UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2012 - 2013

CLOSTRIDIUM INFECTIES BIJ HOND EN KAT

door

Céline MORTIER

Promotor: Dorien Mot, MVSc Literatuurstudie in het kader

Medepromotor: Prof. dr. Filip Van Immerseel van de Masterproef

© 2013 Céline Mortier

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of

volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk

uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor

enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig

vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2012 - 2013

CLOSTRIDIUM INFECTIES BIJ HOND EN KAT

door

Céline MORTIER

Promotor: Dorien Mot, MVSc Literatuurstudie in het kader

Medepromotor: Prof. dr. Filip Van Immerseel van de Masterproef

© 2013 Céline Mortier

VOORWOORD

Het schrijven van deze literatuurstudie was een leerrijke ervaring. Informatie opzoeken, verwerken, en

vooral kritisch leren interpreteren is essentieel voor iedere toekomstige dierenarts. Het is belangrijk

voldoende aandacht te besteden aan de wetenschappelijke achtergrond van medische problemen. Dit

eerste deel van de masterproef was alvast een goede oefening in het objectief analyseren van

gegevens uit wetenschappelijk onderzoek, en in het zoeken naar de waarde ervan voor de praktijk.

Graag wil ik mijn promotoren Dorien Mot en Prof. Dr. Filip Van Immerseel bedanken voor hun

begeleiding. De combinatie van nuttige feedback en de kans om zelfstandig te werken, was ideaal

voor mij.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING………………………………………………………………………………………………..1

INLEIDING…………………………………………………………………………………………………….….2

LITERATUURSTUDIE…………………………………………………………………………………………...3 1. CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ......................................................................................................... 3

1.1 ETIOLOGIE ................................................................................................................................... 3

1.2 EPIDEMIOLOGIE .......................................................................................................................... 4

1.2.1 Associatie tussen isolatie van de kiem en diarree.................................................................. 4

1.2.2 Associatie tussen CPE en diarree .......................................................................................... 5

1.2.3 Endosporen en relatie met CPE ............................................................................................. 7

1.2.4 Predisponerende factoren ...................................................................................................... 7

1.2.5 Besluit ..................................................................................................................................... 8

1.3 PATHOGENESE ........................................................................................................................... 8

1.4 SYMPTOMEN ............................................................................................................................. 11

1.5 DIAGNOSE .................................................................................................................................. 11

1.5.1 Symptomen........................................................................................................................... 11

1.5.2 Fecale cytologie .................................................................................................................... 12

1.5.3 Fecale cultuur ....................................................................................................................... 13

1.5.4 Bepalen van toxine genen in C. perfringens isolaten ........................................................... 13

1.5.5 Fecale CPE detectie ............................................................................................................. 13

1.5.6 Fecale PCR .......................................................................................................................... 14

1.6 BEHANDELING ........................................................................................................................... 14

1.7 PROGNOSE ................................................................................................................................ 15

1.8 PREVENTIE ................................................................................................................................ 15

1.9 ZOÖNOTISCH BELANG ............................................................................................................. 15

2. CLOSTRIDIUM DIFFICILE ................................................................................................................ 16

2.1 ETIOLOGIE ................................................................................................................................. 16

2.2 EPIDEMIOLOGIE ........................................................................................................................ 17

2.2.1 Voorkomen van de kiem ....................................................................................................... 17

2.2.2 Associatie tussen isolatie van de kiem en diarree................................................................ 18

2.2.3 Associatie tussen toxines en diarree .................................................................................... 18

2.2.4 Incidentie C. difficile infectie (CDI) ....................................................................................... 19

2.2.5 Omgeving ............................................................................................................................. 19

2.2.6 Predisponerende factoren .................................................................................................... 19

2.3 PATHOGENESE ......................................................................................................................... 21

2.4 SYMPTOMEN ............................................................................................................................. 22

2.5 DIAGNOSE .................................................................................................................................. 22

2.5.1 Symptomen........................................................................................................................... 22

2.5.2 Fecale cultuur ....................................................................................................................... 22

2.5.3 Common antigen assay ........................................................................................................ 22

2.5.4 Real time PCR ...................................................................................................................... 23

2.5.5 Detectie fecale toxines ......................................................................................................... 23

2.5.6 Toxigene cultuur ................................................................................................................... 23

2.5.7 Combinatie............................................................................................................................ 23

2.6 BEHANDELING ........................................................................................................................... 23

2.7 PROGNOSE ................................................................................................................................ 24

2.8 PREVENTIE ................................................................................................................................ 24

2.9 ZOÖNOTISCH BELANG ............................................................................................................. 25

BESPREKING…………………………………………………………………………………………………..26

REFERENTIELIJST……………………………………………………………………………………………28

1

SAMENVATTING

Clostridium spp. zijn belangrijke veroorzakers van intestinale pathologie bij de mens en verschillende

diersoorten, zoals het paard en het varken.

Deze literatuurstudie behandelt Clostridium perfringens en Clostridium difficile geassocieerde diarree

bij de hond en kat. Het pathogeen belang van C. perfringens en C. difficile staat bij de hond en kat ter

discussie. Deze kiemen kunnen deel uitmaken van de normale microflora in de darm, maar bepaalde

studies tonen aan dat er een verband is met diarree.

De symptomen van deze infecties zijn erg uiteenlopend, en kunnen variëren van een milde

zelflimiterende diarree tot het potentieel fatale acute hemorrhagische diarree syndroom. Zowel acute

als chronische infecties kunnen voorkomen, en zowel de dunne als dikke darm kunnen betrokken zijn.

Het diagnosticeren van Clostridium infecties bij honden en katten is niet eenvoudig wegens het

voorkomen van asymptomatische dragers, het ontbreken van één standaard test en het feit dat de

technieken nog niet gevalideerd werden bij de hond en kat. Momenteel wordt aangeraden om voor C.

perfringens een combinatie van ELISA voor C. perfringens enterotoxine (CPE) detectie en PCR voor

detectie van het cpe gen te gebruiken. Voor C. difficile is de ideale benadering een combinatie van

toxine detectie door ELISA en detectie van het organisme door cultuur, common antigen assay of real-

time PCR.

De voorkeurbehandeling bestaat uit een metronidazole kuur. Voor C. perfringens kan ook tylosine

gebruikt worden. Meestal verdwijnt de diarree na enkele dagen, maar bij de chronische vorm treedt

vaak herval op en zijn regelmatig meerdere behandelingen nodig.

Algemeen wordt gesteld dat C. perfringens en C. difficile kunnen worden opgenomen in de

differentiaal diagnose van diarree bij de hond en kat, maar dat men een kritische houding moet

aannemen bij de interpretatie van testresultaten.

Key words: Bacteriology – Cat – Clostridium – Diarrhea – Dog

2

INLEIDING

Clostridium perfringens en Clostridium difficile staan al lang bekend als belangrijke intestinale

pathogenen. Zo veroorzaakt C. perfringens voedselvergiftigingen bij de mens, hemorrhagische

gastroenteritis bij het paard en necrotiserende enteritis bij biggen, kippen en kalveren (Songer, 1996).

C. difficile is verantwoordelijk voor pseudomembraneuze colitis bij de mens en necrotiserende

hemorrhagische enterocolitis bij het paard (Berry en Levett, 1986; Marks en Kather, 2003b). Ook bij

andere diersoorten kunnen de bacteriën problemen geven (Songer, 1996).

Bij de hond en kat zijn er nog veel vragen omtrent het pathogeen belang van deze twee kiemen. Een

aantal studies tonen een verband met diarree aan, maar de kiemen worden ook geregeld bij gezonde

dieren gevonden. Het voorkomen van Clostridium spp. in het darmstelsel wil dus zeker niet zeggen

dat de dieren diarree ontwikkelen (Kruth et al., 1989; Weese et al., 2001b; Marks et al., 2002). Het zou

kunnen dat ziekte slechts ontstaat wanneer bepaalde predisponerende factoren aanwezig zijn. Voor

C. difficile lijkt hospitalisatie duidelijk een risicofactor te zijn. Met antibiotica behandeling, de

belangrijkste geassocieerde factor bij de mens, lijkt echter geen verband te zijn bij hond en kat. Het

evenwicht in de darm raakt om een bepaalde reden verstoord, waardoor de kiemen kunnen aanslaan.

Er is nog niet veel geweten over de factoren die dit uitlokken (Clooten et al., 2008).

Diarree is een probleem dat dagelijks gezien wordt in elke dierenartsenpraktijk. Wanneer de klacht

niet met traditionele medicatie verdwijnt, en men geen oorzaak kan vinden, is dit een bron van

frustratie voor zowel eigenaar als dierenarts (Marks en Kather, 2003b). Alhoewel Clostridium spp. niet

bovenaan staan in de differentiaal diagnose van diarree bij de hond en kat, kan het interessant zijn om

de mogelijkheid in overweging te nemen. Er zijn gevallen beschreven van jarenlang aanslepende

diarree waarvoor men geen oorzaak kon achterhalen, die uiteindelijk waarschijnlijk te wijten waren aan

Clostridium spp. (Berry en Levett, 1986; Weese et al., 2001a). Gezien de behandeling meestal goede

resultaten oplevert, is het belangrijk om notie te hebben van het potentiële belang van deze kiemen

(Berry en Levett, 1986; Twedt, 1992).

In deze literatuurstudie worden de etiologie en epidemiologie van C. perfringens en C. difficile

uitgebreid besproken. Hierbij wordt vooral de nadruk gelegd op volgende vraag: wat is het verband

tussen deze bacteriën en diarree? Verder komen ook de pathogenese, het symptomen beeld, de

diagnose en de behandeling aan bod. Uiteindelijk zal het ook even gaan over preventieve

maatregelen en het potentiële zoönotisch belang.

3

LITERATUURSTUDIE

1. CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

1.1 ETIOLOGIE

Clostridium perfringens is een gram-positieve, anaerobe en sporenvormende bacil, die geassocieerd

wordt met intestinale ziekten bij een groot aantal species (Songer, 1996). Deze kiem kan een bewoner

zijn van het gastrointestinaal stelsel bij mens en dier, en komt daarnaast ook voor in de omgeving. Dit

maakt dat C. perfringens een van de meest wijdverspreide facultatief pathogene bacteriën is (Greene,

2006).

C. perfringens stammen kunnen één of meerdere major toxines (alpha, beta, epsilon en iota)

produceren. Op basis van aanwezigheid van de genen coderend voor deze major toxines

(respectievelijk het cpa, cpb, etx en iA gen) worden ze onderverdeeld in 5 biotypes, A tot E (Tabel 1)

(Rood en Cole, 1991; Songer, 1996).

Tabel 1. Indeling Clostridium perfringens in biotypes (uit Greene, 2006)

Major toxine

Type α β ι ε enterotoxine (CPE)

A + - - +/-

B + + - + +/-

C + + - - +/-

D + - - + +/-

E + - + - +/-

Nagenoeg alle stammen die geïsoleerd worden bij de hond en de kat horen tot type A. Zo

verzamelden Marks et al. (2002) 843 isolaten van 103 honden, en allen bleken type A stammen te

zijn. Enkel Argenti et al. (1987) maakten melding van 5 cases waarbij type C zou betrokken zijn in

peracute lethale hemorrhagische enteritis bij honden. Deze stam zou pathogener kunnen zijn, maar

de exacte rol is nog onduidelijk.

Naast de vier major toxinen kan elk biotype minstens tien andere toxines tot expressie brengen

(Songer, 1996), waarvan het Clostridium perfringens enterotoxine (CPE) als het belangrijkste

beschouwd wordt bij hond en kat (Marks et al., 2002). Elk biotype kan het gen coderend voor dit

enterotoxine, het cpe gen, bezitten maar de meerderheid van de cpe-positieve stammen behoort tot

type A (Kokai-Kun et al., 1994; Songer en Meer, 1996). In de studie van Marks et al. (2002) bezat 15%

van de type A stammen het enterotoxine gen. Bij de andere biotypes komt cpe minder voor.

Enterotoxigene C. perfringens type A wordt geassocieerd met voedselvergiftiging en incidentele

diarree bij de mens. De bacterie is ook verantwoordelijk voor hemorrhagische gastroenteritis bij het

paard, en voor necrotiserende enteritis bij biggen (Songer, 1996). Bij de hond en kat wordt vermoed

dat C. perfringens betrokken is bij zowel acute als chronische diarree, en dat de kiem een rol kan

4

spelen in het acute hemorrhagische diarree syndroom (AHDS) (Prescott et al., 1978; Kruth et al.,

1989; Werdeling et al., 1991; Twedt, 1992; Meer et al., 1997; Sasaki et al., 1999; Marks et al., 2002).

Het is echter nog niet helemaal duidelijk wat de ware rol van C. perfringens in diarree bij de hond en

kat is. Studies hebben een verband aangetoond tussen diarree en de aanwezigheid van CPE in de

faeces van honden, maar daartegenover staat dat het enterotoxine ook wordt aangetroffen bij tot 14%

van de honden zonder diarree (Weese et al., 2001b; Marks et al., 2002).

Naast CPE is er recent een groeiende interesse in de mogelijkse rol van het beta 2 toxine in de

pathogenese van C. perfringens-geassocieerde diarree (CPAD) bij hond en kat, aangezien dit toxine

betrokken zou zijn bij enteritis bij paarden en biggen (Garmory et al., 2000). Tot op heden werd weinig

onderzoek verricht naar de betekenis bij hond en kat en is er niet veel bruikbare informatie

beschikbaar. Thiede et al. (2001) voerden een studie uit bij de hond, waaruit bleek dat het cpb2 gen,

dat codeert voor het beta 2 toxine, aanwezig was bij 33% van de faecesstalen verzameld van dieren

met diarree. Marks en Kather (2003b) onderzochten 269 isolaten, en isoleerden beta 2-toxigene

stammen bij 22% van de honden met diarree, en bij 15% van de gezonde controledieren.

Het feit dat meerdere virulentiefactoren mogelijks een rol kunnen spelen in de pathogenese,

bemoeilijkt de interpretatie van het pathogene belang van C. perfringens. Het heeft ook tot gevolg dat

bij isolatie van een niet-enterotoxigene stam bij een dier met diarree niet kan worden uitgesloten dat

C. perfringens betrokken is (Marks et al., 2011).

C. perfringens kan deel uitmaken van de normale intestinale microflora bij de hond en de kat.

Verschillende onderzoekers hebben aangetoond dat de kiem aan een gelijkaardig percentage kan

worden geïsoleerd uit de faeces van dieren met (27-86%) en zonder (11-100%) diarree (Weese et al.,

2001b; Marks et al., 2002).

Het aantreffen van een type A stam in de faeces van een hond of kat heeft dus weinig klinische

relevantie, aangezien deze ook regelmatig bij gezonde dieren gevonden wordt (Twedt, 1992).

Daarnaast lijkt het alpha toxine bij hond en kat, in tegenstelling tot andere diersoorten, een lage

toxiciteit te hebben, en wordt de mogelijkheid om ziekte te veroorzaken waarschijnlijk meer bepaald

door het al dan niet produceren van het enterotoxine of het beta 2 toxine (Weese, 2011).

1.2 EPIDEMIOLOGIE

1.2.1 Associatie tussen isolatie van de kiem en diarree

Verschillende auteurs hebben onderzocht of er een verband bestaat tussen diarree bij hond en kat en

het detecteren van C. perfringens stammen in de faeces. Zo voerden Marks et al. (1999) een studie uit

op 144 faecesstalen van honden, waarbij eidooier agar platen gebruikt werden voor het cultiveren van

de kiem. Er was geen significant verschil in aan- of afwezigheid van C. perfringens tussen de dieren

met en deze zonder diarree.

Dit resultaat stemt overeen met dat van Werdeling et al. (1991). In dat onderzoek kon C. perfringens

geïsoleerd worden bij 77.9% van de honden met diarree, en bij 53.9% van de gezonde honden. Bij

katten met diarree werd de kiem gedetecteerd in 65.6% van de gevallen, bij katten zonder diarree was

50% van de stalen positief. Ook het aantal aanwezige C. perfringens stammen werd bepaald. In de

5

groepen met diarree bedroeg dit 104-10

10 kolonie vormende eenheden (cfu) per gram faeces, in de

gezonde controlegroep 104-10

8 cfu/g faeces.

Weese et al. (2001b) daarentegen, vonden wel een significante associatie tussen de aanwezigheid

van C. perfringens en diarree bij honden. De kiem werd geïsoleerd uit 86% van de stalen verzameld

bij dieren met diarree en uit 71% van de controlestalen. De auteur benadrukt wel dat de hoge

isolatiefrequentie bij gezonde dieren ervoor zorgt dat er aan de hand van cultuur geen conclusies naar

diagnose van C. perfringens-geassocieerde ziekte kunnen worden genomen.

Kruth et al. (1989) kwantificeerden C. perfringens in de faeces en vond een significant hoger aantal

stammen bij de dieren met diarree.

Marks et al. (2002) voerden een studie uit waarbij C. perfringens gecultiveerd werd uit 75% van de

stalen van honden met diarree, en uit 83% van de stalen afkomstig van de controlegroep. Hij stelt dat

isolatie een erg onbetrouwbare methode is voor de diagnose van C. perfringens-geassocieerde

diarree. Wanneer men de kiem echter niet kan isoleren, helpt dit wel bij het uitsluiten van een

mogelijke betrokkenheid van C. perfringens bij diarree, zoals eerder door Weese et al. (2001b) werd

aangehaald.

De prevalentie van C. perfringens bij gezonde katten lijkt lager dan bij de hond, en bedraagt 43 tot

63% (S.L.M., ongepubliceerde data).

Algemeen blijkt dat isolatie van C. perfringens uit een faecesstaal geen betekenisvolle informatie

oplevert. De meeste onderzoekers gaan akkoord dat er geen duidelijke associatie is tussen isolatie

van de kiem en diarree. Dit is ook logisch aangezien C. perfringens een bewoner kan zijn van de

normale intestinale microflora. Isolatie van de kiem wil ook niet zeggen dat de vereiste

virulentiefactoren om ziekte te veroorzaken aanwezig zijn. Dit alles zorgt ervoor dat cultuur geen

betrouwbare methode is voor de diagnose van C. perfringens-geassocieerde diarree.

1.2.2 Associatie tussen CPE en diarree

Kruth et al. (1989) onderzochten de relatie tussen enterotoxigene C. perfringens en ziekenhuis

geassocieerde diarree bij honden. Hiervoor werden faecesstalen van honden die diarree ontwikkelden

tijdens of binnen 1 maand na verblijf in een dierenkliniek geanalyseerd, en vergeleken met de

resultaten van een gezonde controlegroep. Onder andere werd gekeken naar de aanwezigheid van

CPE in de stoelgang van de dieren aan de hand van een enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA). Bij de honden met diarree werd het enterotoxine in 41% van de gevallen aangetroffen,

tegenover slechts 7% bij de gezonde honden. Volgens deze bevinding is er een significante associatie

tussen nosocomiale diarree en het vinden van CPE in de faeces.

Ook Weese et al. (2001b) kwamen in een studie bij 142 honden tot deze conclusie. Daarin was 28%

van de dieren met diarree, en 5% van de gezonde honden CPE-positief.

Marks et al. (1999) daarentegen, vonden geen significant verschil in de aanwezigheid van CPE tussen

gezonde honden versus dieren met diarree. Van de dieren met diarree had 26.8% C. perfringens

enterotoxine in de stoelgang. Gezonde dieren werden bemonsterd in twee groepen, een deel

gehospitaliseerde honden en een deel ambulante patiënten. Bij hen werd CPE gedetecteerd in 24.0%

respectievelijk 26.4% van de gevallen.

6

Weese et al. (2001b) suggereerden dat het verschil in waarnemingen tussen de verschillende auteurs,

kan gelegen zijn aan het feit dat Marks et al. (1999) gebruik maakten van de reverse passive latex

agglutination (RPLA) assay voor de detectie van CPE, terwijl de andere onderzoekers kozen voor

ELISA. Er werd aangetoond dat ELISA een specifiekere methode is voor detectie van het enterotoxine

dan RPLA (Berry et al., 1988).

Werdeling et al. (1991) konden wel een associatie tussen CPE en diarree aantonen met RPLA. Zij

detecteerden CPE bij 48.5% van de honden met diarree, en bij 28.1% van de katten met diarree. Bij

de gezonde dieren kon geen enterotoxine aangetoond worden.

Cave et. al (2002) vonden een associatie tussen diarree en de aanwezigheid van C. perfringens

enterotoxine bij gebruik van RPLA (45.2% van de diarreehonden CPE-positief, versus 25% van de

controlegroep), maar niet bij het aanwenden van ELISA (CPE gedetecteerd bij 14.3% van de

diarreehonden tegenover 12% bij de gezonde dieren).

Bij het bestuderen van het acute hemorrhagische diarree syndroom (AHDS) vonden ze dan weer wel

een associatie met detectie van CPE via ELISA (67% van de honden met AHDS was CPE-positief),

en niet via RPLA. Hierbij ging het om honden die plots acute hemorrhagische diarree of hematemesis

ontwikkelden. De auteurs vermelden dat de associatie tussen CPE en AHDS niet beoordeeld kan

worden aan de hand van de uitgevoerde RPLA in deze studie, omdat de prevalentie van AHDS erg

laag was in de groep geteste dieren.

In een latere studie uitgevoerd door Marks et al. (2002), waarbij hij ditmaal ook gebruik maakte van

ELISA, werd wel een significante associatie gevonden tussen detectie van CPE in de faeces en

diarree. In de groep van honden met diarree werd 34.4% van de stalen CPE-positief bevonden, bij de

gezonde dieren 14.3% respectievelijk 12.1% naargelang het om gehospitaliseerde honden of

ambulante patiënten ging. Daarnaast werden de isolaten met behulp van een polymerase chain

reaction (PCR) getest op aanwezigheid van het cpe gen. Hier toonden de auteurs een significant

verband aan tussen de detectie van het gen, en het lijden aan diarree.

De meerderheid van de auteurs kwam tot het besluit dat er een significante associatie bestaat tussen

diarree en detectie van C. perfringens enterotoxine in de faeces van honden. Deze bevinding wordt

overschaduwd door het feit dat CPE ook wordt gevonden bij tot 14% van de honden die geen diarree

hebben. Er is een vermoeden dat het enterotoxine een potentieel agens is in de pathogenese van C.

perfringens-geassocieerde diarree, maar er is verder onderzoek vereist. Hierbij moet zeker aandacht

besteed worden aan het mogelijks belang van predisponerende factoren.

Verder vermelden Cave et al. (2002) dat men geen causaal verband kan aantonen, gezien er bij dit

soort studies geen informatie is over het al dan niet aanwezig zijn van het enterotoxine alvorens de

dieren diarree ontwikkelden. De bevindingen zouden namelijk ook net een respons op de diarree

kunnen zijn, waarbij residente bacteriën sterker prolifereren wegens het veranderde microklimaat

(Kruth et al., 1989).

Marks et al. (2002) geven een mogelijke verklaring voor het hoog aantal CPE-positieve stalen bij

gezonde dieren. Het zou kunnen zijn dat het enterotoxine pas vanaf een bepaalde concentratie ziekte

veroorzaakt. Aangezien de gebruikte ELISA enkel een idee geeft over de aan- of afwezigheid van het

toxine, kan het interessant zijn om in de toekomst studies uit te voeren met kwantificatie van CPE.

De rol van CPE bij de kat is eveneens onduidelijk want het enterotoxine werd slechts bij 4.1% van de

katten met diarree gedetecteerd, terwijl het ook voorkwam bij 2% van de katten zonder diarree

(S.L.M., ongepubliceerde data).

7

1.2.3 Endosporen en relatie met CPE

De sporulatie en enterotoxinevorming zijn gecoreguleerd bij C. perfringens aangezien de sporulatie

genen en het cpe gen geactiveerd worden door dezelfde transcriptiefactoren (Rood en Cole, 1991).

Twedt (1992) beweert dat men zelden grote hoeveelheden (meer dan 103 organismen per gram) C.

perfringens endosporen aantreft in de faeces van gezonde honden, en dat er een correlatie is tussen

het aantal sporen en de aanwezigheid van CPE. Er wordt voorgesteld een sporentelling uit te voeren

op faecesuitstrijkjes als een snelle screeningtest voor C. perfringens-geassocieerde diarree.

Marks et al. (1999) vonden in een studie dat de prevalentie van endosporen significant verschilde

tussen honden met en honden zonder diarree. Bij de dieren met diarree werden endosporen

gedetecteerd in 41.5% van de gevallen. In de groep van honden zonder diarree waren endosporen

aanwezig bij 60% respectievelijk 71.7% van de dieren, naargelang het om gehospitaliseerde of

ambulante patiënten ging. Er was echter geen verschil tussen de drie groepen in het mediane aantal

endosporen aanwezig in de faeces.

De auteurs bestudeerden ook de correlatie tussen het aantal sporen in de faeces en de aanwezigheid

van CPE. Globaal gezien had 22.2% van de dieren een positief resultaat bij de CPE detectie, ondanks

een lage sporentelling van 2.6 of minder endosporen per olie immersie veld. Bij de CPE-negatieve

dieren had 11.1% toch een hoge telling van 5 tot 156 sporen per veld. Hieruit kan worden besloten dat

er geen associatie was tussen de aanwezigheid van het enterotoxine en het aantal endosporen in de

faeces.

Ook in een studie van Weese et al. (2001b) kon geen correlatie worden aangetoond tussen het aantal

endosporen geteld op faecesuitstrijkjes en de detectie van CPE.

Marks et al. (2002) vonden bij een groep honden zonder diarree eveneens geen associatie tussen de

endosporentelling en aanwezigheid van het C. perfringens enterotoxine. Bij de dieren met diarree

vonden ze echter wel een significant verschil. De auteurs besluiten dat het tellen van endosporen op

faecesuitstrijkjes geen betrouwbare methode is om de diagnose van C. perfringens-geassocieerde

ziekte te stellen. Het is ook moeilijk om aan de hand van een uitstrijkje zeker te weten dat het werkelijk

om C. perfringens sporen gaat.

1.2.4 Predisponerende factoren

Bij de mens blijkt er een associatie te zijn tussen C. perfringens-geassocieerde diarree en

voorafgaande antibiotica toediening (Borriello et al., 1985). Kruth et al. (1989) bekeken de

voorgeschiedenis van 30 honden met ziekenhuis-geassocieerde diarree in een retrospectieve studie,

maar vonden hierbij geen verband met behandeling met antimicrobiële middelen.

Ook in een case van terugkerende C. perfringens-geassocieerde diarree bij een hond was er geen

recent gebruik van antibiotica (Weese et al., 2001a). Berry en Levett (1986) beschreven drie gevallen

van C. perfringens geassocieerde diarree, en twee honden hadden geen antibiotica geschiedenis.

In de studie van Marks et al. (2002) werd gekeken of de geteste honden behandeld werden met

antibiotica in de maand vooraleer de faecesstalen verzameld werden. Dit was zo bij 20% van de

dieren met diarree, bij 4.8% van de gehospitaliseerde dieren zonder diarree en bij 10.3% van de

8

ambulante patiënten zonder diarree. Er was geen associatie tussen het gebruik van antimicrobiële

middelen en detectie van CPE in de faeces. Wanneer gekeken werd naar het verband tussen isolatie

van C. perfringens en antibiotica toediening, werd zelfs een significante negatieve associatie

gevonden. In de groep van dieren met diarree was de isolatie positief bij 29% van de dieren die

antibiotica kregen, en bij 88% van de honden die niet recent behandeld waren.

Ook Weese et al. (2001b) en Cave et al. (2002) vonden geen verband tussen CPE detectie en

antibiotica toediening.

C. perfringens-geassocieerde diarree lijkt voor te komen bij alle rassen en leeftijden (Berry en

Levett,1986; Kruth et al., 1989; Twedt, 1992; Marks et al., 2002).

Kruth et al. (1989) vonden in hun retrospectieve studie geen associatie met de toediening van

medicatie of met chirurgische behandeling. Ook een verband met recente hospitalisatie werd niet

gevonden (Weese et al., 2001b).

Er bleek geen verband te zijn met het soort voeding dat aan de dieren verstrekt werd in de kliniek.

Twedt (1992) stelt dat een plots dieetwijziging wel predisponerend zou kunnen zijn aangezien dit

geassocieerd wordt met een stijging van het aantal endosporen in de faeces.

Volgens Twedt (1992) zouden stress en het voorkomen van co-infecties met andere pathogenen

predisponerend kunnen werken. Hier is echter weinig onderzoek naar gebeurd. Onder andere het

bestuderen van een simultane C. perfringens en C. difficile infectie zou interessant kunnen zijn.

1.2.5 Besluit

Het is moeilijk uit te maken wat de incidentie en prevalentie van C. perfringens infecties zijn bij de

hond en kat (Marks et al., 2011). Dit heeft te maken met de moeilijkheid om een causaal verband aan

te tonen wanneer men CPE vindt in de faeces, en met het feit dat de kiem deel kan uitmaken van de

normale darmflora en zowel bij dieren met als zonder diarree kan worden geïsoleerd. Ook het

ontbreken van testen om andere potentieel betrokken toxines te bepalen, compliceert de vraag naar

het pathogeen belang van C. perfringens. Toch zijn er een aantal bevindingen die sterk doen

vermoeden dat deze bacterie een rol speelt bij diarree bij honden en katten, zoals de associatie

tussen detectie van het enterotoxine en het corresponderende cpe gen enerzijds, en het voorkomen

van diarree anderzijds (Weese et al., 2001b; Marks et al., 2002).

1.3 PATHOGENESE

De huidige kennis omtrent de pathogenese van C. perfringens-geassocieerde diarree is vooral

toegespitst op het enterotoxine. Dit is een eiwit met een atomaire massa-eenheid van 35 kDa, dat een

receptorbindend C-terminaal domein en een cytotoxisch N-terminaal domein heeft (Fig. 1) (Songer,

1996; Marks en Kather, 2003b).

9

Fig. 1: Clostridium perfringens enterotoxine met N-terminaal deel in blauw en C-terminaal deel in rood

(uit Briggs et al., 2011)

De productie van CPE is gecoreguleerd met sporulatie van de kiem aangezien het cpe gen en de

genen betrokken bij sporulatie door dezelfde transcriptiefactoren worden geactiveerd (Rood en Cole,

1991; Songer, 1996). Sporulatie is echter niet noodzakelijk voor enterotoxine productie. Het toxine

wordt namelijk vaak foutief aanzien als een onderdeel van de sporemantel (Twedt, 1992), maar het is

geen essentieel sporecomponent want alle CPE-negatieve stammen kunnen sporuleren (Rood en

Cole, 1991; Songer, 1996). Het toxine kan dus ook worden gevormd tijdens exponentiële groei van de

kiem, maar de concentratie is wel maximaal tijdens sporulatie (Rood en Cole, 1991). Het enterotoxine

wordt vrijgezet bij lyse van de vegetatieve kiem (Songer, 1996).

Het huidige model over de werking van CPE is afgeleid van de bevindingen van McClane (2001). Om

een nog onbekende reden ondergaat C. perfringens massale sporulatie waarbij grote hoeveelheden

enterotoxine worden gevormd. Dit zou voornamelijk gebeuren in het alkalisch milieu van de distale

dunne darm en de proximale dikke darm (Twedt, 1992). Het toxine wordt dan vrijgezet en komt terecht

in het darmlumen, waar het een binding aangaat met bepaalde eiwitten van de epitheliale tight

juncties. Hierbij ontstaat een klein eiwitcomplex van zo’n 90 kDa. Dit kleine complex gaat verder

interageren met tal van andere eiwitten, waardoor grotere complexen worden gevormd. Er wordt

gedacht dat het 155 kDa complex cytotoxisch werkt, waardoor weefselschade ontstaat die ervoor

zorgt dat het toxine toegang krijgt tot occludine, één van de tight junctie eiwitten. Samen met

occludine vormt het toxine een groot complex van ongeveer 200 kDa (Fig. 2) (McClane, 2001).

10

Fig. 2: Clostridium perfringens enterotoxine-occludine complex (uit Mitchell en Koval, 2010)

Door de interactie met occludine ontstaan veranderingen in de structuur en functie van de tight

juncties. Dit resulteert in paracellulaire permeabiliteitswijzigingen waardoor er een accumulatie van

vloeistoffen gebeurt in de darm. Het verlies van vocht via het darmlumen leidt tot het ontstaan van

diarree (Twedt, 1992; McClane, 2001; Marks en Kather, 2003b).

Het effect van CPE bij de hond werd bestudeerd door Bartlett et al. (1972). Het toxine veroorzaakte

een accumulatie van vocht in de darm en diarree wanneer het oraal of rechtstreeks in het darmlumen

werd toegediend.

Er zijn 2 mogelijke wegen waarop ziekte veroorzaakt kan worden door C. perfringens. De eerste is

deze die wordt beschreven in het food-borne model. Hierbij is voedsel gecontamineerd met hoge

aantallen enterotoxigene C. perfringens. Na consumptie hiervan, gaan de kiemen sporuleren in de

dunne darm waarbij het CPE vrijkomt. Deze voedselgeassocieerde infectie komt vooral bij de mens

vaak voor (McClane, 2001).

Daarnaast bestaat ook een non-food-borne model. Hierbij beginnen commensale C. perfringens

stammen, die een normaal onderdeel vormen van de intestinale microflora, plots massaal te

sporuleren. Welke factoren dit kunnen uitlokken, is momenteel nog niet geweten. Het zou kunnen dat

plotse dieetwijzigingen of toediening van antibiotica een triggerende werking hebben (Marks en

Kather, 2003b).

Tot nu toe werden geen studies uitgevoerd bij honden om uit te maken welk van de twee modellen bij

deze diersoort een rol speelt. Het lijkt echter meer waarschijnlijk dat het om de niet-voedsel-

geassocieerde vorm gaat (Marks en Kather, 2003b).

Het is ook nog onduidelijk of C. perfringens-geassocieerde diarree een primair of secundair fenomeen

is (Weese et al., 2001b; Marks et al., 2002). Het zou kunnen dat de kiem een primair pathogeen is en

op zichzelf ziekte kan veroorzaken. De mogelijkheid bestaat ook dat proliferatie en sporulatie van C.

perfringens optreedt secundair aan een verstoring van de gastrointestinale microflora. Het is mogelijk

dat Clostridium difficile, een ander species dat mogelijks betrokken is bij diarree bij honden en katten,

en C. perfringens elkaar beïnvloeden. Er is meer onderzoek vereist naar de effecten van co-infectie

met beide kiemen (Weese et al., 2001b).

Marks et al. (2011) merken op dat de pathogene werking van het enterotoxine mogelijks pas geuit

wordt vanaf een bepaalde concentratie.

11

1.4 SYMPTOMEN

C. perfringens wordt zowel met acute als chronische diarree geassocieerd. In het eerste geval houden

de symptomen meestal zo’n vijf tot zeven dagen aan, bij de chronische vorm kan de diarree weken tot

jaren aanslepen en is er vaak een intermitterend verloop (Twedt, 1992).

Het kan gaan om dunne darm diarree, dikke darm diarree of een diffuse diarree waarbij de volledige

darm is aangetast.

Dikke darm diarree komt het meest voor. De dieren vertonen vaak tenesmus en een verhoogde

defecatiefrequentie. Hematochezia en mucus in de faeces kunnen aanwezig zijn, maar dit is niet

steeds zo (Kruth et al., 1989; Twedt, 1992; Marks et al., 1999).

Af en toe zijn er dieren die dunne darm diarree vertonen, met een waterige stoelgang (Twedt, 1992).

Ook braken kan voorkomen, maar dit is niet het hoofdsymptoom (Kruth et al., 1989; Twedt, 1992). De

meeste dieren vertonen anorexie en een milde depressie (Kruth et al., 1989), maar er zijn ook

gevallen beschreven van honden die een normale eetlust bewaarden (Weese et al., 2001a).

Over het algemeen blijft C. perfringens-geassocieerde ziekte beperkt tot een lokale infectie en

ontwikkelen er zich geen systemische symptomen zoals koorts (Twedt, 1992). Op het klinisch

onderzoek worden er naast diarree meestal geen verdere afwijkingen gevonden, en ook de

hematologische en biochemische parameters op het bloedonderzoek zijn normaal (Kruth et al., 1989;

Twedt, 1992).

C. perfringens wordt ook geassocieerd met het acute hemorrhagische diarree syndroom (AHDS).

Sasaki et al. (1999) en Schlegel et al. (2012) bespreken elk een case van AHDS bij honden. Beide

honden zijn plots gestorven na het vertonen van hemorrhagische diarree. Bij één van de honden werd

ook braken opgemerkt (Sasaki et al., 1999).

1.5 DIAGNOSE

Diagnosticeren van C. perfringens-geassocieerde diarree is niet zo eenvoudig. De kiem kan namelijk

een normale darmbewoner zijn en wordt dus ook vaak bij gezonde dieren teruggevonden. Bovendien

kan C. perfringens meerdere toxines produceren en is hun pathogeen belang nog niet helemaal

duidelijk. Er is ook niet voor alle toxines een commerciële test voorhanden.

Momenteel wordt gesteld dat de optimale diagnostische benadering bestaat uit een combinatie van

een ELISA om C. perfringens enterotoxine te detecteren, en een PCR om de aanwezigheid van het

cpe gen op te sporen. De PCR kan rechtstreeks op het staal of na isolatie van de kiem worden

uitgevoerd (Marks et al., 2002; Weese, 2011).

Twedt (1992) merkt op dat de diagnose bij dieren met chronische intermitterende diarree moet worden

gesteld gedurende een periode waarin de dieren daadwerkelijk diarree hebben.

1.5.1 Symptomen

Er zijn geen pathognomonische symptomen die kunnen helpen om de diagnose van C. perfringens-

geassocieerde diarree te stellen. Ten eerste kan het zowel om dunne darm, dikke darm, als diffuse

diarree gaan (Cave et al., 2002; Marks et al., 2002). Daarnaast is er een enorme variatie in ernst van

12

de symptomen, gaande van een milde diarree die zelflimiterend is tot een acute hemorrhagische

diarree die mogelijks fataal afloopt (Cave et al., 2002; Sasaki et al., 1999).

1.5.2 Fecale cytologie

Sommige auteurs stelden voor om faecesuitstrijkjes te gebruiken als diagnostisch middel. De stalen

worden hierbij uitgestreken op een draagglaasje, aan de lucht gedroogd of hitte-gefixeerd, gekleurd

met een standaard kleuring (bijvoorbeeld een Diff-Quik kleuring) en microscopisch bekeken. De

sporen hebben typisch het uitzicht van een veiligheidsspeld (Fig. 3) (Twedt, 1992).

Fig. 3: Clostridium perfringens endosporen op een Diff-Quik kleuring, vergroting 100x (uit Broussard,

2003)

Zo suggereerde Twedt (1992) dat het tellen van het aantal endosporen op deze uitstrijkjes gebruikt

kan worden als een snelle screeningtest. Hij stelt dat het vinden van 2 tot 3 of meer sporen per olie

immersie veld bij een 100x vergroting als abnormaal kan worden beschouwd, en dat dit een goede

indicatie geeft van betrokkenheid van C. perfringens in de etiologie. Andere studies toonden echter

aan dat er geen goede correlatie is tussen het aantal endosporen en de aanwezigheid van het

enterotoxine, of tussen sporentelling en het voorkomen van diarree (Marks et al., 1999; Weese et al.,

2001b; Marks et al., 2002). Bovendien werd vastgesteld dat C. perfringens continu sporuleert, zowel

bij gezonde honden als dieren met diarree (Marks et al., 2002). Verder kan er morfologisch geen

onderscheid gemaakt worden met de endosporen van andere Clostridium species, waartoe ook

volstrekt onschadelijke soorten behoren (Weese, 2011). Bijgevolg kan worden besloten dat fecale

endosporentelling geen betrouwbare methode voor diagnostiek is (Marks et al., 2002; Weese 2011).

Ook het gebruik van cytologie voor identificatie van de vegetatieve kiem is geen bruikbaar

diagnostisch middel. Het is moeilijk om de C. perfringens te onderscheiden van andere organismen.

Daarnaast kan de bacterie deel uitmaken van de normale darmflora en wordt ze dus ook vaak bij

gezonde dieren aangetroffen, en is er geen associatie tussen diarree en het aantal kiemen (Weese et

al., 2001b).

13

1.5.3 Fecale cultuur

Ook de geschiktheid van een cultuur voor de diagnose van C. perfringens-geassocieerde ziekte werd

onderzocht. Hiervoor werden faecesstalen rechtstreeks geënt op eidooier agar platen, waarna deze

gedurende 24 uur in een anaerobe incubatiekamer bij 37°C werden geplaatst. Daarna werd een

aantal lecithinase-positieve kolonies overgeënt op een Brucella bloed agar, die opnieuw anaeroob

geïncubeerd werd voor 24 uur. C. perfringens wordt geïdentificeerd door de kolonies die een dubbele

zone hemolyse vertonen, te testen op zuurstoftolerantie en een Gram kleuring uit te voeren (Marks et

al., 1999).

In de studie van Marks et al. (1999) werd echter geen verschil in aanwezigheid van de kiem tussen

honden met en zonder diarree gevonden. Ook Werdeling et al. (1991) kwamen tot deze bevinding.

Hieruit blijkt dat men voor de diagnose niet kan steunen op isolatie van C. perfringens uit de faeces

(Marks et al., 1999). Wanneer men de kiem niet kan isoleren, kan dit wel helpen bij het uitsluiten van

C. perfringens als etiologisch agens. Bij 96% van stalen waarin CPE gedetecteerd werd, was de

cultuur immers positief (Weese et al., 2001b).

1.5.4 Bepalen van toxine genen in C. perfringens isolaten

Het is mogelijk om de geïsoleerde C. perfringens stammen met PCR te testen op aanwezigheid van

specifieke toxine genen. Deze test is voornamelijk geschikt ter aanvulling van serologische testen die

het toxine detecteren, zoals ELISA. Wanneer een staal dat positief test voor de aanwezigheid van

CPE ook het cpe gen bezit, verkleint de kans dat het om een vals positief resultaat van de ELISA

gaat. Detectie van toxigene C. perfringens heeft ook als voordeel dat stammen die het cpe gen

bezitten maar niet in vitro sporuleren, toch kunnen worden opgespoord. Hierdoor vermindert het aantal

vals negatieve resultaten (Kokai-Kun et al., 1994).

Er zijn nog veel onduidelijkheden, zoals het belang van het cpb2 gen bij hond en kat, en de correlatie

tussen aantreffen van toxigene stammen en ziekte. Zolang hier niet meer over geweten is, kan de test

niet op zichzelf gebruikt worden (Weese, 2011).

1.5.5 Fecale CPE detectie

Om het C. perfringens enterotoxine te detecteren in faeces zijn momenteel twee testen beschikbaar,

een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en een reverse passive latex agglutination (RPLA)

assay. Deze testen worden routinematig gebruikt bij de mens. Ondanks dat er geen species

verschillen zijn en alle C. perfringens stammen antigenisch op elkaar lijken (Songer, 1996), moet bij de

interpretatie toch enige voorzichtigheid aan boord worden gelegd aangezien de testen nog niet

gevalideerd werden voor gebruik bij de hond en kat (Marks et al., 1999).

Marks et al. (2011) merken op dat een goede gevoeligheid van de testen belangrijk is omdat de

werking van het enterotoxine concentratie-afhankelijk zou kunnen zijn.

De RPLA werd beschreven in het werk van Berry et al. (1986). De resultaten moeten echter steeds

kritisch bekeken worden want het blijkt een minder specifieke methode te zijn, en vals positieve

resultaten zouden geregeld voorkomen (Berry et al., 1988; Marks et al., 1999).

De commercieel beschikbare ELISA maakt gebruik van een monoklonale antistof die gericht is tegen

het eiwit van CPE dat interageert met de enterocyten. Dit maakt dat de ELISA een specifiekere

methode is dan RPLA (Bartholomew et al., 1985; Berry et al., 1988). Wegens de kans op vals

14

positieve resultaten bij RPLA, stelt Berry et al. (1988) voor om RPLA-positieve stalen met een lage

titer opnieuw te testen met een ELISA.

Het is belangrijk te beseffen dat zowel RPLA als ELISA een CPE-positief resultaat kunnen geven

terwijl het geteste dier geen diarree heeft. Dit kan zowel veroorzaakt zijn door een onvoldoende

specificiteit van de test, als door het feit dat aanwezigheid van het enterotoxine niet altijd tot ziekte

leidt. Dit toont aan dat de interpretatie van een positief resultaat steeds met de nodige omzichtigheid

dient te gebeuren. Het geeft een vermoeden van C. perfringens-geassocieerde diarree, maar het kan

geen sluitende diagnose leveren (Weese, 2011). Ideaal gezien worden deze testen gecombineerd met

een PCR om enterotoxigene stammen te detecteren (Marks et al., 2002).

Western immunoblotting werd ook gebruikt voor CPE detectie, maar wegens de complexere en meer

tijdrovende procedure moet de voorkeur worden gegeven aan ELISA of RPLA. Het is wel een veel

specifiekere methode, waardoor het een goede manier is om bij twijfel ELISA- of RPLA-positieve

resultaten te bevestigen (Kokai-Kun et al., 1994).

Het is ook belangrijk om rekening te houden met het feit dat deze testen enkel het enterotoxine

detecteren, en geen andere toxines die mogelijks een rol kunnen spelen (Weese, 2011).

1.5.6 Fecale PCR

Men kan een polymerase chain reaction (PCR) uitvoeren op faecesstalen om de aanwezigheid van

bepaalde C. perfringens genen op te sporen. Een PCR die het cpa gen detecteert is niet nuttig omdat

dit gen aanwezig is bij alle C. perfringens stammen, en de kiem bij veel gezonde dieren voorkomt.

Het kan wel interessant zijn om genen te detecteren die coderen voor toxines met een mogelijks meer

belangrijke rol in de pathogenese, zoals het cpe of cpb2 gen (Marks et al., 2011; Weese, 2011).

Een potentieel nadeel van deze methode is de mogelijkheid op vals positieve resultaten wanneer een

stam die het gen bezit toch niet het corresponderende toxine produceert (Kokai-Kun et al., 1994).

PCR kan voorlopig nog niet als een alleenstaande test gebruikt worden. Het kan wel een goede

aanvulling vormen voor de toxine detectie assays. Wanneer een staal CPE- én cpe-positief is,

verkleint de kans op een vals positief resultaat aanzienlijk (Marks et al., 2002).

1.6 BEHANDELING

Voor de behandeling van C. perfringens-geassocieerde diarree wordt best een onderscheid gemaakt

tussen de acute en chronische vorm.

De acute diarree is vaak zelflimiterend (Twedt, 1992) en Marks et al. (2011) merken op dat de

doeltreffendheid van antibiotica in deze gevallen niet is aangetoond. Twedt (1992) raadt toch aan een

zevendaagse antibioticakuur in te stellen, waarbij de dieren meestal na 3 tot 5 dagen als genezen

verklaard kunnen worden.

De chronische intermitterende diarree is vaak moeilijker te behandelen. Initieel reageren de dieren

snel op therapie, maar in veel gevallen komt de diarree terug wanneer men de behandeling stopzet.

Meestal moet men meerdere antibioticakuren verstrekken en is de behandeling een werk van lange

adem (Twedt, 1992).

15

De gebruikte antibiotica zijn bij voorkeur metronidazole of tylosine, maar men kan ook ampicilline,

erythromycine, tetracycline en cephalexine toedienen (Kruth et al., 1989; Twedt, 1992; Weese et al.,

2001b). Recent wordt echter het gebruik van tetracyclines afgeraden omdat blijkt dat er een vrij hoge

graag van resistentie tegen dit antibioticum is (Marks en Kather, 2003a; Kather et al., 2006; Weese,

2011). Twedt (1992) merkt op dat bij chronische diarree zelfs dosissen onder de minimum

inhibitorische concentratie (MIC) een gunstig resultaat opleveren. Marks en Kather (2003a), Marks en

Kather (2003b) en Kather et al. (2006) waarschuwen echter dat dit de selectie op antibiotica

resistentie in de hand werkt. Deze resistentie zou vooral een probleem vormen bij tetracyclines: in de

studie van Marks en Kather (2003a) bleken 21% van de isolaten niet gevoelig aan dit antibioticum.

Kather et al. (2006) zag dat 96% van de C. perfringens isolaten het tetracycline resistentie gen tetA(P)

bezat.

Verder is vaak een symptomatische therapie aangewezen, zoals het toedienen van zacht voedsel en

een darmbeschermer. Bij erge dehydratatie kan intraveneuze vloeistoftherapie nodig zijn (Kruth et al.,

1989).

Het blijkt dat enkel het overschakelen naar een meer vezelrijk dieet voldoende is voor sommige

honden. Men denkt dat de sporulatie geremd wordt ten gevolgde van een pH verlaging in de darm, of

dat de kiemproliferatie wordt tegengegaan door een wijziging in het intestinale milieu (Twedt, 1992).

1.7 PROGNOSE

Acute gevallen van C. perfringens-geassocieerde diarree zijn doorgaans goed te behandelen en de

prognose is uitstekend. Bij chronische vormen treedt vaak herval op, en is een lange tot soms

levenslange therapie vereist (Twedt, 1992).

Bij gevallen van AHDS is de prognose beduidend minder goed, met mogelijks een fatale afloop

(Sasaki et al., 1999; Schlegel et al., 2012).

1.8 PREVENTIE

Aangezien besmetting vaak geassocieerd is met een gecontamineerde omgeving, zoals een

dierenkliniek, is preventie vooral gericht op een goede omgevingsontsmetting. Hiervoor dienen

desinfectantia gebruikt te worden die effectief zijn tegen de vrij resistente sporevorm (Kruth et al.,

1989; Twedt, 1992). Verder wordt een goede handhygiëne aangeraden, en isolatie van aangetaste

dieren waarbij extra hygiënemaatregelen worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en

een kiel (Kruth et al., 1989).

1.9 ZOÖNOTISCH BELANG

Honden en katten zijn waarschijnlijk van geen belang in ziekte veroorzaakt door C. perfringens bij de

mens. De kiem komt namelijk regelmatig voor bij gezelschapsdieren, terwijl zelden niet-voedsel

geassocieerde infecties bij de mens gezien worden (Weese, 2011).

16

2. CLOSTRIDIUM DIFFICILE

2.1 ETIOLOGIE

Clostridium difficile is een gram-positieve, strikt anaerobe en sporenvormende bacil die geassocieerd

wordt met darmaandoeningen bij verschillende diersoorten, zoals het paard en varken (Weese et al.,

2001b). Bij de mens is deze kiem één van de meest voorkomende oorzaken van antibiotica-

geassocieerde diarree en de belangrijkste oorzaak van pseudomembraneuze colitis (Berry en Levett,

1986; Weese et al., 2010; Marks et al., 2011). Er wordt vermoed dat C. difficile ook een rol kan spelen

bij diarree bij honden en katten, maar het is nog niet duidelijk hoe belangrijk deze potentiële

pathogeen hierbij werkelijk is (Berry en Levett, 1986; Weese et al., 2001b).

Buiten het lichaam sporuleert de kiem snel en in deze vorm kan ze jaren overleven in de omgeving.

Wanneer sporen opgenomen worden door een gastheer en in een geschikt milieu terecht komen,

gaan ze over in hun vegetatieve vorm. Wanneer deze vermeerdert, kan door productie van toxines het

darmstelsel aangetast worden (Marks et al., 2011). Niet alle stammen produceren echter toxines en

van deze zogenaamde niet-toxigene stammen wordt aangenomen dat ze geen ziekte kunnen

veroorzaken.

Oorspronkelijk dacht men dat twee toxines een belangrijke rol spelen in de pathogenese: het toxine A

en B. De meeste toxigene C. difficile stammen produceren beide toxines, maar het is gebleken dat

ook A-negatieve, B-positieve stammen voorkomen (Weese et al., 2001b; Marks et al., 2011; Weese,

2011). Recent onderzoek heeft echter aangetoond dat toxine B de belangrijkste virulentiefactor is, en

dat toxine A niet essentieel is in de pathogenese (Lyras et al., 2009).

Daarnaast bestaan nog drie andere toxines, waaronder het binaire toxine CDT, maar het belang

hiervan is nog niet duidelijk (Weese et al., 2001b; Marks et al., 2011; Weese, 2011).

Vooral bij de mens en het paard is veel onderzoek gebeurd naar C. difficile. Opvallend is de sterke

uiteenlopendheid aan symptomen tussen verschillende individuen. Het kan gaan om

asymptomatische dragers van de kiem, maar ook een acute ernstige darmontsteking kan voorkomen.

Bij de mens gaat het hierbij om een mogelijks fatale pseudomembraneuze colitis, bij veulens kan een

necrotiserende hemorrhagische enterocolitis ontstaan (Marks en Kather, 2003b).

Bij de hond en kat is het nog niet volledig duidelijk welke rol C. difficile speelt in het ontstaan van

intestinale problemen. Een aantal studies hebben een associatie aangetoond tussen de aanwezigheid

van C. difficile toxines in de faeces en ziekte (Weese et al., 2001b; Cave et al., 2002; Marks et al.,

2002). Marks et al. (2011) stellen dat C. difficile betrokken zou zijn in 10-21% van de gevallen van

honden met antibioticum-geassocieerde diarree. Mogelijks heeft de kiem ook een rol in het acute

hemorrhagische diarree syndroom (AHDS) dat voorkomt bij honden (Cave et al., 2002).

Het grootste probleem is dat men tot nu toe geen oorzakelijk verband kon aantonen, en dat de kiem

misschien eerder een opportunistische rol speelt bij darminfecties of dat het om een incidentele

bevinding gaat (Marks et al., 2011). Men kon immers nog geen diarree uitlokken bij honden door het

toedienen van C. difficile (Marks et al., 2002). Bij de mens veroorzaakt de kiem enkel problemen na

verstoring van de darmflora, voornamelijk na antibiotica gebruik. Mogelijks moeten bij de hond en kat

ook predisponerende factoren aanwezig zijn vooraleer C. difficile voor aantasting van de darm kan

zorgen (Pacheco en Johnson, 2013).

17

2.2 EPIDEMIOLOGIE

2.2.1 Voorkomen van de kiem

Borriello et al. (1983) troffen C. difficile aan in de faeces van 23% van de bemonsterde honden en

katten. Deze kolonisatie bleek evenwel niet geassocieerd met het voorkomen van diarree. Eenzelfde

resultaat werd gevonden door Chouicha en Marks (2006). In een studie door Riley et al. (1991) in

twee dierenklinieken was 39.5% drager van de kiem. C. difficile kwam even frequent voor bij katten

(38.1%) als bij honden (40.0%). Struble et al. (1994) isoleerden de bacterie bij 18.4% van de dieren,

Lefebvre et al. (2009) vonden de kiem bij 4.6% van de honden die hij bemonsterde.

Algemeen kan gesteld worden dat C. difficile geïsoleerd kan worden bij 0 tot 40% van de honden en

katten. Dieren kunnen dus asymptomatisch drager zijn van de bacterie (Marks en Kather, 2003b).

Weese et al. (2010) bekeken de aanwezigheid van de bacterie bij gezelschapsdieren in verschillende

gezinnen, en verzamelde hiertoe vijf faecesstalen per dier . De cultuur was positief bij 10% van de

honden en 21% van de katten. Opmerkelijk was dat in 93% van de gevallen slechts één van de vijf

stalen een positief resultaat opleverde. Wanneer men alle stalen samen nam, werd C. difficile

geïsoleerd bij 2.9% van de hondenstalen en 4.3% van de kattenstalen. Deze bevinding zou kunnen

betekenen dat de kolonisatie intermitterend optreedt. Het kan echter ook veroorzaakt zijn doordat de

uitscheiding rondom de detectiegrens schommelde, of door passieve passage van sporen in het

darmstelsel.

Verder werd gekeken naar de aanwezigheid van toxine A, B en CDT genen in de geïsoleerde

stammen. De resultaten hiervan worden weergeven in tabel 2.

Tabel 2. Percentage toxigene Clostridium difficile stammen en bepaling van aanwezige toxine genen

Auteur % Toxigene stammen Toxine genen

Borriello et al., 1983 23.5% niet vermeld

Riley et al., 1991 28.6% niet vermeld

Struble et al., 1994 50% A+, B+

Marks et al., 2002 70% A+, B+

Chouicha en Marks, 2006 73% niet vermeld

Clooten et al., 2008 69% A+, B+

Lefebvre et al., 2009 64.4% A+, B+, CDT-: 81.6%

A+, B+, CDT+: 7.9%

A-, B+, CDT-: 7.9%

A-, B-, CDT+: 2.6%

Weese et al., 2010 80% niet vermeld

18

2.2.2 Associatie tussen isolatie van de kiem en diarree

Weber et al. (1989) kwamen tot de conclusie dat het voorkomen van C. difficile niet sterk

geassocieerd is met intestinale klachten. De kiem werd gevonden bij 9.2% van de honden met diarree

en bij 2.7% van de dieren zonder diarree.

In een studie van Weese et al. (2001b) konden de kiem bij 7% van de honden met diarree geïsoleerd

worden terwijl de cultuur een negatief resultaat gaf bij alle gezonde honden. De auteur merkte echter

op dat studies gebaseerd op isolatie van de kiem niet geschikt zijn wegens het voorkomen van niet-

toxigene stammen en asymptomatische dragers.

Marks et al. (2002) onderzochten faecesstalen van honden en vond hierbij geen significant verschil

tussen dieren met of zonder diarree. C. difficile werd aangetroffen bij 14.3% van de gezonde honden

en bij 16.1% van de honden met diarree.

Ook Chouicha en Marks (2006) vonden geen significante associatie tussen diarree en isolatie van C.

difficile uit de faeces van honden. De bacterie werd geïsoleerd bij 30% van de dieren met diarree, en

bij 20% van de dieren zonder diarree. Struble et al. (1994) kwamen tot eenzelfde conclusie.

Algemeen kan C. difficile geïsoleerd worden bij 0 tot 57% van de honden zonder diarree (Riley et al.,

1991; Weese et al., 2001b; Marks et al., 2002; Marks en Kather, 2003b), en bij 2 tot 30% van de

katten met normale faeces (Weese et al., 2001c). Een verschil in voorkomen van de kiem tussen

gezonde honden en katten, en dieren met diarree kan dus niet aangetoond worden (Struble et al.,

1994; Marks en Kather, 2003b).

Ook wanneer met behulp van PCR gekeken werd naar de aanwezigheid van toxine A en B genen,

werd geen verschil gevonden tussen beide groepen. Toxigene stammen kwamen even frequent voor

bij dieren met en zonder diarree (Marks et al., 2002). Chouicha en Marks (2006) vonden een hoger

percentage toxigene stammen bij honden met diarree (80%) dan bij dieren zonder diarree (62%),

maar dit was geen significant verschil.

2.2.3 Associatie tussen toxines en diarree

Weese et al. (2001b) vonden een significant verband tussen diarree en de aanwezigheid van C.

difficile toxines in de faeces van honden. Bij 21% van de honden met diarree werden het toxine A, B of

beiden aangetroffen, bij dieren zonder diarree was dit slechts zo in 7% van de gevallen.

Ook Marks et al. (2002) vonden een significante associatie tussen de detectie van toxine A via ELISA

en diarree.

Ondanks dat er een significante associatie werd gevonden tussen de toxinen A en B van C. difficile en

diarree, moet men er rekening mee houden dat deze toxines ook worden aangetroffen bij gezonde

dieren. Ook bij de mens komen asymptomatische dragers voor (Weese et al., 2001b).

Chouicha en Marks (2006) merkten op dat de ELISA’s aangewend in vorige onderzoeken niet

gevalideerd werden bij honden en katten. Ze zouden een erg lage sensitiviteit hebben en niet geschikt

zijn voor gebruik bij deze diersoorten. De referentietest voor het detecteren van C. difficile toxines is

de cytotoxin B tissue culture assay (CTA). Wanneer deze gebruikt werd, bleek de aanwezigheid van

toxine B niet significant geassocieerd met het voorkomen van diarree. Men moet er dus rekening mee

houden dat studies gebaseerd op ELISA mogelijks een hoog aantal vals positieve resultaten bevatten.

19

Toxigene stammen produceren namelijk altijd toxine B, dus bij een negatieve CTA werd de diarree

waarschijnlijk niet door C. difficile veroorzaakt (Lyras et al., 2009).

2.2.4 Incidentie C. difficile infectie (CDI)

Over het voorkomen van diarree geassocieerd met C. difficile is niet veel informatie beschikbaar. De

diagnose werd gesteld bij 15% van de honden die met diarree werden aangeboden in een kliniek

(Chouicha en Marks, 2006). In andere studies is sprake van 21% (Weese et al., 2001b) en 10.2%

(Cave et al., 2002).

Weese en Armstrong (2003) vermelden een incidentie van 0.25% bij honden en katten, met een

stijging tot 1.9% tijdens een vermoedelijke uitbraak van CDI.

2.2.5 Omgeving

Weese et al. (2010) bekeken het voorkomen van de bacterie in de huiselijke omgeving. De kiem kon

geïsoleerd worden in 31% van de huizen, op 5.3% van de bemonsterde plaatsen. Hieruit blijkt dat C.

difficile algemeen voorkomt en dat mens en dier regelmatig er regelmatig mee in contact komen.

2.2.6 Predisponerende factoren

2.2.6.1 Antibiotica

Bij mensen en paarden lijkt het toedienen van antibiotica de belangrijkste predisponerende factor voor

het ontwikkelen van C. difficile geassocieerde diarree. Een C. difficile infectie (CDI) komt enkel voor

wanneer het darmmilieu verstoord is (Borriello et al., 1983; Weese et al., 2001b).

Bij honden en katten is tot nu toe geen associatie gevonden tussen antibioticabehandeling en CDI

(Weese et al., 2001b). In de studie van Borriello et al. (1983) werd de kiem frequenter geïsoleerd bij

dieren die antibiotica gekregen hadden (31%) dan bij dieren die niet behandeld werden (19%), maar

het ging niet om een significant verschil.

Riley et al. (1991) bekeken honden en katten in twee dierenklinieken. Ook hier werd geen verband

gevonden tussen antibioticagebruik en isolatie van C. difficile. Wanneer echter gekeken werd naar het

resultaat van beide klinieken samen, bleek er wel een significant verschil te zijn naargelang er al dan

niet een antibiotica geschiedenis was. Dieren die antimicrobiële middelen gekregen hadden, droegen

de kiem in 52% van de gevallen, tegenover 23.9% van de dieren die niet behandeld waren.

Toch blijkt uit de meeste studies dat er geen significant verschil is in antibiotica gebruik tussen honden

waarbij C. difficile werd geïsoleerd, en deze waarbij dat niet het geval was. Ook wanneer men keek

naar het aanwezig zijn van toxigene of niet-toxigene isolaten, was er geen verschil. Antibiotica

toediening lijkt dus geen erg belangrijke rol te spelen in het ontwikkelen van C. difficile geassocieerde

diarree bij honden (Struble et al., 1994; Weese et al., 2001b; Marks et al., 2002; Weese en Armstrong,

2003; Clooten et al., 2008).

20

2.2.6.2 Hospitalisatie

De meeste humane C. difficile infecties zijn ziekenhuis geassocieerd (Pacheco en Johnson, 2013).

Ook bij honden en katten lijkt verblijf in een dierenkliniek een risicofactor voor het ontwikkelen van C.

difficile geassocieerde diarree. Het verwerven van C. difficile tijdens de hospitalisatie was

geassocieerd met het krijgen van diarree. Van de honden die bij hun opname de kiem niet droegen,

maar hem wel verkregen tijdens hun verblijf in de kliniek, ontwikkelde 19% diarree. Bij de honden die

geen drager werden tijdens de hospitalisatie kreeg slechts 4.2% diarree (Clooten et al., 2008). Ook

werd gezien dat de isolatiefrequentie steeds toenam naarmate de dieren langer gehospitaliseerd

werden (Clooten et al., 2008).

Een oorzakelijk verband kan op deze manier niet bevestigd worden, maar een hospitaal-verworven

infectie lijkt mogelijk te zijn (Clooten et al., 2008).

In een studie door Riley et al. (1991) waarin twee klinieken werden bekeken, was er een opvallend

verschil in isolatiefrequentie tussen beide (61.0% tegenover 17.5%). In deze eerste kliniek was ook de

omgevingbesmetting hoger dan in de tweede, wat doet vermoeden dat een deel van de infecties werd

verworven in de kliniek.

Bij katten ligt de isolatiefrequentie hoger in kliniekomstandigheden dan in de algemene populatie. In

een studie waarbij katten in verschillende gezinnen bemonsterd werden, kon C. difficile geïsoleerd

worden bij 21% van de dieren (Weese et al., 2010). In twee dierenklinieken was de cultuur positief bij

38.1% van de katten (Riley et al., 1991).

In 2003 was er een uitbraak van C. difficile geassocieerde diarree bij honden en katten, waarvan

wordt vermoed dat het om een hospitaal-geassocieerde infectie ging (Weese en Armstrong, 2003).

Ook Struble et al. (1994) vonden een significant hoger aantal dragers van de kiem bij

gehospitaliseerde honden. Enkel Weese et al. (2001b) konden geen verband aantonen. Recente

hospitalisatie van honden gaf geen verschil in aan- of afwezigheid van toxines.

2.2.6.3 Andere geneesmiddelen

Weese en Armstrong (2003) vonden geen verband tussen behandeling met chemotherapeutica en

CDI. In de studie van Clooten et al. (2008) was het toedienen van immunosuppressieve

geneesmiddelen wel een risicofactor. Ook bij de mens is dit een predisponerende factor voor het

aanslaan van de kiem (Jamal et al., 2010).

2.2.6.4 Leeftijd

Struble et al. (1994) toonden aan dat C. difficile frequenter wordt geïsoleerd met toenemende leeftijd.

Dit fenomeen wordt ook bij de mens geobserveerd (Jones et al., 2013). Marks et al. (2002) vonden

daarentegen geen verband tussen uitscheiding van de kiem of aanwezigheid van toxines in de faeces

en leeftijd. Tijdens de uitbraak in 2003 (Weese en Armstrong, 2003) varieerde de leeftijd van de dieren

van 1 tot 18 jaar. Weese et al. (2010) stellen dat leeftijd geen significante predisponerende factor is.

2.2.6.5 Ras

Er zijn geen rassen bekend die gevoeliger zijn voor het ontwikkelen van CDI (Weese et al., 2010).

21

2.2.6.6 Co-infectie

Bij een aantal dieren die C. difficile toxine positief waren, werden stalen onderzocht op aanwezigheid

van andere enteropathogenen (Weese en Armstrong, 2003). In 7% van de gevallen werd ook het C.

perfringens enterotoxine (CPE) gevonden, bij 11% Giardia, bij 17% Campylobacter en bij 9.1% een

enterovirus. Er werd geen Salmonella, Yersinia of Shigella aangetroffen.

2.3 PATHOGENESE

C. difficile kan als vegetatieve kiem vermeerderen in het darmstelsel en hierbij toxines produceren.

Oorspronkelijk dacht men dat toxine B op zichzelf geen weefselschade kan induceren en dat toxine A

en B synergistisch werken. Bij konijnen en knaagdieren ontstond hemorrhagische necrose van de

darmmucosa en diarree wanneer men toxine A of een toxigene C. difficile stam toediende. Er

gebeurde echter niets wanneer alleen toxine B gegeven werd, tenzij men op voorhand de mucosa

beschadigd had (Lyerly et al., 1985).

Recent onderzoek heeft echter aangetoond dat niet toxine A, maar toxine B de sleutelrol speelt in de

pathogenese. Mutanten die geen toxine B kunnen produceren, zijn duidelijk minder virulent, terwijl

toxine A-deficiënte stammen hun pathogeniciteit behouden (Lyras et al. 2009).

Toxine A en B bestaan uit minstens 4

domeinen, voorgesteld door het zogenaamde

ABCD model. Hierbij staat het A domein voor

het glucosyltransferase dat verantwoordelijk is

voor de pathogene werking. Na binding van

het toxine aan een receptor op de

celmembraan volgt internalisatie van het

toxine-receptor complex. Het protease domein

zorgt voor een splitsing van de molecule,

waardoor het actieve glucosyltransferase vrij

in het cytosol terecht komt. Daar gebeurt

glucosylatie van Rho GTPasen, die hierdoor

geïnactiveerd worden. Dit leidt tot

depolymerisatie van actine filamenten,

waardoor het cytoskelet van de epitheelcellen

uiteen valt en er celdood volgt (Fig. 4).

Hierdoor verliest het darmepitheel zijn barrière

functie, en door permeabiliteitstoename

ontstaat vloeistof accumulatie en diarree. Dit

wordt vergezeld door een inflammatoire

reactie ter hoogte van het epitheel (Aktories,

2011; Badger et al., 2012).

Fig. 4: Structuur en werkingsmechanisme van

Clostridium difficile toxines A en B (uit Aktories, 2011)

22

De meeste studies naar pathogenese werden uitgevoerd bij andere diersoorten, en de specifieke

gevoeligheid van hond en kat werd nog niet onderzocht (Marks en Kather, 2003b). Er lijkt bij honden

en katten geen specifiek deel van het darmstelsel aangetast te zijn. Zowel dunne als dikke darm

kunnen betrokken zijn (Weese et al., 2001b).

2.4 SYMPTOMEN

De symptomen zijn erg uiteenlopend. Het kan gaan om een milde en zelflimiterende diarree, maar ook

een acute hemorrhagische diarree kan optreden (Cave et al., 2002; Weese en Armstrong, 2003;

Marks et al., 2011). Berry en Levett (1986) beschreven drie gevallen van chronische diarree waarbij

uiteindelijk werd vastgesteld dat het om een C. difficile infectie ging.

Weese et al. (2001b) bekeken in een studie 87 honden met diarree. Van de dieren waarbij C. difficile

toxines gevonden werden in de faeces, vertoonde 62% dikke darm diarree, 8% dunne darm diarree en

30% een gemengde vorm.

De meeste dieren vertonen een goede algemene toestand en een goede eetlust. Braken wordt niet

gezien, er is geen koorts en er zijn geen afwijkingen te vinden op het klinisch onderzoek (Berry en

Levett, 1986; Weese, 2011) Ook het bloedonderzoek is in de meeste gevallen normaal (Berry en

Levett, 1986). Weese et al. (2001c) beschreven een aantal gevallen bij katten. Bij één kat was een

milde lymfopenie en een milde neutropenie aanwezig. Bij de katten werd wel anorexie en een

progressieve depressie tot lethargie gezien. Door de diarree waren de dieren gedehydrateerd, en één

kat had ook koorts en vertoonde tachypnee. Abdominale palpatie leek pijnlijk te zijn.

2.5 DIAGNOSE

2.5.1 Symptomen

De symptomen zijn erg variabel en niet specifiek voor een C. difficile infectie (Marks et al., 2011).

2.5.2 Fecale cultuur

Isolatie van de kiem is geen betrouwbare manier om de diagnose van C. difficile geassocieerde

diarree te stellen. Er zijn ook niet-toxigene stammen, en dieren kunnen asymptomatisch drager zijn

van toxigene stammen. Verder moet men er rekening mee houden dat de kiem weinig zuurstoftolerant

is (Weese et al., 2001b). Men moet ook meerdere dagen wachten op het resultaat van de test (Marks

et al., 2011).

De belangrijkste rol van cultuur is het uitsluiten van C. difficile infectie. Bij een negatief resultaat mag

men er praktisch van uitgaan dat de kiem niet betrokken is (Weese, 2011).

2.5.3 Common antigen assay

Hierbij wordt het glutamaat dehydrogenase gedetecteerd, dat aanwezig is in toxigene en niet-toxigene

C. difficile stammen. Deze test heeft dezelfde beperkingen als cultuur, met als voordeel dat ze erg

23

gevoelig is (Chouicha en Marks, 2006). Als enige test is ze niet geschikt maar het is wel een goede

gevoelig is (Chouicha en Marks, 2006). Als enige test is ze niet geschikt maar het is wel een goede

screeningtest, waarbij positieve resultaten verder onderzocht dienen te worden met een andere

methode (Weese, 2011).

2.5.4 Real time PCR

Dit is een snelle en gevoelige test die vooral geschikt is voor het uitsluiten van CDI (Marks et al.,

2011). Hierbij wordt gezocht naar de aanwezigheid van toxine B genen in de faeces, aangezien toxine

B de belangrijkste virulentiefactor is. Deze test is echter nog niet gevalideerd bij honden en katten, en

momenteel valt het gebruik ervan bij deze diersoorten niet aan te raden (Weese, 2011).

2.5.5 Detectie fecale toxines

Het aantonen van C. difficile toxines in de faeces heeft als voordeel dat vals negatieve resultaten door

niet-toxigene stammen vermeden worden.

De gouden standaard voor het aantonen van toxines is de cytotoxin B tissue culture assay (CTA). Dit

is echter een dure en tijdrovende test, waardoor hij niet geschikt is voor routine diagnostiek (Chouicha

en Marks, 2006; Marks et al., 2011). Momenteel wordt gebruik gemaakt van ELISA’s maar geen

enkele van deze testen werd grondig geëvalueerd bij de hond en kat. De testen blijken weinig

gevoelig te zijn bij deze diersoorten en er wordt geen standaard ELISA gebruikt door de verschillende

laboratoria. De sensitiviteit varieert van 7 tot 60% en de specificiteit van 65 tot 100% (Chouicha en

Marks, 2006). Het voordeel van ELISA is dat de test goedkoop en gemakkelijk uit te voeren is (Weese,

2011). Een ELISA gecombineerd met een cultuur of common antigen assay is betrouwbaarder voor

het stellen van de diagnose (Weese, 2011).

2.5.6 Toxigene cultuur

Hierbij wordt cultuur gecombineerd met detectie van toxine genen. Ook hier spoort men enkel de

toxigene stammen op, waardoor minder vals negatieve resultaten optreden (Marks et al., 2011).

2.5.7 Combinatie

Het algemene probleem bij de diagnose is dat C. difficile ook regelmatig voorkomt bij gezonde dieren,

zowel toxigene als niet-toxigene stammen. Ook toxines kunnen worden gevonden bij dieren zonder

diarree. Daarom is het belangrijk om rekening te houden met het klinisch beeld, en om verschillende

testen te combineren. Ideaal wordt zowel een toxine test (ELISA) als een test voor detectie van het

organisme (cultuur, common antigen assay of real-time PCR) uitgevoerd. Wanneer beiden een positief

resultaat opleveren is dit suggestief voor CDI, maar de interpretatie moet steeds met de nodige

voorzichtigheid gebeuren (Marks et al., 2011).

2.6 BEHANDELING

Het is niet duidelijk of asymptomatische dragers van toxigene C. difficile een verhoogd risico lopen op

het ontwikkelen van diarree. Het is bijgevolg niet nodig dieren te behandelen die geen diarree

vertonen (Weese et al., 2001b).

24

Een symptomatische behandeling kan nodig zijn, afhankelijk van hoe erg en acuut de symptomen zijn.

Bij erge dehydratatie is vloeistoftherapie een must. In het (zeldzame) geval van anorexie is nutritionele

ondersteuning aan te raden. In de meeste gevallen blijft de algemene toestand van de dieren echter

goed, en is geen kritische zorg nodig (Weese et al., 2001c; Marks et al., 2011).

Wanneer men een vermoeden heeft van een antibiotica-geassocieerde infectie, is het beter deze

behandeling stop te zetten, als de toestand van de patiënt dit toelaat (Marks et al., 2011). Als het een

hospitaal-verworven ziekte lijkt, is het belangrijk hygiënische maatregelen te nemen om herinfectie en

besmetting van andere dieren te voorkomen (Weese en Armstrong, 2003).

De behandeling van CDI gebeurt bij voorkeur met metronidazole. Dit kan oraal worden toegediend

aan een dosis van 10-15mg/kg tweemaal daags, of intraveneus aan 15mg/kg tweemaal per dag. Deze

therapie wordt klassiek 5 tot 7 dagen aangehouden, en in de meeste gevallen verdwijnen de

symptomen na enkele dagen (Berry en Levett, 1986; Weese et al., 2001c; Marks et al., 2011). In de

praktijk bleek echter een hoog aantal recidieven voor te komen na stopzetten van de behandeling.

Vaak zijn meerdere kuren van langere duur noodzakelijk voor het definitief oplossen van het probleem

(Berry en Levett, 1986). Er lijkt geen resistentie tegen metronidazole voor te komen bij C. difficile

(Weese en Armstrong, 2003).

In de humane geneeskunde wordt ook vancomycine gebruikt. Er wordt echter aangeraden dit

antibioticum voor te behouden voor de mens omdat het daar onmisbaar is bij ernstige gevallen van

CDI, en men resistentie ontwikkeling wil vermijden (Marks et al., 2011).

Di-tri-octohedral smectiet is een stof die toxines adsorbeert en regelmatig gebruikt wordt voor de

behandeling van CDI bij het paard. Ook bij de hond kan dit product ter ondersteuning worden

toegediend, maar er is geen bewijs over de doeltreffendheid ervan (Weese en Armstrong, 2003;

Marks et al., 2011).

Ook probiotica en een dieet met een hoog vezelgehalte kunnen een bijdrage leveren, maar wederom

is de effectiviteit hiervan niet aangetoond (Weese en Armstrong, 2003; Marks et al., 2011).

2.7 PROGNOSE

In de meeste gevallen reageert de diarree snel op metronidazole behandeling. Na stopzetten van

deze behandeling wordt echter regelmatig beschreven dat de dieren snel hervallen. In die gevallen

zijn vaak meerdere kuren nodig, die soms maandenlang moeten worden aangehouden. Toch valt de

prognose gunstig te noemen en blijft de algemene toestand van de dieren meestal goed (Berry en

Levett, 1986).

Bij erge en acute gevallen van hemorrhagische diarree (AHDS) is de prognose veel minder goed, en

deze aandoening kan fataal aflopen (Cave et al., 2002; Weese en Armstrong, 2003; Marks et al.,

2011).

2.8 PREVENTIE

De sporen van C. difficile zijn resistent aan alcohol, maar ze kunnen wel vernietigd worden met

bleekwater of waterstof peroxide (Marks et al., 2011).

25

Bij een uitbraak van CDI worden best een aantal hygiënische maatregelen genomen. Dieren met

diarree kan men best in quarantaine houden en bij het betreden van deze ruimte zou men ideaal

gezien een kiel, handschoenen en overschoenen moeten dragen. De vloer wordt best schoongemaakt

met een 10% bleekwater oplossing (Weese en Armstrong, 2003). Verder wordt voorgesteld sterk

besmette uitlaatgebieden te voorzien van een nieuwe toplaag zodat aanwezige sporen verwijderd

worden (Weese en Armstrong, 2003).

2.9 ZOÖNOTISCH BELANG

Tot nu toe zijn er geen bewijzen dat honden een besmettingsbron voor de mens kunnen vormen,

maar men kan deze mogelijkheid nog niet uitsluiten (Weese et al., 2001b). Sommige auteurs denken

dat huisdieren als reservoir kunnen optreden (Borriello et al., 1983; Riley et al., 1991). In een

dierenkliniek waar men de prevalentie van C. difficile bekeek, meldde een medewerker dat hij aan

terugkerende diarree leed. Het is evenwel niet duidelijk of deze klacht werkelijk door C. difficile werd

veroorzaakt (Riley et al., 1991).

Wanneer een hondeneigenaar antibiotica kreeg of immunogecomprimeerd was, hadden de honden

een grotere kans om gekoloniseerd te zijn. Dit zou erop kunnen wijzen dat transmissie tussen mens

en dier mogelijk is (Lefebvre et al., 2009; Weese et al., 2010).

Aangezien CDI een belangrijke humane ziekte is, en de stammen die gevonden worden bij honden en

katten niet verschillend lijken van deze bij de mens, is het toch verstandig om C. difficile als een

potentieel zoönotisch agens te beschouwen (Marks et al., 2011).

26

BESPREKING

De centrale vraag in dit verhaal is: welke rol spelen Clostridium spp. nu werkelijk in het ontstaan van

diarree bij hond en kat? Alhoewel sommige studies een verband lijken te tonen, is er een gebrek aan

duidelijk bewijs.

Algemeen gezien is er geen significant verband te vinden tussen isolatie van Clostridium spp. uit de

faeces van honden en katten en het voorkomen van diarree.

Bij onderzoek naar C. perfringens bleek er geen associatie te zijn in de meeste studies (Werdeling et

al., 1991; Marks et al., 1999; Marks et al., 2002). In de studie van Weese et al. (2001b) was wel een

associatie aanwezig, maar ook bij gezonde dieren werd C. perfringens aan een erg hoge frequentie

geïsoleerd.

Ook een positieve cultuur voor C. difficile bleek weinig geassocieerd te zijn met diarree klachten

(Weber et al., 1989; Riley et al., 1991; Struble et al., 1994; Weese et al., 2001b; Marks et al., 2002,

Marks en Kather, 2003b; Chouicha en Marks, 2006b).

Algemeen blijkt dat er geen sterke associatie is tussen de aanwezigheid van de kiem en diarree. Dit

zou kunnen komen door het aantonen van niet-toxigene stammen of door het feit dat Clostridium spp.

wel diarree kunnen veroorzaken, maar dat hiervoor bepaalde predisponerende factoren moeten

aanwezig zijn. Een bepaalde concentratie aan toxines zou vereist kunnen zijn, of het kan dat eerst

een verstoring van het darmmilieu aanwezig moet zijn. Hieruit blijkt de nood aan meer onderzoek naar

predisponerende factoren. Ook zou het kunnen dat het aantreffen van Clostridium spp. bij dieren met

diarree een toevalsbevinding is.

Wanneer men kijkt naar de aanwezigheid van Clostridium toxines in de faeces, valt op dat niet alle

studies hetzelfde resultaat bekwamen. Sommigen vonden een verband tussen deze toxines en

diarree (Kruth et al., 1989; Weese et al., 2001b; Marks et al., 2002), maar er waren net zo goed

studies die helemaal geen associatie aantoonden (Marks et al., 1999; Chouicha en Marks, 2006).

Zelfs wanneer er wel een verband was, waren er nog steeds dieren zonder diarree die toxine-positief

bleken. Of dit er nu op wijst dat toxines ook bij gezonde dieren kunnen worden gevonden, of dat de

specificiteit van de test niet optimaal is, is niet duidelijk.

Bij het onderzoek naar het C. perfringens enterotoxine gebruikten de verschillende auteurs niet steeds

dezelfde detectiemethode: sommigen maakten gebruik van RPLA, anderen van ELISA. Volgens Berry

et al. (1988) is deze laatste techniek specifieker, en Weese et al. (2001b) suggereerden dat dit het

verschil tussen de auteurs kon veroorzaakt hebben. Wanneer men echter per methode kijkt, blijkt dat

de resultaten van beide methoden over het algemeen niet verschillen. Met ELISA werd zowel

aangetoond dat er een verband was (Kruth et al., 1989; Weese et al., 2001b; Marks et al., 2002) als

dat er geen verband was (Cave et al., 2002). Ook bij RPLA waren er resultaten die op een associatie

wezen (Werdeling et al., 1991; Cave et al., 2002), als resultaten die dit niet deden (Marks et al., 1999).

Voor de toxines A en B van C. difficile werd wel meestal een associatie gevonden met diarree (Weese

et al., 2001b; Marks et al., 2002). In deze gevallen werd echter een ELISA gebruikt, waarvan de

sensitiviteit vrij laag is. Wanneer men de stalen met de betrouwbaardere CTA onderzocht, bleek geen

associatie meer aanwezig te zijn (Chouicha en Marks, 2006). Bij verder onderzoek zou men steeds

eenzelfde referentietest moeten gebruiken om meer vergelijkbare resultaten te bekomen.

Het feit dat beide bacteriën verschillende toxines kunnen produceren, compliceert de zaak verder. Dit

bemoeilijkt ook de diagnose. Wanneer een negatief resultaat wordt bekomen bij een toxine detectie,

27

kan immers niet worden uitgesloten dat geen ander toxine betrokken was. Verder onderzoek naar

deze minder bestudeerde toxines is nodig. Hierbij lijken vooral het C. perfringens beta 2 toxine en het

C. difficile toxine CDT belangrijk (Thiede, 2001; Weese et al., 2001b).

Bij andere diersoorten en de mens is meestal een verstoring van het darmmilieu aanwezig wanneer

problemen ontstaan. Bij de hond en kat valt op dat hier erg weinig onderzoek naar gebeurd is. Vooral

over C. perfringens is weinig of geen informatie beschikbaar. Clooten et al. (2008) hebben

verschillende risicofactoren voor C. difficile kolonisatie geëvalueerd, en vooral hospitalisatie bleek

geassocieerd te zijn met CDI. Antibiotica toediening, in de humane geneeskunde één van de

belangrijkste risicofactoren, lijkt tot nu toe echter niet geassocieerd met C. perfringens of C. difficile

infecties bij hond en kat. Daarom is het aangewezen de predisponerende factoren verder te

bestuderen bij deze diersoorten. Ook onderzoek naar co-infecties van C. perfringens en C. difficile zou

interessant kunnen zijn (Weese et al., 2001b).

Tot nu toe zijn de meeste studies bij de hond gebeurd. Over de kat zijn minder gegevens beschikbaar,

en er is nog meer onduidelijkheid over het pathogeen belang. Aangezien er toch gevallen van C.

difficile geassocieerde diarree bij katten beschreven zijn (Weese et al., 2001c), kan verder onderzoek

nuttig zijn.

Cruciaal voor het bewijzen van de rol van Clostridium spp. in diarree bij de hond en kat is het

aantonen van een causaal verband. De resultaten gevonden in de beschreven studies zouden

namelijk ook te wijten kunnen zijn aan een secundaire proliferatie van de kiemen. Om aan te tonen dat

C. perfringens en C. difficile werkelijk de oorzaak zijn van de diarree, zijn experimentele studies nodig.

Deze zijn tot nu toe niet uitgevoerd (Cave et al., 2002). Hierbij zou kunnen worden onderzocht of

toediening van Clostridium spp. onder gecontroleerde omstandigheden diarree kan uitlokken.

Het is ook niet duidelijk of asymptomatische dragers van de bacteriën een verhoogd risico lopen om

diarree te ontwikkelen. Ook hiernaar is verder onderzoek nodig.

Het stellen van de diagnose is niet eenvoudig. Enerzijds is voor beide bacteriën geen standaard test

beschikbaar voor toxine detectie. Dit maakt resultaten van verschillende laboratoria moeilijk

vergelijkbaar. Ook is geen enkele test gevalideerd bij hond en kat, en kan men zich vragen stellen

over de betrouwbaarheid. Dit is zeker iets waar in de toekomst aandacht aan zou moeten besteed

worden. Ideaal zou zijn dat één bepaalde techniek als uniforme test door alle labo’s zou worden

gebruikt (Marks et al., 1999; Chouicha en Marks, 2006).

Anderzijds geeft een positief testresultaat geen zekerheid over de betrokkenheid van Clostridium spp.

in de diarree, aangezien de kiemen en hun toxines ook bij gezonde dieren kunnen worden gevonden.

Daarom is het een goed idee meerdere testen te combineren (Marks et al., 2002; Marks et al., 2011).

De conclusie lijkt dat C. perfringens en C. difficile als potentiële veroorzakers van diarree bij hond en

kat kunnen beschouwd worden, maar bovenal moet een kritische houding aangenomen worden. Bij

de interpretatie van diagnostische testen moet ook steeds rekening gehouden worden met het klinisch

beeld. Bij een passend symptomenbeeld, uitsluiting van frequent voorkomende oorzaken van diarree,

en een combinatie van positieve testen, valt het zeker aan te raden een gepaste behandeling te

starten. Uit de beschreven gevallen (Berry en Levett, 1986; Twedt, 1992; Weese et al., 2001c) blijkt

dat de diarree meestal binnen enkele dagen na behandeling verdwijnt. Wanneer een dergelijke

gunstige respons op metronidazole gezien wordt, ondersteunt dit de veronderstelling dat Clostridium

spp. betrokken waren.

28

REFERENTIELIJST

Aktories K. (2011). Bacterial protein toxins that modify host regulatory GTPases. Nature Reviews

Microbiology 9 (7), 487-498.

Argenti L., Coiro R., Ciorba A. (1987). Enterite emorragica nel cane associate alla presenza di

Clostridium perfringens tipo C. Summa 4, 279-281. Bron: Journal of Veterinary Internal Medicine

(2011) 25, ref. 35, p.1206.

Badger V.O., Ledeboer N.A., Graham M.B. (2012). Clostridium difficile: epidemiology, pathogenesis,

management, and prevention of a recalcitrant healthcare-associated pathogen. Journal of Parenteral

and Enteral Nutrition 36 (6), 645-662.

Bartholomew B.A., Stringer M.F., Watson G.N. (1985). Development and application of an enzyme

linked immunosorbent assay for Clostridium perfringens type A enterotoxin. Journal of Clinical

Pathology 38, 222-228.

Bartlett M.L., Walker H.W., Ziprin R. (1972). Use of dogs as an assay for Clostridium perfringens

enterotoxin. Applied Microbiology 23, 196-197.

Berry A.P., Levett P.N. (1986). Chronic diarrhea in dogs associated with Clostridium difficile infection.

Veterinary Record 118 (4), 102-103.

Berry P.R., Rodhouse J.C., Hughes S. (1988). Evaluation of ELISA, RPLA, and Vero cell assays for

detecting Clostridium perfringens enterotoxin in faecal specimens. Journal of Clinical Pathology 41,

458-461.

Berry P.R., Stringer M.F., Uemura T. (1986). Comparison of latex agglutination and ELISA for

detection of Clostridium perfringens type A enterotoxin in faeces. Letters in Applied Microbiology 2 (5),

101-102.

Borriello S.P., Honour P., Turner T. (1983). Household pets as a potential reservoir for Clostridium

difficile infection. Journal of Clinical Pathology 36, 84-87.

Borriello S.P., Barclay F.E., Welch A.R. (1985). Epidemiology of diarrhea caused by enterotoxigenic

Clostridium perfringens. Journal of Medical Microbiology 20, 363-372.

Briggs D.C., Naylor C.E., Smedley J.G. (2011). Structure of the food-poisoning Clostridium perfringens

enterotoxin reveals similarity to the aerolysin-like pore-forming toxins. Journal of Molecular Biology

413, 138-149.

Broussard J.D. (2003). Optimal fecal assessment. Clinical Techniques in Small Animal Practice 18 (4),

218-230.

Cave N.J., Marks S.L., Kass P.H. (2002). Evaluation of a routine diagnostic fecal panel for dogs with

diarrhea. Journal of the American Veterinary Medical Association 221, 52-59.

Clooten J., Kruth S., Arroyo L. (2008). Prevalence and risk factors for Clostridium difficile colonization

in dogs and cats hospitalized in an intensive care unit. Veterinary Microbiology 129 (1-2), 209-214.

Chouicha N., Marks S.L. (2006). Evaluation of five enzyme immunoassays compared with the

cytotoxicity assay for diagnosis of Clostridium difficile-associated diarrhea in dogs. Journal of

Veterinary Diagnostic Investigation 18 (2), 182-188.

Garmory H.S., Chanter N., French N.P. (2000). Occurrence of Clostridium perfringens beta 2-toxin

amongst animals, determined using genotyping and subtyping PCR assays. Epidemiology and

Infection 124, 61-67.

Greene C.E. (2006). Infectious Diseases of the Dog and Cat. 2th edition. Saunders, Philadelphia, p.

363-368.

29

Jamal W., Rotimi V.O., Brazier J. (2010). Analysis of prevalence, risk factors and molecular

epidemiology of Clostridium difficile infection in Kuwait over a 3-year period. Anaerobe 16 (6), 560-

565.

Jones A.M, Kuijper E.J., Wilcox M.H. (2013). Clostridium difficile: A European perspective. Journal of

Infection 66 (2), 115-128.

Kather E.J., Marks S.L., Foley J.E. (2006). Determination of the prevalence of antimicrobial resistance

genes in canine Clostridium perfringens isolates. Veterinary Microbiology 113, 97-101.

Kokai-Kun J.F., Songer J.G., Czeczulin J.R. (1994). Comparison of western immunoblots and gene

detection assays for identification of potentially enterotoxigenic isolates of Clostridium perfringens.

Journal of Clinical Microbiology 32, 2533-2539.

Kruth S.A., Prescott J.F., Welch M.K. (1989). Nosocomial diarrhea associated with enterotoxigenic

Clostridium perfringens infection in dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association 195,

331-334.

Lefebvre S. L., Reid-Smith R.J., Waltner-Toews D. (2009). Incidence of acquisition of methicillin-

resistant Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, and other health-care-associated pathogens by

dogs that participate in animal-assisted interventions. Journal of the American Veterinary Medical

Association 234 (11), 1404-1417.

Lyerly D.M., Saum K.E., MacDonald D.K. (1985). Effects of Clostridium difficile toxins given

intragastrically to animals. Infection and Immunity 47 (2), 349-352.

Lyras D., O’Connor J.R., Howarth P.M. (2009). Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile.

Nature 458 (7242), 1176-1181.

Marks S.L., Kather E.J., Kass P.H. (2002). Genotypic and phenotypic characterization of Clostridium

perfringens and Clostridium difficile in diarrheic and healthy dogs. Journal of Veterinary Internal

Medicine 16, 533-540.

Marks S.L., Kather E.J. (2003a). Antimicrobial susceptibilities of canine Clostridium difficile and

Clostridium perfringens isolates to commonly utilized antimicrobial drugs. Veterinary Microbiology 94,

39-45.

Marks S.L., Kather E.J. (2003b). Bacterial-associated diarrhea in the dog: a critical appraisal.

Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 33, 1029-1060.

Marks S.L., Melli A., Kass P.H. (1999). Evaluation of methods to diagnose Clostridium perfringens-

associated diarrhea in dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association 214, 357-360.

Marks S.L., Rankin S.C., Byrne B.A. (2011). Enteropathogenic bacteria in dogs and cats: diagnosis,

epidemiology, treatment, and control. Journal of Veterinary Internal Medicine 25, 1195-1208.

McClane B.A. (2001). The complex interactions between Clostridium perfringens enterotoxin and

epithelial tight junctions. Toxicon 39, 1781-1791.

Meer R.R., Songer J.G., Park D.L. (1997). Human disease associated with Clostridium perfringens

enterotoxin. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology 150, 75-94.

Mitchell L.A., Koval M. (2010). Specificity of interaction between Clostridium perfringens enterotoxin

and claudin-family tight junction proteins. Toxins 2 (7), 1595-1611.

Riley T.V., Adams J.E., O’Neill G.L. (1991). Gastrointestinal carriage of Clostridium difficile in cats and

dogs attending veterinary clinics. Epidemiology and Infection 107, 659-665.

Rood J.I., Cole S.T. (1991). Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens .

Microbiological Reviews 55, 621-648.

Pacheco S.M., Johnson S. (2013). Important clinical advances in the understanding of Clostridium

difficile infection. Current Opinion in Gastroenterology 29, 42-48.

30

Prescott J.F., Johnson J.A., Patterson J.M. (1978). Hemorrhagic gastroenteritis in dog associated with

Clostridium welchii. Veterinary Record 103 (6), 116-117.

Sasaki J., Goryo M., Asahina M. (1999). Hemorrhagic enteritis associated with Clostridium perfringens

type A in a dog. Journal of Veterinary Medical Science 61 (2), 175-177.

Schlegel, B.J., Van Dreumel T., Slavic D. (2012). Clostridium perfringens type A fatal acute

hemorrhagic gastroenteritis in a dog. Canadian Veterinary Journal 53, 555-557.

Songer J.G. (1996). Clostridial enteric diseases of domestic animals. Clinical Microbiology Reviews 9,

216-234.

Songer J.G., Meer R.R. (1996). Genotyping of Clostridium perfringens by polymerase chain reaction is

a useful adjunct to diagnosis of clostridial enteric disease in animals. Anaerobe 2, 197-203.

Struble A.L., Tang Y.J., Kass P.H. (1994). Fecal shedding of Clostridium difficile in dogs: a period

prevalence survey in a veterinary medical teaching hospital. Journal of Veterinary Diagnostic

Investigation 6 (3), 342-347.

Thiede S., Goethe R., Amtsberg G. (2001). Prevalence of beta 2 toxin gene of Clostridium perfringens

type A from diarrhoeic dogs. Veterinary Record 149, 273-274.

Twedt D.C. (1992). Clostridium perfringens-associated enterotoxicosis in dogs. In: Kirk R.W.,

Bonagura J.D., eds. Current veterinary therapy XI: small animal practice. WB Saunders Company,

Philadelphia, p. 602-604.

Weber A., Kroth P., Heil G. (1989). The occurence of Clostridium difficile in fecal samples of dogs and

cats. Journal of Veterinary Medicine Series B - Infectious Diseases and Veterinary Public Health 36

(8), 568-576.

Werdeling F., Amtsberg G., Tewes S. (1991). Enterotoxin producing strains of Clostridium perfringens

in feces of dogs and cats. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift 104, 228-233.

Weese J.S., Greenwood S.J., Staempfli H.R. (2001a). Recurrent diarrhea associated with

enterotoxigenic Clostridium perfringens in 2 dogs. Canadian Veterinary Journal 42, 292-294.

Weese J.S., Staempfli H.R., Prescott J.F. (2001b). The roles of Clostridium difficile and

enterotoxigenic Clostridium perfringens in diarrhea in dogs. Journal of Veterinary Internal Medicine 15,

374-378.

Weese J.S., Weese H.E., Bourdeau T.L. (2001c). Suspected Clostridium difficile-associated diarrhea

in two cats. Journal of the American Veterinary Medical Association 218 (9), 1436-1439.

Weese J.S., Armstrong J. (2003). Outbreak of Clostridium difficile-associated disease in a small

animal veterinary teaching hospital. Journal of Veterinary Internal Medicine 17 (6), 813-816.

Weese J.S., Finley R., Reid-Smith R.R. (2010). Evaluation of Clostridium difficile in dogs and the

household environment. Epidemiology and Infection 138 (8), 1100-1104.

Weese J.S. (2011). Bacterial enteritis in dogs and cats: diagnosis, therapy, and zoonotic potential.

Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 41, 287-309.