Cong Nghe Enzym Duoc 2014

8/17/2019 Cong Nghe Enzym Duoc 2014

1/63

Công nghệ Enzym - Protein- Đại cương- Xúc tác sinh học

- Enzym cố định


2/63

Đại cương

Công nghệ

enzym: ứ ng dụng enzym hoặc xúc tác sinhhọc để

tạo ra sản phẩ m hay dịch vụ

Ứ ng dụng của enzym

Công nghiệp:

Thự c phẩ m: Làm bánh mì, rượu bia, các sản phẩ m sữ a

Tẩ y rử a: protease, lipase

Xử

lý tinh bột: các amylase, isomerase, CGTase

Dệt-da: amylase, lipase, cellulase


3/63

Đại cương

Ứng dụng của enzym

Y Dược

Trợ

tiêu hóa: amylase, protease

Chẩ n đoán: Alcol dehydrogenase, Cholesterol esterase,Creatinase

Đi ều trị: Asparaginase, Uricase, Streptokinase

Hóa dược: Ibuprofen, Salbutamol…

Nghiên cứ u: Endonuclease, RNase, DNase, Polymerase,

Ligase


4/63

Nhu c ầu sử

dụng enzym

Chỉ

tiêuCôngnghiệp Phân tích Dược phẩm

Lượng sử

dụng Tấ n Milligam

gam Milligam

gam

Độ

tinh

khiế t

Không tinh

khiế t

Tinh thể

tinh

khiế t

Tinh thể

tinh

khiế tNgu ồngố c

Vi sinh vật,thường ngoạibào

Vi sinh vật,động vật, thự cvật, thườngnội bào

Vi sinh vật,động vật, thự cvật, thườngnội bào

Giá

sảnxuấ t

Thấ p Trung bình Cao


5/63

Khái niệm xúc tác sinh học

Enzym là

chấ t xúc tác của các quá

trình sinh học

Bản chấ t là

protein

Giúp phản ứ ng đạt được điể m cân bằng nhanh hơn

Giúp phản ứ ng xảy ra nhanh hơn trong đi ều kiện bình

thường v ề

áp suấ t, nhiệt độ, pH

Enzym không thể

xúc tác PƯ với sự thay đổi nănglượng tự

do không thuận lợi trừ khi PƯ đó

song hànhvới một PƯ có

sự thay đổi năng lượng tự

do thuận lợi


6/63

Công nghệ

enzym hiện đại

Hóa học protein

Lý sinh phân tử

Sinh học phân tử

Cấ u trúc, hoạt động của protein-enzym

Can thiệp để thay đổi phân tử

protein-enzym –

côngnghệ

protein (protein engineering)


7/63

Xúc tác sinh học

Tính chọn lọc cao

Chọn lọc theo vị

trí

nhóm hóa học

Chọn lọc không gian

Hoạt động trên cơ chấ t đa dạng

Hoạt động được trong môi trường không phải là nước

Khả năng đảm nhận lượng cơ chấ t cao

Có độ

b ền đủ

cao

Tính kinh tế


8/63

Tính chọn lọc theo vị

trí

N N

N

N

OCH3

NH2O

OHHO

HO N

N N

N

OCH3

NH2O

OHHO

O

CH3O 5'vinyl acetat

C. antarcticalipase

Dẫn xuất Purine (Nelarabine) Sản phẩm acyl hóa


9/63

Tính chọn lọc không gian

COOCH3

H3CO

COOH

H3CO

COOCH3

H3CO

lipase

H2O

+

(R,S)-naproxen methyl ester

(S)-naproxen

(R)-naproxen methyl ester

Lipase từ

Candida rugosa

Lipase từ

Aspergillus niger


10/63




trí

nhóm hóa học





Có độ

b ền đủ

cao

Tính kinh tế


11/63



12/63



13/63




trí

nhóm hóa học





Có độ

b ền đủ

cao

Tính kinh tế


14/63

Sản xuấ t enzym -

Ngu ồn nguyên liệu

Chiế t tách

Động vật

Thự c vật

Lên men

Vi sinh vật

Nuôi cấ y tế

bào

Công nghệ

gen


15/63


Ngu ồn nguyên liệu

Chiế t tách từ

mô: lysozym, papain, bromelin, …

Lên men b ề

mặt: amylase, protease nấ m mố c

Lên men chìm: các enzym dùng trong công nghiệp,phân tích và

y học

Qui mô lớn: enzym thô dùng trong công nghiệp

Qui mô nhỏ: enzym dùng trong y học

Chủng được chọn lọc thông qua biế n đổi di truy ền

Tăng hoạt tính

Tính ổn định

Nhiệt độ, pH

Chuyể n gen sản xuấ t enzym vào các ký chủ

dễ

nuôi cấ y


16/63

Phương pháp sản xuấ t -

Tổ ng quát

Chuẩn bị

nguyên liệu

Chiết tách

Cô đặc

Tinh chế

Hoàn chỉ nh sản phẩm

•

Loại bỏ

mô tạp•

Phá

vỡ

tế

bào

•

Ly tâm, lắng•

Tủa bông•

Lọc

•

Bay hơi•

Tủa•

Siêu lọc

•

Kết tinh tr ực tiếp

•

Sắc ký•

Hấp phụ

•

Cô đặc

•

Kết tinh•

Đông khô• Ổn định


17/63

Chuẩn bị

nguyên liệu sinh học

Cơ quan động vật

Loại chấ t béo và

mô liên k ế t trước khi đông lạnh

Bảo quản lạnh đế n khi đủ

mẫu để

xử

lý

Nghi ền mẫu và enzym được chiế t với dung dịch đệm, hoặcdùng enzym để

phá

vỡ

tế

bào

Nguyên liệu thự c vật

Thự c vật có

thể được nghi ền và

chiế t với dung dịch đệm.

Tế

bào cũng có

thể được phá

vỡ

bằng enzym.

Vi sinh vật

Ngoại bào: tách tế

bào ra khỏi dung dịch lên men.

Nội bào: phá

vỡ

tế

bào


18/63

Phá vỡ tế bào

Các thành phần của thành tế bào:

Peptidoglucan, phospholipid, lipoprotein, liposaccharid

Sắp xếp các thành phần của thành tế bào

VK Gram + có lớp peptidoglucan dày hơn VK Gram –

Tế bào nấm men có lớp polyphosphoryl mannan vàglucan dày

Lipopolysaccharides +proteins

Cell membrane

Cell wall Peptidoglycan

Cell membrane

Periplasm


19/63

Các phương pháp phá

vỡ

tế

bào

Áp suấ t cao (Manton

-

Gaulin, French-press)

Nghi ền (máy nghi ền bi)

Siêu âm

Làm khô (đông khô, dung môi hữ u cơ)

Ly giải:

Vật lý: đông lạnh, số c thẩ m thấ u

Hóa học: chấ t tẩ y, kháng sinh

Enzym: lysozyme


20/63

Phá vỡ tế bào – Áp suất cao

French-press

Áp dụng: ở quy mô nhỏ

Cơ chế: Sự thay đổi áp suất đột ngột

Áp suất: 10.000 –

50.000 psi

Manton

-

Gaulin


21/63


22/63

Phá vỡ tế bào –

Siêu âm

Áp dụng: thường dùng trong PTN

Cơ chế: các bọt khí được tạo ra dưới tác dộng củasóng siêu âm

Tần số: >18 KHz, thông thường 20-50 KHz.

Cell suspension

Ultrasound tip

Ultrasoundgenerator


23/63

Phá vỡ tế bào – PP khác

Làm khô (đông khô, dung môi hữ u cơ)

Ly giải:

Vật lý: đông lạnh, số c thẩ m thấ u

Hóa học: chấ t tẩ y, kháng sinh

Enzym: lysozym


24/63


25/63


Chiế t tách

Tách dịch enzym ra khỏicác ph ần khác

Lắng

Ly tâm liên tục

Lọc

truy ền thố ng

lọc áp suấ t, lọc chân không

lọc chả y qua (cross-flow

filtration).

Phương pháp k ế t bông


26/63

Cô đặc

Bay hơi

Cơ chế: nhiệt độ thấp để bay hơi

Bề mặt bay hơi, khuấy tr ộn

K ế t tủa

Siêu lọc (MWCO)


27/63

Cô đặc – K ế t tủa

Muố i:

N ồng độ muố i cao tác động lên các phân tử nước bao quanh

protein, thay đổi lự c t ĩ nh điện

Dung môi hữ u cơ: giảm hằng số lưỡng cự c của MT nước

Polymer

Điể m đẳng điện


28/63

Cô đặc – Siêu lọc

10.000 đế n 1.000.000

MWCO


29/63

Tinh chế

K ế t tinh

Điện di

Sắc ký

Loại sắc ký Nguyên lý Tách theo

Hấ p phụ Liên k ết bề

mặt Ái lực bề

mặt

Phân bố Cân bằng phân bố Tính phân cựcTrao đổi ion Liên k ết ion Điện tích

Lọc gel Khuếch tán lỗ Kích thướ c và

hình dạng phân tử

Ái lực Hấ p phụ đặc hiệu Cấu trúc phân tửK ỵ nướ c Tươ ng tác k ỵ nướ c Cấu trúc phân tử

Đồng hóa tr ị Liên k ết đồng hóa tr ị Tính phân cực

Đánh bắt ion kimloại

Sự

thành lậ p phức Cấu trúc phân tử


30/63

Tinh chế – Sắc ký


31/63

Nguyên lý Sắc ký


32/63

Chọn Phương pháp sắc ký

GF = Lọc gel AC = Sắc ký Ái lực

IEX = Sắc ký Trao đổi IonHIC = Sắc ký Tương tác kỵ nướcRPC = Sắc ký Pha đảo


33/63

Ví

dụ

tinh chế

amylase bằng hấ p phụ

Dịch Enzym thô

Phức Enzym Alginat natri

Tủa Enzym Alginat Calci

Dịch Enzym tinh

•

Natri alginat

•

Calcium chlorid•

Lọc lấy tủa

•

Phản hấp phụ

•

Lọc lấy dịch

Dịch tạp chất

Alginat Calci

Sản phẩm amylase

•

Cô đặc

•

Thẩm tích


34/63

Ví

dụ

sản xuấ t Taq polymerase

Thermus aquaticus

hay E.coli tái tổ

hợpMôi tr ường

Lên men

Thu tế

bào

Phá

tế

bào

Tủa (NH4

)2

SO4

Thẩm phân

Cột DEAE

Cột Hydroxyapatide

Cột DEAE

Cột phosphocellulose

Taq polymerase tinh khiết

Môi tr ường thừa

Xác tế

bào

Dịch nổi


35/63

Enzym cố định

Là enzym được định vị

trong không gian xác định

Lịch sử

phát triể n

Giai đoạn đầu (1916–1950),

Giai đoạn phát triể n (1960-1980),

Giai đoạn thiế t k ế

hợp lý (1990–nay)

Ổn định trong dung môi hữ u cơ

Phương pháp tinh thể

enzym liên k ế t chéo (cross-linkedenzyme crystals -

CLEC)

K ế t hợp các chấ t mang với nhau.


36/63

Enzym cố định

Ư u điể m

Enzym có

thể được sử

dụng lặp lại nhi ều l ần

Chế

phẩ m b ền hơn enzym tự

do

Enzym cố định có

tố c độ

phản ứ ng lớn, dễ

tổ

chứ c sảnxuấ t ở

mứ c độ

tự động hóa cao.

Nhờ

sự

cố định mà

enzym không lẫn vào sản phẩ mcuố i

Enzym cố định bảo quản tố t hơn enzym tự

do cùng loại

Nhược điể m

Giảm hoạt tính của enzym so với ban đầu.

Cản trở

v ề

không gian do liên k ế t với chấ t mang làmhạn chế

sự

tiế p xúc giữ a enzym và cơ chấ t.


37/63

Enzym cố định


38/63

V ật liệu cố định

Chấ t mang phải rẻ

ti ền, dễ

tìm hoặc dễ

tổng hợp

Chấ t mang phải có

tính cơ lý ổn định

Chấ t mang phải b ền vữ ng v ề

mặt hóa học, không hòatan trong môi trường phản ứ ng.

Chấ t mang phải có diện tích b ề mặt lớn

Có

khả năng trương nở trong môi trường


39/63

Các phương pháp cố định enzym

Đặc tính

Phươ ng pháp liên k ết vớ i chất mang Phươ ng pháp khác

Hấp phụ

vật lýLiên k ết

ion

Liên k ếtđồng hóa trị

Liên k ếtchéo

Bắt giữ

K ỹ

thuật Dễ Dễ Khó Khó Khó

Hoạt tính enzym Thấ p Cao Cao Trung bình Cao

Tính đặc hiệu cơ

chất

Không đổi Không đổi Thay đổi Thay đổi Không đổi

Lực liên k ết Yếu Trung bình

Mạnh Mạnh Mạnh

Khả năng tái cố

định

Có

thể Có

thể Không Không Không

Khả năng ứng dụng Thấ p Trung bình

Trung bình Thấ p Cao

Chi phí

cố định Thấ p Thấ p Cao Trung bình Thấ p


40/63

Cố định thuận nghịch

E

E

Hấ p phụ

E+ -

E+ -

E+ -

Liên k ết ion

E

E

E

Liên k ết ái lực

Liên k ết ion kim

loại hoặc chelate

EMe-

EMe-

E

ES S

ES S

ES

E

Liên k ết disulfit

Me-

S


41/63

Cố định không thuận nghịch

E

E

E

Liên k ết đồng hóa tr ị

E E

EE

Bắt giữ

EE

E

E

E

E

E

Tạo vi hạt bao

E

E

E

E

E

E

E

Liên k ết chéo

Ứ à


42/63

Ứ ng dụng enzym trong ngành dược

Liệu pháp enzym

Enzym trong sản xuấ t thuố c

ệ ằ


43/63

Trị

liệu bằng enzym

Thay thế

enzym do bệnh di truy ền

Thay thế

enzym do một bệnh mắc phải

Cung cấ p tác dụng sinh học đặc hiệu

Dùng trong đi ều trị

hỗ

trợ

khi phố i hợp vớicác liệu pháp khác, hay để

giải độc máu hay

mô.

ệ á ê ầ ủ


44/63

Liệu pháp enzym -

Yêu c ầu của enzym

Phải đế n được vị

trí

tác động của chúng trong cơ thể

hay mô.

Phải có

hoạt tính ở đi ều kiện môi trường tại nơi tác động.

Đủ

b ền để

có được các thông số dược động học c ần thiế t

Độ

tan thỏa mãn yêu c ầu nế u được dùng theo đường tiêm bắphay dưới da.

Độ

tinh khiế t đủ

cao

Có

hiệu quả đi ều trị

dự a trên hoạt tính đặc hiệu của enzymđược dùng. Hiệu quả

của liệu pháp phải được chứ ng minh

An toàn đố i với bệnh và

chỉ định đi ều trị

Dạng sử

dụng thuận tiện

á ấ đề ủ h ố i


45/63

Các vấ n đề

của thuố c protein

Không ổn định

Sinh khả

dụng

Tính thấ m tế

bào

Tính chấ t gây miễn dịch

Phản ứ ng dị ứ ng

Sản xuấ t và

kiể m định

Lợi thế

Ít tác dụng phụ hơn

Thời gian phát triể n ngắn

Tỷ

lệ

thành công khi xin cấ p phép cao

há h hứ


46/63

Thách thứ c

Cải thiện tính ổn định

PEG, liên k ế t chéo

Đẳng điện, ư a nước,ít hoạt động

Bao bảo vệ

Cải tiế n phân tử

Thá h hứ


47/63

Thách thứ c

Giảm tính miễn dịch

Định hướng đặc hiệu

Khả năng xuyên màng tế

bào

N ồ


48/63

Ngu ồn enzym

Chiế t xuấ t -

Tinh chế :

Không phải người: nấ m, vi khuẩ n, động vật, thự c vật

Gây miễn dịch

Dùng ngoài

Người: yế u tố đông máu, urokinase…

Giới hạn công suấ t, nguyên liệu hạn chế

Nhiễm virus và

các yế u tố

gây bệnh khác

Tái tổ

hợp

Sử

dụng gen người tái tổ

hợp trong tế

bào khác

Cải thiện hoạt tính, đặc điể m thông qua cải tiế n trình tự

Hệ thố ả ất


49/63

Hệ

thố ng sản xuấ t

Nuôi cấ y tế

bào người – động vật

Chấ t lượng tố t

Năng suấ t giới hạn

Nhiễm virus

Nấ m men

Thự c hiện được một số

biế n đổi hậu dịch mã

Vi khuẩ n

Năng suấ t cao

Không thự c hiện được biế n đổi hậu dịch mã

Sinh vật chuyể n gen

Liệu pháp gen


50/63

Sản xuấ t thuố c bằngcông nghệ

enzym

Th ố đối


51/63

Thuố c đố i quang

Cấ u trúc không gian của phân tử

sinh học và

thụ

thể

Chỉ

một trong hai đồng phân có

hoạt tính,

Các đồng phân có

hoạt tính khác nhau

Dược động học và

chuyể n hóa khác nhau

Thuố c tinh khiế t quang học (enantiopure) -

racemic

Bản quy ền đồng phân

Th ố đối


52/63

Thuố c đố i quang

Tác dụng dượ c lý chính Khác biệt giữa các đồng phân

Thuốc chẹn β: propranolol, acebutolol, atenolol, alprenolol, betaxolol, carvedilol, meto-prolol, labetalol,

pindolol, sotalol, …

l > d (d = không có

hoạt tính)Ví

dụ: S(-)-propranolol > R(+)-propranolol

Thuốc chẹn kênh calci:verapamil, nicardipine, nimodipine, nisoldipine,felodipine, mandipine …

l > dVí

dụ: S(-)-verapamil > R(+)-verapamil

Thuốc giãn phế

quản:albuterol (salbutamol), salmeterol và

terbutalinel > d (d = không có

hoạt tính)Ví

dụ: R(-)-albuterol > S(+)-

albuterol

An thần:hexobarbital, secobarbital, mephobarbital, pentobarbital, thiopental, thiohexital

l > dVí

dụ: S(-)-secobarbital > R-(+)secobarbital

Thuốc gây mê:ketamine, isoflurane

d > l (l = không có

hoạt tính)Ví

dụ: S(+)-ketamine > R(-)-ketamineS(+)-isoflurane > R(-)-isoflurane

Giảm đau tác động trung ươ ng: Methadone Ví

dụ: R(-)-methadone > S(+)-methadone

Kháng viêm không steroid:

ibuprofen, ketoprofen, benoxaprophen, fenprofen

d > l

Ví

dụ: S(+)-ibuprofen > R(-)-ibuprofenAn thần: nhóm 3-hydroxy-benzodiazepines:

oxazepam, lorazepam, temazepamd > l (l = không có

hoạt tính)Ví dụ: S(+)-oxazepam > R(-)- oxazepam

Th ố đối i


53/63

Thuố c đố i quang -

racemic

Thuốc: 668

Không bất đối: 2

Bất đối: 145Chế phẩm mộtđồng phân: 119

Tự nhiên/ bán tổng hợ p: 147

Chế phẩm dạngracemic: 8

Bất đối: 252

Không bất đối: 269

Chế phẩm dạngracemic: 140

Tổng hợ p: 521

Chế phẩm mộtđồng phân: 110

Cá l i hả ứ đượ ú tá bởi


54/63

Các loại phản ứ ng được xúc tác bởi enzym

Lớ p enzym theo IUBMB Phản ứng xúc tác

EC 1 Oxidoreductases Không đ òi hỏi đồng cơ chấ t

Oxi hóa/khử đối vớ i –CH–OH, –C=O, –C=C,

…EC 2 Transferases

Không đ òi hỏi đồng yế u t ố

Chuyển các nhóm chức như halogen,aldehyde, keto, acyl, glycosyl, …

EC 3 Hydrolases Không đ òi hỏi đồng yế u t ố

Thủy phân/ngưng tụ

các ester, glycosid, nitril,amid, halogen, …

EC 4 Lyases Không đ òi hỏi đồng yế u t ố

Thêm/loại bỏ; cắt các liên k ết C–C, C–O, C–N

EC 5 Isomerases Không đ òi hỏi đồng yế u t ố Đồng phân hóa, chuyển dạng cis-trans, epimehóa

EC 6 LigasesC ần đồng cơ chấ t ATP

Tạo các liên k ết C–O, C–S, C–N, C–C

Một số ấn đề công nghệ


55/63

Một số

vấ n đề

công nghệ

Chi phí

cố định phải bù đắp được bởi sự gia tăng tính ổn địnhhoặc hoạt tính.

Giảm thiể u sự

mấ t hoạt tính trong quá

trình cố định.

Khi enzym được cố định bằng phương pháp có

tính thuậnnghịch, sự

rò rỉ

enzym phải được nghiên cứ u và

có

biện phápthích hợp.

Sự

giới hạn v ề

luân chuyể n vật chấ t trong chấ t mang c ần đượctính toán khi đi ều chỉnh pH hay nhiệt độ

trong quá

trình phảnứ ng.

Với enzym tự

do, hoạt tính chuyể n hóa có

thể đạt được cao

hơn ở

n ồng độ enzym cao, do đó việc chuyể n hóa các cơ chấ tkhó có thể

thự c hiện được.

Tính vô trùng của phản ứ ng c ần được quan tâm.

Sự tương thích của dung môi với chấ t mang và

ảnh hưởng củadung môi đế n hoạt tính c ần được xem xét.

Lựa chọn nồi phản ứng


56/63

Lự a chọn n ồi phản ứ ng

* ***

*

* **

*****

* ***

*****

* *

*

*

**

**

*

*

****

******

**** ** * **

**

****

*

**

** ***

*

* **

*****

* ***

*****

* *

*

*

**

**

*

*

****

******

**** ** * **

**

****

*

**

*

***

*

*

* *

***

**** **

*

*****

* *

** *

**

*****

**

******

**** ** * **

**

****

*

**

** *

****

* ***

* ***

**

**

**

* *

*

a b c

f ed A: vận hành theo lô; B: vận hành theo lô có

tuần hoàn; C: thùng khuấy có

siêu lọc;D: thùng khuấy vận hành liên tục; E: thùng nhồi liên tục; F: tầng sôi liên tục

Oxidoreductase


57/63

Oxidoreductase

N

N

N

N

HN

ClO

OHHO

HO

Ph

Ph

N

N

N

N

HN

ClO

OHHO

HO

Ph

PhO Nucleoside Oxidase

H2O, pH 6, 25 oC, 12-24h5'

Nucleoside oxidase lấy từ

Stenotrophomonas maltophilia

(FERM BP-2252)

Sản xuất các dẫn xuất 5’-carboxylic

acid

của cácnucleoside đồng đẳng.Enzym thô từ

dịch chiết tế

bào hoặc cố định lên Eupergit-C

Lipase Transferase


58/63

Lipase –

Transferase

O

OH

O

N N N

N

F

F

O O

N N N

N

F

F

OAc

O

OH

O

N N N

N

F

F

OHCOOH

OH

N N N

N

F

F

O

OH

O

N N N

N

F

F

Lipase

37oC, 20h

LipaseH2O

racemic

(S)-acetat (R)

(S)

+

Thuốc hạ

cholesterol

Lipase Hydrolase


59/63

Lipase -

Hydrolase

OO

O

O

OO

O

O

OO

OH

OO

O N

+LipaseH2O, 25

oC, 4h

racemic cis-hexanoate (3R,4S)-phenol

(-)-OrmeloxifeneThuốc ngừa thai tác dụng kéo dài (1 viên/tuần)

Lipase


60/63

Lipase

CH3 O

OH Novozym 435

CH3 O

OH

CH3 O

OC12H25

(S)-(+)-ibuprofen

(R)-(-)-ibuprofen ester

+

(R,S)-ibuprofen

1-Dodecanol

Thuốc kháng viêm không steroid

Amidase


61/63

Amidase

NHO

NHO

NH3+

OO-

NHO

N NH

N NH2

OH

-lactamase

H2O, 70oC

+

Carbovir

rac-lactam (+)-lactam (-)-acid amin

Đồng đẳng Carbovir

Thuốc kháng HIV

Deaminase


62/63

Deaminase

N

N

O

S

NH2

OHO

N

N

O

S

NH2

OHO

N

NH

O

S

O

OHO

+Cytidine Deaminase

H2O, pH 7, 32

o

C, 35-70h

Lamivudine

Thuốc kháng virus (HBV, HIV)

Lyase


63/63

Lyase

N

CN

N

CONH2

H2O, pH 8, 25oC, 18h

Nicotinamide

Tế bào R. rhodochrous J1cố định

Vitamin B3

Cong Nghe Enzym Duoc 2014

Documents

Transcript of Cong Nghe Enzym Duoc 2014