COLORACIONES MICROBIÓLOGICAS

COLORANTE• Los colorantes, son sustancias que pueden tener un

origen natural o artificial y que se usan para potenciar el color.

¿DIFERENCIA ENTRE TINCION Y COLORACION?

Coloración: Ocurre a nivel de la superficie.

Tinción: Ocurre nivel molecular o celular

CLASIFICACION DE LOS COLORANTES

Según su origen

Natural

artificial

Según sus propiedades

quimicas

Colorantes acidos

Colorantes básicos

Colorantes neutros

Colorantes

indiferentes

orcenina

Azul de metileno, safranina

Eosina

Azul de metileno

Eosinato de azul de

metileno

Colorante sudan

MECANISMO DE COLORACIONESSIMPLE

• Tamaño, arreglo y forma

• Un solo tintese divide:• DIRECTATiñe bacteria

Ejemplos: • tinción azul de

metileno• Azul de lactofenol

• INDIRECTAtiñe el fondo pero no

a la Bacteria

Ejemplos: tinción negativa

ESPECÍFICA•Para identificar

estructuras: Ejemplos: Tinción

de flagelos, espiroquetascápsulas y esporas.

DIFERENCIAL•Separar y clasificar

los microorganismos observados de acuerdo a sus Características

•Más de un tinteEjemplos:

Tinción Gram y Ácido

Resistente

Coloración simple• Tiñe las células de los

microorganismos proporcionando información sobre MORFOLOGÍA, definida por el tamaño, forma, agrupación USANDO UNICO COLORANTE como safranina, azul de metileno, cristal violeta y carbolfuesina,etc

• Se le puede añadir un mordiente.

Coloración simple

El reactivo que se usa, que preferentemente es de tipo básico y contiene

un cromógeno (compuesto que da color

al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con

carga negativa que atraen y enlazan el

cromógeno.

Todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color.

C.S DIRECTA

EJEMPLOS :COLORACION CO AZUL DE METILENO, AZUL DE LACTOFENOL,SAFRANINA ,CRISTAL VIOLETA

Procedimiento en el laboratorio

1.-Frotis: hacer un extendido a partir de un cultivo bacteriano en un portaobjetos.

2.-Fijar la preparación exponiendo el portaobjetos rápidamente a la llama del mechero evitando un excesivo calentamiento.

3.-Cubra el extendido con una pequeña cantidad de azul de metileno y déjelo actuar por un minuto.

4.-Lave con agua hasta eliminar el exceso de colorante.

5.-Seque la preparación al aire o al mechero.

6.-Examine las preparaciones teñidas al microscopio, con el lente de inmersión.

COLORACION DE AZUL DE LACTOFENOL

Útil para la identificación de estructuras y esporas de hongos

Colorante acido que tiñe que tiñe el citoplasma y la quitina presente en las celulas fungicas.

1.-Hacer una extendido a partir de un cultivo en un portaobjetos.2.-Cubra la muestra con azul de lactofenol.3.-cubrir con cubreobjetos.4.-observar.

Procedimiento en el laboratorio

COLORACION DE AZUL DE LACTOFENOL

Fotomicrografía dehongos filamentososcon el método deazul algodón de lactofenol.Exserohilumsp. (izquierda); Mucorspp. (derecha)(aumento 40x).Imagen en color en:www.medigraphic.com/rid

C. SIMPLE INDIRECTA

Las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el

perfil de las células.

COLORACION NEGATIVA

Permite observar las bacterias con color translucido sobre un campo

oscuro, utilizando LA TINTA CHINA.

Limitado por la presencia de un fondo oscuro que no permitirá la

correcta identificación y detallada de los componente de dichas células.

Manifiesta la presencia del hongo cryptococcuc

neoformans, causante de la MENINGITIS

COLORACIÓN NEGATIVA• PROCEDIMIENTO EN

LABORATORIO

1.-Hacer un extendido a partir de un cultivo bacteriano en un portaobjetos

2.- Cubra el extendido con tinta china

3.-Cubrir con portaobjetos

4.-Observar

COLORACIÓN DIFERENCIAL

COLORACIÓN DIFERENCIAL

El colorante utilizado pone de manifiesto

diferencias entre células bacterianas o entre

partes de una misma célula. Estas técnicas

utilizan mas de un colorante o bien ciertos

reactivos complementarios para la tinción.

Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-

Neelsen.

TINCIÓN DE GRAMEsta tinción diferencial depende de la estructura de la pared celular de las bacterias.

Las bacterias Gram negativas tienen una membrana externa de la que carecen las bacterias Gram positivas.

La técnica consiste en una tinción primaria, una decoloración y una tinción de contraste.

MÉTODO DE TINCIÓN:

Tinción de ZIEHL-NEELSEN (Ácido Alcohol Resistentes)

Esta tinción permite diferenciar micobacterias, bacterias con ácidos micólicos en su pared celular pertenecientes a los géneros Mycobacterium y Nocardia.

Manifiesta la capacidad de resistir a

la decoloración gracias al alto

contenido de lípidos complejos (ácidos

micólicos) y ceras que poseen algunos

microorganismos en su pared celular.

Mycobacterium tuberculosis

Tinciones especiales

• las tinciones especiales incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen endosporas, los flagelos y las cápsulas.

TINCIÓN DE ESPORAS MÉTODO WIRTZ-CONKLIN

• ESPORAS:

• La espora bacteriana es un cuerpo refringente oval formado dentro de la célula . Esta puede estar ubicada en el centro o en un extremo. La espora puede tener diámetro mayor que la bacteria vegetativa y ser deformante de ella.

PROCEDIMIENTO:

• Preparar un frotis.

• Cubrir con verde malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos.

• Lavar con agua corriente.

• Colorear con safranina por 1 minuto.

• Lavar y secar.

• Observar.

TINCIÓN DE CÁPSULAS

• La cápsula bacteriana o glucocálix es una capa que se forma en la parte externa de la pared de la mayoría de las bacterias.

TINCIÓN DE CÁPSULAS POR EL MÉTODO DE HISS

• Preparar un frotis.

• 2.- Cubrir fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos.

• 3.- Lavar con solución acuosa de sulfato de cobre al 20%.

• 4.- Lavar con agua corriente y secar.

• 5.- Observar.

TINCIÓN DE ESPIROQUETAS

• bacterias Gram negativas largas, delgadas, helicoidales y móviles.

• Treponema, Borrelia y Leptospira

TINCIÓN DE ESPIROQUETAS CON EL MÉTODO DE VAGO

• Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.

• Fijar el frotis al calor suave

• Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos

• Lavar con agua corriente

• Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos

• Lavar con agua corriente

• Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

TINCIÓN DE FLAGELOS

• Flagelo:

• Es un orgánulo filiforme.

• Provee de movimiento a las células.

• Los flagelos son estructuras demasiado finas para poder ser visibles en el microscopio de luz.

MÉTODO DE GRAY• Preparar una suspensión de la bacteria

en agua estéril.

• Sobre el portaobjetos flameado y frio colocar 5 gotas de suspensión.

• Dejar secar al aire, no calentar.

• Cubrir con el mordiente durante 10 min.

• Lavar con agua, tratando de no arrastrar la preparación.

• Cubrir con solución de carbol-fucsina durante 5 a 10 min.

• Lavar con agua y dejar secar al aire.

• Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

• Los flagelos se observaran de color rojo.