COMPORTAMENTO COMO INDICADOR DE SAÚDE EM … · Manuscript 2, the infected prawns that were...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

DOUTORADO EM PSICOBIOLOGIA

Viviane da Silva Medeiros

COMPORTAMENTO COMO INDICADOR DE SAÚDE EM CAMARÕES

INFECTADOS POR Vibrio parahaemolyticus

Natal/RN

2016




Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Psicobiologia, Centro de

Biociências da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, como requisito parcial para a

obtenção do título de Doutora em

Psicobiologia.

Área de concentração: Estudos do

Comportamento.

Orientadora: Profa. Dra. Maria de Fátima

Arruda.

Co-orientador: Prof. Dr. Pedro Carlos da C.

Martins.

Natal/RN

2016

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do

Centro de Biociências

Medeiros, Viviane da Silva.

Comportamento como indicador de saúde em camarões infectados

por Vibrio parahaemolyticus / Viviane da Silva Medeiros. – Natal,

RN, 2016.

68 f.: il.

Orientadora: Profa. Dra. Maria de Fátima Arruda.

Coorientador: Prof. Dr. Pedro Carlos da Cunha Martins.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.

1. Bem estar animal. – Tese. 2. Isopatia. – Tese. 3. Sanidade. –

Tese. I. 4. Vibriose. – Tese. I. Arruda, Maria de Fátima. II. Martins,

Pedro Carlos da Cunha. III. Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU

591.5




Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Psicobiologia do Centro de

Biociências da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, como requisito parcial para a

obtenção do título de Doutora em

Psicobiologia, e aprovada pela seguinte banca

examinadora:

Professora Doutora Maria de Fátima Arruda – UFRN

Presidente

Professora Doutora Cibele Soares Pontes – UFRN

Examinador Interno

Professora Doutora Emiko Shinosaki Mendes – UFRPE

Examinadora Externa

Professor Doutor José Cuauhtémoc Ibarra Gámez – ITSON, MX

Examinador Externo

Professor Doutor José Ticiano Arruda Ximenes de Lima – UFERSA

Examinador Externo

Natal/RN

13/11/2015

Todo caminho da gente é resvaloso.

Mas também, cair não prejudica demais

A gente levanta, a gente sobe, a gente volta!...

O correr da vida embrulha tudo, a vida é assim:

Esquenta e esfria, aperta e daí afrouxa,

Sossega e depois desinquieta.

O que ela quer da gente é coragem.

Guimarães Rosa

AGRADECIMENTOS

Quando a Inteligência suprema, causa primária de todas as coisas nos criou, criou-nos

para sermos felizes. No entanto, creio que ele não pretendia que houvesse doutorado, isso com

certeza é criação humana! Brincadeira! E por ser nossa criação, precisamos da ajuda de

nossos pares para dar cabo à tão árdua tarefa. Por isso, contei primeiro com a família, estes

amados e loucos que me apoiam e acreditam em mim: Mãe Lenita e Pai Claudionor (amor

presente), Laércio (amor de sempre → para sempre), filhos queridos e amados (Taís,

Carolina, Rafael, Clarice e Gabriel), netos feitos de ternura (Pedro, Lavínia, Miguel e Ítalo),

genros e nora para crescer o amor na família (Jorge Augusto, Paulo Dário, Raphael e

Maynnara), Edna Silva (minha Beth querida), Kácia, Claudinha e todos os Medeiros (partindo

dos meus amores Lenildo e Lêda), Silva, Rocha e Trindade. A todos vocês, agradeço!

Fátima Arruda, você é especial, admiro muito a sua pessoa. Obrigada por tudo, do

pessoal ao profissional você é minha orientadora! Teresa Mota, amiga de muitos anos, até

comadre virou! Arrilton, Fívia, Regina Silva, Alessandra, Wall e Alícia, vocês me ajudaram

muito além da academia.

Professora Emiko, meu porto seguro na UFRPE, sou muito grata por tudo. E, claro,

agradeço a todos da UFRPE: Fernando Leandro, Alexandre Duarte, Carol Notaro, Rodrigo,

João, Juliana (CE) e Juliana (PE), Artur e todos os bolsistas e funcionários, vocês me

ensinaram muito.

Ao professor Alberto Nunes e toda equipe do LABOMAR, pela doação dos sujeitos

experimentais.

Pedro Carlos, agradecida pela enorme contribuição e confiança, seu laboratório ficou

comigo por dois anos e consegui aprender sobre o que eu nem imaginava saber: sanidade na

carcinicultura. Tamiris (braço direito), Emanuelly, Cajá, Isabelle, Emilly, João Henrique,

Jonas Leite, João Pedro, Rony Jeijo, Hortência, todos os bolsistas do CSAq, obrigada.

Obrigada Seixas e todos os professores e funcionários do DOL, vocês me ajudaram, e muito!

Pessoal da Microbiologia da UFRN, técnicas e professoras, obrigada por me

socorrerem para os testes de Gram, para a escala Mc Farland. Agradeço às Professoras

Daniele, Nayssandra, Cadu Moura, amigos para sempre!

Professor Idivaldo e Ilany, da Officinalis, agradeço pelo trabalho e estudo, sempre me

orientando nas dúvidas, doando material, emprestando livros, fazendo medicação, muito

agradecida!

Minha querida Daniele Bezerra, uma galega muito amiga, colega de doutorado, colega

muitos meses na FACEX e que conto todas as horas. Sem palavras para lhe dizer o quanto

você é importante em minha vida! Priscila, Dina e Fabiana Gonçalves, esta, colega de

mestrado e doutorado, agora colega da UFRN, obrigada por seu semblante de paz todos os

momentos.

Escola Agrícola de Jundiaí – aqui eu vejo a escola em que trabalho como um núcleo

de amor, não é para ser piegas não, lá somos assim. A patente não importa, quem limpa o

chão, quem carrega o lixo, quem constrói a parede, quem faz o documento na direção, quem

serve o café, quem dirige ou coordena um setor, tanto faz a função, lá você é uma pessoa!

Amo a EAJ e muitas são as pessoas para agradecer: Gerbson, Josenildo (Chinida), Jailson,

Carlinhos, João Inácio, Lígia, Joanice, Afrânio, Eronilson, Herika, Dona Deusa, Dorinha,

Rodolfo, Isaque, Valquíria, Amandita, Gean, Dulce, Dalvanisa, Prof. Júlio, Lulão, Cristiano,

Emerson, Cláudio, Seu Raimundo, sei que tem muito mais... A todos vocês pedi ajuda,

compreensão e sempre encontrei carinho, respeito e tolerância. Vocês me ensinam a viver.

Meus colegas e amigos queridos da Aquicultura, aprendo muito com todos vocês.

Obrigada Karina, Paulo, Cibele, Fabiana, David, Dárlio, Fábio, Rodrigo, vocês me ajudaram

muito! Lendo a tese, doando material, emprestando aquário, doando aeração, avisando da

queda de energia no DOL, ensinando a fazer filtro biológico, fazendo testes, lendo, relendo,

auxiliando, fazendo parte da banca... Vocês são super!

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, por ter me propiciado fazer o que mais

gosto: estudar. Pelos bolsistas, pelo material, pelo afastamento, pelo estágio no México, por

desmantelar a minha vida e juntar em uma nova etapa da mesma vida.

Para los amigos de México. Me gustaria de decir a ustedes que le soy muy grata e muy

feliz con su amistad, que todas las personas que conoci son queridas y no hay um solo dia que

no me acuerde de los momentos em que estuvi ahi. Profesor Temo, Martha Quiroz, Ceci,

Reyes, Ricardo, Marco, Diva, Doña Sara, Migdalia, Elda, Ariel, Lionel, Martha, El Patólogo

Lionel, Maestra Conchita, Rafael Borguez, Livia, Rebecca, Gilberto, Gerardo. Gracias por

todo.

E para agradecer melhor: ao bolsista sem remuneração, ao psicólogo sem formação, ao

técnico em aquicultura, técnico em informática, massagista, saco de pancada, ASG, motorista,

relações públicas, agente de turismo, amigo, namorado, companheiro, amor da minha vida,

Laércio Medeiros!

RESUMO

A carcinicultura mundial sofre grandes perdas econômicas por enfermidades virais e

bacterianas, sendo importante que sejam incentivados estudos e ações que minimizem os

danos provocados por estas doenças em todas as áreas, desde os econômicos, saúde animal e

humana até ambientais. Diante destes fatos, foram avaliados: a) o efeito da presença de areia

como substrato sobre o comportamento de camarões juvenis Litopenaeus vannamei em

laboratório (manuscrito I); b) as atividades comportamentais de camarões juvenis L. vannamei

infectados por Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802) e submetidos a tratamentos

veterinários em laboratório (manuscrito II); c) identificação dos agentes envolvidos em

enfermidades com altas mortalidades em fazendas de carcinicultura (manuscrito III). O estudo

foi realizado em três etapas. Na primeira etapa (manuscrito I), os animais foram submetidos a

tratamentos com ausência ou presença de areia como substrato, divididos em dois grupos,

cujos animais foram colocados em 30 aquários de material plástico com capacidade para

quatro litros, 15 deles com areia como substrato e 15 sem areia. Foram avaliados os

comportamentos de enterramento somente para o grupo com areia e inatividade, natação,

ingestão de alimento, limpeza e rastejamento; sobrevivência e ganho de peso para ambos os

grupos. Na segunda etapa (manuscrito II), os animais foram divididos em cinco grupos: 1)

Controle 1, 2) Controle 2 -animais infectados e sem tratamento veterinário; 3) Animais

infectados, tratados com medicamento isopático ISO; 4) Animais infectados, tratados com

medicamento antibiótico (florfenicol) ANTIB; 5) Animais infectados, tratados com

medicamentos isopático e antibiótico (florfenicol) simultaneamente ISO+ANTIB. Foram

então analisados os comportamentos desses animais, a sobrevivência e o ganho de peso. Na

terceira etapa (manuscrito III), foi visitada uma fazenda de carcinicultura com altos índices de

mortalidade na cidade de Obregón, em Sonora, no México. Foram coletados 30 animais dessa

fazenda, os quais foram levados para análises presuntivas (análise a fresco e bacteriologia) e

confirmatórias (bioquímica e qPCR) para identificação de agentes patogênicos virais e/ou

bacterianos. Os resultados obtidos no manuscrito 1 mostram que não houve diferença

significativa entre os comportamentos observados, também não houve diferença entre

crescimento e ganho de peso, indicando que a ausência de areia não interferiu na expressão de

comportamento dos animais. Isto possibilita que os experimentos seguintes não usem areia

como substrato. No manuscrito 2, os camarões infectados e tratados com isopatia e antibiótico

simultaneamente apresentaram desempenho comportamental semelhante ao grupo controle 1,

indicando que apresentam comportamento compatível com animais saudáveis. No Manuscrito

3, ficou evidente que a alta mortalidade identificada em viveiros com camarões juvenis, além

da cepa patógena causadora da AHPND, Vibrio parahaemolyticus, outras espécies de

bactérias dos gêneros Vibrio e Aeromonas estavam associadas.

Palavras chave: Bem estar animal; Isopatia; Sanidade; Vibriose.

ABSTRACT

World shrimp culture suffers large economic losses for viral and bacterial diseases, so it is

important that studies and actions be encouraged to minimise the damage caused by these

diseases in all areas - economy, animal and human health and environment. The present study

evaluated the effect of a) presence of the substrate on the behaviour of juvenile shrimp

Litopenaeus vannamei in the laboratory (manuscript I); b) behavioral activities of juvenile

shrimp L. vannamei infected by Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802) and subjected to

veterinary treatments in laboratory (manuscript II); c) identified the pathogenic agents

associated to diseases with high mortality in shrimp culture farms (manuscript III). The study

was conducted in three stages. In the first stage (manuscript I), the animals were subjected to

two treatments, the absence or presence of sand as substrate, and were divided into two

groups, placed in 30 plastic aquariums with capacity for four liters, half of them with sand on

the bottom as substrate and the other half without sand. Burying behavior was evaluated only

for the group whose aquariums had sand as substrate; inactivity, swimming, food intake,

cleaning and crawling, survival and weight gain were measured in both groups. In the second

stage (manuscript II), the animals were divided into five groups: 1) control, 2) infected

animals with no veterinary treatment; 3) infected animals treated with isopathic medicine; 4)

infected animals treated with antibiotics (florfenicol); 5) infected animals treated with

isopathic medicine plus antibiotics (florfenicol). Then, the behaviors and survival and weight

gain of the animals were analysed. In the third stage, we visited a shrimp farm with high rates

of mortality in Obregón city, Sonora, Mexico. Thirty animals collected in the ponds were

taken to presumptive (fresh smear analysis and bacteriology) and confirmatory (Biochemistry

and qPCR) analyses for identification of viral and/or bacterial pathogens. The results in

Manuscript 1 showed that for juvenile prawns maintained in aquariums with or without sand

as substrate for up to three weeks, behavior, survival and weight gain were not significantly

different, which demonstrates that lack of sand on the substrate did not modify behavioral

responses of the animals. So, in the next stage, sand was not used as substrate anymore. In

Manuscript 2, the infected prawns that were treated with isopathy plus antibiotics showed

behavioral performance similar to the control group, indicating that their behavior is

compatible with healthy individuals. And in Manuscript 3, concerning the high mortality of

juvenile prawns in the ponds, besides the pathogenous that causes AHPND, Vibrio

parahaemolyticus, other species of bacteria of the genus Vibrio and Aeromonas were

associated to the pathology of the prawns.

Keywords: animal welfare; Isopathy; Sanity; Vibriosis.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

INTRODUÇÃO

Figura 1 – Diagrama da anatomia externa de L. vannamei............................................. 14

MANUSCRITO I

Figura 1 – Tratamento sem areia..................................................................................... 26

Figura 2 – Tratamento com areia..................................................................................... 26

MANUSCRITO II

Figura 1 – Estantes e aquários de vidro numerados......................................................... 35

Figura 2 – Comportamento alimentar dos camarões infectados por Vibrio e

submetidos a tratamentos clínicos com antibiótico e/ou isopatia, após a oferta da

ração. Tratamentos: 1) ANTIB: grupo de camarões infectados e com administração

de antibióticos; 2) CONTR: grupo controle sem inoculação de patógeno e sem

administração de medicamentos alopático e isopático; 3) INFEC: grupo infectado e

sem administração de medicamentos alopático e isopático; 4) ISO+ANTIB: grupo

infectado e com administração de medicamentos alopático e isopático; 5) ISOP:

grupo infectado e com administração de medicamento isopático. Médias seguidas de

letras iguais não diferem pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade...........................

37

Figura 3 – Comportamento manipulação do alimento após a oferta da ração em L.

vannamei Tratamentos: 1) ANTIB: grupo de camarões infectados e com

administração de antibiótico; 2) CONTR: grupo controle sem inoculação de patógeno

e sem administração de medicamentos alopático e isopático; 3) INFEC: grupo

infectado e sem administração de medicamentos alopático e isopático; 4)

ISO+ANTIB: grupo infectado e com administração de medicamentos alopático e

isopático; 5) ISO: grupo infectado e com administração de medicamento isopático.

Médias seguidas de letras iguais não diferem pelo teste de Tukey, a 5% de

probabilidade.

39

Figura 4 – Comportamentos do camarão L. vannamei infectados por Vibrio e

submetidos a tratamentos clínicos com antibiótico e/ou isopatia, após a oferta da

ração. Figura A: comportamento limpeza. Figura B: comportamento de inatividade.

Figura C: comportamento rastejando. Figura D: comportamento de natação.

Tratamentos: 1) ANTIB: grupo de camarões infectados e com administração de

antibióticos; 2) CONTR: grupo controle sem inoculação de patógeno e sem

administração de medicamentos alopático e isopático; 3) INFEC: grupo infectado e

sem administração de medicamentos alopático e isopático; 4) ISO+ANTIB: grupo

infectado e com administração de medicamentos alopático e isopático; 5) ISOP:

grupo infectado e com administração de medicamento isopático. Médias seguidas de

letras iguais não diferem pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade..........................

41

Figura 5 – Média de ganho de peso nos grupos experimentais a cada 6 dias do

experimento a) Controle, b) Isopatia e florfenicol simultaneamente (ISO+ANTIB), c)

Infectado, d) Antibiótico florfenicol (ANTIB) e Isopatia............................................... 43

Quadro 1 – Descrição dos resultados da observação histopatológica dos camarões dos

5 grupos experimentais, onde 0= não encontrado lesão, 1= encontrado lesões

características, 2= encontradas muitas lesões características.......................................

44

Tabela 1 – Descrição dos grupos experimentais.............................................................. 48

Tabela 2 – Descrição dos comportamentos observados durante o experimento............. 48

Tabela 3 – Taxa de mortalidade observada nos grupos................................................... 48

MANUSCRITO III

Figura 1 – Camarão L. vannamei recuperado de viveiro com alta mortalidade com

carapaça amolecida, letárgico e hepatopâncreas esbranquiçado.....................................

52

Figura 2 – Camarões apresentando hepatopâncreas esbranquiçado e conteúdo

intestinal entrecortado. Observe a diferença de coloração entre hepatopâncreas (seta).

54

Figura 3 – Lesões de necrose e má formação dos túbulos do hepatopâncreas.............. 55

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Quadro 1 – Estão apresentadas as hipóteses e suas respectivas predições e os

resultados que demonstram se elas foram ou não corroboradas.....................................

59

SUMÁRIO

APRESENTAÇÃO ................................................................................................................. 11

INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 12

HIPÓTESES E PREDIÇÕES ............................................................................................... 21

OBJETIVOS ........................................................................................................................... 22

OBJETIVO GERAL ................................................................................................................. 22

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................... 22

MANUSCRITO I – COMPORTAMENTO DO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus

vannamei (BOONE, 1931) EM AQUÁRIOS DE EXPERIMENTAÇÃO COMO

INDICADOR DE CONFORTO ............................................................................................ 23

MANUSCRITO II – RESPOSTAS COMPORTAMENTAIS DE CAMARÕES

INFECTADOS POR VIBRIOS E EXPOSTOS A DIFERENTES TRATAMENTOS

VETERINÁRIOS ................................................................................................................... 31

MANUSCRITO III – DETECÇÃO DE NECROSE HEPATOPANCREÁTICA AGUDA

ASSOCIADA A BACTÉRIAS OPORTUNISTAS EM CAMARÕES JUVENIS ............ 50

CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................. 57

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 59

11

APRESENTAÇÃO

Optou-se por colocar esta produção científica em formato de manuscritos para

publicação. Todavia, para esclarecer etapas importantes da construção deste documento – e

que foi comum a todos os manuscritos – a tese foi elaborada da seguinte forma: (a) introdução

geral; (b) hipóteses e predições; e (c) objetivos. Em seguida, apresentam-se (d) propostas de

manuscritos; (e) considerações finais; (f) conclusões; e (g) referências. Não foi descrita uma

metodologia geral, pois, aos experimentos foram aplicadas metodologias muito distintas entre

si, em todas suas etapas nos dois primeiros manuscritos e o ultimo sendo um relato de caso.

Dessa forma, em cada trabalho constarão os métodos ali utilizados para o desenvolvimento do

estudo.

A introdução geral consta de uma revisão da literatura sobre as enfermidades que

atingem os camarões criados, as enfermidades provocadas por bactérias do gênero Vibrio, as

terapias utilizadas na produção animal e os riscos presumíveis para as atividades aquícolas por

uso de substâncias potencialmente impactantes ao ambiente.

Já o manuscrito I, é o resultado do primeiro experimento, em que se buscou esclarecer

se a ausência de sedimento nos aquários de experimentação poderia causar alguma mudança

comportamental que fosse passível de gerar algum dano aos animais.

No manuscrito II, é relatado, pela primeira vez, o tratamento de camarões com

enfermidades bacterianas através de isopatia. Neste estudo, observou-se as respostas

comportamentais à infecção bacteriana e às alterações de comportamento durante o uso de

terapêuticas alopática e isopática ou, ainda, ambas.

O manuscrito III é um relato de caso decorrente do interesse em estudar um surto de

enfermidade bacteriana provocada por Vibrio parahaemolyticus, ainda não diagnosticada no

Brasil, a Hepatopancreatite necrosante aguda – AHPND. Acompanhou-se animais infectados

por seus sinais clínicos, observou-se o comportamento nos viveiros e identificou-se, em

laboratório, a ocorrência do agente causador da enfermidade e outros agentes patogênicos.

Ao fim do trabalho, apresentam-se as considerações finais a partir das conclusões

geradas das hipóteses criadas inicialmente, além do referencial utilizado para a produção da

tese.

12

INTRODUÇÃO

O camarão continua a ter o maior valor entre os commodities, representando cerca de

15% do valor total dos produtos oriundos da pesca, comercializados internacionalmente em

2012 (FAO, 2014).

A produção mundial deve-se, sobretudo aos países asiáticos, que chegam a uma

produção superior a 1 milhão de toneladas anuais. Em primeiro lugar destaca-se a China, em

seguida a Tailândia e o Vietnã. Entre os países do continente americano, destacam-se

Equador, México e Brasil (FAO, 2014).

Em 2011, o camarão tornou-se uma das mercadorias mais negociadas do agronegócio

mundial (FAO, 2014) e, em 2012, sua produção oriunda da captura registrou 3,4 milhões de

toneladas (FAO, 2014). Devido ao aumento na demanda por camarões e a diminuição dos

estoques pesqueiros, observou-se, a partir de 2010, uma queda na produção por captura (FAO,

2014). Todavia, o camarão mantém-se como produto interessante e importante no mercado

mundial e sua criação é sempre crescente. Observa-se que, em 2012, 48,9% da produção

aquícola do mundo foi originária de criatórios e, desta produção, a de crustáceos foi bastante

representativa, sendo liderada pelos camarões marinhos com 70,6% (FAO, 2014).

A criação de camarões – ou carcinocultura, como é conhecida no Brasil

(CAVALCANTI, 2012) – é uma área da produção animal muito importante do ponto de vista

de segurança alimentar como vimos, mas também o é do ponto de vista social, pois grande

parte de seus produtores estão caracterizados como pequenos e médios, tendo como maiores

estados produtores os da região nordeste do país (ROCHA, 2015).

Observa-se que a produção mundial de camarões criados diminuiu em 2012 e 2013,

sobretudo como consequência de problemas relacionados à enfermidades como a

hepatopancreatite necrosante aguda (AHPND), em alguns países da Ásia e da América Latina,

levando a uma redução da oferta e impulsionando os preços do camarão em todo o mundo.

Nos camarões da família Peneidae está a espécie mais relevante para a criação, a

saber, Litopenaeus vannamei, a mais explorada comercialmente no sul do México,

Guatemala, El Salvador e em todo Hemisfério Ocidental (BARBIERE JÚNIOR;

OSTRENSKY NETO, 2002; FAO, 2012), destacando-se também no oriente como a espécie

mais criada, a partir de 2003, em detrimento do Penaeus mondon (FAO, 2014).

Até o ano 2003, o Brasil apresentava-se como o maior produtor de camarão cultivado

do Hemisfério Ocidental, tendo sua produção chegado a, aproximadamente, 90 mil toneladas,

correspondendo a mais de 6% da oferta mundial no segmento de camarões marinhos

13

cultivados (ROCHA et al., 2004). As dificuldades que ocorreram a partir de 2004, seja por

fatores climáticos, enfermidades ou questões de mercado internacional (MADRID, 2005;

ROCHA, 2009), levaram à queda da exportação, fazendo com que a produção se voltasse para

o mercado interno. Desta forma, com tal nova demanda, a produção de peneídeos na região

Nordeste continua sendo da espécie L. vannamei e é líder na produção brasileira de camarões

(FAO, 2012).

Esta espécie é indicada para a criação devido à suas características, que consistem em

ampla tolerância à salinidade e à temperatura, resistência ao manuseio, rápida taxa de

crescimento, sobrevivência e boa taxa de conversão alimentar (BRAY; LAWRENCE;

LEUNG-TRUJILLO, 1994; SAOUD et al., 2003). Além disso, é uma espécie que apresenta

crescimento uniforme e grande capacidade adaptativa às mais variadas condições de criação

(BROCK; MAIN, 1994).

Observa-se a anatomia da espécie L. vannamei, que apresenta o corpo alongado,

comprimido lateralmente e coberto por um exoesqueleto calcificado, dividido em cefalotórax

(cabeça) e abdômen. No cefalotórax, encontram-se os principais órgãos funcionais como o

coração, o estômago, a glândula digestória (hepatopâncreas) e as brânquias (FENUCCI,

1988). Ventralmente, localizam-se a boca e os apêndices torácicos. Na boca, as mandíbulas e

maxilas servem para captura e dilaceração do alimento, o que permite sua ingestão. Próximo à

boca, encontram-se também três pares de maxilípedes. Os apêndices torácicos são

constituídos por cinco pares de pereiópodos (BROCK; MAIN, 1994; NUNES; MARTINS,

2002). Geralmente, somente o terceiro par de maxilípedes e os três primeiros pares de

pereiópodos participam da apreensão, manipulação e condução do alimento à boca, enquanto

os dois últimos pares têm papel na manutenção do equilíbrio durante a alimentação (NUNES;

GESTEIRA; GODDARD, 1997), participando ainda na locomoção e detecção de alimentos

enterrados. A localização e o reconhecimento do alimento são feitos principalmente pelas

antenas e antênulas. No abdômen, encontram-se as estruturas natatórias (pleópodos), os

apêndices reprodutivos dos machos (petasmas) e parte do cordão nervoso (NUNES;

MARTINS, 2002), conforme designado na Figura 1, disposta a seguir.

14

Figura 2 - Diagrama da anatomia externa de L. vannamei

Fonte: LEBER; PRUDER, 1988.

A digestão química nos camarões começa após o bolo alimentar atravessar o esôfago e

o estômago, também chamados conjuntamente de proventrículo. Essa é uma estrutura

complexa e dividida em duas porções: anterior ou cardíaca e posterior ou pilórica, que estão

separadas por uma válvula cárdio-pilórica. A ação das partes que compõem o estômago

possibilita a maceração do alimento e impede a passagem das partículas grandes para o

intestino médio. O alimento, sendo então misturado a secreções da glândula do intestino

médio, conhecida como hepatopâncreas, leva à degradação química do alimento. O

hepatopâncreas é um dos órgãos mais importantes em peneídeos, chegando a representar de 2

a 6% do peso corporal de um animal (DALL; MORIARTY, 1983).

Durante o período de muda, os camarões não se alimentam, pois algumas porções da

boca, esôfago e parte do estômago se desprendem junto com o exoesqueleto antigo e deixam

de ser funcionais, impedindo a realização de funções como apreensão, passagem e trituração

do alimento (CECCALDI, 1997). Por meio da muda, ocorre o aumento de tamanho e de peso

do camarão e tem lugar outros processos vitais, como expulsão de parasitas e regeneração dos

apêndices (BARNABÉ, 1996). Sendo assim, as modificações estruturais e fisiológicas

causadas pela muda interferem em diversos sistemas funcionais (LOCKWOOD, 1967), como

a percepção sensorial e o comportamento, que são direta ou indiretamente afetados pela troca

do tegumento e por ciclos característicos de acumulação metabólica (PASSANO, 1960).

O comportamento que se modifica diante de uma alteração do ambiente interno ou

externo traz em si um sinal, que pode ser observado e ter significado na comunicação, por isso

15

a Etologia, ciência que estuda o comportamento animal, torna-se uma excelente ferramenta de

tradução do animal e suas relações com o ambiente, vindo somar-se a várias outras atividades,

sobretudo na perspectiva do bem-estar animal, buscando a melhoria na produção, levando

sempre em conta a promoção de conforto e de tratamentos eficientes que atendam às

necessidades dos mesmos (YAMAMOTO, 2011). Isso deve acontecer, ora pela compreensão

de comportamentos simples e complexos, ora discutindo a vida em grupo, o comportamento

social e reprodutivo das espécies, trazendo benefícios aos vertebrados e invertebrados,

melhoria aos sistemas de produção e possibilitando menor comprometimento da saúde

animal.

Os benefícios do estudo do comportamento para a produção são difundidos em várias

áreas da criação. Nesse sentido, tais conhecimentos possibilitam a diminuição do sofrimento

dos animais e, consequentemente, a promoção de conforto aos mesmos, servindo de base para

que outra ciência assim surgisse: o bem-estar animal. Esse campo da ciência tem conceito

mais abrangente, seja este interno ou externo (BROOM, 1986), assim, vemos que estão

implícitas todas as modificações mentais e/ou físicas que possam ocorrer a um animal em

relação ao seu ambiente. A dificuldade de adaptação, repetidas vezes ou por tempo muito

longo, pode levar o animal a uma situação de estresse, propiciando o ataque por agentes

patogênicos. Observa-se, nessa direção, que a doença pode ser a causa ou ser causada pelo

bem-estar pobre (BROOM, 1988).

Estudar o comportamento de crustáceos e, mais especificamente, de camarões, tem

trazido informações importantes que devem ser utilizadas como primeiro passo para novas

pesquisas, mas que podem também ser aplicadas à produção animal. Muitos estudos de

comportamento têm auxiliado a ciência do bem-estar, pois, nesses, observa-se a densidade de

estocagem ideal de camarões criados para que o estresse não interfira negativamente no

conforto, seja sobre a própria densidade de estocagem (SILVA et al., 2013), horários de

alimentação (PONTES; ARRUDA, 2005) ou tipos e cores de substrato (LUCHIARI et al.,

2013; SANTOS; FREIRE; PONTES, 2013).

As pesquisas com L. vannamei juvenil descrevem comportamentos como natação,

limpeza, rastejamento e, principalmente, alimentação. Tais itens têm sido descritos como

importantes ferramentas para os produtores, pois a ingestão e o enchimento do trato digestório

podem ser itens utilizados para avaliação da ocorrência de desperdício de alimento, dado este

que influenciaria não só em ganho de peso, mas a qualidade de água e economia no processo

(PONTES; ARRUDA, 2005; SANTOS; FREIRE; PONTES, 2013), Outros autores,

patologistas em sua maioria, descreveram os sinais clínicos de doenças destes animais

16

(MORALES-COVARRUBIAS, 2010; LIMONTA; COFFILNY, 2012), porém sem o registro

da expressão comportamental destes. Ao observar animais doentes, pôde-se identificar as

mudanças que ocorreram durante o adoecimento, podendo influenciar sobremaneira o

tratamento clínico dado a estas enfermidades, identificando as possíveis fases em que os

animais devem ser efetivamente tratados.

Percebe-se que um ambiente inadequado para criação, somado a fatores internos dos

organismos animais, podem provocar mudanças na fisiologia e no comportamento dos

crustáceos (HINDLEY, 1975), que levará a um estado de estresse, tornando possível o

surgimento de doenças e, em último caso, levar à morte os animais. Neste contexto, podem

surgir enfermidades infecciosas causadas por agentes patogênicos como vírus, bactérias,

protozoários e fungos. Considera-se que as enfermidades têm sido o principal fator limitante

para o sucesso da carcinicultura mundial (BARRACCO; PERAZOLO; ROSA, 2008).

Tratamentos podem não ser eficazes e vacinas não são viáveis devido ao sistema imune dos

invertebrados não contar com a possibilidade de desenvolver imunidade adquirida, na

concepção clássica do termo, diminuindo a possibilidade de se prevenir e controlar doenças

nesses animais através deste método (SMITH; BROWN; HAUTON, 2003).

Observou-se a partir dos anos 80 e na década de 90 que muitas doenças tiveram um

efeito devastador na criação de camarão marinho, causando um colapso na produção de

grandes países produtores e grande impacto econômico na indústria (HERNANDEZ;

NUNES, 2001). Desde então, as enfermidades passaram a ser vistas como um obstáculo

econômico e uma ameaça à viabilidade desta criação. Considerando o potencial da indústria

aquícola mundial, as enfermidades em organismos aquáticos passaram a figurar entre os

principais fatores de risco do investimento nesta área (GARCÍA, 2003).

Uma destas enfermidades é a doença da mancha branca (WSSV), a qual tem arrasado

criações de camarão no mundo (LIGHTNER, 2005), chegando ao Brasil e levando a quedas

na produção de até 95% (COSTA, 2010). Mais recentemente uma nova doença causada por

uma bactéria já conhecida, o Vibrio parahaemolyticus, foi inicialmente chamada síndrome da

mortalidade precoce (EMS) e, após ser identificado seu agente etiológico, recebeu o nome de

Doença da Necrose Aguda Hepatopancreática (AHPND).

Os primeiros casos foram descritos na Ásia (LIGHTNER et al., 2012) e, desde 2011,

muitas instituições e agências (nacionais, regionais, internacionais, públicas e setores

privados) têm se esforçado de forma a compreender e encontrar soluções para conhecer o

agente e conter os impactos reais significativos para o camarão e para a indústria da

aquicultura. Os vibrios podem ser causadores de doenças graves como a AHPND, sendo

17

comumente os causadores de doenças bacterianas nos sistemas de criação (MORALES-

COVARRUBIAS, 2010). Acometem os camarões em todos os estágios de vida e, como

formam parte dos microrganismos que decompõe os detritos encontrados nos sedimentos e na

água dos viveiros, estão quase sempre presentes como oportunistas quando há um

desequilíbrio no ambiente.

O excesso de matéria orgânica pode causar desequilíbrio no sistema de criação,

podendo favorecer o crescimento da biomassa desses patógenos, que encontram nos animais

debilitados condições ideais para a infecção (VANDENBERGHE; THOMPSON; GOMEZ-

GIL; SWINGS, 2003). Podem levar, ainda, ao aumento de taxa de mortalidade,

principalmente na presença de estressores no sistema de criação, tais como: diminuição de

oxigênio, densidade de estocagem excessiva, manuseio inapropriado do estoque, lesão na

cutícula dos animais, subalimentação e altas concentrações de compostos nitrogenados no

ambiente (AGUIRRE-GUZMÁN; VÁZQUEZ-JUÁREZ; ASCENCIO, 2001).

As espécies causadoras dos maiores prejuízos à produção são: Vibrio harveyi, Vibrio

vulnificus, Vibrio parahaemolyticus e Vibrio alginolyticus (BROCK; MAIN, 1994; NUNES;

MARTINS, 2002). O processo de infecção da vibriose pode causar enfermidades diferentes:

cuticular ou erosão de carapaça, sistêmico (envolvendo vários órgãos), doença da

luminescência e a síndrome Zoea II (COVARRUBIAS, 2010). Quando localizada, apresenta

lesões melanizadas na carapaça e/ou abscessos pontuais no hepatopâncreas. O impacto da

vibriose é variável, mas em alguns casos pode alcançar até 70% da população cultivada

(LIGHTNER, 1998; SAULINER; HAFFNER; GOARANT; LEVY; ANSQUER, 2000;

SOTO-RODRIGUEZ et al., 2010). Os animais infectados apresentam extrema fraqueza

(ficam no fundo do viveiro), nado desorientado, opacidade da musculatura abdominal,

aumento da pigmentação e grampo na cauda (BROCK; MAIN, 1994; COVARRUBIAS,

2010). O diagnóstico presuntivo a fresco pode ser realizado a partir de amostras observadas ao

microscópio óptico, em que se podem analisar as brânquias, apêndices orais, animais

completos, como larvas e pós-larvas. Fragmentos de tecidos e órgãos são muito úteis para

demonstração destas enfermidades (HERZBERG, 1996).

Como prática rotineira, deve ser buscado o diagnóstico da doença que atinge a criação,

realizado através da observação de vários parâmetros: aparência física, resposta

comportamental, variáveis de produção (conversão e produção/ha/ano), características

populacionais do estoque criado e qualidade dos parâmetros ambientais ao longo da criação.

A taxa de sobrevivência, o peso corporal e a taxa de crescimento são os índices mais sensíveis

a alterações adversas na condição de saúde da população criada em cativeiro (NUNES;

18

MARTINS, 2002). Uma estratégia importante, e que sempre deve ser utilizada para avaliar o

estado de saúde dos animais, é a análise presuntiva, protocolo aceito mundialmente, capaz de

identificar modificações anatômicas dos camarões, as quais podem estar relacionadas a

enfermidades; em seguida, exames confirmatórios e escolha do melhor fármaco através de

antibiograma e da concentração mínima inibitória (MIC), sempre tendo o cuidado de ministrar

produtos quando a sua possível eficácia seja comprovada. O cuidado é imprescindível, pois os

antibióticos podem permanecer nos ambientes de criação, nas águas e nos vegetais por mais

de duas semanas e ser encontrados em organismos que consumiram restos de alimentos com

resíduos destes antibióticos (ARAÚJO et al., 2016; REGITANO; LEAL, 2010).

O uso de antibióticos na criação animal, quando usado de forma inadequada, pode

causar o surgimento de cepas resistentes, levando ao aumento na mortalidade

(MACMILLAN, 2001). A resistência bacteriana foi investigada por Montoya (2003), que

verificou o desenvolvimento dessa resistência quando os agentes antimicrobianos foram

usados em baixas concentrações em fazendas de criação de camarão, assim como em criações

de peixes, o que leva a maior dificuldade no controle de bactérias patogênicas

(FIGUEIREDO; LEAL, 2008).

A disseminação e a presença de resíduos de antibióticos no camarão e no ambiente,

quando despejados na água, podem provocar a mortalidade de diversos organismos, mudando

a composição e a diversidade das comunidades locais (XUAN LE; MUNEKAGE, 2004).

Nota-se uma grande diferença climática e de solo nas diversas regiões no Brasil, dessa forma,

fica difícil entender o comportamento de resíduos de antibióticos no ambiente, por isso é

ainda mais importante a pesquisa desse tema em busca da qualidade, sobretudo na criação de

animais, plantio e ambiente que, certamente, vão influenciar a saúde humana (REGITANO;

PEREIRA, 2010). A busca pela diminuição do uso de antibióticos em fazendas de camarão é

um dos pontos que poderá trazer ganhos para a saúde humana, meio ambiente e ecossistemas

costeiros (HOLMSTROM et al., 2002).

É importante ressaltar que pesquisas para a diminuição do uso de medicamentos que

deixem resíduos devem ser estimuladas, pois essas qualidades devem estar presentes em todos

os produtos, principalmente nos orgânicos, incluindo os oriundos da aquicultura. Tal fato já é

uma realidade, a preocupação com a sustentabilidade dos projetos para que não levem a

degradação ambiental, nem humana (BALDI; LOPES, 2008). Equilíbrio ecológico, qualidade

de vida e bem-estar animal são fatores prioritários na produção animal, por isso fornecer

alimentos que não levem contaminantes ao ambiente, aos produtores e aos consumidores é

urgente como detalhado na Instrução Normativa 46/2011 (MAPA, 2011). Faz-se necessário

19

desenvolver procedimentos de segurança e/ou buscar produtos que tragam menor risco ao

ambiente (PLASCENCIA; ALMADA, 2012).

O produto ideal para a aquicultura seria o que apresentasse as seguintes características:

ausência de danos ao tecido animal, ter degradação rápida, não deixar resíduo na água, no

substrato ou no tecido do animal, não interferir na qualidade da água, não oferecer perigo aos

humanos e animais, baixo custo e fácil aplicação (NUNES et al., 2004). A homeopatia é uma

possibilidade terapêutica que pode ser usada para evitar a resistência dos microrganismos aos

tratamentos, minorando os problemas de saúde pública da resistência bacteriana

(VIKSVEEN, 2003).

A homeopatia, como Samuel Hahnemann a propôs e como vem sendo aplicada, é uma

terapêutica em que cada paciente ou população recebe o medicamento que cobre a totalidade

dos sintomas (PUSTIGLIONE, 2002). A palavra homeopatia tem origem no grego: homeo =

semelhante; pathos = moléstia, foi criada por Samuel Hahnemann (1755-1843) na Alemanha

e divulgada através da publicação de suas bases e princípios no livro Organon da arte de

curar, em 1810 (BENEZ; BOERICKE; CAIRO; JACOBS; MACLEOD; SCHROYENS;

TIEFENTHALER; VIJNOVSKY; WOLFF, 2002).

A utilização da homeopatia em animais data da época em que foi testada pelo próprio

Hahnemann, quem medicava seus cavalos com essa terapêutica. Além dele, Guilherme Lux

(1773-1849), médico veterinário, aplicou com sucesso medicamentos dinamizados em

animais doentes de mormo, enfermidade grave e zoonótica, que acomete estes animais. A

medicina veterinária homeopática é uma terapia na qual seus preparados são resultantes da

dinamização de substâncias de origem animal, mineral e vegetal. As preparações

homeopáticas são caracterizadas pelas dinamizações, que consistem em diluição seguida de

sucussão, que libera energia dinâmica da substância original. A diluição progressiva promove

a liberação do potencial interno da substância, aumentando o respectivo potencial

(BELLAVITE, 2002).

Na medicina humana, cada indivíduo é tratado de acordo com suas necessidades,

sendo a individualização do paciente o ideal. Em medicina veterinária, na presença de grande

número de animais, muitas vezes sujeitos ao mesmo agente pela sua condição de cativeiro, a

aplicação da homeopatia pode ser feita direta aos grupos animais (rebanhos, manadas,

cardume), o que constitui a Homeopatia Populacional. Esta forma de tratar tornou-se a

medicina ideal para rebanhos, devido ao seu custo reduzido, à sua eficácia, pela ausência de

toxidez e por serem os princípios ativos extremamente diluídos, apresentando absoluta

20

impossibilidade de deixarem resíduos nos produtos animais, sendo incapazes de prejudicar a

saúde humana (REAL, 2006).

As atuais terapias propostas para uso de antibióticos em doenças bacterianas já são

conhecidas, mas com muitas críticas a seu uso inadequado. Além disso, não são aceitos pela

comunidade mundial quando para tratamento de animais em sistemas de criação orgânicos.

Os medicamentos homeopáticos não provocam danos aos animais, aos consumidores

dos produtos de origem animal, nem ao meio ambiente, o qual é favorecido pelo menor uso de

produtos químicos (LOPES, 2004).

Além do uso do medicamento homeopático, pode-se trabalhar com o agente causador

da doença altamente diluído e dinamizado ao que se chama isoterápico, antes chamado

nosódio. Os termos nosódio e isopatia derivam do grego, nosos que significa doença, eidos,

significa semelhante; iso significa igual e pathos, afecção. Portanto, nosódios ou isoterápicos

são medicamentos cuja matéria prima é o produto de uma doença potencializada da mesma

maneira que se potencializa um medicamento homeopático (MACLEOD, 1994; SAXTON;

GREGORY, 2005).

Os isoterápicos são medicamentos preparados de acordo com a farmacotécnica

homeopática a partir de produtos biológicos, quimicamente indefinidos, tais como, secreções,

excreções, tecidos e órgãos doentes ou não, produtos de origem microbiana e alérgenos

(AMORIM; FONTES, 2001).

O uso de isopatia é conhecido na medicina veterinária, entretanto trabalhos com seu

uso ainda não foram descritos para uso em camarões criados, sendo importante estudar a

resposta dos animais ao tratamento. Somado a isto, o conhecimento científico das

modificações comportamentais que ocorrem com o camarão branco do Pacífico, L. vannamei,

durante o adoecimento, podem trazer contribuições para técnicas complementares de manejo

quando identificada a presença de vibrioses na criação.

21

HIPÓTESES E PREDIÇÕES

Hipótese 1 – Os camarões em aquários de experimentação exibirão respostas

comportamentais ajustadas ao ambiente com ou sem areia como substrato.

Predição 1.1 – Os camarões apresentarão frequências mais elevadas de

comportamentos indicativos de movimentação no ambiente sem areia no substrato.

Predição 1.2 – Os camarões apresentarão taxas de sobrevivência e ganho de peso mais

baixas no ambiente sem areia.

Hipótese 2 – O tratamento clínico influenciará nas respostas comportamentais de

camarões infectados.

Predição 2.1 – Os camarões tratados com medicamento isopático exibirão mais

comportamentos de movimentação, como natação e exploração de substrato.

Predição 2.2 – Os camarões infectados e sem tratamento apresentarão maior

frequência de inatividade quando comparados aos grupos tratados.

Hipótese 3 – Os animais infectados com V. parahaemolyticus e submetidos a

tratamentos clínicos apresentarão lesões teciduais histopatológicas diferentes em

quantidade e gravidade que os não tratados.

Predição 3.1 – Os animais tratados com isopatia apresentarão número inferior de

lesões histopatológicas.

Predição 3.2 – Os animais do grupo infectado e que não recebeu tratamento terão o

número maior de lesões histopatológicas.

22

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

Avaliar a influência da terapêutica alopática e isopática no comportamento do camarão

marinho Litopenaeus vannamei, artificialmente infectado com Vibrio

parahaemolyticus.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar o efeito da presença de areia sobre o comportamento, ganho de peso e

sobrevivência de camarões juvenis Litopenaeus vannamei em laboratório.

Comparar a resposta comportamental de camarões juvenis L. vannamei, infectados por

Vibrio parahaemolyticus, tratados com isopatia, antibioticoterapia ou ambas.

Identificar outros agentes bacterianos presentes em camarões enfermos acima de 5g,

infectados por bactéria V. parahaemolyticus, causadora de AHPND.

23

MANUSCRITO I COMPORTAMENTO DO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus

vannamei (BOONE, 1931) EM AQUÁRIOS DE

EXPERIMENTAÇÃO COMO INDICADOR DE CONFORTO1

Resumo: Objetivou-se avaliar em condições experimentais o comportamento de L. vannamei na

presença e ausência de areia no substrato. O experimento foi conduzido no Centro de Saúde de

Animais Aquáticos do Departamento de Oceanografia e Limnologia da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. Durante 3 semanas, 30 camarões juvenis da espécie Litopenaeus vannamei, foram

divididos em dois grupos: um grupo foi acomodado em aquários de vidro, individuais, com água e

uma camada de areia como substrato e o outro grupo foi acomodado individualmente, sob as mesmas

condições, sem areia. Foram avaliados os comportamentos de inatividade, natação, ingestão de

alimento, limpeza e exploração do substrato; também, sobrevivência e ganho de peso. Não foram

encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos paratodas as variáveis

analisadas. Assim, conclui-se que, por não promover alterações comportamentais nos camarões jovens

testados, a ausência de um substrato de areia por um período de três semanas em condições

laboratoriais, não interfere no comportamento dos animais.

Palavras-chave: Bem-estar animal. Bioética. Invertebrado.

BEHAVIOR OF THE MARINE SHRIMP LITOPENAEUS VANNAMEI (BOONE,

1931) IN EXPERIMENTAL AQUARIA AS AN INDICATOR OF COMFORT

Abstract: In this study, our objective was to determine whether the lack of sand as the substrate of

aquariums, restraining shrimps from burying in the sand – a typical behavior of such animals – has any

influence in other kinds of behavior as well as in those animals’ survival and weight gain,

consequently reducing shrimps’ comfort when they are used as subjects in laboratory research. As a

way of monitoring the animals’ behavior, a bioassay was conducted at the Department of

Oceanography and Limnology at the Federal University of Rio Grande do Norte. For the experiment,

which was carried out for three weeks, thirty juvenile whiteleg shrimps (Litopenaeus vannamei) were

kept, respectively, in thirty aquariums, of which fifteen had sand as substrate and fifteen did not have

any kind of material on their bottom. The purpose was to examine the following behaviors: inactivity,

swimming, feeding, cleaning, substrate exploration, survival and weight gain. The results of this study

did not show statistically significant differences between the groups, both showing similar

performances and weight gain and survival. The lack of sand as substrate during the research did not

interfere with the shrimps’ comfort, indicating that the absence of sand as substrate does not hamper

the animals’ welfare.

Key words: Animal welfare. Bioethics. Invertebrate.

1 O manuscrito I corresponde ao artigo submetido à Revista Ciência Animal Brasileira, da Universidade Federal

de Goiás, e, inclusive, já se encontra normatizado conforme preconiza o periódico em questão.

24

1 INTRODUÇÃO

Pesquisas que utilizam animais devem, obrigatoriamente, ter seus protocolos

experimentais aprovados por um comitê de ética que avaliará o protocolo experimental

apresentado. Para que isto fosse aceito, foi necessária a aprovação de uma lei de proteção dos

animais em pesquisa científica para que o uso desses animais não leve os mesmos a

sofrimento. São indicadas recomendações aceitas em todo o mundo, chamadas de os 3R, que

equivalem à substituição dos animais por outras técnicas (Replacement), redução do número

de animais (Reduction) e ao refinamento das técnicas (Refinement)(1)

.

No Brasil, há legislação que trata do uso dos animais em experimentações científicas.

Nela, está especificada a aplicação aos animais das espécies classificadas como filo Chordata,

subfilo Vertebrata, observada a legislação ambiental(2)

, não incluindo os animais

invertebrados. Porém, com as mudanças de paradigma, os animais em todos os seus táxons

devem ser considerados como passíveis de sofrer dor ou desconforto. A iniciativa de

realizarmos pesquisas sobre o conforto animal traz a possibilidade de termos animais com

menor estresse durante experimentos, também que os resultados destas pesquisas sejam mais

próximos às condições naturais, evitando possíveis vieses causados por prejuízos ao bem-

estar.

Prioritariamente com foco na produção animal, várias investigações têm sido

realizadas na área de comportamento animal, fisiologia do estresse, epidemiologia veterinária

entre outros campos(3)

, e muitas outras devem ser feitas nos próximos anos, importando

manter o conforto dos animais, pois como relatou Jeremy Bentham, em 1780, “a questão não

é se eles são capazes de raciocinar ou se são capazes de se comunicar, mas sim, eles são

capazes de sofrer?” (4)

. Assim, o que se busca é compreender onde começa e até onde vai o

possível sofrimento dos animais em cativeiro, que poderá auxiliar ao desenvolvimento das

pesquisas.

Em crustáceos, já foi observado que mudanças nos comportamentos de locomoção –

como desorientação, diminuição da atividade, assim como diminuição na ingestão de

alimentos, associados a modificações teciduais macroscópicas – entre elas, alterações na

aparência e na cor de brânquias, apêndices, cutícula e músculo abdominal, podem ser

indicativos de estresse(5)

. Os camarões L. vannamei apresentam uma boa adaptação a

mudanças no ambiente aquático, como por exemplo as variações de salinidade, que não

interferem no crescimento de pós-larvas(6)

, entretanto, diferente de outros crustáceos, o

25

substrato é um fator muito importante, para os camarões, pois possui comportamento

bentônico em sua fase juvenil e gastam grande parte do seu tempo no fundo dos viveiros (7)

.

Neste estudo, buscou-se esclarecer se a ausência de areia como substrato em aquários

de experimentação é capaz de influenciar o padrão comportamental, sobrevivência e

crescimento de animais da espécie Litopenaeus vannamei, o que poderia denotar alteração da

qualidade do ambiente e do bem-estar para estes animais que, uma vez detectados, podem

influenciar resultados de pesquisas que o adotarem como sujeito experimental.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 ANIMAIS

O experimento foi realizado no Centro da Saúde dos Animais Aquáticos (CSAq),

Departamento de Oceanografia e Limnologia (DOL) da Universidade Federal do Rio Grande

do Norte (UFRN), nos meses de novembro e dezembro de 2012. Os sujeitos experimentais

foram camarões juvenis da espécie L. vannamei, com peso médio de 6 g (±0,3), provenientes

de fazenda de criação de camarões do município de São Gonçalo do Amarante, pertencente à

grande Natal/RN (5°47’35.3”S e 35°19’15.4”W).

Os camarões foram transportados em caixas plásticas de polietileno (310 L), com a

água do viveiro e aeração constante, mantendo o oxigênio dissolvido entre 5 e 8 mg/L. Ao

chegarem ao laboratório, realizou-se troca parcial da água e os animais foram colocados em

tanques de alvenaria, onde permaneceram por um período de 10 dias para aclimatação. Após

este período, foram transferidos para aquários individuais.

2.2 AQUÁRIO, ÁGUA E AREIA

As unidades experimentais foram compostas de aquários com tampa de plástico

transparente com capacidade para 4l (Figura 1). Todos os aquários foram higienizados com

solução clorada (10%) antes de serem colocados no laboratório. Filtros e aeração foram

instalados para manter a boa qualidade da água. A salinidade da água foi monitorada para que

permanecesse constante em 35ppt e a reposição da evaporação foi realizada sempre que

necessário com água tratada.

Toda a água utilizada no processo experimental foi previamente clorada (4%) e, após

48h de aeração e verificação da ausência de cloro da mesma, foi passada por um filtro UV por

26

mais 48h. Durante o experimento, a cada 48h os seguintes parâmetros de qualidade da água

foram monitorados: oxigênio dissolvido, temperatura (oxímetro acoplado a termômetro

digital), amônia total, nitrito e pH (métodos colorimétricos). A areia utilizada como substrato

foi clorada e exposta ao sol por 24 horas em balde telado para evitar contaminação.

Figura 1 – Tratamento sem areia Figura 2 – Tratamento com areia

Fonte: acervo da pesquisa Fonte: acervo da pesquisa

2.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

O experimento foi dividido em 2 tratamentos: (1) um grupo sem areia no substrato

(SA) (Figura 1) e outro grupo utilizando areia no substrato (CA) (Figura 2). Para cada um dos

tratamentos foram utilizadas 15 unidades experimentais, composta de um aquário e um

camarão juvenil.

A alimentação foi realizada com ração peletizada com 35% de proteína bruta, própria

para juvenis, duas vezes ao dia (às 08h00 e às 15h00). As observações foram realizadas pelo

método focal sampling ou animal focal, que consiste em focar a atenção em um único

indivíduo, casal ou ninhada por um tempo determinado ou enquanto o evento comportamental

acontece. Neste estudo, foram utilizadas janelas de observação de 10 min., com registros

instantâneos a cada dois minutos, uma antes e outra posterior a alimentação, havendo um

intervalo de 5 min. para disponibilização dos pellets de ração. Essas observações foram

realizadas durante 21 dias consecutivos.

Os comportamentos observados foram natação (NAT), ingestão de alimento – o

animal pega o alimento com pereiópodos e coloca na boca sendo observada a entrada do

alimento no trato digestório (ING), exploração (EXP) e inatividade (INAT), para ambos os

tratamentos, e enterramento (ENT), para o tratamento com areia. Os animais foram mantidos

em ciclo claro/escuro de 12/12h, sendo as coletas de dados sempre realizadas na fase de claro.

Ao final do experimento, avaliou-se tamanho (medido do rostro ao urópodo), ganho de peso e

27

sobrevivência durante o período. Para a análise estatística utilizou-se o Programa livre “R”.

Os dados foram analisados utilizando-se as premissas exigidas para a parametricidade ou não

dos dados (Normalidade – Kolmorov – Smirnov; Homocedasticidade – Shapiro Wilks),

análise de variância para medidas repetidas. Havendo diferença, realizou-se o teste post hoc

de Tukey, quando necessário. O nível de significância adotado foi de 5%.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para os fatores associados ao crescimento dos animais, como ganho de peso e

comprimento, assim como sobrevivência, não se observou diferença significativa entre os

grupos com e sem substrato de areia (p>0,05)1 (Tabela 1). Em estudos realizados com L.

vannamei, não encontrou-se diferença nos índices zootécnicos de criação em substratos com

diferentes granulometrias ou sem substrato(8)

. Entretanto, em Penaeus monodon foi observado

que o crescimento dos animais é maior quando há substrato, quando comparados ao sem

substrato(9)

. Da mesma forma, em outro trabalho, observou-se que quando estavam em

laboratório havia relação entre o tipo de solo e o crescimento de L. vannamei(6)

. Talvez, num

experimento com duração maior que 21 dias, fosse observado uma diferença entre a presença

de areia como substrato ou sua ausência.

Tabela 1 - Médias finais de peso, comprimento e percentual de sobrevivência dos camarões submetidos aos

tratamentos com e sem areia

Crescimento e sobrevivência Tratamento com areia (CA) Tratamento sem areia (SA)

Média do peso inicial (g)

Média de peso final (g)

6,00(±3)

7,00 (±0,2)

6,00(±3)

6,60 (±0,3)

Média de comprimento (cm) 10,01 (±0,4)

9,45 (±0,4)

Sobrevivência (%) 73,33 (11animais) 66,67 (10)

Fonte: acervo da pesquisa 1Não houve diferença significativa ao nível de 5 % de probabilidade pelo teste de Tukey

O comportamento de enterramento (ENT) diferiu entre os turnos manhã e tarde, sendo

a frequência superior no período da manhã. Este comportamento está relacionado à defesa de

predadores. O aparecimento da luminosidade deve atuar como um sinalizador de perigo de

predação (p≤0,05) (Tabela 2), pois, sabe-se que parte dos camarões marinhos utiliza o

enterramento como estratégia de fuga e refúgio(10)

.

28

Apesar de não terem sido verificadas diferenças na frequência de exploração do

substrato (EXP) entre os turnos da manhã e tarde (p> 0,05), observou-se uma redução

significativa de exploração do substrato após a oferta de alimento aos camarões e presença do

comportamento ingestão do alimento (ING). Já estava descrito que L. vannamei se alimenta

sempre que o alimento é oferecido e a quantidade é sempre maior na fase clara(10)

. Neste

trabalho, foram realizadas observações apenas na fase de claro. Talvez não tenha sido

observado que após o oferecimento do alimento cessa o comportamento de exploração e tem

lugar a ingestão do alimento (ING), neste estudo, porque as observações foram realizadas na

fase claro, apenas.

Tabela 2 – Médias da frequência dos comportamentos: Enterramento (ENT), Natação (NAT), Ingestão de

Alimento (ING), Exploração do substrato (EXP) e Inatividade (INAT), durante os turnos da manhã (M) e tarde

(T), antes (A) e depois (D) da alimentação. n=11

COM AREIA A D A D A D A D A D

Comportamentos ENT ENT EXP EXP NAT NAT ING ING INAT INAT

Manhã 4,1 3,8 17,15 5,65 14,1 3,75 0 48,8 27,55 8,75

Tarde 2,1 1,62 16,81 7,86 12,67 7,57 0,29 38,29 14,86 4,24

SEM AREIA A D A D A D A D

Comportamentos

EXP EXP NAT NAT ING ING INAT INAT

Manhã

16,35 7,35 14,7 8,15 0,35 41,45 26,04 8,8

Tarde 11,35 2,3 12,67 9,05 0,57 32,43 9,46 2,94

Fonte: acervo da pesquisa 1C/A, Com areia; S/A, sem areia.

Para o comportamento de ingestão de alimento (ING) (p>0,05), a presença de areia

como substrato não provocou diferenças em número de episódios de ingestão. Também não

foram observadas diferenças comportamentais para os turnos manhã e tarde, o que era

esperado, pois, estes horários são os melhores para alimentação destes animais(11)

.

De acordo com os resultados apresentados, a utilização ou não de uma camada de

areia no assoalho dos aquários não promoveu alterações significativas diretas sobre os

comportamentos, crescimento e sobrevivência, nas condições experimentais apresentadas.

Resultados semelhantes já foram publicados(13,14)

, após utilizarem diferentes substratos para

testar o desempenho zootécnico de adultos e juvenis da espécie L. vannamei. Afirmaram que

a presença ou não de areia e outros substratos no ambiente não promoveram diferenças

significativas sobre os parâmetros zootécnicos analisados, confirmando que o desempenho de

29

camarões independe do substrato do ambiente em que se encontram, sejam adultos ou juvenis,

pois esta espécie tem fácil adaptação a modificações ambientais, inclusive a salinidades

diferentes e, até em água doce, é possível ser cultivada(15)

, prestando-se, desta forma, mais

facilmente, a experimentação em laboratórios, pois sendo mais resistentes a mudanças

ambientais, provavelmente estará menos sujeita a mudanças no conforto que interfiram

negativamente em seu bem-estar.

A natação é mais observada na espécie L. vannamei durante a fase de escuro(11)

. Em

Xiphopenaeus kroyeri também foi observado uma maior frequência de natação durante a fase

de escuro(12)

. Neste trabalho, observou-se apenas na fase de claro, não havendo diferença na

natação na presença ou ausência de areia, e também entre os turnos manhã e tarde.

4 CONCLUSÃO

A ausência de areia por um período de três semanas, em condições laboratoriais, não

interferiu na expressão dos comportamentos observados e, provavelmente, não interfere no

conforto dos animais.

AGRADECIMENTOS

Ao CSAqui, ALCONpet e a todos que colaboraram com este trabalho.

REFERÊNCIAS

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31

MANUSCRITO II RESPOSTAS COMPORTAMENTAIS DE CAMARÕES

INFECTADOS POR VIBRIOS E EXPOSTOS A DIFERENTES

TRATAMENTOS VETERINÁRIOS2

Resumo: O estudo do comportamento animal auxilia no conhecimento das enfermidades e subsidia as

discussões sobre manejo em muitas espécies. Na carcinicultura, foram descritos dados sobre o

comportamento de Litopenaeus vannamei, que podem ser de grande valia no controle da sanidade.

Objetivou-se descrever o comportamento de juvenis L. vannamei infectados por Vibrio

parahaemolyticus submetidos a tratamentos veterinários. Cento e sessenta camarões juvenis foram

trazidos para o Centro de Sanidade Aquícola do Departamento de Oceanografia e Limnologia da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Foram divididos em cinco grupos com 32 aquários de

vidro cada, com capacidade para 5L, colocado apenas um camarão, obedecendo a um ciclo de

claro/escuro de 12h. A qualidade de água foi avaliada diariamente. Grupos: a) Controle 1, Animais

saudáveis; b) Controle 2, Animais infectados e não tratados; c) Grupo ANTIB, tratado com antibiótico

florfenicol; d) Grupo ISO, tratado com isopatia; e) Grupo ANTIB+ISO, tratado com as duas

terapêuticas. Para todos os grupos, à exceção do grupo Controle 1, foi aplicado por via oral, em dose

única, 0,5 mL inóculo com V. parahaemolyticus. Os comportamentos de inatividade, exploração de

substrato, natação, ingestão de alimento, limpeza, manipulação do alimento, foram observados. Os

resultados obtidos indicam que os animais tratados com a associação de medicamentos ANTIB+ISO

têm respostas comportamentais semelhantes ao grupo Controle 1, sugerindo que os animais

mantiveram o comportamento semelhante aos animais saudáveis.

Palavras-chave: Isopatia. Litopenaeus vannamei. Vibrioses.

VETERINARY TREATMENTS TO VIBRIOSIS IN MARINE SHRIMP:

BEHAVIORAL RESPONSES

Abstract: The study of animal behavior is important for a better comprehension of animal diseases

and for supporting development of species management. Data obtained from shrimp culture focusing

the behavior of Litopenaeus vannamei have been identified as an important tool in the control of

shrimp sanity. This study aimed to describe the behavior of L. vannamei juveniles infected with Vibrio

parahaemolyticus and undergoing veterinary treatment. One hundred and sixty juvenile shrimp were

brought to the Aquaculture Health Center of the Department of Oceanography and Limnology at the

Federal University of Rio Grande do Norte, where they were divided into five groups of 32

individuals, each introduced to a glass aquarium, with a capacity of 5L, under a 12 hour light/dark

cycle. Water quality was analysed daily. The five groups according to treatments were as follows: a)

control, b) animals infected, but not treated, c) Group treated with antibiotics, d) treated group with

isopathy, e) Group treated with isopath plus antibiotics. For all groups, but the control group, a single

dose of 0.5 ml Inoculum to V. parahaemolyticus was administered orally. The behaviors of inactivity,

substrate exploration, swimming, food intake, cleaning, food handling were recorded. The results

indicate that infected prawns treated with isopathy plus antibiotics showed behavioral

performance similar to the control group, indicating that their behavior is compatible with

healthy individuals.

Index terms: Isopathy, Litopenaeus vannamei, Vibrio Infections.

2 O manuscrito II corresponde a artigo a ser submetido para publicação em periódico especializado, estando

normatizado conforme preconiza a Associação Brasileira de Normas Técnicas – ABNT.

32

1 INTRODUÇÃO

Na produção animal, em algumas ocasiões, faz-se uso de uma grande quantidade de

medicamentos para manter a sanidade dos animais em criação e sua produtividade. Entre os

fármacos mais utilizados estão os antibióticos, o que tem gerado um problema para saúde

animal e humana, a resistência bacteriana (BENGTSSON; GREKO, 2014). Observa-se que,

nessa produção, muitas vezes como tratamento, outras para prevenir ou ainda como aditivo,

os antibióticos são usados (MOTA et al., 2005; MENDES et al., 2009), sendo a possibilidade

de presença de resíduos verdadeira (NERO et al., 2007).

Os impactos causados pelo uso de antibióticos no ambiente não estão bem definidos, o

que causam nos animais e destes para a saúde pública. As possibilidades de interação entre

produtos para a lavoura e saúde animal são inúmeras no ambiente, pois o produto poderá

chegar aos mananciais e retornar em pequenas concentrações para outros animais e destes à

saúde humana por meio de vários mecanismos, sem que tenhamos como avaliar sua meia-

vida, ou ação em somatório com outros agentes dispersos no ambiente (ARIAS et al., 2007).

Os antibióticos apresentam peso molecular alto, muitos grupos funcionais ionizáveis, fatores

que dificultam a compreensão de sua ação no ambiente, já que são poucos os estudos

realizados nas nossas condições climáticas (KAY et al., 2005). Entende-se que é imprevisível

o impacto do uso indiscriminado destas moléculas e que há necessidade de mais pesquisas

sobre o tema.

As enfermidades na carcinicultura, por ser uma área de alta produtividade e grande

empregabilidade, sobretudo na região Nordeste do Brasil (ROCHA, 2011), geram um forte

impacto econômico e social. Dentre essas enfermidades, destacam-se as provocadas por

bactérias do gênero Vibrio, pois são agentes patogênicos importantes de caráter oportunista,

infectando os camarões em situações estressantes da criação, tais como, mudanças de

parâmetros ideais da água e aparecimento de outros agentes causadores de doença

(LIGHTNER, 1993; MENDES et al., 2005).

Os camarões infectados por este grupo de patógenos podem desenvolver: vibriose

sistêmica, síndrome Zoea II, necrose com erosão da carapaça e doença de luminescência

(MORALES-COVARRUBIAS, 2008). Em uma vibriose sistêmica, a mais grave entre estas,

L. vannamei, pode apresentar o seguinte quadro clínico: nado incoordenado, grampeamento

abdominal, inflamação em hepatopâncreas e, também, luminescência. Se outros agentes

mórbidos estiverem envolvidos ou ocorrer algum desequilíbrio no ambiente, pode levar ao

33

agravamento da doença (MORALES-COVARRUBIAS, 2014). A cura poderá advir do

diagnóstico e manejo sanitário adequado.

No ano de 2009, foi relatado à carcinicultura mundial uma enfermidade atualmente

conhecida como Hepatopancreatite Necrosante Aguda, em sua sigla inglesa AHPND, sendo

identificado como agente causador Vibrio parahaemolyticus. Esta enfermidade, com altas

taxas de mortalidade entre camarões juvenis, foi identificada na Ásia e América do Norte,

levando a perda de grandes produções de camarões (SOTO et al., 2015).

Nas enfermidades bacterianas, entre a melhoria do manejo e da qualidade ambiental

alguns fármacos são permitidos, inclusive alguns antibióticos. Dentre os usados na

aquicultura brasileira podemos citar a oxitetraciclina (UNO et al., 2006), enrofloxacina e o

florfenicol (CARRASCHI et al., 2011), que tem seu uso permitido para algumas espécies de

peixes (MSD, 2009). Estes entre outros antibióticos têm sido encontrados em ambientes

aquáticos (HIRSCH et al., 1999), podendo deixar resíduos nos animais se não respeitada sua

meia-vida. O mau uso dessas substâncias pode trazer problemas graves através da seleção de

bactérias resistentes, que podem permanecer nos resíduos da produção (GASTALHO et al.,

2014).

Devido aos transtornos que o uso indevido de antibióticos pode causar, busca-se

terapêuticas mais seguras aos humanos e animais e menos impactantes ao ambiente. A

homeopatia, princípio que trata através de similitude, é uma alternativa terapêutica segura,

usada em muitas espécies, inclusive sendo especialidade na medicina veterinária desde o ano

1995 (SOUZA, 2002).

Da mesma forma, a isopatia, cura pelos iguais, também descrita pelo fundador da

homeopatia, tem sido prescrita na medicina veterinária para tratamentos de várias

enfermidades e em muitas espécies animais (CAMILO et al., 2015). A isopatia, princípio em

que o medicamento é elaborado a partir do agente que causa a enfermidade, segue as

orientações de preparo da farmacotécnica homeopática, excluindo, no entanto, o princípio de

similitude, ou seja, no caso da isopatia o princípio usado é da igualdade, o agente que causa a

doença será o mesmo que será usado na medicação para provocar a cura (CORREA et al.,

2006). Por sua característica de diluição a doses mínimas, onde muitas vezes não há a

substância que deu origem ao preparo, não deixa resíduos nos animais, na água e no ambiente.

Não causa perigo à saúde pública, o que pode fazer deste uma terapia ideal para uso na

aquicultura (MARTINS et al., 2004).

Outro fator de fundamental importância e que pode fornecer subsídios para a busca do

bem-estar dos animais, como diminuição do estresse e melhoria dos índices zootécnicos na

34

criação, são as investigações sobre a resposta comportamental desses animais às terapêuticas

aplicadas. Os estudos em etologia aplicada à criação comercial visando o entendimento do

comportamento natural da espécie animal e a promoção de conforto aos animais pela

adequação dos recintos. Esse tema tem sido uma preocupação da sociedade hodierna,

confirmada pela criação da “International Society for Applied Ethology” – ISAE (MILLMAN

et al., 2004; LAWRENCE, 2008; HUNTINDFORD et al., 2008).

Além da observação dos sinais clínicos, um dado importante na compreensão do

adoecimento e que ainda não está claro, é em de que forma uma infecção irá modificar

expressões comportamentais dos camarões, além das já descritas na literatura como sinais

clínicos (PEÑA-NAVARRO; VARGAS-CORDERO; VARELA-MEJÍAS, 2013). Alguns

estudos têm avançado trazendo dados sobre as respostas comportamentais dos camarões

peneídeos saudáveis (PONTES et al., 2008; SANTOS et al., 2011; FREIRE et al., 2011;

SANTOS et al., 2013). Como sinais clínicos característicos das vibrioses, observa-se letargia,

inapetência, nado errático e anorexia, estes dados são fruto da observação, das avaliações

macroscópicas e análises a fresco.

A ocorrência de parâmetros ruins de qualidade da água, alimentação inadequada, nível

de salinidade alterado, podem causar estresse aos animais e desencadear alteração na resposta

do sistema imune (PERAZZOLO et al., 2002) diminuindo seu potencial de resposta ao

agressor e predispondo estes organismos a doenças. Sendo um intricado número de fatores

que atuam na resposta do animal ao agente patogênico, o objetivo deste trabalho foi descrever

o comportamento de camarões marinhos infectados pela bactéria Vibrio parahaemolyticus,

submetidos a tratamentos clínicos com antibiótico associado ou não a medicamento isopático.

2 MATERIAL E MÉTODO

O trabalho experimental foi realizado no Centro de Sanidade de Animais Aquáticos,

Departamento de Oceanografia e Limnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN), Natal/RN, entre novembro de 2012 e fevereiro de 2013. Toda a água usada no

experimento foi previamente clorada, filtrada, passada em raios UV por 48h, e seguida de

análise microbiológica. Livre de patógenos foi utilizada para encher os 160 aquários de vidro

com capacidade para 5L, os quais foram divididos em 5 grupos (Controle 1, Controle 2,

Infectado INF, Isopatia ISO, Antibiótico ANTIB e Isopatia e antibiótico ISO+ANTIB) de 32

aquários, numerados sequencialmente e colocados em prateleiras, onde fosse possível

visualizar todos os animais (Figura 1).

35

Figura 1 – Estantes e aquários de vidro numerados, que constituíram as unidades experimentais

Fonte: acervo da pesquisa

Os camarões juvenis da espécie L. vannamei foram colocados individualmente nos

aquários para aclimatação cinco dias antes do início do experimento. Foram pesados no início

do tratamento (5,1± 0,29 g) e, durante todo o experimento, receberam ração para camarões

juvenis com 35% de proteína bruta. A ração foi preparada após a pesagem, sendo embebida

em óleo de peixe (Biogel) para que, independente do grupo a ser tratado, tivessem

palatabilidade semelhante. Em parte da ração foi adicionado florfenicol (10 mg/kg) para ser

oferecida ao grupo tratado com antibiótico. A ração, para todos os grupos, foi oferecida duas

vezes ao dia, às 9h e às 16h, na proporção de 5% da biomassa.

Previamente ao início do experimento, as cepas de Vibrio parahaemolyticus foram

reativadas em Agar Triptona de Soja (TSA adicionado 1% de NaCl), incubadas à temperatura

de 30ºC e após 24h foram semeadas em Agar Tiosulfato-Citrato-Sais Biliares-Sacarose

(TCBS) em placas invertidas e incubadas na mesma temperatura por mais 24h. Algumas

colônias foram semeadas em tubos inclinados com TSA com sal (1%) e incubadas por 24h. O

inóculo foi preparado a partir das colônias que foram retiradas, sendo dissolvidas em 100 mL

de solução salina estéril até obter a concentração de 0,5 da escala Mc Farland.

O experimento foi composto por dois grupos controle, um sem infecção (CONT) e

outro com camarões infectados (INF), mas que não receberam tratamento com medicamentos

(antibiótico ou isopatia), e três grupos experimentais, tendo um recebido tratamento com

antibiótico florfenicol, o outro tratado só isopatia (medicamento preparado com colônia de V.

parahaemolyticus diluído em água na CH12, conforme farmacotécnica homeopática) e o

terceiro recebendo ambos os tratamentos (Quadro 1).

36

Todo o experimento teve duração de 18 dias. No primeiro dia, os animais dos grupos

experimentais e Controle 2 (INF, ANTIB, ISO e ISO+ANTIB) foram inoculados com cepa de

V. parahaemolyticus (ATCC-17802). O inóculo foi aplicado imediatamente após o seu

preparo, na dose de 0,5 mL por via oral com auxílio de seringa de 1 mL e cateter para uso

endovenoso no. 24. Os animais do grupo Controle 1 receberam 0,5mL de solução salina

0,09% por via oral, para que houvesse similaridade no manejo. Para confirmação da

viabilidade das bactérias e ausência de contaminação, o inóculo aplicado aos animais foi

semeado em placas TCBS e incubado por 24h (CLSI).

A água dos aquários foi monitorada a cada três dias para os seguintes parâmetros:

oxigênio dissolvido (OD), temperatura (estes dois usando oxímetro digital acoplado com

termômetro), pH, nitrito, amônia total (testes colorimétricos). Nos mesmos dias, amostras de

água foram retiradas de cinco aquários de cada grupo de 32 ao acaso e realizada análise

microbiológica para confirmação da presença das bactérias.

A cada seis dias, foram sorteados aleatoriamente cinco camarões vivos, previamente

pesados e encaminhados para análise presuntiva a fresco, seguida de bacteriologia do

hepatopâncreas, e um deles era encaminhado para histologia de acordo com a metodologia

proposta por Bell e Lightner (1988) e Lightner (1996). A mortalidade em todos os grupos foi

registrada ao longo do experimento.

Para os dados comportamentais, cinco animais foram observados, por sorteio,

diariamente em cada grupo. As observações ocorreram nos dez minutos anteriores e dez

minutos posteriores à colocação do alimento, pelo método focal (ALTMANN, 1974), com

registro instantâneo a cada 2 minutos. Durante as observações, foi utilizada uma planilha

elaborada para registros, que incluiu os seguintes comportamentos já observados por Pontes

(2006), descritos no Quadro 2. Os horários estabelecidos para observação foram às 9h e às

16h. As observações foram feitas no período claro e os animais foram mantidos em ciclo

claro/escuro de 12h, com o claro iniciando às 6h.

Para realização das análises estatísticas, foi utilizado o programa SIGMASTAT,

versão 3.5 (Systat, Erkrath, Alemanha) e STATISTIC 6.0. Os dados foram analisados

utilizando-se a análise de variância não paramétrica de Friedman, dependendo da sua

parametricidade (normalidade: Kolmorov-Smirnov; homocedasticidade: ShapiroWilks),

seguido do teste de Tukey ou do teste de Student-Newman-Keuls (SNK), a 5% de

probabilidade (ZAR, 1999).

37


3.1 ATIVIDADES COMPORTAMENTAIS DE L. vannamei ANTES E APÓS A

OFERTA DA RAÇÃO

A presença do alimento artificial influencia a expressão comportamental (PONTES;

ARRUDA, 2005). Observou-se que a ingestão de alimento (ING) registrada apenas após a

oferta da ração, diferiu entre os tratamentos testados (χ2 = 100,911; Tukey) (Figura 2), sendo

os maiores valores médios observados para o grupo controle 1 (CONTR 1) (4,71±0,78) e para

o grupo tratado com isopatia e antibiótico (ISO+ANTIB) (4,01±0,89). Observou-se nos

grupos que receberam tratamentos com isopatia+antibiótico (ISO+ANTIB), apenas isopatia

(ISO) e no grupo controle 2(INF) valores semelhantes entre si e superiores ao grupo tratado

apenas com antibióticos (χ2 = 100,911; Tukey).

Figura 2 – Comportamento alimentar dos camarões infectados por Vibrio e submetidos a tratamentos clínicos

com antibiótico e/ou isopatia, após a oferta da ração. Tratamentos: 1) ANTIB: grupo de camarões infectados e

com administração de antibióticos; 2) CONTR 1: grupo controle sem inoculação de patógeno e sem

administração de medicamentos alopático e isopático; 3) INF: grupo controle 2 infectado sem uso de

medicamentos alopático e isopático; 4) ISO+ANTIB: grupo infectado e com administração de medicamentos

alopático e isopático; 5) ISOP: grupo infectado e com administração de medicamento isopático. Médias

seguidas de letras iguais não diferem pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.


O princípio do vitalismo de que trata a homeopatia justifica que os animais tratados

com o medicamento isopático se alimentam melhor, pois têm a sua energia vital estimulada,

daí observamos que o grupo enfermo e que usa só antibiótico não consegue o mesmo

resultado quanto à ingestão de alimento (SOUZA, 2002). O grupo tratado com as duas

38

terapêuticas, a que recebe as duas ao mesmo tempo tem a resposta de ingestão maior,

provavelmente porque o antibiótico diminui a carga bacteriana, enquanto que o isopático

estimula a força vital. O comportamento alimentar de peneídeos é desencadeado a partir da

oferta de alimento artificial, especialmente das rações que são acrescidas de atrativos

químicos de baixo peso molecular (aminoácidos livres) (LEE; MEYERS, 1996; PONTES;

ARRUDA, 2005). Observou-se que as atividades comportamentais de L. vannamei sofrem

influência da presença do alimento artificial, variando em função da oferta, o que também foi

observado por Pontes e Arruda (2005).

Sobre os comportamentos exibidos por L. vannamei na presença do alimento artificial,

foi observado que os animais se tornam mais ativos (busca pelo alimento) durante os

primeiros minutos de exposição à ração, fato este também observado por Pontes e Arruda

(2005a) e, além disto, para F. subtilis, a alimentação é mais intensa nos 10 minutos

posteriores à exposição à ração, ocorrendo após esta fase de forma ininterrupta e pausada

(NUNES et al., 1997). Neste trabalho, observamos a ingestão do alimento apenas nos

primeiros 10 minutos após o oferecimento do alimento, de modo que não podemos relatar se a

ingestão foi maior após este período em algum grupo.

Na descrição dos sinais clínicos de vibriose nos camarões, estes apresentaram

fraqueza, inapetência, anorexia e baixo ou nenhum enchimento do trato digestório (NUNES;

MARTIN, 2002; AGUIRREZ-GUSMAN, 2004). No entanto, diferente destes dados,

observou-se que os camarões infectados, recebendo ou não tratamento, apresentaram sinais

(registros comportamentais) de apetite durante as observações.

Os grupos controle 1 (CONTR 1) e tratados com isopatia e florfenicol (ISO+ANTIB)

tiveram mais registros de ingestão de alimento, provavelmente os demais grupos testados

tiveram menores registros devido à colonização de Vibrio no hepatopâncreas dos animais.

Ainda não está clara a relação de patogenicidade de espécies de Vibrio no hepatopâncreas

com o atraso no crescimento (SUNG, 1994; 2001). O autor sugeriu que o camarão sob ataque

do patógeno teria o seu crescimento retardado por algum(ns) mecanismo(s), porém não se

sabe se comportamental ou fisiológico, os quais permanecem indeterminados.

Observou-se a manipulação do alimento (MAN) em todos os grupos após a oferta da

ração, apresentando diferença significativa entre os grupos testados (χ2 = 93,339, Tukey). As

maiores médias foram encontradas nos grupos tratados com florfenicol (0,49±0,78) (ANTIB)

e isopatia (0,53±0,8) (ISO) (Figura 3). Alimentos para camarões que possuam em sua

composição nutricional quimioatratores são importantes para este grupo animal, pois seu

consumo do alimento é lento e pode ocasionar lixiviação dos nutrientes após a imersão na

39

água (NUNES et al., 2006). Desta forma, entende-se aqui que não houve diferença entre os

grupos pela presença de óleo de peixe que funcionou como um quimioatrator.

Figura 3 – Comportamento manipulação do alimento após a oferta da ração em L. vannamei Tratamentos: 1)

ANTIB: grupo de camarões infectados e com administração de antibiótico; 2) CONTR: grupo controle sem

inoculação de patógeno e sem administração de medicamentos alopático e isopático; 3) INFEC: grupo

infectado e sem administração de medicamentos alopático e isopático; 4) ISO+ANTIB: grupo infectado e com

administração de medicamentos alopático e isopático; 5) ISO: grupo infectado e com administração de

medicamento isopático. Médias seguidas de letras iguais não diferem pelo teste de Tukey, a 5% de

probabilidade.


Observou-se que os comportamentos que obtiveram os maiores valores médios antes

da oferta da ração foram inatividade, exploração do substrato, limpeza e natação. A

inatividade diferiu estatisticamente (χ2 = 136,106, Tukey), antes e após a oferta do alimento,

sendo observadas maiores frequências para os grupos infectado (INF), antibiótico (ANTIB) e

isopatia (ISO). Observou-se que o comportamento de exploração de substrato foi diferente

entre os grupos (χ2 = 64,211, Tukey) antes da oferta do alimento, tendo maiores valores

médios para o grupo tratado com isopatia + florfenicol (ISO+ANTIB) (1,89±1,38). Não foi

observado diferença neste comportamento (EXP) após a oferta do alimento (χ2 = 7,610, p=

0,107).

A limpeza (LIM) foi um comportamento exibido antes e após a oferta do alimento,

tendo sido observada diferença significativa antes da oferta, com maiores valores médios para

o grupo tratado com isopatia + florfenicol (ISO+ANTIB) (χ2 = 32,816, Tukey). A limpeza é

um comportamento que em crustáceos pode estar ligado a quimiorrecepção, capacidade

importante para o estabelecimento de hierarquia (BARBATO; DANIEL, 1997). Apesar de

várias espécies de crustáceos decápodes apresentarem este comportamento e gastarem muito

tempo e energia na realização desta atividade, consideramos este dado como um

40

comportamento aparentemente deslocado (tensão), que pode ser relacionado com o tamanho

do aquário (espaço restrito) e a presença de microrganismos no ambiente externo e interno.

Neste trabalho, a inatividade foi o comportamento mais frequente e este sofreu

modificações em função da presença do alimento artificial. Os indivíduos mostraram-se mais

inativos em todas as observações ocorridas antes (A) da oferta, sendo os grupos infectados e

tratados com antibiótico (ANTIB) e isopatia (ISO) com maiores registros de inatividade. É

descrito na literatura que camarões infectados por Vibrio apresentam letargia e quando estão

próximos à morte, deitam-se no fundo do viveiro e ficam com pouca ou nenhuma

movimentação de seus apêndices locomotores, ficando parados (MENDES et al., 2009). Nos

trabalhos de Dall (1986) e Dall et al. (1990) foi enfatizado que os camarões peneídeos

(Penaeus esculentus, L. vannamei) reduzem suas atividades exibidas durante o dia para

poupar o gasto energético. Afirmam que os camarões permanecem inativos durante o dia e

que à noite, tornam-se mais ativos, triplicando o consumo de oxigênio.

Guerao e Ribeira (1996) analisaram o padrão de atividades do camarão

marinho Palaemon serratus e observaram que o camarão apresenta ritmicidade endógena de

período circadiano, com atividade máxima noturna. No entanto, Lima (2011) registrou maior

frequência de inatividade durante a fase de escuro do dia e em temperatura de 18ºC. Santos et

al. (2013) registraram frequências de atividade (emergência do substrato e atividade natatória)

durante a fase clara do dia. Devido à ausência de areia, provavelmente para diminuir o gasto

energético e a exposição a predadores, observou-se que os animais ficaram mais tempo

inativos, uma vez que não pôde exibir o comportamento de enterramento e nem revirar

sedimento sobre o substrato.

Os animais exploraram o ambiente de forma homogênea em todos os horários

observados e em todos os tratamentos testados. Este comportamento também foi observado

em camarões L. vannamei por outros autores (PONTES et al., 2006; LIMA, 2011; SANTOS

et al., 2013).

O deslocamento dos animais (comportamento de exploração e natação) é mais

frequente durante o dia (DALL et al., 1990; FREIRE, 2005; PONTES, 2006; SANTOS,

2013), no entanto, comparado aos outros comportamentos, consideramos o registro de

menores frequências de natação, podendo estar relacionado ao fato da presença de patógenos

no ambiente. Observou-se que a natação apresentou sua maior média no grupo infectado sem

tratamento depois da alimentação. Este dado é importante e está relacionado aos sinais

clínicos da enfermidade, desorientação e nado errático (MENDES et al., 2005), mesmo

sensibilizado pela presença do alimento. Por apresentar os sinais da doença, os animais giram

41

sem parar até conseguirem segurar a ração e, em seguida, param e iniciam o processo de

ingestão, ou seja, os animais deste grupo (INFEC) demoram mais que os animais dos outros

grupos para realizarem a ingestão.

Figura 4 – Comportamentos do camarão L. vannamei infectados por Vibrio e submetidos a tratamentos clínicos

com antibiótico e/ou isopatia, após a oferta da ração. A: comportamento limpeza. B: comportamento de

inatividade. C: comportamento rastejando. D: comportamento de natação. Tratamentos: 1) ANTIB: grupo de

camarões infectados e com administração de antibióticos; 2) CONTR: grupo controle sem inoculação de

patógeno e sem administração de medicamentos alopático e isopático; 3) INFEC: grupo infectado e sem

administração de medicamentos alopático e isopático; 4) ISO+ANTIB: grupo infectado e com administração de

medicamentos alopático e isopático; 5) ISOP: grupo infectado e com administração de medicamento isopático.

Médias seguidas de letras iguais não diferem pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

42

3.2 TAXA DE MORTALIDADE

Não foi registrada diferença estatística significativa na taxa de mortalidade entre os

grupos (p>0,05) (Tabela 3). Houve registros de animais mortos em todos os grupos, sendo o

número de mortos maior no grupo controle 2 (infectado) do que nos grupos controle 1 e nos

grupos que fizeram uso de medicamentos (isopatia e antibioticoterapia, simultaneamente). As

vibrioses podem levar à morte dos animais em 48h pós-inoculação (PADILHA et al., 2013).

No entanto, no grupo CONTR ocorreu nos primeiros 12 dias do período experimental,

provavelmente os animais gravemente enfermos morreram e os que sobreviveram, tratados ou

Antes Depois


A

D

C

B

43

não, entraram em fase de recuperação e remissão dos sinais clínicos, o que também foi

acompanhado através da histopatologia.

3.3 GANHO DE PESO

Na carcinicultura, o parâmetro zootécnico do ganho de peso é um dos mais

importantes (NUNES, 2005). Os dados do controle (CONT) e isopatia mais antibiótico

simultaneamente (ISO+ANTIB) formaram curva ascendente nos 18 dias de experimento,

embora ao analisarmos o ganho semanal em gramas por camarão, o melhor desempenho foi

ainda o controle (CONT) com 0,6g/semana. O grupo ANTIB tratado com florfenicol

apresentou mesmo ganho de peso, 0,6g/semana. Este parâmetro zootécnico depende de outros

fatores, entre eles destacamos: qualidade nutricional do alimento, biodisponibilidade dos

nutrientes, parâmetros de qualidade da água e densidade de estocagem. Em Penaeus

monodom observou-se aumento do peso destes organismos em 0,58 g/semana em uma dieta

basal (WILLIAMS et al., 2005), o que se aproxima dos resultados aqui obtidos para L.

vannamei. O grupo controle 2 (INFEC) apresentou ganho de peso de 0,3g/semana, muito

abaixo dos outros dois grupos: isopatia mais florfenicol simultaneamente (ISO+ANTIB)

0,5g/semana e grupo isopatia (ISO) 0,5g/semana, mesmo que com relação a ingestão de

alimento os três grupos não apresentassem diferença estatística. É possível que a presença de

Vibrio nos camarões resultou em baixa taxa de conversão alimentar e de crescimento, o que

significa dizer que camarões altamente colonizados por Vibrio no hepatopâncreas tendem a

crescer mais vagarosamente e, portanto, consomem mais insumos (CHAYABURAKUL et al.,

2004). Observamos ingestão de alimento igual nos três grupos (CONT, ISO+ANTIB e

INFEC), assim, sugere-se que o desgaste observado no grupo infectado para alcançar o

alimento (nado incoordenado e desorientado) contribuiu para a diminuição de sua taxa de

conversão e, consequentemente, seu ganho de peso.

À exceção dos camarões do grupo ISO+ANTIB, todos os demais apresentaram um

ganho de peso nos primeiros 6 dias, seguido de queda para o grupo INFEC e ISSO. Talvez a

situação de estresse provocada pela inoculação do patógeno tenha levado ao disparo na

resposta humoral do sistema imune. Estas incluem o sistema profenoloxidase, a coagulação

em cascata e vários peptídeos com ação antimicrobiana (IWANAGA; LEE, 2005). Em

seguida deve ter ocorrido um aumento da carga bacteriana nos animais, morte de alguns, os

camarões não tratados tiveram perda de peso e os tratados reverteram e ganharam peso ou

estabilizaram. Observa-se que nos últimos seis dias houve uma ligeira queda no ganho de

44

peso do grupo tratado com florfenicol (ANTIB), mas não interferiu na sua média de ganho de

peso semanal, mantendo este grupo em situação semelhante ao de controle (Figura 5).

Figura 5 – Média de ganho de peso nos grupos experimentais a cada 6 dias do experimento a) Controle,

b)isopatia e florfenicol simultaneamente (ISO+ANTIB), c) Infectado, d) Antibiótico florfenicol (ANTIB) e

Isopatia.


Um dado importante, e que foi avaliado para todos os grupos, foi o acompanhamento

da histopatologia a cada 6 dias pós infecção (Quadro 1). Os camarões estavam saudáveis no

início do experimento, entretanto não eram livres de patógenos específicos. Quando se

observou a histologia dos animais amostrados, foram identificadas lesões compatíveis com

doença viral conhecida por Doença da Mionecrose Infecciosa (IMNV).

Quadro 1 – Descrição dos resultados da observação histopatológica dos camarões dos 5 grupos experimentais,

onde 0= não encontrado lesão, 1= encontrado lesões características, 2= encontradas muitas lesões características.

Tratamento 12/12/2013 18/12/2013 25/12/2013

Gravidade das lesões encontradas

CONTROLE IMNV 0 1 0

BACTERIOSE 0 0 0

INFECTADO IMNV 2 2 1

BACTERIOSE 1 1 0

ISOPATIA IMNV 1 1 0

BACTERIOSE 1 0 0

ANTIBIOTICO IMNV 1 1 1

BACTERIOSE 0 0 0

ANTIB + ISO IMNV 1 0 1

BACTERIOSE 1 0 0


45

A IMNV atinge camarões juvenis e está relacionada a estresse físico e ambiental,

apresentando na fase aguda alta mortalidade, reduzindo na fase crônica (LIGHTNER;

PANTOJA, 2004). Nos dois animais de cada grupo retirados para histopatologia foram

observadas lesões características de infecção bacteriana até 12 dias pós inoculação do

patógeno no grupo infectado (INFEC). Nos demais animais medicados seja por isopatia (ISO)

ou por florfenicol (ANTIB) ou ainda os dois simultaneamente (ISO+ANTIB), as lesões

provocadas pelas bactérias só foram observadas até o sexto dia após a inoculação do patógeno

e o grupo controle (CON) e o tratado com florfenicol (ANTIB) não foi verificada lesão

característica de infecção bacteriana.

4 CONCLUSÕES

O grupo tratado com antibiótico florfenicol associado ao medicamento isopático

Vibrio parahaemolyticus CH 12 e o grupo controle apresentaram maiores

frequências de comportamento de ingestão de alimento e exploração de substrato.

O grupo tratado com antibiótico florfenicol associado ao medicamento isopático

Vibrio parahaemolyticus CH 12 e o grupo controle apresentaram menor número de

animais mortos durante o experimento.

O uso do medicamento isopático para tratar vibriose em camarões juvenis leva as

mesmas frequências comportamentais que os tratados apenas com alopático.

Utilizando este parâmetro como indicativo de enfermidade ou sanidade a melhor

escolha, por provocar menos danos ambientais, é a isopatia.

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ANEXOS

Anexo A

Tabela 1 – Descrição dos grupos experimentais

Grupos experimentais Inoculação

do patógeno

Tratamento

isopático

Tratamento

alopático

Controle (CONT) Não Não Não

Infectado (INFEC) Sim Não Não

Antibiótico (ANTIB) Sim Não Sim

Isopático (ISO) Sim Sim Não

Isopático+Antibiótico (ISO +ANTIB) Sim Sim Sim


49

Anexo B

Tabela 2 – Descrição dos comportamentos observados durante o experimento

Comportamento Descrição

Inatividade (INA) O animal fica imóvel ou estacionário no fundo do aquário, movendo

ou não os apêndices locomotores

Exploração de substrato

(EXP)

O animal move os apêndices locomotores e se desloca no fundo do

aquário, aparentemente buscando sobras de alimento

Natação (NAT) O animal se mantém suspenso ou se desloca verticalmente ou

horizontalmente na coluna d’água com movimento dos pleópodos

Ingestão de alimento (ING) O animal ingere a ração peletizada

Limpeza (LIM) O animal fricciona os dois primeiros pares de pereiópodos sobre a

superfície do cefalotórax ou abdome

Manipulação do alimento

(MAN)

Antes e durante a ingestão do alimento o animal gira o alimento com

os apêndices.

Fonte: Pontes, 2006

Anexo C

Tabela 3 – Taxa de mortalidade observada nos grupos

Tratamento Morte Sobrevive

N % N %

ISOPATIA 5 15,6% 27 84,4%

ANTIBIOTICO 5 15,6% 27 84,4%

ISO +ANTIB 4 12,5% 28 87,5%

INFECTADO 6 18,8% 26 81,3%

CONTROLE 4 12,5% 28 87,5%


AGRADECIMENTOS

Ao Laboratório de Farmacotécnica Homeopática e Farmácia Oficinallis pela

elaboração dos medicamentos isopáticos utilizados.

Ao Laboratório de Piscicultura Ornamental da Escola Agrícola de Jundiaí pela cessão

dos aquários de vidro utilizados no experimento.

Ao Labcon pela cessão de testes colorimétricos para análise de água.

50

MANUSCRITO III DETECÇÃO DE NECROSE HEPATOPANCREÁTICA

AGUDA ASSOCIADA A BACTÉRIAS OPORTUNISTAS

EM CAMARÕES JUVENIS3

DETECÇÃO DE NECROSE HEPATOPANCREÁTICA AGUDA ASSOCIADA A

BACTÉRIAS OPORTUNISTAS EM CAMARÕES JUVENIS

Resumo: A carcinicultura mundial tem sofrido forte impacto causado por enfermidades, sobretudo as

de origem viral e bacteriana, levando a queda de produção do Litopenaeus vannamei e perdas

econômicas. A partir de 2009 uma enfermidade causada por Vibrio parahaemolyticus, a

hepatopancreatite necrosante aguda (AHPND) foi relatada em vários países asiáticos e na América do

Norte. O grupo etário alvo são animais juvenis, os quais apresentavam: letargia, anorexia,

permanência no fundo do viveiro, estômago e intestino vazio e atrofia e coloração esbranquiçada do

hepatopâncreas. Em fazenda de cacinicultura apresentando mortalidade foram capturados animais

apresentando os sinais da vribriose, foram examinados com o objetivo de identificar os agentes

bacterianos presentes. Por meio de análise presuntiva, seguida de confirmatória foi isolado V.

parahaemolyticus, e presença das bactérias Aeromonas hydrophila e Vibrio mimicus, agentes

presentes em viveiros provável causa primária da hepatopancreatite necrosante aguda (AHPND).

Conclui-se que é necessário manter os animais cultivados em conforto, uma vez que são oportunistas e

estão em ambientes aquáticos.

Palavras-chave: Bem-estar animal. Litopenaeus vannamei. AHPND.

DETECCIÓN DE BACTERIAS DE LA NECROSIS AGUDA

HEPATOPANCREÁTICA ASOCIADOS EN CAMERÚN JUVENIL OPORTUNISTA

Resumén: La camoronicultura mundial ha sufrido impactos de las enfermedades infecciosas, ya sean

virales o bacterianas. Así la caída de la producción conduce a pérdidas económicas. Desde el año 2009

una nueva enfermedad causada por Vibrio parahaemolyticus se ha reportado en alguns países de Asia

y América del Norte, el grupo de edad son los animales en las primeras etapas de la vida y que pesan

cerca de 2 g. Mostran signos clínicos cómo: letargo, anorexia, quedarse en el fondo del estanque, tripa

vacía y retraso en el crecimiento y el hepatopáncreas blanquecinas. Objetivouse hacer la identicación

de los agentes oportunistas en animales infectados AHPND. Hiciemos a través del análisis presuntivo

seguido por V. parahaemolyticus de confirmación por la biología molecular y había presencia de otras

bacterias además de este agente: Aeromonas hydrophila y agentes de Vibrio mimicus describen por ser

oportunista en viveros y también ser un riesgo para la salud pública, ya que afectan la ser humano.

Palabras-clave: Bienestar de los animales. Litopenaeus vannamei. AHPND.

1 INTRODUÇÃO

3 O manuscrito III corresponde a artigo a ser submetido à revista Industria Acuicola Aqua Negocios S.A. de C.V.

de las Torres, n. 202, CP: 82136, Mazatlán, Sinaloa, México (669) 981 85 71. A priori, encontra-se normatizado

conforme preconiza a ABNT.

51

A carcinicultura mundial sofre prejuízos na produção por enfermidades virais e

bacterianas, que causam alta mortalidade, gerando perdas econômicas

(JIRAVANICHPAISAL et al., 1993; VERSCHUERE et al., 2000; ESCOBEDO-BONILLA,

2008; LIGHTNER, 2011; DANTAS et al., 2015). Os vibrios são bactérias conhecidas por

serem oportunistas, ou seja, estão no ambiente aquático e em baixas de imunidade dos

animais podem provocar infecção. Mudanças bruscas no ambiente aquático, que alterem os

parâmetros de qualidade de água podem debilitar os animais, deixando-os vulneráveis a estes

patógenos (SAULNIER et al., 2001).

A partir de 2009, uma alta taxa de mortalidade nas fases iniciais do ciclo de produção

em camarões peneideos foi relatada em países asiáticos com alta taxa de mortalidade variando

entre 40 a 100% (CUÉLLAR-ANJEL; LIGHTNER; PANTOJA, 2012; HONG et al., 2015).

Em 2010, 2011 e 2013 mais casos com sinais clínicos semelhantes foram identificados no

Vietnam, Malásia e México, tendo o seu agente etiológico, Vibrio parahaemolyticus, sido

identificado em 2013 (SOTO-RODRIGUES et al., 2015). Os sinais clínicos apresentados

pelos animais são: nado errático, pouco crescimento, hepatopâncreas pálido ou esbranquiçado

de tamanho reduzido, carapaça amolecida e intestino com presença entrecortada de alimento

ou sem alimento, manchas escuras no hepatopâncreas que podem ser visualizadas a olho nu e

permanência dos animais no fundo do viveiro. Os sinais clínicos podem aparecer entre o

sétimo e o décimo dia depois do povoamento, podendo ocorrer a reaparição dos sinais clínicos

e mortalidade aos 60 dias da criação (CUÉLLAR-ANJEL, 2013). Foi objetivo deste trabalho

identificar os agentes bacterianos presentes em animais enfermos examinados em fazenda de

produção de camarão que apresentou alta mortalidade.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 LOCAL DE COLETA

Fazenda de produção de camarão Litopenaeus vannamei com 58 ha, 8 tanques de

criação com tamanho aproximado, cada um, de 7ha, localizada na Cidade de

Obregón/Sonora/MX. A fazenda dispunha de berçário, onde as PLs eram mantidas até 30 dias

e em seguida levadas para os viveiros escavados.

2.2 ANIMAIS

52

Camarões da espécie L. vannamei coletados de fazenda onde havia sido relatada alta

mortalidade em viveiros no dia anterior. Do viveiro suspeito foi retirada uma amostra de 10

camarões moribundos apresentando sinais de enfermidade que pesavam entre 7 e 9g (Figura

1). A densidade de criação nos viveiros era de 15 animais/m2, os quais estavam no 52º dia de

cultivo no dia da coleta.

Figura 1 – Camarão L. vannamei retirado do viveiro com alta mortalidade com carapaça amolecida, letárgico e

hepatopâncreas esbranquiçado


2.3 LABORATÓRIO DE ANÁLISES

Todas as análises presuntivas e confirmatórias foram realizadas no Laboratório de

Biosistemas Acuáticos do Instituto Tecnológico de Sonora, unidade centro-ITSON.

2.4 ANÁLISE A FRESCO

Seguindo-se o método estabelecido por Morales Covarrubias (2014). É uma técnica

presuntiva e, como tal, necessita de outras técnicas complementares para diagnóstico

definitivo. Após a observação dos tecidos, a presença de necrose no hepatopâncreas, lesões

necróticas na carapaça, entre outros sinais característicos de infecções por víbrios, era

indicada a retirada de três destes animais para exame no setor de bacteriologia.

2.5 BACTERIOLOGÍA

53

Os organismos que apresentavam danos no hepatopáncreas (necrose e melanização)

foram processados por bacteriología. O órgão foi macerado em 9mL de solução salina

(relação 1:10) e semeados em 100 µl por extensão em placas de agar TCBS, as quais foram

incubadas a 28-30oC por 24h. Foram contadas colônias verdes e amarelas; aquelas que

prevaleceram foram isoladas para sua posterior análise e caracterização. Os isolados foram

purificados em placas de TSA 2% NaCl, e criopreservados a -80oC em frascos com TSB

2%NaCl-30% glicerol (GÓMEZ GIL, 1998).

2.6 COLORAÇÃO DE GRAM

A coloração de Gram (GRAM, 1884) foi utilizada para avaliar possível contaminação

do material observado. As bactérias testadas para V. parahaemolyticus são Gram negativos e

são observadas ao teste com coloração rósea ou vermelha e em forma de vírgula.

2.7 BIOQUÍMICA

As cepas que cresceram foram isoladas e identificadas por sua cor e características de

crescimento da colônia e encaminhadas para provas bioquímicas realizadas por kit comercial

para identificação bioquímica após teste de oxidase.

2.8 BIOLOGIA MOLECULAR

Os isolados com suspeita de V. parahaemolyticus foram analisados mediante reação

em cadeia de polimerase em tempo real (qPCR) com primers AHPND/EMS (IQ2000). Cada

isolado recuperado na bacteriologia dos animais foi submetido ao enriquecimento em Caldo

Soja Tripticaseína (TSB) 2% NaCl e incubado a 28 oC; um mililitro amostra foi transferido

em microtubo e enviado ao Laboratorio de Biología Molecular para confirmação da espécie.


Foi observada alta mortalidade no viveiro, o que dificultou a captura de animais. A

maior parte destes apresentavam carapaça amolecida e hepatopâncreas esbranquiçado (Figura

2). Segundo Moralles-Covarrubias (2014), a primeira etapa da identificação da enfermidade é

a observação dos sinais clínicos.

54

Figura 2 – Camarões apresentando hepatopâncreas esbranquiçado e conteúdo intestinal entrecortado.

Evidenciado na diferença de coloração entre hepatopâncreas (seta)


Observou-se um aumento do tempo de coagulação em todos os organismos

examinados. Vieira e Gesteira (2008) relataram que a contagem do tempo de coagulação da

hemolinfa não tem relação com o grau de infecção dos animais. No entanto, Maggioni (2004)

e Santos et al., (2005) descrevem que o processo de coagulação da hemolinfa está envolvido

na ação do sistema imune dos camarões, que bloqueia e fecha pequenas lesões, evitando,

assim, a entrada de patógenos em situações de estresse e em possíveis invasões bacterianas.

Isto leva ao desequilíbrio no processo e a coagulação se dá mais lenta do que o esperado.

Na observação do trato digestório, todos os animais apresentavam o intestino vazio e

hepatopâncreas atrofiado e branco, os túbulos também apresentavam deformações, necrose e

melanização, dados que estão de acordo com os descritos para infecção AHPND

(MORALES-COVARRUBIAS, 2014) (Figura 3).

Figura 3 – Lesões, necrose e má formação dos túbulos do hepatopâncreas


55

Os animais com lesões graves em hepatopâncreas tiveram material encaminhado para

PCR no Laboratório de Biologia Molecular de ITSON-centro, com resultado positivo para

AHPND, entretanto, mesmo encaminhando material para identificação molecular, foi seguido

o protocolo de identificação bacteriológica. Estômago e hepatopâncreas foram encaminhados

para o setor de bacteriologia e macerados em solução salina e 100µL foi pipetado e aplicado

sobre o agar TCBS e incubado em placas invertidas a temperatura de 28 a 30°C por 24 h.

Após este período, foi feita a primeira leitura das placas, identificou-se crescimento de

colônias sacarose positivas em hepatopâncreas e estômago para um dos camarões que

apresentou-se com as mais graves lesões em hepatopâncreas. Após o isolamento das cepas em

TSA e feita coloração de Gram para identificar possíveis contaminações, realizou-se

identificação bioquímica das cepas com kits comerciais

Foram identificadas as bactérias Aeromonas hydrophila, bactéria oxidase positiva,

fermentadora de sacarose e patogênica para camarões e Vibrio mimicus, não fermentadora de

sacarose e oxidase positiva, ambas bactérias são patogênicas para camarões e estão descritas

em águas de viveiros, são patogênicas para humanos, portanto, importante para a saúde

pública (COSTA et al., 2008).

Após o crescimento de bactérias dos gêneros Vibrio e Aeromonas encontradas em

estômago dos camarões que apresentaram necrose em hepatopâncreas, foi encaminhado

material para biologia molecular e esta amostra foi positiva para a presença de V.

parahaemolyticus. A região do estado de Sonora havia sido relacionada à presença de

AHPND em 2013 (LIGHTER et al., 2013; SOTO et al., 2015). Sabe-se que os camarões

infectados por esta enfermidade têm mortalidade alta, com 35 dias após a estocagem (TRAN

et al., 2013). Assim, os camarões aqui descritos, no quinquagésimo segundo dia, com peso

entre 7 e 9g, estavam fora deste limite, provavelmente sobreviveram a uma infecção anterior

pela AHPND e foram infectados por bactérias oportunistas frequentemente encontradas em

água de viveiros.

4 CONCLUSÃO

Conclui-se que, em camarões positivos para AHPND, acima do peso, em que

frequentemente incide esta enfermidade, têm alta mortalidade quando infectados por bactérias

oportunistas que estão comumente em águas de viveiros. Desta forma, sugere-se que é

56

necessário manter os animais de criação em condições de conforto, reduzindo o estresse, que

os deixaria vulneráveis a estas infecções.

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AGRADECIMENTOS

A ITSON, Comitê de Sanidade Acuícola de estado de Sonora, Escola Agrícola de Jundiaí e

Secretaria de Relações Internacionais da UFRN.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo demonstrou que pesquisas em laboratório que visem utilizar

camarões juvenis L. vannamei para testes com enfermidades, o uso de aquários sem areia não

afeta a expressão dos comportamentos (alimentação, natação, exploração com substrato,

manipulação de alimentos e inatividade) desses animais, provavelmente não afetando o bem-

estar.

Quando essa espécie na fase juvenil está infectada pelo V. parahaemolyticus, o

tratamento veterinário que utiliza a combinação de medicamentos isopático e alopático

(florfenicol) apresenta frequências comportamentais semelhantes ao grupo controle, o qual

não havia sido infectado.

Em fazendas de carcinicultura com alta mortalidade de L. vannamei, observamos in

loco a presença da bactéria V. parahaemolyticus, causadora de AHPND, e a alta mortalidade

encontrada nos camarões foi relacionada à infecção por bactérias oportunistas frequentemente

encontradas nos viveiros.

A partir das respostas obtidas, conclui-se que a observação do comportamento dos

animais é uma ferramenta importante para auxiliar na manutenção de conforto dos animais

submetidos a condições laboratoriais, pois as respostas não diferiram entre os grupos com

areia e sem areia, mesmo na ausência da possibilidade de execução do comportamento de

enterramento. A partir desta observação, teve-se a tranquilidade de usar condições

semelhantes, sem areia, para avaliar animais infectados experimentalmente por bactérias da

espécie Vibrio parahaemolyticus.

58

As respostas obtidas em resposta aos tratamentos indicaram que é possível usar a

isopatia para tratar camarões, um tratamento que ainda não havia sido testado para as

infecções bacterianas. Mostrou-se importante para a carcinicultura, por sua ação de

estimulação da força vital, provavelmente proporcionando uma melhor resposta aos animais

tratados com antibiótico concomitantemente.

A bactéria Vibrio parahaemolyticus é o agente causador de AHPND, enfermidade com

alta mortalidade no continente Asiático e na América do Norte. Por se tratar de uma cepa

diferente da que trabalhamos no Brasil, visitamos fazendas no México e identificamos a

presença deste agente causando mortalidade naquele país. Também observamos que animais

recuperados se infectavam por bactérias oportunistas, levando novamente à altas taxas de

mortalidade.

Quadro 1 – Estão apresentadas as hipóteses e suas respectivas predições e os resultados que demonstram se elas

foram ou não corroboradas

HIPÓTESE 1 – Animais em aquários de experimentação exibem respostas comportamentais ajustadas ao

ambiente com ou sem areia como substrato.

PREDIÇÕES RESULTADOS CONCLUSÕES

1 - Os camarões apresentarão

frequências comportamentais

diferentes dependendo do

substrato oferecido.

As frequências comportamentais

foram semelhantes entre os

grupos testados

Hipótese negada

(manuscrito 1)

2 - Os camarões que tiverem

areia como substrato

apresentarão taxas de

sobrevivência e ganho de peso

maior que o grupo sem areia.

A sobrevivência e ganho de peso

não apresentou diferença entre

os grupos.

Hipótese negada

(manuscrito 1)

HIPÓTESE 2 -O tratamento clínico influenciará nas respostas comportamentais de camarões infectados.

2.1 - O camarão tratado com

medicamento isopático exibirá

mais comportamentos de

movimentação, como natação e

exploração de substrato.

O camarão tratado

concomitantemente por

antibiótico e isopatia obteve

resposta comportamental

semelhante ao grupo controle.

Parcialmente corroborada

(manuscrito 2)

2.2 – O camarão infectado e sem

tratamento apresentará maior

frequência de inatividade

comparado aos grupos tratados.

O camarão sem tratamento e

infectado apresentou frequência

de inatividade semelhante ao

grupo antibiótico

Parcialmente negada

(manuscrito 2)

HIPÓTESE 3 – Os animais infectados com V. parahaemolyticus e submetidos a tratamentos clínicos

apresentarão lesões teciduais histopatológicas diferentes em quantidade e gravidade que os não tratados

3.1 - Os animais tratados com

isopatia apresentarão número

inferior de lesões

histopatológicas.

Os animais tratados apenas por

alopatia não apresentaram lesões

por infecção bacteriana.

Hipótese negada

(manuscrito 2)

3.2 – Os animais do grupo

infectado e que não recebeu

tratamento terão o número maior

de lesões histopatológicas.

Os animais do grupo infectado

apresentaram maior frequência

de lesões por bactéria e também

apresentaram mais lesões

sugestivas de IMNV.

Hipótese corroborada

(manuscrito 2)


59

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