arrays-CGH, existe un programa europeo de control de calidad. Este control, organizado por el Programa CEQA (del ingls Cytoge-netics European Quality Assesment) se lleva a cabo anualmente y ofrece una posibilidad nica para determinar y evaluar la calidad del trabajo que realiza el laboratorio. Se puede obtener ms informacin en www.ceqa-cytog.eu.

En general, tanto los requisitos recogidos en la Orden como los descritos en la norma sobre ISO 15189 hacen referencia a asegurar la mejor profesionalidad a lo largo todas las fases del proceso de diagnstico: registro, fases pre- y postanaltica, informes, cualifica-cin del personal, etc.

1.6. recomendacIones tcnIcas y profesIonales

Dentro del contexto de esta gua, que est dirigida a la implantacin de los array-CGH para su aplicacin clnica en el diagnstico gentico, se considera recomendable que los laboratorios que ofrezcan tecnologas genmicas se comprometan al cumplimiento de los siguientes requerimientos tcnicos:

1. El laboratorio que ofrece la tecnologa de arrays-CGH debe tener definido sin ambige-dad el catlogo completo de plataformas genmicas disponibles para el genetista clnico.

Este catlogo debe incluir para cada plataforma: Tipo de plataforma: BAC, oligos, SNP, otros. Compaa fabricante. Tipo de cobertura: Genoma completo.

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Plataforma de diseo especfico para patologas o regiones de inters. Para esta opcin ser necesario tener disponible la descripcin detallada de las regiones y/o los sndromes: tamao de cada regin incluida, localizacin en el genoma, contenido en genes de inters, diseo registrado en organismos o bases de datos pblicas o privadas.

Resolucin: tamao mnimo (terico y real) de la alteracin para ser detectada, identifi-cada y mapeada con la mayor precisin posible.

Tiempo de hibridacin recomendado. Disponibilidad de autorizacin legal para su uso en el diagnstico in vitro (por ejemplo,

la marca CE para IVD o similar). Definicin de las limitaciones de la tecnologa. Definicin de falso positivo. Definicin de falso negativo.

2. El laboratorio que ofrece la tecnologa de arrays-CGH debe tener accesible la informa-cin sobre los siguientes puntos considerados crticos en sus instalaciones:

Localizacin del laboratorio, entorno y disponibilidad para recibir muestras con trazabilidad. Tipo de escner: fabricante, resolucin. Software(s) de extraccin, almacenamiento y anlisis de la informacin: escner, control

de calidad de los datos generados, servidor, tipo de proteccin de los datos almacena-dos, mtodo seguro de transferencia de datos.

3. El laboratorio que ofrece la tecnologa de arrays-CGH debe reunir algunos requisitos que permitan, de forma razonable, confiar en los datos que proporcionen al genetista. Esta confianza est sustentada en:

El responsable cientfico y/o tcnico del laboratorio ha de reunir los siguientes requisitos: Formacin mnima de licenciatura en alguna disciplina biosanitaria: Medicina, Biolo-

ga, Farmacia, Bioqumica o similar. Experiencia demostrable en el campo de la genmica aplicada al diagnstico gen-

tico: actividad asistencial desarrollada en un hospital o laboratorio acreditado o con actividad reconocida, actividad cientfica en el rea (tesis doctoral, artculos, partici-pacin en congresos de la especialidad).

Se considera muy recomendable la pertenencia a sociedades cientficas relaciona-das con el rea de la Gentica.

En particular, la Asociacin Espaola de Gentica Humana, dada la ausencia de es-pecialidad sanitaria, otorga una acreditacin en Gentica Humana a aquellos de sus asociados que, tras solicitarlo, superan la puntuacin exigida mediante un baremo es-tablecido que reconoce la actividad cientfica y asistencial en esta rea (ms informa-cin en la pgina web de esa asociacin [www.aegh.org]). Sera recomendable que el responsable tcnico ostente la acreditacin de la AEGH.

4. El laboratorio que ofrece la tecnologa de arrays-CGH como herramienta de ayuda al diagnstico clnico gentico debe cumplir la normativa sobre actividad sanitaria que le sea aplicable dependiendo de su ubicacin funcional. Si est integrado dentro de un centro sanitario pblico o privado con actividad asistencial con una cartera de servicios


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que incluya el diagnstico gentico, deber cumplir la normativa que est en vigor en dicho centro. Si no se encuentra integrado deber cumplir la normativa que sea aplicable a la actividad sanitaria de centros de diagnstico. Esta normativa se desarrolla a partir del Real Decreto 1277/2003, de 10 de octubre, por el que se establecen las bases genera-les sobre autorizacin de centros, servicios y establecimientos sanitarios, y del Decreto 74/1998, de 2 de junio, que regula las autorizaciones de los laboratorios clnicos y se establecen sus condiciones y requisitos tcnicos, as como las normas reguladoras de su actividad. Adems, cada comunidad autnoma ha desarrollado su propia normativa, recogida en el Anexo I.

En cualquier caso, se considera muy recomendable establecer en el laboratorio un sis-tema de acreditacin de calidad especfico para laboratorios clnicos (tipo UNE-EN-ISO 151789) y participar de forma regular y documentada en controles de calidad externos.

5. Como recomendacin final, el personal de los laboratorios de Genmica dedicados al diagnstico gentico ha de tener una base de conocimiento natural en Gentica Humana (tanto en teora como en la prctica clnica), que sea la adecuada para llegar a establecer, mediante consulta gentica, la necesidad y oportunidad de incorporar esta tecnologa como herramienta de primera opcin o como herramienta alternativa a las ya existentes. Por tanto, los requerimientos tcnicos que se aplican a un laboratorio de diagnstico gentico han de ser exigibles al laboratorio que proporcione la tecnologa genmica. Una descripcin detallada de los mismos se puede encontrar en la pgina web de la Asociacin Espaola de Gentica Humana, en su seccin de documentos (http://www.aegh.org/documentos.jsp).

1.7. bIblIoGrafa

1. Mitelman F. Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. (2005), Accession Date: 2006, http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman.

2. Schinzel A. Catalogue of Unbalanced Chromosome Aberrationsin Man. Berlin/New York: Walter de Gruyter 2001.

3. Chaganti RS. Significance of chromosome change to hematopoietic neoplasms. Blood 1983; 62 (3): 515-24.

4. Espinet B, Lloveras E, Sol F. In situ hybridization techniques. Basis and applications in hematologic neopla-sias. Barcelona: Sangre 1999; 44 (4): 261-7.

5. Sellner LN, Taylor GR. MLPA and MAPH: new techniques for detection of gene deletions. Hum Mutat 2004; 23: 413-9.

6. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 1992; 258: 818-21.

7. Suela J, lvarez S, Cigudosa JC. ADN profiling by arrayCGH in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes. Cytogenet Genome Res 2007; 118 (2-4): 304-9.

8. Solinas-Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, Nickolenko J,

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