INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA ESCUELA DE BIOLOGIA

INFORME DE PRCTICA DE ESPECIALIDAD

COMPARACION DE TRES METODOS DE EXTRACCION DE ADN DE RESTOS OSEOS.COMPLEJO DE CIENCIAS FORENSES DEL ORGANISMO DE INVESTIGACION JUDICIAL, HEREDIA

Christian Del Valle Sibaja

CARTAGO, 2002

COMPARACION DE TRES METODOS DE EXTRACCION DE ADN DE RESTOS OSEOS

Christian Del Valle Sibaja1

RESUMENLa extraccin de ADN amplificable es un problema frecuente en las muestras degradadas de tipo forense, especialmente en los huesos. El poder obtener la mayor cantidad de informacin posible de estas muestras es muy importante a nivel legal. El presente estudio trata de encontrar el mtodo que proporcion las mejores condiciones de extraccin de ADN amplificable a partir de restos seos. Se compararon tres mtodos de extraccin fenlica en seis huesos de diferente procedencia. Los tres mtodos utilizados son: el usado por la Universidad de Santiago de Compostela, el usado en el OIJ y el del FBI. En la comparacin se tom en cuenta la cantidad de cidos nucleicos extrados, la amplificacin de STRs y Amelogenina por la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), el contexto ambiental en el que se encontraba la muestra y la presencia de inhibidores de PCR. Se encontr pequeas diferencias entre los mtodos, pero es el contexto de las muestras lo que afecta la cantidad y calidad del ADN. Se obtuvo mejores resultados de amplificacin de Amelogenina que de STRs en todos los mtodos. El mtodo del FBI es el que present las mejores las mejores condiciones de ADN amplificable an cuando no fue el mtodo que extrajo la mayor cantidad de ADN. El mtodo usado en la Universidad de Santiago de Compostela es el que present la mayor cantidad de contaminantes y los resultados ms pobres de amplificacin. El xito de amplificacin depende de una remocin efectiva de los contaminantes inhibidores de PCR.

Informe de Prctica de Especialidad, Escuela de Biologa, Instituto Tecnolgico de Costa Rica, Cartago, Costa Rica. 2002.

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COMPARACION DE TRES METODOS DE EXTRACCION DE ADN DE RESTOS OSEOS

Informe presentado a la Escuela de Biologa del Instituto Tecnolgico de Costa Rica como requisito parcial para optar al ttulo de Bachiller en Ingeniera en Biotecnologa.

Miembros del Tribunal

_______________________________ Johnny Peraza, Profesor Gua

________________________ Dra. Marta Espinoza, Representante de la Empresa

______________________ Dra. Anayanci Rodrguez, Lectora

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DEDICATORIAA mis padres y hermanos quienes me apoyaron durante mis estudios. Christian

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AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Marta Espinosa y al Complejo de Ciencias Forenses en general por haberme brindado la oportunidad de hacer la prctica de especialidad, as mismo por el apoyo financiero y logstico para la ejecucin del proyecto. A los miembros del Departamento de Bioqumica, por los conocimientos que me transmitieron en la materia, tambin por su paciencia. Al Dr. Luis Del Valle por los conocimientos que enriquecieron este trabajo y su apoyo. A Ana Morales, Anayanci Rodrguez, Gladis Nez, Silvia Fallas, Concepcin Morelli y Jose Luis Peraza por su dedicacin en el entrenamiento que me brindaron, en las labores del laboratorio, que influyeron grandemente en este trabajo. A mi padre Gerardo Del Valle y mi hermana Mnica Del Valle y a Irene Jimnez por su gran ayuda. A Maira Cartn de la Escuela de Medicina de la UCR y a Francisco Monge del ITCR por su ayuda en materia de estadstica. A mi querida madre por todo su amor y apoyo en mis 24 aos. A los miembros del Tribunal evaluador, por su gua, su paciencia, sus aportes y sugerencias durante la prctica.

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INDICE GENERAL RESUMEN .................................................................................................................... i DEDICATORIA ..........................................................................................................iii AGRADECIMIENTOS ............................................................................................... iv INDICE GENERAL..................................................................................................... v INDICE DE TABLAS ................................................................................................ vii INDICE DE GRAFICOS..........................................................................................viii INDICE DE FIGURAS .............................................................................................. ix INDICE DE ANEXOS ................................................................................................. x INTRODUCCIN ...................................................................................................... 11 MARCO TERICO.................................................................................................... 14 Fundamentos bsicos. ............................................................................................... 14 Restos seos como fuente de ADN............................................................................. 15 Obtencin de cidos nucleicos ................................................................................... 17 Cuantificacin de cidos nucleicos. .......................................................................... 18Cuantificacin Espectrofotomtrica .................................................................................................. 19 Cuantificacin por Hibridacin con una sonda ................................................................................. 19

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)........................................................... 21 Secuencias cortas repetidas en tandem (STRs) ....................................................... 22 Amelogenina............................................................................................................... 24 Electroforesis .............................................................................................................. 25 MATERIALES Y METODOS ................................................................................... 26Seleccin de muestras ....................................................................................................................... 26 Extraccin de ADN ........................................................................................................................... 26 Cuantificacin de cidos Nucleicos ................................................................................................. 30 Amplificacin (montaje de PCR) ...................................................................................................... 30 Electroforesis en Poliacrilamida con Tincin de Plata ...................................................................... 30 Bsqueda de Inhibidores de PCR ...................................................................................................... 30 Anlisis de las muestras .................................................................................................................... 31

RESULTADOS........................................................................................................... 32 DISCUSION ............................................................................................................... 38Anlisis de cuantificacin entre los mtodos. ................................................................................... 38 Anlisis de amplificacin entre los mtodos ..................................................................................... 46 Anlisis de la influencia del contexto de las muestras sobre los extractos. ....................................... 51

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ......................................................... 60

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Conclusiones ..................................................................................................................................... 60 Recomendaciones.............................................................................................................................. 61

BIBLIOGRAFA ........................................................................................................ 62 ANEXO ....................................................................................................................... 64 Modificacin del protocolo de Extraccin de ADN de restos seos segn el FBI (1998) (Acondicionado al laboratorio de Ciencias Forenses del OIJ)..................... 65 Extraccin fenlica de ADN a partir de restos seos (OIJ) ..................................... 67 Extraccin fenlica de ADN utilizada en la Universidad de Santiago de Compostela ..................................................................................................................................... 69 Protocolos de amplificacin para STR y Amelogenina utilizados en el Termociclador GeneAmp 9700 del Laboratorio de Bioqumica del Complejo de Ciencias Forenses del OIJ. ........................................................................................ 71 Procedimiento resumido de cuantificacin de ADN (mtodo de Quantiblot).......... 72 ESTADISTICA........................................................................................................... 74

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INDICE DE TABLASTabla 1. Resultados obtenidos de la cuantificacin de cidos nucleicos .32 Tabla 2. Resultados de la amplificacin de STRs, Amelogenina e Inhibidores..................................................................................................................34 Tabla 3. Resultados de la cuantificacin en el GeneQuant...37 Tabla 4. Resumen ......................................75

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INDICE DE GRAFICOS

Nm. Ttulo

Pg.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de DyNA Quant 200 segn el mtodo de extraccin utilizado. Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de DNA Strips segn el mtodo de extraccin utilizado. Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de Quantiblot segn el mtodo de extraccin utilizado. Comparacin de las medias de ARN presente segn el mtodo de extraccin utilizado. Comparacin de las medias de protenas presentes segn el mtodo de extraccin utilizado. Comparacin de las medias del porcentaje de pureza segn el mtodo de extraccin utilizado. Comparacin entre los diferentes mtodos de extraccin segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa Comparacin entre los diferentes mtodos de extraccin segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa de Amelogenina. Comparacin entre los diferentes mtodos de extraccin segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa en la bsqueda de inhibidores. Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de DyNA Quant 200 segn el contexto de las muestras. Comparacin de las medias cuantificadas por mtodo de DNA Strips segn el contexto de las muestras. Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de Quantiblot segn el contexto de las muestras. Comparacin entre los diferentes contextos, segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa de STRs. Comparacin entre los diferentes contextos, segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa de Amelogenina. Comparacin entre los diferentes contextos, segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa en la bsqueda de inhibidores.

39 40 41 43 43 44 46

47 48 51 52 53 55 56 57

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INDICE DE FIGURAS

Nm. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ttulo Absorbancia del ADN monocatenario y bicatenario Membrana de cuantificacin (Quantiblot) Termociclador 9700 Equipo bsico de electroforesis Limpieza exterior de un fmur Remocin de la mdula del fmur Discos cortados de la parte central del fmur Freezer/Mill Cristales observados en las muestras extradas por el mtodo de Santiago de Compostela Ejemplo de un gen de poliacrilamida. Corrida de STR para la muestra AF1. Se muestran las diferentes diluciones realizadas. Corrida de Amelogenina para las tres repeticiones de la muestra B, extradas por el mtodo del OIJ Corrida de inhibidores de PCR para la muestra C y D

Pg. 19 20 21 25 26 27 27 28 33

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35 36

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INDICE DE ANEXOS Modificacin del protocolo de Extraccin de ADN de restos seos segn el FBI (1998) .............................................................................................................. 65 Extraccin fenlica de ADN a partir de restos seos (OIJ) ..................................... 67 Extraccin fenlica de ADN utilizada en la Universidad de Santiago de Compostela ................................................................................................................. 69 Protocolos de amplificacin para STR y Amelogenina ............................................ 71 Procedimiento resumido de cuantificacin de ADN (mtodo de Quantiblot).......... 72 ESTADISTICA........................................................................................................... 74

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INTRODUCCINLa existencia de polimorfismos genticos ha demostrado ser muy til en la identificacin de individuos. Estos polimorfismos han impulsado el descubrimiento, desarrollo y estandarizacin de nuevas tcnicas de biologa molecular, las cuales han simplificado el trabajo y han aumentado el poder de discriminacin entre individuos. An as, falta mucho por hacer ya que, se siguen presentando problemas de contaminacin y deterioro en cierto tipo de muestras. La identificacin de individuos a nivel gentico ha adquirido gran importancia en varios campos, por ejemplo: la antropologa solamente trataba de reconstruir las organizaciones sociales del pasado por medio de las escrituras antiguas (jeroglficos), artefactos y tumbas, encontrados en sitios de excavaciones arqueolgicas. Tambin los restos seos se analizaban morfolgicamente con el fin de diferenciar sus gneros y aproximar la edad que tenan los individuos cuando murieron, as como tambin para apreciar el fenmeno evolutivo entre otras cosas. Hoy da, los restos humanos encontrados se pueden analizar por medio de tcnicas que permiten estudiar los cidos nucleicos presentes en los restos seos, tanto para identificarlos como para tratar de encontrar las relaciones de parentesco. De esta manera, los restos humanos como tales, han adquirido mayor valor pues se ha enriquecido el conocimiento de las civilizaciones pasadas. Otro campo importante es el de las ciencias forenses, que trata en conjunto con las autoridades de mantener el orden social entre otras cosas. Instituciones como el Organismo de Investigacin Judicial (OIJ) del Poder Judicial de Costa Rica, han hecho un esfuerzo por aclarar los resultados de los estudios de criminologa (homicidios, violaciones, negacin de paternidades, etc). En el pasado, se hacan anlisis de identificacin de individuos basados en los grupos sanguneos ABO/Rh, cuyo poder discriminatorio era muy pobre. Otro anlisis que an se practica es el de huellas digitales, que sigue siendo muy til ya que tiene gran poder discriminatorio, inclusive entre gemelos idnticos, sin embargo, no siempre se encuentran bien marcadas o disponibles. La biologa molecular ha aportado basto conocimiento en este campo. Actualmente las nuevas tecnologas basadas en el anlisis del cidos desoxirribonucleicos (ADN) son la base esencial para aclarar la mayora de los conflictos sociales. El anlisis del ADN permite estudiar a fondo las

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evidencias presentes en cualquier caso. Con estas tcnicas se analizan cabellos, semen, saliva, sangre, tejidos carnosos, huesos, dientes y uas, comnmente encontrados en los sitios del suceso. Para el anlisis del ADN, se intenta siempre trabajar con la mejor muestra. Instituciones de investigacin forense como el OIJ o el Federal Bureau of Investigation (FBI) cuentan con un plan de trabajo que indica la jerarqua de los tejidos, con el fin de obtener el mejor resultado con el menor nmero de complicaciones y en el menor tiempo. En general, se busca sangre, luego tejidos carnosos y por ultimo huesos. En ocasiones, los restos seos se han presentado como la nica muestra presente a la que se le puede practicar un anlisis de ADN. Por ejemplo, en la investigacin de la paternidad en el que el padre ha fallecido y hay que realizar la investigacin a partir de restos seos exhumados, o bien, cuando se debe hacer la identificacin de restos encontrados a la intemperie en zonas de escaso o difcil acceso. Debido a las condiciones en las que se encuentran y a los elementos con los que han interactuado (como lo son animales, la erosin o el simple proceso de descomposicin del cuerpo) es muy probable que no exista otro tipo de muestra analizable a nivel molecular, ms que huesos. El hueso, a diferencia del resto de los tejidos conjuntivos, posee componentes extracelulares calcificados que lo hacen un material duro, capaz de resistir en el tiempo ms que el resto de los tejidos (excluyendo a los cabellos). A pesar de parecer solamente un material de soporte, el hueso es un material vivo y dinmico (Fawcett, 1990). Sin embargo, la degradacin de los huesos es evidente e irreversible en muchas de las muestras, lo que dificulta la extraccin de ADN en cuanto a su cantidad y calidad. Ahora bien, si se toma en cuenta que todas las clulas nucleadas presentes en la muestra contienen el mismo ADN, cuyas dimensiones microscpicas podran haber sobrevivido a la degradacin; y que las secuencias necesarias para el anlisis de identificacin son muy cortas, la probabilidad de encontrar ADN amplificable es mayor. El nico obstculo presente es la cantidad de contaminantes que inhiben la amplificacin de las secuencias tiles; es por eso que el mtodo de extraccin es la nica variable que se puede tratar de controlar con el fin de preservar el material gentico de la muestra, para el anlisis. La metodologa de trabajo no ha logrado eliminar por completo los contaminantes, que difieren segn la muestra, el contexto y la eficiencia de la extraccin.

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Existen varias casas comerciales que han desarrollado paquetes de extraccin que de alguna manera han demostrado ser provechosos como el de glass milk (Cattaneo et al, 1997), pero son costosos y no resuelven la problemtica por completo. La necesidad del Laboratorio de ADN de la seccin de Bioqumica del Complejo de Ciencias Forenses de optimizar los protocolos, con el fin de obtener un mejor provecho sobre las muestras de material humano degradado, ha promovido esta investigacin. El presente estudio, realizado en el Complejo de Ciencias Forenses del Organismo de Investigacin Judicial, persigue determinar el mtodo que proporcione las mejores condiciones al material gentico durante la extraccin, mediante la evaluacin de 3 mtodos de extraccin fenlica de cidos nuclicos, a partir de restos seos, donde se tom en cuenta la cuantificacin y amplificacin por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) de las muestras.

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MARCO TERICO Fundamentos bsicos.El cuerpo humano est compuesto por unos 100 trillones de clulas, las cuales poseen en su ncleo el ADN con la misma informacin gentica. Esto se debe a que todas se originan de una sola clula, el cigoto (Butler, 2001). El Cigoto es una clula pluripotencial formada por la unin de un vulo y un espermatozoide, de modo que la mitad del ADN nuclear proviene del padre y la otra mitad, de la madre. El ADN contiene la informacin necesaria para la sntesis de protenas, este ADN es el llamado expresivo o codificante el cual representa tan solo un 3% del ADN total (Birney et al, 2001). El ADN codificante es el ms interesante desde el punto de vista mdico y posee en general poca variabilidad entre las personas, con excepcin de la regin HLA la cual presenta una gran cantidad de polimorfismos de un solo nucletido (SNPs). El ADN es el soporte de toda la informacin gentica, la cual se transmite de generacin en generacin. Esta informacin es la que determina nuestras caractersticas fsicas, as como tambin otros atributos que en conjunto nos hacen nicos. De esta manera, el ADN refleja quines somos (genotipicamente y fenotipicamente), es por eso que se utiliza como huella gentica. La identificacin humana por marcadores genticos se vale de la variacin polimrfica que existe entre individuos, debido a la existencia de varias posibilidades (alelos) para cada locus gentico. Cada Marcador busca estas variantes polimrficas dentro de cada par de cromosomas homlogos. Estos cromosomas son del mismo tamao y contienen la misma distribucin de la informacin; es decir, que una copia de cada gen est ubicada, en la misma posicin de cada cromosoma perteneciente a un par homlogo, sin embargo, los segmentos o pequeas secuencias utilizadas para la identificacin humana, se encuentran en las secciones no codificantes del ADN, las cuales se pueden encontrar entre genes, dentro de genes y en secciones que no codifican para variacin gentica (Butler, 2001). Desde el punto de vista de la investigacin criminal y el establecimiento de relaciones de parentesco en pruebas de paternidad, es mucho ms til el

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ADN no codificante. Este no es transcrito a ARN y no contiene informacin para la produccin de protenas, sin embargo es altamente variable entre individuos y por eso se dice que es muy polimrfico. El ADN no codificante representa la mayor parte del genoma humano (97%). Aproximadamente la mitad del ADN no codificante (46%), est compuesto por secuencias repetidas las cuales an no se sabe cual es su funcin. Sin embargo el ADN ms utilizado en la gentica forense es el repetido en tandem; y dentro de l, el ADN minisatlite y microsatlite. El resto del ADN esta compuesto por secuencias promotoras, secuencias reguladoras de transcripcin y otras (Birney et al, 2001). Si partimos de que genotipo es la caracterizacin de los alelos presentes en un locus gentico, que se expresa en trminos de homocigota o heterocigota, lo cual es muy til al tratar de dilucidar cual alelo proviene del cromosoma paterno y cual del materno; el proceso de la amplificacin e identificacin de estos marcadores genticos persiguen obtener un perfil gentico, que consiste en la combinacin de varios genotipos obtenidos de mltiples loci2, con lo que se podra diferenciar a un individuo del resto y relacionarlo con sus parientes.

Restos seos como fuente de ADNEn la identificacin por ADN de restos seos se prefiere el fmur y el hmero, debido a que son huesos largos que brindan suficiente material para anlisis, especialmente en la identificacin de restos de nios. Este tipo de hueso se presenta como un cilindro de pared gruesa hecho de hueso compacto y una cavidad central voluminosa, ocupada por mdula sea. Su funcin es la de envolver a los elementos formadores de la sangre de la misma. Tambin posee caractersticas como alta resistencia a la traccin y a la compresin, que hacen que el hueso sea ms resistente a la degradacin (Fawcett, 1990). El hueso compacto carece de porosidades visibles a simple vista. De esta manera, las estructuras ms externas sirven de proteccin a las clulas ms internas (como las oesteoprogenitoras, osteoblastos, osteocitos y osteoclastos), las cuales son de inters en el anlisis molecular porque contienen ADN. Adems el hueso compacto posee unas estructuras cilndricas llamadas Sistemas Haversianos u osteonas las cuales tienen una funcin vascular (donde es posible encontrar clulas nucleadas), a diferencia del hueso esponjoso (Fawcett, 1990), el cual no se utiliza en el anlisis de2

Plural de locus.

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ADN ya que, su porosidad permite una mayor degradacin y sirve como mejor hospedero a la microbiota de la zona. El sistema Haversiano es muy importante en la extraccin de ADN debido a que la sangre que se encuentre en estos canales aumenta la posibilidad de obtener ADN de la muestra pues no se utiliza la mdula. La mdula sea ocupa las cavidades cilndricas de los huesos largos y los intersticios de la esponjosa de los cuerpos vertebrales, las costillas, el esternn y los huesos planos del crneo y de la pelvis Es un tejido blando, densamente celular, formado por los precursores de la sangre y por macrfagos, clulas adiposas, clulas y fibras reticulares. Las proporciones relativas de estos diferentes tipos celulares sufren cambios con la edad, y varan tambin en diferentes regiones del esqueleto (Fawcett, 1990). Al nacer los huesos son muy activos y su mdula es de color rojo, pero lentamente con la edad, cambian a un color amarillo por un incremento de clulas adiposas. En los adultos, la mdula roja persiste slo en los extremos proximales del hmero y del fmur (Fawcett, 1990) y en otros huesos ms pequeos. Todas estas caractersticas, refuerzan la eleccin del fmur y el hmero para la extraccin de ADN. En estos huesos, gracias a su forma compacta, la mdula puede ser removida para disminuir los contaminantes adiposos, entre otros. An cuando el hueso es una estructura muy fuerte, su descomposicin normalmente ocurre como una prdida de la estructura integral, donde las clulas expuestas sufren una degradacin importante a nivel molecular. Se ha observado una destruccin del Sistema Haversiano del hueso compacto (Colson et al, 1996), donde los osteoblastos (sus clulas vecinas), podran sufrir una degradacin significativa. La destruccin se observa como la creacin de tneles que se asumen son de origen microbiano o fngico. Existen estudios que indican que la preservacin de los huesos no se ve afectada tanto por el tiempo ni el perodo de exposicin, sino por las condiciones inapropiadas caractersticas del medio en que se encuentran. Por ejemplo, Colson et al (1996) basa su investigacin en la teora que menciona que los cambios degradativos en los huesos enterrados no se producen de forma gradual, sino que estos cambios ocurren por accin de los microorganismos en las etapas ms recientes del entierro. Esta idea sugiere que los huesos enterrados son posiblemente los ms degradados. Segn Cattaneo et al (1997), el trabajar con dientes genera menos problemas ya que la cmara pulpar es ms limpia, pero no siempre se cuenta con este tipo de muestra y pueden presentarse distorsiones si las piezas

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dentales se encuentran enterradas en diferentes condiciones de suelo y de pH. Un inhibidor de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es el ADN de origen microbiano, debido a que la cantidad de ste presente en la muestra, puede inhibir la hibridacin de los primers 3 o imprimadores; ya sea por competencia o por baja probabilidad de interaccin ADN humano-primer. Para reducir este problema, Colson et al (1996) y Lassen et al (1996) recomiendan irradiar con luz ultravioleta por 5 minutos para inactivar la contaminacin en la superficie de la muestra. Sin embargo, esta radiacin no elimina el ADN contaminante (microbiano u otro), sino que altera la estructura de los cidos nucleicos mediante la formacin de enlaces covalentes entre dos pirimidinas adyacentes que resultan en dmeros de pirimidinas (timinas o citocinas) (Alberts et al, 1994), lo que podra imposibilitar la hibridacin con un primer o la accin de la polimerasa. Esto no es muy seguro, ya que la radiacin incluye a los cidos nucleicos de la muestra de inters, en alguna medida disminuye la posibilidad de extraer ADN amplificable. En el laboratorio de Bioqumica del OIJ lo que se hace es una limpieza exhaustiva, la cual consiste en remover una capa delgada de la superficie del hueso; de esta manera se elimina gran parte del ADN contaminante sin alterar el ADN de la muestra.

Obtencin de cidos nucleicosEn el proceso de recuperacin de ADN, cada paso es vital. Las muestras deben ser manejadas apropiadamente desde las etapas iniciales de la investigacin. La recoleccin de las muestras es muy importante ya que se puede contaminar con ADN extrao. De igual manera, las muestras se preservan mejor si se almacenan secas, en condiciones de fro (-70C preferiblemente) para reducir la tasa de crecimiento bacteriano y la degradacin. Los extractos ya realizados, se deben mantener a -20C o preferiblemente a -80C para prevenir la accin de nucleasas4. El tipo de extraccin de ADN tambin afecta la calidad y la cantidad de ADN. Existen varios mtodos de extraccin de cidos nucleicos, como por ejemplo:

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Son pequeas secuencias especficas de oligonucletidos que son utilizados en la PCR. Enzimas cuya funcin es la de degradar el ADN para reciclar los componentes de los nucletidos.

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La extraccin con Chelex que es simple, rpida y menos costosa que otros mtodos, extrae ADN de cadena simple, pero es muy poco eficiente en huesos. El Chelex es un inhibidor de la PCR. Las tcnicas con slica son muy prometedoras pero las columnas son costosas. Las tcnicas fenlicas son las ms utilizadas en la recuperacin de ADN a partir de restos seos, sin embargo los reactivos que se utilizan son peligrosos y hay que manejarlos con cuidado.

La extraccin fenlica, es una extraccin orgnica. Requiere bsicamente de la adicin de qumicos como SDS (sodium dodecyl sulfate) y proteinasa K para lisar las clulas y remover las protenas que protegen al ADN, como las histonas, cuya funcin es empacar al ADN para que adquiera la forma de cromosoma; una mezcla de fenol-cloroformo se utiliza para separar las protenas del ADN. Las protenas quedan en la fase orgnica de la solucin fenol-cloroformo, mientras que el ADN se encuentra en la fase acuosa.

Cuantificacin de cidos nucleicos.Una vez extrado el ADN, una forma de estimar la cantidad presente en el extracto, es mediante la cuantificacin. Segn el mtodo que se utilice, se puede apreciar la cantidad de cidos nucleicos totales, protenas presentes, pureza del extracto, ADN humano solamente, etc. El determinar cuanto ADN hay y su pureza en un extracto, es muy importante en muchos de los ensayos basados en PCR. Por ejemplo, existen ensayos que resultan mejor si la concentracin de ADN es baja. En casos donde hay mucho ADN, podra inhibirse la PCR o los resultados podran presentar picos que se salen de la escala los cuales imposibilitan el anlisis. Este tipo de contratiempos se pueden evitar al hacer diluciones de extracto luego de la cuantificacin. Por el contrario, donde hay muy poco ADN se pueden presentar falsos negativos por una falla en la amplificacin (Butler, 2001); se puede tratar de corregir si se sabe que hay poco ADN al agregar mayor cantidad de muestra a la reaccin de PCR.

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Cuantificacin EspectrofotomtricaUna caracterstica del ADN es la de presentar un pico de absorcin en presencia de radiacin a 260nm. Este pico de absorcin se debe la presencia de las bases pricas y pirimdicas. El ADN bicatenario presenta una absorcin menor que el monocatenario, debido a que el emparejamiento de las bases (por enlaces de puentes de hidrgeno) reduce la absorcin de la luz ultravioleta (figura 1) (Madigan et al 1998). Esta particularidad es aprovechable en la cuantificacin de ADN; sin embargo, as como encontramos ADN en la muestra, tambin se encuentran contaminantes tales como protenas o fenol residual que pueden incurrir en un falso positivo. Es decir, la absorbancia a 260nm no es especfica para ADN.

Figura 1 Absorbancia del ADN monocatenario y

La cuantificacin espectrofotomtrica tambin permite estimar la cantidad de ARN presente en un extracto. La absorbancia del ARN se puede analizar en trminos de proporciones, lo que genera informacin til de pureza. Por ejemplo, si la proporcin entre la absorbancia de ARN a 260nm y 280nm es menor a 1.75, el extracto contiene contaminantes de tipo protenico, y si la proporcin entre la absorbancia a 260nm y 230nm es menor a 2.0, existe contaminacin por carbohidratos en el extracto (Miesfeld, 1999).

Cuantificacin por Hibridacin con una sondaExisten otros tipos de cuantificacin, por ejemplo, los que implican la afinidad de una sonda. Este tipo de tcnica se puede obtener en diferentes presentaciones segn la casa comercial y el objetivo que se persigue. Por ejemplo la cuantificacin por Slot blot ms conocida en el mercado es el Quantiblot (figura 2). La cuantificacin por Slot Blot es tal vez el mtodo ms utilizado en el mbito forense (Butler, 2001). Su objetivo especfico es el medir la cantidad de ADN humano, por comparacin con un patrn. La tcnica consiste en la5

La proporcin debe estar entre 1.7 y 2.1

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hibridacin de una sonda especfica de 40 pb (pares de bases) complementaria a la secuencia D17Z1, localizada en el cromosoma 17. Este ensayo requiere de varias horas, pero es muy certero ya que puede detectar ADN humano de cadena simple y doble. Adems permite la cuantificacin de varias muestras al mismo tiempo.

Figura 2

Membrana de cuantificacin (Quantiblot)

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Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)La reaccin en cadena de la polimerasa es una estrategia de amplificacin de ADN que fue desarrollada en los aos 80. El PCR fue acreditado a Kary Mullis, un cientfico que investigaba para CETUS, una compaa de Biotecnologa ubicada en California. Mullis recibi un premio Novel en Qumica en 1993 al demostrar, junto con otros cinco cientficos, que se poda amplificar secuencias especficas de ADN con el uso de oligonucletidos como primers (Miesfeld, 1999). La PCR se basa en la bioqumica de los cidos nucleicos. La reaccin de amplificacin requiere de la adicin de: primers especficos a la secuencia de inters, ADN polimerasa termoestable (normalmente se usa Taq polimerasa), deoxynucleosidos trifosfatados (dNTPs) y el ADN de la muestra que se desea analizar. Esta mezcla de compuestos se somete a una serie de cambios de temperatura, los cuales se repiten cclicamente con el fin de duplicar la cantidad de segmentos amplificados (amplicones) existentes en el ciclo anterior. Se hacen normalmente de 20 a 35 ciclos. Cada ciclo consta de un breve calentamiento inicial a 95 C para desnaturalizar el ADN bicatenario y obtener cadenas simples. Luego se enfra entre 50 y 65 C para que los primers logren hibridarse a las secuencias complementarias del ADN. A esta temperatura se le llama temperatura de anillamiento. Los complejos primer-ADN se incuban a 72 C (temperatura de extensin) para que la ADN polimerasa pueda sintetizar el nuevo segmento de ADN usando los dNTPs (Alberts et al, 1994). Una vez completados los ciclos, se deja la muestra a 4 C para inhibir cualquier reaccin. El proceso de PCR se realiza en un termociclador (figura 3), este es el aparato utilizado para hacer los cambios de temperatura con la mayor precisin posible en el tiempo ptimo. El termociclador se ha convertido en una herramienta bsica de trabajo, de cualquier laboratorio de Biologa Molecular.

Figura 3 Termociclador 9700

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Secuencias cortas repetidas en tandem (STRs)Antecedentes El descubrimiento de las regiones hipervariables del ADN en el genoma humano, por Wyman y White en 1980, hizo posible el reconocimiento del potencial del ADN en la produccin de perfiles genticos tiles para identificar individuos o indicios biolgicos de cualquier ndole. En 1985 surgieron los denominados minisatlites, con el descubrimiento hecho por Alec Jeffreys y sus colaboradores (1985), de una secuencia de 33pb inmersa en el gen de la mioglobina humana, esta secuencia se encontr repetida 4 veces consecutivas (en tandem). Kusuke Nakamura y colaboradores (1987), denominan a estos minisatlites VNTRs (variable number of tandem repeats). En 1988 Craig y sus colaboradores llamaron STRs (short tandem repeats) a los casos donde la secuencia repetida era un di, tri o tetranucletido. El anlisis de RFLPs (polimorfismos en los tamaos de los fragmentos de restriccin) fue el primer mtodo utilizado para identificacin por ADN. Este anlisis comprende el uso de enzimas de restriccin6, para digerir el ADN en secciones especficas cercanas a un marcador gentico VNTR. Los resultados de la digestin se podan observar por la hibridacin de una sonda, luego de haber hecho una transferencia de Southern7. Inicialmente se utilizaron sondas multilocus en anlisis de paternidad y otros por caractersticas como el suministrar gran cantidad de informacin, estabilidad somtica y herencia mendeliana. Sin embargo, presentaba desventajas tales como que la informacin que generaba consideraba solamente el fenotipo del espcimen ms que el genotipo, de esta manera, los clculos de probabilidad no se basaban en las frecuencias allicas poblacionales ya que, los loci no eran definidos. Luego, las sondas unilocus mostraron la presencia de informacin genotpica, de modo que, los clculos se basaban en las frecuencias allicas de las poblaciones. Tambin detectaban un nico segmento de ADN, el cual brindaba patrones de una o dos bandas (segn si el espcimen era homocigota o heterocigota para ese locus). De esta manera, los resultados eran ms claros y hasta se lograba ver si haba contaminacin con otro ADN (mezclas). Todo esto era ventajoso sobre las sondas multilocus, sintijeras moleculares nucleasa capaz de cortar el ADN en un sitio especfico. Tcnica donde los fragmentos de ADN son separados por electroforesis y luego son inmovilizados en una membrana para detectar la presencia de molculas especficas por medio de un sonda.7 6

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embargo, ambos tipos de sondas requeran de ADN bien conservado y al menos 50 ng del mismo por sonda. En general, los RFLPs presentaban limitaciones en cuanto a la calidad y cantidad de ADN requerido. Adems el tiempo de deteccin era muy largo (semanas) y las sondas deban ser radioactivas o inmunolgicas. El uso de la PCR revolucion los anlisis de identificacin; se utiliz otro tipo de elementos repetitivos (mini y microsatlites). La sensibilidad y rapidez de la PCR estaba menos limitada por la calidad y cantidad de ADN recuperado, lo que era ventajoso. Inicialmente se amplificaron los VNTRs (secuencias de unos 400 a 2300 pb), pero en las aplicaciones forenses no era tan til, ya que las muestras de tipo forense, frecuentemente se encuentran degradadas. Los microsatlites o STRs eran ms tiles, porque las secuencias medan entre 100 y 350 pb lo que aumentaba la probabilidad de encontrarlos conservados. Los marcadores STR han adquirido mucha popularidad en la labor de identificacin gentica forense, bsicamente porque se fundamentan en la tcnica de PCR y adems, porque permiten trabajar con muestras degradadas o con poco ADN. Los STR son pequeas secuencias repetidas (de 3 a 7 pares de bases) de longitud. Estas secuencias estn distribuidas en todo el genoma humano y son una fuente rica en marcadores polimrficos, sin embargo los ms utilizados en gentica forense son las repeticiones de 4 pb o tetranucletidos (Mireya, 1999). Las secuencias amplificables STR, representan a los alelos de cada par de cromosomas. Los alelos son diferenciados unos de otros por el nmero de copias de la secuencia repetida, inmersas en la regin amplificada. Esta diferenciacin se hace por medio de una separacin electrofortica. Algunas de las ventajas de uso de STR son: La metodologa es rpida. La tcnica se basa en PCR. Es un mtodo no radioactivo. Esta evala cantidades muy pequeas de ADN.

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Es ms tolerante al ADN degradado que otros sistemas, porque los productos amplificados son menores a 400 pb de longitud. (menor a los VNTRs). Es un formato que permite el uso de una variedad de tcnicas rpidas de purificacin de ADN. Contiene alelos de longitudes discretas y separables, lo que permite la construccin de escaleras allicas. Permite la automatizacin, al utilizar mtodos de deteccin sensibles a la fluorescencia.

Los marcadores includos en los paquetes de STR, poseen la ventaja de ser seleccionados cuidadosamente para minimizar rtefactos llamados alelos microvariantes. Tambin fenmenos como plus A que se debe a la adicin de una adenina al final de la extensin de la secuencia de inters. Este fenmeno no es problemtico si se estandarizan todas las secuencias de amplificacin, al agregar una etapa final al termociclador de 30 minutos a 60C. Sin embargo, se ha reportado la ocurrencia de otro tipo de fenmenos como: n-4 bands (visto en el gel como ecos), stutter 8 (Rojas, 1995) y shadow bands, que son anomalas que ocurren debido a la prdida de una repeticin durante la amplificacin. Tambin se ha reportado cierto ruido, el cual depende bsicamente del locus y la secuencia de ADN a amplificar9.

AmelogeninaLa amelogenina es un gen que codifica para ciertas protenas encontradas en el esmalte de los dientes. Su amplificacin por PCR produce secuencias de 106 pb que provienen del cromosoma X y secuencias de 112 pb del cromosoma Y (Butler, 2001). El ensayo de amelogenina se utiliza para determinar si la muestra es originada de un hombre o una mujer. La amelogenina no pertenece a los STRs, sin embargo esta basada en la tcnica de PCR. La utilizacin de este primer tiene la ventaja de ser muy sensible y de servir de control positivo, pues el cromosoma X se encuentra en ambos sexos.

Tartamudeo de la polimerasa, producido por la formacin de un bucle entre el ADN de inters y el primer por malos apareamientos a la hora de la sntesis del ADN por disociacin; resulta como la perdida de repeticiones completas. 9 Informacin obtenida del Manual Tcnico de PROMEGA, GenePrint STR.

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ElectroforesisLa electroforesis de cidos nucleicos consiste en la separacin de molculas que difieren en longitud. Esta separacin se logra al hacer migrar a los cidos nucleicos, los cuales estn negativamente cargados, en un campo elctrico uniformemente cargado a travs de una matriz slida. La migracin ocurre del ctodo al nodo del sistema elctrico en la cmara de electroforesis (figura 4). La electroforesis es el proceso utilizado para analizar los fragmentos amplificados en PCR, tambin se puede analizar otros tipos de molculas como por ejemplo, protenas. Cuando se trabaja con fragmentos menores a 500 nucletidos de longitud, se utiliza una matriz especialmente diseada de poliacrilamida desnaturalizante, la cual permite separar las molculas de cidos nucleicos que difieren hasta en un nucletido (Alberts et al, 1994) lo que tambin permite la secuenciacin de los fragmentos. Existe otro tipo de electroforesis, la electroforesis capilar, la cual es mucho ms sensible y rpida. Esta permite no slo la separacin de las molculas, sino tambin la secuenciacin de los segmentos amplificados de ADN, sin embargo, es equipo muy costoso.

Figura 4 Equipo bsico de electroforesis

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MATERIALES Y METODOSSeleccin de muestrasSe seleccionaron seis huesos de diferentes individuos del banco de muestras congeladas a -20 C, del Laboratorio de Bioqumica del Complejo Ciencias Forenses del O.I.J.10. Cinco fmur (cuatro masculinos y uno femenino) y un crneo femenino. Se investig en el archivo de patologa del O.I.J. la procedencia de cada una de las muestras para llevar un registro del contexto en el que se encontraban las mismas antes de ingresar al Laboratorio de Bioqumica. Las muestras fueron clasificadas como: contexto exhumado (para huesos enterrados), acutico (para huesos encontrados en ros y represas) y otros (para los huesos expuestos sobre una superficie o diferentes a los contextos anteriores) (tabla resumen, anexo). Las muestras se manejaron con un cdigo de tres dgitos, por ejemplo AF1. El primer digito se refiere a la muestra: AF1 (A, B, C, D, E o F). El segundo digito hace referencia al tipo de extraccin: AF1 (F = FBI; O = OIJ; S = Santiago de Compostela). El tercer dgito, se refiere al nmero de repeticin por muestra: AF1 (1, 2 o 3).

Extraccin de ADNPulverizacin de muestras Por ser muestras ya analizadas, no se necesit limpiarlos de residuos carnosos o impurezas en su exterior (figura 5). Cada hueso se trabaj por separado, en una pequea cmara de plstico transparente, siempre tratando de mantener la asepsia.Figura 5 Limpieza exterior de un fmur

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La seleccin de los huesos se baso en su disponibilidad. Las muestras haban sido procesadas anteriormente.

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Muestras tipo fmur: Se removi la mdula con un taladro especial (Dremel) (figura 6). Con una sierra vibratoria de morgue, se cortaron aproximadamente 20 discos de hueso (con forma de dona), del centro de cada fmur, que luego se colocaron en una placa de petri estril.

Figura 6 Remocin de la mdula del fmur

Los discos obtenidos presentaban un dimetro de unos 2.5 cm por 0.3 cm de grosor, pero la variacin de estas medidas depende bsicamente de la edad y el fenotipo de la muestra; la cantidad de discos estuvo sujeta a obtener al menos 20 gramos de muestra, ya que los anlisis se requeran por triplicado para obtener resultados significativos y reproducibilidad. Tambin se requera de una cantidad suficiente de extracto para hacer todas las cuantificaciones pertinentes (figura 7).

Figura 7 Discos cortados de la parte central del fmur

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El crneo fue cortado con la misma sierra, debidamente limpia. Se obtuvo varios fragmentos de unos 3 cm de largo y 1 cm de ancho. Todas las muestras, trabajadas individualmente, se cortaron con una cizalla plana 11 , para obtener fragmentos lo suficientemente pequeos para pulverizarlos en el Freezer/Mill12 (figura 8). Una vez obtenidos los trozos de hueso, se introdujeron en viales (tipo Falcon) de 50 ml debidamente rotulados con el nmero de muestra y se almacenaron a -20 C, sin pulverizar.

Figura 8 Freezer/Mill

Los viales utilizados para pulverizar las muestras en el Freezer/Mill fueron previamente irradiados con luz ultravioleta o autoclavados. Se ajust el Freezer/Mill a 15 minutos de pre-enfriamiento con Nitrgeno lquido y tres ciclos de pulverizado a 14 golpes por segundo durante 2 minutos. Cada ciclo de pulverizado estuvo intercalado por dos minutos de enfriamiento de la muestra. Cada muestra se pulveriz por separado.

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Tijera normalmente utilizada para cortar metal. El Freezer/Mill es un aparato utilizado para pulverizar muestras congeladas previamente con nitrgeno lquido.

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Extraccin Se utilizaron 9 viales (tipo Falcon) de 50 ml, por muestra, se repartieron dos gramos de polvo de hueso en cada vial debidamente rotulado. Se realiz la extraccin de ADN de cada una de las repeticiones por muestra de la siguiente forma: tres viales por muestra se destinaron al mtodo de extraccin utilizada de rutina por el Laboratorio de ADN del OIJ, otros tres al mtodo usado por el Laboratorio de la Universidad de Santiago de Compostela y los tres restantes al mtodo utilizado en el FBI. Se debe tener claro que los mtodos de extraccin fueron ligeramente modificados para adaptarlos a las condiciones y materiales de trabajo disponibles en el Laboratorio de Bioqumica del OIJ. Esta modificacin pudo haber influido de alguna manera en el desempeo de los mtodos (anexo).

Mtodo

U. SdC

O.I.J Pulverizado de las muestras en el freezer/mill

F.B.I.

DTT 1M 4ml High TE Buffer de EDTA 0,5M pH8 160l Buffer Lisis extraccin por SDS 10% 280l Proteinasa K reaccin Proteinasa K [10mg/ml] 200l [10mg/ml] Incubacin con agitacin 56 C por 2 h. 50l ms de P. K. 56 C de 16 a 24h

7.5 ml SEB 7.5 ml Proteinasa K 750l [10mg/ml]

6ml 2400l

55 C de 24 a 72h

56 C de 2 a 24h.

Centrifugar y recuperar el sobrenadante (*) Desproteinizacin Recuperacin de ADN PCIA 25:24:1* Fenol* PCIA 25:24:1* CIA 24:1* PCIA 25:24:1*

Precipitacin de los ANT en presencia de Acetato de Sodio y Etanol.

Cuadro 1 Resumen comparativo de los mtodos de extraccin fenlica utilizados en esta investigacin.

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Cuantificacin de cidos NucleicosUna vez obtenidos los extractos de ADN, se cuantificaron por tres mtodos diferentes para estimar la cantidad de ADN presente. Se utiliz el fluormetro Hoefer DyNA Quant 200, el Quantiblot (mtodo de cuantificacin por hibridacin de una sonda especfica) de PERKIN ELMER y el kit DNA DipStick (Invitrogen). Los resultados obtenidos de cada mtodo se tabularon en una base de datos para su posterior anlisis.

Amplificacin (montaje de PCR)Se montaron los ensayos de STR y Amelogenina en la cmara de montaje de PCR. Se utilizaron cuatro diluciones 1:1, 1:2, 1:10 y 1:100, por extracto para los ensayos de STR. Los paquetes de amplificacin de STR utilizados fueron: Silver STR III triplex (incluye los marcadores D16S539, D7S820 y D13S317) y STR Multiplex (incluye los marcadores D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818) de Promega. La Amelogenina se mont con la mejor dilucin por repeticin, la cual se determin luego del anlisis de STR. (anexo).

Electroforesis en Poliacrilamida con Tincin de PlataLos productos de amplificacin se separaron en geles de poliacrilamida al 4%. Las corridas de electroforesis se hicieron aproximadamente a 100 watts, 1850 voltios y 54 mili amperios, por 1 hora y 30 minutos. Para observar los resultados se tieron los geles con una solucin de plata.

Bsqueda de Inhibidores de PCREn aquellas reacciones donde no se obtuvo resultados de amplificacin, se realiz un ensayo cruzado muestra-ADN control, para buscar inhibidores de PCR. Se utiliz el paquete STR III para la amplificacin de PCR, el cual provee el ADN control K562 .Se agrego 2,5 l del ADN control y 3 l de la muestra.

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Adems se cuantificaron las muestras en el GeneQuant, para aproximar la pureza de los extractos y cuantificar la cantidad de protenas presentes.

Anlisis de las muestrasTodos los ensayos de amplificacin y de cuantificacin generaron resultados, los cuales fueron tabulados para ser analizados estadsticamente. Se hizo un anlisis de varianza (ANOVA) a los datos que presentaron una distribucin normal. Los datos que no presentaron esta distribucin, fueron analizados por el Anlisis de la Varianza de una va de Kruskal Wallis.

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RESULTADOSLos resultados obtenidos de la cuantificacin de cada una de las repeticiones por muestra se aprecian en la tabla 1.

Tabla 1. Resultados obtenidos de la cuantificacin de cidos nucleicos por medio de tres mtodos diferentes, de extractos de hueso. Laboratorio de Bioqumica del Complejo de Ciencias Forenses del OIJ, 2001Muestra Mtodo

FBIF1 F226 50.0 0.312 8 0,1 1.25 0 5.0 5 10 1.25 1 5 5 1

OIJF320 50.0 0.312 5 1 0.312 3 5.0 4 10 1.25 1 5 0.625 28 10

SdCO335 0.5 5 5 50 1.25 7 500 0.625 15 500 13 0.625 107 -

O130 10 1.25 8 50 1.25 5 500 1.25 3 10 1.25 7 5 1.25 258 50

O225 5 0.625 10 50.0 1.25 6 0.625 16 50 24 50 0.625 204 50

S110 5 1.25 3 50 1.25 20 5 0 10 0.625 2 0.5 15 1

S211 50 1.25 30 5 0.312 6 10 1 1 10 0.5 20 1

S310 50.0 1.25 2 10 0.625 9 5 25 5 8 0.5 7 1 5

Q2 A S C Q2 B S C Q2 C S C Q2 D S C Q2 E S C Q2 F S C

18 50.0 0.312 8 1 0.312 0 0.5 1.25 9 1 1.25 4 5 42 10

10 2.5 5 10 10 10 5 5 Q2 = Mtodo de cuantificacin de DyNA Quant 200, expresado en [ng/l]. S = Kit de cuantificacin DNA Strips, expresado en [g/l]. C = Mtodo de cuantificacin de ADN humano (Quantiblot), expresado en [ng/l]. - = El mtodo de cuantificacin no arroj valores. SdC = Santiago de Compostela.

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El mtodo de Santiago de Compostela produjo una contaminacin en los extractos, visible en el microscopio (figura 9).

Figura 9 Cristales observados en un microscopio de Luz transmitida a 40X, de las muestras extradas por el mtodo de Santiago de Compostela

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La amplificacin de los STR, Amelogenina e inhibidores de amplificacin generaron los siguientes resultados luego de haber corrido una electroforesis a los productos amplificados (tabla 2). Las figuras 10 , 11 y 12 son ejemplo de amplificacin de STR, Amelogenina e inhibidores de PCR respectivamente.Tabla 2. Resultados de la amplificacin de muestras en el termociclador GeneAmp 9700 del Laboratorio de Bioqumica del Complejo de Ciencias Forenses del OIJ.Muestras STR Amelogenina Inhibidores de PCR Muestras STR Amelogenina Inhibidores de PCR

AF1 1 1 0 DF1 0 0 0 AF2 1 1 0 DF2 0 1 0 AF3 1 1 0 DF3 0 1 0 AO1 0 0 0 DO1 0 0 0 AO2 0 0 1 DO2 0 0 0 AO3 0 0 0 DO3 0 0 0 AS1 0 0 1 DS1 0 0 1 AS2 0 0 1 DS2 0 0 1 AS3 0 0 1 DS3 0 0 1 BF1 0 0 0 EF1 1 1 0 BF2 0 0 0 EF2 1 1 0 BF3 0 1 0 EF3 1 1 0 BO1 0 0 0 EO1 1 1 0 BO2 1 1 0 EO2 1 1 0 BO3 1 1 0 EO3 1 1 0 BS1 0 1 1 ES1 1 1 0 BS2 0 0 1 ES2 1 1 0 BS3 0 1 0 ES3 1 1 0 CF1 0 0 0 FF1 1 1 0 CF2 0 0 0 FF2 1 1 0 CF3 0 1 0 FF3 1 1 0 CO1 0 0 0 FO1 1 1 0 CO2 0 0 1 FO2 1 1 0 CO3 0 0 0 FO3 1 1 0 CS1 0 0 1 FS1 1 1 0 CS2 0 0 1 FS2 1 1 0 CS3 0 0 1 FS3 1 1 0 STR / Amelogenina: 1 = resultado positivo de amplificacin, 0 = resultado negativo de amplificacin. Inhibidores de PCR: 0 = ausencia de inhibidores de amplificacin, 1 = presencia de inhibidores de amplificacin.

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Figura 10 Ejemplo de un gel de poliacrilamida. Corrida de STR para la muestra AF1. Se muestran las diferentes diluciones realizadas.

Figura 11 Corrida de Amelogenina para las tres repeticiones de la muestra B, extradas por el mtodo del OIJ

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Figura 7 Corrida de inhibidores de PCR para la muestra C y D. La corrida de las repeticiones que se muestran de color rojo muestra la inhibicin de amplificacin del ADN control K562, por la presencia de inhibidores en las muestras.

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Los resultados obtenidos al cuantificar las muestras en el GeneQuant, son los siguientes:Tabla 3. Resultados de la cuantificacin de diferentes variables por medio del GeneQuant. Laboratorio de Biologa Molecular del Instituto Tecnolgico de Costa Rica, 2002.Muestras AO1 AO2 AO3 AS1 AS2 AS3 BF1 BF2 BF3 BO1 BO2 BO3 BS1 BS2 BS3 CF1 CF2 CF3 CO1 CO2 CO3 CS1 CS2 CS3 DF1 DF2 DF3 DO1 DO2 DO3 DS1 DS2 DS3 EF1 EF2 EF3 EO1 EO2 EO3 ES1 ES2 ES3 FF1 FF2 FF3 FO1 FO2 FO3 FS1 FS2 FS3 Pureza (A260/A280) 74% 64% 100% 76% 86% 70% 86% 76% 100% 77% 96% 96% 64% 75% 39% 87% 73% 82% 88% 82% 75% 100% 100% 34% 82% 76% 81% 72% 75% 96% 74% 74% 71% 64% 64% 65% 100% 60% 100% 73% 74% 100% 79% 71% 100% 98% 99% 97% 98% 100% 68% Protenas mg/ml 0.1 0.1 0.0 0.3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.4 0.1 0.0 0.2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 5.1 2.1 2.0 0.2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 3.9 0.0 1.9 1.9 2.6 0 0 0 ARN g/l 0.011 0.010 0.009 0.037 0.008 0.003 0.004 0.000 0.011 0.011 0.046 0.014 0.000 0.000 0.001 0.022 0.043 0.019 0.008 0.023 0.004 0.004 0.004 0.000 0.009 0.004 0.009 0.014 0.012 0.024 0.012 0.010 0.022 0.350 0.150 0.141 0.070 0.002 0.009 0.000 0.000 0.000 0.020 0.349 0.000 0.641 0.700 0.809 0.015 0.007 0.002 230 nm 0.008 0.010 0.022 0.151 0.024 0.014 0.036 0.028 0.080 0.009 0.109 0.044 0.046 0.043 0.034 0.249 0.412 0.006 0.060 0.127 0.011 0.039 0.056 0.051 0.012 -0.001 0.007 0.062 0.073 0.134 0.027 0.003 0.098 0.288 0.196 0.156 0.039 -0.011 0.056 0.057 0.032 0.066 0.057 0.282 0.035 0.478 0.392 0.563 0.098 0.062 0.04 260 nm 0.001 -0.003 0.004 0.036 0.014 0.009 0.030 0.032 0.054 0.000 0.079 0.031 0.074 0.039 0.025 0.094 0.090 0.150 0.010 0.022 0.004 0.033 0.046 0.042 0.001 -0.004 -0.001 0.015 0.026 0.082 0.007 -0.002 0.054 0.437 0.251 0.196 0.094 0.004 0.026 0.056 0.021 0.061 0.067 0.441 0.033 0.870 0.884 0.990 0.083 0.052 0.037 280 nm -0.003 -0.005 -0.001 0.023 0.010 0.009 0.028 0.036 0.047 -0.004 0.055 0.023 0.047 0.041 0.026 0.084 0.077 0.030 0.006 0.013 0.003 0.031 0.043 0.041 -0.003 -0.005 -0.005 0.011 0.022 0.069 0.003 -0.005 0.048 0.038 0.224 0.170 0.043 0.004 0.031 0.058 0.022 0.062 0.060 0.344 0.034 0.521 0.499 0.558 0.074 0.046 0.037 320nm -0.013 -0.015 -0.007 -0.011 0.004 0.005 0.025 0.047 0.040 -0.014 0.021 0.013 0.051 0.044 0.025 0.066 0.036 0.022 0.000 -0.006 0.000 0.028 0.041 0.043 -0.011 -0.009 -0.012 -0.002 0.011 0.052 -0.008 -0.014 0.026 -0.001 0.064 0.021 0.028 0.002 0.040 0.063 0.022 0.067 0.043 0.005 0.034 0.068 0.009 -0.002 0.063 0.044 0.034 Ratio (A260/A280) 1.340 1.165 1.908 1.368 1.559 1.267 1.549 1.378 2.205 1.393 1.735 1.731 1.159 1.358 0.714 1.583 1.322 1.490 1.587 1.490 1.353 2.011 1.900 0.621 1.484 1.375 1.462 1.300 1.357 1.737 1.345 1.334 1.285 1.158 1.167 1.175 1.822 1.094 1.983 1.327 1.348 3.860 1.428 1.286 3.443 1.771 1.786 1.749 1.775 3.579 1.224

No se realiz la cuantificacin de la muestra AF

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DISCUSIONComo se ha demostrado en estudios anteriores, los mtodos de extraccin de ADN no son satisfactorios cuando las muestras estn degradadas. Las muestras forenses normalmente son de este tipo, de manera que se dificultan los anlisis moleculares, especialmente en huesos. El valorar la eficiencia de los mtodos de extraccin de ADN es parte del motivo de esta investigacin, con el fin de lograr el mayor provecho de las muestras. La comparacin entre los tres mtodos de extraccin fenlica requiri del anlisis de variables que permitan ilustrar el desarrollo de los mtodos. La obtencin de ADN amplificable en PCR es el objetivo principal de este estudio, el cual necesit de anlisis estadsticos que permitieran explicar las diferencias entre los resultados, ya que estos mtodos son muy similares (extraccin orgnica). Se debe tener claro que los mtodos de extraccin fueron ligeramente modificados para adaptarlos a las condiciones y materiales de trabajo disponibles en el Laboratorio de Bioqumica del OIJ. Esta modificacin pudo haber influido de alguna manera en el desempeo de los mtodos.

Anlisis de cuantificacin entre los mtodos.Anlisis de los mtodos de extraccin segn las diferentes cuantificaciones de cidos nucleicos. Los resultados de la cuantificacin de cidos nucleicos fueron analizados estadsticamente para buscar diferencias entre los mtodos de extraccin13 DyNA Quant 200 Este mtodo de cuantificacin no present diferencias significativas entre los mtodos de extraccin; (p = 0.063) para un 95% de confianza en el anlisis de varianza de una va de Kruskal-Wallis. Sin embargo, la comparacin de medias indica que el mtodo de extraccin del OIJ tiende a extraer mayor cantidad de ADN que los otros mtodos (grfica 1).

13

Los anlisis estadsticos se trabajaron propiamente de la tabla resumen de resultados. Ver anexo.

38

Grfica 1 Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de DyNA Quant 200 segn el mtodo de extraccin utilizado.

50

Medias de DyNa Quant 200

40

30

20

10

0 FBI OIJ SdC

Extraccin

39

DNA Strips Este mtodo de cuantificacin si present diferencias significativas entre los mtodos de extraccin; (p = 0.003) para un 95% de confianza en el anlisis de varianza de una va de Kruskal-Wallis. De manera que s existe una relacin significativa entre la cantidad de cidos nucleicos cuantificados por este mtodo y el mtodo de extraccin utilizado. La comparacin de las medias de los mtodos de extraccin indica que el mtodo del OIJ es el que extrae mayor cantidad de cidos nucleicos en relacin a los otros (grfica 2).

Grfica 2 Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de DNA Strips segn el mtodo de extraccin utilizado.

.14

.12

Medias de DNA Strips

.10

.08

.06

.04

.02 0.00 FBI OIJ SdC

Extraccin

40

Quantiblot Este mtodo de cuantificacin no revel diferencias significativas entre los mtodos de extraccin (p = 0.599), para un 95% de confianza (ANOVA). Sin embargo, la comparacin de medias sugiere que el mtodo de extraccin del OIJ tiende a extraer mayor cantidad de ADN humano que el resto de los mtodos (grfica 3).Grfica 3 Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de Quantiblot segn el mtodo de extraccin utilizado.3.0

2.8

Medias de Quantiblot

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8 1.6 FBI OIJ SdC

Extraccin

En los tres mtodos de cuantificacin se evidencia, segn la comparacin de medias, que el mtodo del OIJ es el que extrae mayor cantidad de cidos nucleicos. En el anlisis de cuantificacin no se encontr diferencias significativas entre los mtodos de extraccin, segn la cuantificacin de ADN humano (Quantiblot) y la cuantificacin de ADN total (DyNA Quant 200); lo que podra deberse a que los mtodos de extraccin son muy similares, todos se basan

41

en la extraccin fenlica. Por otro lado, sera muy ambicioso el pretender encontrar diferencias significativas entre los mtodos, dado que, el nmero de muestras es muy pequeo y no genera la cantidad de datos necesarios para ver detalladamente el comportamiento de los mtodos si se toma en cuenta solo la variable de cuantificacin. Sin embargo la cuantificacin de cidos nucleicos totales (DNA Strips) s present diferencias significativas entre los mtodos de extraccin, adems mostr un comportamiento diferente a los otros dos mtodos de cuantificacin, lo que podra deberse a la cantidad de ARN presente en los extractos, ya que la cuantificacin por DNA Strips es mucho ms sensible al poseer un mbito de cuantificacin mayor que el mtodo de Quantiblot (que busca solamente ADN humano) y DyNA Quant 200 (que busca cualquier tipo de ADN). Si bien es cierto, el mtodo DyNA Quant 200 es un mtodo fluoromtrico, el cual cuantifica por la absorbancia de luz y debera cuantificar el ARN presente, no obstante este mtodo se basa en la cuantificacin de la absorbancia de la sonda H 33258, la cual presenta un pico de absorcin a 356 nm y en menor cantidad a 492 nm. Cuando esta sonda se une al ADN presente (mono o bicatenario), los picos de absorbancia cambian a 365 y 458 nm, esta diferencia es la que calcula la concentracin del ADN. La sonda H 33258 no se une a las molculas de ARN14. La cantidad de ADN en una clula es conocida y depende del genoma al que corresponda (humano, de arroz, caballo, ratn, etc), sin embargo la cantidad de ARN en una clula no se puede generalizar ya que depende de la actividad metablica de esa clula en particular. GeneQuant Una cuantificacin posterior de ARN y protenas en el GeneQuant, revel informacin valiosa, la cual tambin se analiz estadsticamente para comparar los mtodos de extraccin. ARN y Protenas El anlisis de ARN presente en los extractos, result mostrar diferencias estadsticamente significativas entre los mtodos de extraccin; (p = 0.003 de Kruskal - Wallis) con una confianza del 95%. La cantidad de ARN presente en los extractos difiere en los tres mtodos de extraccin. La comparacin de14

Informacin obtenida del manual del usuario Hoefer DyNA Quant 200 ,Fluorometer User Manual , A M E R S H A M P H A R M A C I A B I O T E C H

42

las medias indica que el mtodo del OIJ extrae mayor cantidad de cidos ribonucleicos (ARN) que los otros mtodos. El anlisis de protenas demuestra con una confianza de 95% que existe una diferencia estadsticamente significativa entre los mtodos de extraccin; (p = 0.011 de Kruskal - Wallis). La cantidad de protenas presentes en los extractos difiere segn el mtodo utilizado, de manera que el mtodo del FBI es el que presenta mayor cantidad de protenas, seguido por el mtodo del OIJ y por ltimo, el de Santiago de Compostela ( grfica 4 y 5).Grfica 4 Comparacin de las medias de ARN presente segn el mtodo de extraccin utilizado..16 .14 .12

Media de ARN [ug/ul]

.10 .08 .06 .04 .02 0.00 FBI

OIJ

SdC

Extraccin

Grfica 5 Comparacin de las medias de protenas presentes segn el mtodo de extraccin utilizado.1.0

Medias de Protenas mg/ml

.8

.6

.4

.2

0.0 FBI

OIJ

SdC

Extraccin

43

Pureza del extracto El anlisis del porcentaje de pureza (A260nm/ A280nm) no demuestra diferencias significativas entre los mtodos de extraccin; (p = 0.164 de ANOVA). La comparacin de las medias entre los mtodos de extraccin sugiere que el mtodo del OIJ alcanza el mayor nivel de pureza de los tres mtodos (en trminos de ARN/protenas) (grfica 6).

Grfica 6 Comparacin de las medias del porcentaje de pureza segn el mtodo de extraccin utilizado.88

Medias de Pureza (A260/A280)

86

84

82

80

78

76 74 FBI OIJ SdC

Extraccin

El anlisis de la proporcin A260nm/A280nm indica que las muestras procesadas por los mtodos de extraccin del OIJ y Santiago de Compostela, podran presentar problemas de contaminacin por protenas ya que sus medias se encuentran por debajo de 1.7; mientras que, el mtodo del FBI tiende a no presentar este tipo de problemas (la media es de 2.303)(Miesfeld, 1999).

44

El anlisis de la proporcin A260nm /A230nm indica que las muestras procesadas por el mtodo del OIJ y el de Santiago de Compostela podran presentar problemas causados por la presencia de carbohidratos, ya que las medias se encuentran por debajo de 2.0. El mtodo del FBI tiende a no presentar problemas por carbohidratos (Miesfeld, 1999). El anlisis de ARN presente en los extractos, el cual presentaba diferencias significativas entre los mtodos de extraccin, revel similitud entre las medias de los mtodos y la cuantificacin de cidos nucleicos totales (DNA Strips) de los mismos. De esta manera, la significancia encontrada (p = 0.003) en el anlisis de cidos nucleicos versus el mtodo de extraccin podra deberse a la suma de ADN y ARN presente en lugar de representar solamente la cantidad de ADN que es lo que nos interesa principalmente, porque es el ADN no codificante donde se encuentran las secuencias (STR) que nos permiten identificar a un individuo. El ARN por otro lado podra funcionar como un obstculo o estorbo en la amplificacin de estas secuencias. Las reacciones moleculares, dependen de la cantidad de choques efectivos entre partculas o molculas. La reaccin de PCR depende de que se forme el complejo ADN-primer para que se inicie la extensin de los amplicones. Los sitios donde de unen los primers son muy pequeos en relacin al ADN nuclear, de manera que el ARN u otro tipo de ADN podran servir de obstculo en la hibridacin de los primes a las secuencias especficas de inters.

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Anlisis de amplificacin entre los mtodosAnlisis de los mtodos de extraccin segn los resultados de amplificacin Los resultados de amplificacin fueron analizados estadsticamente para buscar diferencias entre los mtodos de extraccin. STRs El anlisis estadstico de los resultados de amplificacin de los STR no present diferencias estadsticamente significativas entre los mtodos de extraccin; (p = 0.589) segn el anlisis de Chi-cuadrado. Sin embargo, el mtodo de extraccin del FBI tiende a producir mayor cantidad de resultados positivos en la amplificacin, segn el anlisis comparativo de los porcentajes positivos de amplificacin ( grfica 7).

Grfica 7 Comparacin entre los diferentes mtodos de extraccin segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa de STRs.

100 90 80 70 60

50

44

33

67 56 50

%

50 40 30 20 10 0

STR'sAmplificacin + Amplificacin FBI OIJ SdC

Extraccin46

Amelogenina El anlisis estadstico de los resultados de amplificacin de amelogenina, no present una diferencia estadsticamente significativa entre los mtodos de extraccin ya que, p = 0.155, segn la prueba de Chi-cuadrado. La comparacin entre los porcentajes de amplificacin sugiere que el mtodo de extraccin del FBI es el que produce el mayor nmero de resultados positivos (grfica 8).

Grfica 8 Comparacin entre los diferentes mtodos de extraccin segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa de Amelogenina.100 90 80 70 60

72

44

44

%

50 40 30 20 10 0 FBI28

56

56

AmelogeninaAmplificacin + Amplificacin -

OIJ

SdC

Extraccin

47

Inhibidores de PCR El anlisis estadstico de los resultados de inhibicin en la amplificacin muestran claramente una diferencia significativa entre los mtodos de extraccin, (p = 0.0001) segn la prueba de Chi-cuadrado. Los porcentajes de inhibicin muestran que los del FBI no presentaron problemas de inhibicin (0%), los del OIJ presentaron que un 15,4% de los extractos contenan inhibidores de PCR y un 84,6% los de Santiago de Compostela. El mtodo del FBI es el que logra remover la mayor cantidad de inhibidores de amplificacin de las muestras (grfica 9).

Grfica 9 Comparacin entre los diferentes mtodos de extraccin segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa en la bsqueda de inhibidores.100 90 89 80 70 60 100 11 61

%

50 40 39 30 20 10 0 FBI OIJ SdC

Inhibidores de PCRPresentes Ausentes

Extraccin

48

El anlisis de la amplificacin de STRs y Amelogenina no present diferencias significativas entre los diferentes mtodos de extraccin, esto se puede atribuir a que los mtodos son similares, ms an al haber modificado los protocolos para ajustarlos a la disponibilidad de los materiales. Al mtodo del FBI y al usado en Santiago de Compostela, se les cambi el ltimo paso de purificacin a una precipitacin de cidos nucleicos en presencia de acetato de sodio y etanol, este cambio hizo ms grande la similitud entre los mtodos. La comparacin entre las medias de amplificacin de STR y Amelogenina, nos permite ver una diferencia, que an cuando no es significativa, tiene una relacin inversamente proporcional a la presencia de inhibidores, la cual si present diferencias significativas. Este hecho nos lleva a la idea de que el xito de amplificacin en PCR radica en el poder remover los contaminantes que inhiben la reaccin de la polimerasa. La diferencia de las medias relacionada con los inhibidores, indica una jerarqua entre los mtodos, la cual se puede atribuir a la habilidad de remover inhibidores. El mtodo original del FBI y el de Santiago de Compostela, podran presentar un aumento en el porcentaje de resultados positivos de amplificacin, debido a que el paso final de purificacin original, se basa en una tcnica que permite extraer el ADN del extracto en lugar de precipitar los cidos nucleicos y tratar de extraer los contaminantes del medio usando lavados, como se practic en los tres mtodos. Una tcnica que permita extraer el ADN de un medio de extraccin que contenga contaminantes, es mucho ms prometedora que un mtodo que busque extraer los contaminantes del medio. El extraer el ADN (con una herramienta afn al ADN) del medio de extraccin minimiza los problemas de contaminacin, ya que no hay problema si no se puede extraer todo el ADN presente en el extracto; por el contrario, si lo que se desea es remover los contaminantes del extracto, se pueden presentar problemas si no se logra extraerlos por completo, ocurrira algn grado de inhibicin o amplificacin errnea. El anlisis del contenido de protenas y el anlisis de proporcin de absorbancia (A260nm/A280nm) y (A260nm/A230nm) permiten identificar parte del problema que se presenta en la amplificacin de los extractos, ya que no existe una correlacin entre la cantidad de ADN presente en los extractos, segn el mtodo con que se recuper y los resultados positivos de amplificacin en PCR (STRs y Amelogenina). La presencia de protenas en los extractos es indicador de una deficiencia en el mtodo, ya que el mtodo fenlico es de desproteinizacin. Sin embargo,

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el anlisis de pureza (A260/A280), no present diferencias significativas entre ellos. Esta pureza se mide en trminos de cidos nucleicos versus protenas. Ahora bien, en el mtodo del FBI se observan los mejores resultados de amplificacin, sin poseer la mayor cantidad de ADN respecto a los otros mtodos. Tambin present la mayor cantidad de protenas, de manera que no se puede concluir que las protenas sean los contaminantes causantes de la inhibicin de la reaccin de la polimerasa (PCR). El anlisis de proporcin A260/A280, tambin es una relacin entre cidos nucleicos y protenas. Segn Miesfeld (1999) al presentar una relacin de proporcin superior a 1.7, n existe una contaminacin protenica, lo cual es el caso del mtodo del FBI, reflejado en el buen desempeo de amplificacin logrado. Al no haber diferencias significativas en cuanto al porcentaje de pureza, significa que los mtodos son muy similares en esta variable, lo que nos puede llevar a que la cantidad de protenas presentes en los extractos no logra alcanzar una concentracin que indique que estos sean los contaminantes principales que inhiben la reaccin del PCR. Las protenas en este caso podran ser una parte de la causa de la inhibicin y no los causantes principales. El anlisis de proporcin de absorcin entre A260nm y A230nm, propone una contaminacin por inhibicin de PCR. Los mtodos utilizados por el OIJ y Santiago de Compostela presentan medias de proporcin inferiores a 2.0, donde Miesfeld (1999), indica en su tabla de relacin que los extractos pueden presentar problemas por el contenido de carbohidratos. La proporcin A260nm/A230nm presenta adems una correlacin con los resultados de amplificacin segn los mtodos de extraccin. Estos resultados nos llevan a concluir que los problemas de inhibicin presentes en los ensayos, tienen una relacin con la concentracin de carbohidratos en los extractos. Podra asumirse que los mtodos de extraccin difieren en cuanto a la habilidad de remover carbohidratos.

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Anlisis de la influencia del contexto de las muestras sobre los extractos.Anlisis del contexto de las muestras segn las diferentes cuantificaciones DyNA Quant 200 Este mtodo de cuantificacin present diferencias significativas entre los mtodos de extraccin; (p = 0.002) para un 95% de confianza en el anlisis de varianza de una va de Kruskal-Wallis. De manera que si existe una relacin significativa entre la cantidad de ADN cuantificado y el contexto de la muestra. La comparacin de medias indica que el contexto otro proporciona mayor cantidad de ADN en la extraccin que los otros contextos (grfica 10).

Grfica 10 Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de DyNA Quant 200 segn el contexto de las muestras50

40

Medias de DyNA Quant 200

30

20

10

0 EXHUMADO

ACUATICO

OTRO

Contexto

51

DNA Strips Este mtodo de cuantificacin no present diferencias significativas entre los mtodos de extraccin; (p = 0.123) para un 95% de confianza en el anlisis de varianza de una va de Kruskal-Wallis. Sin embargo, la comparacin de medias sugiere que el contexto Acutico proporciona mayor cantidad de cidos nucleicos que el resto de los contextos (grfica 11).

Grfica 11 Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de DNA Strips segn el contexto de las muestras.08 .07 .06 .05 .04

Medias de DNA Strips

.03 .02 .01 0.00 EXHUMADO

ACUATICO

OTRO

Contexto

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Quantiblot Esta cuantificacin present diferencias significativas entre los mtodos de extraccin; (p = 0.0001) para un 95% de confianza (ANOVA). Si existe una relacin significativa entre la cantidad de ADN cuantificado y el contexto de la muestra. La comparacin de medias sugiere que el contexto otro proporciona mayor cantidad de ADN humano en la extraccin que el resto de los mtodos (grfica 12).

Grfica 12 Comparacin de las medias cuantificadas por el mtodo de Quantiblot segn el contexto de las muestras6

5

4

3

Medias de Quantiblot

2

1

0 EXHUMADO

ACUATICO

OTRO

Contexto

Los anlisis de cuantificacin (Quantiblot y DyNA Quant 200) presentaron diferencias entre los contextos, adems mostraron un comportamiento similar entre las medias de los contextos cuantificados. Sin embargo la cuantificacin de los cidos nucleicos totales (cuantificacin por DNA Strips) no present diferencias significativas entre los contextos y la jerarqua entre

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las medias difiere a los otros dos tipos de cuantificacin. Esta diferencia podra basarse en el tipo de molculas que cuantifica cada mtodo. Por ejemplo, el Quantiblot solo toma en cuenta el ADN de origen Humano y el DyNA Quant 200 an cuando cuantifica cualquier tipo de ADN, no toma en cuenta el ARN. Si la diferencia encontrada no se debe a la cantidad de ARN presente (por falta de diferencias significativas), podra proponerse la posibilidad de presencia de ADN microbiano.

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Anlisis del contexto de las muestras segn los resultados de amplificacin STRs El anlisis estadstico (Chi-cuadrado) de la amplificacin de STRs segn el contexto de la muestra, mostr que existen diferencias estadsticamente significativas; (p = 0.0001). Del 100% de los resultados positivos de amplificacin, el 13% pertenece a los huesos que se encontraron enterrados, el 8.7% pertenece a los huesos que se encontraron en algn ro o represa (ambiente acutico) y el 78.3% pertenece a los huesos encontrados en ambientes diferentes a los mencionados anteriormente (bsicamente expuestos sobre el suelo) (grfica 13).

Grfica 13 Comparacin entre los diferentes contextos, segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa de STRs.

100 90 80 70 60

33

7 93

100

67

%

50 40 30 20 10 0 EXHUMADO ACUATICO OTRO

STR'sAmplificacin + Amplificacin -

Contexto

55

Amelogenina El anlisis de Chi-cuadrado de la amplificacin de amelogenina, segn el contexto de la muestra, seala que hay una diferencia estadsticamente significativa entre los mismos (p = 0.0001). Existe una relacin entre la cantidad de resultados positivos de amplificacin de este marcador gentico y el contexto donde se encontr la muestra. Los huesos que presentaron menor cantidad de resultados positivos son los clasificados como contexto exhumado, los siguientes en la escala de resultados positivos son los de contexto clasificado como acutico y los que presentaron mayor cantidad de resultados positivos son los clasificados como otros ( grfica 14).

Grfica 14 Comparacin entre los diferentes contextos, segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa de Amelogenina.100 90 80 70 6067 70

33

30

100

%

50 40 30 20 10 0 EXHUMADO ACUATICO OTRO

AmelogeninaAmplificacin + Amplificacin -

Contexto

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Inhibidores de PCR El anlisis de Chi-cuadrado para la presencia de inhibidores de PCR segn el contexto de la muestra, seala que existen diferencias estadsticamente significativas (p = 0.011). El anlisis descriptivo deja ver que los huesos del contexto acutico presenta el mayor porcentaje de resultados negativos de amplificacin por inhibidores (44.4%), los del contexto exhumado presentan un 33.3%, sin embargo, los huesos del contexto otros, no presentan resultados negativos de amplificacin por inhibidores de PCR (grfica 15).

Grfica 15 Comparacin entre los diferentes contextos, segn los porcentajes de amplificacin positiva y negativa en la bsqueda de inhibidores.100 90 80 70 6067 56

44

33

100

%

50 40 30 20 10 0

Inhibidores de PCRPresentes Ausentes

EXHUMADO

ACUATICO

OTRO

Contexto

57

El anlisis de la amplificacin en PCR, segn el contexto mostr un comportamiento de medias similar a la cuantificacin por Quantiblot y DyNA Quant 200. Este anlisis demostr adems la existencia de diferencias significativas entre los contextos que correlacionan con la cantidad de ADN encontrado. El anlisis de la presencia de inhibidores, el cual es significativo en cuanto a diferencias entre contextos, tiene un comportamiento inversamente proporcional a los resultados de amplificacin y los de cuantificacin (Quantiblot y DyNA Quant 200); de manera que existe una relacin directa entre estas variables analizadas desde el punto de vista de contexto.

Proporcin A260nm/A280nm y A260nm/A230nm El anlisis de la proporcin A260nm /A280nm indica que los contextos de tipo acutico y enterrado podran presentar problemas ya que, los extractos contienen protenas, evidenciado porque las medias de estos contextos se encuentran por debajo de 1.7. El contexto otros no tiende a presentar problemas por protenas en los extractos (media: 1.813). El anlisis de la proporcin A260nm/A230nm indica que todos los contextos podran presentar problemas, ya que, los extractos contienen carbohidratos en alguna medida. Las medias de todos los contextos se encuentran por debajo de 2.0. Los resultados se refuerzan al incorporar la informacin del contenido de protenas y carbohidratos (proporcin de absorbancia), que indica la existencia de contaminantes de este tipo en los contextos acutico y exhumado, mientras que el contexto otro solo posee contaminacin por carbohidratos. El anlisis estadstico de contexto en general, muestra que los medios en donde se encontraban los huesos influyen diferencialmente sobre la extraccin de los cidos nucleicos y en la cantidad de contaminantes (al menos protenas y carbohidratos) presentes. Si se toman las reacciones negativas de amplificacin, que no presentaron problemas de inhibicin, segn el contexto, se observa que el contexto acutico presenta el mayor porcentaje (64%), luego exhumado (33%) y otro (0%). Ya que todos los extractos presentaron alguna cantidad de cidos nucleicos en los anlisis de cuantificacin, no se puede concluir que estos porcentajes se deban a la ausencia de ADN, sin embargo podran

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presentarse problemas por la presencia de ADN no humano o ADN degradado. Los contextos acutico y exhumado, mostraron ser los ms problemticos. Ahora bien, si el problema de amplificacin radica en la degradacin del ADN (el cual no se pudo comprobar), se podra tratar de analizar el ADN mitocondrial (ADNmt) en lugar del nuclear, ya que, las caractersticas del ADNmt prometen una mayor probabilidad de encontrarlo conservado. Posiblemente se disminuira la cantidad de resultados negativos de amplificacin y se obtendra ms informacin de las muestras, an de las que presentan un contexto influyente. En todos los anlisis de contexto, el contexto otro es quien presenta las mejores condiciones de recuperacin de ADN, de modo que no solo posee menor contaminacin, sino que el ADN est mejor conservado para su amplificacin.

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CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONESConclusionesEl anlisis de resultados permiti llegar a las siguientes conclusiones: El mtodo del FBI logra obtener las concentraciones ptimas de ADN, libre de contaminantes de tipo carbohidratos. Este mtodo es el que logra las mejores condiciones para el ADN de la muestra. El mtodo usado por el OIJ es el que logra extraer la mayor cantidad de cidos nucleicos, pero no estn libres de inhibidores de PCR. El mtodo utilizado por la Universidad de Santiago de Compostela es el menos eficiente segn esta investigacin. Todos los mtodos de cuantificacin lograron estimar la cantidad de cidos nucleicos (ADN, ADN humano y cidos nucleicos totales segn el mtodo), presentes en las muestras. Sin embargo, ninguno logra identificar la cantidad de ADN que realmente es til en la amplificacin de STRs y Amelogenina, ya que, ningn mtodo de cuantificacin toma en cuenta los factores de inhibicin o degradacin del ADN. Se confirm que el exceso de molculas de ARN, ADN microbiano o fngico y las protenas podran servir como obstculos en la formacin del complejo primer ADN humano en la reaccin de PCR. El anlisis de inhibidores de PCR, logr identificar la presencia de contaminantes que perjudican la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) en los extractos. Donde no hubo problemas por inhibidores de PCR, se estima que el ADN est degradado o no es ADN humano. En alguna medida, se logr obtener ADN amplificable en la PCR en los tres mtodos. Las diferencias entre los mtodos de extraccin no estn muy marcadas debido al nmero de muestras (muy pequeo) y a la similitud entre los mtodos.

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El contexto de las muestras influye diferencialmente sobre las mismas. Las diferencias entre los contextos son ms pronunciadas que entre los mtodos de extraccin. Las muestras clasificadas como otros presentan las mejores condiciones de ADN para la amplificacin en PCR para STRs y Amelogenina. Adems no presenta problemas de inhibicin en PCR. Los contextos exhumado y acutico se comportan similarmente entre ellos, en la amplificacin de amelogenina, pero difieren en la amplificacin de STRs y la presencia de inhibidores. El contexto acutico es el ms problemtico en la amplificacin de STRs y Amelogenina, lo que supone que el ADN esta degradado. El contexto exhumado presenta la mayor cantidad de inhibidores de PCR.

Recomendaciones Para las prcticas de identificacin forense, se recomienda el uso del Quantiblot para la deteccin de ADN humano, junto con el GeneQuant que logra estimar ciertos niveles de contaminacin en la muestra. El uso de ambos, podra generar los estndares o patrones necesarios, que permitan estimar la cantidad de ADN til en la produccin de perfiles genticos. Se recomienda hacer diluciones en las muestras antes de montar el PCR, para disminuir la cantidad de contaminantes. Se recomienda el uso de las columnas de purificacin en la extraccin.

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ANEXO

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Modificacin del protocolo de Extraccin de ADN de restos seos segn el FBI (1998) (Acondicionado al laboratorio de Ciencias Forenses del OIJ)1. Una vez pulverizada la muestra con el Freezer/Mill, agregue 2 g de la muestra pulverizada a un tubo Falcon de 50 ml. Monte un blanco o control en otro tubo. 2. Agregue 6ml de SEB (stain extraction buffer) buffer de extraccin de manchas y 48 l de proteinasa K [50 mg/ml] a los tubos Falcon. 3. Agite en el vortex brevemente y centrifugue los tubos para forzar a los fragmentos de hueso en el SEB. 4. Incube a 56 C por 2 horas como mnimo y 24 como mximo. (Use el bao con agitador) 5. Remueva los tubos del bao y centrifugue brevemente. 6. Extraiga el sobrenadante y depostelo en un nuevo tubo 7. Agregue 6ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamilo (PCIA, 25:24:1) a cada tubo. PCIA es irritante y txico. Tome las medidas pertinentes, como cmara de extraccin de gases, guantes, mascara, etc. 8. Agite en el vortex por 30 segundos para obtener una emulsin lechosa, luego centrifugue los tubos por 5 minutos a 10 000X g. 9. Extraiga el sobrenadante y depostelo en un nuevo tubo, debidamente rotulado. 10. En lugar de utilizar los concentradores microcon o centricon, precipite los cidos nucleicos con Acetato de Sodio 3 M, para una concentracin de 0.3 M. Agregar 2 volmenes de etanol absoluto fro. Dejar a -20C, al menos toda la noche. 11. Centrifugue a 10 000x g, por 5 minutos. 12. Hacer tres lavados con etanol de 70, al botn extrado en el paso anterior, eliminar al mximo el sobrenadante y secar al vaco o en

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incubadora a 37 C, en ambos casos quitar la tapa del tubo durante el secado. Si se seca al vaco dejar 5 minutos a 45 C. 13. Resuspender en agua destilada, unos 100 l.

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Extraccin fenlica de ADN a partir de restos seos (OIJ)PROCEDIMIENTOS:

Si los huesos vienen con restos de msculo an, se deben poner en SDS al 10%, aproximadamente por 2 horas. Eliminar con bistur los restos de msculo. Poner en etanol absoluto. Dejar secar a temperatura ambiente. Se deben limpiar las brocas con un cepillo grueso y jabn y luego ponerlas en alcohol. Una vez pulverizado el hueso con el FREEZER/MILL. 1- Poner el hueso pulverizado en un tubo de 50ml de polipropileno estril, nuevo, agregar 7.5 ml de High TE y un volumen igual de buffer lisis, as como 750 l de proteinasa K 10 mg/ml, para una concentracin de 0.5 mg/ml. 2- Dejar en agitacin a 55 C de 24 a 72 horas. 3- Centrifugar y tomar el sobrenadante, descartar el sedimento. 4- Poner el sobrenadante de nuevo en un tubo de 50ml debidamente rotulado, agregar un volumen igual de fenol saturado, agitar invirtiendo vigorosamente. Centrifugar a 3500 rpm por 20 minutos a 4 C. 5- Pasar el sobrenadante a un tubo de 50 ml debidamente rotulado, agregar un volumen igual de Fenol-Cloroformo- alcohol isoamilo (25:24:1), agitar invirtiendo vigorosamente. Centrifugar a 3500 rpm por 20 min a 4 C. 6- Poner el sobrenadante en un tubo de 50 ml debidamente rotulado, y agregar un volumen igual de Cloroformo-alcohol isoamilo (24:1), agitar vigorosamente y centrifugar igual que en los pasos anteriores. 7- Precipitar el sobrenadante agregando Acetato de Sodio 3 M para una concentracin de 0.3 M. Agregar 21/2 volmenes de etanol absoluto

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fro. Dejar a -20 C, al menos toda la noche. 8- Centrifugar como en los pasos anteriores y descartar el sobr