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COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA

GERENCIA DE ANÁLISIS Y DESARROLLO DE PRUEBAS INMUNOQUÍMICAS Y BIOLOGÍA MOLECULAR

PROTOCOLO DE CONFIRMACIÓN DEL MÉTODO: DETERMINACIÓN DE CLENBUTEROL EN CARNE DE BOVINO POR EL ENSAYO INMUNOENZIMATICO

DE ELISA

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FECHA DE ELABORACIÓN: 2017-10-30 CCAYAC-PV-155/V1

PROTOCOLO DE CONFIRMACIÓN DEL MÉTODO DETERMINACIÓN DE CLENBUTEROL PARA

CARNE DE BOVINO POR EL ENSAYO INMUNOENZIMATICO DE ELISA PARA EL KIT DE NUEVO DESARROLLO RIDASCREEN FAST R-BIOPHARM R-1711

Elaboró

Revisó: Autorizó

I.A. Sara Vargas García

M. en C. Luz Sandra Sánchez del Angel

M. en MM. Dianelly Yazmin Colli Magaña




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ÍNDICE.

1. OBJETIVO 2. ALCANCE

3. METODO DE ENSAYO

4. EQUIPO 5. MATERIALES 6. REACTIVOS 7. MUESTRA

8. DESARROLLO EXPERIMENTAL

Verificación del Sistema de ELISA Repetibilidad Reproducibilidad (precisión intermedia) Especificidad % de Recobro Ruido de fondo de matriz.

9. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

10. BIBLIOGRAFIA




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1. OBJETIVO 1.1 Objetivo general:

Realizar la confirmación del método de prueba para la determinación de clenbuterol en muestras de carne bovina por medio del uso del kit de ELISA R-1711.

1.2 Objetivos específicos: Diseñar y desarrollar los ensayos para determinar: Repetibilidad, Precisión intermedia, Especificidad/selectividad, Recuperación, Verificación del sistema de ELISA.

2. ALCANCE:

Esta confirmación aplica al método para la determinación de clenbuterol en muestras de carne con el kit de Clenbuterol Fast de R-Biopharm R-1711.

3. MÉTODO DE ENSAYO

Método CCAYAC-M-265/8 utilizando el kit de nuevo desarrollo Clenbuterol Fast Ridascreen R-1711 3.1 Diagrama del proceso analítico. Son 3 etapas de preparación de la muestra: Homogeneización, extracción y evaporación.

I) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.




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3.3 Diagrama analítico de flujo (prueba de ELISA):

(sin filtro)




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4. EQUIPO.

Equipo

Características ID

Calificación /Calibración, M.

Preventivo

Centrifuga

Marca:Thermo mod. Heraeus refrigerada. De 8 camisas con velocidad de 3500 a 4500 rpm. y control de temperatura

2929

Refrigerador

Equipo modular.Temperatura promedio 2°C a 8°C.

Congelador Equipo modular.Temperatura promedio -20°C.

Congelador Con temperatura promedio -20°C.

Balanza Granataria con sensibilidad de 0.01g

Procesador de alimentos u

homogeneizador Sistema de homogeneización Ultraturrax

Lector de ELISA

Marca:Biotek modelo: ELx800 con longitud de onda de 400 a 750 nm.

882

Equipo de Computo De escritorio con software Ridasoftwin, data reduction for inmunoassays R-Biopharm.

NA

Termómetro

De vidrio, con escala de 20 a 100°C de inmersión parcial. 822

Termómetro

De vidrio, con escala de menos -2 a 10°C 2170

Vortex De un plato con regulador de agitación. Marca VWR 2970

Evaporador (con base a aire o nitrógeno)

Sistema concentrador que alcance 60°C

Micropipetas de volumen variable

De 2 a 20 µl 836

De 50 a 300 µl 831

De 100 a 1000 µl 841

De 500 a 5000 µl 2973

De 30 a 300 µl 2614

Micropipeta multicanal de 8 canales de volumen variable de 50 a 300 mcl.

Micropipeta multicanal de 8 canales de volumen variable de 30 a 300 μL




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5. MATERIALES. Material de laboratorio de uso general.

6. REACTIVOS.

6.1 Generales. Nombre Formula Marca,

Grado o pureza Lote y

Especificación

Agua tipo I H2O Agua Tipo I N/A

Buffer de lavado Incluido en Kit de

detección

R-Biopharm

N/A

Kit RIDASCREEN Clenbuterol ensayo inmunoenzimático

-----

R-Biopharm Cat: R1711

Clenbuterol Fast Con placa de 96 micropozos,

6 estándares (std 1 [0 ppt], std 2 [75 ppt], std 3 [150 ppt], std 4 [300 ppt], std 5 [900 ppt], std 6 [2700 ppt]), 1 sol conjugado, 1 sol. sustrato/Cromógeno, 1 sol. de paro 1 sol. buffer de lavado

Acetonitrilo CH3CN pureza grado ≥ 99%

6.2 PATRONES DE REFERENCIA.

Nombre Formula Marca, Grado o pureza

Catalogo

RIDA Clenbuterol Spiking Solution

C12H18Cl2N2O clenbuterol en buffer de lavado

R-Biopharm Cat: R1799

7. MUESTRA. Se recomienda partir de una matriz muy fresca ya sea que contenga o no clenbuterol, la cual se debe caracterizar realizando por lo menos 6 repeticiones independientes. Si la matriz es negativa a la presencia de clenbuterol, se puede utilizar como matriz de soporte para preparar los niveles del ensayo a través de la fortificación.

7.1 Muestra control negativa de carne caracterizada. Se utilizarán muestras que son obtenidas en la rutina de trabajo, donde se ha obtenido un resultado de concentración menor a 100 ppt.




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7.2 Muestra control positiva de carne caracterizada. Se utilizarán muestras que son obtenidas en la rutina de trabajo y que contienen una concentración aproximada entre 900 y 2700 ppt. De no contar con este tipo de muestras trabajar con el esquema de fortificación.

8 DESARROLLO EXPERIMENTAL.

8.1 Determinar la verificación del sistema de ELISA (repetibilidad del sistema). 8.1.1 Realizar la curva de calibración del kit 3 veces por un analísta, en la misma corrida y con el mismo kit. 8.1.2 Leer en el lector de placas de ELISA la densidad óptica (DO) 8.1.3 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.1.4 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 1. 8.1.5 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación

de los resultados (X, DS y CV respectivamente).

Tabla 1 (archivo:xxxxx)

Laboratorio:

Unidades (ng/Kg= ppt)

Respuesta analítica (DO)

*ng/Kg Curva A Curva B Curva C X DS %CV

0

75

150

300

900

2700 *Puntos de la curva del kit R-1711.




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Formato de gráficas

Laboratorio: Clenbuterol

Unidades: ng/kg (ppt)

ng/kg Curva A Curva B Curva C PROM S Cv

0.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!

75.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!

150.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!

300.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!

900.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!

2700.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!

Respuesta analítica (DO)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0.00 1000.00 2000.00 3000.00

Res

pu

esta

An

alít

ica

Concentración

Linealidad del Sistema

Curva A

Curva B

Curva C

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0.00 500.00 1000.00 1500.00 2000.00 2500.00 3000.00

Res

pue

sta

anal

ític

a

Concentración

CURVA A

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0.00 500.00 1000.00 1500.00 2000.00 2500.00 3000.00

Res

pu

esta

an

alít

ica

Concentración

CURVA B

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0.00 500.00 1000.00 1500.00 2000.00 2500.00 3000.00

Res

pue

sta

anal

ític

a

Concentración

CURVA C

8.1.6 Criterios de aceptación.

Herramienta estadística Nomenclatura Criterio

Coeficiente de variación %CV ≤20%

8.2 Repetibilidad del ensayo 8.2.1 Realizar al menos, 6 repeticiones independientes de una muestra positiva y 6 repeticiones de

una negativa de carne. 8.2.2 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA. 8.2.3 Leer en lector de placas de ELISA sin filtro. 8.2.4 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.2.5 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 2. 8.2.6 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación

de los resultados.

Tabla 2 (Archivo: )

Replicas Muestra

Concentración Muestra positiva

Analista 1

Concentración Muestra negativa

Analista 1




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1

2

3

4

5

6

X

DS

%CV



Coeficiente de variación CV ≤20%

8.3 Reproducibilidad (precisión intermedia utilizando muestras nativas)

8.3.1 Realizar al menos 6 repeticiones independientes de la muestra positiva de carne, por 2 analistas

en 2 diferentes días. 8.3.2 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA. 8.3.3 Leer en lector de placas de ELISA. 8.3.4 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.3.5 Registrar las lecturas obtenida en la tabla 3. 8.3.6 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación

de los resultados.

Tabla 3 (Archivo: )

Replicas Muestra

Concentración Muestra positiva Analista 1

Concentración Muestra negativa Analista 2

Día 1 1

2

3

4

5

6




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Día 2 1

2

3

4

5

6

Xr

DSr

%CVr

XR

DSR

%CVR




8.4 Reproducibilidad (precisión intermedia utilizando muestra fortificada en al menos 4 niveles).

8.4.1 Se puede elegir cualquier nivel, pero es recomendable aquellos que caigan en la parte lineal de

la curva y considerar el límite de corte que actualmente es de 2000 ppt. Se recomienda probar también 500ppt y 300ppt.

8.4.2 Se realizarán 6 replicas de muestras independientes de la matriz para cada nivel. 8.4.3 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA. 8.4.4 Leer en lector de placas de ELISA. 8.4.5 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.4.6 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 4. 8.4.7 Se calculará, el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de

variación de los resultados.

Tabla 4 (Archivo: )

Replicas Muestra

Concentración de niveles N1 Analista 1




1

2

3

4

5

6




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X

DS

%CV




8.5 Ruido de fondo de matriz.

Se puede omitir el ensayo sobre este parámetro y utilizar los datos generados en el numeral 8.1 de repetibilidad del ensayo. Si esto no es posible entonces proceder como se describe enseguida.

8.5.1 Realizar 3 replicas de una muestra negativa de carne, donde la concentración sea menor de 500 ppt. (el nivel puede cambiar de acuerdo al límite de detección del kit).

8.5.2 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA. 8.5.3 Leer en lector de placas de ELISA 8.5.4 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.5.5 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 5. 8.5.6 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación

de los resultados.

Tabla 5 (Archivo:xxxx )

Replicas Muestras

Concentración Muestra Analista

1

2

3

X

D. E

% CV







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8.6 % de Recobro

8.6.1 Trabajar con los niveles de fortificación N1, N2, N3 y N,4 que el laboratorio haya establecido en

el numeral 8.4 del presente documento. 8.6.2 Realizar los cálculos para adicionar una solución estándar de clenbuterol de concentración

conocida a una muestra de carne cuya concentración sea menor a 100 ppt (puede ser la muestra que se utilizó para analizar el ruido de fondo). Enseguida se muestra un ejemplo.

Ejemplo de cálculo de fortificación: Se desea fortificar una muestra de carne a 0.4 ppb (ng/mL). El protocolo descrito en el Kit para la preparación de la muestra describe que se debe de partir de 2.0g de carne. La solución fortificante que se preparó tiene una concentración de 10 ng/mL (ppb).

Aplicando la fórmula: Tenemos que: v= C. fortificación x m C. fortificante Donde: v= Volumen de la solución fortificante a utilizar (mL) C.fortificación= Concentración a la cual se desea fortificar la muestra (ppb) C. fortificante: Concentración de la solución fortificante (ppb)(ng/mL) m: Cantidad de muestra fortificar (gramos o mL) Aplicando la formula: (0.4ppb) (2.0 g.) v=_______________= 0.08mL = 80µL de sol. fortificadora de 10 ppb + 2.0 g carne 10 ppb

8.6.3 Realizar 6 replicas independientes de cada una de las muestras fortificadas en cada nivel. 8.6.4 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA. 8.6.5 Leer en lector de placas de ELISA 8.6.6 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.6.7 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 6 y 7. 8.6.8 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación

de los resultados. 8.6.9 Realizar cálculos para obtener el % de recuperación, tomando en cuenta el promedio del ruido

de fondo.




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N1: Cantidad adicionada


Promedio Muestra blanco (Carne)


Replicas Muestra Lectura en ppt

% Recuperación Replicas Muestra Lectura en ppt

% Recuperación

1 1

2 2

3 3

4 4

5 5

6 6

X X

DS DS

%CV %CV






Replicas Muestra Lectura en ppt

% Recuperación Replicas Muestra Lectura en ppt

% Recuperación

1 1

2 2

3 3

4 4

5 5

6 6

X X

DS DS

%CV %CV




% de recuperación %R 73-91%




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8.7 Especificidad / Selectividad (solo en caso de contar con estándares de ractopamina y

salbutamol ó silpaterol) 8.7.1 Seleccionar al salbutamol y ractopamina como otros b-agonistas que pueden estar presentes en

las matrices estudiadas. 8.7.2 Seleccionar el nivel al cual se va a realizar el ensayo de especificidad. Se recomienda

considerar que la concentración seleccionada sea 10 veces mayor al LD. 8.7.3 Fortificar con estas dos soluciones y por separado, dos muestras de carne (muestra

caracterizada como negativa) y realizar al menos 10 repeticiones para cada uno de los b-agosnistas.

8.7.4 Realizar el análisis y determine la concentración. 8.7.5 Realizar otro ensayo con al menos 5 repeticiones independientes con otras dos matrices de

carne fortificadas por un lado con clenbuterol y ractopamina y por otro con clenbuterol y salbutamol mezcladas en una proporción 1:3 (1 parte de clenbuterol y 3 partes del otro beta agonista) para verificar posibles interferencias con el analito.

8.7.6 En caso de existir interferencia con algún(os) analito(s) afín(es), se deberá dejar constancia escrita de este hallazgo en el informe de validación.




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9. Tabla de criterios de aceptación.

9.1 Los criterios para la confirmación del método de prueba fueron obtenidos de varias guías de validación de fuentes oficiales o del mismo proveedor del kit y se muestra en la siguiente tabla.


Parámetro Criterio de aceptación Fuente bibliográfica Resultado de la

confirmación Conclusión

Verificación del sistema de ELISA

Coef. Correlación o linealidad R2 >90 y

CV≤20%

Revista Ambito Regulador. Centro para el control estatal de la

calidad de los medicamentos

CECMED. La Habana No. 00-53, 2007

Repetibilidad El coeficiente de variación

para un sistema inmunoquimico es ≤20%

Guidelines on bioanalytical method validation. European Medicines Agency

2011.

Precisión intermedia

El coeficiente de variación para un sistema

inmunoquimico debe ser ≤20%

Guidelines on bioanalytical method validation. European Medicines Agency

2011

% de Recobro

70-130% (aproximadamente para ésta matriz en promedio

106%)

Inserto del Kit RIDASCREEN

Clenbuterol Fast de la Cia. R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany

R- 1711

Especificidad / Selectividad

Ninguna detección para otros beta agonistas

diferentes a clenbuterol

Community Reference Laboratories Residues (CRLS) 20/1/2010.Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (initial validation and transfer).




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9.2 Los criterios de validez del método de prueba proporcionado por el fabricante del Kit RIDASCREEN

Clenbuterol Fast de la Cia. R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany R- 1711, se muestra en la siguiente tabla.


Parámetro Criterio de aceptación Resultado de la confirmación Conclusión

Temperatura ambiente de realización del ensayo

20-25°C

Absorbancia del estándar 1 (St con cero de concentración)

>0.8

%CV entre repeticiones de las inoculaciones en el pozo de la ELISA

10%

Forma de la curva

Comparar con la forma de la curva del certificado de análisis del kit del mismo lote

Recuperación 70-130%

10. Bibliografía. 10.1 Inserto del Kit RIDASCREEN Clenbuterol Fast de la Cia. R-Biopharm AG, Darmstadt,

Germany. Inmunoensayo enzimático para el análisis cuantitativo de Clenbuterol y otros β-agonistas. Marzo 2017.

10.2 Métodos Analíticos adecuados a su propósito „Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos y Temas Relacionados” 2da. Edición Desarrollado por: Eurachem Publicación técnica CNM-MRD-PT-030 CENAM.

10.3 Community Reference Laboratories Residues (CRLS) 20/1/2010.Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (initial validation and transfer).

10.4 Application note. R-biopharm. Compiliance criteria for manual testing of RIDASCREEN antibiotic/hormone tests (competitive). 2017-10.

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