Cn Higalim 3 Crescimento 2010
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Universidade dos Açores
Departamento de Ciências Agrárias
Curso de Ciências da Nutrição
HIGIENE ALIMENTAR
3. Crescimento e sobrevivência dos microrganismos nos alimentos
Objectivos
• Descrever matematicamente o crescimento
microbiano nos alimentos
• Conhecer os factores que afectam o
crescimento microbiano
• Compreender os efeitos dos diferentes
factores sobre os aspectos quantitativos e
qualitativos das populações microbianas dos
alimentos
Objectivos
• Compreender o impacto da ecologia
microbiana sobre a segurança e a vida de
prateleira dos alimentos
• Compreender as bases teóricas empregues
para prever a segurança e a vida de
prateleira dos alimentos
• Conhecer os principais tipos de modelos
empregues em previsões microbiológicas
Conteúdos
3.1. Crescimento microbiano e sua expressão matemática
3.2. Factores que afectam o crescimento microbiano
3.3. Previsão do crescimento microbiano. Modelos e sua
utilização
3.1. Crescimento microbiano e
sua expressão matemática
Introdução: – Definição
– Características
– Sistemas abertos, sistemas fechados
• Expressão matemática do crescimento em sistemas fechados – a curva do crescimento microbiano e suas fases
• Expressão matemática do crescimento exponencial
• Efeito da taxa de crescimento sobre o nível populacional atingido
Crescimento microbiano
= aumento organizado de todos os
constituintes celulares
• Crescimento microbiano:
– Celular – aumento das dimensões das
células
– Populacional – aumento do número de
indivíduos duma população
Ambientes para o
crescimento microbiano
• Meios líquidos – Caldos
– Urina
– Bebidas
– Lamas activadas
• Meios sólidos – Agares
– Carne
– Solos
– Tecidos animais e vegetais
• Meios semi-sólidos
– Meios laboratoriais
– Certos alimentos
• Biofilmes
Biofilme de E. coli O157:H7
Ambientes para o
crescimento microbiano
• Sistemas fechados: – Como nas culturas por lotes
– Ausência de inputs e de outputs de materiais a partir do momento da inoculação
– Crescimento descontínuo
– Tanto o ambiente como o microrganismo estão permanentemente em mudança
– Apenas se encontram estados transitórios (instáveis)
– Crescimento nos alimentos acabados, matérias-primas
Ambientes para o
crescimento microbiano
• Sistemas
abertos:
– Como nas
culturas
contínuas
– Ex.:
quimióstato
– Certas linhas de
processamento
Ambientes para o
crescimento microbiano
• Sistemas abertos:
– condições de estado estável
– os valores médios de todas as
propriedades dos microrganismos e da
cultura mantêm-se constantes
– Os inputs de subtratos para o
crescimento e os outputs de células e
meio usado encontram-se equilibrados
Expressão matemática do crescimento
microbiano em sistema fechado
• Processo autocatalítico:
– só se verifica se houver pelo menos uma
célula viável
– a taxa de crescimento aumenta com o
aumento da biomassa viável presente
Expressão matemática
do crescimento microbiano em sistema fechado
dx/dt = μ (1)
em que:
• dx/dt = variação da biomassa (nº. de células
ou massa celular
• x = número de microrganismos ou massa
celular
• t = tempo
• μ = taxa específica de crescimento
(constante)
Expressão matemática do crescimento
microbiano em sistema fechado
• Padrão exponencial de crescimento
• Verifica-se nas bactérias e também nos
fungos:
– Aumento da extensão e grau de
ramificação das hifas
– Melhor medir o seu crescimento por
determinação da biomassa
Expressão matemática do crescimento
microbiano em sistema fechado
• Integrando a equação (1):
x = x0eμt (2)
• Tomando os logaritmos naturais e rearranjando:
ln x/x0 = μt (3)
em que x0 é a biomassa presente quando t = 0
Tempo de geração
duma população microbiana, τ
• Pode ser obtido substituindo x por 2x0
na equação 3:
τ = ln 2/μ = 0,693/ μ (4)
• Ou:
x = x02tτ (5)
Fases da curva de
crescimento
• Fase de latência
• Fase exponencial ou logarítmica
• Fase estacionária
• Fase de morte
Fase de latência
• não se distingue crescimento
• adaptação do inóculo ao novo
ambiente
– Síntese das enzimas necessárias
– Reparação de eventuais lesões
resultantes de danos anteriores duração
variável (pode mesmo ser inexistente
• = 0
Fase exponencial
• aumento do número de células
• declive da recta que representa esta
fase = taxa específica de crescimento
(μ)
• μ = aumento do número de células ou
da massa celular por unidade de tempo
• μ é constante
• μ varia consoante:
– o microrganismo
– os factores ambientais (temperatura, pH,
etc.)
Fase exponencial
• Todas as células estão viáveis e
mantêm o seu tamanho constante:
– a massa celular e o número de células
aumentam proporcionalmente.
• as alterações do meio fazem com que
esta fase termine:
• nutrientes chave vão escasseando
• metabolitos inibidores vão-se
acumulando
Fase estacionária
• A taxa de crescimento é nula
• Não se verifica um aumento do número
de células
• O metabolismo celular continua a
ocorrer
Fase de morte ou declínio
• O número de células viáveis sofre uma
diminuição progressiva.
• A cinética da morte microbiana é
exponencial
• Taxa de morte << taxa específica de
crescimento
• A morte celular pode ou não ser
acompanhada de lise
• Se for diminuição do grau de turvação do
meio de cultura
Equação (1) não
representa estas 4 fases:
• Necessário modificá-la:
– fazer com que a taxa de crescimento diminua à medida que a densidade populacional aumenta
Equação (1) não
representa estas 4 fases:
• Equação logística:
dx/dt = (μm - μmx/K)x (6) em que
K = capacidade do ambiente para suportar o crescimento microbiano = população da fase estacionária
μm é a taxa específica máxima de crescimento
• À medida que x aumenta e se aproxima de K, a taxa de crescimento vai diminuindo para zero
Tempo (horas)
Número de células
0 1
0,5 2
1 4
1,5 8
2,2,5 16
3 32
3,5 64
4 128
4,5 256
5 512
5,5 1024
6 2048
... 4096
10 ...
1048576
Estudo matemático
da fase de crescimento
exponencial
Número
de
células
Tempo
Log
númer
o de
células
Tempo
Estudo matemático
da fase de crescimento
exponencial Sendo
x0 = população inicial
x = população final (decorrido o tempo t)
n = número de gerações que ocorreram
Então, decorrido o tempo t, a população final é
x = x0 2n
Estudo matemático
da fase de crescimento exponencial
Tomando log10 de ambos os lados
(+ fácil de trabalhar):
log x = log x0 + n log2 (8)
Ou:
log x = log x0 + (log 2) t/ (9)
porque n = t/td (ou seja, número de gerações = tempo total decorrido / tempo de geração)
sendo = tempo médio de geração
Estudo matemático
da fase de crescimento exponencial
• Em alternativa:
dx / dt = mx (10)
em que m = taxa máxima específica de crescimento (h-1)
• Integrando e tomando os logaritmos:
log x = log x0 + mt (11)
• (11) representa uma linha recta (y = ax + b)
• é equivalente à equação (8) µm = (log 2)/
Representação gráfica de
log x = log x0 +
mt
Declive: µm = (0,301)/
Intersecção:
x0
Log
no.
cél.
Tempo
Efeito da taxa de crescimento
sobre o nível populacional atingido
Diferentes
microrganismos
O mesmo
microrganismo ou
diferentes
microrganismos
Taxas de
crescimento
idênticas
Taxas de
crescimento
distintas
Massa
celular
ou log nº.
de células
Tempo
Importância do crescimento exponencial
para o processamento alimentar
Uma só bactéria com =20 min
(μ = 2,1 h-1) :
• Em condições laboratoriais, teria produzido, ao
fim de 48 h, x > 1043 (massa 4000 superior à
da Terra ...)
• Num alimento ou em porções de alimento que
tenham ficado retidas num equipamento
x> 107 células após as 8 h dum dia de trabalho
Conteúdos
3.2.1. Factores intrínsecos: • Introdução
• Concentração de nutrientes
• pH
• Potencial redox, Eh
• Barreiras e constituintes antimicrobianos
• Actividade da água, aw
3.2. Factores que afectam o crescimento e sobrevivência
dos microrganismos nos alimentos
• Factores intrínsecos
– limitações do substrato (o alimento)
• Factores extrínsecos
– condições do ambiente de armazenagem
• Factores implícitos
– propriedades dos microrganismos e
interações entre microrganismos
• Factores do processamento
– p. vezes incluídos nos intrínsecos
Factores intrínsecos –
concentração de nutrientes
• Taxa específica de crescimento
influenciada pela concentração de
nutrientes
• Substrato limitante = meio que
contém um nutriente em [ ] limitante
Factores intrínsecos –
concentração de nutrientes
µ
S
µ m/2
Ks
µ m
Ks é a constante de saturação do substrato
(igual a S quando = µm/2).
S = concentração do substrato limitante
Para baixos valores de S, µ depende de S
Factores intrínsecos –
concentração de nutrientes
• Quando a concentração de S é baixa, µ depende da concentração do substrato limitante
• Relação descrita pela Equação de Monod:
µ = µmax S/(Ks + S) (12)
• Ou
dx/dt = µmax x S/(Ks + S)
uma vez que dx/dt = µx
Factores intrínsecos –
concentração de nutrientes
• N. B.:
– a Equação de Monod = Equação de
Michaelis-Menten da cinética enzimática
– Reflecte a dependência do crescimento
microbiano de reacções enzimáticas que
limitam a sua taxa
Factores intrínsecos –
concentração de nutrientes
• N. B.:
– a Equação de Monod = Equação de
Michaelis-Menten da cinética enzimática
– Reflecte a dependência do crescimento
microbiano de reacções enzimáticas que
limitam a sua taxa
Factores intrínsecos –
concentração de nutrientes
• Equação de Michaelis-Menten:
v0 = S/(KM+S)
em que:
• v0 é a velocidade inicial da reacção
• S é a concentração do substrato
• KM é a constante de Michaelis
(concentração de substrato para a qual a
velocidade da reacção corresponde a
metade da velocidade máxima)
Factores intrínsecos – pH e poder
tampão
• Acidez actua sobre as macromoléculas
• Assim, influencia também o
crescimento microbiano
Factores intrínsecos – pH e poder tampão
• curva em forma de sino,
aproximadamente simétrica
• abrange 2 – 5 unidades de pH
• valores máximos da taxa de
crescimento num intervalo que abrange
1 – 2 unidades
Factores intrínsecos – pH e poder
tampão
• Dum modo geral:
• bactérias crescem mais rapidamente entre pH 6,0 e 8,
• leveduras entre 4,5 – 6,0
• fungos filamentosos entre 3,5 e 4,0
• Excepções:
• bactérias que produzem ácidos em resultado do seu metabolismo energético
• Ex.: lactobacilos e bactérias do ácido acético têm óptimos de crescimento entre 5,0 e 6,0
pH e poder tampão – influência sobre a
forma geral da curva de crescimento
• A taxa de crescimento diminui
• O número máximo de células
produzidas decresce
• A duração da fase de latência aumenta
• A duração da fase estacionária
decresce
• Aumenta a taxa de morte
pH interno
• próximo dos 7,0
• Excepção: leveduras (5,8)
• Metabolismo funciona melhor a
estes valores
• Mecanismos de homeostasia em
relação ao pH: – Impermeabilidade da membrana a OH- e H+
– Mecanismos para bombear protões para o
exterior
Efeito de valores de pH fora do
óptimo
• os iões H+ e OH- afectam o pH das camadas
externas da célula, mas não o seu pH interno
• poderá afectar
– Os sistemas enzimáticos (permeases)
necessárias para a absorção de nutrientes
– A produção e actividade de enzimas
extracelulares
– O mecanismo de produção de ATP pelas
bactérias, que tem a sua sede na membrana
celular
Efeito de valores extremos de pH
• as membranas celulares sofrem danos
• Os iões H+ e OH- podem então
penetrar na célula
– desnaturando enzimas e moléculas de
ácidos nucleicos
– desencadeando a morte celular
Acção antimicrobiana
dos ácidos orgânicos
• Utilização de ácidos minerais, fortes,
nos alimentos é rara
• Ácido fosfórico ou clorídrico em
bebidas não alcoólicas; ex.: ácido
fosfórico em colas
• não se dissociam completamente em protões
e bases conjugadas quando em solução,
mas estabelece-se um equilíbrio:
HA ←→ H+ + A- (14)
• A constante de equilíbrio para este processo,
Ka, é dada por:
Acção antimicrobiana dos ácidos
orgânicos
HA
AHKa
Acção antimicrobiana dos ácidos
orgânicos
• Esta expressão pode ser rearranjada:
• Tomando os logaritmos de base 10
(equação de Henderson-Hasselbach):
HA
A
KH
11
HA
ApKpH a
log
Equação de Henderson-Hasselbach
• equação de Henderson-Hasselbach descreve a relação entre o pH duma solução, a força do ácido presente e o seu grau de dissociação
• Quando o pH = pKa, metade das moléculas do ácido presentes estarão sob a forma não-dissociada
• Aumentando o pH, o grau de dissociação do ácido também aumenta – quando pH = pKa + 1 haverá dez vezes mais moléculas
dissociadas do que não dissociadas
– quando se decresce o pH para valores inferiores ao pKa, a proporção de ácido não dissociado aumenta
pKa dalguns ácidos de utilização
comum na indústria alimentar
Ácido pKa
Acético (etanóico) 4,75
Propiónico 4,87
Láctico 3,86
Sórbico 4,75
Cítrico 3,14 – 4,77 – 6,39
Benzóico 4,19
Parabenos 8,5
Fosfórico 2,12 – 7,12 – 12,67
Carbónico 6,37 – 10, 25
Nitroso 3,37
Sulfuroso 1,81 – 6,91
Efeito dos ácidos orgânicos
• Ordem de actividade antimicrobiana
dos ácidos orgânicos:
– Propiónico > acético > láctico > cítrico >
fosfórico > ácido clorídrico
– O efeito antimicrobiano dos ácidos
orgânicos é dependente da temperatura
– A intensidade do efeito antimicrobiano
diminui à medida que a temperatura baixa
Valores de pH
Maioria dos frutos
p. ex.:Maçãs
Frutos silvestres
Citrinos
Pêssegos
Ameixas
Pickles
Molhos
Iogurtes
Vinagre
Muito ácido
Muito alcalino
Alimentos de
elevada acidez
Alimentos de
baixa acidez
pH 4,5
fronteira entre muito
ácidos e pouco ácidos
Bananas
Tâmaras
Melões
Papaias
Ananás
Tomate
Maioria dos vegetais
p. ex.:Feijão
Beterraba
Cenoura
Milho
Pepino
Cebola
Pimento
Batata
Carnes e aves
Leite
Maioria dos queijos
pH e poder tampão
• A acidez dum produto influencia:
• a sua ecologia microbiana
• a velocidade e tipo de deterioração a
que este se encontra sujeito
Exemplo 1:
• Vegetais
– pH
moderadamente
ácido
– Deterioração por
bactérias
– Erwinia
carotovora e
outras bactérias
que causam
podridões moles
– pseudomonas
• Frutos
– pH inferior
– crescimento
bacteriano inibido
– deterioração deve-
se principalmente a
bolores e leveduras
Exemplo 2:
• Peixe
– pH post-rigor 6,2 –
6,5
– Deterioração mais
rápida
– Microrganismos
sensíveis ao pH
(gén. Shewanella)
• Carne
– pH post-rigor 5,6
– Vida de prateleira
mais prolongada
– Não se encontra
Shewanella
Alterações do pH dos alimentos
devido ao crescimento microbiano
• Leite – acidificação por crescimento de
lactobacilos e lactococos
Alterações do pH dos alimentos
devido ao crescimento microbiano
• Carne – alcalinização por
pseudomonas
Ácidos presentes nos alimentos
• Produzidos in situ por microrganismos,
a partir dos açúcares
• Adicionados
– Normalmente ácidos orgânicos
– Raramente inorgânicos (fosfórico,
clorídrico)
Finalidades da adição de
ácidos aos alimentos
• Conservação – inibição de
microrganismos que causam
deterioração
• Segurança – inibição de patogénicos
Inibição de patogénicos por ácidos
Microrganismo Mínimo Óptimo Máximo
Staphylococcus aureus 4,0 6,0 – 7,0 9,8
Clostridium perfringens 5,5 7,0 8,0
Listeria monocytogenes 4,1 6,0 – 8,0 9,6
Salmonella spp. 4,05 7,0 9,0
Vibrio parahaemolyticus 4,8 7,0 11,0
Bacillus cereus 4,9 7,0 9,3
Campylobacter 4,9 7,0 9,0
Yersinia 4,6 7,0 – 8,0 9,0
Clostridium botulinum 4,2 7,0 9,0
Inibição de patogénicos por ácidos
• Alimentos com pH < 4,2 consideram-
se, normalmente, como seguros em
relação ao crescimento de bactérias
patogénicas
• “fase de latência” após a adição de
ácido – tem que ser levada em conta
Inibição de patogénicos por ácidos
• maionese e outros molhos
para saladas
• ovos crus como
ingrediente
• perigo potencial de
transmissão de Salmonella
• devem ser armazenados
por 72 h antes de serem
consumidos, para permitir
a morte microbiana
pH dos alimentos enlatados
• pH 4,5 (4,6 - normas americanas): valor-
fronteira entre alimentos de elevada e de
baixa acidez
• Alimentos de baixa acidez – “cozedura
botulínica”
• Alimentos de acidez elevada – não
necessitam dum tratamento térmico tão
severo
• O Clostridium botulinum não consegue
crescer nem produzir toxina em alimentos
enlatados com pH 4,5
Potencial redox
• Equação generalizada de oxidação-redução:
Oxidante + H+ ne Redutor
n = número de electrões transferidos
• Nas células vivas, sequências ordenadas de
reacções de transferência de protões e de
electrões são a base de:
– cadeias de transporte de electrões
– produção de energia por fosforilação oxidativa
Potencial redox, Eh
• Tendência para doar ou aceitar
electrões
• Ou tendência para reduzir ou oxidar
• Mede-se por potenciometria
• Valor negativo ambiente redutor
• Valor positivo ambiente oxidante
Factores que influenciam o
potencial redox dos alimentos
• Pares redox presentes
• Razão entre redutor e oxidante
• pH
• Capacidade de poising
• Disponibilidade de oxigénio (estado
físico, embalagem)
• Actividade microbiana
Potencial redox padrão, E0’
• Expressão da tendência dum átomo ou molécula para aceitar ou doar electrões
• E0’elevado, positivo → a espécie oxidada do par redox é um agente oxidante forte e a forma reduzida é um agente redutor fraco
• E0’tem valor absoluto elevado, negativo → a espécie oxidada do par redox é um agente oxidante fraco e a forma reduzida é um agente redutor forte
Relação entre Eh e E
0’
• Para além do tipo de substância presente, o
Eh é também influenciado pelas proporções
relativas das espécies oxidadas e reduzidas
presentes
• Quando se está na presença dum só par
redox, esta relação pode ser traduzida pela
equação de Nernst:
Relação entre Eh e E
0’
Par redox E0’ (mV)
½ O2/H2O +820
Fe3+/Fe2+ +760
Citocromo C ox/red +250
Ácido desidro-ascórbico/ác. ascórbico +80
Azul de metileno oxidado/reduzido +11
Piruvato/lactato -190
Glutationo oxidado/reduzido -230
NAD+/NADH -320
Relação entre Eh e E
0’
• Quando se está na presença dum só par redox, esta relação pode ser traduzida pela equação de Nernst:
• em que
Eh e E0’ são ambos medidos a pH 7
R é a constante dos gases perfeitos
T é a temperatura absoluta
n é o número de electrões transferidos durante o processo
F é a constante de Faraday
redutor
HOxidante
nF
RTEEh
ln'0
Potencial redox dos alimentos
• Se houver uma preponderância do do
oxidante em relação ao redutor
correspondente, vai haver um
tendência para o aumento do potencial
redox e o meio tenderá a apresentar
natureza oxidante
Potencial redox dos alimentos
• A maioria dos pares redox presentes
nos alimentos tenderiam, por si só, a
conduzir ao estabelecimento de
condições redutoras:
– glutationo/cisteína nas carnes
– em menor grau, ácido ascórbico e açúcares
redutores nos produtos de origem vegetal
• Excepção: oxigénio
Potencial redox dos alimentos
Produto Eh (mV) pH
Carne crua (post-rigor) – 200 5,7
Carne crua moída + 225 5,9
Salsichas cozidas e
outras carnes
enlatadas
– 20 a – 150 Cerca de 6,5
Trigo (grãos inteiros) – 320 a – 360 6,0
Cevada (grãos moídos) + 225 7,0
Tubérculos de batata Cerca de – 150 Cerca de 6,0
Espinafre + 74 6,2
Pera + 436 4,2
Uva + 409 3,9
Limão + 383 2,2
Potencial redox dos alimentos:
relação entre pH e Eh
• a concentração do hidrogenião afecta Eh
• por cada decréscimo de uma unidade no
pH, o Eh aumenta 58 mV
• Os elevados valores positivos do Eh nos
sumos de fruta reflectem em grande parte
o seu baixo pH
redutor
HOxidante
nF
RTEEh
ln'0
“Poising”
• Resistência oferecida pelos alimentos às alterações do Eh
• Análoga ao poder tampão em relação ao pH
• Tal como o poder tampão – é um efeito de “capacidade”
• depende de e aumenta com a concentração do par redox
– o poising é mais acentuado quando os dois componentes do par redox se encontram presentes em iguais
concentrações
Efeito do oxigénio
• mais importante dos pares redox dos
sistemas alimentares
• concentração no ar de cerca de 21%
• elevado valor de E0’– poderoso agente
oxidante
• Se houver ar em quantidade suficiente num
alimento, este terá um elevado potencial
redox e a maioria dos outros pares redox
presentes, se deixarmos que atinjam o
equilíbrio, irão encontrar-se no estado
oxidado
Efeito do oxigénio
• Se houver ar em quantidade suficiente num alimento → elevado potencial redox → a maioria dos outros pares redox presentes estarão no estado oxidado
• potencial redox (factor intrínseco) ↔ atmosfera de armazenagem (factor extrínseco)
• Aumento do acesso do ar ao alimento aumenta o seu Eh – ao picar, moer ou cortar
• Exclusão de ar conduz a um decréscimo do Eh – embalagem em atmosfera modificada ou enlatados
Produto Eh (mV) pH
Carne crua (post-rigor) – 200 5,7
Carne crua moída + 225 5,9
Salsichas cozidas e outras
carnes enlatadas
– 20 a – 150 Aprox. 6,5
Trigo (grãos inteiros) – 320 a – 360 6,0
Cevada (grãos moídos) + 225 7,0
Tubérculos de batata Aprox. – 150 Aprox. 6,0
Espinafre + 74 6,2
Pera + 436 4,2
Uva + 409 3,9
Limão + 383 2,2
Efeito do crescimento
microbiano sobre o Eh
• diminui o Eh
• este efeito pode ser atribuído: – à remoção do oxigénio (principalmente)
– à produção de compostos redutores como o hidrogénio em resultado da actividade microbiana
• à medida que a concentração em oxigénio dum meio diminui, também decresce o seu potencial redox
• decréscimos de cerca de 60 mV de cada vez que a concentração de oxigénio sofre uma diminuição de 10 vezes.
Testes de redução de corantes
• Testes rápidos para determinar a qualidade
microbiológica de alimentos, em especial
leite
• Já antigos
• Baseiam-se na perda de cor dos indicadores
de Eh (azul de metileno, resazurina)
• Também empregues em cervejaria para
determinar a proporção de leveduras viáveis
Efeito do Eh sobre a microflora
dos alimentos
• Forte efeito seleccionador
• Grupos fisiológicos:
– Aeróbios obrigatórios ou estritos
– Anaeróbios obrigatórios
– Anaeróbios aerotolerantes
– Microaerófilos e capnófilos
Aeróbios estritos
• Microrganismos respiratórios
• Obtêm a maior parte da sua energia por
fosforilação oxidativa
• O receptor final de electrões é o oxigénio
• Necessitam de elevada [O2] e elevado Eh
• Crescem à superfície dos alimentos ou nos
locais a que o ar tem fácil acesso
Exemplos de aeróbios estritos
nos alimentos
• Carnes
– Pseudomonas (ex.: Ps. fluorescens) e
outros bacilos Gram-negativos oxidativos
– crescem a um Eh de +100 – +500 mV
– Produzem viscosidade e maus cheiros
Exemplos de aeróbios estritos
nos alimentos
• Pão
– Textura aberta
– Bacillus subtilis
– Eh –100 a +135 mV
– Produz defeito conhecido por “fios”
Exemplos de aeróbios estritos
nos alimentos
• Bebidas alcoólicas
– Espécies de Acetobacter
– Crescimento superficial
– Conversão do etanol em ácido acético
– Produção de vinagre e deterioração
Anaeróbios obrigatórios
• tendem a crescer apenas quando o potencial redox é baixo ou negativo
• muitas vezes exigem a ausência de oxigénio
• O metabolismo anaeróbio permite ao organismo obter menores rendimentos de energia utilizável
• Por isso, preferem ambientes redutores, que minimizam a perda de poder redutor
Toxicidade do oxigénio para os
anaeróbios estritos
• incapacidade dos anaeróbios
obrigatórios para remover e destruir os
produtos tóxicos do oxigénio molecular:
– H2O2
– radical superóxido (O2 _ .
)
Toxicidade do oxigénio para os
anaeróbios estritos
• Ausência de superóxido dismutase e
catalase
• Catalisam
O2 _ .
+ 2H+ H2O2 + O2
2H2O2 2H2O + O2
Anaeróbios obrigatórios nos
alimentos
• Clostrídios
• todos os locais que apresentem condições de anaerobiose – interior dos tecidos das carnes
– guisados
– embalados a vácuo
– enlatados
• causam deterioração
• nalguns casos, pêm em risco a saúde do consumidor – Ex: Clostridium botulinum
Anaeróbios aerotolerantes
• Não utilizam o oxigénio, mas toleram a
sua presença
• Ex.: bactérias do ácido láctico
– Produção de energia exclusivamente por
fermentação
– Não têm catalase nem SOD
– Destroem superóxido por acumulação de
conc. milimolares de Mn
Microaerófilos
• crescem em ambientes com
concentração de oxigénio inferior à
concentração atmosférica
• concentração óptima de oxigénio –
cerca de 6%
• O crescimento de certos microaerófilos
é estimulado pela presença de CO2 –
capnófilos
Barreiras e constituintes
antimicrobianos
• Alimentos já foram organismos vivos –
possuem mecanismos de combate a
infecções
• Primeira linha de defesa: barreiras
físicas
• Segunda linha de defesa: compostos
antimicrobianos
Barreiras físicas
• Tegumentos:
– Compostos por macromoléculas de difícil
degradação
– ambiente inóspito para os microrganismos
• pouca água disponível
• poucos nutrientes facilmente acessíveis
• constituintes antimicrobianos (ácidos gordos
de cadeia curta da pele dos animais ou óleos
essenciais da superfície das plantas)
Barreiras físicas
• Os danos físicos aos tegumentos permitem a
invasão dos tecidos subjacentes, ricos em
nutrientes
• osfrutos e vegetais danificados deterioram-
se mais rapidamente
• o processo de deterioração inicia-se no local
da agressão
• importante que os métodos de colheita e
transporte mantenham a integridade destas
barreiras
Constituintes antimicrobianos
• Concentração local aumenta quando ocorrem traumatismos
• Rotura de células que armazenam óleos essenciais
• pôr em contacto enzima com o seu substrato – mostarda, o rábano, o agrião de água, a couve e
outros membros do género Brassica, originando isotiocianatos (óleos de mostarda) e em espécies do género Allium (alho, cebola e alho francês) originando tiosulfinatos como a alicina
• Produção de fitoalexinas em resposta à invasão por microrganismos – Faseolina - antifúngico produzido pelo feijão
verde
Utilização de constituintes naturais das
plantas como agentes antimicrobianos
• Muitos constituintes naturais dos
tecidos vegetais, como pigmentos,
alcalóides e resinas, têm propriedades
antimicrobianas
• Os ácidos sórbico (Sorbus) e benzóico
(uva do monte)
Exemplos de ervas aromáticas e especiarias com
constituintes antimicrobianos
Jamaica Laranja Alho
Amêndoa amarga Orégãos Gengibre
Angélica Pimentão Limão
Manjericão Salsa Lima
Louro Pimenta Mandarina
Bergamota Hortelã-pimenta Manjerona
Alcarávia Rosmaninho Mostarda
Cardamomo Alecrim Noz-moscada
Aipo Sálvia Cebola
Canela Hortelã Baunilha
Erva-limão Anis Coentros
Cravinho Estragão Endro
Verbena Tomilho Funcho
Poder antimicrobiano das ervas e
especiarias
• Quantidade usada – efeito sobre o
flavor
• Geralmente papel pouco importante na
conservação dos alimentos
• Por vezes, fonte de contaminação
– Esporulados → botulismo em conservas
caseiras de pimento e de alho esmagado
em óleo
Outros constituintes antimicrobianos
dos produtos de origem vegetal
• Humulonas do lúpulo – inibição das
bactérias do ácido láctico que
deterioram a cerveja
• Quantidade de lúpulo presentemente
usada é mais baixa – papel menos
importante na conservação da cerveja
• Conc. subletais de humulonas podem
mesmo seleccionar estirpes resistentes
Outros constituintes antimicrobianos
dos produtos de origem vegetal
• Oleuropeína (amargor nas azeitonas
verdes)
• Extracção alcalina:
– Retirar sabor amargo
– Oleuropeína inibe as bactérias do ácido
láctico responsáveis pela fermentação das
azeitonas
Clara de ovo Leite
Status nutritivo
pH elevado pH moderado
Baixos níveis de azoto disponível Níveis elevados de proteínas, glícidos e
lípidos
Compostos antimicrobianos
Ovotransferrina (conalbumina)
(12% dos sólidos)
Lactoferrina
Lisozima
(3,5% dos sólidos)
Lisozima
Avidina
(0,05% dos sólidos)
-
Ovoflavoproteína
(0,8% dos sólidos)
-
Ovomucóide e ovo-inibidor
(inibidores das proteases)
(11% dos sólidos)
Lactoperoxidase
(30 mg l-1)
Imunoglobulina
(300 mg l-1)
Constituintes antimicrobianos de
origem animal
• Lisozima
– Em ambos os produtos
– catalisa a hidrólise das ligações
glicosídicas do peptidoglicano
– mais eficaz contra bactérias Gram-
positivas, onde o acesso ao
peptidoglicano é mais fácil, do que contra
as Gram-negativas
Constituintes antimicrobianos de
origem animal
• Compostos que diminuem a
disponibilidade dos nutrientes
– Ferro
• ovotransferrina da clara de ovo
• lactoferrina do leite
– Cofactores (biotina, riboflavina)
• Avidina
• ovoflavoproteína
Constituintes antimicrobianos de
origem animal
• Sistema da lactoperoxidase – leite
• produz compostos antimicrobianos na
presença de peróxido de hidrogénio
• catalisa a oxidação do tiocianato pelo
peróxido de hidrogénio, produzindo, entre
outros compostos, hipotiocianato
• pode destruir bactérias Gram-positivas e
inibir as Gram-negativas
• possivelmente danifica a membrana
citoplasmática
Funcionamento do sistema da lactoperoxidase
SCN-
tiocianato +
H2O2
lactoperoxidase
OSCN- (hipotiocianato)+ (c/ excesso de H2O2) O2SCN-+O3SCN-
I. Humidade relativa
• Relacionada com a actividade da água
• HR = medida da aw na fase gasosa
• HR tem reflexo imediato sobre a aw à
superfície do alimento – zona
problemática em relação ao
desenvolvimento de microrganismos
I. Humidade relativa
• Uma vez iniciado o seu crescimento, os
microrganismos também contribuem
para alterar a aw do alimento,
permitindo que se desenvolvam
microrganismos mais exigentes em
termos da disponibilidade da água
I. Humidade relativa
• Frequente em: – Silos de armazenagem de xaropes e
concentrados
– Silos de armazenagem de grãos – variação da HR em função da temperatura e da exposição solar
• Armazenagem de frutos e vegetais frescos: – Controlo cuidadoso da HR
– Demasiado elevada – condensação, deterioração microbiológica
– Demasiado baixa - murchidão
II - Temperatura
• Microrganismos são poiquilotérmicos e
muito pequenos – temperatura tem um
efeito muito acentuado sobre o seu
desenvolvimento e metabolismo
• Intervalo para o crescimento depende
de:
– Disponibilidade da água
– Estabilidade das macromoléculas
– Estrutura da membrana citoplasmática
II. Temperatura
• À pressão atmosférica, verifica-se crescimento microbiano entre os –8ºC e os +100ºC
Parque natural de Yellowstone
Microphotographies en microscopie électronique de différentes
espèces thermophiles isolées des sources hydrothermales profondes
(a, b, c, d) et de puits de pétrole (e, f, g): les autotrophes strictes
réductrices de soufre Desulfurobacterium sp. (a) et Nautilia
lithotropha (b), de sulfate Thermodesulfobacterium hydrogeniphilum
(c), les hétérotrophes Marinitoga piezophila (d), Thermococcus
sibiricus (e), Thermosipho geolei (f) et Petrotoga olearia (g).
A temperatura afecta:
• taxa de crescimento
• duração da fase de latência
• natureza do metabolismo
• requisitos nutricionais
• composição da biomassa microbiana
Efeito da temperatura sobre a
taxa de crescimento
Equação de Arrhenius
• correlaciona a temperatura com a velocidade das reacções químicas
R = constante dos gases perfeitos
T = temperatura absoluta
A = constante (depende da frequência de formação de complexos activados de reagentes)
E = energia de activação da reacção
K AeE
RT
Efeito da temperatura sobre a
taxa de crescimento
Equação de Arrhenius
• também aplicada à obtenção de estimativas aproximadas das taxas de crescimento ou actividade microbiana em função da temperatura do meio, utilizando valores publicados de E ou determinando-os experimentalmente
K AeE
RT
Conceito Q10
Q e10
-E
R(T+10)
-E
RT
logQE
R T T10
2,3
1 1
10
• A generalidade das espécies microbianas mesófilas
têm um Q10 próximo de 2 para grande parte do
domínio compreendido entre as temperaturas mínima
a óptima
Efeito da temperatura sobre a
taxa de crescimento
T (ºC)
.h-1
óptimamínima
máxima
35º C (bactérias)
30ºC (bolores)
Temperatura e taxa de crescimento
• Temperaturas cardeais:
– Óptima
– Máxima
– Mínima
• Variam muito consoante o grupo
microbiano considerado
Classificação dos microrganismos
consoante as suas temperaturas cardeais
Temperatura (ºC)
Grupo Mínimo Óptimo Máximo
Termófilos 40 – 45 55 – 75 60 – 90 Mesófilos 5 – 15 30 – 40 40 – 47 Psicrófilos (psicrófilos obrigatórios)
-5 - +5 12 – 15 15 – 20
Psicrotróficos (psicrófilos facultativos)
-5 - +5 25 – 30 30 – 35
Distribuição dos microrganismos por
ecossistemas de acordo com as suas
preferências térmicas
Ecossistema Espécie Domínio Temperatura
óptima
Glaciares, neves polares Chlamidomonas nivalis Eukaria (alga) ~0ºC
Rúmen Prevotella ruminicola Eubacteria 37ºC
Fumarolas, caldeiras industriais Thermus aquaticus Eubacteria 60ºC
Sulfataras submarinas Pyrodictium brockii Archaea 105ºC
Distribuição dos microrganismos por ecossistemas
de acordo com as suas preferências térmicas
• espécies que crescem a baixas temperaturas têm taxas de crescimento mais lentas que os organismos de temperaturas moderadas
• organismos estruturalmente mais complexos do domínio Eukarya não evoluíram no sentido da adaptação a temperaturas elevadas
• ecossistemas com temperaturas acima de 50ºC são apenas habitados por Eubacteria e Archaea
• ambientes extremamente quentes são quase exclusivamente habitados por Archaea
Grupos mais importantes em
Microbiologia Alimentar
• Mesófilos
– Patogénicos transmitidos pelos alimentos
– Ex.: Salmonella, Staphylococcus aureus,
Clostridium perfringens
Grupos mais importantes em
Microbiologia Alimentar
• Psicrófilos
– Os mesófilos crescem mais rapidamente do que
psicrotróficos às suas temperaturas óptimas
– a deterioração dos alimentos perecíveis que são
armazenados a temperaturas de mesofilia é mais
rápida do que a deterioração em refrigeração
– Carácter da deterioração em refrigeração ou à
temp. ambiente difere – grupos microbianos
distintos
Grupos mais importantes em
Microbiologia Alimentar
• Termófilos
– importância muito menor em microbiologia
alimentar
– esporulados termófilos (ex. Bacillus e
Clostridium) podem causar problemas
Efeito da temperatura sobre a
taxa de crescimento
• curva assimétrica
• a taxa de crescimento
decresce de modo mais
rápido acima da
temperatura óptima do
que abaixo desta T (ºC)
.h-1
óptimamínima
máxima
Efeito da temperatura sobre a
taxa de crescimento
• Abaixo do óptimo, decresce a taxa de crescimento em parte devido ao abrandamento das reacções enzimáticas
• Isto não explica totalmente o decréscimo da taxa de crescimento – este decréscimo não segue a lei de Arrhenius
• O crescimento microbiano resulta da actividade duma rede de reacções que interagem e se regulam umas às outras, representando uma ordem de complexidade muito superior à duma simples reacção química isolada
Efeito da temperatura sobre a
duração da fase de latência
• À medida que a
temperatura se vai
aproximando do
mínimo para
crescimento:
– decréscimo da taxa de
crescimento
– aumento da duração da
fase de latência
Efeito da temperatura sobre a
duração da fase de latência
• O aumento da duração da fase de
latência não é linear: – um psicrotrófico que tenha uma fase de latência
de 1 h à sua temperatura óptima (25ºC, p. ex.),
poderá ter uma fase de latência de 30 h a 5ºC e
de 60 h a 0ºC
– A temperaturas muito próximas do mínimo, as
fases de latência podem tornar-se mesmo muito
prolongadas (chegam aos 414 dias)
Efeito da temperatura sobre a
duração da fase de latência
• Implicações sobre a conservação dos
produtos refrigerados:
– O aumento da vida de prateleira dos alimentos
refrigerados está relacionado com:
• decréscimo da taxa de crescimento da microflora
deteriorante
• extensão da sua fase de latência, durante a qual o
número de microrganismos não aumenta
• o aumento da fase de latência pode ter um efeito tão
importante quanto o decréscimo da taxa de crescimento
Efeito da temperatura sobre a
qualidade e segurança dos alimentos
• factor importantíssimo
• um dos factores mais fáceis de
controlar na prática
Efeito da temperatura sobre a
qualidade e segurança dos alimentos
• O crescimento microbiano é rápido no intervalo 5° - 60°C
• Se os alimentos permanecerem nesta ZONA DE PERIGO por apenas 2 – 4 horas, só ocorrerá crescimento e reprodução mínimos
• Evitar deixar os alimentos nesta ZONA DE PERIGO por muito tempo, porque nesta zona, os alimentos potencialmente perigosos poderão permitir o crescimento de microrganismos patogénicos
Efeito da temperatura sobre a
qualidade e segurança dos alimentos
• Visitar http://www.extension.iastate.edu/foodsafety/Lesson/homepage.
html
http://www.fightbac.org/main.cfm
http://europa.eu.int/comm/food/index_en.htm
http://www.homefoodsafety.org/
III. Atmosfera gasosa
• Oxigénio
– Cerca de 21% da atmosfera
– Influência muito importante sobre o Eh
III. Atmosfera gasosa
• Dióxido de carbono
– Gás incolor, com odor ligeiramente
pungente em concentrações elevadas
– Asfixiante, ligeiramente corrosivo em
presença de humidade
III. Atmosfera gasosa
• Dióxido de carbono
– Dissolve-se facilmente em água (1,57 g/kg
a 100 kPa, 20° C)
– Origina ácido carbónico (H2CO3)
– O ácido carbónico é um ácido dibásico
fraco (pKa 6,37 e 10,25)
– Também solúvel em lípidos e noutros
compostos orgânicos
III. Atmosfera gasosa
• Dióxido de carbono
– Numa solução não tamponizada pode
produzir um decréscimo apreciável do pH:
• água destilada em equilíbrio com a concentração
normal de CO2 na atmosfera - pH de cerca de 5
• efeito menos pronunciado nos ambientes
tamponizados dos alimentos
– Ex. depois de atingido o equilíbrio com 1 atmosfera de
pCO2, o pH do leite é de 6,6 a 6,0
Atmosfera gasosa – CO2
• Efeito inibidor do crescimento
microbiano:
– Embalagem em atmosfera modificada
– Efeito antimicrobiano em bebidas
gaseificadas
Atmosfera gasosa – CO2
• Efeito inibidor difere consoante o tipo
de microrganismos considerado:
– Bolores e bactérias Gram-negativas –
mais sensíveis
– Bactérias Gram-positivas e algumas
leveduras – mais resistentes
– Lactobacilos especialmente resistentes
CO2 – mecanismo de inibição do
crescimento microbiano
• Combinação de fenómenos:
– Efeito antimicrobiano do ácido carbónico
– alteração das propriedades físicas da membrana,
afectando negativamente o transporte de solutos
– inibição de enzimas-chave, em especial
(reacções de carboxilação/descarboxilação, nas
quais o CO2 é um dos reagentes)
– reacção com os grupos amina das proteínas,
alterando as suas propriedades e a sua
actividade
Factores que afectam a inibição do
crescimento microbiano pelo CO2
• Geralmente mais acentuada em condições anaeróbias do que em condições de aerobiose
• A solubilidade do CO2 aumenta à medida que a temperatura decresce
– É muito mais elevada a temperaturas abaixo dos 10° C do que para temperaturas iguais ou superiores a 15° C
– Importante em embalagem em atmosfera modificada – solubilidade excessiva pode causar colapso das embalagens
Microrganismos capnófilos
• O seu crescimento é favorecido pela
presença de CO2 e de anaerobiose
• Condições idênticas ao tracto intestinal
e outros tecidos corporais
• Patogénicos
• Ex.: Campylobacter
Temperatura e segurança alimentar:
Objectivos
• Aula teórico-prática
• Objectivo:
– Conhecer os limites do binómio tempo-
temperatura a que devem ser submetidos
os alimentos durante a sua confecção,
armazenagem e aquecimento
– Conhecer práticas seguras de preparação,
confecção, armazenagem e aquecimento
dos alimentos
Temperatura e segurança alimentar:
Conteúdos
• A zona de perigo
térmico
• Tempo
• Temperatura
• Arrefecer alimentos
quentes
• Diâmetro e
densidade dos
alimentos
• Opções para o
arrefecimento
• Uso do frigorífico
• Aquecer alimentos
• Descongelar
alimentos
• Cozinhar alimentos
• Armazenagem no
frio
A zona de perigo
• Os microrganismos patogénicos crescem e multiplicam-se a temperaturas entre os 5 e os 60ºC - zona de perigo
• O crescimento microbiano é ainda mais rápido entre os 20 e os 50ºC
• Fazer com que a passagem dos alimentos por este intervalo de temperaturas
– dure o menos possível
– ocorra o menor número de vezes possível
Tempo
• Máximo de 4 h na
zona de perigo
– tempo que, em
geral, é necessário
para que as
bactérias passem da
fase de latência à
exponencial
• Não esquecer efeito
cumulativo!
Termómetros
• Em número
suficiente:
– Pelo menos um por
empregado que vai
cozinhar, aquecer
ou arrefecer
alimentos
Medição da temperatura
• A gerência deverá
estabelecer com
clareza
ametodologia de
medição
– alimentos que
devem ser
monitorizados
– quem deve fazê-lo
– com que frequência
deve ser feita a
monitorização
Medição da temperatura
• Registar
– Temperatura
– hora e data
• Finalidade:
verificação dos
procedimentos
• Formulários simples
no exterior das
portas do
equipamento
Arrefecimento bifásico
• Recomendado pela
FDA
• minimiza o tempo
que o alimento vai
passar na porção
mais crítica da zona
de perigo
térmico(20 - 50ºC)
Arrefecimento bifásico
• I - alimento cozinhado seja
arrefecido de 60 para 20ºC
num período que não exceda
as duas horas
• II - arrefecido dos 20 para os
5ºC ou abaixo num período
que não exceda mais 4 h
Arrefecimento bifásico
• Se o alimento não tiver
arrefecido para 20ºC dentro
das duas horas, volta a ser
aquecido
• Necessita de atingir os 74ºC e
permanecer a esta
temperatura por 15 seg, num
período máximo de 2 h, antes
de voltar a tentar-se o seu
arrefecimento
Rapidez de arrefecimento
depende de:
• a espessura do alimento (distância até
ao centro) - factor mais importante
• Densidade - quanto mais densos forem
os alimentos, mais lento é o seu
arrefecimento
– uma panela com 20 cm de altura de
feijoada pode levar mais de 20 h a
arrefecer dos 60ºC para temperaturas
iguais ou inferiores a 5ºC
Rapidez de arrefecimento
depende de:
• material de que são feitos os recipientes
– O aço inoxidável transfere o calor mais
rapidamente do que o plástico
• forma do recipiente
– Os alimentos arrefecem mais depressa em
recipientes rasos do que nos mais fundos
• Composição dos alimentos
– os que têm elevado teor em proteínas e lípidos,
não transferem o calor tão bem como os outros e
tendem a arrefecer mais devagar
Métodos para o arrefecimento
rápido dos alimentos
• Frigorífico nem sempre é uma boa opção
• Dividi-los
• Arrefecer com gelo
• Arrefecimento forçado
• Arrefecimento em recipientes de paredes
duplas
• Agitar os alimentos
Conservar alimentos já frios
no frigorífico
• alimentos densos - em recipientes com 5 cm de profundidade
• líquidos menos espessos - em recipientes com 8 cm de profundidade
• colocar sempre os recipientes nas prateleiras de cima do frigorífico ou câmara
• não cobrir ou cobrir sem fechar hermeticamente antes de arrefecer até 5ºC
Conservar alimentos já
frios no frigorífico
• colocar os recipientes de modo a permitir a circulação de ar
• quando a temperatura do alimento 5ºC, cobri-lo
• o recipiente deve ter sido marcado com a data e hora de preparação do alimento
• marcar também a data e hora de armazenagem
Tempos de conservação
no frio (exemplos):
• Restos: máximo de 3 dias no frigorífico
• Ovos: 30 dias no frigorífico
• Comida congelada: até 1 ano
• Mais exemplos: consultar o Manual do
Inatel
Aquecer alimentos
• O alimento tem que ser aquecido até atingir,
no centro, 75ºC e deve permanecer a esta
temperatura por 15 segundos
• não pode demorar mais de 2 h
• Senão, o alimento deverá ser rejeitado
(deitado fora).
• Ao utilizar um alimento cozinhado como
ingrediente na preparação dum prato, o
prato final deverá atingir os 75ºC
Aquecer alimentos
no microondas
• cobertos (não hermeticamente, para evitar
acidentes)
• deverão ser rodados ou agitados a meio do
tempo de aquecimento
• respitar tempo de repouso deve ser
respeitado
• medir a temperatura interna em vários
pontos para garantir que foram atingidos os
75ºC
• Os alimentos que são aquecidos para
servir imediatamente ao consumidor
podem ser servidos a qualquer
temperatura, desde que se tenham
observado as regras de segurança
durante a sua preparação
Descongelar alimentos
• no frigorífico
• no microondas (cozinhar imediatamente após a descongelação)
• descongelar alimentos contidos em recipientes herméticos num banho de água fria, corrente, ou em água fria mudada de meia em meia hora
• descongelar alimentos à temperatura ambiente não é seguro
Cozinhar os alimentos
Temperatura interna
• Feijoadas, guisados, sopas, restos 75ºC
• Aves 75ºC
• Recheados, carne moída de aves 75ºC
• Carne suína ou bovina moída 70ºC
• Carne bovina (bifes, assados) 63ºC
• Carne suína (bifes, costeletas, assados) 63ºC
• A maioria dos outros alimentos 63ºC
Factores implícitos
• Propriedades dos microrganismos:
– Resposta dos microrganismos às
condições ambientais
– Interacções entre microrganismos
Papel dos factores implícitos na determinação da
natureza das associações microbianas dos
alimentos
• Taxa de crescimento
• Estado fisiológico
• História prévia da célula
• Stress e sensibilidade
• Interacções entre microrganismos:
– Mutualismo
– Antagonismo
Efeito da taxa de crescimento
• Microrganismos com taxas específicas
elevadas tendem a predominar
– Bolores poderiam crescer bem nas carnes,
mas são excluídos pelas bactérias, que têm
mais elevado
• Contudo, há influências doutros factores:
– Se as bactérias forem inibidas (pH, aw, …. ),
os bolores assumem um papel importante na
ecologia do produto
Efeito da taxa de crescimento
• Contudo, há influências doutros
factores:
– Limitações do substrato:
• Dentre 2 mos com idêntica, predominará o
que tiver afinidade mais elevada pelo
substrato (menor Ks) quando este se tornar
limitante
Estado fisiológico do microrganismo
• A resposta real dum microrganismo a
um factor ambiental depende do seu
estado fisiológico
• Células em fase exponencial morrem
mais facilmente por exposição ao calor,
pH ou compostos antimicrobianos do
que as da fase estacionária
Estado fisiológico
do microrganismo
• Em geral, quanto maior for ,
mais facilmente morrem os
microrganismos
• Crescimento a taxas elevadas pressupõe
equilíbrio delicado e fácil de perturbar
• Hipótese: célula morre da sua reacção ao
stress e não do efeito directo daquele
– Morre por “oxidative burst” – produção explosiva
de radicais livres no interior da célula em
resposta a stresses
História prévia da célula
• Adaptação prévia em geral minimiza os
efeitos adversos da alteração das condições
ambientais
• Exposição a níveis subletais pode aumentar
a resistência dos microrganismos:
– Exposição ao calor – aumento da resistência
térmica
– Exposição a pH baixo – aumento da resistência à
acidez
– Crescimento a temperaturas progressivamente
mais baixas – redução da temperatura mínima de
crescimento do mo
Stress e sensibilidade
Resposta ao stress
• Resposta imediata do sistema
enzimático e das proteínas
membranares
• Resposta a prazo mais longo, mediada
por genes
Resposta mediada por
genes
• Produção de chaperonas ou
chaperoninas
• Factores sigma
– proteínas que interagem com as enzimas
que transcrevem o ADN para ARN
mensageiro,
– ajudam a determinar as zonas do ADN
que vão ser transcritas
Resposta mediada por genes
• Factores sigma
– Factor sigma 32 ou RpoH – codifica
proteínas do choque térmico
– RpoS (factor sigma da fase
estacionária) –acumula-se na fase
estacionária – orienta a transcrição de
genes com função protectora
Acção do RpoS
• Produção de proteínas protectoras durante
a fase estacionária ou em resposta a
stresses
• Actua em reposta a um conjunto de
stresses – protege a célula contra os
efeitos de vários stresses simultaneamente
– Implicações em termos de segurança alimentar
Interacção entre microrganismos
• Protecção contra stresses em resposta
a compostos segregados por outras
células
• Relações de sinergia
• Relações de antagonismo
Relações de sinergia
• Crescimento dum microrganismo
prepara o meio para o crescimento
doutro
• Actividade dum microrganismo
aumenta a disponibilidade de
nutrientes para outro
• Um microrganismo neutraliza
compostos que inibem o crescimento
doutro
Relações de antagonismo
• Competição por nutrientes
• Produção de substâncias que inibem o
crescimento doutros microrganismos -
antibiose
Antibiose
nas bactérias do ácido láctico
• Decréscimo do pH do meio
• Acção específica do ácido láctico
(ácido orgânico fraco)
• Outros factores antimicrobianos:
– Peróxido de hidrogénio
– Bacteriocinas
– Outros compostos antimicrobianos
Previsão de acontecimentos
microbiológicos
• Previsão de:
– Vida de prateleira
– Segurança
– Deterioração
Passos na previsão de
acontecimentos microbiológicos
• Descrever com precisão o ambiente
alimentar
• Determinar a forma como este irá
afectar o crescimento e sobrevivência
dos microrganismos
Caracterização físico-química
dum ambiente
• Normalmente simples
• Problemática em ambientes onde a
distribuição das propriedades não é
uniforme
– Caso dos alimentos sólidos
Efeito dos parâmetros ambientais sobre o
cresimento microbiano
• A maioria dos dados experimentais
disponíveis diz respeito ao efeito de
cada factor isolado ou de dois factores
em conjunto
• Nos alimentos os microrganismos
experimentam uma bateria de factores
sub-óptimos que determinam as
características do alimento como meio
para o crescimento microbiano
Efeito barreira
• cada factor
inibidor actua
como uma
barreira que
contribui para a
estabilidade e
segurança geral
do alimento
Três abordagens básicas à previsão
de acontecimentos microbiológicos
• I – consultar peritos
– baseado na experiência individual dum
microbiologista alimentar e na sua
interpretação da literatura publicada
– abordagem útil do ponto de vista
qualitativo
– raramente produz dados quantitativos
fiáveis
Três abordagens básicas à previsão de
acontecimentos microbiológicos
• II - testes de desafio – O microrganismo é inoculado no produto
alimentar e é seguido o seu destino ao serem submetidos a condições que simulam as que prevalecem durante a sua produção
– Produz dados fiáveis
– Caro, moroso e intensivo em termos de mão-de-obra
– De cada vez que houver qualquer alteração é necessário repetir os testes sob as novas
condições
Três abordagens básicas à previsão
de acontecimentos microbiológicos
• III - recurso a modelos matemáticos
Modelo
• Objecto ou conceito utilizado para
representar outro
• Um modelo matemático recorre a
conceitos matemáticos, como
constantes, variáveis, funções,
equações, etc.
Modelo
• Algo que utilizamos em representação
da realidade quando esta é demasiado
perigosa, demasiado dispendiosa ou
simplesmente inatingível
T. Wijtzes
Modelos matemáticos em
Microbiologia Alimentar
• usados com sucesso desde os anos vinte do
séc. XX para prever a probabilidade da
sobrevivência de esporos de Clostridium
botulinum a um dado processo térmico
• permitiram, com uma margem de segurança
aceitável, o design de processos térmicos
para alimentos enlatados de baixa acidez
Etapas do desenvolvimento dum
modelo
• 1. planeamento
• 2. recolha dos dados
• 3. ajustamento do modelo
• 4. validação do modelo
Modelos probabilísticos
• fornecem uma avaliação quantitativa da
probabilidade dum acontecimento
microbiológico ocorrer durante um dado
tempo
• são mais adequados a situações de risco
grave
• O acontecimento mais frequentemente
descrito nestes modelos é a probabilidade
de formação de toxina pelo Cl. botulinum
Ex. modelo probabilístico
• Modelo logístico
para a
probabilidade da
produção de toxina
pelo Clostridium
botulinum em carne
de porco
pasteurizada no
intervalo de pH
entre 5,5 e 6,3.
Desvantagem dos modelos
probabilísticos
• não dão muita informação sobre a taxa
a que os acontecimentos se verificam
Modelos de superfície de
resposta
• modelos que prevêem o tempo que
demora certo acontecimento, como
crescer até um certo nível ou formação
detectável de toxina
Exemplo dum modelo de
superfície de resposta
• crescimento da Yersinia enterocolitica a temperaturas e pHs sub-óptimos
LTG = 423,8–2,54(T)–10,97(pH)+0,0041(T)2+0,52(pH)2+0,0129(pH)(T)
• LTG - logaritmo natural do tempo que leva a acontecer um aumento de 100 vezes nos números de microrganismos
• T – temperatura
• pH - pH obtido quando se usa o ácido acético como acidulante
Exemplo dum modelo de
superfície de resposta
Efeito combinado da temperatura e do pH sobre o tempo para que ocorra um crescimento de 2 ciclos logarítmicos de Yersinia enterocolitica
Modelos cinéticos
• Descrevem a velocidade do
crescimento (, tempo de geração) em
função das condições de crescimento
(temperatura, pH, aw, etc.)
Modelos cinéticos
• 1. Cálculo dos parâmetros da curva de
crescimento por meio de modelos
primários
• 2. Modelos secundários para
estabelecer a relação entre o
parâmetro escolhido e as condições
ambientais relevantes
Modelos secundários
• Equação de Arrhenius:
k = A exp (–E/RT)
E: energia de activação
A: factor de colisão
R: constante universal dos gases
T: temperatura (K)
k: taxa velocidade ou taxa específica de
crescimento
Gráfico tridimensional do tempo de geração previsto
para as salmonelas em função da temperatura
Tempo de geração da salmonela para um valor fixo de pH
Modelos secundários
• Equação de Davey (Arrhenius mod.):
ln k = C0 + C1/T + C2/T2
E: energia de activação
A: factor de colisão
R: constante universal dos gases
T: temperatura (K)
k: taxa velocidade ou taxa específica de
crescimento
Equação de Davey modificada:
• Entra com outros parâmetros para além
da temperatura:
ln k = C0 + C1/T + C2/T2 + C3/aw + C4/aw
2
Modelos cinéticos
• Modelo da raiz quadrada:
k = b (T – Tmin) • Descreve o crescimento para temperaturas abaixo
do óptimo
• Inicialmente descrito por Ratkowsky
• Modificação da equação exponencial de Bĕlehrádek
• Boa concordância com dados obtidos em meios de
cultura e alimentos
• Também pode ser modificado para incluir pH, aw,
etc.
Dados do crescimento de Yersinia
enterocolitica – modelo da raiz quadrada
Dados do crescimento da Yersinia enterocolitica representados de acordo
com o modelo da raiz quadrada de Ratkowsky
Exemplo de modelo primário
• µFit
– Demonstração do seu uso para o cálculo
dos parâmetros do crescimento
microbiano
Utilidade dos modelos:
• Desenvolvimento de produtos
• Previsão do comportamento das
populações microbianas dos alimentos
ao longo da sua cadeia de produção
– Integradores tempo/temperatura
– Sistemas de peritagem informatizada