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Clase PCR III: RT-PCR, y diseños especiales

2016- Docente: Adriana Krapp

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Producto delimitado por los cebadores

Productos largos de longitud variable

ADN moldePCR

Después de 30 ciclos 10 12 copias del producto delimitado por los cebadores- PCR de punto final

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Diagnóstico de enfermedades infecciosas con alta especificidad y sensibilidad(antes de que aparezcan los anticuerpos): por virus (sida, hepatitis B, hepatitis C, influenza), determinaciones de carga viral (pronóstico, respuestaterapéutica); tuberculosis, etc. No es necesario que haya organismos vivos.

Diagnóstico de cáncer: leucemias, cancer de próstata (detección de marcadores, expresión de genes específicos), etc.

Detección de enfermedades hereditarias y prenatales: distrofia muscular de Duchenne, fibrosis quística, hiperlipidemias, enfermedad celíaca, etc

Medicina forense: identificación de individuos

Filiación: pruebas de paternidad

Tipificación de tejidos para determinar compatibilidad en transplantes

Determinación de bacterias patógenas en alimentos

Paleontología, etc,etc.

Investigación : Clonado de genes, generar mutaciones puntuales o deleciones, secuenciación, estudios de expresión de genes, amplificación de secuenciasdesconocidas, etc, etc.

Para qué se usa la PCR?? Cuáles son sus aplicaciones??

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PCR MULTIPLEX es cuando se hace una PCR con más de 1 par de primers, el objetivo es amplificar varios segmentos de un ADN target. Ventaja: se ahorra el ADN templado y se hace de una sola vez. Desventaja: es difícil de optimizar debido a la presencia de tantos primers que pueden unirse al molde con distinta eficiencia, temperaturas de anillado similar, que no interactúen unos con otros, que den productos de tamaño similar pero a su vez distintos para identificarlos por electroforesis en gel. El rendimiento de cada producto amplificado se reduce en proporción al Nº de primers incluídos (hasta ocho pares). Hay que probar cada primer por separado y luego juntos, a veces es necesario modificar las conc. de oligos.

Ej. 1) Distrofia muscular de Duchenne (DMD) y distrofia muscular de Becker (BDM) son dos enfermedades genéticas recesivas unidas al cromosoma X. El gen de la distrofina tiene más de 2.000.000 pb, produce una proteína de 427 kDa (involucrada en la unión entre la matriz extracelular y el citoesqueleto citoplasmático). En DMD la distrofina está casi ausente y en BMD tienen 10-40% o producen una proteína más pequeña, no funcional. El gen tiene 70exones separados por intrones de ~35 kb y las anormalidades provienen de deleciones o duplicaciones en determinados exones. Antes se hacía un southern para investigar los exones con alteraciones, pero había que hacer entre 8 y 6 hibridaciones distintas.

PCR multiplex para DMD o BDM : diseñada por Chamberlain, en un solo tubo se amplifican distintas regiones de los exones que son más frecuentemente delecionados (hot spots), se investigan 18 exones (deleciones), y las duplicaciones se pueden investigar por multiplex bajo condiciones estrictamente cuantitativas. Se puede hacer sobre hombres afectados o mujeres portadoras. Se hacen 2 multiplex con 2 juegos de primers.

Ej. 2) Amplificación de STRs (short tandem repeats) o VNTRs (variable number of tandem repeats) en filiación: multiplex con varios pares de oligos flanqueantes a las regiones repetitivas .

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Si el molde/templado es un RNAm específico ?? El RNA por sí mismo no puede servir como templado, hay que convertirlo en cDNA y luego amplificarloesto es la RT-PCR: la retrotranscripción de un RNAm seguida de PCR

- es más sensible que otras técnicas usadas para detectar RNAm (northern, ensayos de protección con RNasa).- técnica muy importante para el diagnóstico clínico de enfermedades por retrovirus

(que tienen un genoma de RNA, ej. virus hepatitis C),- para la detección de transcriptos específicos que estarían indicando una infección activa, cronicidad (cuantificación), cuando dan negativos los anticuerpos, etc.- para hacer estudios de la expresión de un gen específico en un tejido determinado (cuantificación), etc.

PREPARACION DE LA RT-PCR

1) Obtener el RNA: es el paso crucial (especialmente si la cantidad de material biológico es limitante o el transcripto de interés es de baja abundancia) no debe estar contaminado con ADN porque va a competir con el RNA dando un resultado erróneo.

2) Tratar con Dnasa e inactivarla por calentamiento previo a laretrotranscripción

RNAm

Degradado

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Que cantidad de RNA se precisa?? 1 ug de RNA citoplasmático es más que suficiente y no es estrictamente necesario aislar el RNAm, podemos evitar ese paso que es trabajoso.

Hecha la preparación se puede cuantificar por Abs 260 nm (A260 nm=1 equivale a 40 ug ARN/litro) en un espectrofotómetro.

1-2 ul de muestra

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95º-10 min paradesnaturalizarel híbrido cDNA-RNA e inactiva la transc. Reversa

Retrotranscripción

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RETROTRANSCRIPCION puede variar en su eficiencia (desde 10-90%)

1) elegir la transcriptasa reversa2) el cebador que vamos a usar para el RNA3) las condiciones óptimas para esta reacción

Transcriptasa reversa: es una polimerasa de DNA dependiente de RNA

- AMV (avian mieloblastosis virus) Tóptima 42 ºC esta enzima posee actividad RNasa H que remueve rNTPs desde cualquier nick llevando a la degradación del templado de RNA. Actualmente se comercializa una AMV que tiene mutaciones que eliminan la actividad RNasaH y también tienen mayor estabilidad térmica (55ºC).

- MMLV (Moloney murine leukemia virus) Tóptima 37 º C

AMV Reverse Transcriptase P/RNA de alta estructura 2ría. Tº incubación hasta 58º. 300 u 194.6 Promega

AMV Reverse Transcriptase P/RNA de alta estructura 2ría. Tº incubación hasta 58º. 600 u 372.3 Promega

M-MLV Reverse Transcriptase P/transcriptos largos. 10000 u 124.7 Promega

M-MLV Reverse Transcriptase P/transcriptos largos. 50000 u 480.0 Promega

USD

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Oligonucleótidos para RT: hay tres tipos de primers que se pueden usar, depende de cuál es el propósito de hacer una RT-PCR

I) oligo dT12-18 se une al tallo de poliA en el extremo 3’ del RNAm. Se usa si se desea obtener el “full length cDNA” (cDNA de longitud completa), o si el RNAm es escaso, de pocas copias. Anchored oligo dT: asegura que el primer se una donde comienza la cola de poliA. Aumenta el rendimiento. Se obtiene cDNA de todos los RNAm.

II) N6: hexanucleotidos al azar (“random” NNNNNN) [random hexamer oligont] que pueden unirse al RNAm en cualquier sitio complementario: se obtienen cDNAs de tamaño variado. Si el RNAm forma estructuras secundarias se obtienen mejores resultados con N6 o si la región a amplificar es más cercana al 5’. Se usa para RNAm bacterianos (no tienen poliA). Amplifica también RNAt y RNAr. Se obtiene cDNAs de todos los RNA.

III) oligonucleótido específico : se une al RNAm de interés. Con fines diagnósticos usar oligo específico. Se obtiene el cDNA específico.

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Podemos hacer la RT y PCR :

En Dos pasos (two steps) Paso 1) Se hace la RT con el primer reverso elegido. Después de la RT el cDna se puede usar directamente, o sea una pequeña alícuota de la retrotranscripción para hacer la PCR. Paso 2) Hacer la PCR agregando los primers reverso (por lo general distinto al anterior) y directo. Puedo hacer distintas PCRs con distintos primers porque tengo guardada (freezer) la mezcla de la retrotranscripción.

En un paso (one step): Se agregan los primers reverso y forward (específicos) en la mezcla para hacer la RT, se hace la RT y se prosigue en el mismo tubo con la PCR. Se preparan los controles correspondientes. Se siguen los pasos A, B y C

Transcriptasa reversa y DNA polimerasa

One step: Se usa mucho para el diagnóstico pues se evitan contaminaciones.

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Si el gen no tiene intrones: es necesario tratar el RNA con una DNasa libre de RNasa previo a la RT (porque no vamos a distinguir si hay contaminación por el tamaño del producto), Ej: genes bacterianos no tienen intrones, virus de RNA, o transcriptos de RNA de virus integrados en un genoma. El tratamiento con DNasa se debe hacer para evitar los falsos positivos.

- Se trata el RNA con DNasaI por 30 min a 37 º previo a la RT- Inactivación de la DNasa (dos formas)

1) el RNA puede ser extraído con fenol/cloroformo con riesgo de perder algo de RNA

2) desnaturalización de la DNasaI por calor (inactivación) a 75º durante 5 min.

Es importante al hacer la RT-PCR que no haya contaminación con ADN porque daría falsos positivos!!

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1) Gen con intrones: diseñamos oligos en exones sucesivos

Estrategias para amplificar RNAm (y no DNA genómico y/o RNAhn)

Si el gen tiene intrones: diseñamos oligos en dos exones distintos (generalmente sucesivos) porque nos va a indicar al analizar el tamaño del fragmento obtenido si había ADN contaminante.

Los tamaños de los productos nos van a indicar si hubo contaminación con ADN genómico.

Producto más largo !!!!!

Producto del tamaño esperado

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2 ) Detectar selectivamente transcriptos de RNAm con un primer que tenga un tracto de poliT de 15 nt y una secuencia que anille en la secuencia 3’ no traducida del transcripto target. El anillado preferencial al transcripto target se logra trabajando a una Tanillado ligeramente mayor a la Tm calculada con la secuencia específica.

Secuencia específica

Porque a la temperatura de anillado definida no se hibrida el oligo 2

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3) Usando un primer específico y otro primer “junction” (unión, empalme) que abarca 75% de un exón y 25% del segundo exón en el 3’del primer

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CONTROLES cuando hacemos la RT-PCR

1) Control con RNA sin retrotranscribir: para estar seguros de que no hay contaminación con ADN (debe dar negativo).

2) Controles de la PCR usuales es decir un control negativo (sin ADNc), (puede hacerse un control positivo con un cDNA que tengamos clonado).

3) Control con un gen endógeno cuya expresión no varíe en el caso de que estemos evaluando expresión (RT-PCR semicuantitativa) ya que permite evaluar la calidad de la preparación de RNA, la eficiencia de la transcripción reversa, y de la amplificación dando una referencia de las variaciones tubo a tubo. Se deben ajustar los ciclos de la PCR para trabajar en la etapa donde la amplificación está en una etapa lineal, no llegar al plateau.

Al hacer la electroforesis en un gel de agarosa tenemos que obtener la banda del tamaño esperado. (Si el RNAm tiene splicing alternativo podríamos encontrar varios productos de PCR).

Podemos cuantificar un determinado RNAm en una muestra?? SI !la cuantificación del RNAm es útil en los casos que es necesario hacer estudios de expresión, conocer la carga viral, controlar la respuesta terapéutica a drogas, etc.

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RT-PCR semicuantitativa :Se hace la amplificación en el mismo tubo con 2 pares de cebadores: 1) para el gen que estamos investigando y 2) para el control endógeno cuya expresión no cambia (gen housekeeping). Luego se hace la corrida electroforética, se toma una imagen del gel y luego una densitometría. Obtenemos una cuantificación que es relativa a un control no tratado. El control endógeno sirve para normalizar (controlar las variaciones por tubo, etc.) ,debe ser amplificado con la misma eficiencia y estar presente en concentración similar a la secuencia target (!!!) Compite por los reactivos pero no por los primers. Se deben ajustar los ciclos de la PCR para trabajar en la fase exponencial de la misma.

La cuantificación exacta de los ácidos nucleicos (RNA o DNA) se hace por la técnica de real time (PCR en tiempo real)

RT-PCR cuantitativa competitiva: se agrega un competidor (RNA) de concentración conocida que también se retrotranscribe y amplifica con los mismos primers, pero debe dar un tamaño ligeramente distinto para poderidentificarlo. Compite con los primers, y luego se determina la concentración porcomparación con la del competidor. Es impráctica por eso no se hace.

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REAL TIME PCR: PCR en tiempo real o qPCR (PCR cuantitativa o PCR cinética)

Combina la PCR tradicional (de punto final) con moléculas fluorescentesque se unen al amplicón (producto de la PCR) permitiendo detectarlo en el mismo tubo de reacción (sistema homogéneo).

Se unen los pasos de amplificación y detección para el producto amplificado sin necesidad de hacer una electroforesis en gel (evita la manipulación del producto y las contaminaciones en el laboratorio)Es una técnica rápida, precisa, reproducible, etc.

Con ADN o ARN. Involucra moléculas reporteras que fluorescen a medida que aparece el producto de PCR mostrando la cantidadde ADN producido en cada ciclo. La fluorescencia es proporcional a la cantidad de producto.

Los tiempos en la PCR son pequeños y los productos 60-200 pb (para asegurar una buena eficiencia): MAS RAPIDA

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Químicos fluorescentes de unión al ADN: pueden ser inespecíficos (fluoróforos de unión al ADN doble hebra p.ej Syber Green) o específicos (sondas fluorescentes)

En la real time se determina el Nº de ciclos en el cual un producto de PCR es detectado, o sea cuando supera un nivel “umbral” por arriba del background que se llama Ct (Threshold cycle) y que depende de la cantidad inicial de ADN blanco. En la fase de amplificación exponencial la cantidad de ADN producido y la fluorescencia tienen una relación lineal. El Ct es inversamente proporcional al Nº de copias del templado.

> nº de copias iniciales < Ct< nº de copias > Ct

Ct

Graficando la fluorescencia detectada durante el experimento de qPCR en función de los ciclos se obtiene una curva sigmoidea. Se realizó con diluciones 1/10 de un templado, si diluyo la muestra necesito más ciclos para ver señal. Si graficamos en semi log el Nº de copias iniciales en función del Ct tenemos una relación lineal

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Curva de disociación o Melting curve

Puedo distinguir los productos obtenidos de acuerdo a la Tm y también los dímeros de primers (que se forman con el anillado inespecífico y elongación de los mismos).

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Químicos usados en la qPCR para detectar los productos

Inespecíficos: agentes intercalantes que se unen al DNA doble hebra y detectan cualquier producto. Más usado el colorante SYBR Green I. Por cada molécula de producto se unen varias moléculas de colorante, productos más largos producen más fluorescencia. Los productos se distinguen al ver la curva de melting (productos inespecíficos, dímeros de primers)

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Específicos: TaqMan, Molecular Beacons, Light Cicler

- TaqMan: consiste en una sonda fluorogénica (o sea marcada con un fluoróforo) que usa la acitividad 5’ nucleasa de la Taq polimerasa y se une (anilla) al producto de PCR específicamente en una zona que está muy cerca del sitio de unión de uno de los primers. Esta sonda tiene en el 5’ un cromóforo reportero fluorescente (R) y en el extremo 3’ un quencher (Q).

Cuando la sonda esté intacta el Q apaga la fluorescencia de R mediante FRET (Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia).Si la secuencia target aparece (está en el producto de PCR) la sonda se une y como está “downstream” del sitio de uno de los primers es degradada por la acividad 5’ nucleasa de la Taq polimerasa, liberando el R del Q, el cual empieza a emitir fluorescencia y aumenta cada vez más a medida que aparece el producto.

VENTAJAS de Taqman: - específica (sondas de 30 nt o menos con Tm alta)- se puede marcar cada sonda con un fluoróforo distinto

(permite hacer qPCR multiplex)DESVENTAJA: hay que diseñar una sonda para cada producto, más costoso.

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Cuantificación: ABSOLUTA O RELATIVA

ABSOLUTA se determina el Nº exacto de copias extrapolando el valor desde una curva standard o de calibración. Standard: DNA recombinante en un plásmido, DNA genómico, producto de RT-PCR, oligos largos,etc. Se debe amplificar con la misma eficiencia y los valores obtenidos deben ser reproducibles intra e inter ensayos.Se usa para: conocer la carga viral y monitorear el progreso de una enfermedad, hacer genotipado, discriminación alélica, marcadores de cáncer, detección de OGM (organismos modificados genéticamente), etc. Se informa en alguna unidad. Pej. Nº de copias/ml de sangre o gramo de tejido

Ej: Para hepatitis B se puede hacer una qPCR que determina y cuantifica la presencia del virus y la genotipificación del virus mediante las curvas de melting o de disociación.

Genotipificación de 20 muestras conteniendo 10 con genotipo B y 10 con genotipo C. La curva de melting para cada genotipo muestra las diferencias.

Los productos de la qPCR, se pueden distinguir en la curva de melting si el contenido de G+C es distinto

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Cuantificación Relativa : no es necesario una curva de calibración.

Se analizan cambios en la expresión de un gen en respuesta a un tratamiento, comparando con otro control sin tratar y normalizando con un control endógeno o gen de referencia cuya expresión no cambia en respuesta al tratamiento (gen de referencia o gen house keeping [genes cuya expresión tiene que ver con la supervivencia celular]: actina, proteínas ribosomales, gliceraldehído 3P dh, ciclofilina, etc, ).

La normalización con el gen endógeno corrige diferencias en el agregado de cDNA a cada tubo, errores de pipeteo, etc. (variaciones de la muestra, “sample to sample”) y variaciones cinéticas en la PCR (“run to run”).

CONTROLES- negativo (sin muestra): para controlar contaminación de los reactivos, ver dímeros de primers.- control sin retrotranscribir (si el molde inicial es RNA): para controlar contaminación con ADN- control positivo: si es necesario controlar la presencia de inhibidores de la pcr (sales biliares, heparina, hemo, son inhibidores) se hace agregando un fragmento conocido (puede ser en otro tubo que se amplifica en paralelo) o amplificando un gen endógeno.

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Control exógeno: se agrega para ver que no haya inhibición de la PCR que provenga de la muestra

Referencia pasiva: es para normalizar fluctuaciones de fluorescencia debidas al aparato no tiene que ver con la amplificación de un producto

5 FLUORÓFOROS que emiten a distinta longitud de onda