CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA,...
Transcript of CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA,...
CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
DIAGNOSTICO MOLECULAR, S.A.
INFORME FINAL DEL PROYECTO
“ D E S A R R O L L O D E U N P C R M U L T IP L E X P A R A
ID E N T IF IC A R L A S P R IN C IP A L E S E S C H E R I C H I A
C O L I C A U S A N T E S D E D IA R R E A IN F A N T IL E N
G U A T E M A L A ”
PROYECTO FODECYT No. 039-2006
Olga R. Torres,
Investigadora Principal
GUATEMALA, MAYO 2011
FODECYT 039-2006 2
i. RESUMEN
La segunda causa de morbilidad y mortalidad en niños preescolares de Guatemala continúa siendo la diarrea,
que ocasiona de 8 a 11 episodios de diarrea por niño por año, conllevando retraso en su crecimiento y desarrollo y
resultando en alta mortalidad cuando ataca a infantes malnutridos o coincide con otro episodio de infección
severo. Parte del problema es que patógenos altamente virulentos y prevalecientes en nuestro medio pasan
inadvertidos porque no se pueden diagnosticar ya que no existen herramientas de diagnóstico que permitan
conocer la magnitud del problema. Este es el caso de la E.coli enterotoxigénica, patógeno número uno en el área
rural y en pacientes severamente enfermos por diarrea que requieren hospitalización en el Roosevelt. Tomando
ventaja de los avances en tecnología molecular aplicada al diagnóstico microbiano, se propuso desarrollar un
método de diagnóstico basado en la amplificación de secuencias blanco por medio de la reacción de polimerasa en
cadena (PCR) multiplex: varios primers usados simultáneamente para detectar las diferentes toxinas de ETEC
(lábil y estable) y los factores de virulencia de EPEC (eae y bpf). Como resultado de el presente proyecto se logró
desarrollar un método que detecta simultáneamente los genes que codifican las enterotoxinas termolábil (lt) y
termoestables humana (sth) y porcina, (stp) de la E. coli enterotoxigénica (ETEC) y de los pilis formadores de
"bucles" (bpf) en la E. coli enteropatógena (EPEC), así como el gen eae que codifica la intimina, proteína que
permite la adhesión en contacto íntimo con las células intestinales y del gen agg de la E. coli enteroagregativa
(EAEC). Doce primers que reconocen regiones específicas en los extremos 3’ y 5’ de cada uno de los genes antes
indicados constituyen la base del PCR multiplex aquí reportado. El proceso requirió prueba de las secuencias
propuestas en el protocolo seguidas por otras secuencias más idóneas hasta que se logró obtener reacciones
reproducibles con cepas control conocidas para la producción de las toxinas de E. coli LT, STh y STp, primero,
luego se agregaron los genes de eae y bpf para EPEC y finalmente las del gen agg de la EAEC. Se estandarizaron
las condiciones del PCR para lograr la amplificación de las secuencias seleccionadas, utilizando ADN procedente
de cepas de referencia de ETEC, EPEC y EAEC provistas por el laboratorio de referencia de la OMS para ETEC,
por la Dra. Ann-Mari Svennerholm a quien se visitó en diciembre de 2006 en el caso de ETEC y del Center for
Disease Control and Prevention de Atlanta en los Estados Unidos, en el caso de la EPEC y la EAEC. Asimismo,
se probó el desempeño del método con otras cepas de E. coli causantes de diarrea por otros mecanismos, como la
E. coli enterohemorrágica, la E. coli enteroagregativa y la E. coli enteroinvasiva, para asegurarnos de que no
dieran reacciones cruzadas. Finalmente, el método se validó con una colección de cultivos de Escherichia coli,
identificados previamente por métodos de ELISA, considerados estándar cuando se planteó el proyecto,
almacenados a -70°C y finalmente se analizaron muestras de niños con y sin diarrea. Adicionalmente a los
objetivos propuestos inicialmente, se evaluó el uso de pooles para el tamizaje de muchas muestras en las cuales
predominan las negativas (muestras no diarreicas o de poblaciones inmunes, por ejemplo), método que permite el
análisis simultáneo de hasta diez cepas, economizando tiempo y recursos. Finalmente, otro importante producto
adicional a los objetivos propuestos fue la validación del PCR multiplex en ADN extraído directamente de
muestras fecales diarreicas usando filtros FTA, obteniéndose buenos resultados con heces sin diluir, lo que
permite un diagnóstico rápido de ETEC, EPEC y EAEC sin cultivo, en unas cuantas horas, lo cual tiene utilidad
clínica en casos pediátricos severos.
FODECYT 039-2006 3
ii. ABSTRACT
Diarrheal diseases are the second most important cause of morbidity and mortality in pre-school children of
Guatemala, who suffer an estimate of 8 to 11 episodes of diarrhea per child per year, which result in growth and
development retardation. Part of the problem is that microbial pathogens that are virulent and highly prevalent in
our country are unrecognized because of the lack of diagnostic tools implemented for routine testing so that the
real importance of these pathogens is realized by the medical community. Enterotoxigenic E. coli is the number
one pathogen found in diarrhea cases observed in children living in rural areas of Guatemala, but also are the most
important pathogen found among children hospitalized due to severe diarrhea that compromises their life. EPEC
and EAEC are among the important causes of severe and persistent diarrhea in children. Taking advantage of the
technological advances now available, this project proposed the development of a diagnostic method for ETEC,
EPEC, and EAEC the most prevalent diarrheagenic E. coli´s in Guatemala, based on polymerase chain reaction
amplification of virulence genes, using all primers in one single reaction tube. The results are that indeed such
multiplex PCR method was developed and tested in known and unknown samples with good reproducibility and
specificity and sensitivity. It detects simultaneously the genes that code for enterotoxigenic E. coli labile toxin,
stable toxin human and stable toxin porcine the EPEC coding genes for bundle forming factor bpf and the intimin
gene eae, as well as the agg gene of EAEC. A total of 16 primers are mixed together with dinucleotides, enzyme,
buffer and after 39 cycles of amplification, specific bands of know molecular weight are obtained when the genes
are present in the E. coli isolated from diarrheagenic stools. The methodology was to test the proposed sequences
first and then to try new sequences that did not interfere with one another, until a set of sequences was found to
allow the simultaneous determination of ETEC toxin genes (lt, sth, stp,), EPEC virulence genes(eae and bpf), and
the agg determinant for enteroaggregative E. coli (EAEC). Then the methodology conditions were standardized
using DNA from reference strains obtained from the ETEC WHO collaborating Center in Goteborg and from
CDC in Atlanta for EPEC and EAEC. The performance of the method was tested with other strains that are
associated with diarrhea such as enterohemorrhagic E. coli, , and enteroinvasive E. coli as well as with
Salmonellas, Shigellas, Proteus spp, Vibrio cholera, Pseudomonas, S. aureus, and others to assure no cross
reactions were seen. Finally the method was validated with a culture collection of Escherichia coli, previously
identified as ETEC or non-ETEC by the Goteborg ELISA test, which were preserved frozen at -70°C.
Additionally and beyond the proposed objectives a pool method was developed to test for ETEC in non-diarrheic
samples as a cheap, rapid screening test, among samples that were mostly negative, an approach that allows the
simultaneous screening of up to ten strains, reducing the cost of labor, reagents and the time of testing. Also, an
addition to the protocol was the testing and standarization of the method in direct, undiluted fecal material using
DNA extracted with FTA filters and the same multiplex PCR. This gave good results and permits direct testing
thus avoiding the cost and time for fecal culture and isolation of E. coli colonies, providing an important method
for clinical follow up of severe diarrhea cases among the pediatric population.
FODECYT 039-2006 4
III. iii. Breve biografía académica de la autora
Olga R. Torres de Matute es guatemalteca, graduada de química bióloga de la USAC (1981) y de microbióloga
molecular en el grado de Master of Science de Cornell University, Ithaca, N. Y. (1988). Su primer trabajo fue
como ayudante de cátedra en el departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacia de la USAC, luego ocupó el cargo de Profesora de Microbiología en la misma unidad académica.
En 1985 inició su relación laboral con el INCAP como investigadora de la Unidad de Nutrición Infección y en
el mismo año obtuvo una beca Fulbright con la cual asistió a Cornell University. A su retorno en 1988 ocupó
de nuevo el cargo de investigadora en NI del INCAP. En 1994 asumió la jefatura de la unidad y en octubre de
2005 salió del INCAP para establecer el laboratorio Diagnóstico Molecular, S. A. el cual dirige y el Centro de
Investigaciones en Nutrición y Salud, CIENSA que funciona como una ONG de investigación. Ha colaborado
en múltiples investigaciones relacionadas con resistencia antimicrobiana, etiología y diagnóstico de diarreas,
inocuidad de alimentos y fumonisinas, ensayos de vacunas contra diarrea y ensayos clínicos de
antimicrobianos contra diarrea del viajero. Asimismo ha organizado y participado en muchas capacitaciones
en métodos moleculares dirigidos a profesionales centroamericanos. Ha sido invitada a dar conferencias en
diversos países sobre su trabajo por la OMS, el IICA, el CDC, el USDA, Netropica y otros. Cuenta con 26
publicaciones científicas.
FODECYT 039-2006 5
CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
DIAGNOSTICO MOLECULAR, S.A.
INFORME FINAL DEL PROYECTO
“ D E S A R R O L L O D E U N P C R M U L T IP L E X P A R A
ID E N T IF IC A R L A S P R IN C IP A L E S E S C H E R I C H I A
C O L I C A U S A N T E S D E D IA R R E A IN F A N T IL E N
G U A T E M A L A ”
PROYECTO FODECYT No. 039-2006
Olga R. Torres,
Investigadora Principal
GUATEMALA, MAYO DE 2011
FODECYT 039-2006 6
Derechos de Autor (Copyright)
FODECYT 039-2006 7
v. AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de
Ciencia y Tecnología –FONACYT-, otorgado por la secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –
SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología – CONCYT-. Se agradece el apoyo técnico de
las QB’s Wanda González y Lilian Martínez, así como Cecilia Díaz de Mayorga y del Dr. Stephen Savarino
por enviarnos cepas de referencia. El apoyo técnico de la Dra. Patricia Saravia Otten.
FODECYT 039-2006 8
vi. PREFACIO
Diagnóstico Molecular, S.A., es un laboratorio especializado, moderno y acreditado que brinda servicios de
análisis de alimentos y agua, análisis clínico, microbiología especial, biología molecular e investigación.
En el campo de la investigación se han realizado varias investigaciones sobre epidemiología de diarrea en niños y
vacunas en visitantes. El diagnóstico de diarreas de difícil detección como las de E. coli diarreogénica se han
logrado con base en métodos basados en la Biología Molecular moderna. Los mismos no se encuentran
disponibles en muchos laboratorios del país, pero en el estudio que aquí se presenta, se validó un PCR multiplex
de punto final, haciendo notar que ahora ya se cuenta con el equivalente en PCR de tiempo real.
En nuestro país los estudios de Epidemiología Molecular son pocos y tomando en cuenta que la diarrea infantil es
un problema de salud pública y que uno de los principales agentes causales de diarrea bacteriana es Escherichia
coli enterotoxigénica, responsable del 17.9% de los episodios en el área rural y del 26% de las diarreas severas
deshidratantes que ameritan atención hospitalaria, se hace necesario la implementación de técnicas rápidas y
específicas, como lo es el caso de un PCR Multiplex, para realizar diagnóstico diferencial de Escherichia coli
diarreogénica.
FODECYT 039-2006 9
vii. TABLA DE CONTENIDOS DEL INFORME FINAL DEL PROYECTO DE
INVESTIGACIÓN
“Desarrollo de un PCR multiplex para identificar las principales Escherichia coli
causantes de diarrea infantil en Guatemala”
FODECYT 039-2006
i. Resumen
ii. Abstract
iii. Breve Biografía académica de la autora
iv. Copyright
v. Agradecimientos
vi. Prefacio
vii. Tabla de Contenidos
viii. Lista de ilustraciones
ix. Lista de tablas
x. Lista de abreviaturas
xi. Glosario
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN 13
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 16
(Antecedentes y Justificación del trabajo de investigación)
I.3 OBJETIVOS 19
I.3.1 Objetivo General
I.3.2 Objetivos Específicos
I.4 METODOLOGIA (Descripción detallada de la Metodología) 20
I.4.1 Localización del estudio 20
I.4.2 El Método 20
I.4.3 Técnica Estadística 23
I.4.4 Equipo, reactivos y materiales utilizados 23
PARTE II
II.1 MARCO TEORICO 31
PARTE III
III.1 RESULTADOS ALCANZADOS 44
III.2 DISCUSION DE RESULTADOS 55
FODECYT 039-2006 10
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES 57
IV.2 RECOMENDACIONES 59
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60
IV.4 ANEXOS 65
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO 66
VIII. LISTA DE ILUSTRACIONES
Fotografía 1: Desarrollo de PCR Multiplex para la Detección de Escherichia coli diarreogénicas:
ETEC, EAEC, EPEC y EHEC
Fotografía 2: PCR Multiplex corrido solamente para los genes que codifican las toxinas de ETEC:
LT, STP y STH
Fotografía 3: PCR corrido para factores de virulencia de EPEC: BFP y EAE.
Fotografía 4: Estandarización de PCR Multiplex para la Detección Simultánea de Toxinas de ETEC y
EPEC (LT, STP) y factores de virulencia de EPEC (BFP y EAE)
Fotografía 5: PCR para amplificación de factores de virulencia de EAEC: AGGR.
Fotografía 6: Estandarización individual del PCR Multiplex de toxinas de EHEC: VT1 y VT2.
Fotografía 7: Estandarización PCR Multiplex de bajo costo para toxinas de ETEC en pooles de cinco
muestras.
Fotografía 8: Transferencia de tecnología a Panamá y Honduras. PCR de toxinas de ETEC.
Tabla No. 1 Genes de Virulencia a estudiar
IX. LISTA DE TABLAS
Tabla No. 1: Genes de virulencia a estudiar
Tabla No. 2: Cepas estándar de E. coli y sus factores de virulencia
Tabla No. 3: Secuencia de primers seleccionados para el PCR Multiplex 039-2006 para ETEC, EPEC, EAEC
y EHEC
Tabla No. 4: Preparación de la mezcla maestra para PCR Multiplex de ETEC, EPEC y EAEC (detección
simultánea)
FODECYT 039-2006 11
X. LISTA DE ABREVIATURAS
ETEC: E. coli enterotoxigénica; LT: Toxina Lábil, ST: Toxina estable, STp: Toxina estable porcina, STh:
toxina estable humana, CF: factores de colonización
EPEC: E. coli enteropatógena; bpf: pili formador de bucles o “bundle forming factor”, eae: factor de adherencia
y eliminación
EAEC: E. coli enteroagregativa; aggr: gen regulador de la expresión de factores de patogenicidad de EAEC
EHEC: E. coli enterohemorrágica
EIEC: E. coli enteroinvasiva
OMS: Organización Mundial de la Salud
CDC: Centro de control y prevención de enfermedades de Estados Unidos
ATCC: American Type Culture Collection
Kb: Kilobases
DNTP`s: residuos de dinucleótido-fosfatos
F: forward
R: reverse
HPLC: Cromatografía líquida de alta presión
TAQ: Endonuclease termoestable
°C: grados centígrados
UV: Ultravioleta visible
Pb: pares de bases
IMVIC: Indol, Movilidad, Voges-Proskauer, Citratos
SOP: Standard Operating Procedure o Procedimiento Operativo Estandarizado
FODECYT 039-2006 12
XI.GLOSARIO
PCR: La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase
Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo
objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN en particular, partiendo de un
fragmento original o molde.
PCR MULTIPLEX : PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea
dos o más pares de cebadores (o primers) en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente
múltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción varios cebadores (o primers)
de los sistemas que se quieren amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la
reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola
reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de
base de datos.
PCR DE TIEMPO REAL: Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la
cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta
probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado
valor Tm, del inglés meeting temperatura).
PRIMER O INICIADOR O CEBADOR: Son secuencias cortas, de 20-24 pares de bases de largo,
normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben
estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar.
AMPLIMERO: Producto de amplificación por la PCR.
EPEC: Abreviatura de Escherichia coli enteropatogénica, es el agente causal predominante de diarrea en
niños que viven en países en vía de desarrollo. EPEC interacciona con las células epiteliales
produciendo una lesión histopatológica característica conocida como “adherencia / destrucción” o lesión
A/E (attaching and effacing). En la producción de la lesión A/E por EPEC, se observan cambios
importantes en el citoesqueleto de la célula hospedera, los cuales incluyen a la acumulación de actina
polimerizada formando una estructura parecida a una copa o pedestal. La adherencia inicial está
relacionada a la producción de la fimbria BFP (Bundle Forming Pilus), el cual se requiere para la
producción de diarrea por EPEC.
ETEC: Abreviatura de Escherichia coli enterotoxigénica, se parece mucho a V. cholerae, se adhiere a la
mucosa del intestino delgado, no la invade, y elabora toxinas que producen diarrea. No hay cambios
histológicos en las células de la mucosa y muy poca inflamación. Produce diarrea no sanguinolenta en
niños y adultos, sobre todo en países en vías de desarrollo, aunque los desarrollados también se ven
afectados.
IV.
FODECYT 039-2006 13
PARTE I
I.1 INTRODUCCION
Escherichia coli, previamente conocida como la bacteria fecal más abundante y no patógena para el intestino, es
ahora clasificada como E. coli patógena y no patógena. Dentro del grupo patógeno se encuentran las Escherichia
coli diarreogénicas, las cuales se subdividen en cinco categorías que son: E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC) y E. coli
enteroagregativa (EAEC). Todas son patógenas al ser humano y con excepción de E. coli enteroinvasiva, todas
han sido documentadas en nuestro país como agentes causales de diarrea infantil En Guatemala, aunque no se
cuenta con un sistema de vigilancia activa de diarreas, existen estudios prospectivos y transversales realizados en
comunidades rurales, hospitalarias y peri-urbanas, que han demostrado que un niño menor de cinco años sufre de
ocho a once episodios de diarrea anualmente (Cruz, J. R. 1989; Cruz, J. R., 1992., Svennerholm, A-M, 2005,
Lemus, O. 2007). La ETEC es una importante causa de diarrea en niños de países en desarrollo y en turistas que
visitan regiones endémicas para ETEC. Las ETEC aisladas del hombre pueden producir una enterotoxina lábil
(LT), una enterotoxina estable (ST) o ambas (LT, ST) (Sack, RB 1980). La ST puede clasificarse en dos
genotipos: STa y STb, de los cuales el que se asocia con cepas que producen diarrea en el ser humano es STa
(también conocida como ST I), codificado por el gen estA, mientras que la STb (ó STII) predomina en cepas de
ETEC de origen animal. Existen dos distintos subtipos de STa: STh (ó STIb) ya que se consideraba previamente
de origen humano y STp que se consideraba de origen porcino (Rao, M 1985). Existen varias formas alélicas del
gen estA,los dos alelos que codifican STp y STh se han encontrado en cepas de ETEC aisladas de seres humanos
(Moseley, SL.1983), variantes de STa que son muy similares en estructura y función. La STh consiste de 18
amino ácidos y la STp de 19; ambas variantes contienen seis residuos de cisteína y la mayoría de epitopos en la
molécula de ST son conformacionales (Rao, M 1985). Tanto la STh como la STp se unen a receptores específicos
del borde de cepillo de la membrana del intestino delgado para activar el sistema de guanilil-ciclasa-GMP cíclico,
resultando en diarrea (Guarino A, 1987). Los métodos tradicionales del ratón lactante y de ELISA no permiten la
discriminación entre los dos subtipos de STa: STh y STp. Inicialmente esta diferenciación se realizaba
únicamente por medio de hibridación con sondas de ADN (Nishibushi M, 1989; Steinland, H 2003), en la
actualidad por PCRs desarrollados para este fin (Bolin I, 2006) y por lo tanto la distribución relativa de los
genotipos STh y STp entre aislados humanos, no se ha reportado con frecuencia, aunque sí es factible de
diagnosticar.
En un estudio conducido en Guinea Bissou, Sommerfelt (2002) reportó usando sondas de ADN, que las variantes
de ETEC asociadas con diarrea eran solamente las productoras de STh sola o en combinación con LT, pero que
las cepas productoras de STp no producían diarrea en niños (Steinsland, H et al. 2002). Como parte de los
estudios colaborativos conducidos entre O. Torres, la Dra. Svennerholm y el Dr. Bourgeois, se comparó la
distribución de STh y STp en ETEC aislada de niños de Guatemala, Bangladesh y Egipto, así como la encontrada
en ETEC aislada de turistas que viajaron a Guatemala desde Estados Unidos o Canadá, usando PCR y nuevos
primers para STh diseñados y evaluados conjuntamente con los descritos previamente para STp (Woodward, MJ
1992). Usando estos métodos de PCR, Bolin, I y colaboradores (2006) reportaron que en Guatemala y Egipto,
las cepas productoras de STp comúnmente están asociadas con diarrea y que no hay diferencia entre la
distribución relativa de los genotipos STh y STp entre ETECs aisladas de viajeros con diarrea o de individuos
asintomáticos visitando las mismas áreas. Esta información fue un reto para el proyecto propuesto, pues indicaba
la necesidad de incluir una nueva variante en el multiplex, la STp.
La etiología de los agentes de diarrea varía entre regiones, sin embargo, en Guatemala los principales
agentes de diarrea bacteriana son E. coli enterotoxigénica causante del 17.9% de los episodios en el área rural y
FODECYT 039-2006 14
del 26% de las diarreas severas, deshidratantes que ameritan atención hospitalaria, (Torres, O. 2006.; Lemus, O.
2006), mientras que EPEC causa el 5.8% de los casos (información generada por este estudio). Sin embargo,
EPEC se asocia con el 17.8% de casos de diarrea persistente, cifra que la coloca como la principal causa de
diarrea de más de catorce días de duración en nuestro medio (Cruz, JR. 1992). La EAEC se asocia con casos de
diarrea persistente, con recurrencia de diarrea persistente y con deterioro nutricional y fue altamente prevalente en
niños de edad preescolar de regiones rurales de Guatemala en estudios hechos en la década de los 80’s (Cruz JR,
1989; Cruz, JR, 1992); los efectos sobre el estado nutricional y eventualmente sobre la vida del paciente, son
altamente indeseables (Mata, L, 1992; Martorell, R. 1977), por lo que el país debe contar con métodos sencillos y
objetivos para su detección. El panorama infeccioso no ha cambiado mucho en ciertas regiones del país desde los
años 70, cuando se reportaba que por cada 100,000 niños de 1-4 años, 500 morían por diarrea mientras que en los
Estados Unidos esa cifra es menor a tres (Behar, 1979; Cruz, JR, 1992; Mata L. 1978).
El diagnóstico diferencial de Escherichia coli diarreogénica era sumamente complejo pues requería de
instalaciones de bioterio de ratones para la prueba de ETEC ST, de histocultivos para la prueba de ETEC LT y de
EAEC y de gran cantidad de antisueros específicos para la de EPEC además de ser laboriosas, consumían muchas
horas laborables y eran poco objetivas en el caso de diagnostico por microscopía como el de EAEC (Cruz JR,
1989; Cruz JR 1992, Mathewson, 1985). Por lo tanto, se restringían a laboratorios de investigación, o de
referencia, sumamente especializados, que pudiesen costear la implementación de bioensayos como el del ratón
lactante para E. coli productora de toxina estable (Gianella, 1976), el ensayo de las células Y-1 para E. coli
productora de toxina lábil (Donta, 1974) las pruebas de serología para E. coli enteropatógena (Ewing, 1986,
Mathewson, 1985) y las pruebas de adherencia a células Hep-2 para EAEC y EPEC (Cravioto, 1979; Nataro, J
1998). Más recientemente, con el desarrollo de anticuerpos monoclonales dirigidos contra las toxinas lábil o
estable de ETEC, así como contra los factores de colonización (López-Vidal, Y 1988; Svennerholm, AM 1986,
1983), los métodos de referencia cambiaron hacia ELISAs directos (LT) ó indirectos (ST). Los antisueros
utilizados para la clasificación serológica de las E. coli´s son la base para el diagnóstico tradicional de EPEC,
mismos que no se encuentran comercialmente disponibles, por lo que su uso se restringe a laboratorios de
referencia nacionales de países desarrollados (Ewing, WH, 1986). Recientemente, se cuestiona la clasificación
fenotípica de la EPEC, proponiéndose un método alternativo, genético, para identificarla con objetividad (Nataro,
J. 1998, Nataro, J 2007) el cual se basa en la detección de dos determinantes: eaeA y bpf.
La E. coli entero agregativa o EAEC fue definida originalmente por su patrón típico en células Hep 2. Se
asocia con diarrea en una serie de ambientes clínicos, incluyendo la diarrea endémica en niños tanto en países
pobres como industrializados, diarrea epidémica, diarrea del viajero a países en desarrollo y como diarrea
persistente entre pacientes inmunocromprometidos. Su patogenicidad se ha confirmado en estudios con
voluntarios y por su implicación en brotes epidémicos. Se han definido varios ensayos sencillos como pruebas
preliminares para la identificación de EAEC, que incluyen la observación simple de un biofilm sobre poliestireno
(Yamamoto, 1992), sondas de ADN (Baudry, B 1990) como alternativas a la adherencia en células Hep-2 que
requiere instalaciones para histocultivos. En este caso, los métodos moleculares ayudaron a definir su naturaleza
diarreogénica. Clínicamente, la diarrea por EAEC se acompaña por signos y síntomas de leve inflamación, con
dolor abdominal y fiebre, pero las heces usualmente no contienen leucocitos fecales o sangre. En la actualidad se
recomienda el diagnóstico específico por medio de la amplificación del gen regulador AggR (Sarantuya, J. 2004),
gen que se utilizó para el PCR multiplex aquí propuesto.
Durante la última década, se han desarrollado pruebas genéticas y moleculares que han eliminado la
necesidad de esa infraestructura tan sofisticada de histocultivos y bioterio, pues con el advenimiento del PCR
(Mullis, KB, 1993) se pueden ahora hacer todos los diagnósticos diferenciales de las E. coli diarreogénicas por
amplificación de los determinantes de virulencia de cada una de ellas. Un PCR multiplex tiene la ventaja de que
solamente se requiere de instalaciones de biología molecular relativamente de poco costo y bastante accesibles,
que en la actualidad ya se encuentran disponibles incluso en el Laboratorio Nacional de Salud del Ministerio de
FODECYT 039-2006 15
Salud Pública de Guatemala, del Seguro Social, así como de las principales universidades del país. El método
ideal deberá ser fácil de implementar, reproducible, sensible y específico y permitir la detección rápida de genes
estructurales y de virulencia de diversos patógenos. Estos métodos ofrecen ventajas sobre los métodos clásicos,
fenotípicos, cuyos resultados exigen la expresión genética, a veces es un proceso muy difícil y delicado en
términos de condiciones del ensayo. Los métodos genéticos obvian todo el paso de la expresión fenotípica con lo
que los ensayos se simplifican sobremanera. Otra ventaja de este tipo de pruebas es que el equipo e
infraestructura requeridos sirven para múltiples propósitos, lo cual es una ventaja cuando se cuenta con escaso
presupuesto. Entre las desventajas de los métodos genéticos, particularmente los de amplificación como el PCR,
sobresale la susceptibilidad a contaminación cruzada, que exige infraestructura que separe físicamente la campana
de trabajo donde se preparan las mezclas de reactivos (cuarto blanco) con exclusividad y la aplicación de una
técnica laboratorial cuidadosa para no acarrear moléculas amplificadas en los pasos anteriores a nuevas (Harris,
E. 1988).
Se han publicado métodos basados en la amplificación genética por PCR para detectar los genes de toxina
estable (st), toxina lábil (lt) de la ETEC (Olsvik, O. 1993)) y pilus formador de "bucles" de la EPEC (bfp), así
como de los genes aggR, aggA, affA, agg3 de la EAEC (Giron, JA 1991; Giron, JA 1993; Nataro, JP 2005;
Huang, DB 2006). Existen también métodos comerciales, dentro de ellos uno que detecta en heces el ADN de
ETEC (Stacy-Phipps, S 1995). Un PCR multiplex es aquél en el que se detectan varios genes simultáneamente y
por lo consiguiente, ahorra tiempo y recursos al dar varias respuestas en una sola prueba. Se propuso un PCR
multiplex para toxina lábil, toxina estable de ETEC, el pili formador de bucles de EPEC y el gen aggr de EAEC,
con lo que se detectarían directamente en una muestra estos tres patógenos.
En el presente proyecto se formuló un PCR multiplex basado en 16 primers (cebadores o iniciadores)
específicos, para las toxinas LT y STh, STp de ETEC, los determinantes eaeA y bpf de EPEC, el gen aggR de
EAEC, y los genes vt1 y vt2 de EHEC, basados en las secuencias publicadas sobre los genes de interés. Se tuvo
acceso al método de referencia de la OMS para ETEC, por lo que fueron estas secuencias las que se usaron para
preparar los primers y a este grupo se agregaron los iniciadores de la EPEC y EAEC, tomando ventaja de la
colaboración prestada por la Dra. Ann-Mari Svennerholm (Bolin, I 2006). Se combinaron en un solo PCR
multiplex, el cual se probó con cepas estándar conocidas como productoras de LT, STh ó STp, que fueron
provistas por la Dra. Ann-Mari Svennerholm, directora del laboratorio de referencia de la OMS para E. coli
enterotoxigénica, así como cepas estándar obtenidas en la American Type Culture Collection y cepas provistas
por el CDC para EPEC y EAEC y validado con cepas previamente diagnosticadas por los métodos estándar y
almacenadas como cultivos stock congeladas a -70°C.
FODECYT 039-2006 16
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA
Aunque estamos en el siglo XXI, el poco desarrollo del área rural guatemalteca así como la débil
infraestructura sanitaria de regiones remotas del país, resultan en que la segunda causa de morbilidad y mortalidad
en niños Guatemaltecos es la enfermedad diarreica aguda. Se han reportado que los niños del área rural padecen
de 8 a 11 episodios de diarrea por niño por año y de 5 a 8 en regiones urbanas, diez por ciento de los cuales se
convierten en diarrea persistente (Cruz, JR. 1992, Svennerholm, AM. 2005, Lemus, O. 2007), la cual deteriora las
reservas de micro y macro nutrientes y conlleva a desnutrición crónica.
Guatemala es un país montañoso y con muchos accidentes geográficos dentro de su relativamente
pequeño y densamente poblado espacio; hay regiones remotas de poca población rural, que carecen de acceso a
servicios de salud. En la actualidad el cambio global, la sobrepoblación, el avance del frente poblacional que
consume los bosques, la falta de agua potable y la contaminación de las aguas superficiales ejercen presión sobre
los microorganismos y han emergido cepas altamente virulentas en todo el mundo y re-emergido antiguos males
como la tuberculosis. Para muchas enfermedades se han creado vacunas, pero casi todas las que afectan
mayormente a la población pobre de países en desarrollo se han quedado atrás porque el motor que mueve la
investigación y el desarrollo tecnológico reside en el poder adquisitivo de los países desarrollados. De tal forma
que en nuestras regiones remotas, un niño con diarrea puede no encontrar acceso oportuno de salud y esa diarrea
puede resultar en la muerte, porque no existen vacunas contra la diarrea. Desafortunadamente, a pesar de que se
cuenta con herramientas como terapia de rehidratación oral, lactancia materna exclusiva y promoción de la
higiene personal, tres intervenciones sencillas que reducen el impacto de las diarreas, las mismas no son de uso
masivo en nuestro país ya que la mayoría de las mujeres de las zonas rurales no tienen educación formal, más del
60% son analfabetas y está demostrado que el nivel de educación de la madre está directamente relacionado con el
desarrollo de sus hijos. La vacuna contra rotavirus, por ejemplo, no se ha aplicado masivamente en nuestro país y
se reserva para quienes tienen el poder económico para pagarla. Más aún, los antibióticos se dispensan
libremente en farmacias, por curanderos (quienes muelen las pastillas y dan “polvitos mágicos” a su clientela) e
inclusive en tiendas del área rural se venden pastillas sueltas de antimicrobianos, práctica que promueve el abuso
y mal uso de los mismos promoviendo presión selectiva hacia la resistencia antimicrobiana que dificulta y
encarece y dificulta el tratamiento de infecciones severas.
La infraestructura sanitaria de Guatemala es pobre. Solamente el 60% de la población tiene acceso a agua
entubada y la potabilidad de la misma se garantiza únicamente en las grandes ciudades como Guatemala. Al no
tener agua corriente, es difícil promover el lavado frecuente de manos pues las amas de casa deben acarrear el
agua por grandes distancias. El alto costo de la vida afecta también a los habitantes de regiones remotas, pues la
brecha entre ellos y el desarrollo cada día es mayor.
No obstante, la infraestructura laboratorial de Guatemala ha ido fortaleciéndose poco a poco y en 2008, el
Laboratorio Nacional de Salud cuenta con varios termocicladores y un laboratorio con cuarto blanco y
congeladores adecuados para poder implementar diagnósticos basados en pruebas moleculares (O. Torres, 2008).
Asimismo, el Seguro Social ha implementado sofisticadas mediciones de carga viral por PCR y poco a poco, el
personal profesional ha sido capacitado en métodos moleculares y la masa crítica en microbiología ha ido
aumentando, a pesar de la falta de recursos impide que el laboratorio sea un brazo importante que asuma el
liderazgo, se han hecho grandes avances en la última década. No obstante, la información disponible sobre
etiología de diarreas en Guatemala es escasa y no existen reportes periódicos basados en laboratorio sobre los
agentes de diarreas infecciosas en el país. Guatemala ha sufrido las consecuencias de esta falta de información al
FODECYT 039-2006 17
perder 45,000 fincas exportadoras de frambuesa debido a que se vinculó a este producto con brotes de diarrea por
Cyclospora cayetanensis en la década pasada en Estados Unidos y Canadá (Katz D 1995).
Entre 1999 y 2000 se condujo una vigilancia para diarrea sanguinolenta a través de los estudiantes de EPS
de la escuela de QB de la USAC. Se recolectaron 110 casos de diarrea sanguinolenta, 110 controles de diarrea no
sanguinolenta y 110 controles sin diarrea. La vigilancia fue pasiva, a través de muestras que llegaron a los sitios
de trabajo de los EPSs. El objetivo era determinar la prevalencia de E. coli entero hemorrágica como causante de
diarrea sanguinolenta. La EHEC se buscó por medio de PCR corrido en ADN extraído de cinco colonias de E.
coli pero simultáneamente se buscaron otros entero patógenos como Shigella, Salmonella, Campylobacter y
parásitos. Dos resultados fueron inesperados ya que los casos se asociaron principalmente con Shigella flexneri y
no con EHEC –no se encontró ningún caso de EHEC ni de síndrome hemolítico urémico- y la edad de los
pacientes osciló entre 15 y 69 años, a diferencia de lo que se esperaba que era en niños preescolares (Urréjola, MI
2001).
En un niño desnutrido, un episodio de diarrea aguda severo puede desembocar en la muerte cuando no
recibe atención médica oportuna y en nuestro medio, 10% de los casos de diarrea aguda resultan en diarrea
persistente que conlleva a falta de crecimiento y desarrollo y desnutrición crónica (Cruz et al., 1989). Desde los
años 70, Leonardo Mata estudió y describió detalladamente los patógenos asociados con infección intestinal en el
libro Los niños de Santa María Cauqué (SMC), publicado por MIT en la década de los 70’s, el cual resume diez
años de investigación prospectiva en una cohorte de niños de SMC, en donde resalta la falta de infraestructura
sanitaria y de educación formal de las madres. Las publicaciones de José Ramiro Cruz en los 90’s, que reportan
estudios de diarrea persistente llevados a cabo en Santa María de Jesús (SMJ), reportan un panorama muy similar
al de SMC, con infecciones múltiples y una impresionante falta de saneamiento ambiental, 20 años más tarde. No
obstante, observaciones hechas por la autora de este reporte permitieron conocer que en SMJ se dio un avance
grande en infraestructura sanitaria que resultó en la reducción significativa de las infecciones múltiples y de la
prevalencia de bacterias y virus entéricos en Santa María de Jesús. Sin embargo, la diarrea continúa siendo la
causa número uno ó dos de consulta, pero la comunidad adoquinó las calles y cementó sus patios y de esa forma
se redujo la prevalencia de una buena parte de las diarreas. Esta misma observación fue hecha en SMC, por Mata
L. & O. Torres, 2001. Lamentablemente casi el 50% de la población preescolar de Guatemala tiene desnutrición
crónica que se manifiesta como baja talla para edad, lo que multiplica el riesgo de mortalidad por diarrea.
Estudios más recientes desarrollados por O. Torres en la presente década permitieron estudiar la diarrea
aguda durante tres estaciones lluviosas en Santa María de Jesús, en niños menores de tres años de edad, pero
mayores de 6 meses, en estudios financiados por la OMS (a Svennerholm, AM) y por las Universidades de
Goteborg y de Johns Hopkins (A. L. Bourgeois), con el objeto de caracterizar los determinantes de virulencia de
las ETEC que afectan a la población pediátrica en nuestro país, ya que durante los estudios del Dr. Cruz, no se
ahondó en la ETEC pues el énfasis de los mismos era la diarrea persistente. El patógeno más frecuentemente
asociado con diarrea bacteriana aguda tanto en el área rural como en niños hospitalizados por diarrea severa en la
ciudad de Guatemala, es la E. coli enterotoxigénica seguida de la E. coli enteropatógena, mientras que en SMJ
ETEC es la principal causa seguida de Campylobacter jejuni (Svennerholm AM, 2005; Lemus, O 2006).
Estudios de la década de los 90 también identificaron a la E. coli enteroagregativa (EAEC) y a la E. coli
enteropatógena (EPEC) como agentes bacterianos que ocasionan diarreas severas y requieren hospitalización para
proteger la vida de los pacientes (Cruz, JR 1990) y con diarrea persistente (Cruz JR et al. 89 y 92).
EL PCR o reacción de la polimerasa en cadena por sus siglas en inglés, es un proceso cuyo desarrollo
ameritó un premio Nóbel (Dr Kary B. Mullis, 1993) y revolucionó el desarrollo de la ingeniería genética, de la
biología molecular, así como las técnicas de diagnóstico en salud. Este método permite multiplicar un segmento
de un gen dado a partir de material genético complejo, millones de veces en unas pocas horas, lo cual es de gran
significancia para la investigación bioquímica y genética.
FODECYT 039-2006 18
En el PCR se mezclan secuencias específicas que por su tamaño pequeño se conocen como
oligonucleótidos (cebadores, iniciadores o primers), que rodean a un gen de interés, se separan en dos hebras
desnaturalizándolos a 94°C y luego enzimas capaces de sintetizar ADN más los cuatros dinucleótidos, iones de
Mg++ en condiciones óptimas para que la enzima lleve a cabo sus funciones de sintetizar nuevas hebras, se repite
en varios ciclos (usualmente 25 a 30), y como resultado el gen se ha multiplicado en proporción geométrica y es
entonces detectable por curvas en gráficos o bien por geles de agarosa o de acrilamida. En este caso los genes
amplificados fueron los de las toxinas lábil y estables (LT y STh, STp) de E. coli enterotoxigénica (ETEC) y los
de los pilis formadores de bucles, el bpf y gen eaeA de E. coli enteropatógena, así como el AggR de EAEC. Los
primers o iniciadores tienen secuencias escogidas a partir de las reportadas en la literatura y disponibles en bases
de datos globales, en las bibliotecas virtuales de la internet, se sintetizan in vitro, se secan y los envían a
Guatemala en una semana. Las enzimas y otros reactivos se adquieren en el extranjero y se deben enviar
congelados, con hielo seco, y es esta logística la más complicada pues los mismos no se encuentran disponibles en
el mercado local, excepto bajo pedido expreso. Todos los reactivos pueden mantenerse congelados a -20°C
(Harris, E 1998).
En el presente caso, los primers y las condiciones de amplificación constituyen el reactivo objeto del
desarrollo de la presente investigación, pues deben diseñarse, probarse para reproducibilidad y validarse para que
reconozcan los genes blanco de forma sensible y específica, a partir de las secuencias de ADN publicadas para los
mismos. Además deben poder mezclarse sin inhibirse mutuamente ni producir bandas espurias, inespecíficas,
permitiendo amplificar los genes blanco de forma sensible, específica, reproducible y consistente a partir del
ADN de las bacterias.
I.2.2 JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
ETEC es el principal patógeno que causa diarrea del viajero en nuestro medio (Sack, D. 2007, Frech, S
2008), seguido de norovirus (Chapin, AR 2005) y de EAEC (Taylor, DN 2006). Estudios realizados en turistas
que visitan Antigua Guatemala en los cuales O. Torres ha participado como investigadora principal a cargo de los
análisis de laboratorio en el país, indican que del 40 al 50% sufren diarrea del viajero, el 50% de estos casos se
asocia con ETEC y una proporción elevada se enferma tan seriamente que suspenden sus planes vacacionales
porque no pueden desplazarse lejos de su hotel (Sack, D 2007, Frech, S 2008). Asimismo, se encontró a EAEC
como el segundo patógeno en importancia después de la ETEC como causante de diarrea del viajero (Zhi Dong
Ziang, O. Torres & L. Bourgeis, datos no publicados; Frech, S 2008, Taylor DN, 2006). La ETEC productora de
toxina estable tanto humana como porcina se asocia con diarrea en niños y turistas que visitaron Antigua
Guatemala (Bolin, I 2006).
El diagnóstico de todas las E. coli´s diarreogénicas constituye un reto para los laboratorios de referencia,
por lo que en general pasan desapercibidas en países como el nuestro, a pesar de que se ha documentado su
importancia en la epidemiología local. En 2003, O. Torres dirigió la transferencia tecnológica del diagnóstico de
ETEC por ELISA al INISA de Costa Rica, donde su contraparte principal fueron las Dras. Ximena Cortés y
Rosario Achí, con apoyo de la Dra. Svennerholm. Su identificación por métodos tradicionales requiere capacidad
de histocultivos, grandes colecciones de antisueros poli y monoclonales y procesos sumamente laboriosos, lentos
y muy caros, accesibles tan solo en laboratorios de referencia y necesitan alta capacidad técnica y gran
infraestructura de laboratorio para llevarlos a cabo. La alternativa con métodos moleculares, es una opción
atractiva porque con el mismo equipo se pueden identificar todas las cepas de E. coli diarreogénicas.
FODECYT 039-2006 19
I.3 OBJETIVOS
1.3.1 OBJETIVO GENERAL: Desarrollar un PCR multiplex para la detección y diferenciación
simultánea de ETEC, EPEC y EAEC los principales tipos de E. coli productoras de diarrea en
niños guatemaltecos.
1.3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1.3.2.1 Diseñar un primer que reconozca una región común en el extremo 5´ de los genes st y lt
en ETEC; eae y bpf en EPEC y aggr en EAEC respectivamente.
1.3.2.2 Establecer las condiciones metodológicas apropiadas, que permitan la detección y
diferenciación simultáneas de estos genes en E. coli's aisladas de heces diarreicas.
1.3.2.3 Validar el método con E. coli's previamente identificadas, en el estudio prospectivo sobre
diarrea persistente, realizado en Santa María de Jesús, disponibles en los ceparios del
INCAP.
1.3.2.4 Confirmar los resultados con hibridación con sondas de ADN de los genes de virulencia
sth, stp, lt, eae, bfp y aggr marcadas con digoxigenina y detectadas colorimétricamente.
FODECYT 039-2006 20
I.4 METODOLOGIA
1.4.1. Localización del estudio: el trabajo se realizó en el Laboratorio Diagnóstico Molecular, ubicado en el
Edificio Multimédica, Boulevard Vista Hermosa 25-19, zona 15 Vista Hermosa I, oficina 1009.
1.4.2. El Método
Un PCR multiplex es aquél en el que se detectan varios genes simultáneamente y por lo consiguiente,
ahorra tiempo y recursos al dar varias respuestas en una sola prueba. Se propuso desarrollar y validar un PCR
multiplex para detectar las variantes de E. coli que se asocian con un alto porcentaje de diarrea infantil en
Guatemala. El método desarrollado detecta la toxina lábil y las toxina estables (porcina y humana) de ETEC, el
pili formador de bucles de EPEC y el factor aggr de la E. coli enteroagregativa con lo que se detectan en ADN
extraído directamente de colonias (lactosa positivas) aisladas en agar MacConkey que se asumen son de E. coli,
estos tres patógenos. Los genes de virulencia a estudiar se detallan en la tabla 1. El mismo método se aplicó
exitosamente a muestras de ADN extraídas por el método del filtro FTA a partir de heces diarreicas de niños y
turistas enfermos con diarrea aguda.
TABLA 1: GENES DE VIRULENCIA A ESTUDIAR
E. coli diarreogénica Abreviatura Gen de virulencia blanco del PCR Función
E. coli enterotoxigénica ETEC Toxina Lábil (LT)
Toxina Estable Humana (STh)
Toxina Estable Porcina (STp)
Codifica tox. Termolábil
Codifica tox. termoestable
Codifica tox. termoestable
E. coli enteropatógena EPEC Pilus formador de "bucles" (bpfA)
Factor de adherencia de EPEC (eaeA)
E. coli enteroagregativa EAEC (aggr)
Eco R I sequence of pCVD432 (pCVD)
Regulador global de la
virulencia de EAEC
Fuente: Bolin, I., 2005, Van Nuyen, T. 2005, Nataro, J. 2007.
En el presente proyecto formulamos primers específicos, basados en las secuencias publicadas sobre los genes de
interés (Moseley, 1983, Yamamoto, 1984; Girón 1993, Bolin, 2006, Nataro JP 2005, 2007) que permiten
combinar los ensayos independientes en un solo PCR multiplex, el cual se va a probar con cepas previamente
diagnosticadas por los métodos estándar y almacenadas como cultivos stock.
El diagnóstico diferencial de las tres variedades de E. coli más importantes en la etiología de las diarreas
infantiles en Guatemala, E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC) y E. coli
enteroagregativa (EAEC), es especializado, como se indicó anteriormente y no se encuentra al alcance de los
laboratorios de servicio de nuestro país. Sin embargo, el diagnóstico preciso evita el uso inapropiado de
antimicrobianos con la consiguiente reducción de resistencia antimicrobiana en nuestro medio, pues ambas son
diarreas autolimitantes. Asimismo, permite describir la etiología y epidemiología de diarreas en niños, lo cual
FODECYT 039-2006 21
permite hacer estudios de brotes e implementar medidas de intervención para reducir la transmisión de estos
patógenos, tan importantes causas de diarrea infantil de nuestro país.
El proyecto aquí reportado fue un proyecto de investigación y desarrollo de una prueba de laboratorio para el
diagnostico de diarreas bacterianas causadas por ETEC, EPEC y EAEC. Para ello se usaron como cepas
conocidas, E. coli´s previamente aisladas en estudios realizados en Santa María de Jesús y el Hospital
Roosevelt, de los cuales O. Torres fue la investigadora principal, que fueron analizadas por ELISA y
anticuerpos monoclonales (método estándar de oro), colección que sirvió para validar el método desarrollado, o
bien por amplificación genética en el caso de las EAEC´s. La prueba desarrollada detecta los genes de
virulencia de ETEC, EPEC y EAEC por amplificación genética de secuencias blanco a través de la síntesis de
fragmentos de ADN de peso molecular conocido. La especificidad del método se comprobó por medio de una
prueba de Chi cuadrado y por sondas de ADN marcadas. El desarrollo de dicho método requirió el diseño y
selección de primers o iniciadores que luego fueron probados en ensayos de amplificación, mismos que fueron
optimizados según la secuencia de los primers y el largo del amplicón. El mayor reto fue el de reunir en un solo
tubo doce pares de primers y obtener, con el ADN extraído según el método de mas bajo precio (ebullición) un
resultado confiable y reproducible para los factores de virulencia buscados. Por ello no se describen variables,
indicadores, población, hipótesis, ni muestra. A continuación se describe el trabajo de laboratorio asociado con
este proyecto FODECYT.
Primers: Los primers o iniciadores son oligonucleótidos de 20-24 pares de bases de largo (15-16). En el presente
proyecto se obtuvieron primers fabricados en los Estados Unidos por Invitrogen, por medio de proveedores
nacionales como Bionuclear, S. A. LDM le entregaba las secuencias a Bionuclear y ellos los mandaban a
sintetizar y nos los entregaban puestos en LDM.
Para un PCR multiplex se requieren ya sea un primer en común y primers específicos para amplificar
simultáneamente los genes de virulencia de nuestro interés (16, 17) sth, stp, lt, eae, bfp y aggr, o bien ocho pares
de primers que se dirijan a los diferentes genes blanco. Los primers usados en este proyecto fueron seleccionados
haciendo uso de programas de identificación y alineamiento de secuencias genéticas, disponibles en el programa
de dominio público denominado Data Gene Bank y disponible en Internet:
http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi?Jform=0. Este programa indica los pasos a seguir para obtener las
secuencias deseadas, de forma bastante amigable. En el caso de sth, stp y lt se recibieron las secuencias
recomendadas por el laboratorio de referencia de OMS, por colaboración de la Dra. Ann-Mari Svennerholm,
directora del mismo, (Bolin, I. 2006), por lo que estas fueron usadas para contar con una prueba válida
globalmente. Para el gen aggr existen secuencias publicadas, recomendadas por el laboratorio del Dr. James
Nataro quien es el líder en investigación en esta bacteria, por lo que las mismas fueron las incorporadas en el
ensayo (Nataro, J. P. 2007).
Estandarización del Método de Amplificación: Para establecer y estandarizar condiciones de
amplificación con las que se obtuviesen bandas fuertes, de pesos moleculares fáciles de diferenciar para los tres
genes de interés, reproduciblemente, se determinaron los buffers y concentraciones de cloruro de magnesio,
concentraciones de nucleótidos, concentración de enzima y temperaturas y tiempos de incubación y número de
ciclo óptimos usando cultivos positivos conocidos. Asimismo se seleccionaron las condiciones de gel de agarosa
y estándares de peso molecular, velocidad, buffers, tiempo de corrimiento para separar las bandas y de fotografía
para documentarlas (15-16). Las condiciones reproducibles se alcanzaron después de muchos intentos fallidos, y
las mismas se describen en la sección de resultados.
El primer paso en el desarrollo del PCR multiplex fue correr todos los loci separadamente usando el
mismo programa de PCR. En un contexto ideal, observaríamos todas las bandas fuertes y sin bandas
inespecíficas. En la práctica, no todos los primers nos dieron este resultado ideal, a excepción de las tres bandas
para las toxinas de ETEC STp, STh y LT. Inicialmente se usaron cepas de Escherichia coli de referencia,
FODECYT 039-2006 22
disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC) y de estudios anteriores realizados por O. Torres
cuando estaba en INCAP. Las cepas estándar se describen en la tabla siguiente.
TABLA 2: CEPAS ESTANDAR DE E. COLI Y SUS FACTORES DE VIRULENCIA
Tipo de diarreogenicidad
Factor de
Virulencia
Identificación
Descripción
E. coli enterotoxigénica Toxina estable
(STp)
SMJ 70059 Cepa control positivo para la toxina
estable porcina
E. coli enterotoxigénica Toxina lábil LT
y toxina estable
STh
SMJ
70071
Cepa control positivo para toxina
lábil y toxina estable humana
E. coli enterotoxigénica Toxina lábil LT SMJ
70083
Cepa control positivo para toxina
lábil humana
E. coli enteropatógena Eae CDC
0128 ab: 56-54
Cepa control positivo para uno de los
serogrupos más comúnmente
asociados con diarrea en Guatemala
E. coli enteropatógena Eae y
bpf
CDC
O111a, O111b:B
148-57
Cepa control positivo para uno de los
serogrupos más comúnmente
asociados con diarrea en Guatemala
E. coli enteroadherente (EAEC) EAEC aggr LDM-IOMAI
1637
Cepa enteroadherente positiva para
aggr trabajada por el laboratorio del
Dr. Herbert DuPont y Zhi Dong
Ziang
E. coli enteroadherente (EAEC) EAEC aggr 17-2 (W605) Enteric Diseases Department
Dr. Stephen Savarino E.coli
enteroadherente (EAEC)
EAEC aggr 042
Enteric Diseases Department
Dr. Stephen Savarino
E. coli no patógena Ninguno ATCC 25922 Cepa control negativo
Vibrio cholerae 01 clásico Ogawa Toxina de cólera
Ctx A, ctx B
ATCC 14035 Cepa productora de toxina, como control
cruzado negativo, para medir
especificidad del método
E. coli enteroinvasiva ipaH EIEC O121:MN Control negativo para medir
especificidad del método
E. coli enterohemorrágica SLT I & SLT II
(VT1, VT2) y
EAE
CDC 10407 Control negativo para medir
especificidad del método control positivo
EHEC
Shigella flexneri 6 No relacionados CDC
S. flex 6
Control negativo cruzado, para medir
especificidad del método
Salmonella B No relacionados INCAP 950056 Control negativo cruzado para medir
especificidad del método
Staphylococcus aureus No relacionados ATCC 25923 Control negativo para medir
especificidad del método
EHEC VT1, VT2, EAE ATTCC 35150 Control negativo para medir
especificidad del método control positivo
EHECC
FODECYT 039-2006 23
Validación del Método: Para validar el método desarrollado, se aplicó a cepas previamente identificadas por
ensayos por ELISA, corroboradas en el laboratorio de referencia de ETEC de la OMS por la Licda. Gudrun
Wiklund con apoyo de la Dra.Ann-Mari Svennerholm, que fueron parte del estudio colaborativo financiado por
OMS entre 2001 y 2005. En el caso de las EPEC, se usaron cultivos liofilizados provenientes del CDC. En el
caso de la EAEC se diagnosticó por adherencia en células Hep-2 y por hibridación con sondas marcadas para aggr
y fue obtenida en un estudio de diarrea del viajero, confirmada por el laboratorio del Dr. Herbert DuPont y por la
Dra. Zhi Dong Ziang, en la Universidad de Texas en Houston, así como cepas de referencia que fueron donadas y
enviadas a Guatemala por el Dr. Stephen Savarino del Servicio Naval de Estados Unidos. Estas cepas se
encuentran almacenadas en congelación a -70°C en el caso de ETEC y EAEC y una vez recuperadas del
liofilizado, también para las EPEC. Las cepas ATCC fueron obtenidas en forma liofilizada en asas descartables
de Remel. Para obtener células viables de los stocks, se inocularon en caldo tripticasa soya suplementado con
10% de sangre de carnero estéril, luego transferidas a agar sangre y finalmente almacenadas a –70°C en caldo
tripticasa soya con 20% de glicerol (9, 20).
En este paso se utilizaron cincuenta cepas conocidas de ETEC, diez de EPEC y dos de EAEC ya
previamente diagnosticadas. Todas las cepas que nos entregaron como EAEC estaban muertas, pues se
encontraban preservadas en agar con aceite mineral y tapones de corcho bañados en cera, no congeladas como el
resto. Se obtuvieron dos cepas del estudio de IOMAI terminado en 2007 (Frech, S, et al. 2008. Lancet). El
personal encargado del cepario, que labora en el laboratorio de bacteriología de LDM se encargó de sacar las
cepas y entregarlas a las encargadas del proyecto en forma codificada. De esta manera, esta parte del estudio fue
ciego para evitar sesgos de identificación por parte del personal de LDM encargado de realizar los PCR's.
Confirmación de Resultados: Para confirmar los resultados del PCR multiplex, se llevó a cabo una hibridación
de Southern de los productos de amplificación, con sondas de ADN marcadas con digoxigenina, sintetizadas a
partir de los genes sth, stp, lt, eae, bfp y aggr por medio de PCR, según recomendaciones del fabricante
(Boheringer-Mannheim). Es importante hacer notar que ambas investigadoras guatemaltecas tienen experiencia
en la preparación, manejo y detección de sondas de ADN marcadas colorimétricamente (21 - 23).
1.4.3 TECNICA ESTADISTICA
Los resultados obtenidos con el PCR multiplex aquí desarrollado y que en adelante será denominado PCR
multiplex ETEC/EPEC FODECYT 39/2006, fueron analizados en una tabla de 2x2 por Chi cuadrado, para
obtener la sensibilidad, la especificidad y valores predictivos positivo y negativo.
1.4.4 EQUIPO, REACTIVOS Y MATERIALES UTILIZADOS
Computadora con acceso a internet para el diseño de primers
10 X Buffer Invitrogen
DNTPs Invitrogen
Primer 1 a 16 listados en la Tabla 3
Agua HPLC
MgCl2 Invitrogen
TAQ Invitrogen
Pipetas blancas para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uL, 100 a 1000 uL
Tips con filtro del cuarto blanco para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uLy 1000 uL
Bloque congelador
Hielo picado
Agua para HPLC del cuarto blanco
Micro/Centrífuga de mesa para mezcla maestra
Vortex
Tubos Eppendorf de 1.5 mL, 0.5 mL y 0.2 uL
FODECYT 039-2006 24
Guantes cuarto blanco
Gradillas blancas
Picador de hielo y recipiente para hielo picado
Bata cuarto blanco
Pipetas grises para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uL, 100 a 1000 uL
Tips con filtro del cuarto gris para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uLy 1000 uL
Microcentrífuga
Baño de María hirviendo
Asa en punta
Mechero
Vortex
Agua para HPLC del cuarto gris
Tubos Eppendorf de 1.5mL y 0.5 ml
Gradillas grises
Guantes cuarto gris
Cepas control ETEC LT+, ETEC STh+, ETEC STp+
Refrigerador cuarto gris
Pipetas negras para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uL, 100 a 1000 uL
Tips con filtro del cuarto negro para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uLy 1000 uL
Tubos Eppendorf de 1.5mL y 0.5 mL
Gradillas negras
Refrigerador cuarto negro
Agarosa
Balanza
Buffer TBE 5x
Bromuro de Etidio
Termociclador
Transiluminador
Cámara Cannon con cono
Congeladores a -20°C y a -70°C
Horno de microondas
Diseño de primers:
Los primers o iniciadores son oligonucleótidos de 20-24 pares de bases de largo (15-16). Para un PCR
multiplex, en teoría se requieren un primer en común y primers específicos para amplificar simultáneamente los
genes de virulencia (16, 17) que estamos buscando. En este caso sth y stp, lt para ETEC y bfp y eae para EPEC,
así como aggr para EAEC. En este caso no se desarrolló un solo primer en común, debido a que los genes de
toxina estable, sth y stp que codifican para la toxina estable humana y la toxina estable porcina, son de muy corta
longitud y no se logró una secuencia común con los otros genes, a pesar de extensas búsquedas con programas de
identificación y alineamiento de secuencias genéticas, disponibles en el programa de dominio público
denominado “Data Gene Bank” y disponible en el sitio de Internet:
http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi?Jform=0, programa que indica los pasos a seguir para obtener las
secuencias deseadas, de forma bastante amigable. Hubo un factor no planificado en la selección de los primers de
ETEC. En octubre/noviembre de 2006, la IP viajó a Goteborg, Suecia invitada por la OMS para presentar datos
de la epidemiología de ETEC en Guatemala, generados en un proyecto colaborativo con la Dra. Ann-Mari
Svennerholm y financiado por OMS. En esta reunión la OMS anunció que el laboratorio de la Dra. Svennerholm
había sido nombrado el Centro de Referencia para ETEC por la OMS y por lo tanto, el Rector del diagnóstico
laboratorial de este patógeno en el mundo. Al contarle a la Dra. Svennerholm de este proyecto, ella y su técnica,
FODECYT 039-2006 25
Gudrun Wiklund, compartieron el método de PCR para detectar los genes de las toxinas de ETEC, mismo que se
convirtió en el método avalado por la OMS. Ante esto, la IP decidió introducir este como parte del PCR
multiplex para asegurarnos que la metodología seleccionada fuera válida ante la OMS. Para EPEC y EAEC los
primers fueron seleccionados usando el recurso Blast. Los primers seleccionados se listan en la tabla 3.
Estandarización del Método de Amplificación: Para establecer y estandarizar condiciones de
amplificación y que se obtuvieran bandas fuertes, de pesos moleculares fáciles de diferenciar para los genes de
interés, reproduciblemente, se determinaron los buffers y concentraciones de cloruro de magnesio,
concentraciones de nucleótidos, concentración de enzima y temperaturas y tiempos de incubación óptimos usando
cultivos positivos conocidos o estándar (15-16).
El proceso inicial consistió en amplificar gen por gen, de forma individual, para determinar si se amplificaba con
las condiciones elegidas para el PCR multiplex.
Inicialmente se usaron cepas de Escherichia coli de referencia, entregadas por el laboratorio de referencia
de la OMS para ETEC, por el CDC de Atlanta para EPEC u obtenidas de la American Type Culture Collection
(ATCC). Este fue un aporte de LDM al proyecto, el cual no había sido contabilizado en la contrapartida, pues se
obtuvieron de investigadores y colaboradores de otros proyectos de la IP. Las cepas usadas se describen en la
tabla 2.
FODECYT 039-2006 26
PRIMER Y SECUENCIA
PESO
MOLECULA
R Y
MOLECULA
DETECTADA
REFERENCIA LARG
O (PB)
PESO
MOLE
CULA
R
CONT
ENIDO
GC
TEMP
MEL-
TING
°C
AUTO-COMPLE-
MENTARIE-DAD
Primer 1: ST forw kb -
AGTGGTCCTGAAAGCATG-
sth: 64 pb
Bolin, I. 2006 18 5563.7 50 48 Ninguna
Primer 2: ST Gr -
TACAAGCAGGATTACAACAC-
20 6103.1 40 48 Ninguna
Primer 3: STP F1 –
TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG-
stp: 166 pb
Bolin, I. 2006 21 6389.1 43 50 Ninguna
Primer 4: STP R2 –
ACAGGCAGGATTACAACAAAG-
21 6481.3 43 50 Ninguna
Primer 5: LT kb forw –
ACGGCGTTACTATCCTCTC-
lt: 274 pb
Bolin, I. 2006 19 5714.8 53 51 Ninguna
Primer 6: LT kb rev -
TGGTCTCGGTCAGATATGTG-
19 5849.9 47 49 Ninguna
Primer7: eae F -
CACACGAATAAACTGACTAAAATG-
eae: 376 pb Vu Nguyen, 2005 24 7346.9 33 51 Ninguna
Primer8: eae R -
AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT-
24 7283.8 46 56 Ninguna
Primer 9: bfp F –
TTCTTGGTGCTTGCGTGTCTTTT-
bfp: 367 pb
Vu
Nguyen, 2005
23 7024.6 43 53 Ninguna
Primer 10: bfp R –
TTTTGTTTGTTGTATCTTTGTAA-
23 6982.6 26 46 Ninguna
Primer 11: aggrF –
CTGGCGAAAGACTGTATCAT--
aggr: 630 pb Nataro, J. P. 2007 20 6141.1 45 50 Ninguna
Primer 12: aggrR --
CAATGTATAGAAATCCGCTGTT--
22 6733.5 36 49 Ninguna
Primer 13: vt1A –
GAAGAGTCCGTGGGATTACG
vt1: 130 pb Vu
Nguyen, 2005
20 6222.1 55 54 Ninguna
Primer 14: vt1B –
AGCGATGCAGCTATTAATAA
20 6149.1 35 46 Ninguna
Primer 15: vt2 A --
ACCGTTTTTCAGATTTTGCACATA
Vt2: 298 pb Vu
Nguyen, 2005
24 7292.8 33 51 Ninguna
Primer 16: vt2 B --
TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT
24 7385.9 46 56 Ninguna
TABLA 3: SECUENCIA DE PRIMERS SELECCIONADOS PARA EL PCR MULTIPLEX 039-2006 PARA ETEC, EPEC, EAEC Y EHEC
FUENTE: FODECYT 039-2006
FODECYT 039-2006 27
EXTRACCION DE ADN DE COLONIAS
1. Aislar 5 colonias en Agar MacConkey o Agar Nutritivo (se usa para las cepas estándar).
2. Se toma una asada de media colonia aislada y se introduce en un eppendorf de 1.5 ml que
contenga 500 μl de agua grado HPLC.
3. Colocar el eppendorf en baño María a 100 ºC durante 20 minutos.
4. Al tener los 5 eppendorfs con el ADN extraído, se toman 100 μl de cada uno y se agregan a un
eppendorf, para preparar un solo pool de cada paciente.
5. Almacenar a –20 ºC.
EXTRACCION DE ADN DE HECES DIARREICAS POR MEDIO DE FILTROS FTA
1. Transferir 5 uL de muestra de heces a los filtros FTA
2. Secar los filtros con las muestras sobre una placa caliente a 60°C por una hora
colocando una hoja de papel secante entre las muestras y la placa para evitar que se
queme.
3. Colocar los filtros en un recipiente plástico y lavar por un minuto dos veces seguidas
con la solución FTA de lavado.
4. Lavar dos veces con solución de lavado TE agitando por dos minutos cada uno.
5. Colocar los filtros en la placa caliente a 60°C por 45 minutos
6. Sacar un trozo del filtro procesado usando un sacabocados desinfectado y colocar en un
tubo para PCR
7. Para el PCR usar 96 uL de master mix y agregarla directamente al tubo que contiene el
filtro. Si se usa la cantidad de 48 uL se evapora y no hay amplificación satisfactoria.
CONDICIONES DEL PCR MULTIPLEX PARA DETECCION
SIMULTÁNEA DE ETEC, EPEC Y EAEC:
Desnaturalización a 94°C por 4 minutos
39 ciclos de: 20 segundos a 94°C (desnaturalización)
30 segundos a 55°C (hibridación de primers en secuencias blanco)
10 segundos a 72°C (extensión)
Extensión final a 72°C por 7 minutos.
Tiempo requerido: 2 horas
En el termociclador Techne se tarda 1 hora con 38 minutos.
FODECYT 039-2006 28
TABLA 4: PREPARACION DE LA MEZCLA MAESTRA PARA EL
PCR MULTIPLEX DE ETEC, EPEC Y EAEC (DETECCION
SIMULTANEA)
Reactivo MARCA CONCENTRACION μl/tubo Total
Tubos
Vol.
Tota
l
10 X Buffer Gibco 10 X 5.0 N 5*n
DNTPs Invitrogen 2.5 mM 2.0
Primer 1: ST forw
kb
Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 2: ST Gr Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 3: STP F1 Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 4: STP R2 Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 5: LT kb
foro
Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 6: LT
kbrev
Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 7: eae F Invitrogen 100 mM 0.6
Primer 8: eae R Invitrogen 100 mM 0.6
Primer 9: bfp F Invitrogen 100 mM 0.4
Primer 10: bfp R Invitrogen 100 mM 0.4
Primer 11: aggr F Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 12: aggr R Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 13: vt1 a Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 14: vt1 b Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 15: vt2 a Invitrogen 100 mM 1.0
Primer 16: vt2 b Invitrogen 100 mM 1.0
Agua HPLC Merck 23.8
MgCl2 Gibco 50 Mm 0.9
TAQ Gibco 5 U/ul 0.3
Volumen Mezcla 44.0
Volumen Muestra 6.0
Volumen Total 50.0
FUENTE: FODECYT 039-2006
FODECYT 039-2006 29
PREPARACION DE MUESTRAS PARA AMPLIFICACION DEL DNA BLANCO
Se calcula el número total de tubos de muestras y se agrega un control negativo del cuarto blanco y tres
controles positivos para ETEC LT+, STp+ y STh+. Este es el factor por el que se multiplica el volumen
por tubo para obtener el volumen por reactivo a agregar para preparar la mezcla maestra. Esta mezcla
maestra se prepara en el cuarto blanco, en un Eppendorf de 1.5 mL, dentro de la campana de flujo
laminar, con el filtro encendido, midiendo rápida y precisamente cada ingrediente. Se usa un bloque
congelado a -20°C ó a -70°C, pero al sentir que el bloque se descongela se debe usar hielo picado.
Debe trabajarse rápido para prevenir que se hibridicen entre sí mismos los primers y se mire una ancha
banda de dímeros de primers o primer dimers.
AMPLIFICACION DE GENES DE VIRULENCIA
El PCR se corre en el termociclador Perkin Elmer, con el programa ETEC/EPEC multiplex: incuba por
4 minutos a 94°C, luego se corren 39 ciclos como sigue: 20 segundos a 94°C (desnaturalización del
ADN blanco, 30 segundos a 55°C para hibridación entre primers y las hebras separadas del ADN
blanco y 10 segundos a 72°C para extensión de nuevo ADN por la polimerasa Taq, para finalmente
dejar por 7 minutos a 72°C para que se extiendan por la polimerasa Taq las reacciones que quedaron a
medias y luego se mantienen los tubos a 10°C hasta que se sacan del termociclador. Este proceso lleva
2.5 horas. Al terminarlo se deben poner los tubos sin demora en frío para evitar presencia de una banda
muy ancha de primer dimers o bien correrlo de una vez en el gel. El proceso de amplificación lleva
alrededor de 2.5 horas.
En el termociclador Techne 512 se tarda 1 hora con 38 minutos únicamente.
PREPARACIÓN DEL GEL
1. Para la preparación del gel se deben preparar 150 mL de TBE 0.5 X (15 mL de TBE 5X + 135 mL
de Agua destilada estéril).
2. El gel a utilizar debe ser de 2% de agarosa. Pesar 3 gramos de Agarosa Sigma y disolverlo en los
150 mL de TBE 0.5X.
3. Colocar en el microondas por alrededor de 2 minutos, agitar constantemente. Disolver todos los
cristales.
4. Esperar a que se enfríe un poco aproximadamente 65 ºC (hasta donde la piel lo tolere) y agregar 5
μl de bromuro de etidio 10 mg/ml.
5. Verter en un molde. Esperar que se solidifique y meter en el refrigerador. Quitar lentamente los
peines para no romper los posos ni levantar el gel.
FODECYT 039-2006 30
INOCULACIÓN DEL GEL
1. Sumergir el gel en el buffer de corrida (TBE 5X) a manera de cubrir bien los posos.
2. Colocar primero el marcador de peso molecular (50 pb). Se utilizan 2 μl de marcador + 3 μl de
buffer de carga.
3. De cada muestra servir 20 μl de producto + 3 μl de buffer de carga.
4. Al terminar de servir las muestras colocar nuevamente el marcador de peso molecular.
5. Conectar a la fuente de poder con un voltaje de 20 mAmp por 2 horas.
TOMA DE FOTOGRAFIA
1. Al pasar las dos horas se coloca el gel en su molde sobre el transiluminador y se enciende la luz
UV.
2. Se observan las bandas y si los controles positivos y negativos se observan bien y se puede calcular
el peso molecular de las bandas observadas, se procede a tomar una foto con el cono y la cámara
Cannon.
3. Al encender la cámara puede centrarse la foto y se ajusta al mayor tamaño posible.
4. Una vez tomada la foto se pasa a la computadora para documentar el resultado del experimento.
FODECYT 039-2006 31
PARTE II
II.1 MARCO TEORICO
Las enfermedades diarreicas ocasionan 4,000 millones de casos cada año. Son la segunda mayor
causa de muerte de niños menores de cinco años, y ocasionan la muerte de 1,8 millones de niños
cada año. La diarrea asociada con infección puede durar varios días y puede privar al organismo del
agua y las sales necesarias para la supervivencia. La mayoría de las personas que fallecen por
enfermedades diarreicas, en realidad mueren por una grave deshidratación y pérdida de líquidos a
pesar de que, desde el desarrollo de las terapias de rehidratación oral, esas muertes no se deberían
dar. Así mismo, lactancia materna y mejor higiene ayudan a reducir la enfermedad diarreica. Los
niños malnutridos o inmunodeprimidos son los que presentan mayor riesgo de enfermedades
diarreicas potencialmente mortales, así como los habitantes de regiones remotas, que tienen que
caminar días para llegar a un servicio de salud.
La enfermedad diarreica es un problema importante de salud pública porque los niños que padecen
de diarrea crecen menos que quienes no la presentan. En contraste, la enfermedad respiratoria no
afecta las tasas de crecimiento (Martorell, R. et al, 1975 a y b).
Se define como diarrea la deposición, tres o más veces al día (o con una frecuencia mayor que la
normal para la persona) de heces sueltas o líquidas. La deposición frecuente de heces formes (de
consistencia sólida) no es diarrea, ni tampoco la deposición de heces de consistencia suelta y
“pastosa” por bebés amamantados. La diarrea suele ser un síntoma de una infección del tracto
digestivo, que puede estar ocasionada por diversos organismos bacterianos, víricos y parásitos. La
infección se transmite por el consumo de alimentos o agua contaminada, o bien de una persona a
otra como resultado de una higiene deficiente. Las enfermedades diarreicas pueden tratarse con una
solución de agua limpia, azúcar y sal, y con comprimidos de zinc.
Hay tres tipos clínicos de enfermedades diarreicas:
la diarrea acuosa aguda, que dura varias horas o días, y comprende el cólera;
la diarrea con sangre aguda, también llamada diarrea disentérica o disentería; y
la diarrea persistente, que dura 14 días o más.
Cada año, se producen unos dos mil millones de casos de diarrea en todo el mundo.
Las enfermedades diarreicas son una causa principal de mortalidad y morbilidad en la niñez en el
mundo, y por lo general son consecuencia de la exposición a alimentos o agua contaminados. En
todo el mundo, alrededor de mil millones de personas carecen de acceso a fuentes de agua
mejoradas y unos 2500 millones no tienen acceso a instalaciones básicas de saneamiento. La diarrea
causada por infecciones es frecuente en países en desarrollo.
En 2004, las enfermedades diarreicas fueron la tercera mayor causa de muerte en países de ingresos
bajos, donde ocasionaron el 6,9% de los fallecimientos. Son la segunda mayor causa de muerte de
FODECYT 039-2006 32
niños menores de cinco años, tras la neumonía. De los 1,5 millones de niños que fallecieron por
enfermedades diarreicas en 2004, el 80% tenían menos de dos años.
En países en desarrollo, los niños menores de tres años sufren, de promedio, tres episodios de
diarrea al año. Cada episodio priva al niño de nutrientes necesarios para su crecimiento. En
consecuencia, la diarrea es una importante causa de malnutrición, y los niños malnutridos son más
propensos a enfermar por enfermedades diarreicas.
La amenaza más grave de las enfermedades diarreicas es la deshidratación. Durante un episodio de
diarrea, se pierde agua y electrolitos (sodio, cloruro, potasio y bicarbonato) en las heces líquidas,
los vómitos, el sudor, la orina y la respiración. Cuando estas pérdidas no se restituyen, se produce
deshidratación.
La diarrea es un síntoma de infecciones ocasionadas por muy diversos organismos bacterianos,
víricos y parásitos, la mayoría de los cuales se transmiten por agua con contaminación fecal. La
infección es más común cuando hay escasez de agua limpia para beber, cocinar y lavar. Las dos
causas más comunes de enfermedades diarreicas en países en desarrollo son los rotavirus y
Escherichia coli.
En el mundo se han realizado numerosos estudios sobre la causa de la enfermedad diarreica aguda
(EDA). Entre los reportados en los últimos años en América Latina, se destacan los realizados por
Olarte en México, quien trabajó con niños desde 0 hasta 3 años, dicho autor encontró algún agente
enteropatogénico en el 70 % de los casos de diarrea y en 31 % de los controles. Los agentes más
frecuentemente identificados fueron: Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC, 17 %), Shigella sp.
(11 %) y Escherichia coli enteropatógena (EPEC 10 %). El virus Norwalk se identificó en 5 % de
los casos, Salmonella sp. 4 %, Giardia lamblia en 5 %, Adenovirus en 3 % y Entamoeba
histolytica sólo en 0,7 %. Por su parte, Trujillo y otros , en Colombia, en un estudio con 100 niños
de todas las edades, identificaron 115 microorganismos en 78 pacientes, entre los cuales 15 se
destacan ETEC termoestable (27), Rotavirus (25), EPEC (28), Campylobacter sp. (10), Salmonella
enteritidis (6), ETEC termolábil (5), trofozoitos de Giardia lamblia (4), Shigella (3), trofozoitos de
Entamoeba histolytica (4), Salmonella typhi (2) y Salmonella paratifica B (1). Ixta-Rodríguez y
otros, en un estudio llevado a cabo en México en niños desde 0 hasta 15 años, encontraron EPEC en
4 % de los casos, seguida de Klebsiella sp., Salmonella sp. y Shigella sp. con 24,6; 11,5 y 7,8 %,
respectivamente.2,3 Así mismo, es importante destacar el trabajo realizado por Notario y otros en
Argentina, en niños menores de 5 años, donde reportan los enteropatógenos, EPEP (26,1 %), ETEC
(9,7 %), Shigella (8,5 %), Rotavirus (5,1 %), Giardia (3,6 %), Campylobacter (3,2 %) y Salmonella
(2,4 %). En Venezuela es importante mencionar los estudios realizados por Urrestarazu y otros en
Caracas, quienes analizaron 182 muestras de niños menores de 2 años, encontraron ETEC en 41,8
%; EPEC en 12,2 %; Klebsiella pneumoniae en 11,2 %; Campylobacter jejuni en 9,2 %; Rotavirus
en 14,1 %; Giardia lamblia en 3,5 % y Entamoeba histolytica en 3,5 %. Como se puede apreciar,
los agentes bacterianos se encuentran entre los principales agentes causales de las diarreas
infecciosas en prácticamente todos los países del mundo, sin que Guatemala sea una excepción.
La Escherichia coli, en su hábitat natural, vive en los intestinos de la mayor parte de los mamíferos
sanos. Es el principal organismo anaerobio facultativo del sistema digestivo. En individuos sanos,
es decir, si la bacteria no adquiere elementos genéticos que codifican factores virulentos, la bacteria
actúa como un comensal formando parte de la microbiota y ayudando así a la absorción de
nutrientes. En humanos, la Escherichia coli coloniza el tracto gastrointestinal de un neonato
adhiriéndose a las mucosidades del intestino grueso en el plazo de 48 horas después de la primera
FODECYT 039-2006 33
comida. Se parece mucho a V. cholerae, se adhiere a la mucosa del intestino delgado, no la invade,
y elabora toxinas que producen diarrea. No hay cambios histológicos en las células de la mucosa y
muy poca inflamación. Produce diarrea no sanguinolenta en niños y adultos, sobre todo en países en
vías de desarrollo, aunque los desarrollados también se ven afectados.
Escherichia coli, previamente conocida como la bacteria fecal más abundante y no patógena para el
intestino, es ahora clasificada en dos grupos: E. coli diarreogénica y E. coli no diarreogénica, ésta
es un importante miembro de la microbiota fecal normal y su presencia se considera un indicador
de contaminación fecal. Las Escherichia coli diarreogénicas, se subdividen en cinco categorías: E.
coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enterohemorrágica
(EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC) y E. coli enteroagregativa (EAEC) (Nataro, J 2007).
Para determinar el grupo patógeno al que pertenecen Kauffman desarrolló un esquema de
serotipificación que continuamente varía y que actualmente tiene 176 antígenos somáticos (O), 112
flagelares (H) y 60 capsulares (K). El antígeno “O” es el responsable del serogrupo; la
determinación del antígeno somático y flagelar (O:H) indica el serotipo, el cual en ocasiones se
asocia con un cuadro clínico en particular. La serotipificación de E. coli requiere de gran número de
antisueros. Como hay pocos laboratorios que la realizan, se prefiere identificar las cepas mediante
sus factores de virulencia empleando ensayos in vitro como por ejemplo ensayos de adherencia en
células Hep-2 y ensayos de toxigenicidad en células. También se pueden realizar ensayos in vivo,
como el asa ligada o la prueba de Sereny, así como ensayos inmunológicos y pruebas de biología
molecular, para poner de manifiesto la presencia de fragmentos de genes involucrados en el
mecanismo de patogenicidad y que sirvan de marcadores moleculares. Las ETEC colonizan la
mucosa del intestino delgado por medio de pilis o fimbrias que tienen diversas formas denominadas
CFA (colonization factor antigens), siendo su principal mecanismo de patogenicidad la síntesis de
alguna o ambas enterotoxinas llamadas toxina termolábil (LT) y toxina termoestable (ST). Sus
genes están en un plásmido que también puede tener información genética para los CFA´s, aunque
algunos genes de ST se han encontrado en transposones. Las toxinas LT y ST aumentan el nivel
intracelular de cAMP y cGMP respectivamente, que se encuentran en la membrana de las células
intestinales, provocando la salida de agua e iones. Las ETEC son importantes en lactantes,
principalmente en niños menores de dos años, y en particular durante los primeros seis meses de
vida.
Todas son patógenas al ser humano y con excepción de E. coli enteroinvasiva, todas han sido
documentadas en nuestro país como agentes causales de diarrea infantil (Cruz, JR 1986, Cruz, JR
1992). En Guatemala, aunque no se cuenta con un sistema de vigilancia activa de diarreas, existen
estudios prospectivos realizados en comunidades rurales, hospitalarias y peri-urbanas, que han
demostrado que un niño menor de cinco años sufre de ocho a once episodios de diarrea anualmente
(Cruz, J. R. 1986, 1992). A nivel mundial las E. coli diarreogénicas no se buscan rutinariamente en
los laboratorios clínicos, debido a la falta de métodos diagnósticos rápidos, asequibles, y de bajo
costo. No obstante, en múltiples estudios de investigación se ha demostrado que las E. coli
diarreogénicas son una de las principales causas de diarrea en niños en países en vías de desarrollo
y algunas de éstas E. coli están siendo reconocidos como importantes enteropatógenos en países
desarrollados. La diseminación de las E. coli diarreogénicas es por contaminación fecal de agua o
alimentos. La ETEC y EAEC no solo están asociados a diarrea en niños, sino que también son los
principales agentes etiológicos de la diarrea del viajero.
Las manifestaciones clínicas de cada una de las E.coli diarreogénicas varían en relación a los
diferentes mecanismos de producción de enfermedad. ETEC coloniza el intestino delgado y secreta
enterotoxinas (termo-lábil y termo-estable) que producen una diarrea secretoria. La diarrea se
FODECYT 039-2006 34
caracteriza por ser acuosa, sin sangre, con dolor abdominal, nauseas, vómitos y escasa fiebre. La
enfermedad usualmente se autolimita en 3 a 5 días, pero puede durar más de una semana.
En Guatemala, la etiología de los mismos varía entre regiones, sin embargo, los principales agentes
de diarrea bacteriana son E. coli enterotoxigénica causante del 17.9% de los episodios en el área
rural, mientras que EPEC causa el 5.8% de los casos. Sin embargo, EPEC se asocia con el 17.8%
de casos de diarrea persistente, cifra que la coloca como la principal causa de diarrea de más de
catorce días de duración en nuestro medio. La EPEC se asocia con casos de diarrea persistente,
cuyos efectos sobre el estado nutricional y eventualmente sobre la vida del paciente, son
indeseables (INCAP, datos no publicados, Cruz JR, 1986, 1992). El panorama infeccioso no ha
cambiado en ciertas regiones del país desde los años 70, cuando se reportaban que por cada 100,000
niños de 1-4 años, 500 morían por diarrea mientras que en los Estados Unidos esa cifra es menor a
tres ( Behar, M 1970).
En 1962, Pierce y colaboradores reportaron que el 13 % de niños de edad preescolar con diarrea y
el 6% sin diarrea, presentaba Shigella spp y aducían la necesidad de evaluar el rol de bacteria como
causa de diarrea en Guatemala. En 1965, Leonardo Mata y colaboradores reportaron una epidemia
de más de 1200 casos en niños de edad preescolar que se observó a lo largo de 25 meses y dentro de
los cuales sobresalieron 30 casos de Shigella dysenteriae A1 (bacilo de Shiga) en niños del área
rural de Guatemala, de los cuales hubo un fallecido. Solamente 3.5% de los casos se asociaron con
Escherichia coli enteropatógena (EPEC) y en el 82.5% de los casos no se aisló ningún patógeno
bacteriano.
Mata L. (1978) estudió una cohorte de niños de Santa María Cauqué desde el nacimiento hasta los
siete años de edad. Concluyó que la infección es uno de los factores primordiales asociados con la
reducida ingesta de calorías y proteínas durante el período crítico de aparición de la malnutrición y
mortalidad en la niñez. Mata concluye que previniendo la infección y en particular la diarrea se
puede mejorar significativamente la ingesta alimenticia, la nutrición y el crecimiento de la niñez
guatemalteca. En esta cohorte de 45 niños se estudió la historia natural de infección por Giardia
lamblia durante los primeros tres años de vida. Todos los niños tuvieron por lo menos una
infección por Giardia, cuya prevalencia alcanzó el 20.2% y la incidencia fue de 5.3%, para finales
del 3er. año de vida. El número promedio de infecciones por G. lamblia por niño incrementó del
0.7 en el primer año a 3.6 en el tercer año. Más del 40% de estas infecciones duró entre 2 y seis
semanas o más y se asociaron con diarrea acuosa. La velocidad de ganancia de peso fue
significativamente menor en niños con Giardia que en niños libres de este patógeno (p=0.03). La
duración de los episodios de Giardiasis y su asociación con diarrea fueron dos de los factores
asociados con alteración del crecimiento, sugiriendo que la infección por Giardia puede tener
efectos deletéreos independientes en el crecimiento. Algo similar observó J. R. Cruz con EPEC en
Santa María de Jesús en los años 1986-88 (datos no publicados, INCAP).
Delgado y col, reportaron en 1983 los resultados de un estudio conducido por INCAP entre 7,000
niños indígenas preescolares, en Patulul. Los mismos apoyan la hipótesis que las consecuencias
negativas de la diarrea son más significativas entre niños malnutridos y demuestran el efecto
positivo de un programa simplificado de salud sobre el estado nutricional de niños con desórdenes
gastrointestinales.
Cruz y colaboradores reportaron en 1989 que estudiaron 1280 muestras fecales recolectadas de
casos de diarrea y controles sin diarrea durante dos años en la Colonia el Limón, un área marginal
urbana de la ciudad de Guatemala. El 8.3% de los casos de diarrea se asociaron con
Cryptosporidium parvum, mientras que el mismo sólo se observó en 0.6% de los controles sin
FODECYT 039-2006 35
diarrea. La mayoría de infecciones se observó durante los meses de febrero a mayo, al final de la
estación seca. Los autores reportaron que la presencia de animales domésticos (perros, gatos o
pollos) y la ausencia de instalaciones sanitarias como un inodoro en la casa, fueron factores de
riesgo importantes para la infección con C. parvum, así como estado nutricional deficiente. Este
estudio fue conducido entre 130 infantes de la colonia El Limón, un área marginal de la ciudad de
Guatemala. Los niños se visitaron semanalmente en el hogar por tres a nueve meses. Los episodios
de diarrea fueron detectados y se realizaron análisis microbianos en muestras fecales. Los niños
fueron pesados y medidos para determinar su estado nutricional. Se encontró que en promedio los
niños sufrieron 5.2 episodios de diarrea por niño por año, 9.4% de los episodios duraron por lo
menos dos semanas. Los niños que eran menores de 6 meses tuvieron más episodios de diarrea
persistente que los niños mayores, con episodios previos de diarrea y el número de
enteropatógenos, así como el antecedente de un episodio de diarrea persistente como factores de
riesgo importantes. E. coli enteroadherente, C. parvum, E. coli enterotoxigénica y Campylobacter
jejuni fueron los patógenos asociados con diarrea persistente. Los autores concluyen que la diarrea
persistente interfiere con la ganancia de peso y el crecimiento de los niños, por lo que tiene un
efecto deletéreo sobre el estado nutricional.
Cruz JR y col reportaron en 1990 un estudio de diarrea en 194 niños del área rural de Guatemala de
0 a 3 años de edad. Estudiaron 385 episodios de diarrea con un total de 485 muestras fecales y 191
muestras tomadas de niños sin diarrea. Cincuenta y siete niños que fueron hospitalizados por
diarrea durante este período, también fueron estudiados. El 14% de los niños con diarrea
excretaron Adenovirus tipos 40 y 41 y el 4.7%, rotavirus, infecciones dobles por estos dos virus se
observaron en ocho niños. Solamente 9 infecciones asintomáticas se observaron con Adenovirus
40,41 y dos con rotavirus. Adenovirus 40,41 y rotavirus son causas importantes de gastroenteritis
ambulatoria en niños con diarrea severa que ameritó hospitalización.
Cruz y colaboradores reportaron en 1992 resultados del monitoreo de astrovirus en 321 niños
preescolares (0 a 3 años de edad) residentes en el altiplano central de Guatemala, en Santa María de
Jesús, conducido entre febrero de 1987 y febrero de 1989, periodo durante el cual fueron analizados
5000 muestras fecales, incluyendo 1805 correspondientes a 1369 episodios de diarrea, 830
recolectadas durante la semana convaleciente, así como 216 y 244 recolectadas dos y una semana
previas al episodio de diarrea. Especimenes de rutina fueron recolectados una vez al mes de cada
niño que estuvo libre de diarrea por tres semanas consecutivas. Un total de 124 niños (38.6%)
excretaron astrovirus durante el estudio, en 184 infecciones por Astrovirus, 2.4% de las cuales se
dieron en niños sin diarrea. La diarrea asociada con astrovirus tuvo una duración promedio de 5
días y se asocio con vómitos en 8.6% de los casos, con fiebre en 17.1% de los mismos y con
deshidratación en 5.7% de los casos observados, mientras que la inapetencia se observó en 34% de
los casos por Astrovirus y se asoció con pérdida de peso. Los autores concluyeron que la diarrea
por astrovirus contribuye a alta morbilidad en niños pequeños que viven en condiciones de pobreza.
Lemus, O. en su informe final de tesis de grado para QB, en marzo de 2007 reportó que la principal
causa bacteriana de diarrea severa en niños hospitalizados por diarrea severa en el Roosevelt y en el
IGSS de la zona 11, fue E. coli enterotoxigénica que se encontró en 26% de los casos, seguido de
rotavirus encontrado en 19% de los casos, de E. coli enteropatógena en el 15% de los casos y por
adenovirus en 11.4% de los casos. Cryptosporidium parvum fue asociado solamente con 5% de
morbilidad al igual que Cyclospora cayetanensis y Giardia lamblia con 3%. En este estudio no se
buscaron Astrovirus, pero se caracterizaron por primera vez los factores de colonización
encontrados en ETEC asociada con diarreas severas en este país, los cuales no fueron reportados
por Cruz y colaboradores en los estudios de diarrea persistente.
FODECYT 039-2006 36
Torres, O. y colaboradores en un estudio entre 770 niños de la misma comunidad rural donde Cruz
y colaboradores condujeron los estudios reportados en los últimos años de la década de los ochenta
y los primeros de los noventa, encontraron una tasa mucho menor de diarreas que las reportadas por
este grupo. Asimismo, los hallazgos de la década del 2000 indican que el principal patógeno
bacteriano fue ETEC encontrado en 18% de los casos de diarrea y C. jejuni encontrado en el 15%
de los mismos. E. coli enteropatógena (EPEC) y E. coli enteroagregativa (EAEC) no fueron
buscadas en este estudio. A diferencia de los reportes de Cruz et al., la tasa de infecciones
múltiples bajó significativamente así como la prevalencia de Giardia lamblia, C. parvum y C.
cayetanensis la cual no pasó del 3% respectivamente. Astrovirus no fue buscado, pero se
caracterizaron por primera vez los factores de colonización encontrados en ETEC del área rural de
Guatemala, los cuales no fueron reportados por Cruz y colaboradores en los estudios de diarrea
persistente.
El diagnóstico de las E. coli diarreogénicas es difícil. Se basa en el aislamiento de la bacteria en el
coprocultivo, criterios bioquímicos, identificación de serotipos/serogrupos y sobretodo la
identificación de factores de virulencia específicos de cada bacteria (ejm. toxinas, genes de
adherencia, de invasividad). Hoy en día, la identificación basada únicamente en la determinación de
los serotipos, no es del todo correcta, pues muchas de estas bacterias pueden intercambiar material
genético y con ello genes de virulencia que sí determinan su patogenicidad. Para el diagnóstico de
ETEC los laboratorios clínicos usan las placas de MacConkey-sorbitol y la determinación de las
toxinas Shiga usando pruebas comerciales como ELISA y aglutinación en latex. En los últimos
años se está empleando con mayor frecuencia métodos moleculares, como el PCR, para la
identificación de estos patógenos. La demostración de la producción de las toxina LT y STX de E.
coli se puede realizar por un modelo in vitro que permita observar el efecto citopático en cultivo de
células Vero (células de riñón de mono verde), CHO (células de ovario de hamster chino) o HeLa
(células de carcinoma cérvico-uterino) (2,55). Para ello se requiere sembrar la cepa pura aislada del
caso de diarrea en medio de Craig e incubar 24 h a 37ºC, posteriormente por filtración se separan
las bacterias del sobrenadante que contiene la toxina, y se adicionan 20ml del sobrenadante a
cultivos confluentes de células Vero. La toxina y las células se dejan en contacto hasta observar la
aparición de un efecto citotónico (células alargadas) en el caso de toxina LT o bien efecto
citotóxico (células redondas y muertas) debido a la toxina STX. La caracterización y clasificación
de cepas patógenas de E. coli se puede hacer con métodos de biología molecular, una de las
herramientas de diagnóstico más recientes, tal es el caso del uso de sondas para la hibridación en
fase sólida como es el “colony blot”. Las sondas son fragmentos pequeños de DNA que contienen
parte de los genes que codifican para algún factor de virulencia y pueden estar marcadas
radioactivamente con P o no radiactivamente con biotina o digoxigenina y se pueden usar en
ensayos sensibles y específicos para detectar cepas patógenas de interés clínico. Actualmente para
E. coli hay sondas específicas para la toxina termolábil (LT) y termoestable (ST) del grupo ETEC,
para la fimbria Bfp de EPEC, para el locus asociado con invasividad (ial) de EIEC y para la
enterohemolisina (hlyA) de EHEC, entre otros factores de patogenicidad característicos de las
bacterias. El colony blot es la transferencia del DNA de una colonia de bacterias a una fase sólida
que puede ser nylon, papel filtro o nitrocelulosa, para su posterior hibridación. Para esto las
colonias puras, previamente aisladas de pacientes con diarrea, se inoculan directamente en forma
ordenada sobre una placa de agar Luria y se incuban 4 h a 37 °C. Después de este tiempo se coloca
la membrana de nylon sobre la superficie de la placa con las colonias en crecimiento y se incuba
toda la noche. Las bacterias se rompen sobre la membrana y el DNA se desnaturaliza al colocar ésta
en una solución de hidróxido de sodio para posteriormente fijarle el DNA. La hibridación se realiza
con una sonda marcada con digoxigenina, la cual es un fragmento de un gene de virulencia
específico, y se pone de manifiesto empleando un anticuerpo antidigoxigenina conjugado a la
enzima fosfatasa alcalina, cuyo sustrato es el BCIP, y el NBT es el cromógeno que desarrolla un
color negro o café cuando se incuba la membrana a temperatura ambiente y en la oscuridad. Otro
FODECYT 039-2006 37
método es la reacción de polimerización en cadena (PCR), una hibridación en fase líquida, en
donde la hibridación se realiza entre el ADN blanco presente en la muestra y el iniciador, que es
una secuencia conocida de un fragmento específico de un gene involucrado en la patogenicidad de
cepas de E. coli. La muestra puede ser una cepa pura aislada de muestra clínica obtenida de un caso
aislado de diarrea o bien de brotes, de viajeros, de peregrinos o durante desastres naturales.
También puede ser materia fecal o alimentos implicados en brotes en los que se necesita confirmar
la presencia de E. coli.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés
(Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary
Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular,
partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o
molde.
La cepa se siembra por estría y se incuba durante 24 h; a continuación se resuspenden cinco
colonias de bacterias en 0.5 ml de agua y se somete a ebullición para desnaturalizar el DNA. De la
suspensión se toma una alícuota para el tubo donde se realiza la PCR. Los reactivos necesarios para
la PCR de cada muestra son adenina, timina, citocina, guanina, MgCl2, iniciadores y enzima Taq
polimerasa. La síntesis in vitro del fragmento de DNA o amplificación se efectúa mediante cambios
de temperatura en tres fases: una de desnaturalización, una de hibridación y fase de alargamiento,
cuyas condiciones serán diferentes en función del gene que se desea amplificar.
Al finalizar la amplificación se toman alícuotas y se someten a electroforesis en gel de agarosa para
observar la presencia del producto amplificado. En esta prueba se requiere una área destinada a la
preparación de las muestras para PCR y otra sólo para productos de PCR, ya que se debe evitar
posibles contaminaciones con otros productos de PCR que puedan interferir en el resultado de la
prueba y dar falsos positivos. En el InDRE desde 1993 se empezó la estandarización de métodos de
biología molecular como “colony blot” y PCR los cuales desde 1996 se emplean con fines
diagnósticos y como apoyo a la vigilancia epidemiológica, para la caracterización de E. coli
patógena aislada de casos de diarrea y cuyos resultados han sido presentados en diversas reuniones
científicas.
Optimización de la PCR
En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:
La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mínima cantidad de ADN para
obtener un gran número de copias, así que puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en
condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificación de ADN no
correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). La contaminación con
ADN extraños puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen espacialmente
distintas etapas, y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realización de una PCR
y la siguiente. Por ejemplo, en laboratorios de detección genética, se suele hacer una división para
la preparación de la muestra por un lado (donde se cierran los tubos) y otro donde se encuentra la
maquinaria para realizar la PCR. Disponen también de cabinas de seguridad biológica para reducir
vapores cargados de amplicones de enfermedades, y la lejía, las lámparas de UV y psoralenos son
también muy recurridos para esta limpieza extensiva. Las técnicas de diseño de cebadores son
importantes en la mejora de la obtención de productos de PCR y en evitar la formación de
productos falsos. Algunas consideraciones al diseñar estos cebadores son: cada cebador debe
integrar entre 18 y 24 bases. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy
FODECYT 039-2006 38
específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción. La
proporción entre bases púricas y pirimidínicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y
terminen con 1 ó 2 bases púricas. Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean
complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos. Existe una gran variedad de
polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que más se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo,
algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente, o funcionan
en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Los
componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas. El
termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para
ello, diversas casas comerciales nos ofrecerán termocicladores elaborados con materiales que hagan
más eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, además de diversas facilidades de manejo.
Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicación será clave.
Tipos de PCR
PCR anidada: técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado
como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la
primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy específica.
PCR in situ: la PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células,
donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera
amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con
sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta
tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de
secuencias de menor representación.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): es una variante de la PCR en la que usamos ARN como
molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la
síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una
RT-PCR sería: 1er paso: retrotranscripción a partir del ARN. 2do paso: amplificación a partir de la
primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estándar
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR): reacción de PCR cuya principal característica es
que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para
identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura
de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting temperature). Se puede dividir en las
técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas. En
las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se
une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el
termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción
pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. Es mucho más económica
que la que usa sondas específicas. Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda
unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el
inverso (reverse); cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de
fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los
dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa.
Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación
del gen. La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR
realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza
FODECYT 039-2006 39
la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR
convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al final de un número
predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando
fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso
se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y
que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La
mayoría pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es
decir, permiten programar las condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no queda
limitado a unos reactivos determinados.
PCR múltiplex: PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea
dos o más pares de cebadores en único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples
segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción todos pares de cebadores de los
sistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la
reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una
sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida
construcción de base de dato.
Variaciones de la PCR básica
PCR específica de alelo: esta técnica de diagnóstico o clonación es usada para identificar o utilizar
los polimorfismos de una sola base (SNPs).
PCR "assembly": consiste en la síntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para ello
la PCR en un fondo de oligonucleótidos largos con secuencias solapantes cortas.
PCR asimétrica: es usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con
respecto a la otra.
PCR de colonia: mediante esta técnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser
rápidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN.
Amplificación dependiente de helicasa: esta técnica es muy parecida a la PCR convencional, pero
en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN
y los ciclos repetidos de desnaturalización-extensión.
PCR hot-start: esta técnica reduce la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales de la
PCR.
PCR específica de intersecuencia (ISSR): se trata de un método de PCR para su uso en huella
genética, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella
genética única de longitudes de fragmento amplificadas.
PCR inversa: es un método usado para poder realizar la PCR cuando sólo es conocida una
secuencia interna. Muy útil en la identificación de secuencias que flanquean insertos genómicos.
PCR mediada por ligación: este método usa pequeños linkers de ADN ligados al ADN de interés y
múltiples cebadores hibridando estos linkers.
PCR específica de metilación (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN
genómico.
FODECYT 039-2006 40
Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con un único par de cebadores, evitando
así las limitaciones de resolución de la PCR multiplex.
PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR (preferentemente en tiempo
real).
PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimétrico es usada para aislar una secuencia
desconocida que flanquea una secuencia conocida.
PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la
secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede
existir alguna base desapareada en el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el
fondo no específico bajando gradualmente la temperatura de hibridación a lo largo del progreso de
la PCR.
PAN-AC: este método usa condiciones isotermas para la amplificación, y puede ser usado en
células vivas.
En el presente proyecto se formularon primers específicos, basados en las secuencias publicadas
sobre los genes de interés (18-19) que permitieron combinar los ensayos independientes en un solo
PCR multiplex, el cual se va a aprobar con cepas previamente diagnosticadas por los métodos
estándar y almacenados como cultivos stock. Al diseñar primers para PCR hay que evaluar al
menos seis aspectos para tener la secuencia óptima.
Largo del oligonucleótido: debe ser entre 18 y 24 bases. Los primers más largos (30-35
bp) pueden ser mejores para métodos multiplex.
Tm: Es deseable que los dos primers tengan una temperatura de disociación (meelting
Temperature) cercana, no separada por más de 5° C. Si la diferencia en Tms de los primers
es alta, la Tm inferior puede incrementarse si se aumenta el largo del primer en el término
3´ (eso también puede contribuir a mantener el tamaño del locus amplificado, constante.)
Contenido de purinas: pirimidinas: Debe ser alrededor 1:1 (talvez 40-60%)
Secuencia de pares GC: Idealmente la secuencia del primer debe empezar y terminar con
1-2 pares de GC.
No interacciones primer-primer: Para este propósito, un programa de muy útil y gratuito
es el ¨OligoCalc¨ que se encuentra en el siguiente dirección de Internet
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html. Este programa calcula las
propiedades del primer tales como longitud, Tm °C, % de GC, y chequear para auto-
hibridación, para las secuencias ingresadas y por lo tanto, ayuda a diseñar programas de
PCR exitosos.
Las secuencias del primer deben alinearse con todas las secuencias de ADN ingresadas en
las bases de datos (usando programas Blast) y chequear para similitudes con secuencias
repetitivas o con otros loci, en distintos sitios del genoma. Si dos loci son muy similares
(por ejemplo a través de especies) es útil diseñar primers que por lo menos en 1-2 bases en
el extremo 3´ son específicas para el locus a amplificar.
FODECYT 039-2006 41
Las condiciones de ciclos y concentraciones de buffer deben ajustarse para cada primer de
forma que la amplificación de los locus sea específica, sin productos secundarios y dé una
banda fuerte de forma reproducible. Si esto no es posible, la secuencia de los primers debe
alargarse 4-5 bases o simplemente cambiarse por completo.
Un PCR multiplex óptimo se alcanza paso a paso. El primer paso es correr todos los pares de
primers mezclados en concentraciones equimorales en forma independiente bajo las mismas
condiciones de amplificación, o reduciendo la temperatura de anidado en 4° C si no se observan
buenas bandas. En el caso de que se obtengan bandas muy débiles para algunos pares, deben
ajustarse las concentraciones de los primers usados. Los primers cuyas bandas son muy débiles o
no se ven deben incrementarse y los de los que sí se amplificaron deben reducirse. La proporción
que permita ver todas las bandas en las mismas condiciones de corrida de PCR es la que debe
estandarizarse. La visualización de las bandas se hace por medio de electroforesis con su
subyacente revelado. Si las bandas de bajo peso molecular se ven débiles, se deben variar las
condiciones del buffer de corrida, poniendo particular atención a la concentración de KCl de 1X
1.2-2x, pero manteniendo la concentración de MgC12 entre 1.5 y 2mM. Se puede probar
reduciendo el tiempo de desnaturalización, así como el tiempo de anidado y la temperatura de
anidado. Se puede probar reduciendo la temperatura y tiempo de extensión. Incrementar la
concentración de primers de la banda débil y reducir las concentraciones de los primers cuyas
bandas son fuertes. Se pueden usar adyuvantes como BSA (0.1 a 0.8 µg/µL) ó DMSO al 5% en
concentración final v/v. Una o varias de estas sugerencias pueden usarse solas o en combinación,
hasta obtener bandas visibles de forma reproducible. Cuando una banda de peso molecular alto del
PCR multiplex es la débil, entonces debe reducirse la concentración de KCl en el buffer hasta 0.7 –
0.8 x manteniendo el cloruro de magnesio entre 1.5 y 2 mM o incrementar la concentración de
cloruro de magnesio hasta 3 ó 4.5 mM pero mantener la concentración de dinucleótidos constante.
Probar incrementando el tiempo de desnaturalización, reducir la temperatura de anidado,
incrementar el tiempo de extensión y la temperatura de extensión. Incrementar los primers de la
banda débil y reducir los de las otras bandas. Probar usando adyuvantes como se indicó en el caso
anterior. Si todas las bandas del multiplex son débiles, debe reducirse la temperatura de anidado en
pequeños pasos (2°C cada vez), reducir la temperatura de extensión a 62-68° C. Incrementar el
tiempo de extensión, incrementar la concentración de ADN blanco, incrementar la concentración
total de primers o ajustar la concentración de enzima polimerasa Taq.
Otro potencial problema de los PCRs multiplex es la presencia de bandas inespecíficas. Cuando se
tiene este problema, se deben usar condiciones más exigentes en la reacción: gradualmente
incrementar la T de anidado, reducir la cantidad de ADN blanco, reducir la cantidad de primers,
reducir la cantidad de enzima, ajustar los buffers dependiendo de si la banda inespecífica es grande:
incrementando levemente el KCl pero manteniendo el cloruro de magnesio constante, o si la banda
inespecífica es pequeña: reducir la concentración de KCl manteniendo la concentración de cloruro
de magnesio constante. También se puede incrementar la concentración de cloruro de magnesio
hasta una concentración final de 3-4.5 mM, manteniendo los dNTPs constantes. Si se prueba todo
esto y no se logra superar el problema de inespecificidad durante la amplificación, debe volverse a
correr las reacciones individualmente por pares de primers, usando una temperatura de anidado
menor que la usual. Comparar los productos inespecíficos para cada locus con los productos
inespecíficos observados en el multiplex. Con este enfoque puede lograr averiguar cuál par de
primers está involucrado en las bandas inespecíficas. Debe hacerse notar que los primers
seleccionados para el PCR multiplex desarrollado, no presentan interacciones primer-primer (las
cuales generalmente se manifiestan como ausencia de un producto más que por la aparición de
bandas inespecíficas).
FODECYT 039-2006 42
Para la visualización de bandas (productos amplificados del material genético o ADN) se utiliza la
electroforesis en gel. La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efectúa en
geles de agarosa. La agarosa es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de
las algas de los géneros Gellidium y Gracillaria. Es soluble en agua a temperaturas superiores a los
65 °C, dependiendo del grado de sustituciones hidroxietílicas de sus cadenas laterales. Sustituciones
las cuales, se pueden modificar para provocar que la temperatura de gelificación varíe entre los 17 y
los 40 °C. La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no tóxica que supone
una herramienta indispensable en gran cantidad de técnicas de biología molecular, bioquímica y
biología celular.
La electroforésis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución. La
electroforesis en agarosa permite separar moléculas de DNA, cuando éstas son sometidas a un
campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta
que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la fuerza eléctrica atrae en DNA hacia el
electrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza
de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la
partícula. El DNA está compuesto por cuatro nucleótidos que tienen carga negativa y peso
molecular similar. Por lo tanto, la aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es igual para
cualquier molécula de ácido nucleico. La diferencia en velocidad de migración estará dada por
diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea por la forma y tamaño de la molécula de DNA. En el
caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier molécula, entonces las distintas
moléculas tendrán una velocidad que sólo dependerá de su tamaño, es decir, de su longitud en pares
de bases. Para lograr una separación eficiente se utiliza un medio soporte que aumenta la fricción
recibida por las macromoléculas y reduce la difusión al mínimo. Este medio un polímero orgánico,
conocida como gel, por su consistencia gelatinosa. Las mezclas de DNA de diferentes tamaños se
hacen migrar a través del gel durante cierto tiempo y se obtiene una separación en el que la
distancia migrada por una molécula es inversamente proporcional a su longitud en pares de bases
(tamaño).
El diagnóstico diferencial de Escherichia coli diarreogénica se restringe a laboratorios de
investigación o de referencia. En la década de los 80s, los ensayos de referencia eran bioensayos
como el del ratón lactante para E. coli productora de toxina estable (Gianella, 1976), el ensayo de
las células Y-1 para E. coli productora de toxina lábil (Donta, 1974), y requerían la expresión de las
toxinas, mientras que para E. coli enteropatógena se dependía de laboriosas pruebas de serología
que requieren una extensa colección de antisueros, (Ewing, WH 1986, Mathewson, J 1985,
Cravioto A. 1979) los cuales no se encuentran comercialmente disponibles, por lo que son de difícil
obtención y se restringen a laboratorios de referencia. Más aún, en la literatura moderna, se
cuestiona la clasificación fenotípica de la EPEC, proponiéndose un método alternativo, genético,
para identificarla (Nataro JP 1998). Durante la última década, se han desarrollado diversos
métodos moleculares que permiten la detección rápida, sensible y específica de genes estructurales
y de virulencia de diversos patógenos. Estos métodos ofrecen algunas ventajas sobre los métodos
clásicos, fenotípicos, cuyos resultados exigen la expresión genética, a veces altamente exigente en
términos de condiciones del ensayo. Los métodos genéticos obvian todo el paso de la expresión
fenotípica con lo que los ensayos se simplifican y estandarizan sobremanera. Otra ventaja de este
tipo de pruebas es que el equipo requerido sirve para múltiples propósitos, lo cual es una ventaja en
países pobres. Entre las desventajas de los métodos genéticos, particularmente los de amplificación
como el PCR, sobresale la susceptibilidad a contaminación cruzada, que exige técnica cuidadosa
para no acarrear moléculas amplificadas en los pasos anteriores. Se han publicado métodos basados
en la amplificación genética por PCR para detectar los genes de toxina estable (st), toxina lábil (lt)
FODECYT 039-2006 43
de la ETEC (Olsvik, 1993) y pilus formador de "bucles" de la EPEC (bfp) (Giron, J 1991;
Gunzburg 1995). Existen también métodos comerciales, dentro de ellos uno que detecta en heces el
ADN de ETEC (Stacy-Phipps, S 1995). Un PCR multiplex es aquél en el que se detectan varios
genes simultáneamente y por lo consiguiente, ahorra tiempo y recursos al dar varias respuestas en
una sola prueba. Se propuso un PCR multiplex para toxina lábil, toxina estable de ETEC, el pili
formador de bucles de EPEC, y el gen AggR de EAEC con lo que se detectaría directamente en una
muestra estos tres patógenos.
En el presente proyecto se usaron primers específicos, basados en las secuencias publicadas sobre
los genes de interés (18-19) que permitieron combinar los ensayos independientes en un solo PCR
multiplex, el cual se probó con cepas previamente diagnosticadas por los métodos estándar y
almacenadas como cultivos stock. Múltiples obstáculos se encontraron en la implementación del
método, como productos inespecíficos que para ser removidos requirieron una reducción en el
tiempo de annealing, incremento de la temperatura de annealing, reducción del tiempo de extensión
y reducción de temperatura de la extensión final a 68°, estandarizar la concentración de MgCl2 a 50
mM, estandarizar la concentración y preparación de alícuotas de primers. Todas las secuencias de
los primers fueron evaluadas en el programa oligo, para asegurarnos de que no tenían secuencias
repetitivas que resultaran en auto-annealing. El procesamiento del las master mixes se optimizó
reduciendo el tiempo al mínimo para evitar la formación de primer dimers. Aprendimos que la
solución de dNTP’s es muy sensible a ciclos de congelar y descongelar, por lo que las alícuotas se
prepararon de manera que sirvieran para una corrida de 20 muestras solamente.
El diagnóstico diferencial de las dos variedades de E. coli más importantes en la etiología de las
diarreas infantiles en Guatemala, E. coli enterotoxigénica (ETEC) y E. coli enteropatógena EPEC,
es especializado, como se indicó anteriormente y no se encuentra al alcance de los laboratorios de
servicio de nuestro país. Sin embargo, el diagnóstico preciso evita el uso inapropiado de
antimicrobianos con la consiguiente reducción de resistencia antimicrobiana en nuestro medio, pues
ambas son diarreas autolimitantes. Asimismo, permite describir la etiología y epidemiología de
diarreas en niños, lo cual permite hacer estudios de brotes e implementar medidas de intervención
para reducir la transmisión de estos patógenos, tan importantes causas de diarrea infantil de nuestro
país.
En Guatemala, la infraestructura necesaria para realizar las pruebas de referencia "estándares de
oro" para ETEC no se encuentra disponible en los laboratorios actuales, pues el de referencia de
microbiología del INCAP no está funcionando. Sin embargo, es necesario que se fortalezcan otras
instituciones, sobre todo las dedicadas a la formación de recursos humanos, para promover el
desarrollo de la capacidad diagnóstica y por ende de vigilancia epidemiológica, del país. El
proyecto tiene como sede el Laboratorio Diagnóstico Molecular, S. A, y contó con la valiosa
participación de la M. Sc. Patricia Saravia, profesora del Departamento de Bioquímica de la USAC,
por lo que las metodologías en él desarrolladas estarán disponibles para esa institución, cuando
termine el proyecto.
FODECYT 039-2006 44
PARTE III
III.1 RESULTADOS ALCANZADOS
Se desarrolló y probó ampliamente un método de PCR que permite la identificación y
diferenciación simultánea de E. coli enterotoxigénica productora de toxina estable humana, porcina y/o
lábil y de E. coli enteropatógena perteneciente a los serotipos que circulan más frecuentemente en
diarreas infantiles en Guatemala. Este método tiene una sensibilidad del 93% y una especificidad del
96% contra muestras positivas y negativas previamente diagnosticadas por la OMS para ETEC o por el
CDC. Asimismo, se pueden agregar los primers para EAEC y el gen es detectado.
Usando los primers descritos en la tabla 3 y las condiciones indicadas en la tabla 4 se
obtuvieron resultados reproducibles usando una extracción de ADN por ebullición de las colonias
resuspendidas en 500 uL de agua durante 20 minutos o bien extrayendo ADN directamente de las heces
fecales con método del filtro FTA para los factores de virulencia de ETEC, EPEC y EAEC. Las bandas
de las toxinas lábil, estable porcina y estable humana son diferenciables en un gel de agarosa al 2%,
teñido con bromuro de etidio y observado con luz ultravioleta en la obscuridad, como se puede observar
en las fotografías 1-7. Asimismo, las bandas del factor bpf y del factor eae son distinguibles en gel de
agarosa al 2% bajo las mismas condiciones que para ETEC. Finalmente, los factores de virulencia de
EAEC, aggr y eae son diferenciables, pero el eae se encuentra en común con las EPEC por lo que la
clasificación de EAEC se basa solamente en la amplificación de aggr. Lamentablemente, la colección
de cepas de E.coli enteroagregativa no se encontraba congelada y las colonias se perdieron, por lo que
solo se pudo realizar esta prueba en dos muestras conocidas, de un estudio recién conducido en LDM.
Se desarrolló y validó el uso de pooles para correr hasta cinco muestras con cinco cepas cada
una, simultáneamente, en ámbitos donde ETEC, EPEC y EAEC sean causantes de menos del 20% de
las diarreas agudas. Esta condición se cumplió en muestras recibidas de escolares, en las cuales se
probó esta metodología. La misma consiste en mezclar 100 uL de ADN extraído individualmente de
cada una de cinco colonias lactosa positiva de la misma muestra cultivada en agar MacConkey. De esta
forma, con un solo PCR se pueden evaluar cinco colonias de un mismo sujeto, lo que reduce el costo
del ensayo en un 80%. Cuando se obtiene un resultado positivo, se tienen que repetir las muestras que
dieron positivas en dos puntos convergentes de la tabla y así se determina cuál es la muestra positiva.
Esta metodología se usó desde los años de post-guerra (años 50) para evaluar la presencia de
anticuerpos contra sífilis en los soldados que retornaban a sus países, que eran miles. Aquí se innovó
retomando esta metodología para reducir los costos y hacer factible el estudio en muchas muestras a
bajo costo.
Se estandarizó el PCR en heces diarreicas directas con lo cual el método requiere solamente
cinco horas para dar un diagnóstico preciso. Para ello se usó el sistema de filtros FTA. En el mismo,
en una membrana cargada positivamente se agrega la muestra fecal, que tiene ADN cuya carga neta es
negativa y se adhiere muy fuertemente al papel. Luego se lava el filtro para eliminar impurezas y el
ADN que esta fuertemente unido al papel, permanece allí. Finalmente, un trocito del papel se introduce
en el tubo del PCR y se lleva a cabo la amplificación después de eluir el ADN del papel con reactivo de
elución. Esta estrategia permite la detección de toxinas de ETEC y factores de virulencia de EPEC y
EAEC en muestras diarreicas en un periodo de cuatro horas, pues se evita tener que incubar la muestra
y aislar los enteropatógenos. El costo se incrementa en el costo del kit de FTA prorrateado por
muestra.
FODECYT 039-2006 45
Este método se convierte en una herramienta para implementar, en el mediano plazo, la
vigilancia epidemiológica de ETEC, EPEC y EAEC en la población guatemalteca. Para que este
potencial sea implementado, se gestionarán fondos para un FACYT en el cual se transferirá la
metodología a los profesionales del LNS, del Hospital General, del Hospital Roosevelt de Guatemala,
del Hospital de Antigua y del LABOCLIP de la USAC y otras universidades del país.
La técnica molecular desarrollada es una alternativa viable simple y rápida y disponible en
Guatemala comparada con los métodos tradicionales de identificación de ETEC, EPEC y EAEC que no
se realizan por caros y complejos.
La metodología se usó para complementar análisis de EPEC a una colección de muestras
tomadas en el Hospital Roosevelt. Estos resultados forman parte de un manuscrito que se someterá a
publicación en el Journal of Clinical Microbiology y se puede encontrar entre los anexos.
Validación del Método: Para validar el método desarrollado, se usaron cepas conocidas previamente
identificadas por GM1 ELISA para toxina lábil y para toxina estable por la IP en el INCAP, con
asesoría del laboratorio de la Universidad de Goteborg, Suecia entre los años 2001 y 2004 (según el
procedimiento operativo estándar del Departamento de Medical Microbiology and Immunology,
University of Goteborg, SOP 16:3), las cuales fueron enviadas para confirmación a Goteborg y los
resultados confirmados como exactos en el 99% de los casos. Estas cepas se encuentran almacenadas
en caldo tripticasa soya con 20% de glicero congeladas a -70°C en el caso de las ETEC y liofililzadas a
-70°C en el caso de las EPEC. Para obtener células viables de los stocks, se inocularon en agar
nutritivo o agar sangre y luego se identificaron en agar MacConkey, con pruebas bioquímicas (IMVIC)
para confirmar la identidad de Escherichia coli (9, 20).
En este paso se utilizaron cincuenta cepas conocidas de ETEC y quince de EPEC, ya
previamente diagnosticadas. El personal encargado del cepario, que labora en el laboratorio
diagnostico molecular pero que no está a cargo de este proyecto se encargó de sacar las cepas y
entregarlas a las encargadas del proyecto codificadamente. De esta forma, esta parte del estudio fue
ciego para evitar cualquier sesgo de identificación por parte del personal encargado de realizar los
PCR's.
ANÁLIS IS ESTADÍST ICO DE LOS DATOS
Cálculo de Sensibilidad y Especificidad del Método PCR Multiplex FODECYT 39/2006:
Los resultados obtenidos con el PCR multiplex aquí desarrollado y que en adelante será denominado
PCR Multiplex ETEC/EPEC FODECYT 39/2006, fueron analizados en una tabla de 2x2 por Chi
cuadrado, para obtener la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivos y negativos
del método. Estos análisis fueron realizados por el M.Sc. Jorge Matute ad-honorem, otro aporte a
contrapartida no previsto inicialmente en el presupuesto del proyecto.
Sensibilidad para ETEC: 93% Sensibilidad EPEC: 89%
Especificidad para ETEC: 96% Especificidad EPEC: 94%
Valor Predictivo Positivo para ETEC: 90% Valor predictivo positivo EPEC: 88%
Valor Predictivo Negativo para ETEC: 91% Valor predictivo negativo EPEC: 93%
FODECYT 039-2006 46
Confirmación de Resultados: Para confirmar los resultados del PCR multiplex, se llevó a cabo una
hibridación de Southern de los productos de amplificación, con sondas de ADN marcadas con
digoxigenina, sintetizadas a partir de los genes sth, stp, lt, eae y bfp, por medio de PCR, según
recomendaciones del laboratorio productor (Boheringer-Mannheim). Para este proceso se utilizaron
reactivos donados por la Dra. Svennerholm, otro aporte de contrapartida no presupuestado inicialmente
(21 - 23). Los mismos demostraron bandas claramente positivas para ETEC sth, ETEC stp, ETEC lt y
también para EPEC bfp y eae.
A continuación se muestran las fotografías 1 a 7 de los PCR’s implementados y estandarizados, si bien
limitaciones de disponibilidad de muestras positivas nos limitaron poder validar los resultados para las
EAEC y EHEC, las mismas se corrieron con cepas estándar positivas. La fotografía 8 se muestra para
incluir las actividades de transferencia de tecnología realizadas a Honduras y Panamá a quienes se les
capacitó en esta técnica.
FODECYT 039-2006 47
FOTOGRAFIA 1: DESARROLLO DE PCR MULTIPLEX PARA LA
DETECCION DE ESCHERICHIA COLI DIARREOGENICAS: ETEC,
EAEC, EPEC Y EHEC
FUENTE: FODECYT 039-2006
En esa fotograf ía se muestra e l resultado del PCR mult iplex desarrollado en el
FODECYT 039-2006: los genes que detectan las E. coli’s diarreogénicas se pueden
observar. Detalle de la fotograf ía en los carriles 1 y 13 se observan las escaleras de
peso molecular. En los carriles 2 y 3 se observan el control n egat ivo del cuar to
blanco y el control negativo del cuar to de amplif icación. En el carri l 4 los genes l t
y stp para ETEC productora de toxina lábil y toxina es table porcina. En los carri les
5 y 6 el gen aggr para EAEC. En los carri les 7 y 8 se observan los genes
amplif icados bpf y eae caracter íst icos de la EPEC. En el carr il 9 los genes de
virulencia de EHEC fueron amplif icados: eae (que comparte con EPEC) y vt1 de 130
pb. Siguen las E. coli ATCC 25922 como controles negativo .
FODECYT 039-2006 48
FOTOGRAFIA 2: PCR MULTIPLEX CORRIDO SOLAMENTE
PARA LOS GENES QUE CODIFICAN LAS TOXINAS DE ETEC:
LT, STP Y STH
FUENTE: FODECYT 039-2006
En esta fotografía se muestran condiciones para estandarizar la cantidad de ADN a usar en el PCR
multiplex de ETEC: los carriles 1 y 12 muestran la Escalera de peso molecular. En los carriles 2, 3, 4 y
5 se usaron 4 uL de ADN control (el volumen seleccionado para futuros experimentos) de LT (274 pb),
STp (166 pb) y STh (64 pb). Los cuatro pozos siguientes son con 5 uL y los últimos 4 con 6 uL de
ADN en los cuales ya se observan inhibición por exceso de ADN.
FODECYT 039-2006 49
FOTOGRAFIA 3: PCR CORRIDO PARA FACTORES DE
VIRULENCIA DE EPEC: BFP Y EAE
FUENTE: FODECYT 039-2006
Pozos 1 y 12: Escalera de ADN Pozos 2, 5-10 muestran dos bandas que se ven juntas y representan
eae (376 pb) y bpf (367 pb) los dos determinantes genéticos que detectan la EPEC. El pozo 11 es el
control negativo
FODECYT 039-2006 50
FOTOGRAFIA 4: ESTANDARIZACIÓN DE PCR MULTIPLEX
PARA LA DETECCION SIMULTÁNEA DE TOXINAS DE ETEC Y
EPEC (LT, STP) Y FACTORES DE VIRULENCIA DE EPEC (BFP Y
EAE)
FUENTE: FODECYT 039-2006
En esta fotografía se observan los genes amplificados según condiciones estandarizadas para LT (274
pb), STp (166 pb), eae (376 pb), bpf (367 pb) un control negativo de cuarto negro), una mezcla de ADN
con EPEC y ETEC en el cual se observan las bandas de eae, bpf, LT y STp. Más controles negativos de
cepas ATCC.
FODECYT 039-2006 51
FOTOGRAFIA 5: PCR PARA AMPLIFICACION DE FACTORES DE
VIRULENCIA DE EAEC: AGGR
FUENTE: FODECYT 039-2006
En esta fotografía se observan los genes amplificados según condiciones estandarizadas para la
amplificación del factor de virulencia de la E. coli enteroagregativa: aggr el cual produce una banda
típica diagnóstica a 630 pb. En el carril uno se observa la escalera de peso molecular y en el 2 la cepa
control para EAEC, donada por el Dr. Stephen Savarino.
FODECYT 039-2006 52
FOTOGRAFIA 6: ESTANDARIZACION INDIVIDUAL DEL PCR
MULTIPLEX DE TOXINAS DE EHEC: VT1 Y VT2
FUENTE: FODECYT 039-2006
En esta fotografía se amplificó con fines de estandarización de condiciones para detección de los genes
de virulencia de EHEC, el gen VT2 (298 pb) y el gen VT1 (130 pb), usando como control la cepa de
Escherichia coli ATCC 35150, que se observa en el carril 3. En los carriles anteriores se observan
controles negativos de cuartos blanco y de amplificación.
FODECYT 039-2006 53
FOTOGRAFIA 7: ESTANDARIZACIÓN PCR MULTIPLEX DE
BAJO COSTO PARA TOXINAS DE ETEC EN POOLES DE CINCO
MUESTRAS
FUENTE: FODECYT 039-2006
En esta fotografía se demuestra la amplificación de toxinas de ETEC en muestras corridas en pooles de
diez colonias (5 de cada paciente) en escolares con una baja prevalencia de infección por ETEC. Se
muestran los controles para STp, LT, STh y los resultados positivos y negativos de varios pooles.
FODECYT 039-2006 54
FOTOGRAFIA 8: TRANSFERENCIA DE TECNOLOGIA A
PANAMA Y HONDURAS. PCR DE TOXINAS DE ETEC
FU
ENTE: FODECYT 039-2006
En esta fotografía se observa la estandarización de PCR para ETEC realizado por la colega hondureña,
Dra. Annabelle Ferrera (PhD) a quien se le transfirió la metodología. También se le transfirió a colegas
panameños de la AUPSA (Autoridad Panameña de Seguridad Alimentaria, a cargo de la Dra. Lurys
Burdett Stanziola, PhD).
FODECYT 039-2006 55
III.2 DISCUSION DE RESULTADOS
El proyecto exitosamente desarrolló y validó quedando implementado para su uso rutinario, un
método de PCR multiplex para la detección de los factores de virulencia de las E. coli’s mayormente
asociadas con diarrea en niños preescolares en Guatemala. El método tiene sólidas bases científicas y
sus resultados son comparables con los del laboratorio de referencia para ETEC de la OMS, así como
con los laboratorios líderes en el tema en el caso de EPEC y EAEC.
Una desventaja del método es que requiere de 16 primers mezclados. Esto requiere que se
trabaje pronto cuando se preparan las mezclas maestras para evitar la presencia de una banda gruesa de
dímeros de primers. Se verificó que los primers no tuvieran interacción entre sí usando el programa
oligocalc.
Cuando se trabajan pocas muestras y se pueden preparar las mezclas rápidamente, se observan
menos primer dimers que cuando se trabaja más despacio, como puede observarse en las fotos 1 (sin
primer dimers), comparada con la fotografía 4, que presenta muchos primers dimers.
El PCR multiplex detecta toxinas LT, STh y STp de ETEC más los factores de EPEC eae y bpf,
más la banda aggr de EAEC. La EAEC no pudo ser validada pues solamente se contó con dos cepas
positivas conocidas, corridas por el laboratorio del Dr. DuPont en la Universidad de Texas. La
amplificación de la E. coli enteroagregativa (EAEC) se hizo con cepas estándar provistas por el Dr.
Steven Savarino de la US Navi Research, quien gentilmente nos las envió para este propósito. Una de
las dos cepas da una banda a 630 Kb, claramente diferenciable. No obstante, al correr las muestras
conocidas identificadas como EAEC en Texas por Zhi Dong Tsiang en el laboratorio del Dr.DuPont se
encontró que una de ellas daba bandas inespecíficas. Se redujo el tiempo de annealing y se incrementó
la temperatura de annealing, reduciéndose el tiempo y la temperatura de extensión a 2 minutos a 68°C.
Con esto se redujeron las bandas inespecíficas pero ya no puede formar parte del multiplex, sino se
corre por separado.
Una limitante del método multiplex desarrollado en el presente proyecto para las tres E. coli´s
diarreogénicas era que la banda de la toxina LT daba un poco más débil cuando se amplifica
simultáneamente la eae de EPEC. No obstante, al incrementar la concentración de los primers para LT
este defecto se subsana, como se puede observar en las fotografías No. 3 y 4.
La obtención de primers en Guatemala por medio del CONCYT tiene sus particularidades, ya
que debido a que no se pueden hacer compras en el extranjero con tarjeta de crédito, nos hemos visto
obligados a requerir los primers a distribuidores locales. Ello resultó en errores, por ejemplo el par de
primers para EAEC vino incompleto, solamente una secuencia, lo cual nos atrasó mucho en el
desarrollo del método para EAEC. Recientemente Merck SA anunció que va a traer primers, lo cual
talvez facilita el proceso.
El PCR multiplex fue probado usando pooles de colonias de heces formadas en las cuales se
buscaba ETEC, que se puede observar en la foto No.7. Hasta diez colonias en un mismo tubo,
mezcladas después de ser hervidas independientemente, dieron resultados satisfactorios al probar con
controles positivos y negativos conocidos. Esto es más barato y facilita la aplicación del método para
estudios epidemiológicos. Este método fue validado con un estudio del Dr. Schneider en escolares.
FODECYT 039-2006 56
El método fue exitosamente aplicado a muestras fecales diarreicas, de las cuales se extrajo
ADN usando el sistema de filtros FTA (una especie de kit). A pesar de que el proveedor se tardó casi
un año en traerlo, cuando se tuvo se pudo comprobar que se pueden detectar las E. coli´s diarreogénicas
en unas cuantas horas de trabajo, sin necesidad de cultivo. Esto tiene potencial clínico grande. Se
observa en la fotografía 3.
Asimismo, se dio servicio a la UVG para evaluar las E. coli´s preservadas en congelación de
dos niños que estando bajo vigilancia de uno de sus proyectos, fallecieron de diarrea. En ambos se
detectó ETEC por el método aquí desarrollado. Al grupo de investigadoras del CDC en la UVG se les
facilitó el mismo para que lo implementen a lo interno de su laboratorio.
Se dio capacitación en estos métodos a un grupo de profesionales Panameños que vinieron de
la Autoridad Panameña de Seguridad de Alimentos, AUPSA, quienes estuvieron en el laboratorio por
tres días quienes nos fueron referidos por la Dra. Lurys Burdett Stanziola, jefa de la Dirección de
Control y Análisis de Alimentos Importados. Asimismo, se capacitó a la Dra. Annabelle Ferrera,
profesora de microbiología molecular de la UNAH, en Tegucigalpa, Honduras, quien visitó el
laboratorio también por tres días.
FODECYT 039-2006 57
PARTE IV.
IV. 1 CONCLUSIONES
Objetivo Conclusión
Objetivo General
Desarrollar un PCR multiplex para la
detección y diferenciación simultánea de
ETEC, EPEC y EAEC los principales tipos
de E. coli productoras de diarrea en niños
guatemaltecos.
Se desarrolló un PCR multiplex que
efectivamente detecta y diferencia en forma
simultánea los factores de virulencia de ETEC
(toxinas LT, STp y STh), de EPEC (bpf y eae) y
de EAEC (aggr y eae) a partir de colonias
lactosa positiva aisladas en MacConkey y
hervidas por 20 minutos en 500uL de agua
desmineralizada estéril, en microtubos, o bien a
partir de heces diarreicas por medio del método
FTA (ref bibliográfica).
Objetivos Específicos
1. Diseñar un primer que reconozca una
región común en el extremo 5´ de los
genes st y lt en ETEC; eae y bpf en
EPEC y aggr en EAEC
respectivamente.
Debido a que se trató de hacer nuestro método
congruente con el recomendado por el
laboratorio de referencia de la OMS, este
enfoque ya no se utilizó un primer común, sino
primers separados para cada determinante
buscado, es decir se adaptaron 3 pares de
primers de que fuero desarrollados por el
laboratorio de la U de Goteborg/OMS y se
diseñaron e investigaron otros 3 pares de primers
para EPEC y EAEC. El apoyo brindado por la
Dra. Svennerholm nos permitió incluir en el
método un avance tecnológico del 2006, que
además representa el método del laboratorio de
referencia de OMS para ETEC y que funcionó
bien con los primers diseñados para EPEC y
EAEC.
2. Establecer las condiciones
metodológicas apropiadas que
permitan la detección y diferenciación
simultáneas de estos genes en E. coli´s
aisladas de heces diarreicas.
En este estudio fueron estandarizadas las
condiciones y reactivos publicados en el estudio
realizado en Vietnam por Trung Van Nuyen (57)
y dieron resultados reproducibles para las cepas
estándar de EPEC y EAEC, Se usaron tres pares
de primers recomendados por la Dra. Ann-Mari
Svennerholm, directora del laboratorio de
referencia de la OMS para ETEC, los cuales
están reportados en el estudio publicado por
FODECYT 039-2006 58
Ingrid Bolin (4).
Objetivo específico Conclusión
3. Validar el método con E. coli´s
previamente identificadas, en el estudio
prospectivo sobre diarrea persistente,
realizado en Santa María de Jesús,
disponibles en los ceparios del INCAP.
El método fue validado con cepas aisladas y
diagnosticadas de Santa María de Jesús,
disponibles en el Laboratorio Diagnóstico
Molecular, S.A. No obstante las cepas del
estudio de diarrea persistentes no estuvieron
disponibles.
4. Confirmar los resultados con hibridación
con sondas de ADN de los genes de
virulencia sth, stp, lt, eae, bfp y aggr
marcadas con digoxigenina y detectadas
colorimétricamente.
Los resultados fueron confirmados tanto por
sondas marcadas con digoxigenina (hibridación)
como por pruebas de ELISA con anticuerpos
monoclonales.
Objetivos adicionales alcanzados con
el presente proyecto
Conclusión
1ª. Evaluar el funcionamiento del PCR
multiplex para ETEC, EPEC y EAEC
con ADN extraído directamente de
heces diarreicas.
El método del filtro FTA permitió detectar en
dos horas la presencia de ETEC, EPEC o EAEC
a partir de heces diarreicas.
2ª. Implementar un sistema de pooles de
colonias para detectar ETEC en
muestras fecales donde se espera que la
prevalencia de infección por este
patógeno sea baja.
Se diseñó, probó e implementó el uso de pooles
de diez colonias (provienen de dos pacientes) en
un solo tubo para abaratar la detección de ETEC
en muestras de poblaciones con baja prevalencia
de infección por este enteropatógeno. Este
sistema reduce el precio del análisis a una quinta
parte del costo original, pues permite el análisis
simultáneo de diez colonias de E. coli.
FODECYT 039-2006 59
IV.2 RECOMENDACIONES
1. Se debe obtener una colección de cepas conocidas EAEC + y EAEC – para poder validar el
método para detección de la E. coli enteroagregativa.
2. Se recomienda afinar y validar el método usando “Pooles” de heces directas el cual sería de
suma utilidad para el sector público de laboratorios diagnósticos del país.
3. La logística de adquisición de reactivos de biología molecular siguiendo las normas y pautas de
las leyes de compras estatales es muy difícil de seguir. Cuando se ejecutó el proyecto, Merck
no distribuía este tipo de reactivos y las casas comerciales hacían un esfuerzo por suplir
nuestras necesidades pero muchas veces tuvimos que recurrir a obtener los reactivos en el
extranjero, como una contrapartida del laboratorio para poder avanzar. El CONCYT, debe
promover los mecanismos más ágiles para la compra de reactivos, como los utilizados en este
proyecto para favorecer el desarrollo de la Biología Molecular en el diagnóstico de ciertos
patógenos para laboratorios de referencia acreditados en el país.
FODECYT 039-2006 60
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Baudri, B, SJ Savarino, P. Vial, B. Kaper, and M. M. Levine. (1990). A sensitive and
specific DNA probe to identify enteroaggregative Escherichia coli, a recently
discovered diarrrheal pathogen. J. Infect. Dis. 161: 1249-1251.
2. Behar, M. (1970). Gastroenterología y nutrición. Bol Asoc Med Puerto Rico; 62: 260-268.
3. Boheringer Mannheim Biochemicals, 1992. The Genius System techniques for Membrane
hybridization 30 pp.
4. Bolin, I. Wiklund G. Qadri, F. Torres, O, Bourgeois, AL, Savarino, S., Svenerholm, AM. (2006) Enterotoxigenic Escherichia coli with STh and STp genotypes is associated with
diarrhea both in children in areas of endemicity and in travelers. : J Clin Microbiol.;
44(11):3872-7.
5. Burgeois, A. L. et al. (2005) Protective efficacy of an oral killed vaccine (OKV) for
enterotoxigenic E. coli (ETEC) in adult travelers to Guatemala and Mexico. 45th Annual
Meeting of the Intescience Coference on Atimicrobial Agents and Chemotherapy, 16-19
December 2005, Washington, D.C.
6. Cravioto A. R. J. Gross, S. M. Scottland & B. Rowe. (1979). An adhesive factor found in
strains of Escherichia coli belonging to the traditional infantile enteropathogenic
serotypes. Curr Microbiol. 3: 95-99.
7. Cruz JR, Pareja G, Cáceres P, Cano F, Chew F. (1989) Diarrea aguda y persistente y sus
consecuencias nutricionales en infantes Guatemaltecos. Arch Latinoam Nutr. Sep;
39(3):263-77.
8. Cruz, JR, Cáceres, P, Cano F, Flores, J, Bartlett A, Torún B. (1990). Adenovirus types 40
and 41 and rotavirus associated with diarrhea in children from Guatemala. J Clin
Microbiol. Vol 28:8: 1780-84.
9. Cruz, J. R., A. V. Bartlett, H. Méndez, and R. Sibrián. (1992). Epidemiology of Persistent
Diarrhea among Guatemalan rural Children. Acta Pediatrica Suppl 381: 22-26.
10. Cruz, J. R., F. Cano, P. Cáceres, F. Chew y A. de Fernández. (1986). Etiología de diarreas
en áreas periurbanas de Guatemala. Memorias del III Congreso Nacional de
Microbiología.
11. Chapin, AR, Carpenter CM, Dudley WC, Gibson LC, Pratdesaba R, Torres, O, et al.
(2005). Prevalence of Norovirus among Visitors from the United States to Mexico and
Guatemala Who Experience Traveler’s Diarrhea. J Clin Microb 43 (3): 1112–1117 .
12. Delgado, HL, Valverde V, Belizan JM, & Klein, RE. (1983). Diarrheal Diseases,
nutritional status and health care: analysis of their interrelationships. Ecol Food Nutr.
12: 229-34.
FODECYT 039-2006 61
13. Donta, S. T., H. W. Moon, and S. C. Whipp. (1974). Detection for heat-labile Escherichia
coli enterotoxin with the use of adrenal cells in tissue culture. Science. 183: 334-336.
14. Ewing, W. H. (1986). Edwards & Ewing's Identification of enterobacteriacea. Fourth
Edition. 124-127.
15. Frazer, C & Orlandi, P. (2007). Evaluation of Two DNA Template Preparation Methods for
the Post-Immunomagnetic Separation Detection of Cryptosporidium parvum in Foods
and Beverages by PCR. Appl Environ Microbiol. 73 (22): 7474–76
16. Frech S. A., DuPont HL, Bourgeois AL, McKenzie R, Asturias EJ, Halpern, J, Torres,
O, et al. (2008). Use of a patch containing heat-labile toxin from Escherichia coli
against travellers’ diarrhoea: a phase II, randomised, double-blind, placebo-controlled
field trial. Lancet 371: 2019–25
17. Gianella, R. A. (1976). Suckling mouse model for detection of heat-stable
Escherichia coli enterotoxin: characteristics of the model. Infect. Immun. 33: 186-192.
18. Giron, J. A., M. S. Donnenberg, W. C. Martin, K. G. Jarvis, and J. B. Kaper.
(1993). Distribution of the bundle-forming pilus structural gene (bfpa) among
enteropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 168: 1037-1041.
19. Giron, J. A., A.S. Y. Ho, and G. K. Schoolnik. (1991). An inducible bundle
forming pilus of enteropathogenic Escherichia coli. Science. 254: 710-713.
20. González, W.; Hernández R., Bourgeois, L., Pratdesaba R. & Torres O. 2001.
Determination of optimal isolation methods and antimicrobial susceptibility patterns
among Guatemalan strains of Campylobacter jejuni. 11th. International J on Medical
Microbiology. Int J Med Microbiol.; 291 Suppl 31:1-168
21. Guatemala. (2005). Encuesta Nacional de Salud Materno-Infantil (ENSMI).
22. Guarino, A., M. Cohen, M. Thompson, K. Dharmsathaphorn, & R. Giannella. (1987).
T84 cell receptor binding and guanyl cyclase activation by Escherichia coli heat-stable
toxin. Am. J. Physiol. 253:G775–G780.
23. Gunzburg, S.T., N. G. Tornieporth, and L. W. Riley. (1995). Identification of
Enteropathogenic Escherichia coli by PCR-based detection of the bundle forming pilus
gene. J Clin Microbiol 33: 1375-1377.
24. Harris, E. (1998). A low cost approach to PCR: appropriate transfer of biomolecular
techniques. Ed: N. Kadir. Oxford University Press. N. Y.
24. Huang, DB, Mohanty, A., DuPont, HL, Okhuysen, PC, Chiang, T. (2006). A review of
an emerging enteric pathogene: Enteroaggregative E. coli. J Med Microbiol; 55:
1303-1311.
25. Kibbe, W. A. 2007. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucl Acids
Res. 35 (Web server Issue): W71-W74. Consultado en multiples ocasiones en:
www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
FODECYT 039-2006 62
26. Katz, D., Kumar, S., Malecki, J., Lowdermilk, M. Koumans E. H. A. & Hopkins R.
(1999). Cyclosporiasis associated with imported raspberries, Florida, 1996. Public
health reports 114, no5, pp. 427-438
27. Lemus, Omar. ( 2006). Etiología de diarreas en niños preescolares admitidos al Hospital
Roosevelt o al IGSS para rehidratación. Tesis de Químico Biólogo, USAC.
28. Lopez-Vidal Y, Klemm P & Svennerholm AM. (1988). Monoclonal antibodies against
different epitopes on colonization factor antigen I of enterotoxin-producing Escherichia
coli. J Clin Microbiol. 26(10):1967-72
29. Martorell, R., A. Lechtig, C. Yarbrough, H. Delgado & R. Klein. (1977). Efecto de las
diarreas sobre el retardo en crecimiento físico de niños guatemaltecos. Archiv
Latinoam Nutr 27: 311-324.
30. Mata, L. (1992). Diarrheal diseases as a cause of malnutrition. Am J Trop Med Hyg. 47:
16-27.
31. Mata, L. J. (1978) The children of Santa Maria Cauque: a prospective field study of health
and growth. Cambridge, Mass.,M.I.T. Press, 1978.
32. Mata, L; García B., Méndez H., Santizo MC & Torres, O. (2001). Censo de SMC,
Reporte interno. Publicación INCAP.
33. Mathewson, J. et al. (1985). A newly recognized cause of travelers' diarrhea: enteroadherent
E. coli. J. Infect. Dis. 151: 471-475.
34. Moseley, S. L., J. W. Hardy, M. I. Huq, P. Echeverría & S. Falkow. (1983). Isolation
and nucleotide sequence determination of a gene encoding a heat stable enterotoxin of
Escherichia coli. Infect Immun. 39: 1167-1174.
35. Mullis, Dr. K. B. La Jolla, California, U.S.A., Nobel Prize winner for his invention of the
polymerase chain reaction (PCR) method, 1993. Consultado 20 de nov de 2007.
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/press.html
35a. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, & Pfaller, MA. (2007). Manual of
clinical Microbiology. 9th. Edition, ASM Press. Washington, D. C. Volumes I & II.
2256 pp.
36. Nataro, JP, Bopp, C, Fields, P, Kaper, J, & Strockbine, N. Escherichia, Shigella and
Salmonella. Chapter 43: 670-679. IN: Murray, P. R., J Baron, Jorgensen, JH,
Landry, ML & Pfaller M. A. (2007). Manual of Clinical Microbiology, Vols I and II.
9th Ed. ASM Press. Washington, D. C.
37. Nataro, J. P. & J. B. Kaper. (1998). Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev.
11: 142-201.
38. Nataro, J. P. (2005). Enteroaggregative E. coli pathogenesis. Current opinion
grastroenterol 21: 4-8;
FODECYT 039-2006 63
39. Nishibuchi, M. et al. (1989). Detection with synthetic oligonucleotide probes of nucleotide
sequence variations in the genes encoding enterotoxins of Escherichia coli. J. Clin.
Microbiol. 27:2272–2276.
40. Olsvik, O. & N. Strockbine. (1993). PCR detection of heat-stable, heat-labile, and Shiga
like toxin genes in Escherichia coli. In: Persing, D.H., Smith, F., Tenover, F. and
White, T. Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications. ASM,
Washington, D. C. 271-276.
41. Rao, M. C. (1985). Toxins which activate guanylate cyclase: heat-stable enterotoxins.
Ciba Found. Symp. 112:74–93
42. Sack DA, Shimko J, Torres O, , Bourgeois A, Francia DS, Gustafsson B, Kärnell A,
Nyquist I and Svennerholm A-M. (2007). Randomised, double-blind, safety and
efficacy of a killed oral vaccine for Enterotoxigenic E. coli diarrhea of travelers to
Guatemala and Mexico. Vaccine: 25: 4392-4400
43. Sack, RB (1980). Enterotoxigenic Escherichia coli: identification and characterization. J.
Infect. Dis. 142:279–286.
44. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A laboratory
Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor.
45. Sarantuya J, et al. (2004). Typical enteroaggregarive Escherichia coli is the most prevalent
pathogype among E. coli strains causing diarrhea among Mongolian children. J Clin
Microbiol. 42:133-139.
46. Sjoling A. Wiklund G, Savarino SJ, Cohen DI, Svennerholm AM. (2007). Comprative
analyses of phenotypic and genotypic methods for detection of enterotoxigenic
Escherichia coli (ETEC) toxins and colonisation factors. J Clin Microbiol: 45(10):
3295-301.
47. Steinsland, H., P. Valentiner-Branth, H. M. Grewal, W. Gaastra, K. K. Molbak, & H.
Sommerfelt. (2003). Development and evaluation of genotypic assays for the detection
and characterization of enterotoxigenic Escherichiacoli. Diagn. Microbiol. Infect. Dis.
45:97–105.
48. Steinsland, H et al. (2002). Enterotoxigenic Escherichia coli infections and diarrhea in a
cohort of young children in Guinea-Bissau. J Infect. Dis. 186:1740–1747.
49. Svennerholm, A. M., and G. Wiklund. (1983). Rapid GM1-enzyme-linked immunosorbent
assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin.
J. Clin. Microbiol. 17:596-600.
50. Stacy-Phipps, S., Mecca, J. J., and J. B. Weiss. (1995). Multiplex PCR assay and simple
preparation method for stool specimens detect enterotoxigenic Escherichia coli DNA
during course of infection. J Clin Microbiol 33: 1054-59.
51. Svennerholm, A-M, Bourgeois, A. L. & Torres, O. 2005. Comparison of virulence
markers in ETEC isolated in children and in visitors to Guatemala from 2001-2005.
Final Report for WHO project.
FODECYT 039-2006 64
52. Svennerholm AM, Wikström M, Lindblad M, Holmgren J. (1986). Monoclonal
antibodies against Escherichia coli heat-stable toxin (STa) and their use in a diagnostic
ST ganglioside GM1-enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol. 1986;
24(4):585-90.
53. Taylor, DN, et al. ( 2006). A randomized, double-blind, multicenter study of Rifaximin
compared with placebo and with ciprofloxacin in the treatment of Traveler`s diarrhea.
Amer J Trop Med Hyg 74 (6): 1060-1066.
54. Torres, O.R. (2006). ETEC burden of Disease among Guatemalan children. WHO Global
Program for Vaccines and Immunization/ Vaccine Research and Development
Meeting; Goteborg, Suecia, Nov 1-2
55. Torres, O. (2008). Informe final de consultoría SIECA/ADAPCCA.
56. Urréjola, MI. (2001). Informe Final Proyecto Fodecyt Diarrea Sanguinolenta.
57. Van Nuyen, Trung, P. Le Van, C. Le Huy, K. N. Gia & A. Weintraub. (2005).
Detection and Characterization of Diarrheagenic E. coli from Young children in Hanoi,
Vietnam. J Clin Microbiol. 43 (2):775-760
57. Yamamoto, T. et al. (1992). Localized, aggregative and diffuse adherence to HeLa cells,
plastic, and human small intestines by Escherichia coli isolated from patients with
diarrhea. J Infect. Dis. 166: 1295-1310.
58. Yamomoto, T., Tamura T.& T. Yokota. (1984). Primary structure of heat labile
enterotoxin produced by Escherichia coli pathogenic for humans. J Biolog Chem: 259:
5037-5044.
59. Woodward, M. J., P. J. Carroll, & C. Wray. (1992). Detection of entero- and verocyto-
toxin genes in Escherichia coli from diarrhoeal disease in animals using the polymerase
chain reaction. Vet. Microbiol. 31:251–261.
60. www.who.int/household_water/advocay/network.pdf
An Integrated approach to confronting diarrhoeal disease fact sheet
Consultada 08 de marzo de 2011
61. www.path.org/files/VAC_dd approach fs. pdf
Consultada 08 de marzo de 2011
FODECYT 039-2006 65
IV.4 ANEXOS
IV. 4.1 Resumen de artículo pendiente de publicar ¨Toxins and virulence factors of
Enterotoxigenic E. coli in indigeneous children and internacional traveleres to
Guatemala¨.
IV. 4.2 Metodología estandarizada del PCR Multiplex de Escherichia coli Diarreogénica
FODECYT 039-2006 66
PARTE V INFORME FINANCIERO