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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
FUNDACIÓN ROZAS-BOTRÁN
INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES GENÉTICAS Y
METABÓLICAS –INVEGEM-
INFORME FINAL
“DETECCIÓN DE LA MUTACIÓN T315I EN EL GEN QUIMÉRICO BCR-ABL
COMO INDICADOR DE RESISTENCIA AL TRATAMIENTO CON INHIBIDORES
TIROSIN KINASAS EN PACIENTES CON LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA”
PROYECTO FODECYT No. 46-2013
Dra. Claudia Lorena Carranza Meléndez
Investigadora Principal
Guatemala, mayo 2016
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AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional
de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología
–SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –CONCYT- .
iii
OTROS AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible también gracias a:
• Apoyo financiero y académico del Instituto de Investigación en Enfermedades Genéticas y
Metabólicas –INVEGEM-.
• Apoyo financiero de la Fundación Rozas-Botrán.
• Cooperación de la Unidad de Oncología Pediátrica –UNOP-
• Cooperación del Dr. Mauricio Villegas, Dr. Julio Cáceres y Dra. Silvana Torselli.
iv
RESUMEN
El advenimiento de medicamentos a nivel molecular como los inhibidores tirosin kinasas
(Imatinib, Nilotinib y Dasatinib); marcan una nueva etapa en la era de tratamiento en cáncer. La
leucemia mieloide crónica es una enfermedad cancerosa, que posee una característica molecular
principal: el 90% de los pacientes tienen la t(9;22), que produce el gen quimérico BCR-ABL1. Los
tres inhibidores tirosin kinasas que actualmente se encuentran en el mercado son tratamientos
específicos para los pacientes BCR-ABL1 positivos. Sin embargo a nivel mundial, se ha visto que un
20-30% de pacientes tratados con este tipo de tratamiento, muestran resistencia al mismo. Y la
principal causa de resistencia que se ha encontrado es la presencia de mutaciones en el gen quimérico
BCR-ABL1.
En Guatemala se ha encontrado aproximadamente un 35% de pacientes que no están
respondiendo bien al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas y no se sabe la causa. La mutación
T315I en el gen BCR-ABL es la mutación más agresiva que se ha reportado en la resistencia a los
inhibidores tirosin kinasas; ya que es resistente a los tres inhibidores que se encuentran disponibles
actualmente en el mercado; dejando como única opción el trasplante de médula ósea. Por esta razón
en el presente estudio, se tuvo como objetivo principal detectar la presencia de la mutación T315I en
el gen BCR-ABL1 en pacientes que no han alcanzado una respuesta óptima; esto con el fin de
determinar la posible resistencia a Imatinib, Nilotinib y Dasatinib.
Se determinó la existencia de mutaciones de resistencia a inhibidores tirosin kinasa en el 11 %
del grupo de estudio. La mutación G250E fue la más frecuente (6.0 %); mientras que la mutación
T315I estuvo presente en 1.2 % de los pacientes analizados. Por tanto, los datos obtenidos son un
parámetro a evaluar por parte del médico para cambio en la estrategia de tratamiento en los pacientes
que presenten mutaciones de resistencia. Además este estudio permitió conocer las características
genéticas de población guatemalteca con Leucemia Mieloide Crónica, determinando la incidencia de
esta mutación en nuestra población.
Palabras clave: leucemia mieloide crónica, inhibidores tirosin kinasa, mutación T315I
v
ABSTRACT
The advent of drugs at the molecular level as tyrosine kinase inhibitors (Imatinib, Nilotinib
and Dasatinib); mark a new stage in the era of cancer treatment. Chronic myeloid leukemia is a cancer
disease, which has a main molecular feature: 90% of patients have the t (9; 22), which produces the
BCR-ABL1 chimeric gene. The three tyrosine kinase inhibitors that are currently on the market are
specific treatments for BCR-ABL1 positive patients. However globally, it has been found that 20-
30% of patients treated with this kind of treatment show resistance to it. And the main cause of
resistance that has been found is the presence of point mutations in the BCR-ABL1 chimeric gene.
In Guatemala some researches has been found that approximately 35% of patients are not
responding well to treatment with inhibitors tyrosine kinases and the cause is not known. The T315I
mutation in the BCR-ABL gene generates the most aggressive resistance that has been reported to
tyrosine kinase inhibitors; include the three inhibitors that are currently available in Guatemala;
leaving as the only option a bone marrow transplantation for treatment. Therefore in this study, main
objective was to detect the presence of the T315I mutation in the BCR-ABL1 gene in patients who
have not achieved an optimal response; this in order to determine the possible resistance to Imatinib,
Nilotinib and Dasatinib.
We found the existence of mutations that generates resistance to tyrosine kinase inhibitors in
11% of the study group. The G250E mutation was the most common (6.0%); while the T315I mutation
was present in 1.2% of patients analyzed. Therefore, the data is a parameter to be evaluated by the
doctor to change the treatment strategy in patients who develop resistance mutations. Furthermore,
this study allowed us to know the genetic characteristics of Guatemalan population with chronic
myeloid leukemia, determining the incidence of this mutation in our population.
Key Words: Chronic Myeloid Leukemia, tyrosine kinase inhibitors, T315I mutation
vi
BREVE BIOGRAFÍA ACADÉMICA DE LOS AUTORES
1. Claudia Lorena Carranza, PhD. Biología Molecular:
En el año de 2004 se gradúo con honores de la licenciatura en Química Bilógica en la
Universidad de San Carlos de Guatemala.
En el período 2005-2007 cursó el programa de Doctorado en Biología Molecular y Celular,
especializado en Genética en el Centro de Investigación Médica Aplicada –CIMA–, de la
Universidad de Navarra, en Pamplona España.
En el año 2008, se incorpora en el Instituto de Investigación Científica y Educación acerca de
las Enfermedades Genéticas y Metabólicas - INVEGEM - , el primer centro de investigación
en Genética en Guatemala; donde labora actualmente como Directora Científica.
Durante el período 2011-2012 cursa el Master en Bioética de la Universidad del Itsmo de
Guatemala, graduándose en el año 2013.
2. Luisa Rosales, Br.:
Pensum cerrado de la carrera de Química Biológica, de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala, egresada en el 2012.
Desde el año 2013 hasta la fecha ha laborado en varios proyectos de investigación
relacionados con enfermedades hemato-oncológicas ejecutados por el Instituto de
Investigación Científica y Educación acerca de las Enfermedades Genéticas y Metabólicas -
INVEGEM – como investigadora científica.
3. Lda. Mariana Herrera, Q.B.:
En el año de 2012 se gradúo de Química Bióloga en la Universidad de San Carlos de
Guatemala. Posee pensum cerrado de la Maestría en Microbiología de las Enfermedades
Infecciosas de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos
de Guatemala.
Desde el año 2013 a la fecha labora como investigadora científica del Instituto de Investigación
Científica y Educación acerca de las Enfermedades Genéticas y Metabólicas - INVEGEM - ,
participando en diferentes proyectos de investigación en genética humana.
vii
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... ix
LISTA DE TABLAS ........................................................................................................... xi
LISTADO DE FOTOGRAFÍAS ........................................................................................ xi
LISTADO DE GRAFICAS ................................................................................................ xi
GLOSARIO ........................................................................................................................ xii
RESUMEN ........................................................................................................................ xiii
SUMMARY (ABSTRACT) .............................................................................................. xiv
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1
I. 2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................. 3
I.2.1 Antecedentes en Guatemala ............................................................................... 3
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación .......................................................... 4
I. 3 OBJETIVOS ............................................................................................................. 5
I.3.1 General ............................................................................................................... 5
I.3.2 Específicos ......................................................................................................... 5
I.3.3 Hipótesis ........................................................................................................... 5
I. 4 METODOLOGÍA .................................................................................................... 6
1.4.1 Localización ...................................................................................................... 6
1.4.2 Variables ........................................................................................................... 6
1.4.3 Indicadores ....................................................................................................... 6
1.4.4 Estrategia Metodológica ................................................................................... 6
1.4.5 Método ............................................................................................................. 7
1.4.6 Técnica Estadística ......................................................................................... 11
1.4.7 Instrumentos a utilizar .................................................................................... 12
viii
PARTE II
II.1 MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 13
PARTE III
III. 1 RESULTADOS .................................................................................................. 29
III. 2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS ...................................................................... 36
PARTE IV
IV. 1 CONCLUSIONES .............................................................................................. 41
IV. 2 RECOMENDACIONES ................................................................................... 42
IV. 3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 43
IV. 4 ANEXOS ........................................................................................................... 47
Anexo 1: Consentimiento informado ...................................................................... 47
Anexo 2: Ficha de recolección de datos .................................................................. 51
Anexo 3: Guía para la interpretación de resultados ................................................ 52
Anexo 4: Listado de pacientes y resultados obtenidos ........................................... 53
Anexo 5: Procedimiento de estandarización de muestras ........................................ 56
Anexo 6: PCR de amplificación BCR-ABL en pacientes con LMC ....................... 58
Anexo 7: Electroferograma de pacientes negativos para mutaciones ...................... 63
Anexo 8: Actividades de divulgación de los resultados del proyecto ...................... 89
PARTE V
V. 1 INFORME FINANCIERO ................................................................................ 93
ix
LISTADO DE FIGURAS
Figura No. 1: Frote de Sangre periférica con presencia de blastos ................................ 15
Figura No. 2: Análisis citogenético realizado a pacientes con sospecha de LMC .......... 15
Figura No. 3: Frote de médula ósea de un paciente con LMC ........................................ 16
Figura No. 4: Esquema de la t(9;22) y la localización de los genes ABL y BCR ........... 17
Figura No. 5: Localización de los puntos de rotura en los genes ABL y BCR ............... 18
Figura No. 6: Ruta de señalamiento activada por BCR-ABL ........................................ 21
Figura No. 7: Estructura química de los principales inhibidores tirosin kinasas. ........... 23
Figura No. 8: Estructura química 3D de los principales inhibidores tirosin kinasas. ..... 24
Figura No. 9: Mecanismo de inhibición de la mutación T315I ..................................... 27
Figura No. 10: Electroferograma que muestra la mutación T315I ................................. 32
Figura No.11: Electroferograma que muestra las mutaciones G250E ........................... 32
Figura 12: Electroferograma que muestra las mutaciones G250E + E453K ................. 33
Figura 13: Electroferograma que muestra la mutación E279K ...................................... 34
Figura 14: Electroferograma que muestra la mutación F23V ........................................ 34
Figura 15: Valores de escala internacional de BCR-ABL. ............................................. 37
Figura 16: Agrupación de la mutación del gen BCR-ABL1, según dominio ................. 38
Figura 17: Sensibilidad de TKI según la mutación en BCR-ABL encontrada ............... 39
Figura 18: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 63
Figura 19: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 64
Figura 20: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 65
Figura 21: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 66
Figura 22: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 67
Figura 23: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 68
Figura 24: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 69
Figura 25: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 70
x
Figura 26: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 71
Figura 27: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 72
Figura 28: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 73
Figura 29: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 74
Figura 30: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 75
Figura 31: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 76
Figura 32: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 77
Figura 33: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 78
Figura 34: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 79
Figura 34: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 80
Figura 36: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 81
Figura 37: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 82
Figura 38: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 83
Figura 39: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 84
Figura 40: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 85
Figura 41: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 86
Figura 42: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 87
Figura 43: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 88
Figura 44: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1 .................. 88
Figura 45: Conmemoración día internacional de la LMC 2013 ...................................... 89
Figura 46: Conmemoración día internacional de la LMC 2015 ...................................... 90
Figura 47: Póster Científico FODECYT 46-2013 ........................................................... 91
Figura 48: Presentación de póster y conferencia. ............................................................ 92
xi
INDICE DE TABLAS
Tabla No. 1: Evaluación de la respuesta al tratamiento con Imatinib ................................ 25
Tabla No. 2: Mutaciones frecuentes en BCR-ABL ........................................................... 27
Tabla No.3: Respuesta al Imatinib en pacientes analizados FODECYT 24-2010 .............. 28
Tabla No. 4: Respuesta al Imatinib en el monitoreo molecular FODECYT 24-2010 ......... 28
Tabla No. 5: Características médicas de los pacientes con LMC evaluados ....................... 30
Tabla No. 6: Valores de % IS de los pacientes incluidos en este estudio ........................... 31
Tabla No.7: Características moleculares y clínicas de los pacientes con mutaciones en BCR-ABL .. 35
Tabla No. 8: Listado de pacientes y resultados obtenidos en el proyecto ............................ 53
LISTADO DE FOTOGRAFÍAS
Fotografía No. 1: Estandarización de PCR para dominio tirosin quinsa de BCR-ABL.. 56
Fotografía No. 2: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1 ........ 58
Fotografía No. 3: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1 ........ 59
Fotografía No. 4: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1 ........ 60
Fotografía No. 5: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1 ........ 61
Fotografía No. 6: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1 ........ 62
LISTADO DE GRAFICOS
Grafica No. 1: TKI utilizado como terapia según el centro de asistencia médica ........... 29
Grafica No. 2: Porcentaje de mutaciones de resistencia a TKI encontradas ................... 31
xii
GLOSARIO
BCR-ABL 1: Oncogen de fusión producido por la translocación del cromosoma 9 y 22
(cromosoma Philadelfia); presente en el 90 % de los pacientes con Leucemia Mieloide
Crónica.
Inibidor Tirosin Kinasa (TKI): Fármacos de nueva generación diseñados por computadora
para actuar sobre dianas moleculares específicas (proteínas tirosin quinasas). Son empleados
para el tratamiento de cáncer, ya que eliminan gradualmente las células con la proteína diana
(oncogénicas) sin afectar las células normales. En Guatemala existen tres inhibidores
disponibles: Imatinib, Dasatinib y Nilotinib.
Leucemia Mieloide Crónica: La leucemia mieloide crónica (LMC) es un síndrome
mieloproliferativo crónico de naturaleza clonal, con origen en una célula madre pluripotencial
común a las tres series hematopoyéticas.
Translocación: Es el intercambio de un segmento o fracción entre dos cromosomas no
homólogos. Una translocación ocurre cuando una región cromosómica (brazo o segmento)
cambia de posición en el genoma, pero el número de copias de dicha región se mantiene.
xiii
RESUMEN
El advenimiento de medicamentos a nivel molecular como los inhibidores tirosin kinasas
(Imatinib, Nilotinib y Dasatinib); marcan una nueva etapa en la era de tratamiento en cáncer. La
leucemia mieloide crónica es una enfermedad cancerosa, que posee una característica molecular
principal: el 90% de los pacientes tienen la t(9;22), que produce el gen quimérico BCR-ABL1. Los
tres inhibidores tirosin kinasas que actualmente se encuentran en el mercado son tratamientos
específicos para los pacientes BCR-ABL1 positivos. Sin embargo a nivel mundial, se ha visto que un
20-30% de pacientes tratados con este tipo de tratamiento, muestran resistencia al mismo. Y la
principal causa de resistencia que se ha encontrado es la presencia de mutaciones en el gen quimérico
BCR-ABL1.
En Guatemala se ha encontrado aproximadamente un 35% de pacientes que no están
respondiendo bien al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas y no se sabe la causa. La mutación
T315I en el gen BCR-ABL es la mutación más agresiva que se ha reportado en la resistencia a los
inhibidores tirosin kinasas; ya que es resistente a los tres inhibidores que se encuentran disponibles
actualmente en el mercado; dejando como única opción el trasplante de médula ósea. Por esta razón
en el presente estudio, se tuvo como objetivo principal detectar la presencia de la mutación T315I en
el gen BCR-ABL1 en pacientes que no han alcanzado una respuesta óptima; esto con el fin de
determinar la posible resistencia a Imatinib, Nilotinib y Dasatinib.
Se determinó la existencia de mutaciones de resistencia a inhibidores tirosin kinasa en 11 % del
grupo de estudio. La mutación G250E fue la más frecuente (6.0 %); mientras que la mutación T315I
estuvo presente en 1.2 % de los pacientes analizados. Por tanto, los datos obtenidos son un parámetro
a evaluar por parte del médico para cambio en la estrategia de tratamiento en los pacientes que
presenten mutaciones de resistencia. Además este estudio permitió conocer las características
genéticas de población guatemalteca con Leucemia Mieloide Crónica, determinando la incidencia de
mutaciones en nuestra población.
Palabras clave: leucemia mieloide crónica, inhibidores tirosin kinasa, mutación T315I
xiv
ABSTRACT
The advent of drugs at the molecular level as tyrosine kinase inhibitors (Imatinib, Nilotinib
and Dasatinib); mark a new stage in the era of cancer treatment. Chronic myeloid leukemia is a cancer
disease, which has a main molecular feature: 90% of patients have the t (9; 22), which produces the
BCR-ABL1 chimeric gene. The three tyrosine kinase inhibitors that are currently on the market are
specific treatments for BCR-ABL1 positive patients. However globally, it has been found that 20-
30% of patients treated with this kind of treatment show resistance to it. And the main cause of
resistance that has been found is the presence of point mutations in the BCR-ABL1 chimeric gene.
In Guatemala some researches has been found that approximately 35% of patients are not
responding well to treatment with inhibitors tyrosine kinases and the cause is not known. The T315I
mutation in the BCR-ABL gene generates the most aggressive resistance that has been reported to
tyrosine kinase inhibitors; include the three inhibitors that are currently available in Guatemala;
leaving as the only option a bone marrow transplantation for treatment. Therefore in this study, main
objective was to detect the presence of the T315I mutation in the BCR-ABL1 gene in patients who
have not achieved an optimal response; this in order to determine the possible resistance to Imatinib,
Nilotinib and Dasatinib.
We found the existence of mutations that generates resistance to tyrosine kinase inhibitors in
11% of the study group. The G250E mutation was the most common (6.0%); while the T315I mutation
was present in 1.2% of patients analyzed. Therefore, the data is a parameter to be evaluated by the
doctor to change the treatment strategy in patients who develop resistance mutations. Furthermore,
this study allowed us to know the genetic characteristics of Guatemalan population with chronic
myeloid leukemia, determining the incidence of this mutation in our population.
Key Words: Chronic Myeloid Leukemia, tyrosine kinase inhibitors, T315I mutation
1
PARTE I
I. 1 INTRODUCCIÓN
La genética y la biología molecular son ciencias que han avanzado a pasos gigantes en la
última década, constituyéndose en una herramienta vital para el manejo integral de los distintos
procesos cancerosos.
Actualmente, en países desarrollados se realizan técnicas genéticas y moleculares para
mejorar un diagnóstico, para establecer el pronóstico, para seleccionar el tipo de terapia a prescribir
y para el monitoreo del tratamiento recibido por cada paciente.
En Guatemala, se ha iniciado con una serie de proyectos de investigación, que van
abarcando poco a poco las necesidades actuales de la medicina a nivel molecular y genético.
La leucemia mieloide crónica es una afección hematológica, que se caracteriza por un desbalance en
los procesos de división, diferenciación y apoptosis celular. Esto se produce por alteraciones en
genes que regulan estos procesos celulares. La principal alteración genética encontrada en esta
enfermedad es la presencia de la translocación t(9;22); la cual produce un gen quimérico llamado
BCR-ABL1. Este gen quimérico se convierte en un gen tirosin kinasa activo de manera constitutiva,
es decir no regulada; transmitiendo señales que alteran el desarrollo celular.
En la industria farmacéutica, se han desarrollado un tipo de medicamentos que son
específicos para el gen BCR-ABL1, llamados de manera global: inhibidores tirosin kinasa.
Actualmente, el Imatinib, Nilotinib y Dasatinib son los tres medicamentos de este tipo que se
encuentran en el mercado.
El Imatinib es el medicamento de primera línea para tratar la leucemia mieloide crónica;
cuando hay fallo de este tratamiento, se cambia a Nilotinib y Dasatinib, que son medicamentos de
segunda línea.
Se ha visto que la causa principal de la resistencia a este tipo de fármacos, es la presencia
de mutaciones en el gen BCR-ABL1, que impiden la unión del medicamento con su diana específica.
2
La mutación T315I, es la más agresiva que se ha reportado, y además los pacientes que la presentan
son resistentes a todos los inhibidores tirosin kinasas que se encuentran el mercado. Es decir que a
los pacientes que presenten este tipo de mutación, se les debiera suspender el tratamiento con
inhibidores tirosin kinasas, ya que son resistentes a los mismos; y debieran de ser tratados con
terapias alternativas.
En el presente proyecto de investigación, se tuvo como objetivo general la detección de la
presencia de la mutación T315I en pacientes con leucemia mieloide crónica que muestran resistencia
al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas; para poder apoyar el médico hematólogo en la
estrategia terapéutica ideal para cada paciente.
3
I. 2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.2.1 Antecedentes en Guatemala
Los inhibidores tirosin kinasas son los primeros medicamentos desarrollados en la era
molecular, cuya diana es un gen quimérico llamado BCR-ABL1, y que se encuentra en un 90%
en leucemia mieloide crónica (LMC). Un alto porcentaje de los pacientes con LMC, responden
muy bien a este tipo de medicamentos, y sin efectos secundarios severos como ocurre cuando esta
enfermedad se trata solo con quimioterapia. Una respuesta óptima a este tipo de inhibidores, se
define cuando el paciente alcanza una respuesta molecular mayor (< 0.1% IS BCR-ABL1/ABL)
en un período menor o igual a 18 meses. Si un paciente no logra alcanzar la respuesta molecular
mayor en este período; se dice que hay un fallo de terapia; y este fallo de terapia se debe
principalmente a presencia de mutaciones en el gen BCR-ABL1, que provocan una respuesta muy
pobre al tratamiento; siendo la mutación más agresiva la T315I. En Guatemala, no se han
estudiado las causas de la resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas en los
pacientes con leucemia mieloide crónica BCR-ABL1 positivo.
La importancia de determinar la mutación T315I en estos pacientes, radica en que los
pacientes positivos para esta mutación, son resistentes a todos los inhibidores tirosin kinasas. Por
lo que el hematólogo, debe cambiar de estrategia terapéutica en los pacientes que sean positivos
para la mutación T315I.
En países desarrollados, se realiza la detección de mutaciones en el gen BCR-ABL1 como
una prueba de rutina para determinar la resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas.
En Guatemala no se han estudiado con anterioridad las causas de la resistencia al tratamiento con
inhibidores tirosin kinasas en pacientes con leucemia mieloide crónica BCR-ABL1 positivo. Y
por esta razón la sugerencia de cambio de terapia, se hace sólo basado en datos clínicos, aunque
la indicación sea determinar la presencia de mutaciones en el gen quimérico BCR-ABL1. La
detección de estas mutaciones confirmaría la resistencia al tratamiento, e indicarían el nuevo
tratamiento a elegir.
En un estudio co-financiado por SENACYT (proyecto FODECYT 24-2010) se realizó un
estudio piloto para el monitoreo molecular de las copias de BCR-ABL1 en pacientes con leucemia
4
mieloide crónica, y se determinó que aproximadamente un 35% del total de pacientes analizados
poseen fallo de respuesta a la terapia con inhibidores tirosin kinasas, este grupo es el candidato
para estudiar la presencia de la mutación T315I.
1.2.2 Justificación del trabajo de investigación
En Guatemala, aproximadamente el 35% de pacientes con leucemia mieloide crónica; no
alcanzan la respuesta molecular mayor en 18 meses; por lo que se clasifican como un fallo de
respuesta al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas. El costo de estos medicamentos oscila
entre Q. 30,000.00 a Q. 50,000.00, y actualmente todos los pacientes BCR-ABL1 positivos en
Guatemala, se encuentran recibiendo este tipo de tratamientos, sin importar si son resistentes o
sensibles al mismo.
Este 35% de pacientes que no responden adecuadamente al tratamiento, son candidatos
para evaluar la presencia de la mutación T315I; y de esta manera determinar a nivel de biología
molecular la resistencia a los medicamentos, y evitar la administración de los mismos a los
pacientes resistentes; esto conllevará a una reducción de costos económicos que actualmente están
siendo cubiertos por el seguro social y algunas fundaciones.
La determinación de la mutación T315I, sirve como un indicador para determinar esta
resistencia; y además de parámetro para descontinuar el uso de los inhibidores tirosin kinasas en
los pacientes resistentes.
Por otro lado, la detección de la frecuencia de la mutación T315I en la población
guatemalteca; por lo que los resultados obtenidos permiten continuar la caracterización genética
de los tumores hematológicos en nuestra población. Esto será un aporte a nivel nacional e
internacional, pues se conoce parte de la genética de la leucemia mieloide crónica en Guatemala;
y con ello es posible realizar comparaciones con lo publicado en el resto de países.
5
I. 3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS
1.3.1 Objetivo General:
Detectar y evaluar la presencia de la mutación T315I en el gen quimérico BCR-ABL1,
como causa de resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas en pacientes con
leucemia mieloide crónica.
1.3.2 Objetivos Específicos:
1.3.2.1. Detectar y evaluar la presencia de la mutación T315I en el gen quimérico BCR-
ABL1, como causa de resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas en
pacientes con leucemia mieloide crónica.
1.3.2.2. Establecer la frecuencia de la mutación T315I en el gen quimérico BCR-ABL1 en
la población guatemalteca.
1.3.2.3. Determinar y evaluar la resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas en
pacientes que presenten mutación T315I en el gen BCR-ABL1.
1.3.2.4. Orientar al médico a otro tipo de estrategia terapéutica, en los pacientes con
resistencia a los inhibidores tirosin kinasas.
1.3.2.5 Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el campo de su
competencia la información obtenida de la investigación.
1.3.3 Hipótesis
El presente proyecto de investigación es un estudio de carácter descriptivo, en el que
se determinará en Guatemala la frecuencia de la mutación T315I y se evaluará su presencia
en pacientes con fallo a terapia o respuesta subóptima a los inhibidores tirosin kinasas; por
lo tanto carece de hipótesis estadística.
6
I. 4 METODOLOGÍA
1.4.1 Localización:
La población objetivo de este estudio la integraron todos los pacientes con diagnóstico
clínico de leucemia mieloide crónica, y que reciben tratamiento con inhibidores tirosin
kinasas, y según análisis molecular han presentado fallo de terapia o respuesta sub-optima;
sin importar la edad.
La localización geográfica, será a nivel nacional; ya que todos los pacientes del país son
referidos a la ciudad capital; y se encuentran en el seguro social o son miembros de la
Asociación de Pacientes con Leucemia Mieloide Crónica –ASOPALEU-.
1.4.2 Variables:
1.4.2.1 Variables dependientes: no aplica a este estudio por ser descriptivo.
1.4.2.2 Variables independientes: no aplica a este estudio por ser descriptivo.
1.4.3 Indicadores:
El indicador este proyecto fue de tipo cualitativo y consistió en determinar la presencia o
ausencia de mutaciones en el gen quimérico BCR-ABL1. Para ello se evaluaron los
productos de PCR amplificados en las muestras de los pacientes con Leucemia Mieloide
Crónico que evidenciaron una falla terapéutica. Los productos fueron secuenciados por
medio de la técnica de secuenciación de Sanger. Posteriormente se analizó el
cromatograma para determinar la presencia de mutaciones.
1.4.4 Estrategia Metodológica:
1.4.4.1 Población:
La población objetivo de este estudio la integran todos los pacientes con diagnóstico
clínico y de laboratorio de leucemia mieloide crónica que además evidencia un fallo
terapeútico por medio de pruebas hematológicas o monitoreo molecular sin importar
la edad.
7
1.4.4.2 Muestra:
Pacientes con diagnóstico de Leucemia mieloide crónica, con tratamiento con
inhibidores tirosin kinasas, referido por ASOPALEU (que atiende pacientes del Hospital
General San Juan de Dios y Roosevelt) y por Instituto de Seguridad Social –IGSS-.
Actualmente se tienen aproximadamente 150 pacientes en tratamiento, y se sabe que un
35% son resistentes, según lo reportado en la literatura; por esta razón se espera una
muestra aproximada de 50 pacientes.
1.4.5 El Método:
1.4.5.1 Materiales y suministros de laboratorio:
Guantes de nitrilo libres de polvo.
Puntas de pipeta desechables PCR clean de volúmenes variables.
Pipetas de Pasteur de plástico
Liga de hule.
Agujas Vacutainer 21 x 1 ½ G.
Camisa para Vacutainer.
Tubos Vacutainer de tapón morado (EDTAK2) con capacidad de 4 cc al vacío.
Jeringas con aguja 21 x 1 ½ G.
Papel mayordomo.
Algodón.
Fichas de recolección de datos.
Hojas de consentimiento informado.
Marcador indeleble negro.
Gradillas cooler.
Tubos PCR clean de 0.2, 0.6 y 1.6 mL
Guardianes para el descarte de material punzocortantes.
Papel parafilm
1.4.5.2 Reactivos:
A. Lisis diferencial de eritrocitos:
Bicarbonato de sodio
8
Cloruro de amonio
EDTA
Ácido clorhídrico
Hidróxido de sodio.
Etanol 70 %
Hipoclorito de sodio 5%
Solución salina fisiológica 9 %
B. Extracción de ARN con TRIZOL:
RNAsezap
Trizol
Isopropanol
Etanol 75 %
Agua DPC
Cloroformo
C. RT-PCR:
Kit de retrotranscripción de alta capacidad Applied Biosystems
H2O DEPC
D. PCR convencional:
Kit de amplificación (DNA polimerasa, buffer 10X, MgCl2)
Deoxinucleótidos, 10 mM
Primers específicos de detección (300 picomoles)
H2O DEPC
E. Electroforesis y tinción de geles:
Agarosa LE
Buffer TAE 1x (Tris Base, EDTA, ácido acético)
Gel Red 10,000X en H2O
9
1.4.5.3 Procedimientos de laboratorio:
A. Muestra biológica:
Se utilizaron muestras sangre periférica de pacientes con diagnóstico confirmado de
Leucemia Mieloide Crónica y tratamiento con algún inhibidor tirosin kinasa por más
de 18 meses. Las muestras fueron referidas de los de los distintos hospitales
nacionales, durante el período de dos años correspondientes a febrero 2014 hasta
diciembre 2015. La recolección de las muestras se realizó posteriormente a la firma
del consentimiento informado y aceptación de los pacientes y/o encargados (en caso
de menores) a participar en el estudio (Ver Anexo 1). Además se llenó una ficha
estándar para recolectar datos de interés del estudio (Ver Anexo 2)
Las muestras fueron recolectadas mediante flebotomía y se recolectaron entre 5 y 15
cm3 de sangre venosa periférica. Las muestras fueron recolectadas en tubos con
EDTA y almacenadas a 4 °C por un período máximo de 24 horas hasta su
procesamiento.
B. Obtención de glóbulos blancos por lisis diferencial de eritrocitos:
La forma bicóncava de los eritrocitos, hace su membrana particularmente sensible a
cambios de osmolaridad; y ésta característica permite hacer una lisis diferencial para
obtener células blancas mediante el uso de soluciones de alta osmolaridad con cloruro
de amonio.
C. Extracción de ARN con TRIZOL:
El RNA total se extrajo utilizando Trizol comercial (INVITROGEN, USA) a partir
de las suspensiones de leucocitos obtenidos en el proceso anterior. El procedimiento
fue realizado según las indicaciones de fabricante (Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA).
D. RT-qPCR para la evaluación de enfermedad mínima residual y monitoreo de terapia:
La evaluación de enfermedad mínima residual se realizó utilizando una cuantificación
relativa del gen BRC-ABL por medio de PCR tiempo real utilizando los kits
10
comerciales SuperScript® III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA
Polymerase y MolecularMD® One-Step qRT-PCR BCR-ABL Kit en el equipo 7500
Fast Real-Time PCR Systems de Applied Biosystems; según las instrucciones del
fabricante. Después de obtener los resultados del monitoreo de terapia se evaluaron
todos los pacientes con un valor de escala internacional (% IS) superior a 0.01 % y
más de 18 meses de tratamiento. Se incluyeron además pacientes con menor tiempo
de tratamiento pero una alta sospecha médica de resistencia a inhibidores tirosin
quinasa.
.
E. Retrotranscripción:
Para la síntesis de cDNA se utilizó 1µg de RNA extraído y se utilizó el Kit comercial
de Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, que utiliza
hexámeros al azar para la síntesis en 20µl de reacción en condiciones estándar.
F. Amplificación del dominio Tirosin kinasa del gen BCR-ABL1:
Se realizara un RT-PCR seminested para la amplificación. Los primers utilizados
fueron los descritos por Bradford y Hughes (2006) bajo las condiciones establecidas
por los mismos autores. En este proceso se obtuvo un fragmento de 863 pb
correspondiente al dominio tirosin kinasa del gen BCR-ABL1 [29].
G. Electroforesis en gel de agarosa:
Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa
al 2 %, después de la tinción por 25 minutos con GelRed 2 X. La presencia del
transcrito fue comprobada con la visualización de fragmentos de 1504 y 1579 pb
(primera reacción) y 863 pb (segunda reacción) correspondientes a la presencia del
dominio tirosin kinasa del transcrito BCR-ABL1.
H. Secuenciación de Sanger y análisis de resultados:
Los productos amplificados por medio de PCR fueron purificados por medio del kit
comercial Spin Prep PCR Clean Up (EMD Millipore, Billerica, MA) y fueron
enviados para secuenciación de Sanger a MACROGEN (Macrogen, Rockville, MD).
11
Los electroferogramas fueron analizados utilizando el software GENEIOUS R6
(Auckland, New Zeland).
Los resultados fueron enviados al médico tratante acompañado de la información
correspondiente (Anexo 3), para orientar al cambio de TKI o mantenimiento de la
terapia actual.
1.4.5.4 Consideraciones éticas:
Se solicitó mediante un consentimiento escrito informado la aceptación expresa de los
pacientes de participar en el estudio y proporcionar los datos necesarios para su ejecución,
en el caso de los menores de edad, el encargado responsable del paciente debió aceptar el
consentimiento (Anexo 1). Además el presente estudio fue sometido a un comité de
bioética asociado a la institución.
1.4.6 La Técnica Estadística:
1.4.6.1 Tipo de estudio:
El estudio realizado fue de tipo descriptivo longitudinal prospectivo, ya que se estableció
la frecuencia de la mutación T315I en Guatemala; fue longitudinal y prospectivo ya que
se ejecutó durante 21 meses en el período de enero del 2014 hasta diciembre 2015.
1.4.6.2 Diseño estadístico:
Las variables sociodemográficas y hematológicas fueron recolectadas mediante una
ficha de recolección de datos (Anexo 2).
Las variables obtenidas a través de la ficha de datos fueron tabuladas a de una base de
datos creada en el programa Excell, en el que se realizó el análisis.
Estadística descriptiva general de la muestra en el programa estadístico Excell.
Las variables cuantitativas se analizaron en base a la mediana de la muestra.
12
1.4.7 Instrumentos a utilizar:
Durante la parte experimental de este proyecto, se utilizó una gran diversidad de equipo de
laboratorio y análisis:
Refrigeradora.
Pipetas automáticas de volumen variable de 1.0 – 10.0 μL
Pipetas automáticas de volumen variable de 10 – 100 μL
Pipetas automáticas de volumen variable de 100 – 1000 μL
Centrífuga.
Autoclave.
Cabina de seguridad biológica tipo II.
Balanza analítica.
Termociclador
Vórtex
Congelador -20 °C
Potenciómetro.
13
PARTE II
II. 1 MARCO TEÓRICO
A. Aplicación de las técnicas citogenéticas y moleculares en el estudio del cáncer
El cáncer es una enfermedad en la que se produce un crecimiento desordenado de un
clon celular, debido a una alteración en el proceso de crecimiento celular, en la diferenciación
celular o en la apoptosis celular. Es una enfermedad considerada de origen genético
adquirido; esto quiere decir que su causa son las distintas alteraciones genéticas que se han
desarrollado y adquirido con el transcurso del tiempo.
Las principales técnicas que actualmente se utilizan para el diagnóstico, pronóstico y
monitoreo de las neoplasias son las técnicas citogenéticas y moleculares. Las técnicas de
análisis citogenético permiten estudiar de manera global los 46 cromosomas, y detectar
cualquier alteración presente. Estas técnicas se han desarrollado mejor en neoplasias
hematológicas debido a la facilidad de obtención de metafases en tejidos líquidos. En
neoplasias sólidas se tiene la dificultad de obtención de metafases adecuadas, por lo que la
utilidad de las técnicas citogenéticas es limitada.
Las técnicas de biología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa –
PCR- y sus distintas variedades, se han desarrollado también ampliamente para el estudio de
distintas neoplasias. Sin embargo estas técnicas no son pruebas de screening, por lo que se
necesita conocer específicamente la alteración genética que se desea estudiar. Entre las
ventajas de las técnicas moleculares sobre las citogenéticas es que poseen una mayor
sensibilidad y especificidad.
En el estudio de neoplasias hematológicas es posible la aplicación de métodos de
biología molecular por medio de la detección de transcritos (mRNA de una sección genética
especifica). Estas técnicas son de gran utilidad para el diagnóstico, pronóstico y monitoreo
de la enfermedad mínima residual (EMR) y, por tanto, ayudan en las decisiones clínicas para
definir nuevas estrategias terapéuticas que favorezcan la disminución de la actividad
oncogénica [11].
14
En resumen, para un estudio genético completo de una neoplasia hematológica y
algunos tumores sólidos se recomienda utilizar tanto las técnicas citogenéticas como las
moleculares [11].
B. Neoplasias Hematológicas:
Las neoplasias hematológicas forman un grupo de enfermedades que provienen de la
expansión clonal de células hematopoyéticas. La leucemia constituye una colección
heterogénea de neoplasias originadas en el tejido formador de sangre, que se caracteriza por
la expansión clonal de células hematopoyéticas como resultado de una alteración en los
mecanismos de proliferación, diferenciación y muerte celular, en cualquiera de las etapas de
maduración de las células sanguíneas, habitualmente acompañada de la invasión al torrente
sanguíneo y producción de metástasis, con mayor o menor grado de desorganización de los
tejidos invadidos [11,12].
Las leucemias se clasifican basándose en el tipo de células afectadas y en su estado
de maduración. Las agudas se caracterizan por la presencia de células muy inmaduras
(denominadas blastos) y por un curso rápidamente mortal. Las crónicas se caracterizan por
una población expandida de células que proliferan y que conservan su capacidad para
diferenciarse y madurar. Se distinguen dos variantes: linfocíticas y mielocíticas. Así pues de
forma rudimentaria las leucemias se pueden clasificar en cuatro tipos: leucemia linfocítica
aguda (linfoblástica) (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielocítica aguda
(mieloblástica) (LMA) y leucemia mielocítica crónica (LMC) [11,12].
El diagnóstico se realiza, considerando, además de las manifestaciones clínicas,
estudios de laboratorio que incluyen hemograma, frotis de sangre periférica, inmunofenotipo,
biopsia y el frotis de médula ósea (Ver figura No. 1). En la actualidad la tinción con
inmunohistoquímica de células malignas en sangre periférica, es uno de los métodos más
específicos para clasificar las leucemias por lo cual se recomienda realizar este procedimiento
en todo paciente con esta enfermedad, al igual que el seguimiento de un protocolo que
combine la citomorfología y citoquímica con el inmunofenotipo, y siempre que sea posible
acompañado por métodos citogenéticos y moleculares permitiendo con ello no solo un
15
diagnóstico certero, sino que además proporcionar una amplia información sobre el
pronóstico del paciente y el tratamiento a seguir (Ver figura No. 2) [11,12].
Figura No. 1: Frote de Sangre Periférica con presencia de Blastos
Fuente: fuente:www.telmed.org
Figura No. 2: Análisis Citogenético, realizado en pacientes con sospecha de
Leucemia Mieloide Crónica
Fuente: www.telmed.org
16
C. Leucemia Mieloide Crónica:
La leucemia mieloide crónica (LMC) es un síndrome mieloproliferativo crónico de
naturaleza clonal, con origen en una célula madre pluripotencial común a las tres series
hematopoyéticas (Ver figura No. 3). Representa entre el 15% y el 20% del total de leucemias
y su incidencia en los países occidentales se ha estimado en 1,6 casos por cada 100.000
habitantes/año [12-18].
La LMC fue la primera enfermedad en la que se determinó una anormalidad genética
en el cariotipo, denominada cromosoma filadelfia, el cual se asoció en gran medida a la
patogenia de dicha leucemia. El cromosoma filadelfia, es el resultado de la translocación
entre los cromosomas 9 y 22, esta translocación genera la fusión de los genes BCR-ABL1;
esta reordenación se encuentra en el 90% de los pacientes con LMC. Sin embargo a pesar de
que el cromosoma filadelfia existe como única anormalidad cromosómica a través de la fase
crónica de la enfermedad y se mantiene también durante las fases avanzadas, entre el 50 y 80
% de los pacientes adquieren anormalidades cromosómicas adicionales, desarrollando
cariotipos complejos que incluyen trisomía 8, trisomía 19, isocromosoma 17 y copias
adicionales distintos cromosomas [18-19].
Figura No. 3: Frote de Médula Ósea de un paciente con LMC.
Fuente: www.telmed.org
17
D. Reordenamiento de BCR-ABL:
La fusión génica BCR-AB1L resulta de la formación del cromosoma Filadelfia, en la
que ocurre la translocación de la región q11 del cromosoma 22 (BCR) a la región q34 del
cromosoma 9 (ABL1) (Ver Figura No.4) [19].
Figura No. 4: Esquema de la t(9;22) y la localización de los genes ABL y BCR
Tomado de: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384
El gen ABL1 localizado en el cromosoma 9q, es el homólogo humano del oncogen v-
abl1 del virus de la leucemia murina y codifica para un receptor de tirosina cinasa. La
proteína normal ABL1 está involucrada en la regulación del ciclo celular, en la respuesta al
estrés genotóxico y en la transmisión de información acerca del ambiente celular a través de
la señalización mediada por las integrinas. Al parecer la proteína ABL1 tiene un complejo
papel como modulador celular que integra las señales del ambiente extracelular e intracelular
e influye en las decisiones para mantener el ciclo celular y la apoptosis [19-22].
El gen BCR, se localiza en la región q34 del cromosoma 22. La proteína BCR está
presente en varios tejidos y aunque existen datos que apoyan la hipótesis de que BCR
participa en la transducción de señales, su verdadero papel permanece sin ser determinado
[19-22].
A nivel molecular, la t(9;22) resulta en una fusión cabeza-cola de los genes BCR y
ABL1 cuando parte del gen ABL1 localizado en el cromosoma 9 es transferida e insertada
dentro del gen BCR del cromosoma 22, originando el transcrito de fusión del gen quimérico
33´ BCR
22q11
ABL9q34
5´BCR
3´BCR
5´BCR
ABL
9 22 der(9) der(22)
18
BCR-ABL1, mismo que codifica para una proteína que aumenta la actividad tirosina kinasa
con potencial neoplásico [19-22].
El oncogén quimérico BCR-ABL1 lleva a la síntesis de proteínas de diferente peso
molecular dependiendo de la localización del punto de rotura. Así es posible distinguir tres
nuevas proteínas de fusión (p190BCR-ABL, p210BCR-ABL y p230BCR-ABL). Los puntos de
rupturas más frecuentes en el gen BCR ocurren en los exones 1(e1), 12(b2), 13(b3) y 19(e19)
y el punto de ruptura en el gen ABL habitualmente se produce en el exón 2(a2) [19-23].
Cuando se da la unión de los exones b3a2 y/o b2a2 (Región M-bcr) se codifica para
una proteína de 210kD (p210BCR-ABL) la cual se presenta en el 20% a 40% de los pacientes
con Leucemia Linfoblástica aguda (LLA) y es característica en más del 95% de pacientes
con leucemia mieloide crónica (LMC); si los exones e1 y e2 son removidos por el corte y
empalme (Región m-bcr) la unión de e1a2 se transcribe en una proteína de 190kD (p190BCR-
ABL) la cual se detecta en el 60% a 80% de los pacientes con LLA y en menos del 10% para
aquellos con LMC. Es posible observar una tercer proteína de fusión próxima a 3’ del
extremo distal del gen BCR denominada p230BCR-ABL, la cual resulta de la fusión de los
exones e19a2 (Región µ-bcr), cuya expresión se asocia a leucemias crónicas neutrofilas y
trombocitosis (Ver figura No. 5) [19-23].
Figura No.5: Localización de los puntos de rotura en los genes ABL y BCR
Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.
19
Tanto la p210 como la p190 presentan una mayor actividad de tirosina Kinasa
comparada con la proteína ABL normal. La proteína BCR-1 fosforila residuos de tirosina de
muchas proteínas celulares y activa diferentes rutas de señalización, lo cual conlleva a la
transformación celular. En modelos experimentales, se ha observado que estas proteínas son
capaces de transformar precursores hematopoyéticos por la activación de señales mitógenas,
inhibición de apoptosis y alteraciones en la adhesión de las células al estroma [19-23].
E. Vías de señalización activadas por BCR-ABL1:
Una consecuencia del incremento de la actividad de la tirosina kinasa radica en que el
BCR-ABL1 puede fosforilar diferentes sustratos, activando múltiples señales de transducción
en las células. Las vías activadas son RAS, vía Fosfatidilinositol-3-cinasa, Jak-Stat, MAPK y
ROS.
1. Vía RAS:
La activación de Ras se poduce por transducción de señales mediadas por receptores
con actividad tirosin cinasas. Una vez realizada la unión al ligando y dimerización, los
receptores tirosin cinasas activados, se unen a moléculas adpatadoras que contiene los
dominios SH2 y SH3 como son Grb-2 y SHC formando complejos de señalización con
factores intercambiadores Ras en la membrana celular. Estos complejos desencadenan
una acumulación de la forma Ras e inducen un efecto antiapoptótico que, aunque sea
insuficiente, es necesario para la transformación derivada de BCR-ABL1. La activación
inapropiada del gen Ras por una mutación del gen, ha demostrado ser una importante
vía de la señal de transducción celular para la proliferación y transformación maligna
de los tumores.
2. Vía Fosfatidilinositol-3-cinasa:
Esta vía funciona en la regulación del metabolismo lipídico fosfoinositídico y en la
generación de segundos mensajeros lipídicos relacionados con la transducción de
señales. Se ha visto que una subunidad de esta proteína se fosforila en residuos tirosina
en células que expresan BCR-ABL y forma complejos con cbl y moléculas adaptadas
20
crk y crkl. PI3 está activado de forma constitutiva por la translocación BCR-ABL
jugando un papel importante en su transformación [19-23].
3. Vía Jak-Stat:
El crecimiento de las células hematopoyéticas normales se controla por citocinas. Los
receptores para estas citocinas traducen señales mediante activación de proteínas
denominadas genéricamente Jak (Janus tirosine kinases), que es una familia de cinasas
citoplasmáticas que fosforilan y activan los factores de transcripción STAT (Signal
Transducer and Activators of transcription), BCR-ABL1 activa constitutivamente las
vías de señalización de JAK y STAT en células hematopoyéticas, siendo STAT 1 y STAT
5 las tirosin-fosforiladas más importantes. La fosforilación constitutiva de factores de
transcripción STAT han sido reportados en líneas celulares positivas BCR-ABL y en
células primarias con LMC, la activación STAT 5 contribuye a la transformación
maligna a pesar de sus funciones pleiotropicas; su efecto en la transformación de
células BCR-ABL parece ser anti-apoptotico e implica la activación trasncripcional de
Bcl-xl. En contraste con la activación de la vía Jak-Stat por medio de estímulos
fisiológicos, BCR-ABL activa directamente STAT 1 y STAT 5 sin previa fosforilación
de proteínas Jak [18-23].
4. Vía MAPK:
Un primer acontecimiento de señalización que sigue a la activación de RAS es la
activación de la vía de señalización de proteínas activadoras de mitogénesis con
actividad cinasa (MAPK). Se conocen claramente tres cascadas de MAPK: la cinasa
regulada extracelularmente (ERK), la vía de las Jun cinasas o cinasas activadas por
estrés (SAPK) y la vía de la p28 cinasa. El punto final para cada una de estas vías es la
fosforilación y activación de transcripción. BCR-ABL y v-ABL activan la vía SAPK en
fibroblastos y células hematopoyéticas. Así mismo activan promotores dependientes
de Jun de manera dependiente de RAS, MEPK y SAPK. Mientras que los efectos de
BCR-ABL en la vía JNK parecen ser claros, estudios de la vía ERK muestran que la
BCR-ABL funciona de manera distinta a la mayoría de los receptores con actividad
tirosincinasa [19-23].
21
5. Vía ROS:
La transformación de las líneas celulares con BCR-ABL presenta un incremento de
ROS, comparado con las líneas celulares no BCR-ABL. Este incremento es suficiente
para la transformación fenotípica en sí misma. Se ha sugerido que ROS podría actuar
como segundo mensajero en la regulación de la actividad de las enzimas sensibles a la
acción de oxidorreducción (redox), como son las cinasas y fosfatasas. La inhibición de
la proteína tirosin fosfatasa (PTPasa) mediante la modulación redox explicaría el
amplio espectro de las actividades biológicas de ROS. Un incremento de ROS amplifica
las señales de BCR-ABL, posiblemente regulando las proteínas redox-sensibles, como
es la PTPasa celular, la cual también está incrementada. También es de particual interés
en la LMC humana, el hecho de que un incremento de ROS pueda tener consecuencias
a largo plazo en la estabilidad genética [19-23].
Figura No. 6: Ruta de señalamiento activada por BCR-ABL
Fuente: Weisberg, E., et al. (2007). Nat. Rev. Cancer, 7(5): 345-356.
22
Los niveles de ROS no sólo son modulados por enzimas, antioxidantes y grupos
sulfhidrilos, sino también reaccionados con las bases del ADN. Aunque las
modificaciones pueden ser corregidas eficientemente por los mecanismos de
reparación de ADN, un incremnto persistente de ROS podría inducir la acumulación
de mutaciones en las células de la LMC, que podría contribuir a la progresión de la
enfermedad (Ver Figura No. 6)
F. Inhibidores Tirosin kinasa (TKI´s):
Los inhibidores tirosin kinasa, son los primeros medicamentos de la era molecular, que
fueron diseñados por computadora; y que además tienen como blanco la proteína de un gen
quimérico (BCR-ABL1). Con estos medicamentos el pronóstico de los pacientes con
leucemia mieloide crónica ha aumentado considerablemente. Aunque todavía no se considera
curativo, ha incrementado la expectativa de vida de estos pacientes, con pocos efectos
secundarios. De hecho estos pacientes pueden hacer una vida normal. El primer medicamento
de esta línea es el Imatinib, y ahora más recientemente el Nilotinib, Dasatinib y Bosutinib
(Ver figura No. 7 y 8) [23-26].
1. Imatinib:
Imatinib fue el primer inhibidor tirosin kinasa desarrollado para el cromosoma
filadelfia en leucemia mieloide crónica. Se considera como medicamento de primera
línea a elegir en pacientes BCR-ABL positivos. Estudios demostraron que con una
dosis de Imatinib de 400 mg. un 88% de pacientes alcanzaron la respuesta
hematológica completa y un 49% la respuesta citogenética completa. El nombre
comercial de este medicamento es GLEEVEC [23,24].
2. Nilotinib:
Nilotinib es 30 veces más potente que el Imatinib, y tiene actividad ante varias
mutaciones que confieren resistencia a Imatinib. Fue aprobado en el año 2007.
3. Dasatinib:
Dasatinib es un inhibidor tirosin kinasa 325 veces más potente que el Imatinib.
Dasatinib cruza la barrera hemato encefálica, a diferencia del Imatinib que no la cruza,
23
y además se une tanto a la conformación activa como la inactiva de BCR-ABL. Este
medicamento fue aprobado en el año 2006 [23,24].
Figura No. 7: Estructura química de los principales inhibidores tirosin kinasas.
Tomado de: Weisberg E, et al. Nat. Rev. Cancer 2007 may;7(5): 345-356.
24
Figura No. 8: Estructura química 3D de los principales inhibidores tirosin kinasas.
Tomado de: Weisberg E, et al. Nat. Rev. Cancer 2007 may;7(5): 345-356.
G. Respuesta al tratamiento con TKI´s:
En el estudio IRIS, la resistencia primaria o fallo para alcanzar la respuesta
citogenética completa se observó en al menos 24% de pacientes después de 18 meses de
haber iniciado el tratamiento. Después de cinco años de tratamiento, la resistencia secundaria
o recaídas se observaron en un 17%.
Cuando hay un fallo a la terapia con Imatinib es imperativo el cambio a terapia de
segunda línea (Nilotinib, Dasatinib y bosutinib); y si hay fallo en estos, se recomienda
realizar un trasplante de médula ósea.
25
El nivel inicial de respuesta al tratamiento es la respuesta hematológica completa; que
se define como la normalización de los conteos celulares en sangre periférica. El siguiente
nivel a alcanzar es la respuesta citogenética completa (CCR). Y por último la respuesta
molecular mayor (MMR) medida por PCR en Tiempo Real.
Se considera fallo del tratamiento cuando la terapia con estos inhibidores ya no es
efectiva al paciente y por lo tanto se recomienda un cambio de tratamiento. Una respuesta
sub-optima indica que a pesar de que el paciente puede seguir obteniendo beneficios estos
medicamentos, a largo plazo va a ser necesario un cambio de tratamiento. El Fallo de
conseguir la MMR dentro de 18 meses del inicio del tratamiento o la pérdida de MMR a
cualquier tiempo indica una respuesta sub-optima [23,24].
En el estudio IRIS, el 68% de los pacientes después de un año de inicio del tratamiento
con Imatinib alcanzaron la CCR; y de estos se detectó MMR en 57%. También en el IRIS,
ningún paciente con CCR y MMR a los 12 meses progreso a una enfermedad avanzada en 5
años (Ver Tabla No. 1) [23,24].
Tabla No. 1: Evaluación de la respuesta al tratamiento con Imatinib
MESES OPTIMA SUBÓPTIMA FALLO DE TERAPIA
3 CHR No CHR (Ph>95%) Menos de CHR
6 PCR (Ph<35%) Menos de pCR (h<35%) No CgR (Ph> 95%)
12 CCR pCR (1% a 35%) Menos de pCR (Ph>35%)
18 MMR Menos de MMR Menos de CCR, no MMR
Cualquier tiempo
durante duración de
tratamiento
MMR estable Pérdida de MMR,
presencia de Mutaciones
Perdida de CHR, perdida
de CCR;
CHR: respuesta hematolótica completa; CCR: respuesta citogenética completa; pCR: respuesta citogenética parcial; MMR:
respuesta molecular mayor.
Fuente: Baccarani M, et al. (2009). Journal of Clinical Oncology, 27:6041-6051
26
H. Mutaciones del gen BCR-ABL:
Los mecanismos de resistencia a inhibidores tirosin kinasas son multifactoriales;
dentro de los cuales se puede mencionar un aumento en la producción de la proteína BCR-
ABL1 (debido a amplificación génica y sobreexpresión) y una disminución en los niveles
celulares del tratamiento [25,26].
Por otro lado la resistencia secundaria, se debe principalmente a la presencia de
mutaciones puntuales en BCR-ABL1, las cuales inhiben la unión del Imatinib. En estudios
recientes se ha determinado que la detección de mutaciones en BCR-ABL1 son altamente
predictivas de pérdida de la respuesta citogenética completa y progresión a crisis blástica
[25,26].
El análisis mutacional es recomendado en pacientes en los cuales la terapia ha fallado;
siempre antes del cambio de inhibidor tirosin kinasa u otro tratamiento, y en algunos casos
de respuesta subóptima [25,26].
A las fecha se han reportado más de 100 mutaciones en el gen BCR-ABL; sin
embargo en su mayoría, estas se traducen en sustituciones únicamente 15 aminoácidos (Ver
tabla No. 2) [25,26].
La mutación T315I es considerada la más agresiva, ya que no existe ningún inhibidor
tirosin kinasa que sea efectivo para esta mutación. En la tabla No. 2, se muestran las
principales mutaciones reportadas internacionalmente [25,26].
Las mutaciones dentro del dominio P-loop del dominio kinasa de BCR-ABL
incluyendo la Y253F/H y la E255K/V son altamente resistentes a Imatinib. El Nilotinib
exhibe actividad contra la mayoría de mutaciones que provocan resistencia a Imatinib,
incluyendo la Y253F/H, E255K/V. Dasatinib también presenta actividad contra la mayoría
de mutaciones que causan resistencia a Imatinib, excepto la T315I; el efecto de Dasatinib
para los pacientes con mutaciones es más fuerte que el Nilotinib e Imatinib [25,26].
27
Tabla No. 2: Mutaciones frecuentes en BCR-ABL
MUTACIÓN LOCALIZACIÓN
T315I Región de unión al ATP
Y253F P-loop
Y253H P-loop
E255K P-loop
E255V P-loop
M351T Dominio catalítico
G250E p-loop
F359V Dominio catalítico
H396P A-loop
H396R A-loop
Fuente: Ernst T, et al. 2011, Hematol Oncol Clin, 25, 997-1008.
I. Mutación T315I:
La mutación T315I es la única mutación reportada que es resistente a todos los
inhibidores tirosin kinasas que actualmente se encuentran en el mercado. Los pacientes que
presentan esta mutación no son sensibles a Imatinib, a Nilotinib y a Dasatinib; por lo que
carece de efectividad el brindar este medicamento a este tipo de pacientes. Estos pacientes
deben de ser sometidos a trasplante de médula ósea (Ver Figura No. 9) [25,27].
Figura No. 9: Mecanismo por el que la mutación T315I bloquea la unión al inhibidor
Fuente: Zachary, A. et al( 2010), Nature Reviews Cancer, 10, 130-147
28
J. Situación en Guatemala:
Del período 2010 al 2012 se realizó el primer proyecto de investigación
(FODECYT 24-2010); en el cual se monitoreo cada 3-4 meses, la cantidad de copias de BCR-
ABL1 que tenían 30 pacientes con diagnóstico de leucemia mieloide crónica. Todos los
pacientes se monitorearon por un período de 18 meses. Los pacientes se clasificaron, según
su respuesta al Imatinib como respuesta óptima, subóptima y fallo de terapia. Un 39% de los
pacientes analizados obtuvieron una respuesta óptima; es decir que alcanzaron una respuesta
citogenética completa a los 12 meses o una respuesta molecular mayor a los 18 meses. Y
luego se observa que un 25% de los pacientes incluidos en el presente estudio tuvieron una
respuesta subóptima, menos de respuesta molecular mayor a los 18 meses; y por último
presentaron fallo a la terapia un 36% de pacientes; los cuales no alcanzaron ni respuesta
citogenética completa a los 18 meses; de estos pacientes fallecieron 3. Los pacientes con
fallo a terapia y con respuesta subóptima son candidatos a análisis de mutaciones [28].
En Guatemala, no se han realizado estudios de mutaciones en el gen BCR-ABL1
previamente; por lo que no se conocen las mutaciones más frecuentes en el país. Y también
no se utilizan para evaluar el cambio de inhibidor de tirosin kinasa (Ver tabla No.3 y 4) [28].
Tabla No. 3: Respuesta al Imatinib en los pacientes analizados
RESPUESTA
ÓPTIMA
RESPUESTA
SUBÓPTIMA
FALLO DE
TERAPIA
FALSOS
POSITIVOS
39% 25% 36% 6%
Fuente: FODECYT 24-2010
Tabla No. 4: Respuesta al Imatinib alcanzada durante el monitoreo molecular
% CCgR % MMR %MR
21% 29% 14%
Fuente: FODECYT 24-2010
29
PARTE III
III.1 RESULTADOS
En este estudio participaron 83 pacientes con Leucemia Mieloide Crónica con presencia de
la t(9;22) que produce p210 BCR-ABL y tratamiento por más de 18 meses con algún inhibidor tirosin
kinasa de primera o segunda generación (Ver Anexo 4).
Para determinar la presencia de la mutación T315I en el dominio tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL, se estandarizó previamente la técnica de PCR semi anidada utilizando tres muestras de
pacientes con diagnóstico previo de la enfermedad y diferentes valores de escala internacional (%
IS) (Anexo 5). Posteriormente, las muestras fueron analizadas por secuenciación para evaluar que la
amplificación correspondiera al dominio tirosin kinasa del gen BCR-ABL1 (Anexos 6 y 7).
El 57 % de los pacientes analizados fueron varones (M/F: 1.30) y la mediana de la edad para
el grupo fue de 42 años (IQR 32 – 55 años). Los pacientes fueron referidos del Hospital General
San Juan de Dios – HGSJDD – (36.0 %), Hospital Roosevelt (24. 0 %), Instituto Guatemalteco de
Seguridad Social – IGSS – (36.0 % %), Unidad Nacional de Oncología Pediátrica – UNOP y
pacientes particulares (4.0 %).
Grafica 1. TKI utilizado como terapia según el centro de asistencia médica
Otros: UNOP y pacientes particulares
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
0
5
10
15
20
25
30
Imatinib Nilotinib Dasatinib
IGSS HGSJDD ROOSEVELT OTROS
30
En cuanto a las características clínicas encontradas en todos los pacientes incluidos, la
mediana para el recuento de leucocitos fue de 7.67 células/L (IQR 5.73- 14.42), 226 células/L (IQR
163 - 361.1) para plaquetas y 12.75 g/dL para hemoglobina (IQR 11 - 14.3) con algunos valores
extremos. La mediana del tiempo de vida con la enfermedad fue de 4 años (IQR 2-4) (Tabla No. 5).
Un total de 20 (24 %) pacientes no poseían respuesta hematológica después de más de 18 meses de
terapia.
Alrededor de dos terceras partes del total de pacientes se encontraban en tratamiento actual
con Imatinib, seguido de Nilotinib (23 %) y Dasatinib (11 %); variando su frecuencia según el centro
de referencia hospitalario en el que se recibe atención (Gráfica 1). La dosis recibida de cada inhibidor
fue variable según cada paciente, pero las dosis más frecuentes ingeridas fueron 400 mg/día para
Imatinib, 800 mg/día para Nilotinib y 100 mg/día para Dasatinib.
Tabla No. 5: Características médicas de los pacientes con LMC evaluados
Variable Mediana Mínimo Máximo
Años con la enfermedad 4 1 16
Recuentos celulares
Glóbulos blancos (células/L) 7.67 1.73 548
Plaquetas (células/L) 226 17.7 1590
Hemoglobina (g/dL) 12.75 6.1 28.6
Dosis de inhibidor (mg/día)
Imatinib 400 300 800
Nilotinib 800 100 800
Dasatinib 100 100 400
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
El 51 % de los pacientes presentó un valor de %IS arriba de 10 % y el 20 % presentó valores
por encima de 1%. En un 16 % no fue posible calcular los valores de %IS debido a que el número
de copias del oncogen BCR-ABL sobrepasó al número de copias de ABL en la cuantificación
relativa realizada por PCR tiempo real. El 13 % restante presentó valores de %IS entre 0.01 y 0.1
con valores que sugieren una alarma (Tabla 6).
31
Tabla No. 6: Valores de % IS de los pacientes incluidos en este estudio
IS % Frecuencia (%)
N=83 Mediana RIQ
>0.01α - 0.09 5 (6.0) 0.03 0.01 0.07
0.1β – 0.99 6 (7.2) 0.62 0.42 0.72
1.0γ -9.99 17 (20.5) 2.23 1.47 4.58
10 δ- 99.99 42 (50.6) 38.12 25.69 55.40
BCR-ABL >ABL* 13 (15.7) - - -
α0.01 corresponde a una respuesta molecular 4 (MR4); β 0.1 corresponde a una respuesta molecular mayor (MMR o MR3)
γ1.0 corresponde a una respuesta citogenética completa (CCyR); δ10 corresponde a una respuesta hematológica completa (CHR)
*BCR-ABL >ABL: no es posible calcular debido a que el número de copias de BCR-ABL es mayor al número de copias de ABL.
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
Se determinó la presencia de mutaciones de resistencia para TKI en el 11% de los pacientes
con tratamiento (Grafica 2). De éstos casos, la mutación T315 se presentó en el 1.2 % (Figura 10).
Así mismo se pudo detectar la presencia de otras mutaciones que confieren resistencia a los TKI
como la mutación E279K (Figura 11), G250 (Figura 12) y F359V (Figura 13). En un mismo
paciente se determinó además la presencia de dos mutaciones (G250E y E453K) en el gen BCR-
ABL (Figura 14).
Grafica 2. Porcentaje de mutaciones de resistencia a TKI encontradas
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
89,0%
6,1%
1,2%1,2%
1,2%
1,2%11,0%
WT G250E T315I E279K F359V E453K; G250E
32
Figura No. 10: Electroferograma en el que se observa la mutación T315I en BCR-ABL1. La muestra LMC-
160 mostró un cambio en la secuencia del gen BCR-ABL1 (c. 948 T>C) cuya traducción conlleva a la sustitución
de una Treonina por una Isoleucina en el codón 315 de la proteína; confiriendo una alta resistencia a inhibidores
tirosin quinasa de primera y segunda línea.
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
Figura No. 11: Electroferograma en el que se observa la mutación E279K en BCR-ABL1. La muestra LMC-
179 mostró un cambio en la secuencia del gen BCR-ABL1 (c. 838 G>A) cuya traducción conlleva a la sustitución
de ácido glutámico por lisina en el codón 279 de la proteína; confiriendo a resistencia a inhibidores tirosin quinasa.
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
33
Figura No. 12: Electroferograma en el que se observa la mutación G250E en BCR-ABL1. Las muestras LMC-18,
20, 230, 338 y 422 mostraron un cambio en la secuencia del gen BCR-ABL1 (c. 838 G>A) cuya traducción conlleva a
la sustitución de glicina por ácido glutámico en el codón 259 de la proteína; confiriendo a resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
34
Figura No. 13: Electroferograma en el que se
observa la mutación F359V en BCR-ABL1.
La muestra LMC-325 mostró un cambio en la
secuencia del gen BCR-ABL1 (c.1078 T˃G)
cuya traducción conlleva a la sustitución de
fenilalanina por valina en el codón 359 de la
proteína; confiriendo a resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
Figura 14: Electroferograma
en el que se observa las
mutación E453K y G250E
en BCR-ABL1. La muestra
LMC-49 mostró un cambio en
la secuencia del gen BCR-
ABL1 (c.1078 T˃G y ) cuya
traducción conlleva a la
sustitución de por y por en
los codones 453 y 250
respectivamente de la
proteína; confiriendo a
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
35
Todos los pacientes que presentaron mutaciones de resistencia para TKI presentaron valores
por encima del rango normal para los parámetros del hemograma y una %IS mayor a 1 % (Tabla
7). El 55 % de los pacientes se encontraron en tratamiento con un inhibidor de segunda línea
(Dasatinib o Nilotinib). Respecto a los pacientes con terapia de Imatinib, solamente un paciente
ingería la dosis recomendada para segunda línea (800 mg/día).
Tabla No. 7: Características moleculares y clínicas de los pacientes con mutaciones en BCR-ABL
Código cDNA Proteína Sexo Años de
diagnóstico TKI
Dosis
(mg/día) GB PLT HB %IS
LMC-18 c.752 G>A G250E M 5 Imatinib 400 15.48 614 12.1 38.374
LMC-20 c.752 G>A G250E M 3 Dastinib 100 53.8 614 8.5 68.37
LMC-49 c.752 G>A ;
c.1360 G>A
G250E;
E453K M 9 Nilotinib 800 24.1 242 11.3 NC
LMC-160 c. 948 T>C T315I M 2 Nilotinib 400 21.32 403 11.41 3.84
LMC-179 c. 838 G>A E279K F 16 Nilotinib 800 NR NR NR 57.85
LMC-230 c.752 G>A G250E F 2 Imatinib 400 17.44 1590 12.3 NC
LMC-325 c.1078 T˃G F359V M 1 Dasatinib 100 6.58 64.1 11.01 33.1
LMC-338 c.752 G>A G250E F 13 Imatinib 800 208.9 580.2 7.58 1.43
LMC-422 c.752 G>A G250E M NRβ Imatinib 400 548.32 466 6.3 95.03
TKI: Inhibidores Tirosin Kinasa, GR: Glóbulos Rojos, GB: Glóbulos Blancos, PLT: Plaquetas, HB: Hemoglobina, %IS: Escala Internacional, βNR: No refiere, NC: es posible calcular debido a que el número de copias de BCR-ABL es mayor al número de copias de ABL.
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
Durante el desarrollo del proyecto se realizaron diferentes actividades de divulgación de los
resultados de la misma en sectores de interés como la Asociación de Pacientes con Leucemia
Mieloide Crónica (ASOPALEU), residentes de Medicina Interna de los Hospitales Nacionales,
estudiantes de la carrera de Química Biológica de la USAC y se tuvo participación en el I Congreso
de Actualización en Biología Molecular y Genética realizado en el país (Anexo 8).
36
III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La muestra utilizada en el presente estudio fue de 83 pacientes, que se seleccionaron por tener
más de 18 meses con tratamiento con un inhibidor tirosin kinasa y un porcentaje en escala
internacional mayor de 0.1 % indicando un fallo de terapia o respuesta sub óptima.
En el presente estudio se observa que la mayor parte de pacientes que presentaron resistencia
son de sexo masculino, dato que coincide con lo reportado en otros países, aunque la razón de esto
se desconoce. Y además la mediana de edad es de 42 años; esta mediana de edad es bastante baja
comparado con estudios realizados en la mayoría de países, en los cuales la mediana está por arriba
de los 55 años de edad. Este es un dato interesante, ya que es conveniente determinar factores
genéticos y ambientales en Guatemala, que predispongan a un desarrollo temprano de leucemia
mieloide crónica [30].
Se analizaron muestras procedentes de hospitales nacionales y del IGSS; y se puede observar
en la gráfica No. 1 una clara diferencia, entre el tipo de inhibidor tirosin kinasa utilizado en los
hospitales nacionales y los utilizados en el IGSS. Esto se debe a que el IGSS posee disponibilidad
del uso de tres inhibidores tirosin kinasas: Imatinib, Nilotinib y Dasatinib; mientras los hospitales
nacionales únicamente tienen acceso a Imatinib. El medicamento de primera línea a nivel mundial
sigue siendo el Imatinib; el Nilotinib y Dasatinib son de segunda línea; estos dos últimos son
medicamentos más agresivos, que producen respuestas de los pacientes mucho más rápido; por esta
razón muchas entidades prefieren prescribir primero los de segunda línea. Existe otro medicamento
de segunda línea aprobado mundialmente, que se denomina bosutinib; el cual no se encuentra
disponible en Guatemala. Y uno de tercera línea, ponatinib, que se recomienda en pacientes con
resistencia a inhibidores tirosin kinasa de primera y segunda línea, y/o que posean la mutación
resistente T315I [31, 32].
Si bien la mediana del recuento de glóbulos blancos, plaquetas y hemoglobina (Tabla No. 5)
fue normal; un 24% del total de pacientes no posee respuesta hematológica completa, lo cual es un
criterio mayor para evaluar la presencia de mutaciones o la falta de adherencia de pacientes.
37
El análisis de la presencia de resistencia a inhibidores tirosin kinasa; se realiza cuando el
paciente no ha alcanzado respuesta citogenética completa (1% IS). Antes, de esto se debe corroborar
que el paciente tiene adherencia al tratamiento; una vez revisado esto; se deber realizar el estudio de
la presencia de mutaciones en el gen BCR-ABL1 [31, 32].
En nuestro estudio, el 87 % de pacientes no poseía respuesta citogenética completa a los 18
meses, es decir que presentaron fallo de terapia; y el 13% restante poseen respuesta citogenética
completa, pero no han alcanzado respuesta molecular mayor (0.01%), es decir que presentaron
respuesta sub óptima (Tabla No. 6); esta clasificación se realizó según la Figura 15 [33]. Todos
estos pacientes seleccionados cumplen con los criterios descritos en la leukemianet [31, 32]; para la
evaluación de la presencia de mutaciones en el gen BCR-ABL1, como parámetro e indicador de
resistencia al tratamiento con inhibidores tirosin kinasas. La mutación T315I es resistente a los tres
medicamentos disponibles en Guatemala, y por esta razón se planteó su identificación en el presente
estudio.
Figura 15. Valores de escala internacional de BCR-ABL
Fuente: Baccarani, M., Soverini, S. and De Benedittis, C. (2014). Molecular
Monitoring and Mutations in Chronic Myeloid Leukemia: How to Get the Most
out of Your Tyrosine Kinase Inhibitor. ASCO EDUCATIONAL BOOK. 167 –
175. asco.org/edbook
38
Internacionalmente se ha reportado que entre un 20-30 % de los pacientes que reciben terapia
con inhibidores tirosin kinasas, presentan mutaciones en el gen BCR-ABL1. En nuestro estudio la
frecuencia fue de 11 %; un poco más bajo de lo reportado en otros países. Sin embargo es importante
destacar que algunos pacientes presentaron poca adherencia al tratamiento, situación que puede
afectar la frecuencia encontrada.
La mutación T315I se encontró en un 1.2%, mientras que en otros países se ha reportado de
un 3 a un 7%; y muchas veces se ha reportado como la más frecuente [34]. En la población
guatemalteca esta no es la mutación más frecuente. La mutación más común es la G250E, la cual se
encontró en un 6.1% (Gráfica No. 2). En el caso de la mutación T315I, que es resistente a todos los
inhibidores tirosin kinasas disponibles en Guatemala, la única opción útil es recomendar un
trasplante de médula ósea.
En cuanto a las mutaciones E279K, F359V y E453K; es bien conocido que las mutaciones del
dominio kinasa del gen BCR-ABL más agresivas son las que corresponden al dominio P-LOOP; por
lo que, únicamente la mutación G250E, se ha encontrado. Sin embargo cabe resaltar que es la más
frecuente para la población guatemalteca. En la Figura No. 15, se pueden observar las mutaciones
más frecuentes agrupadas según los dominios de la proteína [35].
Figura No. 16: Agrupación de la mutación del gen BCR-ABL1, según dominio
Fuente: Kimura, Sh., Ando, T., and Kojima, K. (2014). BCR-ABL point mutations and TKI
treatment in CML patients. J Hematol Transfus, 2(3):1-11
39
En la Figura No. 16 se muestra una tabla en donde se pueden observar los cambios en
sensibilidad a los distintos inhibidores tirosin kinasa, según la mutación encontrada en el dominio
ABL, del gen BCR-ABL1 [36]. En esta gráfica se puede observar que la mutación T315I, es
considerada la más agresiva de las encontradas ya que se encuentra de color rojo, indicando que es
resistente.
Figura No. 17. Sensibilidad de inhibidores tirosin kinasas según la mutación
en BCR-ABL encontrada
Fuente: Zabriskie, M. et al. (2014). BCR-ABL1Compound Mutations Combining Key
Kinase Domain Positions Confer Clinical Resistance to Ponatinib in Ph Chromosome-
Positive Leukemia. Cancer Cell, 26: 428–442.
40
En el caso de la mutación G250E, es altamente resistente solo al Imatinib, moderadamente
resistente al Nilotinib y sensible al Dasatinib. Por esta razón, en el caso de las personas que poseen
esta mutación, la opción de tratamiento sería el Dasatinib.
Respecto a la mutación F359V, también genera una resistencia alta al Imatinib, y
moderamente al Nilotinib, sin embargo es sensible al Dasatinib; por lo que esta sería la opción de
tratamiento recomendada para estos pacientes. La mutación E279K y E453K son mutaciones menos
agresivas.
41
PARTE IV
IV. 1 CONCLUSIONES
IV.1.1. La mutación puntual T315I del gen quimérico BCR-ABL1 fue detectada el grupo de
pacientes analizados; así mismo se determinó la presencia de las mutaciones G250E,
E279K, F359V y E453K.
IV.1.2. La frecuencia de la mutación T315I del gen quimérico BCR-ABL1 en el grupo de
pacientes guatemaltecos con LMC analizados fue de 1.2 %. Las mutaciones E279K,
F359V y E453K presentaron la misma frecuencia; mientras que la mutación G250E
fue la de mayor presencia con 6.0 %.
IV.1.3. La mutación T315I del gen quimérico BCR-ABL1 genera una elevada resistencia a los
tres inhibidores tirosin quinasa usados en el país, dejando el transplante de médula ósea
como única medida terapéutica para los pacientes portadores de la misma.
IV.1.4. La detección de las mutaciones en el dominio tirosin kinasa del gen BCR-ABL1 brindó
información importante a los médicos tratantes sobre el pronóstico de la enfermedad y
orientó al cambio de inhibidor tirosin kinasa utilizado para el tratamiento de los pacientes
con LMC según los protocolos establecidos.
IV.1.5. La divulgación de los resultados obtenidos en el presente estudio se realizó a través de
medios escritos que brindaron información a los médicos, pacientes y familiares con
LMC para una intervención médica adecuada.
42
IV. 2 RECOMENDACIONES
IV.2.1. Implementar y fortalecer el programa de monitoreo y seguimiento de enfermedad mínima
residual de pacientes con LMC en tratamiento con inhibidores tirosin kinasa del país
para la detección temprana de pacientes con fallo terapéutico o alarma; y con ello realizar
una intervención terapéutica adecuada
IV.2.2. Promover la educación a pacientes con LMC sobre la importancia de la adherencia al
tratamiento con TKI para prevenir recaídas y evitar el surgimiento de mutaciones de
resistencia que limitan sus opciones terapéuticas.
IV.2.3. Evaluar la presencia de otros factores genéticos asociados a falla terapéutica de los TKI
como las mutaciones en el trasnportador Oct-1, co exsistencia de mutaciones en JAK2 y
polimorfismos en el gen BIM.
IV.2.4. Los resultados obtenidos evidencian la necesidad de utilizar TKI de segunda línea o
tercera línea en pacientes con mutaciones de resistencia al Imatinib que son tratados en
Hospitales de la Red Nacional en los que no se cuentan.
IV.2.5. Fomentar sistemas de inter comunicación con los Hospitales Nacionales que refieren las
muestras de trabajo para estudios de caracterización de LMC con la finalidad de reducir
o eliminar las desviaciones debidas a los sesgos de información.
43
IV. 3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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to treatment. N Engl J Med, 349, 1451-1464.
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27. Zachary A, et al. (2010) Targeting the Cancer Kinome Through polypharmacology. Nature
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28. Carranza, C. (2012) Cuantificación por PCR en tiempo real de los distintos transcritos de BCR-
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29. Branford, S., & Hughes, T. (2006). Detection of BCR-ABL mutations and resistance to Imatinib
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in Chronic Myeloid Leukemia: How to Get the Most out of Your Tyrosine Kinase Inhibitor.
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Positions Confer Clinical Resistance to Ponatinib in Ph Chromosome-Positive Leukemia.
Cancer Cell, 26: 428–442.
47
IV. 5 ANEXOS
Anexo 1: Consentimiento Informado
Consentimiento Informado para Pruebas Genéticas
1. Título de los proyectos
“GENÉTICA DE LA LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA (LMC) EN
GUATEMALA”
(Este estudio se basará en el análisis de ácidos nucleicos para evaluar la presencia de genes alterados en su enfermedad)
2. Investigador Principal
Dra. Claudia Carranza
3. Institución
INVEGEM
El presente documento es un consentimiento informado que le brindará a usted y su familia información
importante sobre los estudios. Puede que el documento contenga palabras que usted no entienda. Por favor
pregunte al investigador encargado o a cualquier personal del estudio para que le explique cualquier palabra
o información que usted no comprenda claramente. Usted puede llevarse a su casa una copia de este
consentimiento informado para pensar sobre este estudio o para discutir con su familia o amigos antes de
tomar la decisión de participar en él.
INTRODUCCIÓN
Usted ha sido invitado a participar en esta investigación. Antes de que usted decida participar en el estudio
por favor lea este documento cuidadosamente. Haga todas las preguntas que usted tenga, para asegurarse de
que entienda los procedimientos del estudio, incluyendo los riesgos y los beneficios.
PROPOSITO DEL ESTUDIO
El propósito del presente estudio una caracterización genética de la leucemia mieloide aguda, es decir
detectar la presencia de genes que se encuentran alterados en leucemia, lo que permitirá un mejor manejo
de su enfermedad ya que le servirán a su médico para conocer el pronóstico de su enfermedad; y por lo tanto
elegir con mayor exactitud el tratamiento más adecuado para usted.
Además se estudiarán otros genes que ayuden a conocer mejor la genética de la leucemia mieloide aguda;
por lo que se obtendrá información que permita conocer mejor los mecanismos de producción del cáncer y
así facilitar la cura del mismo.
Fuente: INVEGEM/Rozas Botrán ONG
48
PARTICIPANTES
Las personas que podrán participar en este estudio deben de tener un diagnóstico confirmado de leucemia mieloide
aguda, y además seguir según los siguientes criterios:
Criterios de Inclusión
Pacientes de 0-99 años
Diagnóstico confirmado de leucemia mieloide crónica
Tratamiento con algún inhibidor tirosin kinasa mayor a 18 meses
Porcentaje de escala internacional (% IS) mayor a 0.1
Pacientes con recaídas.
Criterios de exclusión:
Paciente que presente otras formas de leucemia
Pacientes que ya se encuentren en tratamiento
Pacientes con recaídas
Con el fin de identificar la existencia de estos cuatro marcadores genéticos, el presente estudio requiere su
participación, ya que reúne los criterios de inclusión para colaborar con el estudio. Su participación es
completamente voluntaria y puede abandonar el estudio en cualquier momento sin ser penalizado.
PROCEDIMIENTOS
El cumplimiento de uno o más de los criterios de inclusión indican que su médico sospecha que usted tiene leucemia
mieloide aguda, y por lo tanto se procede a la extracción de sangre periférica o médula ósea. La extracción de sangre
periférica se llevará a cabo por venopunción (extracción de sangre de una vena) y la de médula ósea por punción al
interior del hueso; la muestra extraída será enviada en dos tubos, uno con tapa morada (EDTA) y otro con tapa
verde (heparina) al laboratorio de biología molecular y citogenética de INVEGEM, para su respectivo análisis.
RIESGOS
Los riesgos de la venopunción son mínimos y generalmente se relacionan a hematomas (moretes que se quitan con
el tiempo) en el lugar de punción, los cuales no representan un riesgo para su salud y desaparecen en pocos días,
sin necesidad de tratamiento. Además puede causar dolor, mareos y en raras ocasiones infecciones. Los riesgos de
la extracción de médula ósea también son mínimos, pueden encontrarse en algunas ocasiones sangrado o
infecciones, hematomas y dolor.
COSTOS
La presente prueba tiene un costo elevado, sin embargo por ser parte de este estudio se le realizará de forma gratuita.
Fuente: INVEGEM/Rozas Botrán ONG
49
PRIVACIDAD Y CONFIDENCIALIDAD
Si usted elige participar en este estudio, el investigador del estudio conseguirá información personal sobre usted. Esto
puede que incluya la información que puede identificarle. También puede conseguir información sobre su salud
incluyendo, expedientes médicos actuales y del pasado que pueden incluir resultados de laboratorios, placas o exámenes
físicos
Los resultados de esta investigación pueden ser publicados en revistas científicas o ser presentados en las reuniones
médicas, pero su identidad no será divulgada. La información de su salud será mantenida confidencialmente
bajo la ley. Esta autorización servirá hasta el final del estudio, a menos que usted la cancele antes. Usted puede cancelar
esta autorización en cualquier momento enviando un aviso escrito al Investigador Principal: Dra. Claudia Carranza
Coordinadora de Laboratorios INVEGEM Tel. 40507444 Correo electrónico: [email protected]
Si usted cancela esta autorización, el Investigador Principal no usará ni divulgará su información personal ni de su
salud. La autorización para el uso y el acceso de la información protegida de la salud para los propósitos de la
investigación es totalmente voluntaria.
UTILIZACIÓN DE MUESTRAS Y RESULTADOS
La muestra de médula ósea o sangre obtenida de usted será utilizada para el presente estudio; y el análisis se realizará
en INVEGEM. Se podrá almacenar su muestra para futuros estudios dentro de las instalaciones de INVEGEM, y se
podrá utilizar para otros estudios que ayuden al conocimiento de la genética de leucemia mieloide aguda.
PREGUNTAS
Si tiene alguna pregunta sobre este estudio o sobre su participación usted puede contactar a:
Dra. Claudia Carranza, Coordinadora de Laboratorios INVEGEM
Tel. 40507444 Correo electrónico: [email protected] .
OTROS ASPECTOS DE INTERÉS:
Si existiera información de relevancia en el presente estudio, se le dará conocimiento del mismo.
No se dará ningún tipo de compensación para la participación, su participación es totalmente voluntaria.
Siempre se respetará la opinión de cada participante
No existe ningún conflicto de interés con respecto al patrocinio del proyecto ni en el equipo investigador.
No firme este consentimiento a menos que usted haya tenido la oportunidad de hacer preguntas y recibir contestaciones
satisfactorias.
Si usted firma, aceptando su participación en este estudio, recibirá una copia del consentimiento con su firma, el sello
de aprobación de INVEGEM y la fecha.
Fuente: INVEGEM/Rozas Botrán ONG
50
DECLARACIÓN DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
Señores
Instituto de Investigación sobre Enfermedades Genéticas y Metabólicas – INVEGEM –
Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología – SENACYT –
Yo, ______________________________ (nombre y apellidos) de ____ años edad y con cédula de vecindad o DPI
___________________ he sido infirmado/a sobre la participación de mi o de mi hijo _______________________en
el proyecto “GENÉTICA DE LA LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA (LMC) EN GUATEMALA”; en el que se
tomará una muestra de sangre periférica para la realización de las pruebas necesarias. El resultado de la prueba de
brindará información a mi médico sobre el pronóstico de mi enfermedad o la de mi hijo.
El procedimiento de extracción de sangre periférica o médula ósea constituye un procedimiento seguro para mi salud
y sin complicaciones importantes o que afecten mi integridad física.
Autorizo el uso de la muestra de sangre periférica o médula ósea para la presente investigación y otras investigaciones
que contribuyan a conocer más sobre el comportamiento y tratamiento de la enfermedad. Y otorgo mi consentimiento
para la extracción de sangre periférica o médula ósea y uso del resultado de mi prueba para la presente investigación.
Comprendo que mis datos pueden ser publicados en revistas científicas o ser presentados en reuniones médicas, pero
mi identidad no será divulgada.
Fecha: ___________________________________
Firma del Paciente o huella digital: _________________________
Firma del médico/persona que realizó la extracción: __________________________
Fuente: INVEGEM/Rozas Botrán ONG
Sello de la institución
51
Anexo 2: Ficha de Recolección de datos
DATOS GENERALES DEL PACIENTE INFORMACION HEMATOLÓGICA
NOMBRE: ________________________________________________________
EDAD: ________ FECHA DE NACIMIENTO: ______/______/______
LUGAR DE ORIGEN: ____________________________________________
TELÉFONO: _____________________________________________________
DIRECCIÓN: ____________________________________________________
___________________________________________________________________
FECHA: ______/______/_________
RECUENTO ERITROCITARIO: ____________________________
RECUENTO LEUCOCITARIO: _____________________________
RECUENTO PLAQUETARIO: ______________________________
HEMOGLOBINA: ___________ HEMATOCRITO: ___________
% BLASTOS: ______________________________________________
INFORMACIÓN CLÍNICA DEL PACIENTE OTRAS PRUEBAS
HOSPITAL DE REFERENCIA:
⃞ ROOSEVELT ⃞ IGSS ⃞ UNOP
⃞ GENERAL SAN JUAN DE DIOS
⃞ OTRO (especifique): ____________________________________
MEDICO QUE REFIERE: ________________________________________
TELÉFONO: _____________________________________________________
EXAMEN SOLICITADO:
⃞ Monitoreo ⃞ Mutaciones
EVENTOS TROMBÓTICOS PREVIOS:
⃞ NO ⃞ SI No. DE EVENTOS: ________________
ESPLENOMEGALIA: ⃞ NO ⃞ SI GRADO: _________
OTROS HALLAZGOS RELACIONADOS A LA
ENFERMEDAD:
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
FECHA: ______/______/_________
CARIOTIPO/FISH: __________________________________________
________________________________________________________________
FECHA: ______/______/_________
INMUNOFENOTIPO*: _______________________________________
________________________________________________________________
FECHA: ______/______/_________
OTRA DE INTERÉS: _________________________________________
________________________________________________________________
PACIENTES EN TRATAMIENTO
FECHA DE DIAGNÓSTICO: ________/________/_____________
FECHA DE INICIO TRATAMIENTO: ______/______/________
TRATAMIENTO Y DOSIS: _________________________________
RECAIDA: ⃞ NO ⃞ SI 1Leucemia Mieloide Crónica.
INFORMACIÓN DE LA MUESTRA
FECHA DE RECOLECCIÓN: ________/_________/_____________
TIPO DE MUESTRA: ⃞ SANGRE PERIFÉRICA TUBOS RECOLECTADOS: __________________________
PRUEBA TUBO DE RECOLECCIÓN TIPO DE MUESTRA
ANALISIS CUANTITATIVO DEL TRANSCRITO BCR-ABL Y ANÁLISIS DE MUTACIONES EN BCR-ABL EN PACIENTES CON LMC.
3-4 TUBOS CON EDTA* (MORADO) SANGRE PERIFÉRICA
* Tomar tubos adicionales si el paciente presenta un recuento menor de 4,000 glóbulos blancos por mm3
Fuente: INVEGEM/Rozas Botrán ONG
52
Anexo 3: Guía para la interpretación de resultados de mutaciones
GUÍA PARA INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS PARA LA DETECCIÓN DE
MUTACIONES EN BCR/ABL1 COMO INDICADORES DE RESISTENCIA A INHIBIDORES DE TIROSIN
QUINASA 1. La resistencia a los inhibidores tirosin quinasa es un
fenómeno complejo que puede ser causado por
diferentes factores; uno de ellos es la aparición de
mutaciones puntuales en el dominio tirosin quinasa
de BCR-ABL1.
2. El objetivo de detectar mutaciones en oncogen
BCR-ABL1 es determinar si existe resistencia y fallo
terapéutico con Imatinib y otros inhibidores de
segunda línea (Dasatinib y Nilotinib); así como
también predecir la progresión de la enfermedad en
los pacientes que las presenten.
3. La detección de mutaciones en BCR-ABL1 es una
prueba recomendable:
a) En la fase blástica o acelerada para determinar
mutaciones basales presentes en un bajo
porcentaje (resistencia primaria).
b) Durante la fase crónica con tratamiento, en
todos los casos de fallo de terapia y en los
casos de alerta (resistencia secundaria).
c) Por lo menos cada 3 meses en el caso de los
pacientes con tratamiento de segunda línea o
tercera línea que hayan sido detectados con
alguna mutación previa (resistencia
secundaria).
4. Existen diferentes tipos de mutaciones que pueden
brindar resistencia a diferentes inhibidores de la
tirosin quinasa pero pueden ser sensibles a otros
(ver tabla adjunta).
5. La sensibilidad del método de secuenciación para la
detección de mutaciones en BCR-ABL1 es del 10 -
20 % (10 o 20 copias mutadas por cada 100 copias
de BCR-ABL1)
Mutación Imatinib Nilotinib Dasatinib
M244V
G250E
Q252H
Y253H
E255V
V299L
F311I
T315I
T315M
F317L
M351T
F359V
H396R
L248R
E279K
L248V
Y253F
E255K
D276G
E292L
G250E V299L
Y253H E255V
Y253H F317L
E255V V299L
V299L F317L
V299L M351T
V299L F359V
F317L F359V
Sensible
Moderadamente resistente
Resistente
Altamente Resistente
REFERENCIAS Redaelli, S., Mologni, L., Rostagno, R., Piazza, R., Magistroni, V., Ceccon, M., Flynn, D. y Gambacorti, C. (2012). Three novel patient derived BCR-ABL mutants show different sensitivity to second and third generation tyrosine kinase inhibitors. Am J Hematol. 87(11):E125-8
Zabriskie, M. S., Eide, C. A., Tantravahi, S. K., Vellore, N. A., Estrada, J., Nicolini, F. E., … O’Hare, T. (2014). BCR-ABL1 Compound Mutations Combining Key Kinase Domain Positions Confer Clinical Resistance to Ponatinib in Ph Chromosome-Positive Leukemia. Cancer Cell, 26(8), 428–442. http://doi.org/10.1016/j.ccr.2014.07.006
53
Anexo 4: Listado de pacientes incluidos en el estudio
Tabla No. 8: Listado de pacientes y resultados obtenidos en el proyecto
No. Código Sexo Edad
(años)
Hospital de
Referencia TKI GR GB PLT HB %IS
Mutaciones en BCR-
ABL1
1 LMC-04 M 33 ROOSEVELT IMATINIB 5.4 9.34 442 16.2 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
2 LMC-16 M 49 HGSJDD IMATINIB 3.34 4.5 108 11.8 26.95 No presenta mutaciones
3 LMC-18 M 48 ROOSEVELT IMATINIB 4.35 15.48 614 12.1 38.374 Homocigoto G250E
4 LMC-19 M 37 HGSJDD IMATINIB 4.14 5.7 171 14.3 7.14 No presenta mutaciones
5 LMC-20 M 34 HGSJDD DASTINIB 3.1 53.8 614 8.5 68.37 Homocigoto G250E
6 LMC-37 F 15 UNOP IMATINIB 4.86 7.33 245.2 13.19 1.5178 No presenta mutaciones
7 LMC-38 F 57 HGSJDD IMATINIB 2.79 5.31 17.7 8.44 53.49 No presenta mutaciones
8 LMC-39 M 31 HGSJDD IMATINIB 2.9 194 19.3 9.18 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
9 LMC-42 M 43 HGSJDD IMATINIB NR 8.35 NR 14 56.91 No presenta mutaciones
10 LMC-49 M 67 HGSJDD NILOTINIB 3.77 24.1 242 11.3 BCR-
ABL>ABL Homocigoto G250E
Homocigoto E453K
11 LMC-50 M 42 HGSJDD IMATINIB 3.32 10940 201 10 23.42 No presenta mutaciones
12 LMC-60 M 22 ROOSEVELT IMATINIB 5.62 8.6 269 15 2.23 No presenta mutaciones
13 LMC-65 M 63 ROOSEVELT IMATINIB 4.32 13.6 443 11.9 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
14 LMC-67 F 27 HGSJDD IMATINIB 2.1 4800 184 11 2.096 No presenta mutaciones
15 LMC-68 F 50 HGSJDD NRβ 3.9 8.1 60 10 33.81 No presenta mutaciones
16 LMC-70 M 44 IGSS DASTINIB 5.81 5.73 222.1 11.64 0.01 No presenta mutaciones
17 LMC-71 M 73 HGSJDD IMATINIB NR NR NR NR 0.45 No presenta mutaciones
18 LMC-75 F 44 HGSJDD IMATINIB 4.41 6.2 234 12.6 3.58 No presenta mutaciones
19 LMC-81 F 55 IGSS NILOTINIB 4.76 6.4 241 14.2 10.38 No presenta mutaciones
20 LMC-85 M 39 IGSS IMATINIB NR NR NR NR 0.59 No presenta mutaciones
21 LMC-92 M 24 IGSS NILOTINIB 4.8 9.4 235 13.3 28.9 No presenta mutaciones
22 LMC-105 F 65 ROOSEVELT IMATINIB 2.57 3.45 114 28.6 44.14 No presenta mutaciones
23 LMC-113 M 49 IGSS NILOTINIB 4.63 4.74 206.7 14.74 31.78 No presenta mutaciones
24 LMC-114 M 37 IGSS NILOTINIB NR NR NR NR 2.56 No presenta mutaciones
25 LMC-115 F 71 IGSS NILOTINIB 4.09 8.9 683 11.6 29 No presenta mutaciones
26 LMC-117 F 66 IGSS NILOTINIB 2.51 3.12 146.2 0.1 No presenta mutaciones
27 LMC-118 M 43 ROOSEVELT IMATINIB 5.12 8.56 373 14.9 12.31 No presenta mutaciones
28 LMC-120 M 55 IGSS NILOTINIB 4.51 26.1 250 14 72 No presenta mutaciones
29 LMC-122 F 35 IGSS NILOTINIB 4.81 6.8 344 13.11 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
30 LMC-123 M 50 IGSS NILOTINIB 4.71 6.18 226 13.65 0.009 No presenta mutaciones
31 LMC-124 F 28 IGSS NILOTINIB 4.42 4.7 776 12.7 57.38 No presenta mutaciones
32 LMC-128 M 20 IGSS NILOTINIB 5.69 8.43 583 14.38 76.28 No presenta mutaciones
TKI: Inhibidores Tirosin Kinasa, GR: Glóbulos Rojos, GB: Glóbulos Blancos, PLT: Plaquetas, HB: Hemoglobina, %IS: Escala Internacional, βNR: No refiere
54
Continuación tabla No. 8
No. Código Sexo Edad
(años)
Hospital de
Referencia TKI GR GB PLT HB %IS
Mutaciones en BCR-
ABL1
33 LMC-130 M 44 IGSS IMATINIB 5.53 3.7 167 16.7 0.65 No presenta mutaciones
34 LMC-146 M 51 IGSS DASATINIB NR NR NR NR 0.03 No presenta mutaciones
35 LMC-149 M 60 IGSS DASATINIB 4.62 8.34 130.3 13.96 26.45 No presenta mutaciones
36 LMC-159 F 32 HGSJDD IMATINIB NR 14.7 NR 13 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
37 LMC-160 M 36 IGSS NILOTINIB 4.16 21.32 403 11.41 3.84 Homocigoto T315I
38 LMC-166 M 39 IGSS DASATINIB 4.42 6.5 245 12.8 12.8 No presenta mutaciones
39 LMC-173 M 19 ROOSEVELT IMATINIB 6.54 9 416 10.9 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
40 LMC-178 F 22 HGSJDD IMATINIB 4.31 21 317 12.1 57.1 No presenta mutaciones
41 LMC-179 F 37 IGSS NILOTINIB NR NR NR NR 57.85 Homocigoto E279K
42 LMC-181 M 48 ROOSEVELT IMATINIB 4.84 6.55 239 15.4 8.56 No presenta mutaciones
43 LMC-182 M 59 ROOSEVELT IMATINIB 5.13 7.1 189 16.55 0.71 No presenta mutaciones
44 LMC-184 M 45 HGSJDD IMATINIB 3.9 7.67 347 13 1.99 No presenta mutaciones
45 LMC-191 M 65 IGSS NILOTINIB 3.02 2.7 121 6.1 53.5 No presenta mutaciones
46 LMC-196 F 60 IGSS IMATINIB NR 250 350 8 23.29 No presenta mutaciones
47 LMC-207 F 33 IGSS IMATINIB 3.33 6.09 190.8 11.92 1.15 No presenta mutaciones
48 LMC-215 M 29 ROOSEVELT IMATINIB 6.3 9.3 188 15.9 34.15 No presenta mutaciones
49 LMC-218 M 35 HGSJDD IMATINIB 2.5 1.73 110 10 1.55 No presenta mutaciones
50 LMC-221 M 24 HGSJDD IMATINIB 4.79 5.81 174 14.9 1.43 No presenta mutaciones
51 LMC-230 F 24 ROOSEVELT IMATINIB 3.77 17.44 1590 12.3 BCR-
ABL>ABL Homocigoto G250E
52 LMC-244 M 32 ROOSEVELT IMATINIB 3.93 5.29 76 11.9 41.98 No presenta mutaciones
53 LMC-246 F 64 ROOSEVELT IMATINIB 3.97 5.74 286 10.7 49.37 No presenta mutaciones
54 LMC-252 M 75 IGSS DASATINIB 4.49 5.32 139.8 15.72 8.77 No presenta mutaciones
55 LMC-255 F 46 IGSS NILOTINIB NR NR NR NR 37.88 No presenta mutaciones
56 LMC-261 F 24 HGSJDD IMATINIB 5.31 15.2 561 13.7 50.3 No presenta mutaciones
57 LMC-264 M 70 HGSJDD IMATINIB 3.4 3.6 80 10.7 14.52 No presenta mutaciones
58 LMC-266 F 66 PRIVADO IMATINIB NR 8.2 178 12 48.04 No presenta mutaciones
59 LMC-273 F 27 HGSJDD IMATINIB 3.18 6.63 154 10.4 0.77 No presenta mutaciones
60 LMC-282 F 34 IGSS NILOTINIB 3.57 5.61 207.3 11.5 0.34 No presenta mutaciones
61 LMC-285 F 29 IGSS DASATINIB NR NR NR NR 55.67 No presenta mutaciones
62 LMC-296 F 49 HGSJDD IMATINIB 4.51 7.1 510 14.4 2.74 No presenta mutaciones
63 LMC-300 F 47 IGSS DASATINIB 4.86 10.96 224.4 14.79 34.74 No presenta mutaciones
64 LMC-304 F 34 HGSJDD IMATINIB NR NR NR NR 21.1 No presenta mutaciones
65 LMC-316 F 39 IGSS NILOTINIB 4.38 9.46 372.2 12.86 19.67 No presenta mutaciones
66 LMC-319 M 59 HGSJDD IMATINIB 4.1 21.45 NR 13.3 19.73 No presenta mutaciones
67 LMC-325 M 27 IGSS DASATINIB 3.3 6.58 64.1 11.01 33.10 Homocigoto F359V
68 LMC-328 F 31 ROOSEVELT IMATINIB 2.72 4.17 64 9.9 11.52 No presenta mutaciones
TKI: Inhibidores Tirosin Kinasa, GR: Glóbulos Rojos, GB: Glóbulos Blancos, PLT: Plaquetas, HB: Hemoglobina, %IS: Escala Internacional, βNR: No refiere
55
Continuación tabla No. 8
No. Código Sexo Edad
(años)
Hospital de
Referencia TKI GR GB PLT HB %IS
Mutaciones en BCR-
ABL1
69 LMC-329 M 76 HGSJDD IMATINIB 5.76 9.2 212 16 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
70 LMC-338 F 55 HGSJDD IMATINIB 2.52 208.9 580.2 7.58 1.43 Homocigoto G250E
71 LMC-340 M 41 HGSJDD IMATINIB NR 7.5 143 13.4 1.35 No presenta mutaciones
72 LMC-343 F 7 UNOP IMATINIB NR NR NR NR 0.034 No presenta mutaciones
73 LMC-364 F 32 HGSJDD IMATINIB 4.36 206 225 12.2 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
74 LMC-381 F 42 HGSJDD IMATINIB 3.79 119.8 375 12.1 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
75 LMC-402 F 48 ROOSEVELT IMATINIB 3.53 12.62 226 10.5 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
76 LMC-404 F 50 ROOSEVELT IMATINIB 4.38 24.62 466 13.2 55.31 No presenta mutaciones
77 LMC-407 M 42 ROOSEVELT IMATINIB 4.39 5.78 189 14.4 46.8 No presenta mutaciones
78 LMC-411 M 38 IGSS NILOTINIB NR NR NR NR 31.82 No presenta mutaciones
79 LMC-419 M 61 HGSJDD IMATINIB 2.47 3.8 95 8.4 59.39 No presenta mutaciones
80 LMC-422 M 29 ROOSEVELT IMATINIB 1.79 548.32 466 6.3 95.03 Homocigoto G250E
81 LMC-428 M 44 ROOSEVELT IMATINIB 5.17 11.5 310 16 19.21 No presenta mutaciones
82 LMC-435 M 34 ROOSEVELT IMATINIB 5.98 6.05 166 16.7 BCR-
ABL>ABL No presenta mutaciones
83 LMC-443 F 55 HGSJDD IMATINIB 3.89 6.9 327 13 5.33 No presenta mutaciones
TKI: Inhibidores Tirosin Kinasa, GR: Glóbulos Rojos, GB: Glóbulos Blancos, PLT: Plaquetas, HB: Hemoglobina, %IS: Escala Internacional, βNR: No refiere
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
56
Anexo 5: Procedimiento de Estandarización de la prueba
A
B
Fotografía No.1: Estandarización de PCR para amplificación del dominio tirosin quinsa del gen quimérico
BCR-ABL. Los páneles A y B muestran los productos amplificados de 863 pb en un gel de agarosa al 2 %. En la
parte superior pueden observarse los resultados utilizando una PCR nested y diluciones comparando con el uso de
cDNA (RT) directo para la amplificación. En la parte inferior se observa la amplificación de tres muestras con un
valor de IS% diferenciado (LMC-166:12.8; LMC-115: 12.0 y LMC-81:10.38).
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
57
A
B
Figura No. 18: Análisis informático de electroferogramas. El panel A muestra el análisis de la secuencia de
ADN correspondiente al dominio tirosin kinasa del gen BCR-ABL. En esta se muestra una correspodencia del
100 % con la secuencia consenso de referencia. El panel B muestra la secuencia proteica de BCR-ABL sin ningún
cambio en su estructura primaria. Ambos resultados confirman la estandarización exitosa de la técnica para la
detección de mutaciones en BCR-ABL.
Fuente: Datos experimentales proyecto FODECYT 46-2013
58
Anexo 6: PCR de amplificación del dominio Tirosin Kinasa de BCR-ABL en pacientes con
Leucemia Mieloide Crónica
Fotografía No. 2: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1. Se muestra una serie de fotografías
de geles de agarosa 2% teñidos con Gel Red 2 X en las que se observa el fragmento de 863 pb correspondiente al dominio
tirosin kinasa del gen BCR-ABL obtenido a partir de cDNA. Todas la muestras son amplificadas por triplicado para su
secuenciación. El panel incluye las muestras: LMC-16, 49, 120, 122, 20, 70, 92, 130, 191 y196.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
59
Fotografía No. 3: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1. Se muestra una serie de fotografías
de geles de agarosa 2% teñidos con Gel Red 2 X en las que se observa el fragmento de 863 pb correspondiente al dominio
tirosin kinasa del gen BCR-ABL obtenido a partir de cDNA. Todas la muestras son amplificadas por triplicado para su
secuenciación. El panel incluye las muestras: LMC- 128, 159, 113, 173,. 184, 215, 207, 38, 39, 60, 75, 178, 123, 71, 182,
255, 296, 85, 160, 261, 319 y 304.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
60
Fotografía No. 4: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1. Se muestra una serie de fotografías
de geles de agarosa 2% teñidos con Gel Red 2 X en las que se observa el fragmento de 863 pb correspondiente al dominio
tirosin kinasa del gen BCR-ABL obtenido a partir de cDNA. Todas la muestras son amplificadas por triplicado para su
secuenciación. El panel incluye las muestras: LMC-329, 340, 118, 146, 114, 179, 364, 252,266, 285, 338, 343, 37 y 4.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
61
Fotografía No. 5: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1. Se muestra una serie de fotografías
de geles de agarosa 2% teñidos con Gel Red 2 X en las que se observa el fragmento de 863 pb correspondiente al dominio
tirosin kinasa del gen BCR-ABL obtenido a partir de cDNA. Todas la muestras son amplificadas por triplicado para su
secuenciación. El panel incluye las muestras: LMC-244, 246, 402, 404, 264, 273, 300, 443, 42, 67, 68, 419, 181, 407 y
422.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
62
Fotografía No. 6: PCR del dominio tirosin kinasa del gen quimérico BCR-ABL1. Se muestra una serie de fotografías
de geles de agarosa 2% teñidos con Gel Red 2 X en las que se observa el fragmento de 863 pb correspondiente al dominio
tirosin kinasa del gen BCR-ABL obtenido a partir de cDNA. Todas la muestras son amplificadas por triplicado para su
secuenciación. El panel incluye las muestras: LMC-218, 328, 411, 428, 435, 19, 50, 282, 316, 105, 325, 18, 65, 221 y
230.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
63
Anexo 7: Electroferograma de las muestras de pacientes negativos para mutaciones en
BRC-ABL1
Figura 19: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1. La figura muestra el análisis
realizado que permite la comparación entre la secuencia de ADN amplificada, que corresponde al dominio tirosin
kinasa del oncogen BCR-ABL; y la secuencia consenso referencia. En ambas figuras se observa un 100% de
concordancia entre secuencias, por lo que los pacientes carecen de mutaciones que produzcan resistencia a
inhibidores tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
64
Figura 20: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1. La figura muestra el análisis realizado
que permite la comparación entre la secuencia de ADN amplificada, que corresponde al dominio tirosin kinasa del
oncogen BCR-ABL; y la secuencia consenso referencia. En ambas figuras se observa un 100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los pacientes carecen de mutaciones que produzcan resistencia a inhibidores tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
65
Figura 21: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis realizado
que permite la comparación
entre la secuencia de ADN
amplificada, que corresponde
al dominio tirosin kinasa del
oncogen BCR-ABL; y la
secuencia consenso referencia.
En ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que los
pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores tirosin
quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
66
Figura 22: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1. La figura muestra el análisis realizado
que permite la comparación entre la secuencia de ADN amplificada, que corresponde al dominio tirosin kinasa del
oncogen BCR-ABL; y la secuencia consenso referencia. En ambas figuras se observa un 100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los pacientes carecen de mutaciones que produzcan resistencia a inhibidores tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
67
Figura 23: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis
realizado que permite la
comparación entre la
secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que
los pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
68
Figura 24: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis
realizado que permite la
comparación entre la
secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que
los pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
69
Figura 25: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis
realizado que permite la
comparación entre la
secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que
los pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
70
Figura 26: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis
realizado que permite la
comparación entre la
secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que
los pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
71
Figura 27: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis
realizado que permite la
comparación entre la
secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que
los pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
72
Figura 28: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis
realizado que permite la
comparación entre la
secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que
los pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
73
Figura 29: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis
realizado que permite la
comparación entre la
secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que
los pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
74
Figura 30: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis
realizado que permite la
comparación entre la
secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que
los pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
75
Figura 31: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1. La figura muestra el análisis
realizado que permite la comparación entre la secuencia de ADN amplificada, que corresponde al dominio tirosin
kinasa del oncogen BCR-ABL; y la secuencia consenso referencia. En ambas figuras se observa un 100% de
concordancia entre secuencias, por lo que los pacientes carecen de mutaciones que produzcan resistencia a
inhibidores tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
76
Figura 32: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis
realizado que permite la
comparación entre la
secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que
los pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
77
Figura 33: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis
realizado que permite la
comparación entre la
secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa
un 100% de concordancia
entre secuencias, por lo que
los pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
78
Figura 34: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1. La figura muestra el análisis realizado
que permite la comparación entre la secuencia de ADN amplificada, que corresponde al dominio tirosin kinasa del
oncogen BCR-ABL; y la secuencia consenso referencia. En ambas figuras se observa un 100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los pacientes carecen de mutaciones que produzcan resistencia a inhibidores tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
79
Figura 35: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis realizado
que permite la comparación
entre la secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa un
100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los
pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
80
Figura 36: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis realizado
que permite la comparación
entre la secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa un
100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los
pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
81
Figura 37: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis realizado
que permite la comparación
entre la secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa un
100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los
pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
82
Figura 38: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis realizado
que permite la comparación
entre la secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa un
100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los
pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
83
Figura 39: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis realizado
que permite la comparación
entre la secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa un
100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los
pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
84
Figura 40: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis realizado
que permite la comparación
entre la secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa un
100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los
pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
85
Figura 41: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis realizado
que permite la comparación
entre la secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa un
100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los
pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
86
Figura 42: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis realizado
que permite la comparación
entre la secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa un
100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los
pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
87
Figura 43: Análisis
informático de
electroferogramas del gen
BCR-ABL1. La figura
muestra el análisis realizado
que permite la comparación
entre la secuencia de ADN
amplificada, que
corresponde al dominio
tirosin kinasa del oncogen
BCR-ABL; y la secuencia
consenso referencia. En
ambas figuras se observa un
100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los
pacientes carecen de
mutaciones que produzcan
resistencia a inhibidores
tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
88
Figura 44: Análisis informático de electroferogramas del gen BCR-ABL1. La figura muestra el análisis realizado
que permite la comparación entre la secuencia de ADN amplificada, que corresponde al dominio tirosin kinasa del
oncogen BCR-ABL; y la secuencia consenso referencia. En ambas figuras se observa un 100% de concordancia entre
secuencias, por lo que los pacientes carecen de mutaciones que produzcan resistencia a inhibidores tirosin quinasa.
Fuente: Proyecto FODECYT 46-2013
89
Anexo 8: Actividades de Divulgación de los resultados obtenidos en el proyecto
Figura 45: Conmemoración
del día internacional de la
Leucemia Mieloide Crónica
2013. Durante la actividad
tuvieron participación las
asistentes de laboratorio del
proyecto Mariana Herrera y
Luisa Rosales.
En la actividad se promovió la
adherencia al tratamiento, para
evitar la aparición de
mutaciones de resistencia a
TKI’s. Y se informó de la
ejecución del proyecto para la
participación de los
interesados.
Fuente: FODECYT 46-2013
90
Figura 46: Conmemoración del
día internacional de la Leucemia
Mieloide Crónica 2015. Durante
la actividad tuvieron participación
la asistente de laboratorio del
proyecto Luisa Rosales y el Dr.
Mauricio Villegas, miembro de
INVEGEM.
En la actividad se informó de la
ejecución del proyecto para la
participación de los interesados y
se mostraron algunos de los
resultaos obtenidos en el proyecto.
Fuente: FODECYT 46-2013
91
Figura 47: Póster Científico FODECYT 46-2013. Durante el “I Congreso de actualización en Biología Molecular
y Genética” realizado en el mes de abril de 2016 se tuvo participación con la elaboración y presentación de un
póster científico con los resultados obtenidos en el proyecto.
Fuente: FODECYT 46-2013
92
Figura 48: Presentación de
póster y conferencia. Durante el
“I Congreso de actualización en
Biología Molecular y Genética”
realizado en el mes de abril de
2016 se tuvo participación con la
elaboración y presentación de un
póster científico con los
resultados obtenidos en el
proyecto.
Además la Dra. Claudia
Carranza, investigadora principal
del proyecto impartió una
conferencia sobre el mismo tema.
Fuente: FODECYT 46-2013
93
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO
Monto Autorizado: Q217,000.00 Orden de Inicio (y/o Fecha primer pago): 01/02/2014
Plazo en meses 24 meses
Fecha de Inicio y Finalización: 01/02/2014 al 31/01/2016
Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignación
Presupuestaria
TRANSFERENCIA
Ejecutado Pendiente de
Ejecutar
Menos (-) Mas (+)
1 SERVICIOS NO PERSONALES
122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 2,000.00 Q 2,000.00
181 Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad Q 108,000.00
Q 97,125.00 Q 10,875.00
181 Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad: evaluación externa de impacto Q 8,000.00
Q 8,000.00
185 Servicios de capacitación Q 2,500.00 Q 2,500.00
2 MATERIALES Y SUMINISTROS
261 Elementos y compuestos químicos Q 75,000.00 Q 73,157.04 Q 1,842.96
272 Productos de vidrio Q 1,500.00 Q 923.55 Q 576.45
295 Útiles menores, médico-quirúrgicos y de
laboratorio Q 20,000.00
Q 19,657.35 Q 342.65
3 PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E
INTANGIBLES
GASTOS DE ADMÓN. (10%)
Q 217,000.00
Q190,862.94 Q 26,137.06
MONTO AUTORIZADO Q 217,000.00
Disponibilidad Q 26,137.06
(-) EJECUTADO Q 190,862.94 -
SUBTOTAL Q 26,137.06
(-) ANTICIPO PARA GASTOS MENORES Q -
TOTAL POR EJECUTAR Q 26,137.06
82
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Actividades Duración en meses
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Cotización y compra de reactivos X X X X X X X
Estandarización de técnicas X X X
Vínculos con hospitales X X
Determinación de la mutación
T315I en pacientes con Leucemia Mieloide Crónica
X X X X X X X X X X X X X X X
Informar sobre pronóstico X X X X X X X X X X X X X X X
Orientar a tratamiento X X X X X X X X X X X X X X X
Divulgar resultados X X X
Elaboración de informe final X