I

CARLOMAGNO PACHECO BAHIA

Conexões interhemisféricas do córtex de barris do

rato: análise de neurônios isolados

TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS

MORFOLÓGICAS.

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Anatomia

Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas

Rio de Janeiro – RJ

2009

Livros Grátis

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II

Conexões interhemisféricas do córtex de barris do rato:

análise de neurônios isolados.

Carlomagno Pacheco Bahia

Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro

como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas.

Orientador: Professor Doutor Jean Christophe Houzel

Professor Adjunto do Programa de Anatomia, Instituto de Ciências Biomédicas,

UFRJ.

Co-orientador: Professor Doutor Antônio Pereira Jr

Professor Adjunto do Programa de Fisiologia, Instituto de Neurociências,

UFRN.

Rio de Janeiro 2009

III

Conexões interhemisféricas do córtex de barris de rato:

análise de neurônios isolados.

Carlomagno Pacheco Bahia

Tese submetida ao corpo docente do Programa de Pós-graduação em Ciências

Morfológicas da Universidade Federal do Rio - UFRJ, como parte do requisito

necessário à obtenção do grau de Doutor.

Aprovado por:

Orientador: Prof. Dr. Jean Christophe Houzel. Universidade Federal do Rio de Janeiro

Co-orientador: Prof. Dr. Antônio Pereira Jr. Universidade Federal do Rio Grande do Norte Profa. Dra. Ana Maria Blanco Martinez. Universidade Federal do Rio de Janeiro Profa. Dra. Claudia Domingues Vargas. Universidade Federal do Rio de Janeiro Prof. Dr. Mário Fiorani Junior. Universidade Federal do Rio de Janeiro Profa. Dra. Daniela Uziel Rozental. Universidade Federal do Rio de Janeiro

Profa. Dra. Eliane Volchan. Universidade Federal do Rio de Janeiro

Rio de Janeiro

2009

IV

Bahia, Carlomagno Pacheco. Conexões interhemisféricas do córtex de barris do rato: analise de neurôniosisolados/Carlomagno/Pacheco Bahia. Rio de Janeiro: UFRJ/PCM, 2009. xi, 155f. : 40 il.; 29,7cm

Orientador: Jean Christophe Houzel Co-orientador: Antonio Pereira Jr. Tese de doutorado – Universidade Federal do Rio de Janeiro/Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas, 2009. Conexões interhemisféricas 2.Córtex de barris 4.Neurônios isolados 5. Morfometria –Tese (Doutorado UFRJ/PCM).

V

Agradecimentos

Ao meu orientador, Jean Christophe Houzel, obrigado pela atenção,

confiança, pelo treinamento no sistema de Neurolúcida, por ter acreditado

neste projeto e, principalmente, pela amizade.

Ao meu co-orientador, Antônio Pereira, um agradecimento especial por

ter me acolhido no Laboratório de Biofísica Celular, pelos dez anos de

convivência recheada de amizade, pela demonstração de simplicidade, por ter

me dado força nos momentos que precisei e pelo incentivo à pesquisa.

À Daniela Uziel Rozental, pela revisão deste manuscrito, pelos

incentivos, pela confiança e pela amizade.

Aos Professores Mário Fiorani, Cláudia Vargas, Ana Martinez e Eliane

Volchan, por aceitarem o convite para participar desta banca!

Ao Roberto Lent, por ter aberto as portas do Laboratório de

Neuroplasticidade, onde desenvolvi grande parte desta tese, pelos

ensinamentos, pela amizade, confiança e pela simplicidade.

Ao João Franca, por ter cedido o set up de eletrofisiologia do Laboratório

de Neurobiologia II para realização de experimentos, pela amizade e pela

convivência.

Ao Cristovam Diniz, pela amizade, pelos conselhos, pelo incentivo à

pesquisa e por sempre me acolher em seu laboratório.

À Renata Anomal, por ter me ajudado nos experimentos de

eletrofisiologia, à Carla Moreira, por ter me ajudado com a coloração de Nissl, à

Lena Dalva e Ludmila Ribeiro, as mulheres de minha tese, e ao Adiel Batista,

por cuidar dos animais. Sem vocês, seria impossível eu desenvolver este

trabalho!

VI

Aos Professores Vivaldo Moura Neto e Cláudia Mermelstein e a Tânia

pela ajuda e atenção na resolução dos problemas.

A todos os Neurolpásticos, em especial Patrícia, Mauren, Noboro, Fred,

Jean Pierre, Carol, Rodrigo, Marisol e Virginia, obrigado pelo alto astral e

convivência fraterna. Muito bom trabalhar com vocês. Adoro a todos!

Aos integrantes do Laboratório de Neurobiologia II, em especial à

Anaelli, Ghyslain, Débora, Glauber e Ruben, pela amizade e carinho. Um

obrigado especial à todos os lucidamaníacos por terem me dado prioridade no

uso do sistema Neurolúcida!

Aos integrantes do Laboratório de Neurorregeneração, em especial ao

Walace, Ivanira, Andreinha e Patrycy, obrigado por todo!.

Aos integrantes do Laboratório de Fronteira em Neurociências, em

especial, Marco e Thelma, obrigado pelo inesgotável otimismo!

Um obrigado especial ao Eliã, Fabiana e Andréia, os irmão que a vida

me deu. Obrigado pela convivência, amizade, carinho e pelo dia-a-dia!

À todos os professores do Programa de Anatomia da UFRJ, que me

adotaram como professor substituto, em especial à Jane Amaral, Sandra

Köning e José Garcia, pelo incentivo e por terem acreditado em meu trabalho.

Jamais os esquecerei!

À Rosinay Tavares, obrigado por tentar me entender, pelos incentivos e

pelos momentos mágicos. Adoro você!

Obrigado à toda a minha família. Meu pai, um exemplo de vida, minha

mãe, que me deu o mundo e é o meu pilar, meus irmãos Cláudio e Marco e a

nova geração da família, Gabriel e Neto. Sem vocês, eu nada seria!

VII

Resumo

Ratos exploram o ambiente usando ativamente as vibrissas em movimentos bilaterais e rítmicos. Embora as vias ascendentes trigeminais sejam completamente cruzadas, estímulos em uma única vibrissa podem exercer influência no córtex de barris ipsolateral, via conexões interhemisféricas. No córtex de barris de ratos, existem densas conexões calosas entre as colunas de septo das camadas extragranulares, mas a precisão dessas conexões a nível neuronal ainda é desconhecida. Neste estudo, usamos injeções iontoforéticas do neurorrastreador sensível para analisar a morfologia dendrítica e axonal de células calosas do córtex de barris de rato. Após induzir o estado anestésico, realizamos registro eletrofisiológico multiunitário para a seleção do local (barril ou septo) de injeção de dextrana-amina biotinilada (10%, 3 ou 10 kD). Após sobrevida, os animais foram perfundidos e os encéfalos cortados (150 μm), seriadamente incubados em complexo ABC e reagidos com DAB. Os corpos celulares e seus prolongamentos neuronais marcados foram reconstruídos com o auxilio do sistema Neurolúcida. Identificamos neurônios calosos nas colunas de septo e de barris em todas as camadas do PMBSF. Em trinta células calosas (CC) retrogradamente marcadas e reconstruídas tridimensionalmente, as arborizações dendríticas das CC localizadas nas camadas supragranulares foram maiores e ocuparam maior área do que os das CC nas demais camadas. Adicionalmente, as CC infragranulares das colunas de septo apresentaram maior e mais complexa arborização dendrítica do que as localizadas nas colunas de barris da mesma camada. Dez CC marcadas anterogradamente foram completamente reconstruídas e apresentaram arborização axonal fracamente ramificada e conectando colunas homotópicas entre os dois campos de barris. Os terminais axonais das colunas septais restritos às colunas de septo, porém apresentaram geometria mais complexa e mais botões sinápticos que os das colunas de barris. Finalmente, os neurônios calosos do PMBSF de ratos estabeleceram conexões ponto-a-ponto entre colunas homotópicas do PMBSF, contudo somente os axônios das células localizadas nas colunas de barris apresentaram a precisão em conectar exatamente os mesmos pontos dentro do PMBSF.

VIII

Abstract Rats scan their surroundings through active, rhythmic, bilateral

movements of the whiskers. Although the ascending trigemino-cortical pathway is fully crossed, stimulation of a single whisker can exert timely precise influences onto the ipsilateral cortex, via commissural networks. Callosal connections were shown to be dense between interbarrel septa and extragranular layers, but their degree of precision at the single neurons level is unknown. We applied targeted injections of sensitive neuronal tracers to analyze the morphology of individual callosal cell bodies and axonal arbors in the rat barrel field. Under ketamine/xylazine anesthesia, extracellular recordings of neuronal responses to mechanical whisker stimulation were used to target specific barrel or septal sites, where biotinylated dextran amines (10%, 3 or 10 kDa) were injected iontophoretically. After survival, serial 150μm-thick sections were incubated in ABC complex and processed DAB reaction. Labeled bodies and processes were 3D-reconstructed using Neurolucida. Callosal neurons were identified in septal columns, as well as within barrels and throughout all layers. Thirty callosal cells were reconstructed. Dendrites of supragranular cells were significantly longer, and covered a wider cortical area than in other layers. In addition, infralaminar callosal neurons display more complex dendritic trees in septal columns than within barrels. Ten anterogradely labeled neurons were fully reconstructed with their axonal arbor. Individual axons terminate into weakly ramified and narrow columns homotopic to the cell body, achieving precise connectivity between restricted, corresponding domains of the opposite hemisphere. Septal terminals were as spatially restricted in septa as within barrels, but had more complex geometry and distributed about twice as many buttons than within barrels. Thus, individual callosal neurons establish sets of discrete, point-to-point connections between homotopic (barrel or septal) domains of the rat PMBSF. However, only axons of barrel domains had symmetrical conections between barrels of same column and arc.

IX

Lista de Abreviaturas ALBSF: Subcampo AnteroLateral de Barris.

BDA: neurorrastreador Dextrana-Amina Biotinilada.

CC: Células Calosas.

CitOx: Enzima Citocromo Oxidase.

CR: Campo Receptor.

GABA: Ácido γ-Aminobutírico.

M1: Área Motora Primária.

NADPH-d: Enzima NADPH-diaforase.

PMBSF: Subcampo Pósteromedial de Barris.

POm: Porção Rostral do Núcleo Posterior do Tálamo.

PrV: Núcleo Trigeminal Principal.

PV: Área Parietal Ventral.

S1: Área Somestésica Primária.

S2: Área Somestésica Secundária.

SNC: Sistema Nervoso Central.

SpVi: Porção Interpolaris do Núcleo Trigeminal Espinhal.

VB: Complexo Ventrobasal do Tálamo.

VPI: Núcleo Ventral Posterior Inferior do Tálamo.

VPL: Núcleo Ventral Posterior Lateral do Tálamo.

VPM: Núcleo Ventral Posterior Medial do Tálamo.

X

Lista de Figuras Figura 01: Representação somatotópica da superfície corporal 4 Figura 02: Diagrama esquemático das áreas sensoriais e motoras no cérebro

de rato 5

Figura 03: As diferentes áreas citoarquitetônicas em S1 de humanos 7 Figura 04: A organização colunar é conservada durante a evolução dos

córtices sensoriais de mamíferos 9

Figura 05: A organização laminar do PMBSF de rato 11 Figura 06: Módulos corticais em S1 de ratos 12 Figura 07: As vibrissas mistaciais do rato 18 Figura 08. As vias lemniscal e paralemniscal 21 Figura 09: As vias aferentes e eferentes do PMBSF 22 Figura 10: Circuito do barril versus circuito do septo 26 Figura 11: Padrão de marcação retrógrada para o hemisfério contralateral no

córtex parietal de rato 33

Figura 12: Evidências anatômicas, fisiológicas e funcionais da existência de conexões calosas fora da representação da linha média

37

Figura 13: Conexões calosas nas representações de partes periféricas do corpo distantes da linha média

39

Figura 14: Neurônio caloso na representação do córtex visual de rato 42 Figura 15: Resumo do desenho experimental 52 Figura 16: Contornos de pilha de secções seriadas 60 Figura 17: O sistema Neurolúcida 63 Figura 18: Sítios de injeções não utilizados para a reconstrução 3D 67 Figura 19: Injeções iontoforéticas de BDA adequadas para reconstrução 3D 69 Figura 20: Injeção de BDA retrógrado e a marcação no PMBSF do hemisfério

contralateral 71

Figura 21: Marcação, por BDA de transporte anterógrado, no mesmo hemisfério do sítio de injeção

73

Figura 22: Marcação, por BDA de transporte anterógrado, no hemisfério contralateral ao sítio de injeção

74

Figura 23: As células calosas do PMBSF marcadas retrogradamente 76 Figura 24: Distribuição das células calosas no PMBSF de rato 78 Figura 25: Neurônio caloso supragranular marcado retrogradamente 80 Figura 26: Neurônio caloso granular marcado retrogradamente 81 Figura 27: Neurônio caloso infragranular marcado retrogradamente 82 Figura 28: Neurônios calosos reconstruídos em 3D 83 Figura 29: Tamanho do corpo celular na distribuição laminar das células

calosas do PMBSF de rato 85

Figura 30: As características morfométricas da arborização dendrítica na distribuição laminar das células calosas do PMBSF

86

Figura 31: Os neurônios calosos e a organização colunar do córtex de barris 89 Figura 32: Neurônios calosos classificados segundo sua posição laminar e

colunar 90

Figura 33: Características morfométricas das células calosas localizadas nas colunas de septo e de barris

91

Figura 34: Reconstrução 3D de células calosas do PMBSF 95 Figura 35: Célula calosa supragranular da coluna de barril 96 Figura 36: Célula calosa granular da coluna de barril 97

XI

Figura 37: Neurônios calosos do córtex de barris de rato 99 Figura 38: Célula calosa infragranular septal 100Figura 39: Quantificação dos dados morfológicos dos axônios calosos do

PMBSF 104

Figura 40: Distribuição dos botões sinápticos 106

1

Sumário

Resumo Vii Abstract Viii Lista de Abreviaturas Ix Lista de Figuras X 1. Introdução 1

1.1 O Córtex somestésico: representação topográfica, módulos corticais e conexões interhemisféricas

2

1.1.1 O córtex somestésico 2 1.1.2 A área somestésica primária (S1) 5 1.1.3 Áreas somestésicas secundária e parietal ventral 14 1.1.4 O córtex de barris em roedores 16 1.1.5 Das vibrissas ao córtex de barris: as projeções para o PMBSF 17 1.1.6 Os circuitos locais do córtex de barris 23 1.1.7 As projeções eferentes do córtex de barris 29 1.1.8 As conexões calosas no campo de barris 31

1.2 O corpo caloso e o dogma da "linha média" 35 1.2.1 As conexões calosas fora da representação da linha média 38

1.3 Os neurônios calosos 41 2. Objetivos 44

2.1 Objetivos específicos 44 3. Métodos 45

3.1 Animais experimentais 45 3.1.1 Preparação pré-cirurgica dos animais e anestesia 47 3.1.2 Procedimento cirúrgico 47 3.1.3 Registro eletrofisiológico 48 3.1.4 Injeção de neurorrastreador 50

3.2 Preparação do tecido: perfusão, craniotomia e microtomia 53 3.2.1 Histoquímica para demonstrar a atividade da enzima NADPH-diaforase

54

3.2.2 Histoquímica para demonstrar a atividade da enzima citocromo oxidase

55

3.2.3 Revelação do neurorrastreador (BDA) 56 3.3 Lavagem, desidratação e montagem dos cortes 57 3.4 Coloração de Nissl no material sem contra-marcação de NADPH-d ou CitOx.

58

3.5 Documentação e análise dos dados 59 3.5.1 O sistema Neurolúcida 61

2

3.5.2 Análise estatística 64 4. Resultados 66

4.1 Os sítios das injeções 66 4.2 Análise qualitativa das células calosas do PMBSF de rato 70

4.2.1 A distribuição laminar das células calosas retrogradamente marcadas

70

4.2.2 A localização laminar e a arborização dendrítica das células calosas

72

4.2.3 Os axônios calosos do córtex de barris 72 4.3- Análise quantitativa: as características morfométricas das células calosas do PMBSF de rato

75

4.3.1 Distribuição laminar 75 4.3.2 Distribuição das células calosas na camada IV do PMBSF 79 4.3.3 Características morfométricas do corpo celular e da arborização dendríticas das CC do PMBSF

79

4.4 Características morfométricas dos axônios calosos do PMBSF de rato 93

5. Discussão 104

5.1 Considerações técnicas 1045.2 Distribuição laminar, tangencial e morfologia das células calosas no PMBSF do rato adulto

107

5.2.1 A morfologia dendrítica das células calosas do PMBSF 1105.3 Distribuição e geometria dos axônios calosos no PMBSF do rato 118

6. Conclusões 124 7. Perspectivas futuras e desdobramentos possíveis 125 8. Bibliografia 126 9. Anexos 153

9.1 Spatiotemporal distribution of proteoglycans in the developing rat’s barrel field and the effects of early deafferentation.

155

9.2 On the fate of extracellular hemoglobin and heme in brain. 169

1

1 – Introdução

Um dos desafios permanentes das Neurociências é a compreensão dos

mecanismos neurais responsáveis pelas representações mentais que

permitem aos indivíduos perceberem ativamente seu ambiente e interagir

adequadamente com ele. Entretanto, as bases neurais da percepção

sensorial, mais especificamente a integração cortical das informações

sensoriais que permitem a representação coerente do ambiente, ainda não

estão compreendidas.

Devido à organização anatômica das vias sensoriais aferentes do

sistema nervoso central (SNC) de mamíferos, cada hemisfério cerebral só

recebe informações relacionadas à metade oposta do corpo. Entretanto,

somos capazes de perceber nosso ambiente como uma entidade unitária e a

maioria dos comportamentos exploratórios envolve a participação de

receptores localizados nos dois lados do corpo (membros, olhos, ouvidos).

Cabe então às comissuras cerebrais, que conectam os dois hemisférios,

integrar as informações que chegam das metades do corpo. No encéfalo dos

mamíferos, existem várias comissuras desempenhando este papel:

comissura anterior, comissura hipocampal, corpo caloso e a comissura

posterior. O corpo caloso é filogeneticamente mais recente e, em animais

mais encefalizados, assume papel de destaque na integração

interhemisférica.

2

1.1 - O Córtex Somestésico: representação topográfica, módulos

corticais e conexões interhemisféricas

1.1.1 – O córtex somestésico

As funções desempenhadas pelo sistema somestésico podem ser

divididas em três modalidades principais: 1) Exterocepção (sensações de tato

através dos mecanoceptores, temperatura através dos termoceptores e dor

através dos nociceptores); 2) Propriocepção (percepção de posicionamento no

espaço); 3) Enterocepção ou vicerocepção (sensações conscientes, ou

inconsciente, dos órgãos internos) (Burish et al., 2008; Dunckley et al., 2005;

Aziz et al., 2000 Berlucchi & Aglioti, 1997).

Quando um receptor é estimulado na periferia, em seguida ocorre a

ativação de um grupo específico de neurônios na área somestésica primária

do córtex cerebral, que permitirá determinar a (sub)modalidade do estímulo

somestésico assim como sua localização no corpo (Craig, 2002; 2003).

No cérebro, as áreas corticais são definidas a partir de três

características principais: estrutura interna, função e conectividade. Função e

conectividade estão intimamente relacionadas, uma vez que a fisiologia das

áreas do córtex somestésico pode ser inferida a partir de suas conexões,

particularmente das aferências provenientes do complexo ventrobasal (VB) do

tálamo (Jones & Powell, 1969a e b; 1970; Jones, 1970).

Até o presente momento, o isocórtex de todos os mamíferos estudados

apresentou pelo menos duas representações completas e somatotopicamente

organizadas da metade contralateral do corpo: as áreas somestésicas primária

e secundária (S1 e S2, respectivamente) (para revisão, ver Kaas, 1983).

Essas áreas recebem aferências diretas do complexo VB assim como fazem

3

densas conexões recíprocas entre si. S1 corresponde a uma representação

completa da metade contralateral da superfície do corpo do animal, presente

no córtex parietal (Figura 01). S2 localiza-se lateral e caudalmente à S1,

possuindo uma representação topográfica relativamente menos precisa da

superfície cutânea (Beck et al., 1996) (Figura 02).

Uma terceira representação somestésica vizinha à S2, que também

responde a estímulos cutâneos superficiais, foi recentemente identificada no

lobo parietal de alguns mamíferos e denominada de área parietal ventral (PV)

(prototerianos: Krubitzer et al., 1995b; metaterianos: Beck et al., 1996;

euterianos: Krubitzer et al., 1986, 1995a; para uma revisão ver Krubitzer 1995)

(Figura 02).

4

Figura 01: Representação somatotópica da superfície corporal. (A) Em

humanos, os córtices motor e somestésico localizam-se nos giros pré e pós-central

(pontilhados preto e vermelho, respectivamente). (B) A superfície corporal é

ordenadamente representada em M1 e S1. Caricatura representa a proporção de

S1 (C) que é devotada a processar informações de diferentes partes da superfície

corporal e (D) a proporção de M1 devotada a controlar os movimentos de

diferentes partes do corpo. Notar que as representações da face e das mãos são

proporcionalmente maiores que as outras partes do corpo. Adaptado de Bear et al.,

2002. Em Neurociências: desvendando o sistema nervoso, ArtMed, Segunda

Edição.

5

Figura 02: Diagrama esquemático das áreas sensoriais e motoras no cérebro de rato. S1, o córtex somestésico primário, é subdividido nos

subcampo pósteromedial de barris (PMBSF) e subcampo anterolateral de

barris (ALBSF). PR: área parietal rinal; PM: área parietal medial; PV: área

parietal rinal; A1: área auditiva primária; V1: área visual primária; Agl e Agm:

áreas motoras do rato. Adaptado de Fabri & Burton., 1991; Catania &

Remple, 2002.

1.1.2 - A Área Somestésica Primária (S1)

A área S1 corresponde a uma representação completa da metade

contralateral do corpo do animal disposta ao longo do eixo médio-lateral do

córtex parietal, de tal forma que a representação do membro posterior é

6

encontrada mais medialmente e a da face mais lateralmente, com o membro

anterior e o tronco em posições intermediárias (Figuras 01 e 02). Em

humanos, há quatro áreas fisiologicamente e anatomicamente distintas no

córtex somestésico, originalmente designadas como áreas 3a, 3b, 1 e 2 de

Brodmann (para maiores detalhes ver Kaas, 1983) e cada um das quatro

áreas possui uma representação própria da metade contralateral do corpo

(Figura 03). As áreas 3b e 1 respondem preferencialmente a estímulos

cutâneos superficiais, enquanto as áreas 3a e 2 respondem

preferencialmente a estímulos profundos (transmitidos a partir de receptores

nas articulações e músculos) e todas elas recebem axônios provindos do

complexo VB do tálamo (Kaas, 1983).

A área 3b é a mais densamente inervada pelos axônios do complexo

VB e demonstra uma típica estrutura de área sensorial primária, onde os

axônios provindos do tálamo terminam principalmente na camada IV, mas

também podem fazer sinapses na porção mais profunda da camada III

(Padberg et al., 2009). De fato, fortes evidências apontam que a área 3b de

primatas equivale à área S1 de outros mamíferos (Kaas et al., 1979; Padberg

et al., 2009 ; para revisão ver Kaas, 1983). Uma vez que a informação

somestésica trazida pelos axônios das células tálamo-corticais chega na

camada IV, neurônios dessa camada enviam projeções para as camadas II e

III, cujos neurônios retransmitem as informações para a camada IV de outras

áreas somestésicas/associativas (p. ex. S2) num padrão “feedforward” típico.

Já as células piramidais da camada VI enviam seus axônios para VB,

conectando o córtex somestésico com o tálamo somestésico. Além disso, os

campos receptores dos neurônios da área 3b são pequenos. Sendo assim, a

7

área 3b é a primeira etapa do processamento cortical da informação

somestésica (Kaas, 1983).

Figura 03: As diferentes áreas citoarquitetônicas em S1 de humanos. Em

A, as áreas somatossensoriais de primatas que se localizam no giro pós-

central. Humanos possuem quatro áreas citoarquitetônicamente distintas em

S1 (3a, 3b, 1 e 2) e cada uma delas possui uma representação completa da

superfície contralateral do corpo do animal. Em B, a organização laminar do

córtex descrita por Ramon y Cajal. Adaptado de Martin, 2003. Em

Neuroanatomy: Text and Atlas, McGraw Companies, Third Edition.

8

Devido a área 3a estar localizada entre a área motora (área 4 de

Brodmann) e a área 3b do córtex somestésico e enviar projeções para áreas

motoras, no giro pré-central, e também para a área 2 somestésica, alguns

autores a consideram uma área sensorial com alguma função motora (ver

Jones & Porter, 1980). As áreas 1 e 2 do córtex somestésico apresentam

suas respectivas citoarquiteturas com características de áreas corticais e são

bastante semelhantes entre si; tanto que é difícil discernir, apenas por

critérios anatômicos, onde acaba a área 1 e começa a área 2 (Krubitzer et al.,

2004).

As respostas neuronais para um dado estímulo somestésico ocorre em

células organizadas de maneira colunar em um espaço circunscrito do córtex,

desde a camada mais superficial, logo a baixo da piamater, até as células da

camada VI (Mountcastle at al., 1957; Mountcastle, 1995, 1997; 2003). Essas

colunas corticais são perpassadas por axônios tálamo-corticais, calosos e

intracorticais (para uma revisão, ver Mountcastle, 1997).

Como acontece em outros córtices sensoriais primários, S1 possui

representação magnificada de algumas regiões da periferia sensorial no

córtex cerebral, como por exemplo, as grandes vibrissas mistaciais de alguns

roedores (Krubitzer et al., 1986). Acredita-se que essa magnificação seletiva

esteja relacionada não só com diferenças regionais na densidade de

inervação periférica, mas também com fatores corticais intrínsecos (Welker &

Van der Loos, 1986; Catania, 1995).

A especialização da periferia sensorial possui uma contrapartida na

estrutura da representação cortical. Por exemplo, a representação do bico na

área R do ornitorrinco (Krubitzer, et al., 1995), os apêndices perinasais da

9

toupeira de nariz estrelado (Catania & Kaas, 1995), as grandes vibrissas

mistaciais, que são representadas no campo de barris de S1 de alguns

roedores, lagomorfos e marsupiais (Woolsey et al., 1975) (Figura 04).

Figura 04: A organização colunar é conservada durante a evolução dos córtices sensoriais de mamíferos. Desde os monotremados até primatas

há clara organização colunar do córtex cerebral e a presença de módulos de

processamento relacionados com os receptores da periferia sensorial. (A1,

A2) O ornitorrinco possui representação dos eletrorreceptores do bico do

animal no córtex cerebral. (B1, B2) No insetívoro topeira de nariz estrelado há

módulos de processamento sensorial que reproduzem, em S1, os apêndices

perinasais usados para tatear o ambiente. (C1, C2) Alguns roedores, como o

camundongo, também possuem módulos corticais em S1 que são chamados

de campo de barris. Em carnívoros, como o gato (D1, D2), e em primatas

como o macaco Rhesus (E1, E2), o sistema visual é organizado em colunas

de dominância ocular, colunas de orientação, além do sistema de blobs nas

espécies que apresentam visão em cores. Adaptado de Lubke & Feldmeyer,

2007.

Em roedores, S1 é subdividido nas áreas citoarquitetônicas Par1, FL e

HL (Wree et al., 1981, 1983, 1990; ver Figura 02). Estas áreas, como é a

característica do isocórtex, possuem seis camadas de células, com a camada

IV sendo chamada de camada de células granulares ou simplesmente

10

camada granular. Quando as camadas corticais de S1 de rato são analisadas

mais cuidadosamente, entretanto, observa-se que a camada IV não é

uniforme ao longo da extensão destas áreas, ocorrendo regiões onde há o

“empacotamento” de células granulares (zona granular) flanqueadas por

regiões onde a densidade de células é menor (zonas disgranulares) (Wree et

al., 1990). A área Par1 contém a representação contralateral da cabeça e da

face, enquanto FL e HL possuem a representação contralateral dos membros

anterior e posterior, respectivamente. Os agregados de células granulares da

camada IV da área Par1 são chamados de barris devido ao seu formato

tridimensional e a região entre barris é chamada de septo (Woolsey & Van

Der Loss, 1970; ver item 1.1.4 e Figuras 05 e 06). As áreas FL e HL também

contêm agregados celulares na camada IV, embora de formato mais irregular

que as dos barris da área Par1 (Figura 06).

11

Figura 05: A organização laminar do PMBSF de rato. Secções coronais de

S1 de rato adulto reagida para a histoquímica das enzimas NADPH-diaforase

(A) e citocromo oxidase (B). As setas brancas apontam para o barril; as setas

pretas apontam para o septo; os asteriscos mostram vasos sanguíneos; I-VI,

camadas corticais; SB, substância branca. Adaptado de Bahia, 2004.

12

Figura 06: Módulos corticais em S1 de ratos. Secções tangenciais do

encéfalo de rato adulto reagidas para a histoquímica da NADPH-diaforase

(A), e para a histoquímica da enzima citocromo oxidase (B). Note que em SI,

há regiões mais reativas às enzimas (barris), flanqueada por regiões menos

reativas (septo). SI: córtex somestésico primário; VI: córtex visual primário; AI:

córtex auditivo primário. Barra de escala 1 mm. Adaptado de Bahia, 2004.

13

Como é característico do córtex cerebral, a camada IV das regiões

granular e disgranular do S1 de rato são os alvos das aferências do tálamo

somestésico. Os principais núcleos aferentes são o núcleo ventral posterior

lateral (VPL), que transmite informação cutânea do tronco e membros e o

núcleo ventral posterior medial (VPM), que transmite informação da face e

cabeça para a região granular. Adicionalmente, S1 recebe aferentes do

núcleo posterior medial tálamo (POm), que se projeta para as regiões

disgranulares (para maiores detalhes ver Kim & Ebner, 1999; Figura 08).

1.1.3 - Áreas Somestésicas secundária e parietal ventral

A área somestésica secundária (S2), assim como S1, recebe aferências

sensoriais talâmicas diretas de VB, além de receber aferências diretas de S1

e, no caso de primatas, também recebe aferências das áreas 3a, 3b, 1 e 2

(Burton & Carson, 1986). Os neurônios de S2, por sua vez, enviam projeções

de volta para S1 e também fazem projeções para o córtex insular, corpo

amidalóide e hipocampo (Pons et al., 1987; 1992), sendo presumivelmente

uma via de retransmissão somestésica para o córtex límbico em mamíferos

(p. ex. primatas; ver Friedman et al., 1986). Seus neurônios respondem

robustamente a estímulos cutâneos superficiais, mesmo se o estímulo for

aplicado com baixa intensidade. Os primeiros estudos eletrofisiológicos

realizados no córtex somestésico do gato, no início da década de 1940, já

identificavam a existência de campos sensoriais distintos entre as áreas S1

área S2, sendo que os campos receptores de S2 são geralmente maiores do

que aqueles encontrados em S1 (ver revisão em Burton & Carlson, 1986).

14

Em termos citoarquitetônicos, S2 possui as mesmas seis camadas de

células que S1, embora não possua a mesma proporção de células

granulares na camada IV. A representação topográfica somestésica em S2

possui um mapa completo da periferia cutânea contralateral, com algumas

regiões do corpo apresentando magnificação preferencial, como a face, em

primatas e roedores (Burton et al., 1982; 1993; 1995). Esta magnificação em

S2, entretanto, não é tão dramática quanto em S1. A disposição topográfica

do mapa somatotópico em S2 é semelhante na maioria dos mamíferos

estudados: a representação da cabeça é localizada mais anterior e

medialmente que a cauda (Burton & Carlson, 1986). A destruição completa de

S2 leva a uma incapacidade permanente de discriminar objetos com base em

sua textura e também ocorre um prejuízo acentuado na discriminação de

objetos com tamanhos diferentes (Murray & Mishkin 1984).

Uma outra área somestésica, a área parietal ventral (PV), também é

ativada pela aplicação de estímulos cutâneos superficiais (Krubitzer et al.,

1986). PV faz limites com a região da face de S1 e a região da face e de

membros anteriores em S2. Semelhante a S2, a camada de células

granulares em PV não é tão desenvolvida quanto em S1. Os aferentes

talâmicos para PV são provenientes de outras subdivisões do tálamo basal,

tal como o núcleo ventral posterior inferior (VPI), em macacos (Qi et al., 2002)

(ver Figura 02).

15

1.1.4 - O córtex de barris em roedores

Alguns animais, como ratos e camundongos, constroem a

representação neuronal do seu ambiente com o auxílio da informação tátil

proveniente das vibrissas mistaciais. As vibrissas são utilizadas para

reconhecer as posições do chão, paredes e obstáculos, especialmente em

condições de baixa luminosidade (Carvell & Simons, 1990; para revisão ver:

Petersen, 2007). Quando as vibrissas tocam num objeto, esses animais

recolhem informações adicionais sobre suas características tais como

tamanho, forma e textura, através de um processo ativo de movimentos

oscilatório das vibrissas para frente e para trás, varrendo os objetos e

normalmente acompanhados de movimentos da cabeça (para uma revisão,

ver: Diamond et al., 2008).

Na área S1 desses animais, mais especificamente na região de

representação da face chamada de Subcampo Pósteromedial de Barris

(PMBSF: acrônimo, em inglês, Posteromedial Barrel Subfield), existem

agregados cilíndricos de células granulares chamados de barris (Woolsey &

Van der Loos, 1970; Welker & Woolsey, 1974; Woolsey et al., 1975). Os

barris maiores representam individualmente cada uma das vibrissas da face

do animal de maneira topograficamente ordenada e o padrão completo pode

ser demonstrado por diversos métodos anatômicos e/ou histoquímicos,

dentre eles a tradicional técnica de Nissl. Outros métodos incluem a

revelação da atividade das enzimas mitocondriais citocromo oxidase,

desidrogenase succínica e da enzima NADPH-diaforase (Wong-Riley & Welt,

1980; Killackey & Belford, 1979, Franca & Volchan, 1995; Pereira et al.,

2000). Apesar dos barris serem mais proeminentes na área citoarquitetônica

16

Par1 do rato, esses módulos de processamento sensorial também estão

presentes nas áreas FL e HL (Wree et al., 1990), que correspondem à

representação da pata anterior e da pata posterior, respectivamente (Dawson

& Killackey, 1987; ver Figuras 02, 05 e 06).

Ratos e camundongos apresentam barris que se distinguem entre si

com relação ao seu tamanho (os barris dos ratos são maiores), forma (mais

elípticos para os ratos e mais arredondados para os camundongos) e pela

estrutura interna, com os barris dos ratos sendo mais homogêneos em cortes

transversais, enquanto os dos camundongos possuem uma região central

com baixa densidade de células granulares (Welker & Woolsey, 1974). Além

de ratos e camundongos, os barris estão presentes em outras espécies de

mamíferos, como o hamster, o rato almiscarado, o porquinho-da-índia (todos

roedores de pequeno porte), em alguns insetívoros e alguns marsupiais

(Woolsey et al., 1975; Rice, 1985; Weller, 1993; Catania, 2002).

Assim como os demais módulos de processamento cortical, uma

questão básica acerca dos barris que permanece ainda não totalmente

esclarecida é sobre a sua função. Porém, uma constatação óbvia é de que

estes módulos podem aumentar a eficiência do processamento cortical ao

agrupar neurônios que lidam com o processamento de áreas sensoriais

adjacentes num mesmo espaço do córtex e assim excluir conexões de origem

topográficas inapropriadas. Esse tipo de organização pode permitir o máximo

de eficiência em conectar múltiplas áreas do encéfalo que processam

diferentes aspectos de informações sensoriais de um mesmo local do corpo

(para revisão ver Catania 2002).

17

1.1.5 – Das vibrissas ao córtex: as projeções para o córtex de barris

Desde os trabalhos pioneiros de Woolsey & Van der Loos, nos anos 70,

neurofisiologistas e neuroanatomistas têm canalizado esforços para entender

as vias neuronais que transmitem a informação desde as vibrissas até o

córtex de barris. Atualmente, o córtex de barris de roedores é um dos

modelos mais estudados nas neurociências, seja em trabalhos que abordem

o desenvolvimento do córtex cerebral, sua conectividade, plasticidade e

regeneração (Schubert et al., 2007; Alloway, 2008).

As grandes vibrissas mistaciais do ratos (também chamadas de

macrovibrissas) são dispostas numa organização espacial composta por

cinco fileiras, designadas de A a E, e vários arcos que são numeradas no

sentido caudo-rostral de modo que uma vibrissa individual possa ser

identificada pela coordenada de sua fileira e arco (como por exemplo, a

vibrissa C3, ver Figura 07). Esta disposição se repete em cada uma das

estações sinápticas na via ascendente, que se inicia nas vibrissas e chega ao

córtex cerebral, passando pelo tronco cerebral e tálamo, com uma clara

relação “uma vibrissa-um barril”. A combinação de métodos fisiológicos e

anatômicos demonstra que estímulos aplicados em uma vibrissa específica

ativa a coluna de neurônios num barril correspondente em S1 (Welker &

Woolsey, 1974; para revisão, ver: Diamond et al., 2008).

18

Figura 07: As vibrissas mistaciais do rato. Em (A), desenho esquemático

da disposição do conjunto de vibrissas. Em cada lado do focinho há cinco

fileiras (identificadas de A a E) e arcos (identificados por números). Em (B),

desenho esquemático do folículo de uma vibrissa cujos mecanorreceptores

conduzem as informações para os núcleos trigeminais que, por sua vez,

fazem projeções para o tálamo. Finalmente, as células talâmicas projetam

seus axônios para o córtex de barris em S1. Adaptado de DIamond et al.,

2008.

19

A estrutura que ancora as vibrissas na pele é chamada de folículo

(Figura 07). Os folículos são inervados pelo nervo trigeminal, cujas

terminações nervosas convertem a energia mecânica em potenciais de ação

(Dörfl, 1985). Uma vez que o estímulo tátil ativa a célula do folículo, esse sinal

viaja pelo ramo periférico do nervo trigeminal até chegar ao corpo das células

localizadas no gânglio trigeminal, no sistema nervoso periférico. A informação

sensorial propaga-se, agora no ramo central do nervo trigeminal, até o tronco

cerebral onde os axônios das células localizadas no gânglio do nervo

trigeminal fazem sinapses com as células dos núcleos do trigeminal. Nos

núcleos do trigeminal, está localizada a primeira estação sináptica das vias

somestésicas da região da cabeça, onde aglomerados de neurônios formam

estruturas chamadas de barriletes, cuja organização espacial assemelha-se à

disposição das vibrissas do focinho do animal (Clarke & Bowsher, 1962;

Veinante et al., 2000a, b). Os neurônios dos núcleos do trigeminal, por sua

vez, retransmitem as informações da vibrissa para o tálamo, através de duas

vias paralelas: a via lemniscal e a via paralemniscal (Deschenes et al.,

2005, ver Figura 08).

No rato, a via lemniscal faz sinapse no núcleo trigeminal principal (PrV).

Os neurônios de PrV projetam seus axônios para o núcleo ventral posterior

do tálamo (Peschanski 1984; Peschanski et al., 1984; Williams et al., 1994;

Veinante et al., 2000). No tálamo, o núcleo ventral posterior medial (VPM) é

considerado a principal via tálamo-cortical para a área de barris em S1. Lá,

um outro aglomerado de células organiza-se de modo semelhante à

disposição das vibrissas e são chamados de barrilóides (Killackey & Ebner,

1973; Pierret et al., 2000). Estudo utilizando injeções do neurorrastreador

20

Phaseolus vulgaris (PHA-L) em VPM de rato (Lu & Li,1993), demonstrou um

sítio denso de marcação anterógrada na camada IV, na camada III, na porção

mais profunda da camada V (também chamada de camada Vb), na camada

VI, em locais que correspondem a barris individuais de S1, e sem marcação

na região de septos (Akers & Killackey, 1978; Jessen & Killackey, 1987). Este

núcleo talâmico também envia aferências para S2 e outros núcleos

subcorticais (Chmielowska et al., 1989; Lu & Lin, 1993; Brecht, 2007; ver

Figuras 08 e 09).

A via paralemniscal tem sua primeira estação sináptica na porção

interpolaris do núcleo trigeminal espinhal (SpVi), cujos neurônios fazem

projeções topograficamente organizadas para a porção rostral do núcleo

posterior do tálamo (POm) (Erzurumlu & Killackey, 1980; Chiaia et al., 1991).

As células de POm, por sua vez, projetam seus axônios principalmente para a

camada IV da região de septos de tal modo que os terminais axonais de POm

localizam-se em regiões complementares àqueles do VPM (Koralek et al.,

1988; Figuras 08 e 09). O núcleo POm faz projeções menos densas para as

camadas supragranulares (camadas I, II e III), para a porção mais superficial

da camada V (também chamada de camada Va) da mesma coluna septal

(Pierret et al., 2000). Adicionalmente, em rato POm também faz aferências

para a área motora primário (M1), para S2, para a ponte, núcleo estriado

(Alloway, 2008; ver Figuras 08 e 09).

21

Figura 08. As vias lemniscal e paralemniscal. Em (A), fotomontagem das

vias periferia-trigeminal-tálamo até o córtex cerebral mostrando a via lemniscal

que vai de uma vibrissa-trigeninal-VPM-barril. A via paralemniscal segue pelo

trigeminal-POm-septo na camada IV de S1. Adaptado de Pettersen, 2001. Em

(B), esquema das aferências para o PMBSF. A via lemniscal, em vermelho, e

a via paralemniscal, em verde. Adaptado de Alloway, 2007.

22

Figura 09: As vias aferentes e eferentes do PMBSF. Diagrama esquemático

das vias trigeminais até o córtex somestésico (A) e das conexões aferentes e

eferentes a partir de S1 (B). Notar que a via lemniscal (em azul) está mais

restrita ao processamento sensorial enquanto a via paralemniscal (em verde)

está tanto relacionada com o processamento sensorial quanto também conduz

a informação sensorial para áreas motoras. Em vermelho, as conexões

calosas. Adaptado de Bahia, 2004; Alloway, 2008.

23

Esse arranjo mantém as vias lemniscal e paralemniscal relativamente

segregadas desde a periferia sensorial até o córtex de barris (Bureau et al.,

2006; para revisão Castro-Alamanco & Connors, 1997; Petersen, 2007; ver

Figura 09).

Outra diferença importante entre as duas vias é que a lemniscal

apresenta campos receptores relativamente pequenos, latência de resposta

curta (Chapin et al., 1987) e conduz exclusivamente informações sensoriais

oriundas das vibrissas (Brecht, 2007) enquanto a via paralemniscal possui

campos receptores relativamente grandes, apresenta uma latência de

resposta longa (Chapin et al., 1987) e conduz informações tanto sensoriais

quanto motoras que surgem durante os movimentos coletivos das vibrissas

quando o animal está exploração o ambiente (Sharp & Evans, 1982; Yu et al.,

2006).

1.1.6 – Circuitos locais no córtex de barris

O arranjo dos circuitos intrínsecos dos córtices sensoriais determina

suas propriedades funcionais, e diferentes estratégias evoluíram para integrar

a atividade que surge a partir das aferências da periferia sensorial para o

córtex cerebral (ver Catania, 2002). Em ratos, as vibrissas são representadas

na camada IV de S1 pelos barris que, por sua vez, são separados entre si por

regiões de septo, com baixa densidade de células granulares. Esses dois

domínios diferentes do córtex de barris recebem aferências de duas vias

distintas a partir da periferia sensorial (Kim & Ebner, 1999).

As projeções intracorticais originadas numa coluna de barril geralmente

são de curto alcance, terminando quase sempre nas bordas das colunas dos

24

barris adjacentes em uma mesma fileira (por exemplo, projeções do barril 3B

alcançam as bordas dos barris 2B e 4B) enquanto as projeções córtico-

corticais podem alcançar S2. Em contraste, as projeções intrínsecas oriundas

dos septos estendem-se por uma distância que corresponde ao tamanho de

dois ou três barris da mesma fileira ao longo de um septo (por exemplo, ao

longo da fileira “B”). Já as projeções córtico-corticais da coluna septal

alcançam a região disgranular anterior à fileira de barris “E” (ver Chapin et al.,

1988), a região do córtex parietal posterior e também os córtices motor

primário (M1) e S2 (para revisão ver, Petersen, 2007; ver Figuras 09 e 10).

Enquanto os barris são praticamente desprovidos de conexões laterais,

os septos apresentam muitas conexões laterais (horizontais) na camada IV,

conectando barris vizinhos (Brecht, 2007; Alloway, 2008). Isto indica que as

duas principais vias subcorticais que partem das vibrissas até chegar à S1

continuam como duas vias parcialmente segregadas no córtex cerebral

(Chepin et al., 1988; Kim & Ebner, 1999).

Os neurônios localizados na camada IV da coluna de barril fazem

projeções para as camadas supragranulares, diretamente acima do barril,

enquanto as células das camadas supragranulares fazem projeções para as

camadas infragranulares, assim como se projetam para outras regiões

corticais (p. ex. S2). Já as camadas infragranulares fazem projeções para

regiões subcorticais, mas também emitem axônios colaterais que chegam a

atingir as camadas supragranulares (Chapin et al., 1988; Kim & Ebner, 1999;

Figura 10).

25

Figura 10: Circuito do barril X circuito do septo. Diagrama esquemático

mostrando o resumo da organização da conectividade a partir da camada IV

da coluna de barril e da coluna de septo. Note que as vias lemniscal e

paralemniscal se mantém segregadas até a camada IV, onde as informações

trazidas pelas duas vias começam a ser juntadas. As setas vermelhas

indicam conexões do circuito de barris e as setas verdes indicam conexões

do circuito do septo (Adaptado de Alloway, 2008).

26

Enquanto o circuito da coluna do barril processa as informações

espaço-temporais dos objetos em contato com as vibrissas, o circuito

relacionado com as colunas de septo codifica a freqüência e outras

características cinéticas dos movimentos ativos das vibrissas (revisto por

Alloway, 2008). Então, de acordo com esta proposta, as aferências das

colunas dos septos modulam as regiões do cérebro que controlam as

vibrissas enquanto que tanto as colunas dos septos quanto as colunas de

barris processam cooperativamente o fluxo das informações para identificar

os estímulos externos encontrados pelas vibrissas (Brecht, 2007; Alloway,

2008). Por sua vez, as colunas de barris e de septo fazem a integração da

informação proveniente do ambiente nas camadas I e Va (Alloway, 2008).

Este padrão de conectividade é ditado, em grande parte, pela

arquitetura da arborização axonal e vários trabalhos mostraram que existem

diferentes classes de neurônios com diversos tipos de propriedades de

disparos de potenciais de ação (Porter et al., 2001; Bruno & Simons 2002;

Petersen et al., 2003; Schubert et al., 2003; Staiger et al. 2004) e os

neurônios do córtex de barris apresentam conexões e interações locais que

variam de acordo com a camada onde seus corpos estão localizados

(Sheperd et al., 2005; Shepherd & Svoboda 2005; Schubert et al., 2006).

Neste contexto, então, cada módulo dos circuitos colunares do córtex de

barris pode assegurar o processamento das informação físicas dos estímulos

táteis adquiridos pelas vibrissas (“o que”) enquanto transfere essas

informações para colunas e áreas vizinhas (“onde”) e a integração desses

circuitos pode permitir a combinação espaço-temporal dos estímulos físicos

(Simons, 1985; Shepherd & Svoboda 2005).

27

Negligenciando as células gliais, buscando a simplificação do circuito,

uma coluna cortical consiste de basicamente dois diferentes tipos de

neurônios: (a) neurônios excitatórios, que usam glutamato como seu principal

neurotransmissor e geralmente são neurônios de projeção e (b)

interneurônios inibitórios, que usam o ácido γ-aminobutírico (GABA) como

principal neurotransmissor e seus axônios ficam predominantemente dentro

da coluna cortical a qual a célula se encontra, ou mesmo dentro da camada

cortical onde está localizado o corpo da célula (Peters, 1984; Fairen et al.,

1998). Dependendo da região cortical, 75-85% dos neurônios são excitatórios

e 15-25% são interneurônios (Ren et al.1992; Beaulieu, 1993). Na camada IV,

podem-se distinguir três principais tipos de neurônios excitatórios: neurônio

piramidal, neurônio piramidal estrelado e o neurônio espinhoso (Jones, 1975;

Feldmeyer et al., 1999; Schubert et al., 2003; Staiger et al., 2004).

Neurônios estrelados são células cujo axônio colateral permanece

confinado à coluna formando uma densa e eficiente rede local que pode

funcionar como amplificador para os sinais provindos do tálamo e ainda

manter claramente segregadas as informações que chegam na camada IV do

córtex de barris (Petersen & Sakmann, 2000; Brecht & Sakmann, 2002;

Staiger et al., 2004). Os outros dois tipos de neurônios excitatórios da

camada IV do córtex de barris apresentam axônios para as outras camadas

de suas respectivas colunas corticais e, na maioria dos casos, fazem claras

aferências transcolunares (Elston et al., 1997; Petersen & Sakmann, 2000;

Stayger et al., 2004; Egger et al., 2007).

Os outros neurônios excitatórios do córtex exibem morfologia

somatodendrítica claramente uniforme, o que dá consistência ao termo

28

células piramidais. Os neurônios das camadas supragranulares (camadas II

e III) predominantemente fazem projeções axonais para áreas associativas,

através das comissuras e apresentam tufos oblíquos em seus dendritos

apicais (Staiger et al., 2004; Shepherd & Svoboda, 2005; Feldmeyer et al.

2006). Nas camadas infragranulares, os neurônios da camada Va exibem

morfologia homogênea e são densamente inervados por axônios intracolunar

e transcolunar de neurônios de sua própria coluna e por neurônios de outras

colunas. Então, estes neurônios podem ser funcionalmente caracterizados

como a primeira interface cortical, ou ponto de convergência, participando da

integração das vias lemniscal e paralemniscal (Feldmayer et al., 2005; Bureau

et al., 2006; Kleinfeld et al., 2006; Frick et al., 2008). Os neurônios piramidais

da camada Vb inervam alvos subcorticais não talâmicos (p. ex. núcleo

estriado, colículo superior e núcleos pontinos) e, em contraste com as células

da camada Va, esses neurônios mostram clara segregação entre as duas

vias tálamo-cortical, mantendo seus axônios confinados à sua coluna e

atravessando as várias camadas (Chagnac-Amitai et al., 1990; Larkman &

Mason, 1990; Mason & Larkman, 1990; Schubert et al., 2001; Molnar &

Cheung, 2006) e seus dendritos apicais atravessam todas as camadas

(Ghazanfar & Nicolelis, 1999; de Kock et al., 2007). Já as piramidais da

camada VI projetam seus axônios quase que exclusivamente para o tálamo

mas também fazem sinapses para outras camadas da mesma coluna (Jones,

1981; Kyllackey & Sherman, 2003; West et al., 2006 ).

Os neurônios das camadas corticais apresentam diferenças em relação

ao tamanho de seus respectivos campos receptores (CRs). Os mecanismos e

a exata conseqüência desse fenômeno ainda não estão esclarecidos.

29

Entretanto, tem-se assumido que quanto maior o campo receptor, maiores as

chances de integração das informações táteis (Armstrong-James & Fox,

1987). Então, neurônios da camada IV, os quais exibem menor campo

receptor, são basicamente limitados a processar as informações que vêm de

uma vibrissa específica. Já os neurônios das camadas supragranulares

exibem CRs maiores e suas células possuem substrato anatômico de

interações transcolunares (Petersen et al., 2003; Feldmeyer et al., 2006).

Finalmente, as piramidais das camadas infragranulares apresentam os

maiores campos receptores, o que pode significar mais integração entre os

diferentes aspectos da informação tátil capturado pelas vibrissas (Ito, 1985;

Simons & Carvell, 1989; Moore & Nelson, 1998; Manns et al., 2004).

Entretanto, alguns autores apontam possíveis correlatos anatômicos para as

diferenças no tamanho dos campos receptores, como a área de

espalhamento do dendrito apical (Larkum et al., 2001; Schubert et al., 2001) e

o tamanho das arborizações dendrítica/axonal (Gottlieb & Keller, 1997;

Staiger et al., 1999).

1.1.7 – As projeções eferentes do córtex de barris

O córtex de barris emite projeções eferentes para várias áreas corticais

como M1, S2, para a região ventral do córtex parietal e para o córtex de barris

contralateral (White & DeAmicis, 1977; Welker et al., 1988; Fabri & Burton,

1991a, b; Hoeflinger et al., 1995; Chakrabarti et al., 2008; ver Figura 09). A

partir do córtex de barris, também partem projeções para regiões motoras

subcorticais, como o núcleo estriado, a ponte e o colículo superior (Mihailoff

et al., 1985; Crandall et al., 1986; Welker et al., 1988; Mercier et al., 1990;

30

Brown et al., 1998; Alloway et al. 1999; Hoffer et al. 2005), assim como para

núcleos talâmicos e também para o tronco cerebral (Hoogland et al., 1987;

Chmielowska et al., 1989; Bourassa et al., 1995; Veinante et al., 2000 a, b;

Killackey & Sherman, 2003). Apesar dos inúmeros estudos, contudo, poucos

examinaram se a origem dessas projeções é a coluna do barril ou a de septo.

Se colunas de barris e de septo representam componentes distintos dos

circuitos que processam aspectos específicos das informações sensoriais

captadas pelas vibrissas, então é provável que as projeções a partir destes

dois domínios do córtex de barris conduzam informações distintas a partir de

S1. De fato, os dados disponíveis na literatura até o presente momento

mostram que há três padrões de projeções a partir do córtex de barris

(Chapin et al., 1987; Kim & Ebner, 1999). Um padrão é caracterizado por

projeções que se originam de neurônios predominantemente alinhados com a

região de septos na camada IV, cujos axônios terminam em regiões do

cérebro que são associadas com o sistema motor (Figuras 09 e 10). O

segundo padrão de projeções a partir do córtex de barris é caracterizado por

se originar em neurônios que estão distribuídos em S1 de rato e não estão

alinhados nem com colunas de septo e nem com colunas de barris e,

finalmente, o terceiro padrão de projeções cujos corpos celulares estão

localizados na coluna de barril (Chapin et al., 1987; Kim & Ebner, 1999;

Staiger et al., 1999; Petersen, 2007; Alloway, 2008).

31

1.1.8 - As conexões calosas no campo de barris.

Uma das principais características do neocórtex é a sua organização

em camadas de células onde cada uma delas possui conexões e funções que

diferem das outras (revisado em Jones & Hendry, 1980; Keller & White, 1989;

DeFelipe et al., 2002). Em mamíferos, o corpo caloso é a maior fonte de

comunicação entre as células dos dois hemisférios cerebrais, principalmente

entre as células das camadas supragranulares (II/III) e infragranulares (V/VI)

e em menor proporção, as células da camada granular (IV) (Ivy et al., 1984;

DeFelipe et al., 2002).

O córtex parietal de rato é subdividido em áreas que recebem densas e

específicas aferências talâmicas, fazem projeções córtico-corticais para áreas

do mesmo hemisfério e áreas que são conectadas através do corpo caloso -

por exemplo o córtex de barris (Wise & Jones, 1976a, b, 1978; Akers &

Killackey, 1978; Ivy et al., 1979, 1984) - cujos neurônios que projetam para o

hemisfério oposto estão distribuídos por todo o córtex de barris (Ivy et al.,

1984; Olavarria et al., 1984). Neurônios excitatórios, com clara morfologia

piramidal, são as principais células que realizam projeções calosas (Bayer &

Altman, 1991; DeFelipe et al., 2002), mas também existem neurônios

claramente com morfologia estrelada espinhosa (Ivy et al., 1984) e também

células GABAérgicas (Fabri & Manzoni, 2004) que mandam seu axônios até o

hemisfério oposto através do corpo caloso (Ramos et al., 2008).

No PMBSF, as células piramidais que conectam esse subcampo de

barris, via corpo caloso, estão localizadas preferencialmente nas camadas II-

III e V (Ivy et al., 1979; Ivy et al., 1984) com os terminais axonais localizados

nas camadas supragranulares das regiões septais contralaterais homólogas

32

(Hayama & Ogawa, 1996; Petreanu et al., 2007, Wang et al., 2007). Este

padrão de organização parece complementar ao padrão de organização das

aferências tálamo-corticais, que por suas vez, chegam preferencialmente no

centro dos barris (Olavarria et al., 1984).

Como descrito para o rato (Wise & Jones, 1976a, 1978) e recentemente

para o camundongo (Mitchell & Macklis, 2005), os corpos celulares dos

neurônios calosos encontram-se em regiões homotópicas ao local em que

seus respectivos axônios chegam no hemisfério oposto. No córtex de barris,

neurônios calosos marcados retrogradamente, a partir de injeções

contralaterais, foram sempre distribuídos em duas bandas horizontais que

correspondem às camadas supragranulares e infragranulares (Hayama &

Ogawa, 1996; Ramos et al., 2008; Figura 11). Apesar de sua morfologia ser

predominantemente piramidal, também houve relatos de neurônios estrelados

fracamente marcados por rastreadores neuronais retrógrados na camada

granular (Ivy et al., 1984).

33

Figura 11: Padrão de marcação retrógrada para o hemisfério contralateral no córtex parietal de rato. A marcação retrógrada é resultado

de injeção de neurorrastreador em animais com 25 dias de vida pós-natal.

Observe muitos neurônios marcados na camada Va (seta branca) no campo

de barris (delimitado pelas setas pretas). Note também muitas células

marcadas nas camadas supragranulares e somente algumas poucas células

marcadas na camada IV e na camada VI. Adaptado de Ivy & Killackey, 1982.

34

Os neurônios piramidais das camadas supra e infragranulares

aparentemente apresentam morfologia similar, não demonstrando diferir

quanto à complexidade de suas árvores dendríticas, porém o perímetro do

corpo celular entre essas duas populações de neurônios piramidais é

diferente, sendo os das camadas supragranulares maiores do que os das

camadas infragranulares (Ramos et al., 2008). Entretanto, os neurônios

calosos da camada V apresentam arborização do dendrito apical menos

complexa do que os dos neurônios da mesma camada que projetam para

outros alvos (Le Be et al., 2007).

O papel exato da atividade das células calosas na função cortical ainda

é assunto de discussão. No córtex de barris, neurônios calosos

provavelmente são ativados tanto por aferências subcorticais quanto por

aferências intracorticais e sendo assim, é possível que atividade permanente

das células calosas seja uma característica geral do processamento cortical

(Wiest et al., 2005).

Consistente com a proposta acima, estudo recente demonstrou que

após se estimular uma vibrissa, o córtex de barris no hemisfério contralateral

é ativado e, em menos de 20 milisegundos, há atividade cortical do campo de

barris do hemisfério ipsolateral à estimulação periférica (Ferezou et al., 2007).

A inibição da atividade no PMBSF do hemisfério contralateral ao estímulo

também inibe o componente ipsolateral da atividade cortical em região

homotópica (Shuler et al., 2001; 2002), assim como lesões unilaterais em S1

resulta em diminuição acentuada na atividade das células piramidais do

hemisfério oposto, localizadas homotopicamente à região de lesão (Rema &

Ebner, 2003). A atividade cortical provocada pela estimulação das vibrissas

35

mistaciais também tem sua ativação cortical reduzida nas camadas granular,

supragranular e infragranular após lesão no campo de barris do hemisfério

oposto (Rema & Ebner, 2003; Li et al., 2005; Figura 12).

1.2 - O corpo caloso e o “dogma da linha média"

Em várias espécies, as conexões calosas estão principalmente

localizadas na zona de representação da linha média da periferia sensorial.

No córtex somestésico primário, em particular, a maioria dos estudos

anatômicos e funcionais realizados até o momento revelou conexões calosas

concentradas nas zonas de representação das porções medianas do corpo

(rato: Akers & Killackey, 1978; macaco: Karol et al., 1970; Pandya et al.,

1971). No córtex visual primário, as conexões calosas estão principalmente

localizadas na zona de representação da linha média do campo visual

(Innocenti, 1982).

Esses dados indicam que uma provável função do corpo caloso seria

juntar as duas metades dos mapas corticais localizados nas áreas primárias

de cada hemisfério. De fato, estudos eletrofisiológicos demonstraram que a

secção do corpo caloso suprime o componente ipsolateral de campos

receptores que, uma vez estimulados em condições normais, provocam

respostas nos dois hemisférios cerebrais, sejam eles somestésicos ou visuais

(p. ex. ver Shuler et al., 2002). Já que uma organização similar também foi

observada no córtex motor primário, onde cada hemisfério manda sinais para

os motoneurônios que ativam os músculos do lado oposto do corpo, o

conceito da "linha média" tornou-se um verdadeiro dogma, até o ponto em

que a existência de conexões calosas fora das representações da linha

36

média nos córtices primários passou a ser minimizada ou mesmo negada na

literatura.

Entretanto, a periferia sensorial não é representada de maneira

contínua no córtex cerebral, havendo áreas onde a representação é

descontínua (Rocha et al., 2007), outras em que os neurônios apresentam

campos receptores com respostas multimodais (Rizzolatti, et al., 1981) ou

mesmo conexões calosas em regiões do córtex cerebral que não estão

relacionadas com receptores localizados na linha média do corpo (Hayama &

Ogawa, 1997). As conexões calosas nessas áreas claramente violam a regra

da linha média (Figura 12).

37

Figura 12: Evidências anatômicas, fisiológicas e funcionais da existência de conexões calosas fora de áreas de representação da linha média. Em

(A), injeção de WGA-HRP nos barris da representação das vibrissas do

focinho (A’) e nos barris da representação da pata anterior (A’‘) num

hemisfério e neurônios retrogradamente marcados no hemisfério oposto.

Adaptado de Hayama & Ogawa., 1998. Em (B), registro óptico da região de

S1 (ponto vermelho) e da região de M1 (ponto azul) após a estimulação da

vibrissa C2 da face direita. Adaptado de Ferezou et al., 2007. Em (C), sinal

“BOLD” evocado por deflexão de múltiplas vibrissas mistaciais da face

esquerda do animal numa freqüência de 10 Hz (C’) e a resposta “BOLD” nos

dois hemisférios (L: esquerdo, ipsolateral; R: direito, contralateral). Adaptado

de Alonso et al., 2008.

38

1.2.1 - As conexões calosas fora da representação da linha média.

Nas áreas secundárias ou associativas (visuais ou somestésicas), fibras

calosas conectam regiões de representação periférica - visuais, somestésicas

ou motoras. Entretanto, estudos mais recentes demonstraram que conexões

similares existem também nas áreas primárias, onde elas são realmente mais

escassas que as conexões ao longo das linhas médias (ex.: Koralek &

Killackey, 1990; Koralek et al., 1990; Hayama & Ogawa, 1997; Petreanu et al.,

2007; Wang et al., 2007).

No córtex somestésico primário, conexões calosas nas representações

de partes periféricas do corpo (membros, dedos e vibrissas mistaciais) foram

descritas em algumas espécies: rato (Akers & Killackey, 1979), roedores da

amazônia (Rocha et al., 2007), macaco (Pandya et al., 1971) e homem

(Maldjian et al., 1999a e b). Na década passada, um estudo demonstrou que

injeções de peroxidase de raiz forte (HRP) nas regiões de representação da

mandíbula e do maxilar em S1 do rato marcavam muitos corpos celulares e

terminais nas regiões homotópicas do hemisfério contralateral (Hayama &

Ogawa, 1997). Na região de representação das vibrissas, também houve

marcação de corpos celulares e terminais axonais contralaterais, porém em

menor quantidade. Recentemente, dados de eletrofisiologia (Ferezou et al.,

2007) e ressonância magnética (Karageorgiou et al., 2008) corroboraram

estes resultados (Figura 12).

39

Figura 13: Conexões calosas nas representações de partes periféricas

do corpo distantes da linha média. Desenho tridimensional (A) de terminal

axonal caloso e fotomicrografia (C,D) de um fragmento do axônio caloso tipo

II na área de representação da pata anterior da cutia. Um axônio tipo I (B)

com os detalhes de sua morfologia (E, F). Os boxes de (C) e (E)

correspondem à região ampliada nas fotomicrografias (D) e (F),

respectivamente. Essas conexões calosas estão na representação de partes

periféricas do corpo localizadas longe da linha média. Barra de escala A, B:

50mm; C e E: 20mm; D e F: 10mm. Adaptado de Rocha et al., 2007.

40

Mas, qual seria o papel fisiológico das conexões calosas na região das

vibrissas que, aparentemente, não obedecem ao dogma da linha média?

Recentemente, Shuler et al., (2001, 2002), utilizando métodos

eletrofisiológicos, demonstraram que o comportamento exploratório do rato

depende da integração espacial e temporal bilateral dos estímulos recebidos

nas vibrissas mistaciais. Por outro lado, as conexões calosas não apresentam

uma organização óbvia cujo princípio seja imposto diretamente de acordo

com a organização espacial da periferia sensorial a ainda sofrem influências

de conexões de circuitos locais, de projeções tálamo-corticais e córtico-

corticais (Innocenti, 2009).

Nas últimas três décadas, o uso de moléculas que funcionam como

rastreadores neuronais (p. ex. biocitina) em modelos experimentais, e mesmo

o aperfeiçoamento dos métodos de estudo por imageamento em cérebros

vivos, promoveram uma enorme melhoria na compreensão das conexões

calosas, os locais do córtex cerebral em que elas se encontram, assim como

os morfotipos neuronais que dão origem a elas, a trajetórias dos axônios que

passam pelo corpo caloso e o local onde esses axônios terminam (Carmeli et

al., 2007). Contudo, o papel funcional das conexões calosas permanece

controverso. Atualmente, atribui-se às conexões calosas a função de

sincronizar a atividade de grupos de neurônios nos dois hemisférios que

disparam potenciais de ação conjuntamente facilitando e/ou inibindo

respostas neuronais durante a percepção de estímulos periféricos, execução

de um comando motor ou durante processos cognitivos (Innocenti, 2009).

41

1.3 – Os neurônios calosos

Nos últimos anos, inúmeros trabalhos foram devotados ao

detalhamento anatômico, eletrofisiológico e funcional das conexões calosas,

em espécies não-humanas e também em humanos, e demonstrou-se que a

organização delas entre as áreas sensoriais e motoras é mais elaborada do

que se previa (Houzel, et al., 1999; 2002; Carmeli et al., 2007; Ferezou et al.,

2007; Innocenti, 2009). No caso das áreas sensoriais, as conexões calosas

parecem estar relacionadas ao reconhecimento das características distintas

de um objeto já que essa “construção” requer a interação entre as metades

esquerda e direita do cérebro, como conseqüência das especializações

hemisféricas (Innocenti, 1995; Innocenti et al., 1995).

Aparentemente, não há diferenças na complexidade da arborização

dendríticas das células calosas entre as que estão localizadas nas diferentes

camadas de uma mesma área cortical (Ramos et al., 2008). Já a arborização

axonal apresenta–se com diferentes diâmetros ao longo de seus ramos

(Houzel, et al., 1999) e com geometria radial e tangencial bastante variada

(Houzel et al.,1999; Rocha et al., 2007; ver Figura 13) sugerindo que as

interações entre os dois hemisférios podem usar diferentes canais e isso se

reflete nas diferenças morfológicas dos axônios calosos (Innocenti et al.,

1995).

Esses axônios calosos podem projetar um ramo colateral para a mesma

coluna em que se encontra o corpo celular (Houzel et al., 2002), ramifica-se

na substância cinzenta do hemisfério oposto, em região homotópica ao corpo

celular, não emite ramos colaterais, ramifica-se nas camadas infragranulares

e alcança as supragranulares (Houzel et al.,2002; Figura 14).

42

Figura 14: Neurônio caloso na representação do córtex visual de rato.

Reconstrução tridimensional de um neurônio caloso da parte mais medial de

V1. (A) visão coronal do cérebro do rato indicando, em ambos os lados, a

extensão médio-lateral de V1 (linha espessa preta) e a localização da

representação da linha média vertical (cabeça de setas). (B) ampliação do

desenho 3D do neurônio (cinza: corpo celular e árvore dendrítica; preto:

axônio). (C) vista dorsal do neurônio tridimensionalmente reconstruído obtido

após giro de 90 graus ao longo do eixo médio-lateral. (D) ampliação da vista

coronal mostrando o corpo celular (seta), a arborização dendrítica (cinza) e

do axônio colateral ascendente ipsolateral. Adaptado de Houzel et al. 2002.

43

Apesar das inúmeras informações que são geradas cotidianamente

sobre conexões calosas e o campo de barris em S1 de rato, a originalidade

deste projeto reside na combinação de métodos eletrofisiológicos,

histoquímicos e anatômicos, pela primeira vez utilizando a reconstrução

morfométrica completa de neurônios que realizam projeções calosas entre os

campos de barris de rato,

44

2 - Objetivos

O presente trabalho tem como objetivo reconstruir tridimensionalmente

os neurônios que realizam projeções calosas entre os campos de barris de

rato, abordando especificamente as seguintes questões:

2.1 – Objetivos específicos

(1) Qual a morfologia dos neurônios interhemisféricos em termos de:

• área do corpo celular;

• geometria da árvore dendrítica (comprimento linear dos dendritos,

área dendrítica, volume do campo dendrítico e complexidade

geométrica da árvore dendrítica);

• geometria da árvore axonal (comprimento linear axonal, área

axonal, volume do campo axônico, complexidade geométrica do

axônio e características dos terminais axonais como quantidade

total de botões, quantidade de botões de passagem e botões

terminais).

(2) Qual a topografia das conexões interhemisféricas estabelecidas por

neurônios individuais do PMBSF de rato?

45

3 – Métodos

Este projeto foi realizado nos Laboratórios de Neuroplasticidade,

Neurobiologia II e Fronteiras em Neurociências todos na UFRJ, e nos

Laboratórios de Neuroanatomia Funcional e de Neuroproteção e

Neurorregeneração Experimental na UFPA, sob orientação dos professores

Jean Christophe Houzel (UFRJ) e Antônio Pereira Júnior (UFPA).

Os motivos principais para escolhemos o rato como modelo

experimental são os seguintes: (1) este animal usa ativamente as vibrissas

durante a exploração do ambiente; (2) o córtex somestésico primário desse

animal apresenta módulos de processamento sensorial (barris) bem definidos

que correspondem às grandes vibrissas mistaciais, seguindo uma relação

topográfica precisa; (3) o rato possui um cérebro liso, o que facilita a

sobreposição dos mapas eletrofisiológicos com dados histoquímicos e

anatômicos e, por fim, (4) fácil disponibilidade.

3.1 – Animais experimentais

Neste projeto, utilizamos 84 ratos (Ratus norvegicus) machos da

linhagem Wistar (ver Tabela 01), criados no biotério do Instituto de Ciências

Biomédicas (ICB) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), com

idade entre 90 e 120 dias de vida e pesando entre 350 e 400 g. O uso e os

cuidados na manipulação dos animais seguiram as normas estabelecidas

pela Society for Neuroscience (Handbook for Use of Animals in Neuroscience

Research. Washington, D.C.: SfN, 1991. http://www.sfn.org).

46

Tabela 01

Traçador No de animais Com eletrofisiologia

Com NADPD-d

Com CitOx

Injeção Satisfatória

ComNissl

BDA 10KD

60

48 36

--

12 3

BDA 3KD

24

--

--

12

6

3

Total

84

48

36

18

18

6

Tabela 01. Resumo dos experimentos realizados.

47

3.1.1 - Preparação pré-cirurgica do animal e anestesia

Vinte e quatro horas antes da cirurgia, os animais foram pré-tratados

com 1,0 mg/Kg (IM) de dexametasona (Decadron, PRODOME), para evitar a

formação de edema no cérebro, durante e após o procedimento cirúrgico, e

1,0mg/Kg de vitamina K (Kanakion, Roche), para evitar sangramento

excessivo durante a cirurgia. No dia da cirurgia, aplicamos novas doses de

1,0 mg/Kg de dexametasona (Decadron, PRODOME) e 1,0mg/Kg de vitamina

K (Kanakion, Roche). Adicionalmente, aplicamos uma dose de 0,1mg/Kg (IM)

de sulfato de atropina (ARISTON) para diminuir a produção de muco nas vias

respiratórias.

Induzimos o estado anestésico com uma dose intramuscular (IM) de

100mg/Kg de cloridrato de cetamina (Ketalar, PARKER) e 1,5mg/Kg de

valium (Diazepan, ROCHE) mais 5mg/Kg (IM) do relaxante muscular

cloridrato de xilazina (Rompun, BAYER). Quando necessário, utilizamos

doses adicionais (1/3 da dose inicial) de cloridrato de cetamina (Ketalar,

PARKER).

3.1.2 - Procedimento cirúrgico

Durante o procedimento cirúrgico, os batimentos cardíacos foram

permanentemente monitorados num eletrocardiógrafo. A temperatura corporal

dos animais foi mantida em 37oC com o auxílio de um termômetro retal e um

colchão térmico (Homeothermic Blanket Control, Harvad, USA). Após

completa ausência de reflexos dolorosos, avaliada pelo pinçamento da pata,

os animais tiveram as cabeças fixadas num aparato estereotáxico (Narishig,

JAPÃO) com barras auriculares untados em gel de cloridrato de lidocaína 2%

48

(Xilocaína, ASTRA QUÍMICA FARMACÊUTICA). Após tricotomia da região

craniana, realizamos uma ampla incisão longitudinal na posição mediana do

couro cabeludo, expondo os músculos occiptofrontais e parieto-temporais, os

quais foram desinseridos da crista do osso parietal direito, assim como a

fáscia do músculo occipto-frontal foi desinserido dos osso occipital e frontal,

respectivamente. Com os ossos do crânio dorsal direito expostos,

realizávamos pequena abertura (1,5 a 2,0 mm de diâmetro), utilizando uma

broca odontológica, em local de coordenadas estereotáxicas a seguir: -2,0

mm posterior ao ponto de encontro entre as suturas coronal e sagital e 5,0

mm lateral à linha média (bregma), ou ainda 7,0 mm anterior ao ponto de

encontro entre as suturas sagital e lambdóidea (lambda), e 5,00 mm laterais à

linha média. Essas coordenadas correspondem à localização do PMBSF no

córtex cerebral de ratos Wistar. Para acessar o córtex cerebral do animal,

realizamos uma micro-incisão na duramáter, usando pinça de relojoeiro e

microtesoura íris, auxiliado por um estereomicroscópio cirúrgico (Sm 2001 –

Opto, BRASIL). Para evitar o ressecamento da superfície do córtex cerebral

exposto, utilizamos solução salina a 0,9% sobre o mesmo. Em alguns

animais, a atividade neuronal extracelular multiunitária foi registrada antes da

injeção de neurorrastreador (ver item 3.1.3).

3.1.3 - Registro eletrofisiológico

Em alguns animais (ver Tabela 1), realizamos o registro da atividade

extracelular multiunitária de neurônios usando microeletródios de tungstênio

(FREDERICK HAER Co. Inc., USA) revestidos com verniz, com ponta

exposta de cerca de 10 μm e impedância nominal de 9 a 12M Ohms(MΩ). O

49

eletródio foi posicionado na superfície cortical exposta com o auxílio de um

micromanipulador (Narishig, JAPÃO) e introduzido no parênquima cerebral a

1 mm ortogonalmente à superfície pial. Em cada penetração do eletródio,

registrávamos o sinal elétrico da atividade neuronal a 900 μm, 600 μm e 300

μm a partir da superfície pial. O sinal elétrico derivado dos neurônios e

capturado pelo eletródio foi enviado para um amplificador de alto ganho e alta

impedância (ME 04011 – FHC BRUNSWICK, USA), onde também foi filtrado

(numa banda entre 5 Hz e 50 Hz, para obtermos apenas os potenciais de

campo local e evitarmos artefatos durante o registro das respostas neuronais)

e finalmente enviado para um osciloscópio (1476A – BK PRECISION, USA) e

um monitor de áudio.

Após os procedimentos de craniotomia e de o eletródio estar dentro do

tecido cortical, na área correspondente ao PMBSF, estimulamos levemente a

superfície corporal do animal usando varetas de madeira. Fizemos a deflexão

dos pêlos da face e do corpo do animal, incluindo as vibrissas, e compressão

suave e manipulação dos membros (pata anterior e pata posterior).

Consideramos a ocorrência de resposta somestésica quando havia o

aumento do sinal eletrofisiológico multiunitário no monitor de áudio e o

aumento na freqüência de potenciais de ação observados no osciloscópio

concomitante à estimulação tátil da superfície do corpo do animal.

Os campos receptores foram delimitados de acordo com a presença do

aumento da freqüência das respostas neuronais ao toque da periferia

sensorial. Respostas neuronais relacionadas ao toque numa única vibrissa

sempre resultam em registro do barril correspondente àquela vibrissa.

Quando a atividade neuronal aumentava sua freqüência de disparos de

50

potenciais de ação em respostas ao toque em duas ou mais vibrissas

adjacentes, esse perfil se relacionou sempre ao registro de um ponto da

região de septo, correspondente à área entre as vibrissas estimuladas.

A partir da delimitação dos campos receptores, escolhemos então o

local para a realização da injeção do neurorrastreador dextrana-amina

biotinilada (BDA, Molecular Probes). As injeções do neurorrastreador BDA

foram realizadas iontoforeticamente (ver item a seguir) em três diferentes

profundidades e perpendiculares à superfície pial: 900 μm, 600 μm e 300 μm,

a partir da superfície pial. Entretanto, em alguns animais (ver Tabela 01)

usamos apenas coordenadas estereotáxicas para realizar as injeções do

neurorrastreador. Este procedimento foi adotado com o objetivo de realizar

uma pequena injeção e, conseqüentemente, alcançar o menor número

possível de células marcadas pelo BDA, o que facilita sobre maneira a

reconstrução das células marcadas.

3.1.4 - Injeção de neurorrastreador

Para a marcação neuronal, realizamos injeções iontoforéticas usando

micropipetas de vidro cuja ponta media entre 5-10 μm de diâmetro (as pontas

das pipetas foram medidas e selecionadas com o auxílio do sistema

Neurolúcida). Para preencher as pipetas com a solução de dextrana

biotinilada (BDA 10 %, peso molecular de 3 kD ou 10 kD, em PBS, Molecular

Probes), usamos uma seringa Hamilton de 5 μL. Durante as injeções

iontoforéticas, a passagem de microcorrente elétrica através da solução de

neurorrastreador foi conduzida por um filamento de prata, que ficava em

contato com a solução de BDA 10 % em PBS dentro da pipeta de vidro e que

51

se conectava à fonte geradora de microcorrente elétrica (Stoelting, NIH).

Então, as pipetas de vidro foram posicionadas ortogonalmente à superfície

pial e um micromanipulador introduzia a micropipeta no parênquima cerebral,

em região previamente selecionada (ver item anterior).

A expulsão das moléculas de BDA da micropipeta de vidro em direção

ao tecido cerebral foi realizada através de pulsos de microcorrente elétrica

durante 3 minutos (com pulsos de 3μA de corrente negativa com 7 s on, 7 s

off, para as injeções com grande marcação) ou ainda pulsos de corrente

negativa de 1,5μA durante 1,5 minutos com ciclos de 7 s on, 7 s off (Stoelting,

NIH, USA), para as injeções com pequena marcação, sem registro

eletrofisiológico prévio (ver Fig. 15). Após a injeção, as micropipetas de vidro

permaneceram inseridas no local da injeção por mais 5 minutos antes de

serem lentamente retiradas do parênquima cerebral, para evitar o refluxo do

neurorrastreador.

Ao final, as aberturas nos crânios foram recobertas com gelfoam

(Gelatina Absorvível, PHARMACIA) e vedadas com acrílico (Acrílico Auto-

polimerizante, JET). A pele foi então suturada e untada com pomada

bactericida (Nebacetin, BYK QUÍMICA) e, adicionalmente, aplicamos dose de

0,33 mL de antibiótico de largo espectro (Pentabiótico, ROCHE) para prevenir

infecções. Após recuperação do estado anestésico, devolvemos os animais

para as gaiolas no biotério, onde permaneciam por 10 dias (no caso de

injeção de rastreador retrógrado) ou por 15 dias (no caso de injeções de

rastreador anterógrado).

52

Figura 15: Resumo do desenho experimental. Diagrama esquemático

resumindo os procedimentos experimentais realizados durante o

desenvolvimento desta tese de doutorado: do registro eletrofisiológico à

reconstrução tri-dimensional.

53

3.2 - Preparação do tecido: perfusão, craniotomia e microtomia

Passado o tempo de sobrevida, os animais receberam dose letal de

1000 mg/Kg de cloridrato de cetamina (Ketalar, PARKER) e 15 mg/Kg de

cloridrato de xilazina (Rompun, BAYER) pela via intramuscular (IM). Após

verificar a ausência de respostas à estimulação dolorosa, realizamos uma

ampla abertura torácica. Obliteramos a aorta descendente, usando uma pinça

hemostática, e injetamos intraventricularmente 0,2 mL do anticoagulante

liquemine (Heparina Sódica, ARISTON). Usamos uma cânula ligada a uma

bomba peristáltica (Pump Controller, Chicago, USA) para perfusão, que se

iniciava com 200 mL de tampão fosfato 0,1 M e 0,9 % de NaCl (PBS; pH 7,4),

seguido por 300 mL de paraformaldeído tamponado 4 % (PFA, SIGMA).

Após a perfusão, os encéfalos foram retirados da caixa craniana e

estocados em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2) a 4 ºC. Finalmente, os encéfalos

foram cortados, em plano coronal, a 150 μm de espessura num vibrátomo

(Vibratome Serie 1000 - TED PELLA INC, USA). O plano coronal permitiu-nos

melhor visualizar tanto as camadas como as colunas de barris ou septo em

S1, além de podermos acompanhar os axônios das células anterogradamente

marcadas atravessando o corpo caloso, em direção ao PMBSF do hemisfério

oposto, durante o procedimento de reconstrução 3-D (ver item 3.5.1). Os

cortes foram então recolhidos em solução PB a 0,1 M e pH 7,4.

Antes dos procedimentos histoquímicos, as secções foram lavadas três

vezes em PBS 0,1 M, vinte minutos cada vez, para retirar o excesso de

fixador. Em seguida, os cortes foram incubados em solução para a

histoquímica que demonstra a atividade das enzimas NADPH-diaforase, ou

citocromo oxidase (CitOx), e/ou ainda incubados em solução contendo o

54

complexo avidina-biotina peroxidase (Kit ABC Elite, VECTOR LAB). Para

manter a seqüência correta dos cortes no sentido rostro-caudal, uma vez que

os encéfalos sempre foram cortados no sentido antero-posterior, usamos

cubas de acrílico, com 20 mm de espessura, que possuíam três fileiras de 4

poços, forradas por uma microtela. As cubas de acrílico permitiram deixar

todos os cortes boiando em contato com a mesma solução enquanto lavamos

o tecido e depois o processamos histoquimicamente (ver Figura 15).

3.2.1 - Histoquímica para demonstrar a atividade da enzima NADPH-

diaforase

Com o intuito de visualizar os barris do PBMSF, em alguns animais (ver

Tabela 1) utilizamos a marcação da atividade da enzima NADPH-diaforase

(NADPH-d), usando um protocolo adaptado de estudo anterior (Scherer-

Singler et al., 1983). Brevemente, os cortes foram previamente lavados em

PB 0,1 M durante 20 minutos. Esse procedimento foi realizado três vezes,

para retirar o excesso de fixador.

Em seguida, os cortes foram lavados em tampão TRIS (0,1M; pH 8,0)

durante 5 minutos; este procedimento foi necessário para ajustar o pH das

secções ao pH da solução de NADPH-diaforase. Finalmente, as secções

foram deixadas durante a noite toda em solução contendo 6 mg/mL de ácido

málico (REGEM), 1 mg/mL de β-nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

(β-NADPH, SIGMA), 0,4 mg/mL de cloreto de manganês (REGEM), 0,1

mg/mL de dimetilsulfóxido (DMSO, RIEDELl), 0,3 mg/mL de nitroblue

(SIGMA) e 1% de Triton X-100 (VETEC) sob agitação suave e constante,

protegido da luz e à temperatura ambiente. Quando observamos um padrão

55

bem definido de marcação do neurópilo em S1 (presença dos barris) com o

auxílio de um microscópio (Nikon, JAPÃO ; Zeiss, GERMANY),

interrompemos a reação com duas lavagens em tampão TRIS pH 8,0. Na

presença de β-NADPH , a enzima óxido nítrico sintase (NOS) reduz o

nitroblue tetrazolium à formazam, um sal de coloração azulada (Santer, 1994)

deixando o neurópilo e os neurônios nitridérgicos com coloração azulada.

Esta técnica evidencia os campos de barris em S1 de ratos, entre outras

estruturas.

3.2.2 - Histoquímica para demonstrar a atividade da enzima citocromo

oxidase

Em alguns animais (ver Tabela 1), utilizamos o padrão de marcação da

atividade da enzima citocromo oxidase no PMBSF de rato, segundo o

protocolo adaptado de estudo anterior (Wong-Riley & Welt, 1980).

Os cortes foram lavados durante cinco minutos em tampão fosfato 0,1

M (pH 7,4) para retirar o excesso de fixador e pré-incubados em solução

contendo 0,5 % de cloreto de cobalto (Sigma) durante 20 minutos.

Posteriormente, as secções foram incubadas numa solução contendo 0,05 %

de diaminobenzidina (DAB, Sigma), 0,02 % de catalase (Sigma) e 0,03 % de

citocromo C (Sigma) dissolvidos em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4), sob

agitação suave e constante, protegido da luz e à temperatura ambiente. A

cada 30 minutos, monitorávamos a reação utilizando um microscópio óptico.

Quando observamos um padrão bem definido de marcação do neurópilo em

S1 (presença de barris), interrompemos a reação com uma lavagem de 5

56

minutos em formalina 10%, seguido de uma lavagem de 10 minutos em

tampão fosfato 0,1 M e pH 7,4.

A citocromo C oxidase (CitOx) está localizada na membrana interna das

mitocôndrias de todos os eucariotos e é responsável por catalisar a

transferência de elétrons a partir da ferrocianina C para o oxigênio molecular,

gerando ATP e água (para uma revisão ver Wong-Riley, 1989). Sua estrutura

protéica possui de seis a treze subunidades, onde três grandes subunidades

(as subunidades I, II e III) originam-se do genoma mitocondrial, enquanto que

as demais subunidades são derivadas do genoma nuclear (para uma revisão

ver Wong-Riley, 1989; Di Ricco et al., 1989). Uma vez que o sistema nervoso

não possui reservas energéticas, depende criticamente do metabolismo

oxidativo e da enzima Citocromo C Oxidase em particular. O produto final do

metabolismo aeróbico da glicose, o ATP, é utilizado na síntese de

neurotransmissores e na ativação de bombas de íons que mantém o

potencial de repouso da membrana dos neurônios.

3.2.3 - Revelação do neurorrastreador (BDA)

Após microtomia, os cortes com espessura de 150 μm foram lavados

por 3 vezes (5 mim cada) em tampão fosfato salina (PBS) e pré-incubados

numa solução de tampão fosfato 0,1 M contendo 2 % de triton X100 (SIGMA)

(solução PBT 2%) durante 20 minutos. Esse procedimento ajuda a aumentar

a permeabilização do tecido para as etapas subseqüentes. Em seguida,

realizamos o bloqueio da peroxidase endógena do tecido nervoso lavando as

secções na solução de PBT contendo 2 % de peróxido de hidrogênio (diluição

volume/volume), durante 10 minutos, sob agitação suave e constante. Para

57

finalizar o bloqueio da peroxidase endógena, lavamos as secções novamente

em PBS 0,1M durante 20 minutos. Finalmente, as secções foram incubadas

no complexo avidina-biotina peroxidase (Kit ABC, VECTOR LAB, 1:200), em

PBT, por pelo menos 8 horas, sob temperatura ambiente em agitação suave

e constante.

Revelamos a peroxidase associada ao ABC utilizando o método da

glicose oxidase-diaminobenzidina-níquel (solução GND) proposto por e

adaptado para o protocolo da BDA (Shu et al., 1988), seguindo instrução do

fabricante (MOLECULAR PROBES). Antes de serem submetidos à solução

GND, as secções foram lavadas em tampão acetato 0,1 M (pH 6,0) durante

cinco minutos. A solução GND consiste de 1,25 g de sulfato de níquel

amoniacal (ALDRICH) diluído em 25 mL de tampão acetato 0,2 M pH 6,0

(solução A) e 25 mg de DAB (Diaminobenzidine, SIGMA) diluídos em 25 mL

de água destilada (solução B). Após homogeneização, as soluções A e B

podem ser misturadas, filtradas e acrescentadas de 100 mg β-D-Glucose

(SIGMA) e 20 mg cloreto de amônia (SIGMA). Inicialmente, as secções foram

incubadas em solução GND durante 5 minutos e, então, adicionou-se à

solução pitadas da enzima de glucose oxidase (SIGMA). O tempo de reação

foi controlado visualmente pela intensidade de marcação e interrompida com

lavagem em tampão acetato 0,1 M (pH 6,0), durante 10 minutos, sob agitação

suave e constante.

3.3 - Lavagem, desidratação e montagem

Após histoquímica, as secções foram recolhidas em PBS 0,1 M para

serem montadas seriadamente em lâminas gelatinizadas, deixadas para

58

secar em temperatura ambiente durante oito horas e desidratadas em bateria

de álcool com concentração de 50%, 70%, 80%, 90%, 100% e a 100%, 5

minutos cada, e clareadas por xileno em duas baterias de 5 minutos.

Finalmente, as lâminas foram cobertas com lamínula usando-se como meio

de inclusão entellan (Entellan, MERK).

3.4 - Coloração de Nissl no material sem contra-marcação de NADPH-

diaforase ou citocromo oxidase.

Para os animais cujas secções dos encéfalos não receberam contra-

marcação de NADPH-d ou CitOx, após a reconstrução 3-D das células

marcadas com BDA (ver item a seguir), as lâminas histológicas foram

desmontadas em xilol (SIGMA) durante 48 horas e re-hidratadas em bateria

decrescente de álcool (álcool e clorofórmio [1:1] durante 10 minutos; álcool a

100%, álcool a 95%, álcool a 76% todos durante 3 minutos), foram

brevemente lavadas em água destilada e colocadas em cresil violeta (a

0,25% em água destilada) à 370C durante 3 minutos seguido de lavagem em

água destilada novamente. Após isso, seguiram para álcool 75% (durante 3

minutos), álcool 95% por 10 minutos, álcool 95% mais clorofórmio (1:1)

durante 3 minutos, álcool 95% com algumas gotas de ácido acético durante 3

minutos (para remover o excesso de coloração), álcool 95% por 3 minutos

(para retirar o excesso de clorofórmio e ácido acético), álcool etílico 100%

mais álcool butílico 100% (proporção de 1:1) durante 3 minutos e, finalmente,

clareado com xilol por 5 minutos.

Este procedimento de coloração permitiu-nos visualizar as camadas

corticais e os barris de S1 do rato após a etapa de reconstrução 3-D das

59

células marcadas por BDA e, finalmente, adicionamos os contornos dos barris

e delimitamos as camadas corticais, usando o sistema Neurolúcida (ver item

a seguir) aos arquivos das células reconstruídas previamente e assim

pudemos determinar a exata posição dos corpos celulares e dos terminais

axonais em relação às colunas do PMBSF do rato (ver Figura 15).

3.5 - Documentação e análise dos dados

As lâminas histológicas, contendo as secções seriadamente

organizadas dos encéfalos de rato, após os experimento relatado

anteriormente, foram levadas à um microscópio óptico Axioplan (Zeiss,

GERMANY) para observação, em diferentes aumentos da marcação do

neurorrastreador. As células marcadas pelo BDA no PMBSF com projeções

córtico-corticais através do corpo caloso foram classificadas de acordo com

sua posição nas camadas corticais (supra granular, granular e infragranular)

segundo a marcação da CitOx ou NADPH-d ou ainda a coloração de Nissl.

As células que apresentaram corpos celulares e arborizações dendrítica

e axônica claramente bem preenchidas pelo BDA anterógrado e retrógrado

foram selecionadas para serem reconstruídas em 3D e terem sua

morfometria fina analisadas com o auxílio do sistema Neurolúcida (MBF

Bioscience). Cada uma das secções teve seu contorno externo desenhado,

as camadas corticais, os ventrículos e os vasos sanguíneos de maior calibre

(Figura 16). Este procedimento facilitou o alinhamento correto das secções

adjacentes, uma vez que tanto as células anterogradamente marcadas

quanto as células retrogradamente marcadas pelo BDA localizaram-se

sempre em mais de uma secção.

60

Figura 16: Contornos de pilha de secções seriadas. Em A, visão coronal e

em B, uma visão superior. Note os vasos sanguíneos (vermelhos) que, junto

com outras estruturas anatômicas, ajudaram a alinhar a pilha de seções do

encéfalo de rato.

61

3.5.1 – O Sistema Neurolúcida

Hoje em dia, são raros os casos em que apenas a análise qualitativa é

tão óbvia que possa comprovar, per se, os achados experimentais. Ao invés

disso, há necessidade de mais e mais análises quantitativas para se avaliar

modificações celulares e até subcelulares. No caso específico das

neurociências, torna-se cada vez mais necessária a análise de parâmetros

morfológicos finos dos neurônios tais como a área do corpo celular e do

campo dendrítico (isto é, área de ocupação dos dendritos); complexidade da

arborização dendrítica (como a dimensão fractal); número de varicosidades

dendríticas; viés (bias) dendrítico; área de arborização e complexidade axonal

(outra dimensão fractal); número e densidade de ramificações dos axônios;

ângulo das ramificações axonais; número de botões sinápticos, etc. A análise

desses parâmetros permite caracterizar diferentes populações de neurônios e

detectar até mesmo as mais sutis mudanças nas células nervosas.

Desenvolvido especificamente para as neurociências, o sistema

Neurolúcida (MBF Bioscience Inc, USA) (Figura 17) pode realizar o

mapeamento neuroanatômico, rastreamento de neurônios e reconstrução

seriada de secções do encéfalo e análise da morfometria fina dos neurônios.

Ele é composto pelo programa Neurolúcida, uma câmera digital (ou ainda

minimonitor Lucivid), uma platina motorizada com controlador de foco, mouse

ou tablet, um computador com Windows 2000 (ou versão posterior) e uma

impressora (ver Figura 17).

O sistema controla a platina motorizada, adicionada ao microscópio,

que conduz a navegação durante análise das preparações histológicos nos

62

três eixos (X, Y e Z), permitindo integrar um ilimitado número de secções de

encéfalo seriadamente ordenadas num único arquivo, mantendo cada secção

na posição espacial adequada (3D) para uma completa análise quantitativa,

via o programa de computador Neuroexplorer (MBF Bioscience Inc, USA).

É possível adaptar o sistema Neurolúcida a diferentes desafios ópticos

de imagens e/ou vídeos, como por exemplo em microscópios verticais,

invertidos, eletrônicos e mesmo os confocais. É possível usar qualquer tipo

de iluminação, incluindo campo claro, campo escuros, contraste de fase e

fluorescência. Neste trabalho, usamos microscópio vertical Axioplan (Zeiss,

GREMANY) com luz de transmissão. Características do sistema como a

correção de foco e o reposicionamento no centro do campo de visão quando

se mudam as lentes objetivas são preciosas para se ganhar tempo durante a

análise do material histológico, sejam eles com necessidade de pequeno ou

grande campo de visão.

Neste trabalho, realizamos a reconstrução tridimensional de neurônios

que conectam, via corpo caloso, os campos de barris do PMBSF de ratos

adultos. Para isso, realizamos a reconstrução seriada das secções de

encéfalos de ratos Wistar que receberam injeções iontoforéticas de BDA (de

transporte anterógrado ou retrógrado). As secções foram alinhadas usando

os acidentes anatômicos e os grandes vasos sangüíneos como referências

(ver Figura 16). Em cada secção, desenhamos o contorno externo (superfície

pial), os ventrículos e os grandes vasos sanguíneos. Considerando-se o eixo

antero-posterior, para cada uma das secções fizemos os contornos da porção

mais anterior (sempre em contato com a lamínula) e o contorno da porção

mais caudal da secção (sempre em contato com a lâmina).

63

Figura 17: O Sistema Neurolúcida. Em (A), desenho esquemático de um

sistema Neurolúcida com o minimonitor Lucivid. Em (B), fotografia de um

sistema Neurolúcida com câmera digital de alta resolução. 1: microscópio

vertical; 2A; minimonitor Lucivid acoplado ao microscópio; 2B: câmera digital

acoplada ao microscópio; 3: platina motorizada; 4: controlador da platina

motorizada; 5: joystick; 6, 6B.1 e 6B.2: monitores de vídeo; 7: computador; 8:

mouse.

64

Quando as lâminas estavam posicionadas na platina as imagens foram

enviadas pelo minimonitor Lucivid, que superpõe as imagens da tela do

computador com as imagens que são projetadas nas oculares, ou as imagens

foram enviadas para monitores digitais, com o auxílio de uma câmera digital

de alta resolução acoplada ao microscópio. Desenhamos, então, os axônios

que atravessavam o corpo caloso em direção ao PMBSF contralateral ao

corpo celular. Após desenhar todo o terminal axonal, voltamos a seguir o

axônio a partir do corpo caloso, agora em direção ao corpo celular localizado

próximo ao sítio de injeção. Após a reconstrução do corpo celular, fizemos a

reconstrução tridimensional da arborização dendrítica.

Os neurônios marcados retrogradamente foram desenhados a partir

dos corpos celulares, arborização dendrítica e axônios proximais, até

entrarem na substância branca, no PMBSF do hemisfério oposto ao sítio de

injeção. Em média, os neurônios calosos do PMBSF de ratos tinham seu

corpo celular, arborização dendrítica, axônio e terminais axonais dispostos de

três a seis secções consecutivas do encéfalo. Finalmente, os arquivos

gerados pelo programa Neurolúcida foram abertos no programa

Neuroexplorer, onde extraímos os dados das características morfométricas

das células reconstruídas. Os resultados foram então plotados em planilhas

do programa Biostat (Mamirauá, UFPa) e analisados estatisticamente (ver

Figura 15 para resumo dos métodos) .

3.5.2 – Análise estatística

Os neurônios calosos do PMBSF marcados retrogradamente foram

divididos em três diferentes populações, de acordo com sua localização laminar

65

(supragranular, n=10; granular, n=10; infragranular, n=10) e as características

morfométricas como a área de corpo celular, o comprimento linear dos

dendritos, a área dendrítica, o volume do campo dendrítico e a complexidade

geométrica da arborização dendrítica foram comparadas entre as três

populações usando-se a analisadas variância (ANOVA) com α=5% e pós teste

de Tukey. Para comparar essas mesmas características morfométricas, mas de

acordo com a disposição colunar do PMBSF, os células calosas (CC) foram

subdividas de em: coluna de septo e coluna de barril e usamos o teste t de

Student, com α=0,05.

Para comparar as características morfométricas dos axônios calosos do

PMBSF de rato, 10 células (n=10) marcadas anterogradamente foram

totalmente reconstruídas com o auxílio do sistema Neurolúcida e as mesmas

foram divididas de acordo com a posição colunar do corpo celular no PMBSF:

coluna de septo e coluna de barril. Nessas duas subpopulações, analisamos

o comprimento linear dos axônios, área axonal, o volume do campo axônico,

a complexidade da arborização axonal e a quantidade de botões sinápticos

(de passagem e terminais) utilizando o teste t de Student, com α=0,05, para

comparar as duas subpopulações.

66

4 – Resultados

4.1 – Os sítios de injeção

As injeções iontoforéticas de BDA 3 kD e 10 kD, precedidas de registro

eletrofisiológico extracelular multiunitário, promoveram marcação

predominantemente retrógrada e anterógrada, respectivamente. Entretanto,

dos 84 experimentos realizados neste estudo (ver Tabela 1), usando-se os

mesmos parâmetros nas injeções iontoforéticas (mesmo tempo de pulsos,

polaridade e intensidade da corrente elétrica, mesmo tempo de sobrevida dos

animais e mesma concentração do BDA, ver Métodos), os sítios de injeção

variaram desde sítios muito pequenos, com pouca marcação celular, a sítios de

injeção muito grande que inviabilizaram a reconstrução de células isoladas

(Figura 18).

67

Figura 18: Sítios de injeções não utilizados para a reconstrução 3-D. Em

(A) e (B), injeções que resultaram em sítios grandes e, sendo assim,

inviabilizam a reconstrução 3D devido ao fato de vários dendritos e axônios, de

diferentes células, sobreporem-se uns aos outros. Entretanto, há boa marcação

das conexões córtico-corticais ipsolaterais (setas) a serem analisadas. Em (C),

um sítio de injeção em que BDA não marcou adequadamente, C’ é um

aumento da área C e C” é a ampliação da área em C’.

68

Para a reconstrução em 3D do material histológico no sistema

Neurolúcida, as secções foram primeiramente observadas sob microscopia

óptica e selecionadas de acordo com a presença de corpos celulares,

arborizações dendríticas bem preenchidas (com presença ou não de espinhas)

e arborização axonal com axônios que seguiam em direção ao corpo caloso,

atravessando a linha média em direção ao PMBSF do hemisfério contralateral

e apresentavam terminais axonais bem evidentes, com presença de botões

sinápticos.

As células marcadas pelo BDA retrógrado foram contadas (total de 4160

células), no hemisfério contralateral ao sítio de injeção. Desenhamos os

contornos da superfície pial e dos ventrículos encefálicos e reconstruímos os

neurônios retrogradamente marcados a partir do corpo celular, arborização

dendrítica e parte do axônio que seguia em direção à substância branca. Após

a contagem e a reconstrução dessas células, as lâminas foram desmontadas

em xilol e processadas para a coloração de Nissl. Após serem remontadas,

usamos as lâminas para adicionar os contornos dos barris.

Para a marcação anterógrada, selecionamos os casos em que o sítio de

injeção foi pequeno e que apresentavam células bem preenchidas pelo BDA

com corpos celulares, arborizações dendríticas bem preenchidas (com

presença ou não de espinhas) e arborização axonal com axônios que seguiam

em direção ao corpo caloso, atravessando a linha média em direção ao PMBSF

do hemisfério contralateral e apresentavam terminais axonais bem evidentes,

com presença de botões sinápticos (Figura 19). Após a reconstrução desses

neurônios, as lâminas foram desmontadas em xilol e processadas para a

coloração de Nissl, para visualização dos barris.

69

Figura 19: Injeções iontoforéticas de BDA adequadas para reconstrução

3D. Superior, fotomicrografia de uma secção com injeção iontoforética de

BDA anterógrado. Em (a), os axônios da células marcadas em direção à

substância branca e seguindo em para o corpo caloso, em (b), na substância

branca do hemisfério contralateral ao sítio de injeção, em (c), e os axônios

calosos arborizando em região homotópica do córtex de barril contralateral ao

sítio de injeção, em (d). A barra de escala de a também se aplica em b, c e d.

70

4.2 – Análise qualitativa das células calosas do PMBSF de rato

4.2.1 – A distribuição laminar das células calosas retrogradamente

marcadas

As injeções iontoforéticas de BDA 3 kD resultaram em ampla marcação

retrógrada de corpos celulares em regiões próximas ao sítio de injeção

(PMBSF), em áreas mais laterais à S1, correspondentes à S2 e PV, células

aferentes do núcleo VB do tálamo e também no PMBSF contralateral ao sítio

de injeção (Figura 20).

(1) No hemisfério oposto ao sítio de injeção, as células calosas (CC)

distribuíram-se por todas as camadas do PMBSF, sendo que as camadas

supragranulares apresentam mais células marcadas.

(2) Na camada granular, as células marcadas estavam distribuídas por

todo o plano tangencial, indicando que nessa camada há células que fazem

conexões calosas localizadas tanto na coluna de septo quanto na coluna de

barril.

(3) As camadas infragranulares apresentaram menores quantidades de

células marcadas pelo neurorrastreador e essas células localizaram-se

principalmente na camada V. Algumas poucas células marcadas

retrogradamente localizaram-se na camada VI (ver Figuras 20).

71

Figura 20: Injeção de BDA retrógrado e a marcação no PMBSF do

hemisfério contralateral. Em (A), seções organizadas seriadamente

mostrando o sítio de injeção (hemisfério esquerdo). Em (B), uma secção

superposta com a figura do atlas Paxinos, demonstrando o sítio de injeção na

área correspondente ao PMBSF do córtex somestésico de rato. Em (C),

ampliação do sítio de marcação no hemisfério contralateral em local

homotópico ao sítio de injeção. Em (D), ampliação da área verde, mostrando

neurônios piramidais calosos supragranulares marcados retrogradamente por

BDA.

72

4.2.2 – A localização laminar e a arborização dendrítica das células

calosas

As CC marcadas retrogradamente nas camadas supragranulares

apresentaram arborização dendrítica exuberante, com ramos que alcançaram

até a sexta ordem, espalhamento extenso da árvore dendrítica, dendritos

apicais que alcançaram a camada I (intensamente ramificados) e todas as

células reconstruídas apresentaram espinhas dendríticas.

As CC marcadas retrogradamente na camada granular apresentaram

arborização dendrítica pouco extensas e claramente menor que as CC das

camadas supragranulares e infragranulares, com ramos que alcançaram até

terceira ordem e nenhuma célula apresentou espinhas dendríticas.

As CC marcadas retrogradamente nas camadas infragranulares

apresentaram arborização dendrítica exuberante, com ramos que alcançaram

até a quarta ordem, espalhamento extenso da árvore dendrítica, dendritos

apicais longos que emitiam vários ramos, e células com e sem espinhas

dendríticas.

4.2.3 – Os axônios calosos do córtex de barris

As injeções iontoforéticas de BDA 10 kD promoveram marcação

predominantemente anterógrada. Algumas células marcadas enviavam

axônios para regiões laterais à S1 no mesmo hemisfério (correspondendo à

S2, PV e PR). Nenhuma célula calosa reconstruída fez projeções para outras

áreas ipsolaterais ao corpo celular. Usamos os axônios que se projetaram

para outras áreas ipsolaterais, mas que alcançaram distância semelhante a

73

percorrida pelos axônios calosos, como parâmetro para se determinar o

adequado transporte intracelular do neurorrastreador (Figuras 21 e 22) .

Figura 21: Marcação, por BDA de transporte anterógrado, no mesmo

hemisfério do sítio de injeção. Secção do encéfalo de rato que recebeu

injeção iontoforética de BDA numa coluna de barril (em (A), cabeça de seta) e

as projeções a partir da coluna de barril para o hemisfério ipsolateral. Em (B),

as fibras da coluna de barril penetrando na substância branca, em (C)

terminais axonais que se projetaram para S2, em (D) terminais axonais que

projetaram para PV. Alguns terminais axonais chegando numa área próxima

a fissura rinal (E).

74

Figura 22: Marcação, por BDA de transporte anterógrado, no hemisfério

contralateral ao sítio de injeção. Hemisecção do encéfalo de rato (A’),

contralateral ao sítio de injeção iontoforética de BDA, mostrando as fibras

passando pelo corpo caloso (B’) e terminais axonais chegando ao PMBSF do

hemisfério contralateral ao sítio de injeção (C’).

75

Os terminais axonais calosos no PMBSF oposto inervaram regiões

homotópicas ao corpo celular e foram restritos ou à coluna de septo ou à

coluna de barril. Esses terminais axonais ramificaram-se na camada granular

mas também atingiram as camadas supragranulares, independentemente da

posição laminar do corpo celular, e apresentaram um grande número de botões

sinápticos, com uma clara predominância de botões de passagem em relação

aos botões terminais.

Os terminais das CC dos barris sempre ocupavam a coluna do barril

correspondente à do corpo celular, enquanto os terminais provenientes de

septo inervaram regiões septais no hemisfério contralateral localizadas ao

entorno da linha de barril mais próxima em relação a posição do corpo celular

de origem.

4.3 – Análise quantitativa: as características morfométricas das células

calosas do PMBSF de rato

4.3.1 – Distribuição laminar.

As injeções iontoforéticas de BDA 3 kD no PMBSF de ratos produziram

ampla marcação retrógrada próxima ao sítio de injeção, em regiões ipsolaterais

ao sítio de injeção (S2, PV, PR), no hemisfério contralateral e também no

tálamo, em região correspondente ao núcleo VB (Figura 23).

76

Figura 23: As células calosas do PMBSF marcadas retrogradamente. Em

(A), fotomicrografia de uma secção do PMBSF com células marcadas

retrogradamente. Em (B), fotomontagem dos desenhos no sistema

Neurolúcida e de fotomicrografia da região do PMBSF marcada

retrogradamente. Em (C), montagem de uma pilha de desenhos, com os

barris, e fotomicrografia de parte do sítio de injeção de BDA e marcação

retrógrada no tálamo. Em (D), reconstrução 3D de uma pilha de secções.

Cada ponto colorido corresponde a uma célula marcada. Note que houve

marcação em todas as camadas, sugerindo que há células calosas nas

colunas de septo e de barris.

77

A distribuição laminar das células calosas do PMBSF de rato é a seguinte

(Figuras 24):

• Camadas supragranulares: apresentaram a maior quantidade de células

calosas (850 + 18 células; n=3);

• Camada granular: apresentou quantidade intermediária de células

calosas (411 + 43 células; n=3);

• Camadas infragranulares: apresentaram a menor quantidade de células

calosas (110 + 19 células; n=3).

As médias dos números de CC foram comparadas usando-se análise de

variância (ANOVA) e o resultado aponta que há diferença estatisticamente

significativa entre os valores médios da distribuição laminar das CC no PMBSF

de rato (p<0,05, ANOVA; ver Figuras 24).

78

Figura 24: Distribuição das células calosas no PMBSF de rato. Em (A), a

distribuição laminar das células calosas do PMBSF que se localizaram

principalmente nas camadas supragranulares (850 + 18), seguidas da

camada granular (411 + 43) e, finalmente, nas camadas infragranulares (110

+ 19; ANOVA, p<0,05*). (B) Na camada granular (camada IV), as células

calosas localizaram-se preferencialmente na região septal do que dentro dos

barris (276 + 14, 138 + 12, respectivamente; teste t, p<0,0002***).

79

4.3.2 – Distribuição das células calosas na camada IV do PMBSF.

A distribuição colunar das 4160 CC no PMBSF foi avaliada apenas na

camada IV, em virtude da precisão da transição entre septo e barril:

• Coluna de septo: apresentou maior número de CC marcadas (276 + 14

células; n=3);

• Coluna de barril: apresentou menor número de CC marcadas (138 + 12

células; n=3).

Os valores médios das CC localizadas nas colunas de septos ou nas

colunas de barris foram comparados com o teste t de Student que apontou

diferença estatisticamente significativa entre as duas distribuições na camada

granular (camada IV) do PMBSF (teste t, P<0,0002) (Figura 24B).

Resumindo, no córtex de barris as CC encontram-se localizadas em todas as

camadas do PMBSF, com predominância nas camadas supragranulares,

seguida da camada granular e, em menor quantidade, nas camadas

infragranulares. Na camada granular (camada IV), há predominância de CC

na coluna de septo em relação às colunas de barris.

4.3.3 – Características morfométricas do corpo celular e da arborização

dendríticas das CC do PMBSF

Para análise da morfometria fina das CC, reconstruímos 10 neurônios

de cada camada (sendo cinco células para coluna de septo e cinco para a

coluna de barril) com o auxílio do Sistema Neurolúcida (Figuras 25, 26, 27 e

28).

80

Figura 25: Neurônio caloso supragranular marcado retrogradamente. Em

(A), fotomicrografia mostrando o corpo celular, parte da arborização

dendrítica e o axônio (setas) de um neurônio caloso supragranular. Note a

arborização dendrítica exuberante. Em (B), aumento do boxe em (A),

mostrando parte do dendrito apical com presença de espinhas dendríticas

(cabeças de seta).

81

Figura 26: Neurônio caloso granular marcado retrogradamente. Em (A),

fotomicrografia mostrando o corpo celular, parte da arborização dendrítica e o

axônio (setas) de um neurônio granular caloso. Note a arborização dendrítica

com poucos ramos basais e também no dendrito apical. Essas células não

apresentam espinhas dendrítica. Em (B), maior aumento do boxe em (A),

mostrando o corpo celular e parte proximal dos dendritos basais e do dendrito

apical (cabeças de seta).

82

Figura 27: Neurônio caloso infragranular marcado retrogradamente. Em

(A), fotomicrografia mostrando o corpo celular, parte da arborização

dendrítica e o axônio (seta) de um neurônio infragranular caloso. Note a

arborização dendrítica que é mais exuberante em relação aos neurônios

granulares. Em (B), aumento do boxe em (A), mostrando o corpo celular e

parte dos dendritos basais e do dendrito apical (cabeças de seta).

83

Figura 28: Neurônios calosos reconstruídos em 3D. Um aglomerado de

neurônios calosos marcados retrogradamente por BDA (A) e subdividido por

camadas em (B). Azul corresponde às camadas supragranulares, laranja

corresponde à camada granular e verde às camadas infragranulares. Note a

exuberância das células supragranulares em relação as demais.

84

No total de 30 células reconstruídas e analisadas, as características

morfométricas das CC na distribuição laminar foram as seguintes:

• A área do corpo celular das CC nas camadas supragranulares (151, 4 +

38,36 μm2; n=10), granular (151,3 + 28,43 μm2; n=10) e infragranulares

(142,2 + 20,16 μm2; n=10) foi semelhante entre elas ( ANOVA, p>0,05;

Figura 29);

• O comprimento dendrítico linear foi muito maior nas camadas

supragranulares (2629,0 + 467,1 μm; n=10), menor na camada granular

(142,2 + 6,37 μm; n=10) e de tamanho intermediário nas camadas

infragranulares (217,5 + 37,55 μm; n=10). Houve diferença

estatisticamente significativa para essa característica morfométrica entre

as três subpopulações (ANOVA, p<0,05);

• A área de arborização dendrítica também foi maior nas células das

camadas supragranulares (4149 + 649 μm2; n=10), menor nas células

da camada granular (137 + 23 μm2; n=10) e de tamanho intermediário

nas células das camadas infragranulares (646 + 132 μm2; n=10),

diferindo significativamente entre as três subpopulações de CC (ANOVA,

p<0,05);

• O volume da arborização dendrítica foi maior nas células

supragranulares (3709788 + 201000 μm3; n=5), nas células da camada

granular (14625 + 10592 μm3; n=10) e infragranulares (1112913 +

126800 μm3; n=10), também diferindo significativamente entre as células

das três camadas (ANOVA, p<0,0001);

• E, finalmente, a complexidade geométrica das células das camadas

supragranulares (1,179 + 0,18 k-dim; n=10) foi sempre maior que na

85

camada granular (1,059 + 0,03 k-dim; n=10) e camadas infragranulares

(1,100 + 0,05 k-dim; n=10 e ANOVA, p<0,05; Figura 31).

Figura 29: Tamanho do corpo celular na distribuição laminar das células

calosas do PMBSF de rato. A área de corpo celular foi semelhante entre as

células das camadas supragranular, granular e infragranular (151 + 38; 151 +

28; 142 + 20 μm2, respectivamente; ANOVA, p>0,05).

86

Figura 30: Características morfométricas da arborização dendrítica. Em

(A), a soma linear de todos os ramos do dendrito diferiu entre as células das

camadas supragranulares, granular e infragranulares (2629+467, 142+6,

217+37 μm, respectivamente; ANOVA; p<0,0001***; p<0,05*), soma das área

dos segmentos dendríticos em (B) (4149 + 649, 137 + 23, 646 + 132 μm2,

respectivamente; ANOVA, p<0,0001***; p<0,05*) o volume que a arborização

dendrítica ocupa no espaço em (C) (3709788+2101000; 14625+10592;

1112913+126800 μm3, respectivamente;ANOVA, p<0,0001***; p<0,05*). A

complexidade geométrica da arborização dendrítica diferiu significativamente

apenas entre as células das camadas supragranulares da camada granular,

em (D) (ANOVA, p<0,05*), e não foi diferente entre as células das camadas

supragranulares e infragranulares e entre as células das camadas granula e

infragranulares (1,179 + 0,18, 1,059, 1,100+ 0,05 k-dim, respectivamente;

ANOVA, p<0,05*; p>0,05).

87

Após adicionarmos os contornos dos barris do PMBSF às reconstruções

da série de secções coronais, foi possível então dividir as células marcadas

pelo neurorrastreador retrógrado de acordo com a posição colunar do corpo

células: coluna de septo ou coluna de barril (Figuras 31, 32) e assim analisar as

características morfométricas das CC do PMBSF de rato de acordo com sua

distribuição colunar:

• A área do corpo celular nas colunas de septo e de barril das camadas

supragranulares (131,0 + 19,25 μm2 e 150,2 + 15,81 μm2,

respectivamente; n=10), camada granular (153,4 + 22,03 μm2 e 148,0 +

19,95 μm2, respectivamente; n=10) e camadas infragranulares (168,3 +

16,83 μm2 e 140,2 + 18,63 μm2, n=10; respectivamente) não diferiram

entre as duas colunas (teste t, p>0,05 para todas as comparações);

• O comprimento dendrítico linear das CC nas colunas de septo e de barril

das camadas supragranulares (2791 + 933,5 μm e 2080 + 714,4 μm,

respectivamente; n=10), camada granular (163,6 + 47,30 μm e 200,8 +

46,45 μm, respectivamente; n=10) e camadas infragranulares (829,6 +

294,60 μm e 501,1 + 140,1 μm, n=10; respectivamente) também não

diferiu entre as duas colunas (teste t, p>0,05 para todas as

comparações);

• A área dendrítica foi semelhante entre as CC das colunas de septo e

barril das camadas supragranulares (4402 + 727,24 μm2 e 4161 +

1019,0 μm2, respectivamente; n=10; teste t=0,1969, p=0,4710), camada

granular (142,9 + 25,69 μm2 e 162,1 + 76,11 μm2, respectivamente;

n=10; teste t=0,3389, p=0,3803) e foi maior nas colunas de septo que

nas colunas de barris das camadas infragranulares (1219,0 + 419,9 μm2

88

e 432,6 + 111,0 μm2, respectivamente; n=p; teste t=0,3389, p<0,001)

(Figura 33).

• O volume de arborização dendrítica foi semelhante entre as células

das colunas de septo e barris nas camadas supragranulares (4513000

+ 2845000, 2906000 + 1561000 μm3, respectivamente; n=10; teste t,

p>0,05) e camada granular (14579000 + 589000, 14673000 +

5198000 μm3, respectivamente; n=10; teste t, p>0,05) e foi maior nas

CC das colunas de septo nas camadas infragranulares barris (septo:

2057000 + 169178 μm3; barril: 1468000 + 196873 μm3,

respectivamente; , n=10; teste t, P<0,05) (Figura 33).

89

Figura 31: Neurônios calosos e a organização colunar do córtex de barris.

Em (A), o padrão de cores das fileiras de barris usada neste trabalho. Em (B),

contornos das fileiras de barris feitos com o auxílio do sistema Neurolúcida. Em

(C), aglomerado de neurônios calosos reconstruídos em 3D. Note que tanto as

colunas de septo quanto as colunas de barris apresentam neurônios calosos

nas camadas supragranulares (em azul), camada granular (laranja) assim

como as camadas infragranulares (verde) do PMBSF de rato.

90

Figura 32: Neurônios calosos classificados segundo sua posição laminar e colunar. Em azul, os neurônios calosos das camadas supragranulares, em

laranja, os neurônios calosos da camada granular e em verde os neurônios

calosos das camadas infragranulares. Pontilhado representa barril. Note que,

qualitativamente, a arborização dendrítica dos neurônios calosos

supragranulares é mais exuberante.

91

Figura 33: Características morfométricas das células calosas localizadas nas colunas de septo e de barris. A linha (A) representa a área de corpo

celular, (B) é a somatória do comprimento total dos dendritos, (C) é a área

dos dendritos e (D) é o volume da arborização dendrítica. A coluna da

esquerda representa as camadas supragranulares (azul), a coluna central

representa a camada granular (laranja) e a coluna da direita representa as

camadas infragranulares (verde). As características morfométricas foram

semelhantes entre as colunas de septo e de barris nas camadas

supragranulares e granular. Nas camadas infragranulares, o volume

dendrítico foi maior nas células calosas das colunas de septo do que nas

barris (septo: 2057000 + 169178 μm3; barril: 1468000 + 196873 μm3,

respectivamente; n=10; teste t, P<0,05*).

92

Adicionalmente, dividimos qualitativamente as CC das colunas de septos e

de barris de acordo com a presença ou ausência de espinhas dendríticas. Nas

camadas supragranulares, todas as células das colunas de septos e de barris

apresentaram espinhas. Na camada granular, nenhuma célula apresentou

espinha dendrítica. Já nas camadas infragranulares, todas as CC localizadas

nas colunas de septo apresentaram espinhas enquanto nenhuma das CC

localizadas nas colunas de barris apresentou espinhas dendríticas.

Assim, os corpos celulares e as arborizações dendríticas apresentam-se

mais diferenciados entre as camadas do que entre as colunas corticais.

Somente as camadas infragranulares apresentaram variações na morfologia

dendrítica na sua organização colunar. Por exemplo, as células da coluna de

barris das camadas infragranulares não apresentam espinhas dendríticas, o

comprimento linear e a área dendrítica apresentaram tendência de serem

menores nas CC dos barris do que nas septais e o volume dendrítico foi maior

nas CC septais dessas camadas.

Resumindo, nossos resultados demonstram que as CC das camadas

supragranulares apresentam arborização dendrítica maior e mais complexa

que as das outras camadas. As células das camadas granulares não

apresentam espinhas dendríticas. As CC localizadas nas colunas de septo e de

barril nas camadas supragranulares possuem morfologia semelhantes entre si,

assim como as CC localizadas nas colunas de septos e de barris na camada

granular possuem morfologia semelhante entre si. Já as CC septais das

camadas infragranulares apresentam volume dendrítico maior que as CC das

colunas de barris, além disso as CC septais possuem espinhas dendríticas

enquanto que essas estruturas estão ausentes nas CC das colunas de barris.

93

4.4 – Características morfométricas dos axônios calosos do PMBSF de

rato

As injeções de BDA 10 kD que produziram pequenos sítios de marcação

foram selecionadas para a reconstrução 3D total das CC, com o auxílio do

Sistema Neurolúcida. Essas células foram classificadas em CC das colunas de

septos e CC das colunas de barris, de acordo com a posição colunar dos seus

corpos celulares no PMBSF. Nos neurônios reconstruídos, os axônios se

ramificaram pouco na substância cinzenta, próxima ao corpo celular,

navegaram em direção à substância branca, seguiram em direção ao corpo

caloso, cruzaram a linha média e ramificaram seus terminais axonais no

PMBSF do hemisfério contralateral ao sítio de injeção (Figuras 21 e 22).

Além da presença de axônios calosos que alvejaram o PMBSF

contralateral (Figura 22), também observamos axônios de outras células,

entorno do sítio de injeção, projetando-se para inervar outras regiões

somestésicas, além de S1, no hemisfério ipsolateral ao sítio de injeção como

as áreas S2, PV e uma área próxima à fissura rinal, provavelmente a área PR

(Figuras 21). Tanto os axônios que projetaram para o hemisfério oposto quanto

os axônios que projetaram para outras áreas do mesmo hemisfério do sítio de

injeção apresentaram terminais axonais com botões de passagem e botões

terminais. Entretanto, neste trabalho analisamos as características

morfométricas apenas das células que fazem conexões calosas.

94

Nas 10 células totalmente reconstruídas, o corpo celular, os dendritos e

o axônio localizaram-se entre duas a seis secções consecutivas. As CC do

PMBSF completamente reconstruídas tiveram as seguintes características

morfométricas analisadas:

• comprimento linear dos axônios;

• área axonal;

• volume da arborização axonal;

• complexidade geométrica da arborização axonal;

• o número de botões sinápticos,

• o número de botões de passagem versus o número de botões terminais

Apesar de todas as CC do PMBSF fazerem projeções calosas

homotópicas para o PMBSF do hemisfério contralateral, apenas os neurônios

que se encontraram nas colunas de barris, seja nas camadas

supragranulares, camada granular ou camadas infragranulares,

demonstraram precisão em conectar locais correspondentes dentro do

PMBSF, ou seja, o axônio das CC cujo corpos celulares localizam-se no barril

C3, por exemplo, inervaram o barril C3 do hemisfério contralateral,

permanecendo restrito à coluna de barril, ramificando seus terminais axonais

na camada IV, mas também alcançando as camadas supragranulares.

Nenhuma das células reconstruídas apresentou ramificações axonais para

mais de um barril no hemisfério oposto (Figuras 34, 35 e 36).

95

Figura 34: Reconstrução 3-D de células calosas do PMBSF. Neurônios

que conectam os dois PMBSF, enviando seus axônios através do corpo

caloso. Em (A), padrão de cores usadas para identificar as linhas dos barris.

Em (B), visão coronal da posição de alguns dos neurônios reconstruídos. (C,

D), ampliação dos boxes em (B). Contornos coloridos correspondem aos

barris do PMBSF. Os corpos celulares encontram-se no hemisfério esquerdo

e os terminais axonais no hemisfério direito. Em cinza, os contornos da

superfície pial e em azul, os contornos seguindo os ventrículos encefálicos.

96

Figura 35: Neurônio caloso supragranular da coluna de barril. Neurônio

caloso das camadas supragranulares, coluna de barril, completamente

reconstruído com o auxílio do Sistema Neurolúcida. Em (A), visão frontal e o

esquema de cores das fileiras de barris, em (B), visão superior e em (C),

ampliação do corpo celular e do terminal axonal. Note que o terminal axonal

localiza-se preferencialmente no barril, na região homotópica à localização do

corpo celular

97

Figura 36: Célula calosa supragranular da coluna de septo. Neurônio

caloso das camadas supragranulares, coluna de septo, completamente

reconstruído com o auxílio do Sistema Neurolúcida. Em (A), visão frontal e o

“x” indica a posição do corpo celular (esquerda) e do terminal axonal (direita).

Em (B), visão superior e em (C) ampliação da visão frontal com os contornos

dos barris. Note que o terminal axonal localiza-se preferencialmente no septo

que envolve a fileira de barris mais próxima do corpo celular. Barra de escala

1000 mm.

98

Já os neurônios do PMBSF que fazem projeções calosas e cujos corpos

celulares encontram-se nas colunas de septo, projetaram seus respectivos

axônios também para a região de septo do PMBSF no hemisfério contralateral.

Os terminais axonais evitaram as colunas de barris e se ramificaram na

camada granular (camada IV), mas também alcançavam as camadas

supragranulares.

A região septal no PMBSF contralateral inervado pelo axônio caloso,

correspondia às fileiras de septos adjacentes à fileira de barris mais próximas

do corpo celular. Por exemplo, se o corpo celular de uma célula calosa

encontrava-se no septo próximo aos barris da fileira C, seu axônio inervava a

região de septo adjacente à fileira C no PMBSF contralateral. Outra

característica importante é que esses axônio tendem a não invadir as colunas

de barris (Figuras 37 e 38).

99

Figura 37: Neurônios calosos do córtex de barris de ratos. Neurônios

calosos do PMBSF de ratos, reconstruídos tridimensionalmente com o auxïlio

do sistema neurolúcida. Note que, independente da localização

colunar/laminar do corpo celular, os terminais axonais no hemisfério oposto

são sempre pouco exuberante.

100

Figura 38: Célula calosa infragranular septal. Neurônio caloso totalmente

reconstruído com o auxílio do sistema Neurolúcida. Em (A), visão frontal, em

(B), visão superior, em (C) ampliação do corpo celular e dos contornos dos

barris e em (D), ampliação do terminal axonal. Note que o terminal axonal é

pouco ramificado, restrito ás colunas de septo e, neste caso, para na camada

granular. Barras de escala, 500 μm.

101

A seguir, as características morfométricas dos axônios calosos do córtex

de barril:

• O comprimento linear dos axônios: as colunas de septo (10896 + 1370

μm; n=5) e as colunas de barris (11512 + 1029 μm; n=5) apresentaram

comprimento linear dos axônios semelhantes entre si (p=0,5457, teste t);

• A área de arborização axonal: foi levemente maior nos axônios das

colunas de septo (26006 + 5291 μm2; n=5) do que nos axônios das colunas de

barris (21785 + 4061 μm2; n=5) e a diferença não foi estatisticamente

significativa (p=0,3311, teste t).

• O volume da arborização axonal (septo: 2.932x106+1.333x106 μm3;

barril:1.746x106+785x106 μm3; teste t, P=0,2505) foi maior nos axônios septais,

porém a diferença não foi estatisticamente significativa.

• A complexidade geométrica dos axônios: análise das dimensões

fractais, pelo método da contagem de caixas, mostrou que os axônios das

colunas de septo (51,360 + 25,40 k-dim; n=5) apresentam formas mais

complexas que as dos axônios da coluna de barril (8,023 + 3,131 k-dim; n=5),

com p<0,0001 no teste t de Student (Figura 39).

• O número total de botões sinápticos: os axônios das colunas de septo

(161 + 8 botões; n=5) apresentaram muito mais botões que os axônios das

colunas de barris (48 + 15 botões; n=5) com p<0,001 no teste t de Student.

Botões sinápticos de passagem e botões terminais: tanto os axônios das

colunas de septo (149 + 22 botões de passagem; 17 + 5 botões terminais;

n=5) quando os axônios das colunas de barris (73 + 8 botões de passagem;

14 + 2 botões terminais; n=5) apresentaram muito mais botões de passagem

que botões terminais (Figura 40).

102

Figura 39: Quantificação dos dados morfológicos dos axônios calosos

do PMBSF. Em (A), o comprimento linear médio (septo: 10896+1370 μm;

barril: 11512+1029 μm; n=10; teste t p=0,7612), em (B), a área dos axônios

(septo: 26006+5291 μm2; barril: 21785+4061 μm2; n=10, teste t, p=0,3311) e

em (C), o volume médio dos axônios (septo: 2932x106+1333x106 μm3;

barril:1.746x106+785x106 μm3; n=10; teste t, p=0,2505) da coluna de septo

foram maiores que os da coluna de barril, porém a diferença não foi

significativa entre os dois grupos. Em (D), a complexidade geométrica foi

maior nos axônios das coluna de septo do que nos axônios das colunas de

barris (septo: 51+25 k-dim; barril: 8+7 k-dim, respectivamente; n=10; teste t,

p<0,0001).

103

Figura 40: Distribuição dos botões sinápticos dos axônios calosos do PMBSF. Os axônios calosos do PMBSF de ratos localizados na coluna de

septo apresentaram mais botões sinápticos do que os axônios localizados na

coluna de barril (161+8, 48+15 botões; teste t, p<0,001) em (A). Quando os

botões sinápticos são analisados separadamente entre botões de passagem

e botões terminais, tanto os axônios localizados nas colunas de septo

(149+22 botões de passagem, 17+5 botões terminais; teste t, p<0,0001**)

quanto os localizados nas colunas de barris (73+22 botões de passagem,

14+8 botões terminais; teste t, p<0,0001**) possuem mais botões de

passagem do que botões terminais, em (B).

104

5 – Discussão

5.1 – Considerações técnicas

A dextrana-amina biotinilada (BDA) é um rastreador sensível para

marcar retrogradamente (BDA de 3 kD) ou anterogradamente (BDA de 10 kD)

neurônios (Reiner et al., 2000; Vercelli et al., 2000). A BDA pode ser injetada

por pressão, ou ainda por iontoforese, e visualizada seguindo um protocolo

padrão, o qual consiste em incubação com complexo avidina-biotina

peroxidase (ABC), revelação por oxidação da diaminobenzidina (DAB) com

intensificação por um metal pesado (como o níquel).

As injeções iontoforéticas de BDA 3 kD no PMBSF de ratos adultos

resultaram em marcação detalhada de corpos celulares e de sua arborização

dendrítica em diversas regiões ipsolaterais bem como no PMBSF do hemisfério

contralateral. Foi possível identificar com facilidade os ramos dendríticos mais

finos assim como as espinhas dendríticas. Houve, também, marcação

retrógrada no tálamo, em região que corresponde ao complexo ventrobasal

(VB). Como era esperado, encontramos células retrogradamente marcadas

distribuídas tangencialmente em todas as camadas do córtex de barris

contralateral ao sítio de injeção.

Para as injeções de BDA 10kD, o objetivo foi de injetar a menor

quantidade possível de neurorrastreador, suficiente para marcar

completamente algumas poucas células calosas, sem prejudicar a visualização

dos seus corpos e prolongamentos celulares. Apesar de usarmos sempre

parâmetros semelhantes (diâmetro da micropipeta, tempo e intensidade dos

pulsos de corrente) na realização das injeções iontoforéticas, o tamanho dos

sítios de injeção variou muito, necessitando de um alto número de

experimentos usados neste projeto. Algumas injeções resultaram em sítios

105

grandes e densos, marcando numerosas células e inviabilizando a

reconstrução de neurônios individuais, enquanto que outras resultaram em

marcação insuficiente e/ou não preenchimento correto de toda os

prolongamentos celulares.

Algumas injeções resultaram num numero pequeno de células bem

preenchidas pelo BDA, sendo a situação ideal para a visualização do axônio

caloso com todos seus ramos terminais. Detalhes da morfologia axonal,

inclusive os ramos mais distais e mais finos, e os botões sinápticos, de

passagem e terminais, foram facilmente visualizados. Portanto, todas as

células analisadas com o auxílio do sistema Neurolúcida, foram reconstruídas

com todos os detalhes de suas estruturas dendríticas e axonais.

Os tempos de sobrevida de 10 dias para os animais que receberam

injeções iontoforéticas de BDA 3 kD e de 15 dias para os animais que

receberam injeções iontoforéticas de BDA 10 kD foram ideais para que o

neurorrastreador fosse transportado por todos os prolongamentos das CC e

permitisse a visualização de estruturas como as espinhas dendríticas e os

botões axonais. Como controle interno da marcação neuronal pelo BDA,

sempre nos certificávamos de que as conexões ipsolaterais ao sítio de

injeções, como as para S2, PV e PR, estavam evidentes e com preenchimento

celular completo. Para marcar os axônios que chegavam até a área PR, por

exemplo, o neurorrastreador tinha que ser transportando intracelularmente por

uma distância semelhante à que percorria até alcançar o hemisfério

contralateral.

Durante a execução deste projeto, utilizamos duas configurações

diferentes do sistema Neurolúcida: a primeira (que chamaremos de 01),

106

utilizava o minimonitor Lucivid colocado no tubo da câmera clara do

microscópio. Neste caso, o desenho era feito com o experimentador olhando

nas oculares do microscópio, onde ocorria a sobreposição entre a imagem

óptica da preparação histológica e da saída gráfica produzida pelo programa de

computação (ver Métodos). Na segunda configuração (que chamaremos de

02), a preparação histológica foi digitalizada on-line através de uma câmera

digital de alta resolução e projetada num monitor de vídeo, juntamente com a

saída gráfica do programa de computação. Neste caso, o experimentador

trabalhava diretamente na tela do computado, sem precisar usar

constantemente as oculares do microscópio.

Como a reconstrução de neurônios isolados demanda bastante tempo,

em virtude da necessidade de seguir os ramos dendríticos e axonais de cada

célula calosa do PMBSF através pelo menos três (e até 06) secções coronais

de 150 μm do encéfalo de rato, foi mais confortável usar o sistema 02, uma vez

que a imagem enviada para monitores de vídeo digitais retira a necessidade de

ficarmos com os olhos, por horas ininterruptas, nas oculares do microscópio.

Mas, apesar dessa vantagem, nos maiores aumentos o sistema 02

apresentou problemas ne resolução de imagem e algumas vezes foi

necessário usar as oculares do microscópio para melhor visualizar as

estruturas de menor tamanho. Outra dificuldade foi a perda de profundidade

na imagem projetada no monitor de vídeo. Como no sistema 02 a imagem da

preparação histológica é visualizada de uma única perspectiva (a imagem

capturada pela câmera digital) a noção de profundidade fica prejudicada,

enquanto no sistema 01 o observador beneficia-se da fusão binocular das

imagens projetadas em cada um dos seus olhos, o que produz uma imagem

107

estereoscopica que possui uma aparente profundidade de campo. Em alguns

casos de duvidas, usando-se o sistema 02, como por exemplo na

sobreposição de dois ramos axônicos muito finos que poderiam ser

interpretados de forma errônea como uma bifurcação, o usuário tem sempre

que verificar essas estruturas usando as oculares. Por outro lado, a

possibilidade de capturar imagens com alta resolução no sistema motorizado

02 nos permite realizar microfotomontagens precisas em qualquer aumento.

5.2 – Distribuição laminar, tangencial e morfologia das células calosas no PMBSF do rato adulto.

Diversos trabalhos usando neurorrastreadores como HRP e WGA-HRP

demonstraram que nas fases precoces do desenvolvimento pós-natal do rato

existem numerosas células calosas espalhadas por toda a extensão do córtex

de barris (Ivy et al., 1979, 1984; Ivy & Killackey, 1982), da mesma forma que

existem inicialmente numerosas células calosas em toda a extensão tangencial

do córtex visual (Innocenti, 1982). Esses resultados clássicos foram

recentemente confirmados por técnicas modernas usando eletroporação

(Mizuno et al., 2007; Wang et al., 2007). Durante as primeiras semanas pós-

natais, muitas dessas células perdem seu ramo axônico caloso e mantém

conexões somente com o córtex ipsolateral, ou com estruturais subcorticais

(Ivy & Killackey, 1982). A partir da terceira semana de vida pós-natal, as células

calosas tornam-se mais esparsas, concentradas principalmente nas camadas

II-III e Va, com poucas células de projeção calosa na região de septo e

ausentes nos barris da camada IV (Ivy et al., 1984; Olavarria et al., 1984;

Hayama & Ogawa, 1997, Mizuno et al., 2007; Wang et al., 2007).

108

Nossos resultados demonstram que, no PMBSF do rato adulto, existem

células calosas tanto nas colunas de septo quanto nas colunas de barris e em

todas as camadas: supragranulares, infragranulares e também na camada IV.

Quantitativamente, as células calosas localizaram-se principalmente nas

camadas supragranulares, depois na camada granular e, em menor

quantidade, nas camadas infragranulares. Na camada granular, as células

calosas foram principalmente localizadas nos septos, embora não forma

ausentes dos barris.

A maior quantidade de células calosas localizadas nas camadas

supragranulares e também a existência de células calosas nas camadas

infragranulares estão de acordo com os resultados de outros estudos (Ivy &

Killackey, 1982). A presença de células calosas na região de septo da camada

granular também (Hayama & Ogawa, 1997). Entretanto, nossos resultados

demonstraram que, na camada IV, existem células calosas dentro dos barris.

Essa discrepância de resultados pode ser atribuída às diferentes sensibilidades

dos neurorrastreadores retrógrados usados.

Enquanto os estudos anteriores usaram neurorrastreadores retrógrados

como o HRP e o WGA-HRP, no presente estudo utilizamos o BDA de baixo

peso molecular (BDA 3 kD), um polissacarídeo hidrofílico caracterizado por sua

boa solubilidade em água, não tóxico e resistente à clivagem de glicosidases

celulares endógenas (ver Vercelli et al., 2000), portanto é um neurorrastreador

mais estável. O BDA marca fibras de passagem que foram rompidas, mas

também marca fibras intactas e tem sido afirmado que é o mais sensível

neurorrastreador para visualização neuronal e seu uso resulta em marcação

detalhada de espinhas dendríticas e de botões sinápticos (Reiner et al., 2000).

109

Neste trabalho também usamos o BDA de alto peso molecular, um

neurorrastreador essencialmente anterógrado (Xue et al., 2004) e obtivemos

marcação de células na camada granular, tanto nas regiões de septo quanto

nas regiões de barris. A reconstrução 3D individual desses neurônios e do seu

axônio, a partir do corpo celular, elimina toda possibilidade que tais células

granulares não sejam, de fato, as de projeções calosas. O fato de tais células

terem passado despercebidas em estudos anteriores pode ser devido a

redução das suas arborizações axonais e dendríticas, em relação às células

calosas das demais camadas, o que limita, respectivamente, tanto a captura do

rastreador retrogrado pelos terminais quanto a acumulação deste nos

dendritos. Embora não tenhamos observado diferenças significativas nas

arborizações das células granulares localizadas nos septos ou no barris,

podemos sugerir que traçadores menos sensíveis não foram adequados para

preencher corretamente tais células com ramificações muito discretas.

Recentes estudos no córtex somestésico (Petreanu et al., 2007, Wang et

al., 2007) e no córtex visual (Mizuno et al., 2007), todos usando técnicas de

eletroporação, demonstraram que as conexões calosas das camadas

supragranulares fazem mais sinapses ipsolaterais e contralaterais com as

camadas V, menos com as camadas II/III e VI e não fazem sinapses com a

camada IV. A manutenção dessas sinapses é dependente de atividade elétrica

durante o desenvolvimento do animal (Togawa et al., 2008). Nossos resultados

também demonstram que as células das camadas supragranulares, tanto nas

colunas de septos quanto nas de barris, possuem axônios calosos que

alcançam as camadas supragranulares do PMBSF contralateral.

Adicionalmente, nossos resultados demonstram que existem botões sinápticos

110

(de passagem e terminal) que se localizam por toda a arborização do terminal

axonal.

Uma vez que as vibrissas desempenham importante papel na

exploração do ambiente pelo animal (Brecht et al., 1997; Brecht 2007), há

diversas evidências fisiológicas apontando para a existência de conexões

entre os campos de barris dos dois hemisférios (Pidoux et al., 1979; Shuler et

al., 2001, 2002; Ferezou et al., 2007; Petersen, 2007) e que existem circuitos

distintos responsáveis por conduzirem as informações desde as vibrissas até o

córtex de barris (ver Alloway, 2008). Essas características podem justificar a

presença das células calosas em todas as camadas e colunas do PMBSF, já

que a segregação laminar e colunar desses circuitos parece ser mantida pelas

conexões interhemisféricas (Alloway, 2008, ver adiante).

Diferentes autores (Ivy et al., 1979; Olavarria et al., 1984) propuseram

que a localização dos terminais calosos seria complementar à das aferências

talâmicas na camada IV do córtex de barris. Além dos nossos resultados

presentes, diversas evidências sugerem uma revisão desse conceito: em

primeiro lugar, não existe uma segregação tão marcante entre as vias

talâmicas e calosas, já que as colunas de septo também recebem aferências

talâmicas na camada Va (Kim & Ebner, 1999). Em segundo lugar, foi

demonstrado que no córtex visual do gato, algumas células calosas

distribuem arborizações terminais na camada IV, embora menos extensas do

que nas demais camadas (Houzel et al., 1994).

111

5.2.1 – Morfologia dendrítica das células calosas do PMBSF

As informações sensoriais são processadas por redes neuronais

conectadas e são fortemente influenciadas pela geometria das células que as

compõem. Neste estudo, analisamos as características morfométricas das

células calosas em relação à sua organização laminar e colunar.

As células calosas supragranulares reconstruídas apresentaram

arborização dendrítica típica de neurônios piramidais supragranulares: corpo

celular de formato piramidal, 2 a 3 dendritos basais espinhosos com densa

ramificações locais e dendrito apical espinhoso, que se ramifica e atinge a

camada I. Tanto o comprimento dendrítico linear quanto a área de arborização

dendrítica das CC supragranulares foram muito maiores do que nas outras

camadas (comprimento: 2629 + 467, 142 + 6, 217 + 37 μm; área: 4149 + 649,

137 + 23, 646 + 132 μm2, supragranular, granular e infragranular,

respectivamente). Entretanto o tamanho do corpo celular foi semelhante entre

elas.

Estudos anteriores demonstraram que neurônios piramidais formando

circuito local nas camadas supragranulares possuem comprimento dendrítico

linear médio maior nas célula localizadas nas colunas de septo (L2 barril =

2375 + 162; L3 barril = 6356 + 1143; L2 septo = 7505 + 1409; L3 septo = 8535

+ 2959 μm) (Brecht & Sakmann, 2002; de Kock et al., 2007). As células calosas

das camadas supragranulares do PMBSF apresentaram comprimento

dendrítico linear menor do que as piramidais de circuito local (2629,0 + 467,1

μm). Morfologicamente, as CC das camadas supragranulares do córtex de

barris formam uma subpopulação peculiar de neurônios piramidais no PMBSF

de rato, com arborização dendrítica exuberante, podendo assim receber mais

112

sinapses das células da camada granular e com isso, integrar a informação

sensorial que chegam na camada IV e retransmitir essas informação para o

hemisfério oposto. Entretanto, ainda há a necessidade de se caracterizar

fisiologicamente essas células.

As células estreladas espinhosas da camada IV recebem aferências

talâmicas e/ou aferências excitatórias e inibitórias quase que exclusivamente

de outros neurônios localizados dentro da mesma coluna cortical. Já as células

piramidais estreladas e as piramidais, em contraste, recebem aferências

excitatórias do tálamo, das outras camadas corticais e até mesmo de barris

vizinhos (Shubert et al., 2003). Essas subpopulações apresentam diferentes

dinâmicas de atividade elétrica em respostas a deflexão de uma vibrissa

(Brecht & Sakmann, 2002). Adicionalmente, estudos demonstraram a

existências de conexões monossinápticas entre as células da camada granular

e células das camadas II/III (Feldmayer et al., 2002; Petersen et al., 2003) bem

como da camada V (Feldmayer & Sakmann, 2000; Feldmeyer et al., 2005).

As CC reconstruídas na camada granular apresentaram dendritos lisos

com menor comprimento linear, resultando em arborizações de área restrita

(142,2 + 6,37 μm). Observamos que as células calosas granulares restringem

sua arborização dendrítica na sua coluna de origem (septo ou barril) e não

houve diferença entre as características morfológicas das arborizações

dendríticas das CC localizadas nos septos e nos barris. Esta configuração mais

restrita já era esperada, já que estudos anteriores indicam que as interações

horizontais são fracas e limitadas dentro da camada IV (ver Petersen &

Sakmann, 2000), e essencialmente formada por uma rede local de neurônios,

principalmente excitatórias, capazes de amplificar o sinal trazido pelas

113

aferências talâmicas antes de retransmiti-lo verticalmente para as demais

camadas da mesma coluna (Stratford et al., 1996; Feldmeyer et al., 1999,

2002).

De modo geral, a camada granular de S1 do rato contém pelo menos

três diferentes morfotipos característicos: neurônios estrelados espinhosos,

neurônios piramidais estrelados e neurônios piramidais (Jones, 1975) que

diferem entre si pela presença ou ausência do dendrito apical e de espinhas, o

formato da arborização dendrítica e suas propriedades fisiológicas, embora as

respostas das células espinhosas estreladas e piramidais estreladas da

camada IV sejam semelhantes (Brecht & Sakmann, 2002; Bannister et al.,

2007). Nossos resultados mostraram que os neurônios calosos da camada IV

se aproximam mais dos neurônios estrelados piramidais em virtude da

morfologia do corpo celular, presença de um dendrito apical curto e ausência

de espinhas dendríticas (ver Staiger et al., 2004), mas também há uma CC

granular com dendrito apical longo, que atingiu as camadas II/III.

Diversos estudos demonstraram que as células piramidais de circuito

local das camadas granulares apresentam arborização dendrítica restrita ou à

coluna de septo ou à coluna de barril (Petersen & Sakmann 2000, 2002; Brecht

et al., 2003). Quando os prolongamentos neuronais conectam dois barris

diferentes, eles o fazem preferencialmente em barris localizados na mesma

fileira. Por exemplo, alguns ramos dendríticos de uma célula no barril C3

podem alcançar o barril C4 (mesma fileira) e raramente alcançará o barril B3 ou

D3 (mesmo arco) (Brecht et al., 2003; Pertersen et al., 2003). Fisiologicamente,

as células das colunas de barris apresentam propriedades de respostas

distintas daquelas das células das colunas de septo (Brecht et al., 2003).

114

As CC das camadas infragranulares apresentaram comprimento

dendrítico linear e área de arborização axonal intermediários entre os valores

encontrados nas camadas supragranulares e camada granular. Localizada

principalmente na região mais superficial da camada V, essas células

possuem forma caracteristicamente piramidal, com dendrito apical que se

ramifica alcança as camadas II/III, porém sua arborização dendrítica é restrita à

coluna cortical de origem (septo ou barril). Uma característica importante das

CC infragranulares é que algumas apresentam espinhas dendríticas e outras

não. As que se localizaram nas colunas de septo apresentam espinhas e as

que se localizam nas colunas de barris, não.

As camadas infragranulares recebem aferências das células

supragranulares (Kim & Ebner., 1999) e fazem projeções para as regiões

subcorticais, como para o núcleo estriado, para a ponte e o tálamo (Wise &

Jones, 1977). No córtex de barris de roedores, a camada V, mais

especificamente a camada Va, é o principal alvo das aferências talâmicas da

via paralemniscal (Kim & Ebner, 1999; Alloway, 2008) além de receberem

conexões monossinápticas da camada IV (Feldmeyer & Sakmann, 2000,

Feldmeyer et al., 2003).

As características morfométricas das CC infragranulares também são

compatíveis com as descritas para as piramidais da camada Va como, por

exemplo, o dendrito apical que atinge as camadas II/III e que se ramifica na

própria camada Va, camada IV e nas camadas II/III. Entretanto, também

encontramos algumas poucas CC que se localizaram em posição laminar

corresponde às camadas Vb e VI. As CC infragranulares foram as únicas a

apresentarem diferenças entre a morfologia dendríticas das localizadas nas

115

colunas de septo (1219,0 + 419,9 μm2) e as localizadas nas colunas de barris

(432,6 + 111,0 μm2). Como as células das camadas infragranulares fazem

projeções para alvos subcorticais e também para o hemisfério contralateral, as

diferenças na morfologia dendrítica parecem manter as vias lemniscal e

paralemniscal segregadas.

A camada VI é a camada que apresenta a maior diversidade morfológica

e funcional dentre todas as camadas do córtex de barris (Chen et al., 2008) e

suas eferências desempenham importante papel, junto com as da camada V,

formando a principal via de saída na comunicação córtico-talâmica e conexões

córtico-corticais ipsolaterais e interhemisféricas (Zhang & Deschenes, 1997,

1998).

Estudos usando o método de impregnação pela prata para análise das

características da morfologia dendrítica descreveram seis grupos morfológicos

na camada VI: neurônios piramidais com dendritos elaborados, neurônios

piramidais com moderado dendrito apical e dendritos basilares padrão,

neurônios piramidais com dendritos curtos, grandes neurônios não piramidais,

neurônios sem dendrito apical e interneurônios complexos (Chen et al., 2009).

Praticamente a metade dos neurônios da camada VI do córtex de barris

de rato faz projeção para o tálamo somestésico e o restante deles projeta-se

para outras áreas corticais ipsolaterais e contralaterais (Zhang & Deschênes,

1997). A diversidade de morfotipos neuronais nas camadas infragranulares

pode justificar as diferenças morfológicas entre as CC das colunas de barris e

das colunas de septo encontradas no presente trabalho.

Nossos resultados demonstraram que as CC das camadas

infragranulares localizam-se principalmente na porção mais superficial dessas

116

camadas e que as colunas de septos e de barris apresentaram as mais

evidentes diferenças quanto a morfometria dos dendritos, uma vez que as CC

das colunas de septo apresentando maior área de arborização dendrítica e

presença de espinhas dendríticas enquanto que as CC das colunas de barris

possuem menor área de arborização dendríticas e não apresentam espinhas.

Na camada V, os neurônios piramidais podem ser classificados em 5

grandes grupos segundo a sua morfologia dendrítica (Tsiola et al., 2003) ou em

2 grandes grupos segundo as características morfológicas da arborização

axonal (Molnar & Cheung, 2006). É possível que essa diversidade morfológica

se reflita nas conexões calosas e tornem as CC dessa camada distintas

morfologicamente entre as que estão localizadas nas colunas de septos e as

que estão localizadas nas colunas de barris. Isso mantém segregada as

informações conduzidas pelas vias lemniscal e paralemniscal nas projeções do

córtex de barris para outras áreas ipsolaterais e para o hemisfério contralateral.

Atualmente, acredita-se que a informação sensorial conduzida pela via

lemniscal e o processamento cortical na coluna de barril estejam relacionados

principalmente com o aspecto sensorial como forma e textura (o quê?),

enquanto a informação conduzida pela via paralemniscal e o processamento

cortical na coluna de septo estejam mais relacionados com a integração de S1

e o controle motor das vibrissas (onde?) (Bureau et al., 2006; Le Be at al.,

2007; para revisão ver Alloway, 2008). Nossos resultados indicam que as CC

localizadas nas camadas supra e granular possuem características

morfológicas semelhantes (tamanho de corpo celular, comprimento dendrítico,

área de arborização dendrítica) nos septos e nos barris. Essas características

morfológicas podem indicar um ponto de convergência das informações de

117

forma e textura dos objetos tocados pela vibrissas (o que) com a localização

dele (onde).

Entretanto, nas camadas infragranulares, observamos uma tendência do

comprimento linear e na área dos dendritos ser maior para as CC localizadas

nos septos em relação as localizadas nos barris. Embora essa tendência não

seja estatisticamente significativa na nossa amostra, é interessante notar que

foi também para este parâmetro que observamos o maior desvio padrão,

sugerindo uma maior variação no comprimento dendrítico das CC

infragranulares.

Corroborando a tendência notada no comprimento dendrítico,

observamos uma diferença significativa no volume da arborização dendrítica,

que foi maior para as CC infragranulares septais em relação as de barris. Ao

contrário das outras camadas, onde tanto as células septais quanto as das

colunas de barris apresentaram (camadas supragranulares) ou não (camada

granular) espinhas dendríticas, as células das camadas infragranulares das

colunas de septo apresentaram espinhas dendríticas enquanto que as das

colunas de barris, não, tornando essas CC morfologicamente distintas.

Uma vez que a camada IV é o principal alvo das aferências talâmicas da

via lemniscal (núcleo VPM do tálamo), a camada Va é o principal alvo das

aferências talâmicas da via paralemniscal (núcleo Pom do tálamo), e a maioria

das CC encontradas nas camadas infragranulares tem características

(localização e morfologia) de células da subcamada Va, podemos sugerir que

estas também estejam envolvidas em circuitos divergentes, relacionados com

as vias lemniscal e paralemniscal.

118

Com base em nossos resultados, propomos que as CC do PMBSF de

ratos apresentam pelo menos quatro morfotipos neuronais distintos, segundo

seu padrão de arborização dendrítica: uma subpopulação com morfologia

dendrítica mais exuberante, característica das camadas supragranulares; uma

subpopulação neuronal com arborização dendrítica discreta, característica da

camada granular; as CC das camadas infragranulares podem ser subdividias

em dois morfotipos distintos: um morfotipo neuronal com arborização dendrítica

que apresenta espinhas, relacionado com as CC das colunas de septo das

camadas infragranulares e relacionadas com a via paralemniscal e outro

morfotipo neuronal que apresenta área de arborização dendrítica menor, não

possui espinhas, estão localizadas nas colunas de barris das camadas

infragranulares e relacionadas com a via lemniscal.

5.3 – Distribuição e geometria dos axônios calosos no PMBSF do rato

Os axônios calosos que conectam os dois PMBSFs de ratos

apresentaram organização homotópica tanto para os axônios das células

localizadas nas colunas de septo quanto para os axônios das células

localizadas nas colunas de barris, onde um axônio cujo corpo celular encontra-

se na coluna de septo projeta-se para a região de septo do PMBSF

contralateral enquanto o axônio cujo corpo celular encontra-se na coluna de

barril projeta-se para coluna de barril correspondente no PMBSF do hemisfério

contralateral.

Entretanto, a precisão topográfica é maior entre os axônios das CC

localizadas nas colunas de barris onde, por exemplo, se o corpo celular

encontra-se localizado na coluna do barril C3 (seja nas camadas

119

supragranulares, camada granular ou camadas infragranulares) o seu axônio

projeta-se para o barril homólogo do hemisfério contralateral, ou seja, para o

barril C3 do PMBSF do hemisfério contralateral.

Por outro lado, os axônios das CC cujos corpos celulares encontram-se

nas colunas de septo projetam-se para a região de septo do córtex de barris

contralateral que envolve a fileira de barril mais próximo do corpo celular, ou

seja, se o corpo celular encontra-se na região de septo próximo a fileira C de

barris, o axônio caloso dessa célula irá localizar-se na região de septo do que

delimita a fileira C de barris do hemisfério contralateral.

Isto significa que os axônios calosos do PMBSF mantêm segregado o

processamento sensorial entre as vias lemniscal e paralemniscal, uma vez que

uma coluna de barril sempre conecta o barril homólogo contralateral e uma

coluna de septo sempre conecta coluna de septo no PMBSF contralateral.

Sendo assim, as vias de processamento sensorial (o quê) e o controle motor

(onde) ainda estão segregadas quando as informação são transferidas entre os

dois hemisférios. A manutenção da segregação das vias é importante para o

animal movimentar uma fileira de vibrissas na mesma direção durante a

exploração do ambiente, pois a modulação do controle motor é feita pela via

paralemniscal. Uma vez que as colunas de barris conectam colunas de barris

correspondentes no hemisfério contralateral e o mesmo acontece com as

colunas de septo, então as vias se mantém segregadas após a transferências

de informações entre os hemisférios.

Nossos resultados permitem-nos assumir que a organização pontual das

conexões interhemisféricas do PMBSF de ratos conectam regiões corticais

semelhantes e assim podem sincronizar os dois hemisférios e permitir uma

120

representação coerente do ambiente enquanto o faz animal o exploração. No

caso de ratos, isso permite ao animal mover as vibrissas das duas faces de

forma assimétrica, aumentando a precisão da periferia sensorial na busca das

informações do ambiente (ver Brecht, 2007).

No córtex visual de gatos, os terminais axonais calosos também

conectam colunas corticais que processam informações com a mesma

seletividade de orientação de movimento e analisam o mesmo ponto na cena

visual (Rochefort et al., 2009). Esses dados demonstraram, em conjunto com

os resultados do presente estudo, que as conexões interhemisféricas estão

organizadas de modo a conectar regiões corticais dos dois hemisférios que

processam os mesmos aspectos da informação sensorial (Ver Innocenti et al.,

1995; Innocenti 1995, 2009).

Tanto os terminais axonais das CC localizadas na coluna de septo

quanto os terminais axonais das CC localizas nas colunas de barris projetaram-

se radialmente, a partir do corpo celular, em direção à substância branca,

apresentaram poucas ramificações no hemisfério ipsolateral ao corpo celular,

defletiram em direção ao corpo caloso e ascenderam na substância cinzenta do

hemisfério contralateral em região homotópica ao corpo celular. Apresentaram-

se com morfologia discreta, pontual, ramificaram-se na camada IV do

hemisfério contralateral, porém atingiram as camadas supragranulares.

O comprimento linear e a área de arborização axonal foram

semelhantes entre axônios provenientes das colunas do septo e dos barris,

porém os axônios das CC das colunas de septo apresentaram-se mais

complexos, segundo os resultados da análise das dimensões fractais, e com

muito mais botões sinápticos do que os axônios das CC das colunas de barris.

121

As diferenças entre a morfologia dos axônios das CC de coluna de septo

e das CC de colunas de barris pode ser explicado em virtude de existirem mais

células calosas nas regiões de septo que nas regiões de barris e isso se reflete

na maior quantidade de botões sinápticos dos axônios das CC das colunas de

septo. Dividindo-se os botões sinápticos em botões de passagem e botões

terminais, tanto as CC das colunas de septos quanto as CC das colunas de

barris apresentaram muito mais botões de passagem que botões terminais. Já

a maior complexidade dos terminais axonais das CC de coluna de septo pode

ser explicado em razão das regiões de septo possuírem áreas contínuas

(linhas e arcos) tanto no sentido antero-posterior quanto no sentido médio-

lateral o que pode permitir o terminal axonal se espalhar mais.

Entretanto, nossos resultados não nos permitem dividir os axônios

calosos do PMBSF de ratos em duas subpopulações distintas, como as que

ocorrem na representação da pata anterior da cutia. Esse animal apresenta um

tipo de axônio claramente mais curto e com maior densidade de botões

enquanto o outro tipo possui maior comprimento linear e menor densidade de

botões de passagem (Rocha et al., 2007). Essa diferença pode ser resultado

dos hábitos diuturnos distintos entre as duas espécies de animais, além de a

cutia apresentar destreza manual que o rato não possui.

Em outras áreas sensoriais, como por exemplo no córtex visual primário

de ratos, o axônio caloso também é homotópico em relação à posição do corpo

celular, porém a arborização axonal é mais exuberante (Houzel et al., 2002).

No PBMSF, a arborização axonal calosa é homotópica em relação à posição

do corpo celular, porém o terminal axonal é discreto e pontual. Em V1 de gatos,

os axônios calosos ramificam-se intensamente na camada granular e atingem

122

as camadas supragranulares, comportamento semelhante ao que observamos

nos terminais axonais calosos do PMBSF (ver Rochefort et al., 2009).

A organização colunar das conexões calosas no córtex visual de gatos e

macacos se assemelha a aglomerados de terminais axonais que se repetem

regularmente ao longo da borda entre as áreas 17 e 18 (Heimer et al., 1967;

Jones et al., 1979; Houzel et al., 1994). Tanto os corpos celulares quanto os

terminais axonais no córtex visual estão localizados nos domínios ricos em

atividade da citocromo C oxidase (Boyd & Matsubara, 1994; Olavarria & Abel,

1996). Essa periodicidade está correlacionada com o padrão de colunas de

dominância ocular do córtex visual (Olavarria, 2001).

Tal organização colunar está presente no PMBSF de ratos, onde uma

coluna de barril conecta especificamente o barril homólogo no hemisfério

contralateral, e a coluna de septo conecta-se à coluna de septo no hemisfério

oposto, segundo o padrão de bandas dos de marcação de domínios ricos

(barris) e pobres (septo) em citocromo C oxidase, e outras enzimas

metabólicas, no PMBSF de ratos (ver Walace, 1987).

Finalmente, nossos resultados demonstram que há mais diferenças

morfológicas entre as populações de CC na organização laminar, onde as

características morfométricas dos dendritos diferem entre as células calosas

das diferentes camadas, do que na organização colunar, onde somente nas

camadas infragranulares as características morfológicas da arborização

dendríticas das CC difere entre as células localizadas nas colunas de septo e

as células localizadas nas colunas de barris.

Os terminais axonais calosos apresentaram morfologia semelhante

entre os que se encontram nas colunas de septo e os que se encontram nas

123

colunas de barris, sendo que os terminais axonais das colunas de septo

apresentam formas mais complexas e com mais botões sinápticos do que nos

terminais axonais das colunas de barris. Isso nos leva a concluir que o

processamento das vias lemniscal e paralemniscal mantêm-se segregados

mesmo após a transferência da informação sensorial de um hemisfério para o

outro. Essas características se reflete no comportamento do animal,

permitindo um controle motor mais elaborado das vibrissas mistaciais que

podem ser movimentadas de forma assimétrica e independente na busca da

informação sensorial enquanto o animal explora o ambiente.

124

6 – Conclusões

• No córtex de barris de rato, as células calosas estão presentes

nas camadas supragranulares, camada granular e camadas

infragranulares e são mais densamente concentradas nas

camadas supragranulares;

• Na camada granular, existem mais células calosas nos septo que

nos barris;

• As células calosas do PMBSF de rato possuem arborização

dendrítica semelhante a dos neurônios que fazem projeção

ipsolateral;

• Nas camadas infragranulares, a morfologia dendrítica das células

calosas do PMBSF de rato é mais exuberante nas colunas de

septos;

• Os axônios das células calosas do PMBSF de ratos apresentam-

se de forma discreta e pontual e conectam colunas corticais

homotópicas do PMBSF nos dois hemisférios cerebrais;

• Nas colunas de barris as conexões são mais precisas,

conectando barris homotópicos;

• Nas colunas de septos, a integração interhemisférica ocorre ao

longo das fileiras;

• Os axônios calosos das colunas de septos apresentam maior

quantidade de botões sinápticos e maior complexidade

geométrica.

• Existem pelo menos dois “canais” interhemisféricos que mantém

a segregação entre as vias lemniscal (barril) e paralemniscal

(septo).

125

7 - Perspectivas futuras e desdobramentos possíveis

Uma vez determinada a topografia das conexões córtico-corticais

interhemisféricas do PMBSF, assim como a morfologia dos dendritos, dos

axônios as terminações dessas células calosas, poderemos utilizar métodos

imunohistoquímicos para:

• Caracterizar a morfologia dos alvos pós-sinápticos;

• Caracterizar o(s) tipo(s) de neurotransmissor(es) que as células

alvos das conexões calosas utilizam;

Podemos também utilizar modelos de animais acalosos para averiguar

se há a formação dos feixes aberrantes (feixe de Probst e feixe sigmóide),

como ocorre em humanos (Tovar Moll at al., 2007) e comparar a morfometria

fina das células que formam esses feixes com a das células que cruzam

normalmente o corpo caloso.

126

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9 – Anexos

9.1 – Spatiotemporal distribution of proteoglycans in the developing rat’s barrel

field and the effects of early deafferentation.

9.2 – On the fate of extracellular hemoglobin and heme in brain.

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