Clonage Banques

8/3/2019 Clonage Banques

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POPULATION D ADN COMPLEXE

- ADN gnomique

ou- copie d ARNm = CDNA

Amplification spcifique

Clonage dans

des vecteurs

Amplification in vitro

PCR

Dtection spcifique

Hybridation molculaire

- vecteur

- lier le fragment

d ADN au vecteur

- transfert dans

lhte

- polymrase

thermostable

-information sur la

squence permettant

de gnrer des amorces

damplification

- Sonde ADN ou ARNmarque


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LE CLONAGE


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I - Proprits des vecteurs de clonage

capables de rplication autonome dans une cellule hte donne

(origine de rplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique)

possdent un polylinker ou site multiple de clonage

Possdent des proprits permettant la slection de la cellule hte (rsistance ATB)

supportent linsertion dun fragment dADN plus ou moins grand

Molecular Cell Biology



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II Principes gnraux dutilisation dun vecteur

- Prparation du vecteur

- Prparation de lADN insrer

- Ralisation dun recombinant

- Incorporation lhte


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Obtention de lADN recombinant

An Introduction to Genetic Analysis

+ traitementPAL


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La ligation (ligature...)

Une enzyme, la ligase,

est capable

de lier de faon

covalente

deux molcules dADN

en une.



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Diffrents vecteurs de clonage

Taille maximum approximative du fragment dADN qui peut

tre clon dans chaque vecteur

Type de vecteur ADN clon en kb

Plasmide

Phage lambda

Cosmide

Phage P1

BAC(bacterial artificial chromosome)

YAC (yeast artificial chromosome)

10

25

45

100

3001000


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Les plasmides comme vecteurs de clonage (1)Molcule dADN de taille rduite, d'origine bactrienne

Molcule dADN circulaire taille 2kb 5kb

Peut accepter jusqu 10kb dADN exogne

Peut tre considre comme un minichromosome capable derplication autonome

Confre la rsistance un ou plusieurs antibiotiques=

slection



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Les plasmides comme vecteur de clonage (2)


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Dfinition

Le squenage de lADN, est la dtermination de la

succession des nuclotides le composant.

Cest aujourd'hui une technique de routine pour les

laboratoires de biologie.

Cette technique utilise les connaissances qui ont tacquises depuis une trentaine d'annes sur les

mcanismes de la rplication de l'ADN.

II Principes gnraux dutilisation dun vecteur

- Prparation du vecteur

- Prparation de lADN insrer

- Ralisation dun recombinant

- Incorporation lhte


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De type procaryotique(bactries):

Cas dun vecteur plasmidique:lADN est introduit dans lesbactries traites spcialementle plus souvent par chocthermique ou par choclectrique.

Introduction de lADN recombinant dans les cellules htes

lectroporateur


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Identification des clones intressants


Dans ce cas les bactries transformes avec le vecteur nepossdant pas ou possdant linsert sont slectionnes --> uncriblage est ncessaire


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AmpRTetR

AmpRTetSClone intressant

Criblage desclonesintressants (3)

pBR322


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Dfinition








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Criblage -screening- des clones intressants (2)


Test blanc-bleu (E

complmentation)


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III - Diffrents vecteurs de

clonageTaille maximum approximative du fragment dADN qui peut

tre clon dans chaque vecteur

Type de vecteur ADN clon en kb

Plasmide

Phage lambda

Cosmide

Phage P1BAC(bacterial artificial chromosome)

YAC (yeast artificial chromosome)

10

25

45

100300

1000


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Les phages comme vecteurs de clonage


Phage = virus de bactries


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Dfinition








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Introduction de lADN recombinant dans les cellules htes

De type procaryotique:

Cas dun vecteur phagique


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Les cosmides comme vecteurs de clonage



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Les YACs comme vecteurs de clonage

YAC : Yeast Artificialchromosome


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Criblage dune banque phagique


Hybridationavec uns sonde

spcifique...Prochain cours!


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IV - APPLICATIONS DES VECTEURS

- Clonage et amplification dune squence dADN

- Cration des banques dADN gnomiques et dADNc- Introduction dun gne dans des cellules, des plantes oudes organismes(animaux transgniques)

- Production dARN- Production de protines codes par les gnes insrs


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Banques dADN

-Banques dADN gnomique

- Banques de cDNA


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Banque (librairie)dADN gnomique



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Comment dfinir si une banque estsuffisamment grande pour esprer trouver un

fragment dintrt?Calcul afin de dfinir la probabilit de trouver une squence donne

dans une banque.

N=ln(1-P)/ln(1-f)

N: nombre de recombinants

P: probabilit dsire

f: proportion de gnome dans un seul recombinant

Ex: 99% de probabilit davoir une squence reprsente dans unebanque de fragments de 17kb dun gnome eucaryote (3.109pb)

N= ln(1-0.99)/ln(1-(1,7.104/ 3.109))=8,1.105 colonies


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Banque dADNc

Le problme ici estlobtention de clone dit

full length .


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ObtentiondelADN delorganismedonneur

A partirdelARN:

Principe de la "reverse

transcription":



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Dfinition







APPLICATIONS DES VECTEURS

- Clonage et amplification dune squence dADN

- Cration des banques dADN gnomiques et dADNc- Production de protines codes par les gnes insrs

-Introduction dun gne dans des cellules, des plantes ou

des organismes(animaux transgniques)


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Production de protinesUtilisation de vecteur dexpression



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Production de protines humaines but thrapeutique

- Facteur VIII de la coagulation dans lhmophilie A

- Hormone de croissance

- Insuline


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Exemple delinsuline


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Dfinition







CELLULES HTES

-B

actries : E. Colipremier hte utilisnombreux vecteurs plasmidiques connus et utilisablesculture en masse dans les fermenteurstaux dexpression levs (plusieurs g de protine/litre)

MAIS secrtent mal les protines : clatement des bactriespas de modifications post-traductionnelles

-Levure saccharomyces cerevisiaemodifications post traductionnelles

MAIS pas de secrtion, moins bon rendement

-Cellules CHO (chinese hamster ovary)culture de masse en bioracteurs, protines complexes

MAIS cher et rendement plus faible


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Levures et bactries utilises comme usines:production d'antibiotiques -pnicilline, ttracycline-,d'enzymes comme lipases -lessives-...

Vaccins : fraction de protines viralesncessaire la production dAC

Bioractifs Enzymes de restrictiondiminution du cot

Autres exemples


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Cration de plantes transgniques



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Cration danimaux transgniques

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