Informazioni utili • E-mail: usare anche

– saverio.minucci@ieo.it • Libri:

– Abbas-Lichtman: le basi dell’immunologia – Pier-Lickzak-Wetzler: immunologia-infezione-immunità

• Test finale: – 2 domande aperte

• Una a piacere • Una scelta da me

• Lezioni su sito – L'home page: http://users.unimi.it/minucci/index.htm

• le lezioni si troveranno cliccando su didattica : – http://users.unimi.it/minucci/didattica.htm

– Ariel

Immunità

• Resistenza dell’individuo alle malattie, in particolare a quelle infettive

• Due meccanismi principali di immunità: – Innata: è immediata, non è specifica e non conferisce

protezione immunitaria – Adattativa: emerge durante la vita dell’individuo ed in

seguito all’esposizione ad un agente infettivo, è specifica per quell’agente infettivo e conferisce protezione immunitaria a successive esposizioni allo stesso agente

• Ogni sostanza che può stimolare qualsiasi tipo di risposta immunitaria adattativa (p.es. produzione di anticorpi) viene definita un antigene

Sistema immune • Insieme di cellule e molecole che effettua la risposta immunitaria

(innata o adattativa) • Ha 4 compiti principali

– Riconoscimento immunologico: cioè deve fare da “sensore” e capire che una infezione è in corso

• Cellule bianche del sangue (granulociti e macrofagi) per la risposta immune innata

• Linfociti per la risposta immune adattativa – Eliminazione dell’agente che espone l’antigene

• Anticorpi, molecole del complemento, funzioni dei linfociti citotossici e delle cellule della risposta innata

– Auto-regolazione: deve evitare che la risposta sia eccessiva • Quando fallisce si hanno le malattie autoimmuni

– Proteggere l’individuo da successive esposizioni allo stesso antigene • Tipica della immunità adattativa

Le cellule del sistema immune hanno origine nel midollo osseo

• Sistema immune è costituito da leucociti, che originano nel midollo osseo

• Tutte le cellule del sangue (incluso I leucociti) originano da cellule staminali ematopoietiche

Cellule del sistema immune

Linea mieloide e risposta innata

• CMP (common myeloid progenitor) dà origine a macrofagi, granulociti, mastociti, cellule dendritiche, megacariociti ed eritrociti

• Le cellule della risposta innata derivano dal CMP (nota: alcune cellule dendritiche originano dal CLP)

Macrofagi

• Derivano dai monociti che circolano nel sangue continuamente e poi migrano nei tessuti dove differenziano in macrofagi

• Insieme con I granulociti e le cellule dendritiche, costituiscono I fagociti del sistema immune

• Svolgono funzioni sia nella risposta innata che in quella adattativa • Fagocitosi di microrganismi nella risposta innata, eliminazione di patogeni

attaccati dalla risposta adattativa • Presentano l’antigene alle cellule della risposta adattativa

• Oltre alla fagocitosi inducono la risposta infiammatoria e producono citochine regolatorie

• Aldilà della funzione nell’immunità, sono spazzini generali dei nostri tessuti

Granulociti

• Vita più breve dei macrofagi (pochi giorni), e vengono prodotti in maniera regolata aumentando durante episodi di infezione o infiammazione

• Fagociti anch’essi, svolgono un ruolo chiave nella risposta immune innata • Inglobano molti microrganismi e poi li distruggono con le attività enzimatiche

degradative conservate nei granuli citoplasmatici • Importanza chiara da immunodeficienze dove sono gravemente ridotti o assenti, con

infezioni batteriche gravi e frequenti

Basofili ed eosinofili

• Importanti primariamente nella difesa contro I parassiti, troppo grandi per essere fagocitati dai macrofagi e dai neutrofili

• Coinvolti nelle reazioni allergiche

Mastociti

• Principalmente coinvolti in reazioni allergiche/infiammazione • Proteggono le superfici interne del corpo contro microrganismi patogeni (vermi

parassiti, per esempio)

Cellule dendritiche

• Hanno prolungamenti come I dendriti delle cellule neuronali • Migrano dal midollo osseo attraverso il sangue ai tessuti • Effettuano fagocitosi e macropinocitosi (ingestione di liquido extracellulare con il suo

contenuto) • Incontro con microrganismi: attivazione e maturazione con presentazione dell’antigene ai

linfociti T • Le più importanti antigen-presenting cells (APCs) • Svolgono ruolo di cerniera fra risposta innata ed adattativa

Linea linfoide • Origina dal common lymphoid progenitor (CLP) • Linfociti B e T (risposta adattativa) • Linfocita Natural Killer (risposta innata)

– Cellule infettate da virus – Cellule tumorali

• I linfociti B e T sono antigene-specifici – Esprimono recettori antigenici sulla superficie cellulare che si originano con un complesso

meccanismo molecolare per garantire la variabilità necessaria per “captare” praticamente tutti I segnali estranei antigenici

• Prima di incontrare l’antigene sono piccole cellule inattive (dette “naïve”) • Dopo l’incontro con l’antigene avviene la maturazione dei linfociti in linfociti

“effettori” pienamente funzionali • Linfociti B: dopo che un antigene ha legato un antigene presente su queste cellule (B-

cell receptor o BCR), il linfocita prolifera e matura in una plasmacellula e secerne anticorpi (detti anche immunoglobuline o Ig) che sono la forma solubile del recettore di superficie

• Linfociti T: dopo che l’antigene lega il T-cell receptor (TCR) maturano in: – Linfociti T citotossici: in grado di uccidere le cellule infettate da virus o batteri intracellulari – Linfociti T helper: producono segnali (citochine) che stimolano le cellule B a produrre

anticorpi, ed I macrofagi per stimolare la loro attività – Linfociti T regolatori: sopprimono l’attività di altri linfociti e controllano e limitano la risposta

immune • Durante la risposta immune alcuni linfociti T e B diventato “cellule della memoria”,

essenziali per una risposta più efficiente e rapida quando lo stesso antigene si ripresenta (principio alla base della vaccinazione, non discussa in questo corso di base)

Linfociti B/T

I tessuti linfoidi • Organi centrali

• Midollo osseo • Organo dove differenziano I

linfociti B • Timo

• Organo dove differenziano I linfociti T

• Dopo la loro maturazione negli organi primari I linfociti entrano in circolo come linfociti naïve, e circolano nei tessuti linfoidi periferici dove entrano a contatto con l’antigene e diventano linfociti attivati e quindi acquisiscono funzioni addizionali

• Organi periferici • Linfonodi • Milza • Tessuti linfoidi mucosali

• Intestino • Tratto aereo • Mucosa urogenitale • Etc.

Organi linfoidi periferici

• Specializzati nel: – Catturare le cellule dendritiche ricoperte di antigeni

• I patogeni possono entrare nel nostro organismo attraverso molte vie, ma gli organi linfoidi periferici sono il sito dove il “nemico” viene riconosciuto dai linfociti

– Dare inizio alla risposta immune acquisita • Attraverso la presentazione dell’antigene ai linfociti e la loro

attivazione – Fornire I segnali necessari per la ricircolazione dei

linfociti • Una volta attivati (e hanno proliferato), I linfociti lasciano gli

organi linfoidi periferici per dirigersi verso il sito di “attacco”

La risposta immune innata

Le tre fasi della risposta ad un agente infettivo

La prima linea di difesa

• In molti casi, I microrganismi potenzialmente patogeni (che scatenano una malattia nell’individuo colpito dall’infezione) vengono eliminati molto rapidamente dall’organismo grazie alla risposta immune innata

• I macrofagi riconoscono gli agenti patogeni, li fagocitano e producono diverse molecole (citochine e chemochine) che innescano una reazione infiammatoria

• La risposta acquisita si sviluppa solo quando gli agenti infettivi riescono a rompere questa prima linea di difesa

Prima fase

• Effettuata da molecole pre-esistenti – Enzimi anti-microbici come il lisozima attaccano la

parete batterica – Peptidi anti-microbici (defensine) lisano

direttamente le membrane batteriche – Proteine del plasma (complemento) facilitano lisi

e fagocitosi da parte dei macrofagi

La funzione delle superfici epiteliali • Cute e mucose sono una difesa molto importante

– Esempio: ferite molto più soggette ad infezioni • Mucose producono muco che contiene molte

glicoproteine dette mucine, che riducono l’adesione dei microrganismi alle cellule e facilitano la loro espulsione dal battito delle cilia delle mucose epiteliali – Malattie in cui la produzione del muco è alterata portano a

gravi infezioni • Ruolo dei batteri commensali o microbiota. Sono

batteri che svolgono un ruolo anche positivo per l’individuo che li ospita (simbiosi), e che producono sostanze antimicrobiche (batteriocine, acido lattico)

Barriere di difesa epiteliali

Le molecole antimicrobiche prodotte da epiteli-fagociti

• pH acido dello stomaco, acidi biliari, lipidi presenti nel tratto gastrointestinale sono una barriera chimica efficiente contro molti microrganismi

• Enzimi anti-batterici che attaccano la parete cellulare batterica – Lisozima e fosfolipasi A2 (nelle lacrime, saliva,

prodotti dai fagociti)

Lisozima • Peptidoglicano: polimero di

acetilglucosamina che si alterna a acido acetilmuramico, il tutto rinforzato da crosslinking peptidici

• Il lisozima è una glicosidasi che rompe un legame glicosidico presente nel peptidoglicano scindendo il legame fra I due zuccheri

• Per questo è più efficace contro I batteri Gram-positivi, in cui il peptidoglicano è esposto, rispetto ai batteri Gram-negativi in cui lo strato esterno è rappresentato dal lipopolisaccaride (LPS)

• L’esposizione della membrana lipidica dopo distruzione del petidoglicano la rende attaccabile dalla fosfolipasi A2

Peptidi antimicrobici

• Prodotti da cellule epiteliali e fagociti, si trovano nel fluido mucosale e nei tessuti

• Nei mammiferi ci sono tre classi principali: – Defensine – Catelicidine – Istatine

Defensine

• Peptidi carichi di 30-40aa che presentano una regione carica positivamente separata da una regione idrofobica

• In pochi minuti distruggono le membrane cellulari di batteri, funghi e di alcuni virus, uccidendo il microrganismo

• La regione idrofobica s’inserisce nella membrana lipidica, quindi si forma un poro che fa perdere la permeabilità cellulare

• Nei neutrofili le difensine sono immagazzinate nei granuli; quando avviene la fagocitosi I granuli si fondono con le vescicole fagocitiche ed aiutano ad uccidere I batteri

Il sistema del complemento nella risposta innata

• Originariamente è stato identificato come una componente della risposta adattativa, ma gioca un ruolo anche nella risposta innata – ”complemento” della risposta anticorpale

• Costituito da circa 30 proteine prodotte per lo più dal fegato • In assenza di infezione, queste proteine circolano nel sangue in

forma inattiva – Piccole quantità si attivano spontaneamente, da qui la necessità di

proteine regolatorie che ne limitano l’attività • In presenza di patogeni o di anticorpi legati ad agenti patogeni

abbiamo il processo di attivazione del complemento – 3 maniere diverse di attivazione del complemento

• L’attivazione avviene per proteolisi limitata, molte proteine del complemento sono proteasi che attivano altre proteasi – Le proteine inattive sono dette zimogeni

Le proteine del complemento

• Proteine inattive sono indicate con una lettera + numero: es. C1

• Prodotti delle reazioni proteolitiche di attivazione sono indicati dall’aggiunta di una lettera minuscola: es. C3a e C3b

• Il suffisso “b” indica la subunità più grande

• Il suffisso “a” indica la subunità più piccola che spesso agisce da mediatore infiammatorio

• Ci sono molte eccezioni!!!

Il complemento è un sistema di fattori proteici che riconosce e distrugge microrganismi

I. Riconoscimento (varie modalità)

II. Attivazione di C3

III. Fase effettrice

I fase

• Attivazione via lectine: MBL (mannose-binding lectin) o ficoline riconoscono carboidrati presenti sulla superficie esterna del microrganismo patogeno

• Attivazione “classica”: C1 (che comprende una PRR –C1q- e delle proteasi –C1r e C1s) riconosce un microrganismo direttamente o anticorpi che legano un microrganismo

• Attivazione “alternativa”: spontanea idrolisi della componente C3, che insieme ad altri fattori della via alternativa si lega direttamente alle superfici dei microrganismi

II fase

• Nella fase precedente si genera una attività di C3 convertasi (varia in funzione del pathway di attivazione), che cliva C3 per generare:

• C3b, componente chiave che si lega in maniera covalente alla superficie dei microrganismi ed agisce come opsonina, cioè facilita il riconoscimento del bersaglio da parte dei fagociti (che hanno recettori per C3b ed altre componenti del complemento)

• il legame covalente avviene grazie ad alcuni residui che vengono esposti solo dopo il clivaggio di C3 in C3b

• Viene esposto un gruppo tioesterico che reagisce con gruppi nucleofili (amine, idrossili)

• Anche C4b funziona con un meccanismo simile • C3a, che viene rilasciato ed induce infiammazione

III fase

• Reclutamento di fagociti, opsonizzazione • C3b+C3convertasi -> C5 convertasi che libera C5a (pro-infiammazione) e C5b che

inizia gli eventi finali dell’attivazione del complemento, in cui con altre proteine forma il membrane-attack complex, che crea un poro nella membrana cellulare e così causa lisi cellulare

Assemblaggio del MAC

Regolazione del complemento

• Le componenti del complemento una volta attive devono essere legate alla superficie dei patogeni, altrimenti vengono rapidamente inattivate

• Esistono inoltre molte proteine regolatorie che impediscono l’attivazione inappropriata – Cellule che stanno morendo possono attivare il

complemento, e questo facilita la loro rimozione

Seconda fase

• Le cellule della risposta immune innata vengono attivate, mettendo in atto molti meccanismi di eliminazione dell’agente patogeno

• Se ciò riesce, si ha risoluzione dell’infezione senza memoria

I “pattern-recognition receptors” della risposta immune innata

• Anche la risposta innata riconosce e distingue il “self” dal “non-self”, ma in maniera semplificata dal momento che per riconoscere il “non-self” utilizza un numero limitato di recettori, I “pattern-recognition receptors”

• I macrofagi, I neutrofili e le cellule dendritiche riconoscono molecole semplici e pattern strutturali molecolari presenti in molti microrganismi e detti “pathogen-associated molecular patterns “ (PAMPs), che non sono espressi dalle cellule del nostro corpo.

• I recettori per I PAMPs sono detti pattern-recognition receptors (PRRs), e riconoscono: – Oligosaccaridi – Peptidoglicani – Lipopolisaccaridi – DNA non metilato (il DNA delle cellule umane è metilato nella maggior

parte dei residui CpG)

Le cellule della risposta immune innata e la “pattern recognition”

• PRRs (pattern recognition receptor) sono divisi in 4 gruppi: – Recettori solubili (come MBL) – Recettori dei fagociti membrana-associati – Recettori di segnalazione membrana-associati – Recettori di segnalazione citoplasmatici

Diversità dei recettori fra immunità innata ed adattativa

Esempio di recettore immunità innata:TLR

Cellule immunità innata (macrofagi, dendritiche, polimorfonucleati) sono in grado di riconoscere strutture molecolari comune a patogeni diversi: Pathogen Associated Molecular Pattern (PAMP) I PAMP sono riconosciuti dai recettori Pattern Recognition Receptor (PRR), in numero limitato e coespressi sulla stessa cellula. Il legame attiva il processo infiammatorio La classe più importante: I recettori Toll (TLR) Esempio: il lipopolisaccaride LPS, costituente della parete di batteri Gram-, lega il recettore TLR4 e attiva la risposta infiammatoria mediata dalla proteina adattatrice MYD88 effettore é il pathway di NF-kB

PAMP

PRR

I fagociti

• Quando I microrganismi passano la barriera epiteliale, si trovano a dover affrontare l’attacco dei fagociti

• 3 classi – Macrofagi – Granulociti – Cellule dendritiche

Macrofagi

• I Monociti (sangue circolante) migrano nei tessuti e maturano in macrofagi – I macrofagi hanno avuto vari nomi a seconda del

tessuto (microglia nel sistema nervoso, cellule di Kupfer nel fegato…)

• Sono particolarmente abbondanti nel connettivo dei vari organi

Granulociti e cellule dendritiche • Granulociti

– Neutrofili • Maggiore potenziale fagocitario

– Eosinofili e Basofili • Cellule dendritiche

– Convenzionali: fagocitano ma il loro ruolo principale non è l’eliminazione degli agenti patogeni ma quello di processare molecole provenienti dal patogeno per generare antigeni peptidici in grado di stimolare la risposta immune adattativa dei linfociti T

– Plasmocitoidi: produttori di citochine (interferoni) antivirali, considerate come facenti parte della risposta innata

Riconoscimento degli agenti patogeni

• I fagociti esprimono diversi recettori di superficie in grado di riconoscere agenti patogeni direttamente, o mediante riconoscimento del complemento

• Tra questi recettori alcune lectine in grado di riconoscere carboidrati batterici, ed altri recettori per lipidi e lipoproteine batteriche

Fagocitosi • Il patogeno viene inglobato all’interno del

fagocita dopo una invaginazione della membrana plasmatica, a formare una vescicola che contiene il patogeno detta fagosoma

• Il fagosoma si acidifica e questo porta già alla morte di molti patogeni

• A questo punto c’è la fusione con I lisosomi (nei granulociti con I granuli che contengono varie molecole antimicrobiche) a formare il fagolisosoma che porta all distruzione dei microrganismi

• Importante è anche la produzione di ROS ed altre molecole ossidanti dai fagociti (vedi dopo)

• Nelle cellule dendritiche I patogeni

possono essere anche captati in maniera aspecifica per macropinocitosi

Recettori per il signaling intracellulare • Oltre ai recettori per la fagocitosi, le cellule della risposta innata presentano anche

recettori della superfamiglia GPCR (G-protein coupled receptor) che hanno funzione di signaling

• Recettore fMet-Leu-Phe (fMLP ) riconosce un particolare aminoacido (formil-metionina) che è presente nei batteri ma non nelle cellule eucariotiche, il recettore quindi “sente” la presenza dei batteri e stimola la migrazione dei macrofagi e neutrofili verso la regione con la massima concentrazione di peptidi contenenti questo aminoacido

• Oltre alla migrazione verso l’agente patogeno l’attivazione di fMLP induce anche la produzione di molecole antimicrobiche, incluso I ROS (“burst” respiratorio)

Recettori per il signaling intracellulare

Il burst respiratorio

Burst respiratorio • Nei neutrofili non attivati, le subunità dell’enzima

NADPH ossidasi sono localizzate in compartimenti cellulari diversi – Granuli – Citoplasma

• Dopo l’attivazione di fMLP-Rac2, le subunità si riassemblano sulla superficie del fagolisosoma

• NADPH trasferisce un elettrone dal FAD (suo cofattore) all’ossigeno a formare superossido, che attraverso altre reazioni contribuisce all’attivazione di altri enzimi del fagolisosoma ed al killing dei patogeni (conversione in acqua ossigenata ed ipoclorito)

Il ruolo delle citochine come segnali per una risposta “allargata” di difesa dell’organismo

Alcune citochine (TNF-alpha) possono causare shock e morte se espresse a livello sistemico

Interazione patogeno-ospite: Reazione infiammatoria

• L’infiammazione: – Favorisce il reclutamento di cellule immuni

(neutrofili, macrofagi) dal sangue al sito di infiammazione

– Favorisce coagulo locale che “blocca” l’infezione – Favorisce il riparo del tessuto danneggiato

Il fenomeno dell’infiammazione -Fasi dell’infiammazione: -eventi vascolari -eventi cellulari: reclutamento e attivazione dei leucociti

Le molecole che ci permettono di “sentire” e “reagire” all’agente patogeno: -induttori/mediatori dell’infiammazione Infiammazione = fonte di danno?

INFIAMMAZIONE La risposta dei tessuti connettivi vascolarizzati a un danno cellulare derivato agenti endogeni/esogeni

coinvolgimento dei vasi Passaggio di fluido e leucociti dai vasi allo spazio extra-vascolare.

Scopo: Eliminare la fonte del danno Riparare il tessuto danneggiato - Rigenerazione del tessuto con cellule dello stesso tipo - Sostituzione con tessuto connettivo: fibrosi (cicatrice)

Apparente paradosso

Infiammazione é un essenziale processo protettivo per eliminare la fonte del danno e le conseguenze Infiammazione é potenzialmente dannosa: -Ipersensibilità a punture insetti, tossine, farmaci -Malattia croniche -Cicatrici; sfiguranti, ostruzione intestinali, problemi articolari - cancro?

INFIAMMAZIONE

Acuta: breve durata (minuti-ore-giorni) edema emigrazione leucociti (neutrofili) Cronica lunga durata infiltrato linfociti e macrofagi angiogenesi fibrosi - necrosi

Inflammation Cardinal Signs

Redness (rubor) Swelling (tumor) Heat (calor) Pain (dolor) Loss of function (functio laesa)

Eventi infiammazione acuta

Fenomeni vascolari sono fondamentali 1) Alterazione diametro vasi: aumento flusso sangue

2) Cambio struttura vasi: rilascio di fluido e proteine (edema)

Fenomeni cellulari 3) reclutamento leucociti: si accumulano nel sito danneggiato 4) fagocitosi

Fenomeni vascolari

Fenomeni vascolari: cambio flusso e diametro vasi

1) vasodilatazione, con apertura di nuovi capillari: aumento flusso (rossore, calore)

2) Aumento permeabilità della microvascolatura: diminuzione flusso, essudato, accumulo eritrociti (STASI)

3) Marginazione leucocitaria: leucociti si attaccano all’endotelio e emigrano nello spazio interstiziale

Aumento permeabilità: come?

Fenomeni cellulari

1) Reclutamento leucocitario

2) fagocitosi

Reclutamento leucocitario

1) Eliminazione fonte del danno 2) Degradazione tessuto necrotico 3) Rilascio di enzimi, mediatori e radicali liberi: possibile prolungamento

stato infiammatorio

Momento fondamentale dell’infiammazione é il reclutamento di leucociti nel sito del danno

Scopo:

Fasi del reclutamento

Marginalizzazione: Il rallentamento del flusso sanguigno cambia le condizioni emodinamiche e si accumulano leucociti sulle pareti. Rotolamento: I leucociti interagiscono blandamente con endotelio e iniziano a rotolare. Attivazione: Interazione con fattori chemiotattici attiva i leucociti. Adesione: Leucociti attivati legano ora più avidamente l’endotelio. Migrazione trans-endoteliale: Leucociti iniziano a inserire pseudopodi nelle giunzioni cellulari fino a superare la membrana basale (DIAPEDESI) e entrare nello spazio interstiziale guidati da fattori chemiotattici.

Margination and Pavementing

diapedesi

Come vengono regolate le molecole di adesione durante attivazione leucocitaria?

Ri-distribuzione: P-selectin presente in cell. endoteliali in granuli Weibel-Palade sono ridistribuite sulla superficie su segnale di istamina, trombina, PAF Induzione di molecole di adesione: Neo-sintesi di E-selectin su stimolo di TNF e IL1 Aumento avidità di legame: Le integrine presenti su leucociti aumentano l’aviditá di legame con le immunoglobuline ICAM/VCAM in seguito a azione di chemochine

Terza fase

• Se le prime due linee di difesa effettuate nelle prime due fasi non sono sufficienti e la infezione continua, inizia la risposta immune adattativa