Comparative Proteomic Analysis of Comparative Proteomic Analysis of Extracellular Proteins Reveals Secretion of Extracellular Proteins Reveals Secretion of

T-Kininogen from Vascular Smooth T-Kininogen from Vascular Smooth Muscle Cells in Response to Incubation Muscle Cells in Response to Incubation

with S-Enantiomer of Propanololwith S-Enantiomer of Propanolol

Jianjun Sui, Jianhua Zhang, Chi Bun Ching and

Wei Ning Chen

Proteómica

La proteómica comprende todas las proteínas presentes en un organismo, tejido o célula en particular en un momento determinado. En contraste con la genómica, la proteómica no es estática.

Las diferencias en la expresión de proteínas no son accesibles a nivel genómico, pero si a nivel proteómico.

La información cuantitativa de las proteínas expresadas es necesaria y constituye un paso clave para entender por completo la función de las organelas, células, organismos; así como también los procesos de enfermedad.

La técnica de la proteómica puede resumirse en cuatro pasos fundamentales:

- Aislamiento de la proteína y preparación- Separación de la proteína (HPLC, 1D gel

electrophoresis, etc)- MS- Software bioinformático

Introducción

Los receptores β adrenérgicos pertenecen a una familia de receptores acoplados a proteína G.

Existen 3 tipos conocidos de β adrenoreceptores (β1,β2,β3)

β1 Corazón y riñones

β2 Pulmones, tracto gastrointestinal,

vasculatura y útero.

Receptor β2-Adrenérgico

Structure of the β2-adrenergic receptor.  The receptor protein is colored as a rainbow from blue at one end (N-terminus) to red at the other (C-terminus).  In a cell, the long helices at the core of the molecule cross the cell membrane. 

Propanolol R- Propanolol

S-Propanolol

Es un β bloqueador no selectivo, que bloquea la acción de la epinefrina en ambos adrenoreceptores.

Β-bloqueadores inhiben las acciones de los mediadores de epinefrina reduciendo el efecto en la tasa de excitación y fuerza de contracción miocárdica, dilatación de vasos sanguíneos y apertura de bronquios.

El propanolol es utilizado en arritmias ventriculares asociadas a cardiopatía isquémica, reduciendo la actividad arritmogénica en pacientes con infarto de miocardio previo.

T-Kininógeno metabolitos activos (Kininas): BK B1 y B2

B2 protección contra isquemia

Objetivo

Investigar la secreción de proteínas con diferentes niveles de expresión en medios de cultivo de células de tejido vascular liso (A7r5) incubadas por separado con los enantiómeros individuales del Propanolol usando el método de cuantificación iTRAQ acoplado

con LC-MS/MS bidimensional.

Justificación

β bloqueadores se administran como mezclas racémicas, aunque solo el enantiómero S tiene actividad sobre el receptor.

β bloqueadores potenciales efectos adversos a dosis

usuales.

Hipótesis

El enantiómero S del propanolol provoca una mayor secreción protéica en las células de músculo liso vascular con respecto al enantiómero R.

Sección Experimental

Se utilizó una estrategia que simultáneamente detecta y cuantifica diferencias en la secreción de proteínas en células de músculo liso vascular.

Para esto se seleccionó un grupo de células (A7r5):

ControlEnantiómero SEnantiómero R

Condiciones del cultivo celular

Células a 37ºC en atmósfera de 5% de CO2

Luego de alcanzar el 80% de la expansión celular, se incubaron con el enantiómero R y S del propanolol (20 M).

Luego de 24 h, el medio de cultivo fue removido, filtrado y concentrado para su posterior análisis.

Tratamiento de muestras:

Se etiquetaron las proteínas secretadas de cada medio de cultivo con los reactivos iTRAQ

Control A7r5 = iTRAQ 114 Enantiómero S = iTRAQ 115 Enantiomero R = iTRAQ 117

Separación de proteínas mediante CL

Fragmentación e identificación de proteínas por MS

Criterio: 2 o más péptidos deben ser identificados con un alto grado de confianza (>95%)

Cuantificación con método Western Blot

Reactivos iTRAQ

Resultados

Figura 1: Espectro de masas T-Kininógeno

Análisis iTRAQ

Análisis Western-Blot

Discusión

Células tratadas con el enantiómero S generaron mayor producción de T-Kininógeno.

T-Kininógeno cuantificado péptidos de quinina vasoactivos bradiquinina: respuesta mediada por B1 y B2

B2: expresado en la mayoría de tejidos, protege contra la isquemia por disfunción cardiaca

En este artículo, por medio del análisis iTRAQ acoplado a 2D-LC/MS/MS y el análisis de Western Blot se logró demostrar por primera vez que las células A7r5 pueden secretar T-Kininógeno.

En Conclusión

La aplicación de la proteómica cuantitativa provee un acercamiento efectivo para entender el mecanismo de acción del propanolol y aclara los roles de las proteínas (etiquetadas) durante la enfermedad.

Es posible asociar el uso de propanolol en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares a través del T-Kininógeno.

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Gracias