coli (E.coli) E -...
-
Upload
trinhquynh -
Category
Documents
-
view
226 -
download
9
Transcript of coli (E.coli) E -...
-
1
MOLEKULARNA BIOLOGIJA EUKARIOTA
UVOD
Prisustvo ili odsustvo nukleusa je osnova za fundamentalnu klasifikaciju ivih
organizama. One elije koje sadre nukleus nazivaju se eukariotima dok se one koje ga
nemaju nazivaju prokariotima. Termini bakterija i prokariot su termini koji se esto koriste
kao sinonimi. Veina prokariota ive kao jednoelijski organizmi iako neki formiraju lance ili
grupacije ili se ak organizuju u multicelularne strukture. Svi kompleksniji multicelularni
organizmi, ukljuujui biljke, ivotinje i gljive, su formirani od eukariotskih elija. Mnogi
jednoelijski organizmi od kvasaca do ameba, su takoe eukarioti. elije koje poseduju
nukleus, takoe, poseduju i druge, razliite organele koje se ne mogu nai kod prokariota.
U poslednjih desetak godina je poela veoma intenzivno da se razvija molekularna
biologija viih eukariota, i to zahvaljujui saznanjima molekularne biologije prokariota kao i
razvoju novih molekularno biolokih tehnika. Molekularni mehanizmi vitalnih procesa u ivoj
eliji kao to su npr. replikacija DNK, transkripcija, translacija, regulacija ekspresije gena,
reparacija DNK su u velikoj meri razjanjeni kod bakterija. Kao osnovni model sistem za
molekularno bioloka istraivanja u poslednjih 50 godina koriena je bakterija Escherichia
coli (E.coli). injenica da su bakterije haploidni organizmi te se svaka mutacija uvek i
eksprimira, da imaju manji genom od npr. genoma oveka, kao i injenica da ih je jako lako
kultivisati u laboratorijskim uslovima inila je da prvi model sistem u istraivanjima u ovoj
oblasti budu ba bakterije.
Otkrie restrikcionih enzima uinilo je moguim analiziranje DNK, kloniranje eljenog
gena u plazmid ili lambda fag i analizu istog gena ili njegovog produkta u raznim mutantima
E.coli. Saznanja dobijena u zadnjih par desetina godina omoguila su istraivanja u oblasti
molekularne biologije eukariota koja su mnogo kompleksnija. Takodje, otkrie novih tehnika
kao to su Lanana reakcija polimeraze (engl.Polymerase chain reaction-PCR), analiza
diferencijalne ekspresije gena ( engl.differential display), konstrukcija transgenih ivotinja i
biljaka omoguilo je ekstenzivna istraivanja u domenu molekularne biologije eukariota koja,
pre otkria ovih tehnika, nisu, fiziki bila mogua. Uglavnom su istraivanja u ovoj oblasti bila
ograniena na citogenetske i populaciono genetike studije. Tek od nedavno su otvorene
mogunosti veoma precizne analize molekularno biolokih procesa kod viih eukariota.
Najvie ekspimenata je uradjeno na kvascu kao model sistemu, jednoelijskom eukariotskom
organizmu, i ta saznanja su u mnogome pomogla u razvoju molekularne biologije viih
eukariota.
Nukleus je informativni deo elije
Nukleus je obavijen sa dve membrane i sadri DNK koju ine ekstremno dugi polimeri
nukleotida. Ovi gigantski molekuli udrueni sa proteinima u hromatin, mogu se videti
svetlosnim mikroskopom (kada postanu kompaktni pre elijske deobe), i tada su oznaeni
kao hromozomi. Veina elija svakog organizma sadri po 2 kopije svakog hromozoma, pri
emu je jedna kopija nasleena od majke a druga od oca. Ovakve elije se nazivaju
diploidnim elijama, dok jajne elije i elije spermatozoida imaju samo po jedan set
hromozoma i nazivaju se haploidnim elijama. U patolokim stanjima kao to je npr. Daunov
sindrom postoje tri kopije hromozoma 21 (trizomija hromozoma 21).
-
2
Broj hromozoma u diploidnim elijama eukariota se razlikuje od vrste do vrste (Tabela
1) i nije u korelaciji sa sloenou organizma.
Tabela 1. Broj hromozoma u diploidnim elijama eukariota:
Organizam broj hromozoma
ovek 46
pas 78
pacov 42
urka 82
aba 26
vinska muica 8
kraba 254
pasulj 14
krompir 48
kvasac 34
zelene alge 20
Diploidne elije oveka sadre 46 hromozoma razliite duine, a svaki sadri izmeu
48 i 240 miliona baznih parova DNK. DNK jednog organizma sadri informaciju za sve RNK i
proteine koji su neophodni za strukturu i funkciju elije.
Struktura eukariotskog hromozoma
Nukleus tipine elije oveka je dijametra 5-8 m i sadri DNK duine oko 2m, to bi
bio ekvivalent teniskoj lopti koja sadi 20 km ekstremno tankog konca. Ta 2m dugaka DNK
u nukleusu svake elije oveka spakovana je na veoma poseban nain ali opet tako da DNK
ostaje pristupana za sve enzime i druge proteine neophodne za transkripciju, replikaciju
DNK, reparaciju DNK i rekombinaciju. DNK molekuli su u nukleusu rasporeeni u
hromozome. Svaki hromozom je sainjen od jednog enormno velikog molekula DNK i
proteina koji savijaju i pakuju tanak konac DNK u mnogo kompaktniju strukturu. Kompleks
DNK i proteina naziva se hromatin. Mnogi proteini tesno vezani sa DNK ukljueni su u
pakovanje DNK, ali hromozomi takoe sadre i proteine koji su ukljueni u regulaciju genske
ekspresije, replikaciju DNK, reparaciju DNK i rekombinaciju DNK. Stanje kondenzovanosti
hromozoma varira u odnosu na elijski ciklus, to je posledica ekspresije razliitih gena tj.
potrebe elije za produktima (proteinima i RNK) razliitih gena u razliitim fazama elijskog
ciklusa. Veoma kondenzovani hromozomi u eliji koja se deli nazivaju se mitotskim
hromozomima, dok se hromozomi u relaksiranoj fazi nazivaju interfaznim hromozomima.
Nukleozomi su osnovna jedinica hromatinske strukture
Kompleks DNK i proteina u nukleusu naziva se hromatin. Hromatin postoji u razliitim
strukturama tokom razliitih faza elijskog ciklusa. U interfaznim nukleusima hromatin je u
relaksiranom stanju, to omoguava pristup molekulu DNK raznim enzimima i drugim
proteinima neophodnim za ekspresiju genau i replikaciju DNK. U interfazi se vri priprema
hromozoma za ulazak u mitozu pri emu se hromatin kondenzuje zadobijajui veoma
-
3
kompaktnu strukturu tako da se u zavrnoj fazi formiraju visoko kondenzovani mitotiki
hromozomi.
Prvi i osnovni nivo pakovanja hromatina, nukleozom, opisan je 1974 godine. Kada se
razbiju interfazni nukleusi, gde je hromatin u relaksiranom stanju, i kada se sadraj prouava
pod elektronskim mikroskopom vidi se da se veina hromatina nalazi u formi perlica
nanizanih na koncu. Konac ini DNK, a svaka perlica predstavlja nukleozom koji se sastoji
od kompleksa proteina 1,65 puta obmotanog molekulom DNK.
Struktura nukleozoma je odreena u eksperimentima u kojima je vrena digestija
hromatina mikrokokalnom nukleazom koja see dvolananu DNK. Nakon digestije
nukleazama, DNK izmedju perlica odnosno nukleozoma isezava na elektronskim
mikrografijama tj. biva degradirana tretmanom nukleazama. Individualni nukleozom ini
kompleks od 8 histonskih proteina (po dva molekula od svakog histona: H2A, H2B, H3, i H4)
kao i dvolanana DNK od 146 bp. Dvolanani heliks DNK je obavijen oko histonskog
oktamera. Formiranje nukleozoma predstavlja prvi nivo pakovanja ime se DNK prevodi u
hromatin, to smanjuje duinu DNK za jednu treinu inicijalne duine.
Histoni su mali proteini i sadre veliki procenat pozitivno naelektrisanih aminokiselina
(posebno lizina i arginina). Ovo pozitivno naelektrisanje omoguava histonima da se tesno
priljube uz negativno naelektrisanu DNK, nezavisno od same sekvence DNK. Histoni mogu
biti ekstrahovani iz hromatina pomou 0,5 M rastvora NaCl koji interferira sa elektrostatikim
interakcijama uspostavljenim izmeu histona i DNK. Nukleozomi su rasporedjeni du
molekula DNK na oko 200 nukleotidnih parova (146 nukleotidnih parova DNK je obmotano
oko histonskog oktamera i proseno oko 50 bp ini golu DNK izmedju susednih
nukleozoma). Histoni su prisutni u enormnim koliinama u elijama (oko 60 miliona molekula
svakog tipa po eliji), a njihova totalna masa u hromatinu je gotovo identina masi DNK.
Histoni koji ulaze u sastav nukleozoma predstavljaju najkonzervisanije, do sada poznate,
eukariotske proteine. Tako u sekvenci H4 histona graka i krave, vrsta koje su divergirale pre
1,2 milijardi godina, postoje samo razlike u dve aminokiseline. Nedavno su histoni
otkriveni kod arhea koje su filogenetski veoma udaljene od eukariota. Ova ekstremna
evolutivna konzerviranost odraava vitalnu ulogu histona u formiranju hromatina. Histon H1
pokazuje najveu varijabilnost izmeu vrsta.
Hromozom ima nekoliko nivoa DNK pakovanja
U ivim elijama hromatin se jako retko nalazi u relaksiranoj formi. Nukleozomi se
meusobno pakuju u mnogo kompaktniju strukturu koja na elektronskim mikrografijama ima
izgled vlakna debljine od oko 30 nm. Pakovanje nukleozoma u ovu kompaktniju strukturu
posredovano je petim tipom histona H1. Molekularni mehanizam daljeg pakovanja ove
strukture od 30 nm nije jo uvek sasvim poznat ali je verovatno da ova struktura prvo formira
petlje, koje daljim pakovanjem formiraju visoko kondenzovani mitotiki hromozom.
Kondenzovanje mitotikog hromozoma (tj. njegovo tesno pakovanje), ima za posledicu
zaustavljanje sinteze RNK, zato to DNK postaje nepristupana za RNK polimerazu i druge
proteine neophodne za transkripciju.
-
4
Modifikacije histona
Histoni podleu posttranslacionim kovalentnim modifikacijama koje ukljuuju
metilaciju, acetilaciju i fosforilaciju specifinih argininskih, histidinskih, lizinskih, treoninskih i
serinskih ostataka. Ove modifikacije, od kojih su mnoge reverzibilne, smanjuju pozitivno
naelektrisanje histona i na taj nain menjaju histon-DNK interakcije to je od ogromnog
znaaja u regulaciji ekspresije gena. Smanjenje pozitivne are histona smanjuje jainu
interakcije histoni-DNK te tako ini dostupnom DNK koja sada moe biti target za
transkripciju, replikaciju DNK, itd. Uprkos velikoj evolucionoj stabilnosti histona, njihov stepen
modifikacija je veoma razliit izmeu vrsta, tkiva i stadijuma elijskog ciklusa, to opet
potvruje ulogu ovih modifikacija u regulaciji aktivnosti gena.
Mnogi, ako ne svi eukarioti, imaju genetiki razliite podtipove histona H1, H2A, H2B i
H3 ija se sinteza pali ili gasi za vreme specifinih stadijuma embriogeneze kao i u toku
razvia posebnih elijskih tipova. Varijacija u aminkoiselinskoj sekvenci ovih podtipova je
zapravo jako mala za H2A, H2B i H3 dok je ekstenzivnija za H1. ta vie, eritriodne elije
embriona pileta sadre H1 varijantu koja se toliko razlikuje od adultnog H1 da je mnogi
nazivaju H5 histonom (ptiiji eritrociti za razliku od sisarskih sadre nukleus). Modifikacija
histona je najverovatnije u vezi sa elijskom diferencijacijom, ali priroda ove veze jo uvek
nije poznata.
Roditeljski nukleozomi, nakon DNK replikacije distribuiraju se izmedju erki elija
In vivo replikacija eukariotske DNK deava se istovremeno sa pakovanjem u
hromatin. Na osnovu brojnih eksperimentalnih dokaza utvreno je da roditeljski oktameri
ostaju tesno vezani sa DNK za vreme replikacionog procesa umesto da bivaju disocirani sa
roditeljske DNK. Prema tome, nukleozom se ili otvara da bi dozvolio prolaz replikacionoj
viljuci ili se roditeljski histonski oktameri na neki nain prebacuju na novosintetisani heliks
DNK odmah iza replikacione viljuke.
-
5
ORGANIZACIJA GENOMA EUKARIOTA
Vii organizmi su izgraeni od velikog broja razliitih tipova elija koje se razlikuju ne
samo po obliku, strukturi i funkciji, ve i po proteinima koje sintetiu. Svaka elija sadri
identinu DNK ali su razliiti geni eksprimirani u eliji jetre u odnosu na npr., neuron ili
miine elije zahvaljujui emu ove elije mogu obavljati svoje specifine funkcije.
Diferencijacija elija je posledica precizne vremenske i prostorne regulacije ekspresije gena.
Paradoks C-vrednosti (C-vrednost=koliina DNK u haploidnom genomu)
Bilo bi logino oekivati da je bioloka sloenost organizma posledica vee koliine
DNK. ta vie, veruje se da bioloka sloenost organizma mora reflektovati genetiku
sloenost. Meutim ono to je poznato kao paradoks C-vrednosti je injenica da mnogi
organizmi imaju neobino visoke C vrednosti to ne odgovara njihovoj morfolokoj
kompleksnosti. Tako npr. genomi nekih vrsta riba i gutera su 10 do 15 puta vei od sisarskih
genoma, a ne moe se rei da su ribe i guteri morfoloki kompleksniji od sisara. Koliina
DNK prisutna u sisarskoj eliji je samo 800 puta vea od koliine DNK u bakteriji E.coli. 98%
humanog genoma je nepoznate funkcije. Naime, samo 2% humanog genoma ine geni, a o
ulozi ostatka DNK se veoma malo zna. Uloga ove nekodirajue DNK izgleda da je veoma
znaajna s obzirom da se prenosi iz generacije u generaciju.
Ve je u poslednjih 20 godina poznato da transpozoni mogu da uveaju genom dajui
repetativne DNK sekvence a tek od nedavno je postalo jasno da transpozoni mogu uzeti
uea i u znaajnom gubitku DNK. Studije iz 1998 god. sugeriu da je kukuruz koristio
amplifikaciju retrotranspozona da bi duplirao veliinu genoma sa 1.2 milijarde do 2.4 milijarde
baznih parova to se odigralo pre milion do 3 miliona godina. Ove promene se mogu odigrati
veoma brzo na evolutivnoj skali.
ak i veoma srodni organizmi se razlikuju po stepenu transpozon-posredovanih
izmena genoma. Ovaj fenomen moe pomoi u razumevanju paradoksa C vrednosti. Biljke
npr. pokazuju varijacije od 1000 puta u veliini genoma poevi od 125 miliona baznih
parova Arabidopsisa do ekstravagantnog genoma ornamentalnog ljiljana (Fritillaria) koji
sadri 120 milijardi baznih parova, to je 40 puta vie u odnosu na genom oveka. Postoje
nagovetaji da uslovi sredine mogu uticati na aktivnost transpozona, to moe pomoi
organizmu da se adaptira na promene spoljne sredine.
Veliko je pitanje ta restrukturiranje genoma donosi kao prednost datom organizmu.
Mali genomi se bre mogu replicirati to rezultira u brem elijskom ciklusu i kraem
vremenu generacije. Istraivanja obavljena 2000. godine sugeriu, sa druge strane, da i
veliki genomi mogu imati svoju prednost. ulman sa saradnicima je sakupljao primerke
divljeg pretka kultivisanog jema iz razliitih mikroklima u jednom kanjonu planine Karmel u
Izraelu. Pratili su sadraj odreenog tipa transpozona (BARE-1) i nali da ima tri puta vie
ovih retrotranspozona u biljkama koje rastu na vrhu kanjona u poreenju sa onima koje rastu
blizu dna kanjona. Ovi podaci sugeriu da biljke koje ive na veim visinama gube
retrotranspozone sporije u poreenju sa biljkama koje ive nie. injenica da biljke na vrhu
kanjona zadravaju vie kopija retrotranspozona sugerie, po ulmanu, da ovi elementi daju
biljci neku selektivnu prednost. ulman i saradnici predpostavljaju da vei genomi, nastali
prisustvom veeg broja retrotranspozona, mogu pomoi biljci da preivi stresne uslove visine
-
6
i sue tako to e uticati na fizioloku maineriju koja omoguava biljkama da trae ili zadre
vodu.
Druga grupa naunika sa Stanford univerziteta dola je do slinih podataka pokazavi
da UV zraenje moe aktivirati odreene mutatorske transpozone u polenu kukuruza. Ovo
sugerira da sunevo svetlo (prisutnije na vrhu kanjona nego na dnu u gornjem sluaju) moe
takoe biti sredinski faktor ukljuen u restrukturiranje genoma.
Tipovi sekvenci u eukariotskom genomu:
Struktura genoma viih eukariota je izuzetno sloena i vie od 90% genoma ne kodira
proteine. Genom ine razliiti tipovi transpozona, pseudogeni, kompletne ili delimine kopije
viralnih genoma, familije slinih ali ne identinih gena, tandemski ponovljene nizovi identinih
gena, itd. Na osnovu strukture i funkcije sekvence eukariotskog genoma se mogu podeliti na
sledee kategorije:
1. Geni
a) Usamljeni geni (unikalne sekvence)
b) Tandemski ponovljeni nizovi gena
c) Familije gena
2. Ponovljene sekvence
a) umereno ponovljene sekvence - mobilni genetiki elementi
b) visokorepetativne i tandemski ponovljene sekvence
Usamljeni protein kodirajui geni
Usamljeni protein kodirajui geni se nalaze u po jednoj kopiji po haploidnom genomu.
Oko 40% protein kodirajuih gena spada u ovu kategoriju.
Tandemski ponovljeni nizovi gena
Ogroman zahtev elije za molekulima ribozomskih RNK (rRNK) i transportnih RNK
(tRNK) moe biti zadovoljen samo kroz ekspresiju viestrukih kopija istog gena. Histoni,
glavni proteini hromatina, su neophodni u velikim koliinama prilikom replikacije DNK, tako
da su njihovi geni, takoe, prisutni u velikom broju kopija, i predstavljaju jedini gene za
proteine organizovane na takav nain. Tandemski ponovljeni nizovi gena se razlikuju od
dupliciranih gena genskih familija zato to viestruke identine kopije gena kodiraju za
identine funkcionalne RNK ili proteine. Najee se ponovljeni nizovi gena ponavljaju po
principu glava-rep.
Organizacija gena za ribozomske RNK
Ribozomska RNK je glavni proizvod transkripcije i ini oko 80 do 90% ukupne mase
elijske RNK, kako kod prokariota tako i kod eukariota.
Genom E. coli, koji sadri sve gene u po samo jednoj kopiji, ima ak 7 kopija gena za
rRNK i tRNK, kako bi bilo mogue formiranje 15 000 ribozoma, koliko je neophodno za brzu
sintezu proteina. Tokom ranog embrionalnog razvia oveka, mnoge embrionalne elije se
dele svakih 24 sata i sadre 5 do 10 miliona ribozoma. Da bi se sintetisalo dovoljno molekula
-
7
rRNK za formiranje ovolikog broja ribozoma potrebno je najmanje 100 kopija gena za rRNK,
koje e imati najvii nivo ekspresije, tako da veliki broj RNK polimeraza mora transkribovati
svaku kopiju gena za rRNK u isto vreme. Zaista, svi eukarioti, ukljuujui i kvasca, sadre 100
i vie kopija gena za sve vrste molekula rRNK (18S, 28S, 5,8S i 5S).
18S, 5,8S i 28S rRNK su kodirane velikim brojem identinih gena koji se tandemski
ponavljaju na jednom ili nekoliko lokusa u genomu. Regioni DNK sa genima sa rRNK se
esto oznavaju i kao rDNK. Kvantitativna analiza radioaktivno obeleene rRNK koja
hibridizuje sa odgovarajuom nuklearnom DNK (rDNK) pokazuje da rRNK geni mogu biti
locirani na nekoliko hromozoma, a da broj kopija varira od 50 do 10 000 po haploidnom
genomu to se razlikuje izmeu vrsta. Kod niih eukariota broj tandemski ponvljenih nizova
gena iznosi od 100 do 200, dok je kod viih eukariota nekoliko stotina, a kod nekih biljnih
vrsta ak i preko 5 000. U genomu oveka postoji oko 300 kopija gena za rRNK koje
mapiraju na kratkih ruicama 5 akrocentrinih hromozoma (13, 14, 15, 21 i 22). Na svakom
akrocentrinom hromozomu se nalazi oko 60 kopija i izraunato je da oko 0,4% genoma
oveka zauzma rDNK.
Geni za 18S, 5.8S i 28S rRNK se karakteriu osobinama koje su zajednike za sve
eukariote (slika 1). Prvo, svaki lokus sa rRNK genima je organizovan u duge tandemske
nizove koji se puno puta ponavljaju i tako da se deo koje se tanskribuje (transkripciona
jedinica) naizmenino smenjuje sa regionima (graninicima) koji se ne transkribuju (eng.
nontranscribe spacers). Duina graninika koji se ne transkribuju iznosi oko 2 kb kod abe i
oko 30 kb kod oveka. Drugo, transkripciona jedinica je organizovana na isti nain:
posmatrano u 5'3' smeru rasporeeni su gen za 18S, gen za 5,8S i gen za 28S rRNK.
Tree, geni za pojedinane rRNK su meusobno razdvojeni graninicima koji se transkribuju
(eng. transcribe spacers). Ovakav segment ini transkripcionu jedinicu koja daje pre-rRNK
duine 7,9 kb kod abe i 13,7 kb kod oveka. Specifinom posttranskripcionom obradom
pre-rRNK nastaju zrele rRNK. Razlike u duini transkripcione jedinice rRNK gena izmeu
razliitih vrsta potiu od razlika u duini transkribovanih graninika. Ovi graninici se u
posttranskripcionoj obradi pre-rRNK uklanjaju i brzo degraduju i smatra se da su potrebi za
pravilan folding rRNK, a nisu vie potrebni nakon to je folding zavren. U tandemskim
nizovima gena za rRNK transkripciona jedinica je identina kao sve druge kopije, dok
graninici koji se ne transkribuju, a nalaze se izmeu regiona koji se transkribuju, se mogu
razlikovati. Graninici koje se ne transkribuju sastoje se iz kratkih ponovljenih jedinica iji broj
varira, tako da se duine individualnih graninikamogu razlikovati.
Region u nukleusu u kome se deava sinteza rRNK ima karakteristian izgled i
oznaen je kao nukleolus, u kome se razlikuju nukleolarni organizator i fibrilarno jezgro
okrueno granularnom korom. Odreeni hromozomski region koji asocira sa nuklolusom
predstavlja nukleolarni organizator. Svaki nuklolarni organizator odgovara grupi tandemski
ponovljenih gena za rRNK na jednom hromozomu. Fibrilarno jezgro ine rRNK koje se
sintetiu sa tandemski ponovljenih gena aktivnou RNK polimeraze I, dok granularni
korteks ine ribonukleoproteinske partikule nastale asocijacijom obraenih zrelih rRNK i
ribozomskih proteina sintetisanih u citoplazmi. Dakle koncentracija tandemski ponovljenih
gena za rRNK, zajedno sa veoma intenzivnom transkripcijom i obradom pre-rRNK, kao i
deliminim formiranjem ribozomskih subjedinica je odgovorna za formiranje karakteristine
morfologije nukleolusa koja se vidi svetlosnim i elektronskim mikroskopom je rezultat obrade
pre-rRNK i formiranja ribozomskih subjedinica.
-
8
Slika 1. Organizacija gena za rRNK.
Organizacija gena za 5S rRNK
5S rRNK se sintetie odvojeno od ostalih rRNK. Geni koji kodiraju 120 nukleotida
dugu 5S rRNK, takoe, su organizovani kao tandemski ponovljeni nizovi koji sadre nekoliko
stotina do nekoliko stotina hiljada tandemskih ponovaka na jednom ili vie hromozoma. Ovi
geni su potpuno odvojeni od tandemski ponovljenih gena za druge tipove rRNK. Kod
Xenopus laevis, organizma kod koga je 5S rRNK najbolje okarakterisana, ponovljeni blok
ine 5S rRNK gen, pseudogen (segment 101bp duine 5S rRNK koji se ne transkribuje) i
jedan netranskribovani deo varijabilne duine od oko 400 bp. Kod penice postoje dve
glavne varijante ponovljenih gena za 5S rRNK duine 410 i 500 bp, a slina heterogenost
postoji i kod lana gde dve glavne varijante iaju duinu od 340 i 360 bp. U okviru svake od njih
gen za 5S rRNK zauzima 118 bp. 5S rRNK geni se transkribuju van nukleolusa RNK
polimerazom III. Nakon transkripcije 5S rRNK se transportuje u nukleolus radi inkorporacije u
veliku ribozomsku subjedinicu.
Organizacija gena transportne RNK
Geni za tRNK se, takoe, nalaze u viestrukim ponovljenim nizovima (vie stotina
gena za svaku tRNK vrstu po haploidnom genomu) ali organizacija ovih, oko 60 tipova gena,
je uglavnom malo poznata. Transkribuje ih RNK polimeraza III.
Organizacija gena za male nuklearne RNK
Male nuklearne RNK (snRNK) predstavljaju bitne konstituente nukleusa viih
eukariota i, takoe, su kodirane viestrukim kopijama identinih gena. Obino su geni za
snRNK tandemski ponovljeni i sadre samo jedan tip gena za odreenu snRNK. Ovi geni su
okrueni relativno konzerviranim sekvencama DNK, graninicima, dugim od 800 bp do 45
Kb, to se razlikuje izmeu vrsta. Na primer, lokus RNU2 koji kodira U2 snRNK kodoveka je
-
9
organizovan kao skoro perfektan tandemski niz koji sadri 5 do 22 kopije jedinice koja se
ponavlja, a ija jeduina 5,8 kb.
Kod ljudi i ostalih sisara pseudogeni za snRNK se nalaze u 10 puta veem broju u
odnosu na funkcionalne gene. Na primer, postoji 30 funkcionalnih gena za U1 snRNK na
hromozomu 1 kod oveka i oko 500 do 1 000 pseudogena za U1 snRNK. Neki pseudogeni
se razlikuju od funkcionalnih gena za samo jedan nukleotid i imaju homologne graninike
dok, drugi poseduju samo deo sekvence U1 snRNK, a ostatak DNK nema nikakve
homologije sa funkcionalnim genima. Ovih 500 do 1 000 pseudogena nalazi se razbacano po
celom genomu. Nedavno je pokazano da je broj pseudogena za U6 snRNK ak i vei.
Organizacija histonskih gena
Histoni su primarne proteinske komponente hromatina. Iako je na poetku smatrano
da su uglavnom ukljueni u pakovanju DNK kod eukariota, danas je poznato da imaju vanu
ulogu u ekspresiji gena zahvaljujui njihovim postranslacionim modifikacijama (epigenetika
regulacija). elija ima potrebu za koordinisanom sintezom ogromne koliine svkog tipa
histona tokom relativno kratke S faze elijskog ciklusa (oko 108 molekula u elijama sisara),
kao i za brzim organizovanjem roditeljskih i novosintetisanih histona u cilju formiranja
hromatina. Ovo je mogue zahvaljujui postojanju ponovljenih setova histonskih gena. Kod
veine organizama histonski geni su jedini geni koji kodiraju proteine a nalaze se u velikom
broju identinih ili skoro identinih kopija. Histonski geni spadaju u retke eukariotske gene
koji ne sadre introne.
Visoka potreba za histonima H2A, H2B, H3, H4 i H1 tokom S faze postie se
koordinisanom ekspresijom viestrukih kopija histonskih gena prisutnih kod svih metazoa.
Kod sisara postoji oko 75 razliitih histonskih iRNK. Geni koji kodiraju ove transkripte su
grupisani zajedno u genomima svih ispitivanih eukariotskih vrsta, i ove grupe gena tipino
sadre viestruke kopije gena koji kodiraju pet razliitih histona.
Histonski geni su organizovani u ponovljene setove (kvintete) sainjene od 5 razliitih
histonskih gena razdvojenih segmentima koji se ne transkribuju. Raspored gena i smer
transkripcije u kvintetima je evolutivno veoma dugo ouvan. Netranskribovane sekvence
izmeu gena veoma mnogo variraju izmeu vrsta, ali i izmeu ponovljenih kvinteta istog
genoma.
Kod razliith vrsta eukariota postoje dva tipa grupisanih gena histona: tandemski
ponovljeni setovi gena, u kojma jedinica ponavljanja sadri jednu kopiju svakog od pet
histonskih gena (slika 2), i "zbrkani" (eng. jumbled) setovi gena, u kojima ne postoji identian
raspored pet histonskih gena i u kojima pojedinani geni za svaku vrstu histona nisu
identini. Na primer, genom abe sadri tandemski ponovljne setove gena za histone, dok
genomi dok ptice i sisari imaju "zbrkane" setove histonskih gena.
Slika 2. Organizacija histonskih gena kod D. melanogaster.
-
10
Ne postoji korelacija izmeu veliine genoma i ukupnog broja histonskih gena. Na
primer, ptice i sisari imaju 10 do 20 kopija seta od 5 histonskih gena, vinska muica ima oko
100 (duine oko 5 kb), a morski je nekoliko stotina kopija. Dakle broj setova histonskih gena
u genomu D. melanogaster je nekoliko puta vei od broja setova histonskih gena kod sisara,
a njen genom je oko 20 puta manji od genoma sisara. Ovo znai da D. melanogaster ima
mnogo vie histonskih gena nego to je potrebno za elijski ciklus somatskih elija, sa
njihovm relativno dugom S fazom. Meutim, ovoliki broj histonskih gena bi mogao biti
potreban za kraj oogeneze kako bi obezbedio dovoljan broj histonskih proteina za rano
embrionalno razvie. Alternativno, svaki pojedinani gen bi mogao biti eksprimiran na
relativno niskom nivou. U oba sluaja, tandemski ponovljena organizacija gena obezbeuje
da se sintetie jednaki broj svake histonske iRNK, to ujedno daje i jedno od najverovatnijih
objanjenjenja zato je ovakva genomska organizacija histonskih gena zadrana tokom
evolucije.
Jedan od moguih razloga zato se setovi histonskih gena fiziki odravaju zajedno
tokom evolucije jeste da omogue definisanje nuklearnih subdomena u kojim se deava
efikasna sinteza histonskih iRNK. Naime fizika povezanost ponovljenih setova histonskih
gena omoguava da se oni dovedu do Kajalovih tela (eng. Cajal body), odnosno nukearnih
domena koji su specifino obogaeni faktorima neophodnim za ekspresiju histonskih gena. U
elijama sisara i u oocitama abe Kajalova tela sadre U7 snRNP, koja je neophodna za
specifinu obradu 3'-kraja histonskih iRNK, koje su jedine eukariotske iRNK koje ne sadre
poli-A rep. Kajalova tela, slino nuklearnim pegama (eng. nuclear speckles) sadre faktore
splajsovanja, i/ili imaju ulogu kao zalihe faktora za obradu ili predstavljaju sama mesta
obrade. Kajalova tela kod kimenjaka su, takoe, mesta sazrevanja snRNA i asembliranja
snRNP. Nalaze se na nekoliko mesta u nukleusu, ukljuujui i mesto koje je u blizini
histonskih gena u elijama sisara i u oocitama aba. U nukleusima elija D. melanogaster
postoji samo jedno Kajalovo telo i odvojeno telo, oznaeno kao telo hsitonskog lokusa (eng.
histone locus body, HlB). Smatra se da u ovim elijama Kajalovo telo ima funkciju u
sazrevanju snRNK, dok je HlB asocirano sa setovima histonskih gena i obradom histonske
pre-iRNK. Oba tela se nalaze u blizini nukleolusa i esto su blizu jedno drugom, ali se ne
preklapaju.
Pored ponovljenih setova histonskih gena za histone H2A, H2B, H3, H4 i H1, postoje
i geni za nekoliko varijantnih histona koji se ekprimiraju tokom celog elijskog ciklusa i ije
iRNK imaju poli-A repove. Glavne varijante histona jezgra su H3.3 i H2A.Z, koji markiraju
aktivne gene i prisutni su kod svih vieelijskih organizama.
-
11
Familije gena
Intenzivna istraivanja u otkrivanju sekvenci gena i proteina pokazala su da su mnogi
proteini viih organizama kodirani homolognim, ali ne i identinim genima, koji su tokom
evolucije nastali duplikacijom. Grupa gena koja je nastala duplikacijom predakog gena i
daljim promenama u sekvenci naziva se familija gena. lanovi familije gena mogu biti
grupisani zajedno na jednom hromozomu, obino na udaljenosti od 5 do 50 kb, ili mogu biti
rasporeeni na razliitim hromozomima, a nekada su u okviru jedne familije gena prisutna
oba tipa organizacije. Najee, familije gena sadre od nekoliko do 30 lanova, a postoje i
primeri sa nekoliko stotina lanova.
Inicijalni dogaaj koji omoguava postojanje srodnih sekvnci u genomu je
duplikacija, koja podrazumeva stvaranje kopije neke sekvence u genomu. Tandemska
duplikacija, pri kojoj duplikati ostaju zajedno, moe nastati usled greaka tokom
rekombinacije ili replikacije. Razdvajanje duplikata se moe desiti translokacijom, koja
premeta deo DNK sa jednog hromozomana drugi. Duplikat na novom mestu moe nastati i
transpozicijom koja je asocirana sa kopiranjem regiona DNK koji se nalazi u blizini
transpozona. Duplikacijom moe biti obuhvaen celi gen, grupa egzona ili pojedinani
egzoni. U sluaju duplikacije celog gena nastaju dve kopije gena ije se aktivnosti ne
razlikuju, ali one, obino, divergiraju jer vremenom akumuliraju razliite promene u sekvenci
(mutacije). Geni koji su nastali duplikacijom i zauzimaju razliite pozicije u genomu poznati
su i pod nazivom paralogni geni.
Familije gena se znaajno razlikuju u stepenu slinosti sekvence DNK izmeu
lanova, od onih koje se sastoje od skoro identinih lanova, do onih u kojima je slinost u
sekvenci DNK ograniena samo na delove koji kodiraju neki proteinski domen ili
karakteristine aminokiselinske motive. Na osnovu stepena srodnosti lanova, razlikuju se
sledee vrste familija gena: klasine familije gena, koje kodiraju proteine skoro identine
sekvence, familije gena koje kodiraju proteine sa velikim visoko-konzervisanim domenima i
familije gena koje kodiraju proteine sa veoma kratkim konzervisanim aminokiselinskim
motivima. Neki lanovi familija gena su vremenom postali nefunkcionalni jer je usled brzog
akumuliranja mutacija dolo do znaajne divergancije sekvencene, tako da predstavljaju
pseudogene ili genske fragmente.
Proteini kodirani lanovima neke familije gena predstavljaju familije proteina. Ukoliko
su kodirani klasinim familijama gena obino imaju srodne ili ak identine osobine i funkcije,
a eksprimiraju se u razliitim fazama razvia ili u razliitim tipovima elija. Proteini kodirani
lanovima gena koji imaju srodne samo neke egzone, mogu imati i razliite funkcije.
Danas, 10 godina nakon sekvnciranja genoma oveka i intenzivnog razvoja genomike
i proteomike, poznato je da genom oveka ima oko 21 000 gena, a da je proteom svih
plancentalnih sisara, ukljuujui i oveka, veoma slian. Kod ovih vsta, oko dve treine gena
koji kodiraju proteine su ortolozi (homologni geni razliitih vrsta koji potiu od zajednikog
predakog gena i po definicji zadravaju istu funkciju tokom evolucije), a najvei broj ostatka
pripada genskim familijama koje podleu regularnim duplikacijma i divergancijama. Stvaranje
evoluciono potpuno novih proteina je veoma retko.
-
12
Klasine familije gena
lanovi klasinih familija gena odlikuju se visokim stepenom homologije skevence
celog gena ili samo egzona. Ovakve sekvence su evoluciono i funkcionalno veoma srodne.
Knjiki primer za klasinu familiju gena je drevna familija globinskih gena, iji
proteinski produkti u ivotinjskom carstvu obavljaju transport kiseonika kroz krv. Postoje dve
familije globinskih gena, familija gena za globine i familija gena za globine. Obe familije
sadre po nekoliko gena koji kodiraju proteinske komponente hemoglobina. Geni jedne
globinske familije se eksprimiraju odreenim redolsedom u razliitim fazama razvia, tako da
su u eritrocitima embriona i adultne jedinke prisutni razliiti tipovi hemoglobina (slika X).
Prvi hemoglobin koji se sintetie u embrionu oveka je Hb1 predstavljen tetramerom
globina 22 ( zeta, epsilon). Osam nedelja nakon zaea, embrionalni globini bivaju
zamenjeni i globinima, koji formiraju fetalni hemoglobin, HbF. Globin se postepeno
zamenjuje globinom nekoliko nedelja pre roenja deteta. Adultni hemoglobin oveka, HbA,
ini tetramer i globina, 22. U krvi odrasle individue normalno je prisutno 97% HbA, 2%
HbA2 (izgraenog iz tetramera 22, pri emu je varijanta globina ) i 1% HbF.
Embrionalni i fetalni hemoglobin imaju vei afinitet za kiseonik, u odnosu na adultni, to je
neophodno za dobijanje kiseonika iz majine krvi. Familije globinskih gena su primer za
razvojnu kontrolu ekspresije gena, u kojoj se razliiti geni sukcesivno ukljuuju i iskljuuju
kako bi dali alternativne proizvode koji obavljaju istu funkciju u razliito vreme.
Geni za globine organizovani su u dve familije, i , koje se nalaze na razliitim
hromozomima. U genomu oveka familija globinskih gena nalazi se na hromozomu 16, dok
se familija globinskih gena nalazi na hromozomu 11. Kod oveka i mnogih drugih sisara,
raspored gena u okviru jedne familije odgovara njihovom redosledu eksprimiranja u procesu
razvia (slika 3). Suprotno, kod mia adultni globinski geni se nalaze pre embrionalnih.
Slika 3. i familija globinskih gena i espresija globinskih gean tokom razvia. i globinski geni su organizovani u posebne klastere (grupe) koje ukljuuju funkcionalne gene i pseudogene.
globinski loklus se prostire na preko 50 Kb i sadri 5 funkcionalnih gena i jedan
pseudogen. Geni globinskog lokusa navedeni po redosledu su: embrionalni , dva fetalna G i A, i dva adultna i . Izmeu gena A i nalazi se pseudogen . Geni G i A su
duplicirani geni za globine koji se razlikuju po tome da li na poziciji 136 sade glicin ili
-
13
alanin, redom. Pseudogen je netranskribovana relikvija stare duplikacije gena , koji ima
75% homologije sa genom . Osim navedenih gena globinski blok sadri i osam kopija Alu
sekvenci kao i dve kopije sekvenci iz familije Kpn (6Kb dugake umereno ponovljene DNK;
naziv su dobile po tome to veina od 10 000 lanova ove familije kod primata sadri
sekvencu koju prepoznaje restrikcioni enzim KpnI).
Alfa globinski blok zauzima preko 28Kb i sadri tri funkcionalna gena i 4 pseudogena:
embrionalni gen, pseudogen , dva pseudogena (2 i 1), dve kopije (1 i 2)
gena koje se neznatno razlikuju u sekvenci, a koje kodiraju identine polipeptide, i najzad
gen , nepoznate funkcije. Ovaj blok, takoe, sadri i tri Alu sekvence. Dva ili vie identina
gena, kao to su 1 i 2, prisutna na istom ili razliitim hromozomima u genomu su oznaeni
kao nealelske kopije ili nealelski geni.
Sekvence koje kodiraju proteine predstavljaju
-
14
Za razliku od sisara, kod kvasca samo jedan jedini aktinski gen zadovoljava sve potrebe
jednoelijskog organizma za ovim proteinom.
Kod sisara, ostali dobro izueni proteini kodirani familijama gena su albumin i
-fetoprotein (glavne komponente krvne plazme), serin proteaze, interferoni i imunoglobulini.
Familije gena za receptore mirisa, proteinske kinaze ili imunoglobuline su primeri familija
gena sa po nekoliko stotina lanova.
Familije gena koje kodiraju proteine sa dugim visoko-konzervisanim domenima
lanovi nekih familija gena dele sekvence za visoko-konzervisane aminokiselinske
domene, u kojima postoji posebno izraena homologija, dok je slinost u ostalom delu
kodirajue sekvence, kao i prosena slinost razliitih lanova familije sasvim mala. Ovakve
familije gena obino kodiraju transkripcione faktore, koji imaju vanu ulogu u ranom razviu,
a konzervisana sekvenca kodira proteinske domene koji se specifino vezuju za DNK ciljnih
gena (tabela 1).
HOX (eng. Homeobox) familija gena sadri 39 gena i oko 60 gena siroadi. Geni
siroad (eng. orphan genes) su geni koji imaju ogranienu filogenetsku distribuciju, tako da
ili nemaju otrologe kod drugih organizama, ili su njihovi ortolozi ogranieni na blisko srodne
vrste.
U genomu oveka postoje etri grupe HOX gena koje mapiraju na razliitim
hromozomima: grupa HOXA mapira na hromozomu 7, grupa HOXB na hromozomu 17,
grupa HOXC na hromozomu 12 i grupa HOXD na hromozomu 7 (slika 5). Pojedinani geni iz
grupe pokazuju veu slinost sa parnjakom iz druge grupe, u odnosu na ostale gene iz iste
grupe. Proteini HOX se odlikuju homoeodomenom od 60 amiokiselina. Njihova funkcija je da
kontroliu anteriorno-posteriornu osu i segmentaciju tokom razvia ("pattern" determiniui
geni koji odreuju plan organizma) (slika X).
Slika 5. Familija HOX gena oveka, i plan organizma koji odreuju.
PAX (eng. paired box) familija gena sadri 9 lanova koji se odlikuju
visoko-konzervianim DNK vezivnim domenom dugakim oko 130 aminokiselina. Proteini
-
15
PAX su transkripcioni regulatori sa vanom ulogom u formiranju tkiva i organa tokom
embrionalnog razvia. Nakon roenja, veina gena PAX se inaktivira, ali u nekim tkivima oni
ostaju aktivni i pomau regeneraciju tkiva i tite eliju od smrti usled elijskog stresa.
SOX (eng. SRY-related HMG-box genes) familija gena obuhvata 20 lanova, a prvi
otkriven je bio gen SRY, gen sisara koji mapira na Y hromozomu i odreuje pol. Homologija
izmeu ovih gena je ograniena na region koji kodira DNK vezivni domen oznaen kao
HMG. Proteini SOX su transkripcioni regulatori koji aktiviraju ili reprimiraju ekspresiju ciljnih
gena. Imaju kljunu ulogu u razliitim procesima razvia, kao to su rana embriogeneza,
gastrulacija, neuronalna indukcija, formiranje razliitih tikiva i organa, odreivanje sudbine i
diferencijacija mnogih tipova elija.
TBX (eng. T-box) familija gena sadri najmanje 17 lanova koji dele slian segment,
T-box, koji kodira DNK vezivni domen duine oko 170 aminokiselina. Proteini TBX su
transkripcioni regulatori vani za embrionalno razvie. Naroito su znaajni za normalno
razvie ruku i aka i srca.
FOX (eng. Forkhead box) familija gena ima oko 45 lanova kojima je zajedniko da
kodiraju domen forkhead, sekvencu od 80 do 100 aminokiselina koja je DNK vezivni domen.
Domen forkhead se naziva i "krilati" (eng. winged) heliks usled izgleda petlji u strukturi
proteina koja je nalik na leptira. Proteini FOX su transkripcioni regulatori ukljueni u procese
rasta elije, proliferacije i dugovenosti, a mnogi su vani i za embrionalno razvie. Gen
FOXP2 je vaan za procese u razviu koji dovode do razvoja govora i jezika.
Tabela 1. Primeri familija gena koje kodiraju proteine sa dugim visoko-konzervisanim domenima kod
oveka
Gene family Number of genes Sequence motif/domain
Homeobox genes
30 HOX genes (see Figure 14.5) plus ~60 30 gena homeobox genes
Homeobox specifies a homeodomain of ~60 amino acids. A wide variety of different subclasses have been defined
PAX genes 9 Paired box encodes a paired domain of ~130 amino acids; PAX genes often have in addition a type of homeodomain known as a paired-type homeodomain
SOX genes ~15 SRY-like HMG box which encodes a domain of ~70 amino acids
TBX genes ~15 T-Box which encodes a domain of ~170 amino acids
Forkhead domain genes
~45 The forkhead domain is about 110 amino acids long
POU domain genes
~15 The POU domain is ~150 amino acids long,
POU familija gena se sastoji od oko 15 lanova kojima je zajedniki segment koji
kodira domen POU dugaak oko 150 aminokiselina. Proteini familije POU su transkripcioni
faktori, od kojih su mnogi vani za razvie. Prvi geni ove familije koji su otkriveni, Pit1 i Oct2,
odgovorni su za aktivaciju ekspresije gena koja odreuje fenotip hipofize i limfocita. Najvei
broj lanova POU familije se eksprimira u adultnom mozgu, ali i tokom razvia nervnog
sistema.
Mutacije u razliitim lanovima familija HOX, PAX, SOX, TBX i FOX dovode do bolesti
koje se karakteriu nekompletnim razvojem tkiva u kojim se specifian gen eksprimira. Na
primer, mutacije u genu HOXD13 uzrokuju sinpolidaktiliju, dok su mutacije u genu FOXP2
povezane sa razvojnim poremeajima u govoru i jeziku kod osoba normalne inteligencije,
bez bilo kakvog znaajnog senzornog ili neurolokog poremeaja, a koje imaju znaajne
tekoe da steknu sposbnost ekspresivnog i/ili receptinog jezika. Ovaj poremeaj se
nasleuje na autozomno dominantan nain.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/n/hmg/A1680/figure/A1702/?report=objectonly
-
16
Familije gena koje kodiraju proteine sa veoma kratkim konzervisanim
aminokiselinskim motivima
Za lanove nekih familija gena se na osnovu sekvence DNK ne moe ba zakljuiti
da su srodni, ali oni kodiraju proteine koji se karakteriu zajednikom optom funkcijom. Ove
familije gena se definiu preko funkcionalno srodnih proteina koji imaju veoma kratke
konzervisane aminokiselinske motive.
Familija gena DEAD boks obuhvata nekoliko gena koji kodiraju proteine sa
funkcijom RNK helikaza i karakteriu se prisustvom osam kratkih konzervisanih motiva
aminokiselina, meu kojima je i sekvenca Asp-Glu-Ala-Asp, nazvana DEAD boks na osnovu
jednoslovnih oznaka za navedene aminokiseline (slika 6). RNK helikaze su enzimi koji tope
sekundarne strukture RNK i/ili otklanjaju proteine vezane za RNK. lanice familije DEAD
boks i srodne familije DExD boks koriste energiju hidrolize ATP-a da obave svoje funkcije.
Uestvuju u skoro svim koracima biogeneze iRNK: transkripciji, splajsovanju, editovanju,
transportu iz nukleusa u citoplazmu, remodelovanju iRNP, kao i u incijaciji translacije.
Familija gena ponovljenih WD motiva kodira regulatorne proteine. Obino se
karakteriu sa etri do osam tandemski ponovljenih motiva, fiksirane duine (27 do 45
aminokiselina), oznaenih kao centralno jezgro, koje sadri male konzervisane motive
aminokiselina ukljuujui i WD (Try-Asp) motive (slika 6). Proteini ove familije imaju
regulatornu funkciju u razliitim procesima u eliji: regulaciji elijske deobe, transkripciji,
prenosu signala kroz membrane, modifikacijama RNK.
Slika 6. Neke familije gena se definiu preko funkcionalno srodnih proteina koji imaju veoma konzervisane karatke motive aminokiselina: konsenzusni motivi familije DEAD boks (a) i familije ponovljenih WD motiva (b).
Familija gena ponovljenih ankirin motiva se karakterie sekvencama za tandemski
ponovljene motive dugake 33 aminokiselinska ostatka u kojim se odreena aminokiselina
nalazi na nekoliko pozicija. Proteini ove familije obavljaju razliite funkacije, ali su obino
ukljueni u interakcijama protein-protein.
Familija gena domena LIM kodira karakteristian domen duine 56 aminokiselinskih
ostataka koji je bogat cisteinom, i ukljuen je u interakcije protein-proetin.
-
17
Evolucija familija gena
Tokom evolucije familije gena su nastale duplikacijom u razliitim periodima, to se
ogleda u stepenu slinosti sekvence izmeu lanova jedne familije. Na osnovu stepena
slinosti u sekvenci izmeu dva gena moe se odrediti vreme kada se duplikacija desila.
Uopteno, slinija skevenca izmeu gena znai da potiu od predakog gena koji je postojao
u skorijoj prolosti u odnosu na predaki gen onih gena koji se danas vie razlikuju u
sekvenci. Usled genske konverzije mogu nastati sline ili identine kopije gena, u kojem
sluaju se na osnovu stepena slinosti u sekvenci ne moe odrediti vreme kada se
duplikacija desila. Duplikacija gena moe nastati usled greaka pri rekombinaciji (nejednaka
rekombinacije), greaka u replikaciji ili transpozicijom. Nastali duplicirani geni mogu
divergirati u razliite funkcionalne gene ili jedna kopija moe postati neaktivna.
U sluaju duplikacije celog gena, koja ukljuuje duplikaciju svih egzona i svih introna,
moe doi do nakupljanja mutacija u jednoj kopiji, a da ne doe do negativne selekcije. Ova
kopija moe zatim evolurati do neke nove aktivnosti: stei novu funkciju ili se moe
eksprimirati u razliito vreme ili mesto u odnosu na prvu kopiju. Na slici 7 je sumirana brzina
opisanih dogaaja. Postoji oko 1% verovatnoe da e dati gen podlei dulikaciji u periodu od
milion godina. Nakon duplikacije gena, razlike se akumuliraju kao rezultat deavanja razliitih
mutacija u svakoj kopiji. Pojedinane mutacije se akumuliraju brzinom od oko 0,1% za milion
godina.
Slika 7. Nakon duplikacije gena, u nastalim kopijama se akumuliraju razlike. Gen moe stei razliitu funkciju ili jedna od kopija moe postati neaktivna.
Nakon duplikacije gena i akumulacije razlika u sekvenci, moe se desiti da obe kopije
budu neophodne, ili da se jedna od kopija eliminie. U prvom sluaju, usled nastalih razlika
kopije gena kodiraju proteine sa razliitim funkcijama, ili se kopije gena eksprimiraju u
razlliitom tkivu ili vremenu. Ukoliko obe kopije nisu potrebne, jedan od gena e biti
-
18
eliminisan jer su se u njemu nakupile tetne mutacije. Za nastanak nefunkcinalne kopije
gena potrebno je oko 4 miliona godina. Sluajnost je kojae kopija postati neaktivna.
Analize genoma oveka pokazuju da oko 5% genoma predstavlja duplikacije
odreenih segmenata DNK duine 10 do 300 kb. One su nastale relativo skoro, to znai da
nije bilo dovoljno vremena za diverganiciju, koja bi eliminisala njihovu srodnost. Geni u ovim
duplikacijama bi mogli biti posebno interesantni upravo zbog implikacije da su skoro
evoluirali, i da su zbog toga mogli biti zanajni za skoriji evolucioni razvoj (na primer
razdvajanje oveka od majmuna).
Evolucija globinskih gena
Na osnovu organizacije pojedinanih globinskih gena razliitih vrsta mogue je pratiti
evoluciju sadanjih grupa globinskih gena. Funkcionalni globinski geni kod svih vrsta imaju
istu optu strukturu, sastoje se iz tri egzona i dva introna (slika 4). Smatra se da su svi i
globinski geni nastali duplikacijom, transpozicijom i mutacijama predakog gena koji je imao
tri egzona. Zajedniko poreklo sa globinskim genima imaju i geni za mioglobin i
leghemoglobin. Mioglobin je monomerni protein koji vezuje kiseonik i eksprimira se u
miinim lijama kimenjaka. Njegova aminokiselinska sekvenca ukazuje na zajedniko
poreklo sa globinskim genima. Leghemoglobin je monomerni protein koji vezuje kiseonik i
karakteristian je za mahunaste biljke. On takoe deli zajedniko poreklo sa drugim
proteinim koji vezuju hem. Zajedno, globini, mioglobin i leghemoglobin predstavljaju
superfamiliju globina, grupu familija gena koje vode poreklo od dalekog zajednikog
predakog gena. Sadanje shvatanje evolucije superfamilije globinskih gena je prikazanona
slici 8.
Gen za leghemoglobin biljaka je najverovatnije najsliniji predakom genu. Za razliku
od gena za mioglobin i globine, sdari tri introna, od kojih se prvi i poslednji nalaze nalaze na
mestima koja je homologna lokaciji dva introna u genima za mioglobin i globine (slika 8).
Centralni intron u genu za leghemoglobin razdvaja dva egzona, koja zajedno odgovaraju
sekvencu centralnog egzona u genima za mioglobin i globine. Smatra se da je centalni
egzon u genima za mioglobin i globine nastao fuzijom dva centralna egzona u predakom
genu, iako se ne moe potpuno iskljuiti mogunost da je jedan centralni egzon postojao u
predakom genu, koji je u sluaju leghemoglobina razdvojen insercijom introna tokom
evolucije biljaka.
Na osnovu sekvence mioglobina zakljuuje se da je on divergirao pre oko 800 miliona
godina. Neke primitivne ribe imaju samo jedan gen za globine, koji je divergirao tokom
evolucije pre nego to su se globinski geni duplicirali i divergirali u i varijante. Smatra se
da se to desilo pre oko 500 miliona godina, tokom evlucije koljoriba (Osteichthyes). Sledei
korak u evoluciji globinskih gena je predstavljen formiranjem zajednikog klastera i
globinskih gena, kakvu situaciju danas imamo kod X. laevis. Klaster globinskih gena aba
sadri i i globinske gene, kako larvalnog tako i adultnog stadijuma, tako da se smatra da
su ovi klasteri globinskih gena nastali duplikacijom vezanih parova i globinskih gena,
praene divergncijom individualnih kopija, a da se kasnije desila duplikacija kompletne grupe
globinskih gena. S obzirom da i kod ptica i sisara postoje odvojeni klasteri i globinskih
gena, njhovo fiziko razdvajanje, verovatno transpozicijom, se desilo pre nego to su ptice i
sisari divergirali od zajednikog pretka preko oko 270 milona godina. U okviru obe grupe
-
19
globinskih gena dalje su se deavale promene koje su dovele do divergenicije individualnih
gena u klasterima.
Slika 8. Evolucija superfamilije gloinskih gena: a) Svi geni superfamilije globina su evoluirali odserijom duplikacija, mutacijama i transpozicijom jednog predakog gena; b) gen za leghemoglobin ima jedan intron vie u odnosu na ostale gloinske gene, koji sekvencu gena za centralni domen proteina razdvaja na dva egzona;c) Na osnovu divergencije dva gena, koja se ogleda u procentu nesinonimnih supstitucija, moe se izraunati vreme kada su se geni razdvjili i napraviti.
Sekvence homolognih gena razliitih vrsta (ortologa) se razlikuju po nesinonimnim
(kada mutacija dovodi do promene aminokiseline) i/ili sinonimnim supstitucijama (kada
mutacija ne utie na sekvencu proteina). Sinomnimne substitucije se deavaju 10 puta ee
u odnosu na nesinonimne. Evoluciona divergencija dva proteina se meri procentom pozicija
na kojm su se desile nesinonimne supstitucije.
Brzina kojom se akumuliraju mutacije je karakteristina za svaki protein, pre svega u
zavisnosti kolika je njegova fleksiblinost da primi promene. U okviru jedne vrste, protein
-
20
evoluira mutacionim supstitucijama, koje su praene njihovom eliminacijom ili fiksacijom u
genskom poolu vrste. Treba imati u vidu da kada se ispituje genski pool neke vrste, detektuju
se varijante koje su "preivele". Kada su prisutne mnogobrojne varijante, one mogu biti
stabilne (jer nemaju selektivnu prednost) ili mogu biti prolazne jer su u procesu eliminacije.
U procesu specijacije, kada se jedna vrsta razdvoji na dve nove, svaka ima svoj
genski pool, koji evoluiraju nezavisno jedan od drugog. Poreenjem odgovarajuih proteina
dve vrste, detektuju se razlike koje su se akumulirale izmeu njih od vremena kada su
divergirale. Neki proteini su visoko-konzervisani i pokazuju malu razliku izmeu vrsta ili
razlike uopte nema. Ovo ukazuje da su skoro sve promene u takvim proteinima tetne i
podleu negativnoj selekciji.
S obzirom da se mutacije akumuliraju sa manjom ili veom brzinom nakon
razdvajanja gena, divergencija izmeu bilo kojeg para gena je proporcionalna vremenu kada
su se oni razdvojili. Razlika izmeu proteinski produkata takvih gena se izraava procentom
nesinonimnih supstitucija, odonso procentom pozicija na kojima se razlikuju aminokisleine
izmeu njih, to je poznato kao divergencija. Na osnovu poznavanja prosene uestalosti
nesinonimnih supstitucija tokom vremena, mogue je na osnovu broja utvrenih
nesinonimnih supstitucija izmeu dva ispitivana proteina izraunati kada su oni razdvojili u
prolosti.
Da li su pseudogeni bivi geni koji su mutirali i postali nefunkcionalni ili su to geni koji
evoluiraju u nove, budue gene?
Pseudogeni su kopije gena koje su pretrpele promene u sekvenci DNK i, uslovno
reeno, postale nefunkcionalne. Nastaju duplikaciojm gena (konvencionalni pseudogeni) ili
od iRNK koje su prepisane sa funkcionalnih gena, reverznom transkripcijom prevedene u
DNK i reintegrisane u genom (obraeni pseudogeni).
Konvencionali pseudogeni uglavnom zadravaju optu egzon-intron strukturu
funkcionalnog gena. Oni su inaktivirani mutacijama koje spreavaju bilo koji korak u
ekspresiji gena. Mutacije mogu onemoguiti transkripciju, splajsovanje, promeniti
egzon-intron granice, ili dovesti do stvaranja prevremenog stop kodona. Nakon duplikacije
gena, ako se jedna kopija inaktivira mutacijom, ona dalje bez ometanja moe akumulirati
nove mutacije, tako da pseudogeni obino sadre vei broj inaktivirajuih mutacija (slika X).
Pseudogeni koji predstavljaju neaktivne verzije sadanjih aktivnih gena prisutni su u mnogim
familijama gena, ukljuujui globinske, imunoglobinske, familiju histokompaibilnih antigena, i
obino su locirani u samom klasteru gena, najee izmeu aktivnih gena.
Ako su pseudogeni "mrtvi krajevi" evolucije, jednostavno neeljeni pratioci
rearaniranja funkcionalnih gena zato su jo uvek prisutni u genomu? Da li obavljaju neku
funkciju ili su potpuno bezkorisni, u kojem sluaju ne bi trebao da postoji selektivni pritisak za
njihovo zadravanje. ;eutim, trbalo bi se podsetiti da mi vidimo one gene koji su preiveli do
danas i prisutni su u populacijama. S obzirom da je genom veoma dinamian, mnogi
pseudogeni su u prolosti verovatno eliminisani. Njihvoa eliminacija se mogla iznenada desiti
delcijom sekvence ili su oni akumulirali toliko mutacija da se odreeni pseugoen vie ne
prepozanje kao originalnei lan neke familije gena (to je verovatno krajnja sudbina svih
psedogena koji nisu iznenada eliminisani). Mehanizmi koji su odgovorni za duplikacije,
delecije i rearaniranje klastera gena deluju na sve skevnence koje se prepoznaju klao
-
21
lanovi familije, bez obzira da li su oni funkcionalni ili ne, a selekciji je ostavljeno da napravi
diskriminaciju izmeu nastalih produkata ovih procesa.
Procenjuje se da genom oveka sadri oko 20 000 pseudogena. Interesantno je da su u
postgenomskoj eri opisani primeri da molekul RNK, prepisan sa pseudogena, regulie
ekspresiju homolognog gena koji kodira protein. Jo uvek nije poznato koliki procenat
pseudogena nosi genetiku informaciju za ovakve regulatorne molekule RNK. Iz ovakvih
razloga pseudogene bi trebalo a priori posmatrati kao "mrtve krajeve" evolucije, iako veliki
broj to definitivno jesu.
Slika 9. ft pseudogen globinskog klaster kunia ima istu organizaciju egzona i introna koa funkcionalni 1 gen, ali su se u njemu akumulirale mnoge inaktivirajue mutacije: delecija jednog baznog para na poziciji kodona 20 dovodi do mutacije kojamenja fazu iranja i dovodi nizvodno do stvaranja prevremenog stop kodona; nekoliko takastih mutacija se akumuliralo u poslednjim kodonima koji kodiraju aminokiseline koje su visoko-konzervisane u globinima; nijedan od dva introna vie ne poseduje prepoznatljiva mesta splajsovanja; usled mutacija u uzovodnom 5'-regionu ne dolazi do njegove transkripcije.
Nejednaki krosing over dovodi do rearaniranja u familijma gena
U klasterima identinih ili srodnih gena esto se deavaju rearanmani, to se moe
uoiti poreenjem na primer, globiskog klastera izmeu razliitih vrsta sisara (slika X). Geni
u globinskom klasteru razliitih vrsta sisara imaju istu funkciju i svi imaju istu optu
organizaciju, ali svaki gen je razliite duine. Takoe, postoje i razlike u ukupnom broju
globinskih gena prisutnih u klastrima razliitih vrsta, kao i razlike u broju i strukturi
pseudogena u njima. Sve ove promene su se desile nakon radijacije sisara, pre oko 85
miliona godina. Na osnovu ovog primera se moe zakljuiti da je rearaniranje gena u
klasterima jednako vaan faktor evolucije familija gena kao i akumuliranje takstih mutacije u
individualnim genima. Nejednaki krosing over se smatra glavnim mehanizmom koji dovodi do
reorganizacije gena.
-
22
Slika 10. Klasteri globinskih gena su prisutni kod svih kimenjaka i meusobno se razlikuju poduini pojedinanih gena, broju i rasporedu gena i pseudogena koji sdare. Ovakva organizacija globinskih klastera kod razliitih vrsta ukazuje da su mehnaizmi koji dovode do reorganizacije gena u klasterima jednako veni evolucioni faktoi kao i akumuliranje takastih mutacija u pojednanim genima.
Nejednaki krosing over (poznat i kao nereciprona rekombinacija) se deava kao
rezultat sparivanja izmeu dva mesta koja nisu homologna. Obino se homologna
rekombinacja deava izmeu sekvenci koje su tano sparene izmeu dva molekula DNK.
Meutim, u regionima homolognih hromozoma gde postoje dve kopije nekog gena
(nealelskih gena) ili tandemski ponovljene sekvence moe se desiti pogreno sparivanje,
usled ega dolazi do nejednakiog krosing overa, rekombinacije izmeu dva mesta koja nisu
homologna. Osobina koja ovaj dogaaj ini moguim je postojanje ponovljenih sekvenci i
nealalskih gena. Nejednaki korosing over omoguava da da se jedna kopija ponovljene
sekevnce sa jednog hromozoma pogreno spari sa neodgovarajuom kopijom drugog
hromozoma (slika 11). Nakon rekombinacije broj ponovljenih sekvenci u jednom
rekombinovanom hromozomu se poveava, a u drugom smanjuje. Zapravo, jedan
rekombinovani hromozom nosi deleciju (kontrakciju), a drugi duplikaciju (ekspanziju). Ovaj
mehanozam je odgovoran za evoluciju klastera gena i regiona sa visoko-ponovljenom DNK.
Slika 11. Nejednaki krosing over dovodi do pogrenog sparivanja regiona koji sadre ponovljene motive DNK. Ponovljeni motiv DNK na slici je ABC, i peti motiv crvenog hromozoma se sparuje sa treim crnog hromozoma. U regionu sprivanja dva hromozma jedinice ABC jednog hromozoma se sparuju sa jednicama ABC drugog hromozoma. Usled nekednakog krosing overa nastaju rkombinovani hromozomi sa 10 i 6 jedinica ABC, umesto sa po 8, koliko je bilo u originalnim.
-
23
U klasterima gena, pogreno sparivanje izmeu neaelskih gena dovodi do
nejednakog krosing overa. Nejdenaki krosing over u klasterima gena ima dve posledice,
promenu broja gena u rekombinovanim hromozomima i moguu promenu sekvence gena.
Naime, broj nelaleksih gena se na jednom hrmozomu smanjuje, a na drugom poveava
(slika 12). Ako se rekombincaija desi u okviru samog gena (a ne izmeu gena), rezultat
nejdenskog krosingovra zavisi da li su geni koji se rkombinuju identini ili slini. Ako su
nealelski geni koji su pogreno spareni potpuno homologni, nee doi do promene sekvence
u niti jednom od njih. Meutim, nejednaki korosing over moe dase desi i ako su sekvence
gena sline, mada je verovatnoa manja nego kada su identini. U ovom sluaju svaki od
rekombinovanih gena ima sekvencu kojase razlikuje od skvence originalnih.
Slika 12. Nejednakim krosing overom (nerecipronom rekombinacijom) moe se promeniti broj gena u genskom klasteru. Ako se gen 1 jednog hromozma pogreno spari sa genom 2 drugog hromozoma, presotale kopija gena se ne mogu meusobno spariti. Rekombinacijm izmeu pogreno sparenih gena nastaje jedan hromozom sa jednom (rekombinovanom) kopijom gena i jedan hromozom sa tri kopije gena ( jednom rekombinantnom i po jednom od oba roditelja).
Da li e hromozomi nastali nejednakim krosing overom imati selektivnu prednost ili ne
zavisi od posledica promena u sekvancama rekombinovanih gena kao i od promene broja
kopija gena. Smetnja nejednakom krosing overu je diskontinuirana struktura gena. U sluaju
globinskih gena, odgovoarajui egzoni susednih genskih kopija su dovoljno sline da bi
mogle da podr\e sparivanje, ali su sekvence introna znaajno razliite. Ovo ogranienje u
sparivanju egzona, znaajno smanjuje kontinuiranu duinu DNK koja moe biti sparena, to
-
24
smanjuje uestalost nejednakog krosing overa. Na ovaj nain divergaencija izmeu introna bi
mogla pojaavati stabilnost klastera gena ometajui deavanje nejednakog krosing overa.
Talasemije su autozomno recesivne bolesti izazvane mutacijama koje redukuju ili
spreavaju sinterezu gena ili globinskog klasetra. Deavanje krosing overa u globinskim
genima oveka je upravo otkriveno prirodom nekih hromozoma asociranih sa talasemijama.
Mnoge od najteih oblika talasemija su rezultat delecije dela jednog od klastera globinskih
gena (slika 13). U barem nekim sluajevima, krajevi delecije se nalaze u regionima koji su
homologni, to se upravo i oekuje ako su nastale nejdnakim krosing overom.
Varijacije u broju gena u globinskom klasteru se relativno este, to ukazuje da je
nejdnaki krosing over u ovom lokusu dovoljno est. Deavaju se ee nego u gobinskom
klasteru, a razlog za to su verovatno krai introni u globinskim genima, koji kao takvi
predstavljau manju smetnju za nejednaki krosing over. Kompletna delecija globinskog
klastera dovodi do hydrops fetalis, koji je fatalan pre roenja ili na samom roenju, a
podrazumeva abnormalo nakupljanje tenosti na nekoliko mesta u telu fetusa ili
novoroeneta.
Slika 13. Delecije globinskih gena u i klasterima uzrokuju razliite tipove talasemija. Beli pravougaonici oznaavaju deletirane regione usled nejednakog krosing overa sa natpisi iznad njih oznake za odreeni tip delecije.
Na osnovu razlika u grupama globinskih gena kod razliitih vrsta, moe se zakljuiti
da je duplikacija, nastala uglavnom nejednakim krosing overom, (nekada) praena
promenama u sekvenci bila vana odlika evolucije svake grupe gena. Talasemini hromozmi
oveka pokazuju da nejednaki krosing over nastavlja da se deava u obe grupe globinskih
gena. Svaki takav dogaaj dovodi do stvaranja kako duplikacije tako i delecije, koje imaju
odreene sudbine u populacijama. Delecije se, u principu, mogu desiti i usled rekombinacije
homolognih sekvenci istog hromozoma, kada se ne stvara odgovarajua duplikacija.
-
25
Uloga nejednakog krosing overa i genske konverzije u nastanku i odravanju
identinih sekvenci tandemski ponovljenih grupa gena
Nedostatak detektabilnih varijacija u sekveci molekula rRNK ukazuje da su sve kopije
svakog gena identine, ili da eventualno postoje razlike koje su ispod detektabilnog nivoa
(
-
26
paradoks multigenskih familija i bio je prvi opisani primer "udruene" evolucije, po kome
sekvence tandemski ponovljenih gena pokazuju tendenciju da evoluiraju zajedno, a ne da
divergiraju akumulacijom razliitih mutacija.
Udruena evolucija tandemski ponovljenih gena je posledica nejednakog krosing
overa i genske konverzije, procesa koji mogu dovesti do homogenizacije sekvence,
odnosno zadravanja iste sekvence u brojim kopijama gena. Nejednaki krosing over u okviru
dugih tandemski ponovljenih nizova, kao to su geni za rRNK, moe dovesti do irenja neke
nasumine varijante sekvence kroz populaciju gena procesom koji je analogan genetikom
driftu u popualaciji organizama. Genska konverzija podrazumeva direknu konverziju jedne
sekvence u druge, kada se sekvence spare za vreme mitoze ili mejoze.
Kada hromozom nosi nealelske gene, moe doi do nejednakog krosingovera
izmeu homolognih segmenata pogreno sparenih (eng. "missaligned"" ili mispairing")
hromozoma, tako segment sa tandemski ponovljenim genima na jednom hromozomu postaje
dui, a na drugom krai, odnosno nastali hromozomi sadre manji i vei broj ponovljenih
jedinica u odnosu na originalne. Kod gena za rRNK, u okviru jedinice koja se ponavlja
postoje variranja u duini graninika koji se ne transkribuju dok su sekvence transkripcionih
jedinica identine. Meutim, bez obzira na varijacije u duini, sekvence graninika koje se ne
transkribuju su meusobno homologne. Razlog za to je to se graninici koji se ne
transkribuju sastoje iz nekoliko ponovljenih regiona, tako da varijacije u njihovoj duini potiu
od razlika u broju ponovljenih regiona. Upravo ove razlike u duini graninika koji se ne
transkribuju, a koji se sastoje iz vie tipova ponovljenih regiona, ukazuju da se esto deava
nejednaki krosing over. Nejednakim krosing overom menja se ukupna duina grupe
tandemski ponovljenih gena, ali ne i osobine pojedinanih jedinica koje se ponavljaju. Zato
mehanizmom nejednakog krosing overa stalno dolazi do kontinuiranih kontrakcija i
ekspanizija tandemski ponovljene grupe gena (promene broja ponvaljajuih jedinica), a
istovremeno se spreava akumulacija promena (mutacija) u kopijama samih transkripcionih
jedinica, odnosno omoguava se njihova homogenizacija.
Model fiksacije krosing overom predvia da je kompletna grupa tandemski
ponovljenih gena podloena rearaniranju mehanizmom nejednakog krosing overa. Ovaj
model moe objasniti udruenu evoluciju ponovljenih gena, ako nejednaki krosing over
omoguava da svi ponovljeni geni fiziki nastanu od jedne kopije. Tandemska organizacija
omoguava esto pogreno sparivanje gena ije su sekvence identine, ali se nalaze na
razliitim mestima u okviru ponovljenog niza. Kontinuiranim kontrakcijama i ekspanzijama,
odnosno smanjenjem ili poveanjem broja ponovljenih jedinica, mogue je da su sve
ponovljene jedinice u nizu nastale od male proporcije ponovljenih jedinica koje su bile
prisutne u predakom nizu. Razliite duine graninika koji se ne transkribuju u genima za
rRNK su u skladu sa idejom da se nejednaki krosing over deava u okviru ovog graninika
ije se ponovljene jedinice mogu pogreno spariti. Ovo ujedno objanjava homogenost
izmeu transkripcionih jedinica i istovremenu varijabilnost u graninicima. Kada se
individuana ponvaljajua jedinica amplifikuje unutar klastera transkripciona jedinica postaje
podlona selekciji, dok graninici ne, i oni mogu akumulirati promene.
Nejednakim krosing overom nastaju rekombinacioni produkti sa razliitim brojevim
jedinica koje se ponavljaju. U jednom sluaju, tandemski ponovljeni niz e biti dui, a u
drugom krai (slika 11). Ako je nejednaki krosing over est, grupe tandemski ponovljenih
gena e biti podlone kontinuiranim ekspanzijama i kontrakcijama.
-
27
Nejedanaki krosing over moe dovesti i do toga da se odreena jedinica ponavljanja
rairi du grupe ponovljenih gena (slika 14). Pretpostavimo da se grupa gena inicijalno
sastoji od pet jedinica ponavaljanja, oznaenih sa po jednim slovom "abcde". Razliite
jedinice ponavljanja su toliko srodne da se moe doi do pogrenog sparivanja prilikom
rekombinacije. Zatim, serijom nejednakih rekombinacionih dogaaja, veliina ponovljenog
regiona se poveava ili smanjuje, i istovremeno jedna jedinica ponavljanja ("b") se iri i
zamenjuje druge jedinice ponavljanja. Model fiksacije krosing overom predvia da e bilo
koja sekvenca DNK koja nije pod selektivnim pritiskom biti zadrana u seriji identinih
ponovljenih jedinica generisanih na ovaj nain. Treba imati na umu da je proces fikasacije
krosing overom mnogo bri u odnosu na uestalost mutacija, tako da se nove mutacije koje
nastaju u ponovljenim jedinicama se ili eleiminiu (ako se takvi ponovci izgube) ili se brzo
raire po celoj grupi. Model fikasacije krosing overom ima dve posledice: kontinuiranu
promenu duine tandemski ponovljenoih nizova i homogenizaciju jedinica koje se u okviru
njih ponvaljaju.
Slika 14. Nejednaka rekombinacija omoguava da odreena jedinica koja se ponavlja (jedinica "b") okupira kompletnu grupu gena. Brojevi oznaavaju broj ponovljenih jedinica u svakom koraku.
-
28
Mehanizam genske konverzije podrazumeva da jedan lan tandemski ponovljene
grupe gena koriguje susedni, tako da dolazi do promene sekvence u lanu koji se koriguje,
dok sekvenca drugog koji slui kao matrica za korigovanje ostaje nepromenjena. Dakle,
smatra se da genska konverzija efikasno konvertuje sekvencu jednog nealelskog gena u
sekvencu drugog.
Jo jedno interesantno pitanje, na koje jo nemamo odgovor, je kako korektivni
mehanizmi, koji gene za rRNK u okviru jedne grupe (klastera) odravaju konsatantnim,
deluju na grupe gena za rRNK rasporeene na razliitim hromozomima? ak i multigenske
familije koje nisu tandemski ponovljene uspevaju da ouvaju homogenost. Tako npr. osam
identinih gena koji kodiraju tirozin tRNK u kvascu su locirani na osam razliitih hromozoma i
uspeno sadravaju homogenost. Ovih osam gena oigledno koevoluira: njihove sekvence
se istovremeno menjaju. Do danas nije jasno kako osam gena razbacanih na osam
hromozoma medjusobno komunicira?
-
29
Retrotranspozoni bez dugakih terminalnih ponovaka (SINE i LINE)
Retrotranspozoni bez dugih terminalnih ponovaka (eng. long terminal repeats, LTR)
obuhvataju kratke rasute elemente po genomu (eng. short interspersed elements, SINE) i
dugake rasute elemente po genomu (eng. long interspersed elements, LINE). Elementi L1 i
Alu su se toliko umnoili tokom poslednjih 80 miliona godina evolucije primata da danas
zauzimaju jednu treinu genoma oveka (slika 15). Iako dugo posmatrani kao DNK "smee"
(eng. "junk" DNA), danas je poznato da svoj efekat na genom ostvaruju na mnogo razliitih
naina: stvaraju insercione mutacije, dovode do genomske nestabilnosti, inciraju
rekombinaciju, utiu na promene u ekpresiji gena, ali doprinose i genetikim inovacijama
(stvaranju novih funkcionalnih gena). Skevenciranje genoma oveka i ostalih primata
omoguilo je da se bolje razume stepen i sloenost doprinosa koji su proli i dananji
retrotranspozoni bez LTR-ova imali u oblikovanju genoma oveka tokom evolucije. Meutim,
i dalje postoji debata meu naunicima o tome da li su ovi elementi intraelijski "paraziti" koji
napadaju genom domaina i koriste elijske resurse, ili ih elija tolerie zbog povremenih
pozitivnih uticaja na evoluciju genoma.
Slika 15. a) Sadraj transpozona u genomu oveka; b) element L1; c) element Alu.
Alu elementi
Alu elementi pripadaju retrotranspozonima SINE. Sa jedan milion kopija, koje okupiraju oko
10,5% genoma oveka, Alu elementi su najuspeniji retrotranspozoni koji su "okupirali" na
genom kroz kontinuiranu transpoziciju u poslednjih 65 miliona godina. Procenjuje se da se
prilino jedna insercija Alu elementa deava kod svake dvadesete roene osobe. Ime su
dobili po tome to sadre restirkciono mesto za enzim Alu I.
Alu elementi su dugaki oko 300 bp i odlikuju se dimernom strukturom nastalom
fuzijom dva monomera (ruica) koji potiu od 7SL RNK (male RNK koja je komponenta
ribonukleoproteinske partikule za prepoznavanje signalnog peptida, esencijalanog za
translokaciju novosintetisanih proteina kroz membrane endoplazmatinog retikuluma kod
viih eukariota). Monomeri su razdvojeni linker regionom bogatom adeninskim ostacima.
5'-monomer sadri unutranji promotor za Pol III sastavljen od elemenata A i B. Na samom
3'-kraju sadri rep bogat adeninskim ostacima duine oko 100 bp. Alu elementi se
transkribuju sa Pol III na strogo regulisan nain brojnim cis i trans faktorima. Ne poseduju
signal za terminaciju transkripcije sa Pol III, tako da se proces nastavlja nizvodno od Alu
elemenata, sve dok se na naie signal za terminaciju. Alu elementi ne kodiraju proteine, tako
-
30
da predstavljaju neautnomne transpozibilne elemente koji unamljuju maineriju za
retrotranspoziciju kodiranu elementima L1. Zbog ove osobine ih zovu i "parazti parazita.
Alu elementi su meusobno veoma sline i pokazuje u proseku 80 do 90% homologije sa
svojom konsenzusnom sekvencom. Alu elementi se najee nalaze u intronima, 3'
netranslatiranim regionima gena kao i u intergenskim regionima. Pokazano je da se Alu
sekvence preferencijalno akumuliraju u regionima genoma bogatim genima.
SINE elementi u genomu mia su B1 element, zastupljen sa 550 000 kopija, i B2
element, zastupljen sa 350 000 kopija, tako da zajedno zauzimaju oko 5% genoma. B1 i B2
elementi, kao i Alu, pripadaju retrotranspozonima SINE. B1 SINE potiu od 7SL RNK, dok B2
SINE potie od tRNK. B1 su dugaki oko 135 nukleotida i odgovaraju levoj ruici elementa
Alu. B2 su dugaki oko 200 nukleotida. Kao i Alu, B1 i B2 SINE sadre promotorske
elemente za Pol III (A i B boksove).
Prisustvo ovih elemenata u ogromnom broju kopija koje se odravaju milionima
godina, moe da ukae da one imaju neku funkciju i da daju neku selektivnu prednosti
genomu domainu. Otkrie da se ovi elementi transkribuju sa Pol III i da se broj njihovih Pol
III transkripata znaajno poveava u uslovima elijskog stresa, dovelo je do pretpostavke da
su SINE RNK funkcionalne. Poslednjih godina pokazano je da se ovi elementi transkribuju i
sa Pol II, kada predstavljaju samo delove Pol II transkripata. Postoji sve vie dokaza da Pol
III SINE i Pol II transkripti koji sadre SINE uestvuju u kontroli ekspresije gena na vie
razliitih naina: represija transkripcije, kada kao trans faktori stupaju u dirketnu intrkciju sa
Pol II, invertovane Alu sekvence u Pol II transkriptima su mesta editovanja A-u-I, i kada se to
desi u 3'-UTR-u transkripta on biva zadran u nukleusu i njegova ekspresija se reprimira,
utiu na altrnativno splajsovanje kroz posedovanje potencijalnih 5'- i 3'- mesta splajsovanja.
Funkcije Alu, B1 i B2 Pol III transkripata
U elijama oveka Alu RNK se eskprimiraju na niskom nivou, ali u uslovima
fiziolokog stresa, kao to su toplotni stres, virusna infekcija, poveanje koncentracije
etanola, izlaganje UV svetlu i gama radijaciji, nivo Alu RNK se znaajno i prolazno poveava.
Pokazano je da poveanje nivoa Alu RNK u uslovima toplotnog stresa korelie sa
remodelovanjem hromatina, ime se verovatno poveava dostupnost unutranjih Alu
promotorskih elemenata. Poveanje nivoa Alu RNK u uslovima nekih virusnih infekcija
vezano je za poveanu aktivnost transkripcionog faktora TFIIIC, koji se vezuje za
promotorski element B boks. U navedenim tipovima fiziolokog stresa dolazi i do poveanja
nivoa B1 i B2 RNK kod mia. Tako je pokazano da se maksimalno poveanje nivoa B1 i B2
RNK kod mia deava 1 do 3 sata nakon stresa izazvanog toplotom. Nakon uzimanja
etanola nivo ovih RNK kod mia se takoe poveava, a sa smanjenjem koncentracije etanole
u periodu oporavka od oka, smanjuje se i nivo ekspresije B1 i B2 elemenata.
Izgleda da u uslovima fiziolokog stresa Alu, B1 i B2 RNK vezuju proteinsku kinazu
koje se aktivira sa dvolananom DNK (PKR) i negativno je reguliu. PKR ima vanu ulogu u
odbrani od virusa koju ostvaruje fosforilacijom eIF2, to vodi do globalne inhibicije
translacije u eliji.
Pol II sintetie sve iRNK u elijama eukariota, delujui orkestrirano sa optim
transkripcionim faktorima da bi pokrenula transkripciju sa odreenog promotora.
Transkripcija pomou Pol II je visoko regulisana transkripcionim regulatorima, regulatornim
elementima DNK i strukturom hromatina. Odnedavno je poznato da u regulaciji transkripcije
-
31
sa Pol II vanu ulogu imaju nekodirajue RNK (eng. non-coding RNA, nc-RNK).
Transkripciona represija sa Alu i B2 RNK je bila meu prvim opisanim primerima u kojima in
trans regulatornu funkciju u transkripciji pomou Pol II imaju nc-RNK.
U uslovima toplotnog oka, dolazi do poveanja ekspresije SINE RNK, dok se opti
nivo transkripcije sa Pol II smanjuje. Na primer, smanjuje se ekspresija gena kuepazitelja.
Meu retkim genima ija se ekpresija u ovim uslovima znaajno poveava spadaju geni za
proteine toplotnog stresa. Alu i B2 RNK su izgleda odgovorne za optu transkripcionu
represiju gena kuepazitelja tokom odgovora na toplotni ok. Ovu funkciju ostvaruju kao
trans faktori koji asmbliraju sa Pol II na promotorima i potencijalno reprimiraju transkripciju
(slika 16). Pokazano je da se u in vitro uslovima Alu i B2 RNK direktno vezuju za Pol II.
Slika 16. In trans represija Pol II transkripcije pomou Alu RNK. Nakon toplotnog oka, sinteza B1 i B2 RNK u elijama mia i Alu RNK u elijama oveka, pomou Pol III, se poveava. Nastale SINE RNK inhibiraju transkripciju gena kuepazitelja kroz dirkektnu intrakciju sa Pol II.
Funkcija Alu RNK koje su deo Pol II transkripata (iRNK)
Analiza distribucije Alu elemenata u genomu pokazuje da skoro 75% gena koji
kodiraju proteine sadre Alu insercije sa preferncijalnom lokalizacijom u intronima i
3'-UTR-ovima. Kao rezultat ovakve lokalizacije. Alu elementi su prisutni u transkriptima koje
sintetie Pol II. Za ovakeve Alu RNK je pokazano da intenzivno podleu editovanju A-u-I,
doprinosei nuklearnoj retenciji transkripta i utiavanju ekspresije gena. Ovakve Alu RNK
uestvuju i u modulaciji alternativnog splajsovanja.
Promenom skevence RNK u odnosu na sekvencu DNK, mainerija za editovanje
RNK ima mogunost da znaajno povea diverzitet proteoma. Specifini tip editovanja RNK,
koji je neophodan za normalno razvie kimenjaka, je dezaminacija adenozina u inozin
(A-u-I) u okviru dvolnane RNK. Ovaj proces katalizuju enzimi adenozin dezaminaze koje
deluju na RNK (ADAR1-3). ADAR1 i ADAR2 se eksprimiraju u svim tkivima, dok se ADAR3
specifino eksprimira u mozgu. Editorska aktivnost ADAR3 jo nije potvrena. Promena A u I
za posledicu ima da mainerije za translaciju i splajsovanje I prepoznaju kao G, to moe
dovesti do promene znaenja kodona i stvaranja novih mesta splajsovanja. Pored ovoga
editovanje A-u-I moe promeniti stabilnost RNK stvaranjem destabilizujueg wobble para I-U
i stabilizujueg para I-C.
Genomske analize u kojima je poreena sekvenca ogromnog broja cDNK sa
sekvencom genomske DNK su pokazale da su Alu elementi primarni targeti editovanja A-u-I.
Procenjeno je da se 90% editovanja A-u-I deava u Alu elementima prepisanim u Pol II
-
32
transkriptima. U okviru 1 400 gena detektovano je ak 14 000 mesta editovanja, koje se
deava vie puta u okviru jednog Alu elementa.
Supstrati za ADAR enzime su bazno spareni A u dvolnanim regionima RNK. Alu
elemnti postaju supstrati za editovanje enzimima ADAR, jer u transkriptu susedni Alu
elementi suprotnih orjentacija mogu meusobno da se spare i formiraju dovoljno dugaku
dvolananu RNK u samom transkriptu, koju kao svoj supstrat prepoznaje ADAR, i obino
edituje vei broj A (slika 17).
Slika 17. Alu RNK u Pol II transkriptima su spstrat za editovanje A-u-I. Dva susedna elementa Alu invertovanih orjentacija u 3'-UTR-u, formiraju karakteistinu skundarnu strukturu sa dugim dvolananim regionom, koji je idealni supstrat za dezaminaciju A-u-I katalizovanu enzimima ADAR. Editovani dupleks Alu vezuje protein p54nrb, usled ega se transkript zadrava u nukleusu.
Znaaj ove vrste editovanja jo nije potpuno razjanjen. Za sada se zna da editovanje
Alu sekvenci u 3'-UTR-ovima Pol II transkripata moe dovesti do reprimiranja ekspresije
gena usled nuklearne retencije transkripta. Za inozine u dvolnaanom editovanom regionu
iRNK, sa visokom specifinou vezuje se protein p54nrb.
Postoji ideja da bi i Alu RNK i Pol III, takoe mogle biti supstrat za A-u-I editovanje.
Stvaranjem veeg broja produkata od pre-iRNK prepisane sa jednog gena, alternativno
splajsovanje znaajno poveva diverzitet transkriptoma i proteoma. Preko 90% gena u
genomu oveka podlee alternativnom splajsovanju, u najveem broju sluajeva na tkivno
specifian nain. Alu sekvence u molekulima pre-iRNK doprinose alternativnom splajsovanju.
ak se smatra da su ovakve Alu sekvence bile glavna pokretaka snaga evolucije oveka,
jer su upravo one omoguile da se oprobavaju razliite forme proteina, od kojih su opstale
one sa selektivnom prednou.
Konsenzusna sekvenca Alu RNK sadri vei broj potencijalnih 5'- i 3'-mesta
splajsovanja, kako u sense tako i u antisense lancu (slika 18). Alu sekvnca koja se nalazi u
intronu pre-iRNK ima potencijal da postane deo egzona, ugranjom jednog dela Alu
sekvence u zrelu iRNK (slika 18). Interesantno je da se geni koji sadre Alu element u
-
33
intronima predominantno altrnativno splajsuju dajui izoformu sa i bez dela sekvence Alu.
Jedna od pre-iRNK koja je dobro pruan primer za ovakvo altenativno splajsovanje je
ADAR2 pre-iRNK. Kao rezultat alternativnog splajsovanja nastaje proteinksa izoforma koja
ima dodatnih 40 aminokiselina.
Slika 18. Alu sekvence u iRNK i alternativno splajsovanje. a) Shematski prikaz potencijalnih mesta splajsovanja. Strelice iznad elementa ALu oznavaju potencijalna 5'-mesta splajsovanja, a ispod 3'-mesta splajsovanja. b) Egzonizacija Alu RNK, do koje je dolo nakon prepoznavanja mesta splajsovanja u elementu Alu.
Poreenjem zastupljenosti editovanja u razliitim tkivima pokazano je da je ono retko
(1%) u krvi, miiima i pankreasu, da je zastupljeno sa 8,2% u prostati, 12,8% u timusu, i
generalno tri puta ee u modanom u odnosu na ostala tkiva. Editovanje A-u-I je mnogo
zastupljenije kod oveka u odnosu na mieve, i 90% ovog poveanja vezano je za editovanje
Alu elemenata u Pol II transkriptima.