VIROLOGÍAVIROLOGÍA

Dr. Américo Leyva Rojas

EVOLUCIÓN VIRAL

• Desde principios de la década de 1950, los virólogos observaron la importancia potencial de los estudios evolutivos, en particular, el análisis de la variación viral (diferentes características fenotípicas, como tamaño de placa, termosensibilidad o rango de hospedadores) y su asociación con virulencia y patogenia. Pero la limitada calidad y cantidad de información útil que se tenía por entonces restringía el estudio de la evolución, ya que en virología, además de la ausencia de fósiles virales, las características fenotípicas antes mencionadas tienen una utilidad limitada.

• Hoy, en cambio, es un tiempo promisorio para el estudio de la evolución viral, debido al incremento significativo de la información disponible como resultado de las continuas mejoras en las técnicas moleculares (fundamentalmente el secuenciamiento de nucleótidos) y en el desarrollo de instrumentos para el análisis filogenético.

INTRODUCCIÓNEl estudio de los virus representa un importante apartado dentro de la patología infecciosa. Entre los virus más representativos destacan el virus causante de la gripe, el virus del SIDA, el de la hepatitis, etc.

Las características técnicas de un laboratorio de virología son las siguientes:

Deberá tener un primer nivel o nivel básico en el que sólo se realizan técnicas serológicas. Un segundo nivel o intermedio en el que además se aíslan y cultivan los virus más frecuentes. Un tercer nivel en el que se dispone de alta tecnología para realizar todo tipo de estudios de virus.

Todo laboratorio de virología, dado el potencial patógeno con el que se trabaja, debe seguir estrictamente las normas de seguridad y prevención; estas normas esencialmente son las siguientes:

a) Todas las muestras deben manipularse como si fuese material de elevado riesgo patológico.

b) El personal debe seguir vacunaciones y controles médicos periódicos.

c) Acceso restringido a personal capacitado, y señalización clara de "zona peligrosa".

d) Las normas para el laboratorio de bacteriología se deberán extremar en éstos. Ejemplo, no comer, no beber, usar guantes, etc.

e) Usar guantes, mascarillas, batas, lavado exhaustivo de manos.

f) Deben poseer sistemas de esterilización autoclave, cabinas de incineración, etc., para esterilizar cualquier producto antes de ser desechado. Equipo apropiado para conservación y almacenamiento de muestras.

INTRODUCCIÓN

Los virus son los responsables de numerosas enfermedades en los seres humanos; como término medio una persona sufre al año unas cuantas infecciones víricas y a lo largo de su vida unas 200, con lo que supone un grave perjuicio económico por el coste en asistencia médica y medicamentosa, así como falta de productividad de los pacientes en sus respectivas ocupaciones.

Los virus de bacterias se llaman bacteriófagos, otros virus infectan animales y vegetales. Los bacteriófagos proporcionan a los microbiólogos un modelo para el estudio de los virus y de la biología molecular.

LOS VIRUS

• A fines del siglo pasado se cumplieron algo más de cien años del aislamiento del primer agente infeccioso que fuera bautizado con el nombre de virus. Nombre genérico que fue luego aplicado a cada agente transmisible capaz de atravesar los filtros que retenían a las bacterias. De ese hecho surgió el nombre de virus filtrables, con el que se los conoció originariamente. Con el transcurso del tiempo perdieron el aditamiento de filtrables, dado que esta propiedad no es exclusiva de los virus. En cambio surgió claramente la noción de su parasitismo absoluto, ya que no se reproducen fuera de una célula viva.

• Los virus están ampliamente distribuidos en la naturaleza, afectando a los organismos de los reinos animal y vegetal, protistas, hongos y virus. Incapaces de vida independiente.

• Han sido aislados de plantas superiores, algas, hongos, bacterias, protozoarios, invertebrados, anfibios, reptiles, peces,. aves y mamíferos. Debido a su capacidad para producir enfermedad, son causa de epidemias severas en el hombre y/o en los animales, ocasionando graves problemas de salud pública y cuantiosas pérdidas económicas, cuando afectan al ganado o a las plantas que se utilizan como alimento.

DEFINICIONES DE VIRUS

1. Los virus son partículas elementales con vida y línea germinal propia, formados por un solo tipo de ácido nucleico y proteínas (glico y/o lipo).

2. Son parásitos absolutos y agentes infecciosos generalmente causantes de enfermedad.

3. Unidades infecciosas que contienen RNA o DNA encerrado en una cubierta protectora.

4. Unidades infecciosas con independencia genética que contienen RNA o DNA como genoma asociado a macromoléculas, fundamentalmente polipéptidos, que definen su estructura y capacidad de asociarse a la célula que infectan.

5. Son sistemas bioquímicos complejos.

• También las hay más simples o ingeniosas como:

a) Un virus es un paquete proteico o liproteico de ácido nucleico genómico.

b) Un virus es un virus (Lwoff).

c) Los virus son las víctimas de la ignorancia a las que se les atribuye ser la causa de cualquier enfermedad.

• Queda como un ejercicio individual elegir aquella definición que más se adapte a la imagen mental evocada por la palabra virus. Eso sí, no hay que olvidar que la elegida debe diferenciarlos claramente de otros microorganismos o agentes infecciosos.

PROPIEDADES GENERALES DE LOS VIRUS

Los virus son los agentes infecciosos más pequeños hasta ahora conocidos. Casi todas las formas de vida (animales, plantas y bacterias) son susceptibles de ser infectados por determinados virus.

Son tres las principales propiedades que diferencian a los virus de otros microorganismos:

1. Pequeño tamaño. Los virus son más pequeños que otros organismos, oscilando su tamaño entre los 10 y los 300 nm, a diferencia de las bacterias, que tienen un diámetro aproximado de 1.000 nm o de los eritrocitos, con 7.500 nm.

2. Genoma. El genoma vírico puede ser DNA o RNA; los virus poseen un único tipo de ácido nucleico.

3. Metabólicamente inertes. Carecen de actividad metabólica fuera de la célula huésped; no poseen ribosomas ni otro tipo de estructura de síntesis proteica, si bien algunos encierran en su partícula uno o más enzimas; por todo ello, los virus no pueden multiplicarse en medios inanimados, sino sólo en el interior de células vivas. Sin embargo, una vez dentro de la célula el ácido nucleico (genoma vírico) es capaz de replicar nuevas partículas víricas.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS VIRUSLos virus son microorganismos visibles tan sólo con el microscopio electrónico, pasan a través de los poros de filtros que no permiten el paso de las bacterias, carecen de toda estructura citoplasmática y membranosa, así como de todos los orgánulos celulares y enzimas.

Los virus sólo se reproducen dentro de las células de animales, vegetales y otros microorganismos, por eso se les considera como parásitos obligados. Son incapaces de generar energía o de sintetizar proteínas, dependiendo de las células del hospedador para realizar sus funciones vitales.

Los genes víricos poseen información genética para la reproducción y para apoderarse de los sistemas generadores de energía y de síntesis de proteína de la célula hospedadora.

El material genético vírico es, o bien ADN, o ARN y nunca ambos, a diferencia de la célula hospedadora.

El material genético está encerrado en una cubierta proteica muy especializada que protege el virus cuando está fuera de la célula del hospedador, además de servir de vehículo de entrada en una determinada célula.

El virus completo, maduro e infectivo se denomina virión.

Los virus causan multitud de enfermedades infecciosas agudas y algunas de tipo crónico. Durante el periodo de reproducción en las células hospedadoras el virus puede causar enfermedades.

CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES

1) Los virus son partículas compuestas de un centro que contiene DNA o RNA (pero no los dos), cubierto por una cápside proteínica protectora. Algunos virus además tienen una membrana lipoproteínica exterior, llamada envoltura.

2) Los virus deben reproducirse (replicarse) dentro de las células, porque no pueden generar energía o sintetizar proteínas; por esta razón se les llama "parásitos intracelulares obligados".

3) Los virus se replican de una manera diferente a la de las células; es decir, no experimentan fisión binaria. El cuadro compara algunos de los atributos de virus y células.

Tamaño comparativo de los virus con otros agentes infecciosos

Glóbulo rojo = 7 u = 7.000 um

Milimicron (mu) ó nanometro (um) : 10-9 metros

Tamaño promedio de los virus: 20 – 300 um

Tamaño promedio de las bacterias : 0.7 – 10 um

Linfocito: 10 um

ESTRUCTURAS MORFOLÓGICAS

a) b)

Virus DNA:

Virus RNA:

ESTRUCTURAS ULTRAMICROSCÓPICAS

Nucleocapside

Nucleoide

Cápside

Envoltura

ADNó

ARN

•Información genética

•Infectividad

•Protección del nucleoide

•Unión a receptores celulares

•Determinantes antigénicos

•Protección del nucleide

•Unión a receptores celulares

•Determinantes antigénicos en glicoproteínas

Proteínas

Lipoproteínas

ESTUCTURA DE UN VIRION.SU ACTIVIDAD BIOLÓGICA

COMPARACIÓN DE VIRUS Y CÉLULAS

Propiedad Virus Célula

Tipo de ácido nucleico

DNA o RNA, pero no los dos

DNA y RNA

Proteinas Algunas Numerosas

Membrana lipoproteínica

Envoltura presente en algunos virus.

Membrana celular presente en todas las

células.

Ribosomas Ausentes* Presentes

Mitocondrias Ausentes Presentes en células eucariontes

Enzimas Ninguna o unas cuantas

Numerosas

Multiplicación por fisión binaria

No Si (la mayoría de las células)

Las arenavirus tienen algunos ribosomas no funcionales

DIFERENCIAS ENTRE VIRUS. BACTERIAS, MICOPLASMAS, CLAMIDIAS Y RICKETTSIAS

Virus Rickettsias Clamidias Micoplasmas

Bacterias

Acidos nucleico

Fisión binaria

Enzimas metenergético

Ribosomas

Replicación en medios inertes

Tamaño

ADN o ARN

No

No

No*

No

20-300 um

Ambos

+

+

+

No

1 um

Ambos

+

-

+

No

300 um

Ambos

+

+

+

+

250 um.

Ambos

+

+

+

+

0.7 – 10 um

•Algunos virus poseen ribosomas de origen celular. Por ejemplo arenavirus.

CLASIFICACIÓN DE LOS VIRUS DNA

Familia de virus

EnvolvuraSimetría de la

cápsideTamaño de la partícula (nm)

DNA PM (x106)

Estructura del DNA*

Virus importantes en medicina

Parvovirus No Icosaédrica 22 2 TS, lineal Virus B19

Papovavirus No Icosaédrica 55 3 a 5 TD, circular superenrollado Virus del papiloma

Adenovirus No Icosaédrica 75 23 TD, lineal Adenovirus

Hepadnavirus Si Icosaédrica 42 1.5 TD, circular incompleta Virus de la hepatitis B

Herpesvirus Si Icosaédrica 100+ 100 a 150 TD, lineal

Virus del herpes simple, virus de varicela-zoster, citomegalovirus y virus de Epstein-Barr

Poxvirus Si Compleja 250x400 125 a 185 TD, lineal Virus de la viruela y virus de la vaccinia

* TS, tira sencilla; TD, tira doble+ La nucleocápside de los herpesvirus tiene 100 nm, pero su envoltura varía de tamaño. El virus entero puede ser tan grande como 200 nm de diámetro.

CLASIFICACIÓN DEL DNA DE VIRUS ANIMALES:

FAMILIA ESTRUCTURA DEL VIRIÓN

ESTRUCTURA Y PESO MOLECULAR DEL

GENOMA

MIEMBROS REPRESENTATIVOS

Parvovirus

Hepatitis B

Papovavirus

Adenovirus

Virus del herpes

Poxvirus

Cúbica, desnuda

Cúbica, con cubierta

Cúbica, desnuda

Cúbica, desnuda

Cúbica, con cubierta

Helicoidal, con cubierta

cu lineal (1-3x106)

cd ciruclar (2x106), brecha en una cadena; proteína unidacd circular (3-5 x 106)

cd lineal (20-25x106); proteína unidacd lineal (80-130x106)

cd lineal (160-200x106)

Virus diminuto de ratón; adenovirus relacionadosVirus de la hepatitis B en seres humanos, virus de la hepatitis woodchuckPapilomavirus, poliomavirus (ratón), SV40 (mono)Virus de la enfermedad respiratoria humana y animalTipos de virus del herpes simple 1 y 2; virus de la varicela zoster; citomegalovirus; virus de Epstein-Barr; virus del herpes humano 6, virus del herpes humano 8 (sarcoma de KaposiViruela; vaccinia; molusco contagioso; virus de fibroma y mixoma de conejo

Abreviaturas: cu, de cadena única; cd, de cadena doble.

CLASIFICACIÓN DE LOS VIRUS MAS IMPORTANTES CLÍNICAMENTE

Familia Genero Enfermedad causada Ácido nucleico

Simetría 1 Envoltura

Piconaviridae Enetrovírus Rhinovírus

Infecciones intestinales, Polio,Resfriados

RNA Icosaédrica No

Reoviridae Reo virus Infecciones intestinales y respiratorias RNA Icosaédrica No

Togaviridae Alphavírus Fiebre amarilla RNA Icosaédrica Sí

Orthomyxoviridae Influenzavírus Gripe RNA Helicoidal Sí

Paramyxoviridae Mobilvirus Sarampión, Pareras, Infecciones respiratorias

RNA Helicoidal Sí

Rhabdoviridae Lyssa virus Rabia RNA Helicoidal Sí

Retroviridae Ninguno Tumores de animales RNA Sí

Arenavirudae Arenavirus Meningitis RNA Sí

Bunyaviridae Bunyavirus Encefalitis RNA Sí

Coronaviridae Coronavírus Infecciones respiratorias RNA si

Parvoviridae Parvovírus Coinfecciones con adenovirus DNA Icosaédrica no

Papovaviridae Papillomavirus Verrugas DNA Icosaédrica No

Adenoviridae Mastadenovírus Infecciones respiratorias DNA Icosaédrica No

Herpesviridae. Herpesvirus Herpes genital, Herpes zoster, Varicela DNA Icosaédrica Sí

Poxviridae Orthopovírus Viruela DNA Compleja Cubierta compleja

CLASIFICACIÓN DE LOS VIRUS ANIMALES DE RNA:

Familia Estructura del virión

Estructura y peso molecular del genoma Miembros representantivos

Hepatitis BPicornavirus

ArenavirusCalicivirusRabdovirusRetrovirus

Togavirus

OrtomixovirusCoronavirus

FilovirusBunyavirusParamixovirus

Reovirus

Cúbica, con cubiertaCúbica, desnudaHelicoidal, con cubiertaCúbica, desnudaHelicoidal, con cubiertaCúbica, con cubiertaCúbica, con cubiertaHelicoidal, con cubiertaHelicoidal, con cubiertaHelicoidal, con cubiertaHelicoidal, con cubiertaHelicoidal, con cubiertaCúbica, desnuda

cu circular (-) (6 x 103)cu lineal (+) (2-3 x 106); proteínas unidas2 segmentos cu lineales (+/-) (3 x 106)cu lineal (+) (2.6 x 106)cu lineal (-) (3-4 x 106)cu lineal (+), diploide (3-4 x 106)cu lineal (+) (4 x 106)8 segmentos cu lineales (-) (5 x 106)cu lineal (+) (5-6 x 106)cu lineal (-) (5 x 106)3 segmentos cu lineales (+/-) (6 x 106)cu lineal (-) (6-8 x 106)10 segmentos cd lineales (15 x 106)

Virus de la hepatitis humana Enterovirus humanos: virus de polio, coxsackievirus, ecovirus; rinovirus; virus de fiebre añosa de bovino; hepatitis AVirus de Lassa; virus de coriomeningitis linfocítica de ratónVirus de exantema vesicular; virus similares al Norwaik de seres humanosVirus de la rabia; virus de estomatitis vesicular bovinaVirus tumoral de RNA de ratón, aves y gatos; virus visna de las ovejas; virus de inmunodeficiencia humana (leucemia de células T humanas y síndrome de inmunodeficiencia adquirida)Alfavirus: virus de Sindbis y virus del bosque de Semliki; flavivirus; virus del dengue y virus de la fiebre amarilla; virus de la rubéola; virus de enfermedad mucosaVirus de influenza tipos A, B y C en ser humano, cerdo y caballoVirus respiratorio de ser humano; virus de diarrea de becerro; virus entérico de cerdo; virus de hepatitis de ratónVirus de Marburg y ÉbolaVirus de la fiebre del Valle de Rift; virus de bunyamwera; hantavirusVirus del sarampión; paperas; virus de la enfermedad de Newcastle; virus del moquillo caninoReovirus humanos; orbivirus; virus de la fiebre de garrapata de Colorado; virus de enfermedad africana del caballo; rotavirus humano

BASES BIOGENÉTICASa) En la siguiente discusión se presentan las bases biológicas y genéticas de estos

fenómenos, con particular atención a tres temas.1. Los distintos virus tienen estructura genética muy diferente y esta diversidad se refleja en

sus procedimientos de replicación.2. Por su tamaño pequeño, los virus han logrado un grado muy alto de economía genética.3. Los virus dependen en buena medida de las funciones de la célula huésped y por lo tanto

son difíciles de combatir en el campo médico. Sin embargo, presentan pasos singulares en sus ciclos de replicación que constituyen blancos potenciales para la terapia antiviral.

La ventaja de la construcción de la partícula viral a partir de subunidades proteínica idénticas es doble: 1) reduce la necesidad de información genética y 2) favorece el autoensamblaje; es decir, no se requieren enzimas ni energía. De hecho, se han acoplado partículas virales funcionales en un tubo de ensayo mediante la combinación de ácido nucleico purificado con proteínas también purificadas, en ausencia de células, fuente energética y enzimas.

PROTEÍNAS VIRALESb) Las proteínas virales desempeñan varias funciones importantes. Las de la capsides

protegen el material genético y median la adherencia del virus a receptores específicos en la superficie de la célula huésped. Esta interacción de las proteínas virales con el receptor celular es el principal determinante de la especie y de la especificidad de órgano. Algunas de las proteínas interiores se asocian con el ácido nucleico, por ejemplo, ácido nucleico polimerasas, que son esenciales para la replicación. Las proteínas similares a las histonas tienen una función reguladora o pueden neutralizar la carga negativa del ácido nucleico durante el ensamblaje de la partícula viral y también se localizan internamente.

EFECTO DE LOS AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS SOBRÉ LOS VIRUS

• Calor. La mayoría se inactivan a 56°C durante 30 min. a 100°C en pocos segundos.

• Frío. Dada su estabilidad frente a bajas temperaturas, muchos virus pueden almacenarse a —40° C o preferiblemente a —70° C; algunos son parcialmente inactivados en el proceso de congelación y descongelación.

• Sequedad. Variable; algunos sobreviven a ésta, mientras que otros quedan inmediatamente inactivados.

• Radiación ultravioleta. Los inactiva.• Cloroformo y éter. Los virus con envoltura lipídica son

inactivados, mientras que el resto son resistentes. Este procedimiento se utiliza como criterio de clasificación de los virus.

• Agentes oxidantes. Los virus son inactivados por formaldehido, cloro, yodo y peróxido de hidrógeno.

• Fenoles. La mayoría son relativamente resistentes.

EFECTOS DEL VIRUS EN LA CÉLULA

Los virus pueden afectar a las células de tres maneras:

Muerte celular. La infección es letal y mata a la célula causando un efecto citopático (ECP).

Transformación celular. La célula no muere, pero es transformada en otra con caracteres de malignida (célula cancerosa).

Infección latente. El virus permanece en el interior de la célula en estado de actividad potencial, pero n produce efecto detectable sobre su función.

ETAPAS DEL CICLO DE CRECIMIENTO VIRAL

Adherencia y penetración por el virión precursor

Desnudamiento del genoma viral

Síntesis* de mRNA temprano**

Síntesis de proteína viral temprana Replicación del genoma viral

Síntesis de mRNA viral tardío

Síntesis de proteína viral tardío

Síntesis de proteína viral tardío

Ensamblaje de la progenie viral

Liberación de viriones de la célula

* En algunos casos, el genoma viral es fundamentalmente equivalente al mRNA; por tanto, no se requiere síntesis temprana de mRNA.

** Temprano se define como el periodo anterior a la replicación del genoma. No todos los virus muestran una distinción entre funciones tempranas y tardías. En general, las proteínas tempranas son enzimas, en tanto que las tardías son componentes estructurales del virus.

INVASION E INFECCION POR VIRUS

Por lo general, el ciclo de multiplicación viral se divide en las siguientes fases: a) adsorción a la célula huésped, b) penetración o entrada, c) rotura de la cubierta para liberar el genoma, d) producción de los componentes del virión, e) ensamblaje y f) liberación de la célula. Esta serie de sucesos, en ocasiones con ligeras variaciones, describe lo que se llama respuesta productiva o lítica; empero, éste no es el único resultado posible de la infección viral, Algunos virus entran a un tipo de relación muy distinto con la célula huésped, en el cual no se producen nuevos virus, la célula sobrevive y se divide y el material genético viral persiste de forma indefinida en estado de latencia. Este resultado de una infección se denomina respuesta no productiva, a la cual también se da el nombre de lisogenia en el caso de bacteriófagos y ciertas veces se vincula con transformación oncógena por virus animales. (El uso del término transformación debe diferenciarse de la transformación del DNA bacteriano).

El efecto de una infección depende de la combinación específica virus-huésped y otros factores, como el entorno extracelular, la multiplicidad de la infección y la fisiología y estado de desarrollo de la célula. Los virus que sólo pueden penetrar en relación productiva se denominan virus líticos o virulentos. Los virus que pueden establecer ya sea una relación productiva o no productiva con sus células huésped se conoce como virus templados. Algunos virus templados pueden reactivarse o "inducirse" para salir del estado de latencia e ingresar a la respuesta productiva. El hecho de que la inducción ocurra depende de la combinación específica virus-huésped, la fisiología de la célula y la presencia de estímulos extracelulares.

Ejemplo de receptores virales:

Virus Receptor Función celular

Influenza A ReovirusAdenovirus Epstein-Barr Herpes simple Herpes humano 7 HIVCoronavirus humanoRinovirus humanoSarampiónVirus de la polio Virus de la rabiaSV40Vaccinio

Acido siálicoÁcido siálicoReceptor EGFIntegrina.sCR2Sulfato de heparinaCD4CD4CXCR4 y CCR5Aminopeptidasa NICAM-1 CD46 PVRReceptor de acetilcolinaMHC I Receptor EGF

GlucoproteínaGlucoproteínaSeñalización .Enlace con la matriz extracelularReceptor de complementoGlucoproteínaSuperfamilia de las inmunoglobulinas.Superfamilia de las inmunoglobulinasQuimiocinas receptorasProteasaSuperfamilia de las inmunoglobulinasRegulación de complementoSuperfamilia de las inmunoglobulinasSeñalizaciónSuperfamilia de las inmunoglobulinas :Señalización

Abreviaturas. EQF. factor de crecimiento endotelial; HIV. Virus de inmunodeficiencia humana: ICAM, molécula de adhesión intercelular; MHC. complejo mayor de histocompatibilidad; PVR, receptor del virus de la polio.

TÉCNICAS EMPLEADAS EN EL DIAGNÓSTICO VÍRICO

1. Técnicas microscópicas:* Microscopio óptico. Para observación del efecto

citopático de los virus sobre cultivos celulares,• Microscopio electrónico.

2. Técnicas de cultivo y aislamiento de virus:• Técnicas de inoculación en animales de laboratorio.• Técnicas de inoculación en embrión de pollo.• Técnicas de cultivo celular.

3. Técnicas inmunológicas:* Reacción de fijación del complemento.* Método RIA.* Método ELISA.* Hemaglutinación e inhibición de la hemaglutinación.* Determinación de la inmunoglobulina M.* Reacciones de neutralización.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE INFECCIONES POR VIRUS

Salvo raras excepciones, el diagnóstico de laboratorio de las infecciones virales es lento, de modo que por lo general el paciente se encuentra ya en fase de convalecencia al obtener el resultado. Pero, aunque el diagnóstico de laboratorio se encuentra limitado en cada caso particular, es de gran importancia en la investigación médica y epidemiológica. El virus de la viruela es una excepción, ya que tiene un rápido diagnóstico, lo que facilita notablemente el control de las epidemias.El diagnóstico de laboratorio se basa en tres técnicas fundamentales: * Aislamiento del virus en histocultivos.* Serología, o demostración de anticuerpos frente al virus. (niveles)* Demostración directa del virus o de antígenos víricos a partir de frotis de las lesiones. (intra/extracelulares).

CULTIVO DE LOS VIRUS

• El cultivo de virus es un prerrequisito esencial para su estudio. Generalmente no se utiliza al huésped natural, sino que se recurre a animales de laboratorio o a cultivos de células in vitro. La multiplicación de los virus en ambos sistemas permite el desarrollo de distintos aspectos virológicos: aislamiento, identificación, multiplicación, cuantificación y determinación de las propiedades biológicas, bioquímicas y serológicas.

CULTIVO DE CÉLULAS (HISTOCULTIVO)

• Durante la primera mitad del siglo pasado predominaba el misticismo en el desarrollo de cultivos de células in vitro. El éxito dependía de condiciones experimentales muy precisas. Por mucho tiempo sólo se lograba el crecimiento de células de cortes de tejidos extirpados de animales y mantenidos en coágulos formados por extractos de esos tejidos y plasma o suero del mismo animal. Las contaminaciones bacterianas impedían una continuidad en el crecimiento.

MEDIOS DE CULTIVO DE VIRUSPara mantener las mismas condiciones fisiológicas, de presión osmótica, pH, así como las concentraciones adecuadas de iones inorgánicos esenciales, in vitro como in vivo, se precisa una solución de sales equilibrada (Balanced Salt solution, BSS) que es la base de todos los medios de cultivo químicamente definidos. Algunos medios contienen glucosa que proporciona los hidratos de carbono necesarios.

Los medios que se emplean en cultivo celular son los siguientes:

• BSS de Hanks.

• BSS de Earle, con mayor capacidad tampón que el anterior.

• BSS suplementado con vitaminas, aminoácidos, y otros nutrientes para formar medios sintéticos.

Los medios disponibles en el mercado más utilizados en virología son:

• N° 199.

• BME: Medio Basal de Eagle.

• MEM: Mínimum Esential Médium.

Contiene las concentraciones óptimas de nutrientes esenciales, vitaminas, aminoácidos, es el más utilizado. Se conserva a 4°C. Se sabe que la luz fluorescente va en detrimento de los medios de cultivo, porque provoca la formación de fotoproductos tóxicos derivados de la riboflavina y triptófano presentes en el medio. Por lo que se recomienda que el medio líquido se conserve en la oscuridad.

El cultivo celular es la técnica idónea y la más utilizada actualmente para el cultivo y aislamiento de virus, pues presenta muchas ventajas sobre la inoculación en animales vivos y en embrión de pollo.

Los cultivos celulares son de tres tipos según las células que lo constituyen:

a) Cultivos primarios:

Se obtienen células que proceden de un organismo vivo. Estas células se obtienen por fragmentación del tejido y dispersión de las células de forma apropiada para obtener una monocapa en la que se reproducirán los virus. Se pueden emplear células de riñón de mono o de riñón embrionario humano. Las células así obtenidas tienen una pequeña capacidad de reproducción aunque solamente se pueden emplear durante 2-3 semanas.

b) Líneas celulares diploides:

Constituidas por subcultivos obtenidos a partir de cultivos celulares primarios. Se reproducen rápidamente y no se pueden exceder de 50 subcultivos. Ejemplo de estos son las células fíbroblásticas embrionarias.

c) Líneas celulares continuas o heteroploides:

Son obtenidas a partir de tumores humanos malignos o de células animales tales como riñón de mono, riñón de hámster, etc. Ejemplo de ellas son: líneas HeLa, Vero, K-13.

En las células de riñón de mono rhessus pueden aislarse, a través de cultivos primarios, virus como Adenovírus, Echovírus, virus de la poliomelitis, virus Coxackie B, virus de la Parainfluenza, virus de las paperas, virus respiratorio sincitial.

En células de pulmón humano, a través de líneas celulares diploides, se pueden aislar virus como; Adenovirus, virus del Herpes simple, virus de la poliomelitis, virus Coxackie B, virus respiratorio sincitial.

En células de pulmón humano, a través de líneas celulares diploides, se pueden aislar como: adenovirus, virus del Herpes simple, virus de la poliomelitis, virus Coxackie B, virus respiratorio sincitial.

TÉCNICAS DE CULTIVO CELULAR

EMBRIÓN DE POLLO

Antes de la generalización del cultivo tisular se utilizaron abundantemente los huevos fértiles de gallina. En la actualidad este procedimiento ha perdido vigencia al quedar reemplazado por el aislamiento del virus mediante el citado cultivo tisular.

Existen tres vías principales de inoculación

Esquema de embrión de pollo, que muestra las vías de inoculación para el aislamiento vírico.1. En el interior de la membrana corioalantoidea.2. En la cavidad amniótica.3. En la cavidad alantoidea.Se utilizan embriones comprendido entre los 7 y los 12 días; la edad óptima para cada vía de inoculación depende del desarrollo de los distintos tejidos; así, por ejemplo, la cavidad amniótica tiene su máximo a los 10 ó 12 días.

Sitios potenciales para quimioterapia antiviral

Sitio de acción Medicamentos eficaces

Acciones tempranas (entrada o desnudamiento del virus)

Amantadita, rimantadina

Síntesis de ácido nucleico por DNA y RNA polimerasas virales

Aciclovir, ganciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, foscarnet, azidotimida, dideoxiinosina,. Didesoxicitidina y ribavirina

Otras enzimas específicas de virus En investigación

Síntesis de proteinas dirigida de virus Interferón y metisazona

Escisión de polipéptidos precursores Fase experimental

Ensamblaje de partícula, incluyendo la proteína de la matriz.

En investigación

Liberación de la partícula por germinación. Manipulación genética

CARACTERÍSTICAS DE LOS VIRUS Y OTROS AGENTES

Agente

Ácido Nucleico Cápside Envoltura

Agente Patógeno

Virus DNA o RNA

SI SI o NO SI

Viroide RNA NO NO SI

Virusoide RNA NO NO SI

Prión ¿NO? Part. Prot. NO SI

Mecanismo de acción Agente antiviral Espectro vial

Inhibición del descubrimiento y penetración virales

AmantadinaRimantadina

Flu AFlu A

Inhibición de neuraminidasa OseltamivirZanamivir

Flu A, Flu BFlu A, Flu B

Inhibición de polimerasa de DNA viral

AciclovirFanciclovirPenciclovirValaciclovirGanciclovirFoscarnetCidofovirTrifluridina

HSV, VZVHSV, VZVHSVHSV, VZVCMV, HSV, VZVCMV, HSV resistenteCMVHSV, VZV

RESUMEN DE AGENTES ANTIVIRALES:

Mecanismo de acción Agente antiviral Espectro vial

Inhibición de transcriptasa inversa viral

Cidovudina

Didesoxiinosina

Didesoxicitidina

Estavudina

Lamivudina

Nevirapina

Delavirdina

Efavirenz

HIV

HIV

HIV

HIV

HIV, HBVb

HIV

HIV

HIV

Inhibición de proteasa viral Saquinavir

Indinavir

Ritonavir

Nelfinavir

Lopinavir

HIV

HIV

HIV

HIV

HIV

Inhibición de síntesis proteica Interferón a HBV, HCV, HPV

Inhibición de polimerasa de RNA

Ribavirina RSV, HCVb, fiebre de Lassa

Inhibición antisentido de síntesis de mRNA viral

Fomivirsén CMV

TIPOS DE ENFERMEDADES VIRALES

Basándose en aspectos clínicos , podemos dividir de la siguiente manera :

a) INFECCIONES LOCALES .- Aquí las lesiones celulares y la multiplicación del virus solo afectan el foco inicial, el virus puede afectar primero una célula y luego pasar de una célula a otra.

b) INFECCIONES OCULTAS .- Pueden ocurrir muchas infecciones, de tipo tanto citolítico como de estado estable, sin que aparezca síntomas. Estas infecciones son importantes en medicina, pues confieren inmunidad sin enfermedad clínica, se explican por la naturaleza del virus o el estado inmunológico del huésped

c) INFECCIONES CON VIRUS LENTOS .- Se pueden definir como un grupo de entidades que "crecen provocar por virus para loe cuales los periodos de incubación son muy largos y las expresiones clínicas de tipo patológico son de progresión relativamente lenta. El signo principal de estas infecciones es la presencia de un agente viral oxenoma en un huésped que, en última instancia, sufre lesiones celulares y tisulares por efecto del virus, así las respuestas inmunológicas en el huésped que normalmente son eficaces para eliminar los virus comentes no son estimuladas o resultan inoperantes, además, en algunos casos puede producir verdadera lesión celular y tisular a consecuencia de la propia respuesta inmune, tales infecciones por virus lentos se han observado en el hombre y en los animales.

RESPUESTA INMUNITARIA EN INFECCIONES VIRALES

Los virus forman una variedad especial de agentes infecciosos, que son parásitos Ínter celulares obligados. Estos se diferencian de los demás tipos de microorganismos por su:* Organización,* Composición y* Mecanismo de duplicación.La partícula viral completa se puede considerar como un fragmento básico de subsánela genética, de DNA ó RNA, rodeada de una capa protectora de proteínas que son agentes de transmisión de una célula huésped a otra.El espectro de enfermedades producidas va desde las infecciones virales agudas, en las cuales la interacción de virus y respuesta inmune del huésped origina aclaramiento del virus é inmunidad, o bien diseminación, infección y muerte, hasta formas más crónicas de infección viral, en !as cuales tienen lugar una reproducción viral prolongada, junto con respuesta inmune, causa de lesión y origen de enfermedad.Se lograron erradicar muchas infecciones virales empleando vacunas muy eficaces que estimulan las respuestas inmunológicas especificas. Es probable que se dispongan pronto, en terapéutica, de otros tipos de agentes que estimulan el sistema inmunológico inespecífico, por ejemplo, inmunipotenciadores.

ALTERACIONES INDUCIDAS EN LAS CÉLULAS HUÉSPED

• La multiplicación de los virus en cultivos de células puede comprobarse por procedimientos bioquímicos o serológicos que indican el incremento de macromoléculas virales, como enzimas o antígenos, o de partículas virales. Sin embargo, para los cultivos que crecen adheridos a un soporte, los métodos usados son más sencillos y consisten en la evaluación de alteraciones morfológicas de las células, modificación de sus membranas (hemadsorción) o por fenómenos de interferencia viral.

EFECTO CITOPÁTICO (CPA):

• La mayoría de los virus producen alteraciones en las células donde multiplican, de modo tal que los cultivos infectados desarrollan con el transcurso del tiempo cambios en su morfología, que ponen en evidencia la acción ejercida por el virus sobre la célula. Dichas alteraciones se conocen con el nombre de acción o efecto citopático (ACP), siendo características de cada sistema virus-célula. Asimismo, los virus responsables de esos cambios son llamados citopatogénicos.

• Las alteraciones que generalmente se observan son:

a) Destrucción de la monocapa; con redondeamiento y desprendimiento de las células debido a la muerte provocada por el virus.

b) Formación de células multinucleadas; llamadas sincicios o policariocitos.

c) Desarrollo de cuerpos de inclusión; agrupaciones de macromoléculas virales que se observan en el citoplasma o en el núcleo, donde el virus de rabia genera los corpúsculos de Negri.

d) Transformación; el cultivo infectado presenta focos de células que crecen en varios planos, los que inducen tumores al ser inoculados en animales.

• Los descubrimientos que posibilitaron

simplificar el cultivo de células fueron: a) El uso de antibióticos para prevenir la

contaminación bacteriana.

b) La eficacia de la tripsina, una enzima proteolítica

que permite disociar las masas de tejido en sus

células individuales.

c) EL desarrollo realizado por Eagle de medios

definidos que permiten el crecimiento de muchos

cultivos celulares.

PROPIEDADES DISTINTIVAS DE LOS VIRUS EN RELACIÓN CON OTROS MICROORGANISMOS

Propiedad Bacteria Mollicutes Rickettsias Clamidias Virus

Crecimiento en medio artificial

Sí Sí No No No

División binaria Sí Sí Sí Sí No

Contiene:DNA + RNADNA o RNA

SíNo

SíNo

SíNo

SíNo

NoSí

Reproducción por AN aislado

No Sí No No Sí1

Variación de tamaño

Sí Sí Sí Sí No

Sistema energético

Sí Sí Sí Sí No

Ribosomas Sí Sí Sí Sí No2

Contiene ac. Murámico

Sí3 No Sí Sí No

1. No es una propiedad absoluta, sólo la presentan los virus RNA positivos y los DNA virus.

2. Los arenavirus incluyen ribosomas en sus partículas, pero no son funcionales.

3. Hay excepciones.

UBICACIÓN DE LOS VIRUS EN RELACIÓN A OTROS AGENTES

RICKETTSIAS

CLAMIDIAS

VIRUS

VIROIDES VIRUSOIDES

PLASMIDOS Y EPISOMAS

TRANSPOSONES

ELEMENTOS DE INSERCIÓN

CONCLUSIONESPASADO, PRESENTE Y FUTURO DE LA VIROLOGÍA

• La virología como toda ciencia biológica experimental se ha visto beneficiada por la aplicación de las técnicas moleculares que enseña la ingeniería genética. Así es como en los últimos años se ha ido develando la intricada relación del virus con la célula que parasita, en especial, la exquisita regulación de los genes virales, que deviene en la producción de nuevos virus. Este conocimiento ha permitido, por ejemplo, la síntesis de moléculas antivirales que bloquean en forma específica pasos de la replicación, sin afectar al huésped.

• Dentro de este contexto, los virus no sólo han sido y son responsables de muchas enfermedades, sino que fueron las herramientas útiles que permitieron el desarrollo de las técnicas moleculares, las que a su vez sirven para su estudio.

• Dentro del campo de la virología médica, dichas técnicas se aplican en el diagnostico virológico en estudios de patogenia, análisis epidemiológico, en la producción de vacunas. A la vez han permitido rastrear, en muchos casos, al agente responsable de infecciones emergentes.

• Los libros y los artículos que tratan sobre los virus se han enriquecido en nuevas terminologías (muchas de las cuales ni siquiera se han traducido), que reflejan el uso generalizado de las técnicas moleculares.

• El estudiante de ciencias médicas debe realizar un esfuerzo para adquirir los conocimientos básicos que le permitan la cabal comprensión de algunas expresiones, como hibridación molecular, sondas genéticas, expresión de genes en organismos inferiores, transcripción reversa, reacción en cadena de la polimerasa y muchas otras.