Condiciones que favorecen la desnaturalización
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Condiciones que favorecen la desnaturalización
•Alta temperatura
•Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)
•Alto pH (desprotonación de bases)
Monitoreo de la desnaturalización
•Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm
Nucleótidos libres> ssADN> dsADN
•La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm
•La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitudLa Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud
•La condición standard es 0.12 M buffer fosfato de sodio (0.18 M en ion sodio
DESNATURALIZACION POR CALORDESNATURALIZACION POR CALOR
•Oligonucleótidos cortos
Tm = (A+T)x2oC + (C+G)x4oC
•Oligonucleótidos largosTm = 81.5 +16.6Log [Na+]+ +0.41 (%CG) – 625/N
N –length of oligo
Hidrólisis de ácidos nucleicosHidrólisis de ácidos nucleicos
Ruptura de enlaces en el esqueleto polinucleotídicoRuptura de enlaces en el esqueleto polinucleotídico Hidrólisis ácida (1 mM HCl): ruptura del enlace glicosídico entre purinas y Hidrólisis ácida (1 mM HCl): ruptura del enlace glicosídico entre purinas y
desoxiribosa (producto: ac. apurínicodesoxiribosa (producto: ac. apurínico Hidrólisis alcalina (Hidrólisis alcalina (RNA)RNA)– clivaje del enlace fosfodiester– clivaje del enlace fosfodiester
RenaturalizaciónRenaturalización La desnaturalización es un proceso reversibleLa desnaturalización es un proceso reversible Reanealing – reasociación de las cadenas de ADNReanealing – reasociación de las cadenas de ADN
La reasociación de ADN no repetido se produce en un La reasociación de ADN no repetido se produce en un rango de 2-logrango de 2-log
Cinética de renaturalizaciónCinética de renaturalización
Definición de CotDefinición de Cot1/21/2: función inversa de la : función inversa de la
constante de velocidad (constante de velocidad (kk))
tkCc
c
00 1
1
CC00t t ½ ½ :: valor de Cvalor de Coot cuando se t cuando se
reasoció un 50%reasoció un 50%
1)1(2
10 tkC
tkC01
1
2
1
2)1( 0 tkC
1120 tkC
ktC
12/10
¿Complejidad del Genoma ?
¿Qué es?
AAAAAAAAAAAAAAAA
ATATATATATATATATA
ATCATCATCATCATCA
C= 1; L=16
C= 2; L=16
C= 3; L=16
ATCGCTAGAACGTCTG C= 16; L=16
Curvas de reasociación de ADN no Curvas de reasociación de ADN no
repetitivorepetitivo (fragmentos de 500 nt)(fragmentos de 500 nt)
If no repeated sequences: C = to genome size (nt-bp)If no repeated sequences: C = to genome size (nt-bp)N (genome size) is determined directly from CN (genome size) is determined directly from C00tt1/21/2
C = NC = N
(N)(N)
106
repeats
3 genes
200 genes ≈ 4,000
genes
≈ 10,000 genes
CC00tt1/21/2
Reasociación para EucariotesReasociación para Eucariotes
> 2 logs: diferentes poblaciones> 2 logs: diferentes poblaciones
≈ 25-30% Moderadamente Repetitivo 350 copias
≈ 45-55% Copia única
≈ 20-25% altamente repetitivo: 2x106 copias
Leer del Lodish!!!!Leer del Lodish!!!!
¿Qué representan las secuencias ¿Qué representan las secuencias únicas, moderadamente repetidas y únicas, moderadamente repetidas y altamente repetidas???altamente repetidas???
Empaquetamiento del ADN Eucariota
En el genoma humano tenemos 3 x 109 bp distribuidos en 23 cromosomas
La forma B-DNA ocupa 3.4 A/bp
Debemos empaquetarlo en un núcleo con un diámetro de 5 m (10.000 veces)
El DNA durante la interfase se encuentra condensdo formando un complejo nucleoproteico denominado cromatina
La longitud total del ADN celular humano es de 2 metros!!!
Chromatin Proteins
Chromatin proteins 1. Histone Proteins (small, positively charged—rich in lysine and arginine residues) Core histones: H2A, H2B, H3, H4 Linker histone: H1 2. Nonhistone chromosomal proteins
El ADN se enrolla alrededor del núcleo histónico: Nucleosomas2 H2A2 H2B2 H32 H4
Nucleosomes-Contain a histone core octomer + 146 bp core DNA-Spaced ~200 bp apart(146 bp core DNA + 20-60 bp linker DNA)
“Beads on a String”
-Core DNA is protected DNases
La Histona H1 une 2 hélices de ADN
30-nm Fiber
2 Modelos para la fibra de cromatina de 30-nm
Un modelo de la estructura del cromosoma
DNA exists in chromatin form during interphase
DNA in most compact form (chromosomes) during metaphase of mitosis
¿Qué es el superenrollamiento?
Qué es el superenrollamiento?
El superenrollamiento se produce en casi
todos los cromosomas (circular o lineal)
Relajado vs Superenrollado
El ADN relajado no está superenrollado
En el superenrrolamiento negativo el ADN está subenrollado (favorece el desapareamiento de la doble hélice (el ADN circular aislado de células siempre se encuentra superenrollado negativamente
Linking Number (L or Lk) = número de veces que dos cadenas están entrelazadas
Twists (T or Tw) = número de vueltas de hélice
Writhes (W or Wr) = número de veces que el dúplex se entrecruza consigo mismo
L = T + WL = T + W
L = T + W
T = +3 T = +2 T = +1T = +0W = +0 W = +1 W = +2 W = +3
T = –3 T = –2 T = –1T = –0W = +0 W = –1 W = –2 W = –3relaxed
relaxed
Qué hacen las topoisomerasas?
1. Cambian el linking number de la molécula de ADN mediante:A) Cortando una o ambas cadenas y luego,B) Enrollarlas mas o menos y uniendo nuevamente los extremos.
2. Usualmente relajan el ADN superenrollado
Type I Topoisomerases
Topo I from E. coli 1) acts to relax only negative supercoils2) increases linking number by +1 increments
Topo I from eukaryotes 1) acts to relax positive or negative supercoils2) changes linking number by –1 or +1 increments
Maximumsupercoiled
3 min.Topo I
25 min. Topo I
Relaxation of SV40 DNA by Topo I
Type II Topoisomerases
All Type II Topoisomerases Can Catenate and Decatenate cccDNA molecules
Circular DNA molecules that use type II topoisomerases:
E. coli Eukaryotes-plasmids -mitochondrial DNA-E. coli chromosome -circular dsDNA viruses (SV40)
An E. coli Type II Topoisomerase: DNA Gyrase
Topo II (DNA Gyrase) from E. coli 1) Acts on both neg. and pos. supercoiled DNA2) Increases the # of neg. supercoils by increments of 23) Requires ATP
Sample Linking Number Questions
1) You have a relaxed 5,500 bp plasmid DNA molecule,which you treat with DNA gyrase to add 50 negative supercoils
A. How many helical turns are there in the relaxed molecule? B. What is the linking number of the molecule after treatment with DNA gyrase?
A. 5500 bp X 10 bp/turn = 550 turns
B. L = T + W = 550 – 50 = 500
•Virus cuyo material hereditario es ADN. •Virus cuyo material hereditario es ARN. •Virus cuyo material hereditario es ARN-ADN. •Virus cuyo material hereditario es ADN-ARN.
LOS CROMOSOMAS DE VIRUS: CLASIFICACIÓNLOS CROMOSOMAS DE VIRUS: CLASIFICACIÓN
Los virus pueden clasificarse en:
•Bacteriofagos o fagos: virus que parasitan a bacterias
•Virus Animales.
•Virus vegetales
Considerando el tipo de organismo que parasitan
Desde el punto de vista genético
VIRUS CUYO MATERIAL HEREDITARIO ES ADN
VIRUS ADN
Tipo de Molécula Tipo de HéliceTipo de virus según
huésped.Familia de virus
Circular
SencillaFago
ØX174 M13
Animal Parvovirus
Doble Animal
Papovavirus (SV40, polioma)
Adenovirus Herpetovirus
(Herpes) Poxvirus (viruela) Iridovirus (peste
porcina)
Lineal Doble Fago
Extremos cohesivos: Fago
Ø80, 434, P2, 186) Redundancia terminal: serie T-
par, T3 y T7
Fago filamentoso
M13
Esquema del bacteriofago
M13
Fago filamentoso
M13
Esquema del bacteriofago
M13
Fago filamentoso
M13
Esquema del bacteriofago
M13
Ha sido empleado ampliamente en estudios sobre la replicación del ADN
•tienen una cápside poliédrica •molécula de ADN circular de hélice sencilla (hebra +) con 5.400 nt
•forma replicativa duplex
de la hebra - se sintetiza el ARN mensajero que se traducirá para producir las proteínas de la cápside
ØX174
El bacteriofago M13 tiene una cápside de tipo filamentoso dentro de la cual se encuentra una molécula circular de ADN de hélice sencilla de 6.400 nucleotidos. Al igual que ØX174, también pasa por una forma replicativa dúplex.
Fago filamentoso M13Fago filamentoso M13
SV40 (Papovavirus)
tiene una cápside icosaédricaADN circular doble hélice de 5.243 pares de nucleotidos.
Su ADN se asocia con las histonas de la célula huésped
El fago posee una cápside icosaédrica con una cola. Dentro de la cápside existe una molécula de ADN doble hélice lineal con 48.000 pares de bases.
fago
fagos de la serie T
cápside icosaédrica con cola que encierra en su interior ADN doble hélice lineal (aproximadamente 166.000 pb).
Presentan redundancia terminal: repetición de una secuencia de 2.000 a 6.000 bp en los dos extremos
LOS CROMOSOMA DE LAS BACTERIAS: ORGANIZACIÓN EN DOMINIOS
la primera evidencia citológica se obtuvo más tarde (Cairns, 1963) marcando radiactivamente el ADN, realizando una autorradiografía y analizando los resultados al microscopio óptico.
La circularidad del cromosoma de E. colise demostró mediante estudios genéticos de construcción de mapas de tiempo mediante la técnica de la conjugación interrumpida (Jacob y Wollman, 1958).
F. JacobF. Jacob E. L. WollmanE. L. Wollman
En bacterias se han encontrado proteínas con características muy semejantes a
las histonas de los organismos eucariontes.
•la HU que es un dímero de subunidades diferentes y semejante a la histona H2B
•la proteína H dímero de subunidades idénticas y semejante a la histona H2A
•la proteína P semejante a las protaminas,
•la subunidad H1,
•el dímero HLP1 y
•el monómero HLP1.
PROTEÍNAS BACTERIANAS SEMEJANTES A LAS HISTONAS
PROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIASPROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIAS
ProteínaProteína ComposiciónComposición Contenido por Contenido por célulascélulas
Semejanza con Semejanza con eucarionteseucariontes
HUHU
Dímero Dímero subunidadesubunidades s y y de de
9.000 d.9.000 d.
40.000 dímeros40.000 dímeros Histona H2AHistona H2A
HH
Dímero Dímero subunidadesubunidades idénticas s idénticas de 28.000 d.de 28.000 d.
30.000 dímero30.000 dímero Histona H2BHistona H2B
IHFIHF
Subunidad Subunidad de de 10.500 d. 10.500 d.
Subunidad Subunidad de 9.500 de 9.500
d.d.
DesconocidoDesconocido DesconocidaDesconocida
H1H1 Subunidad de Subunidad de 15.000 d.15.000 d. 10.000 copias10.000 copias DesconocidaDesconocida
HLP1HLP1 Monómero de Monómero de 15.000 d.15.000 d. 20.000 copias20.000 copias DesconocidaDesconocida
PPSububnidad de Sububnidad de
3.000 d.3.000 d. DesconocidoDesconocido ProtaminasProtaminas
LOS PLASMIDIOS
.
Los plasmidios se pueden se clasifican según las funciones o el tipo
de información que llevan en: •Factores de Fertilidad o factores F. •Factores de resistencia de transferencia a drogas, factores RTF o
factores R. •Factores colicinógenos, factores Col o factores Cf. Las colicilinas son
sustancias que matan a las bacterias. Naturalmente las bacterias
productoras de colicilinas son inmunes a ellas.
Moléculas de ADN doble hélice circular que se replican de forma autónoma e independiente a la del cromosoma principal y que pueden, en algunas situaciones, integrarse en el cromosoma principal bacteriano y a partir de ese momento replicarse al mismo tiempo.
elementos genéticos extracromosómicos
El tamaño y número de los plasmidios es muy variable (2.000 a 100.000 pares de bases/1-100 copias por célula)
Algunas preguntas-ejercicios….Algunas preguntas-ejercicios….