SX acid citric 1

1.3. Nguyên liệu:

1.3.1. Yêu cầu đối với nguyên liệu lên men acid citric:

- Nguyên liệu phải đảm bảo đủ lượng đường cho vi sinh vật phát triển.

- Đảm bảo nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ tìm, sẵn có.

- Giống vi sinh vật dùng trong SXacid citric phải đảm bảo các yêu cầu sau:

+ Có khả năng tạo acid rất mạnh.

+ Có khả năng chịu được MT acid khi lượng acid citric tăng cao.

+ Ít tạo ra những acid hữu cơ khác như: acid oxalic, acid gluconic, acid fumaric.

1.3.2. Một số nguyên liệu gluxit:

1.4. Vi sinh vật lên men acid citric Aspergillus niger: [8]

1.4.1. Mô tả:

Aspergillus niger là một loại nấm sợi và là một trong những loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus

có nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học, nhiệt độ tối ưu ở 35-37 ° C, pH từ 1,4 đến 9,8. Nó gây ra

một căn bệnh được gọi là nấm mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như nho, hành tây, đậu

phộng, và là một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực phẩm. A. niger là vi sinh vật hiếu khí phát triển

trên các chất hữu cơ, do đó nó có thể được tìm thấy gần như ở khắp mọi nơi trong MT có chứa đất.

Ngoài ra, nó được tìm thấy trong chất thải, nguyên liệu thực vật phân hủy và phân hữu cơ trong MT

ngoài trời. MT ẩm trong nhà tạo ra một MT sống tốt cho sự phát triển của nấm mốc. Chẳng hạn như

trong các lĩnh vực hộ gia đình thông thường, trên các bức tường trong phòng tắm hoặc các khu vực

khác có mositure.

1.4.2. Ý nghĩa:

A. niger đóng vai trò quan trọng trong việc SXcác protein, enzyme (amylases, lipases, cellulose,

xylanases, glucoamylase và protease ) và quá trình lên men.

1.4.3. Ứng dụng:

- A. niger có thể SXalpha-galacatosidase là một enzyme có khả năng phá vỡ oligosaccharides nhất

định không tiêu hóa trong đường tiêu hóa . Những oligosaccharides thường gây chứng đầy hơi.

- Aspergillus niger được sử dụng rộng rãi để SXcác enzym và các axit hữu cơ.

- Ngoài ra A. niger được dùng để SXaxit citric (E330) và axit gluconic (E574) và đã được đánh giá là

chấp nhận được đối với lượng hàng ngày của Tổ chức Y tế Thế giới A. niger là "nói chung được công

nhận là an toàn"

1.5. Cơ chế của quá trình lên men acid citric: [9]

SX acid citric 2

Trong quá trình này glucose được chuyển hoá thành axit pyruvic theo con đường EMP (Embden-

Mayerhof-Parnas), sau đó axit pyruvic tiếp tục chuyển hoá thành axit citric.

Phương trình tổng quát của quá trình này như sau:2C6H12O6 + 3O2 → 6C6H8O7 + 4H2O

Có nhiều loài nấm mốc có khả năng oxy hóa gluxit thành axit citric như Rhizopus, Aspergillus,

Penicillium. Trong đó quan trọng nhất là Aspergillus niger.

1.6. Các giai đoạn quá trình lên men acid citric: [9]

Quá trình SXacid citric bằng pp lên men có thể chia ra ba giai đoạn sau:

-Chuẩn bị dung dịch lên men

-Lên men

-Xử lý dịch đã lên men để thu acid citric.

1.6.1. Chuẩn bị dịch lên men:

Nguyên liệu chủ yếu để lên men citric là đường. Ngoài ra N2, P, S, Zn, Fe và Mg cũng là những thành

phần rất quan trọng của MT lên men. Người ta đã chứng tỏ rằng hiệu suất của acid citric sẽ cao khi

màng nấm mỏng và khi có hình thành bào tử nhưng rất yếu. Và điều đó thường xảy ra khi hàm lượng

muối trong MT là cực tiểu.

- Nitơ là thành phần quan trọng nhất thường được đưa vào MT lên men dưới dạng NH4Cl, NH4NO3.

Hiệu suất của quá trình lên men là cực đại nếu hàm lượng nitơ có trong dịch lên men là 0,07%.

- Phospho cũng là nguyên tố rất quan trọng. Thiếu P, hệ sợi nấm tạo thành yếu và sẽ thiên về tổng hợp

ra acid gluconic. Còn khi không có P thì hệ sợi nấm lại không phát triển. Thường hàm lượng P2O5

khoảng 0,016 – 0,021% là thích hợp để cho hiệu suất cao.

- Lưu huỳnh thường được đưa vào MT lên men dưới dạng muối magie sulfat, kẽm sulfat và sắt sulfat.

Lượng S thích hợp là 71,1ml/l. tăng lượng S cao hơn sẽ giảm khả năng tổng hợp acid citric của hệ sợi.

Các nguyên tố khác như Mg, Zn, và Fe cũng không kém quan trọng. Loại trừ Zn ra khỏi MT thì hầu

như không tổng hợp ra được acid citric. Hiệu suất của acid citric sẽ rất cao nếu như Zn, Fe, Mg có mặt

với hàm lượng giới hạn.

Như vậy các nguyên tố vô cơ là nhân tố điều chỉnh sự tân tạo acid citric rất quan trọng. Trong các

đường làm nguyên liệu thì saccharose (chứa trong rỉ đường) và glucoza kỹ thuật là tốt hơn cả. Đường

củ cải tạo điều kiện cho hệ sợi nấm sinh trưởng tốt và hiệu suất acid cao. Hiệu suất acid cực đại khi

nồng độ đường trong dịch lên men tương đối lớn (25%). Nồng độ đường cao hơn, quá trình lên men bị

ức chế. Khi hết glucid thì hệ sợi nấm bắt đầu sử dụng đến acid citric. Khi đó phần lớn (85%) acid được

hệ sợi dùng cho hô hấp: C6H8O7 + 4,5O2 = 6CO2 + 4H2O

SX acid citric 3

1.6.2. Lên men:

Trong giai đoạn lên men acid citric thì độ pH, nhiệt độ và độ thoáng khí có ý nghĩa rất quan trọng.

(Các yếu tố ảnh hưởng này đã trình bày ở mục 1.2). Có thể lên men bằng pp nuôi cấy bề mặt hoặc

bằng pp nuôi cấy chiều sâu.

1.6.3. Xử lý dịch đã lên men:

Dung dịch đã lên men là một hỗn hợp các acid limonic, acid gluconic, acid oxalic, đường chưa bị lên

men và các tạp chất vô cơ (trong đó acid citric 40 – 50g/l, acid gluconic 3g/l, acid oxalic 1g/l, đường

chưa lên men 70g/l). Trung hòa dung dịch bằng phấn. Dựa vào độ hòa tan khác nhau của các muối tạo

thành để tách muối canxi citrat. Citrat hòa tan ít trong nước sôi, nhưng hòa tan trong nước lạnh, canxi

oxalat không hòa tan, còn canxi gluconat thì hòa tan ở bất kì nhiệt độ nào. Lọc để tách kết tủa canxi

citrat ra. Phân ly canxi citrat bằng acid sulfuric để tạo ra acid citric. Cô đặc và kết tinh acid citric .

1.7. Các pp lên men acid citric: [9]

1.7.1. Pp lên men bề mặt:

PP lên men bề mặt ứng dụng nhiều vào những năm đầu của thế kỷ XX, theo đó các vi sinh vật phát

triển hẳn trên bề mặt MT nằm giữa pha rắn và pha khí hoặc nằm giữa pha lỏng và pha khí. Như vậy,

pp lên men bề mặt có thể sử dụng hai loại MT: MT bán rắn, còn gọi là MT xốp và MT lỏng.

1.7.1.1. Lên men bề mặt với MT bán rắn:

PP này ít được áp dụng vì hiệu suất thu không cao và khá phức tạp ở khâu chiết, tách acid citric. Trước

kia người ta dùng MT cám mì, cám gạo có trộn khoảng 15 - 25% trấu để tăng độ xốp của MT. Ngoài

ra, trong một số cơ sở người ta còn dùng MT khác từ sắn, khoai tây, bắp… MT làm nguyên liệu phải

được nghiền nhỏ đến kích thước vừa phải. Sau khi nghiền xong MT phải được làm ấm đến độ ẩm

khoảng 60 - 65% và đem hấp thanh trùng bằng hơi nóng. MT làm xong phải được làm nguội và chuẩn

bị cho quá trình nuôi cấy.

Trước đó ta phải chuẩn bị giống. Quá trình này còn gọi là giai đoạn thu nhận bào tử giống.

a. PP thu nhận bào tử giống: Có 2 pp thu nhận:

PP thứ nhất:

Chuẩn bị 3 - 4 bình tam giác dung tích 150 ml, cho vào đó khoảng 50g cám để có độ ẩm 60%. Hấp

thanh trùng và để nguội. Từ ống giống Aspergillus niger gốc, ta chuyển toàn bộ khuẩn lạc bằng cách

cho vào mỗi ống nghiệm 10ml nước vô trùng, khuấy đều cho bào tử giống trong ống nghiệm hòa trộn

trong nước. Bằng pp vô trùng chuyển toàn bộ sang các bình tam giác đã chuẩn bị MT sẵn. Lắc đều cho

MT trộn đều bào tử. Nuôi chúng trong tủ ấm có nhiệt độ 30 - 37oC, trong thời gian 3 ngày. Khi thấy

SX acid citric 4

trong bình tam giác toàn là bào tử màu đen là kết thúc giai đoạn nuôi cấy. Tiếp đó, cũng MT như trên

nhưng được chuẩn bị vào khay nhôm hoặc inox. Tải đều khi cho 10% MT giống từ bình tam giác đã

nuôi ở trên vào. Chiều dày khối trộn khoảng tử 3 - 5cm. Để trong phòng có nhiệt độ ổn định là 32oC.

Nuôi trong khoảng 3 - 4 ngày khi bào tử màu đen xuất hiện kín bề mặt MT, đem sấy ở nhiệt độ < 40oC

ta thu được giống bào tử sẵn sàng cho quá trình SXđại trà.

PP thứ 2:

Người ta nuôi trong MT lỏng giống Aspergillus niger. MT để thu nhận bào tử có thành phần như sau:

Dung dịch nước malt có nồng độ chất khô 3 - 5%; NH4Cl 0,25g; KH2PO4 1,25g; MgSO4 0,25g; FeSO4

0,0125g. MT đã chuẩn bị xong được đưa vào bình có dung tích 2 - 3lít với chiều cao của dung dịch

trong các bình là 1cm, đem hấp thanh trùng ở 1 at trong 30phút. Sau đó chuyển giống từ ống nghiệm

giống vào. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 32oC trong thời gian 4 ngày hoặc lâu hơn cho đến khi trên bề mặt

xuất hiện váng nấm sợi, lúc đầu là màu trắng sau đó là đen chứa toàn bào tử. Người ta thu bào tử này

đem sấy ở nhiệt độ < 40oC và dùng nó như bào tử giống cấp 1. Để SXbào tử giống cấp 2, 3, người ta

thực hiện như quá trình nuôi nấm sợi trên khay đã trình bày ở trên.

b. Cách thức thực hiện quá trình lên men bề mặt:

Trộn cám với nước theo tỷ lệ 1:1. Hấp thanh trùng ở 1at trong 30 phút và tãi đều ra khay, sau khi làm

nguội sẽ được trộn giống với tỷ lệ 0,3 - 0,5%. Chiều dày của khối cám + bào tử giống khoảng 3 - 5cm.

Tiến hành nuôi ở nhiệt độ ổn định là 30 - 32oC trong 4 - 5 ngày. Thời gian lên men kết thúc khi bào tử

nấm sợi mới bắt đầu xuất hiện nhiều nhưng chưa hoàn toàn chuyển qua màu đen.

Pp nuôi cấy bề mặt để thu nhận acid citric trên MT bán rắn hiện nay không còn áp dụng ở các nước

châu Âu nữa. Tuy nhiên, ở nhiều nước vẫn pp này vẫn còn được áp dụng và thay cám bằng bột khoai

mì. Cứ 3 – 4kg bột khoai mì người ta thu được 1kg acid citric.

1.7.1.2. Lên men theo pp bề mặt trên MT lỏng:

Trong pp nuôi cấy này người ta sử dụng một trong những công thức MT sau đây:

Thông thường người ta thay đường saccharose bằng mật rỉ. Mật rỉ được xử lý trước khi làm MT. Xử lý

mật rỉ gồm 3 vấn đề cần giải quyết:

-Xử lý màu

-Xử lý hệ keo có trong mật rỉ

-Xử lý sắt nếu mật rỉ chứa sắt.

Mật rỉ đường cần phải được xử lý màu và hệ keo bằng cách cho dịch qua than họat tính để hấp phụ và

pha loãng để điều chỉnh hệ keo của dịch mật rỉ. Nếu trong mật rỉ có Fe3+

người ta cho vào mật rỉ sau

SX acid citric 5

pha loãng K4{Fe(CN)6}. Tiếp theo ta hiệu chỉnh hàm lượng đường và pH để thuận lợi cho quá trình

lên men. Hàm lượng đường được hiệu chỉnh ở hàm lượng từ 14 - 15% về khối lượng. Ngoài ra để quá

trình lên men thuận lợi cho vi sinh vật người ta bổ sung MgSO4, NH4NO3, KH2PO4 và điều chỉnh pH

từ 2,2 - 6 tùy thuộc vào thành phần các chất bổ sung mà điều chỉnh pH cho hợp lý.

Quá trình chuẩn bị giống đã được trình bày ở mục trên.

MT lên men phải được lọc ky và thanh trùng, làm nguội, phân phối vào các khay, nuôi ở nhiệt độ 28 -

32oC trong thời gian từ 48 - 72 giờ. Quá trình lên men trên bề mặt của dịch lỏng nhờ lớp váng dày ở

trên đó là khuẩn lạc của nấm Aspergillus niger. Acid citric sẽ được thẩm thấu qua màng tế bào vào

MT. Kết thúc quá trình lên men, người ta lấy phần dịch lên men đem đi lọc để thu acid citric và tiếp

tục lên men mẻ mới.

1.7.2. Lên men theo pp chìm:

Trong công nghệ SXacid citric theo pp chìm, người ta sử dụng MT giống như MT lỏng dùng trong pp

lên men bề mặt. Quá trình được thực hiện trong các thiết bị lên men có cánh khuấy và có hệ thống thổi

khí liên tục. Người ta tiến hành lên men ở 28 – 320C trong thời gian 6 – 7 ngày. Trong qúa trình lên

men, người ta thường phải sử dụng CaCO3 để điều chỉnh pH vì acid citric được tạo thành sẽ làm giảm

pH xuống 1 – 1,5. Việc điều chỉnh này còn có ý nghĩa là người ta chuyển acid citric thành xitrat canxi

lắng xuống. Kết thúc quá trình lên men, người ta sử dụng H2SO4 để tách acid citric ra. Tiến hành cô

đặc và kết tinh acid citric.

1.8. Thu hồi và tinh chế acid citric: [10]

Pp phổ biến để thu hồi và kết tinh acid citric là kết tủa citrate:

- Đầu tiên sinh khối nấm và các chất không tan được lọc bằng hệ thống lọc băng liên tục

- Citrat canxi được kết tủa từ dịch lọc bằng cách bổ sung hydroxit canxi vôi

+ Ở 700C sản phẩm là tricanxium tetrahydrat vô định hình

+ Ở 900C sản phẩm chủ yếu là dicalcium hydro citrat tinh thể

- Trường hợp lên men chìm, việc loại bỏ acid oxalic là không cần thiết bởi trong quá trình này pH có

thể dễ dàng khống chế

- Lượng acid citric trong dịch lọc có thể được kết tủa lần nữa nhờ việc bổ sung vôi cho tới khi pH= 5,8

- Phần kết tủa được lọc tiếp bằng một băng lọc khác và phần dịch được loại bỏ

- Việc rửa kết tủa nhằm loại bỏ các tạp chất bám theo như đường, protein thủy phân từ sinh khối nấm

- Các tinh thể sau khi rửa và acid sunfuric 98% được chuyển đồng thời vào hỗn hợp chứa 40% acid

citric pH=0,5-0,6

SX acid citric 6

- Phản ứng tiếp theo tạo acid citric và tủa dihydrat sulphat canxi (thạch cao)

- Sau đó dịch lọc được xử lý loại màu bằng than hoạt tính

- Các ion kim loại, sunphat canxi được loại bỏ bởi cột trao đổi cation mạnh và anion yếu (bước loại

khoáng)

- Dd sau đó được cô tới nồng độ 700kgm-3

và chuyển vào hệ thống kết tinh chân không ở 350C

- Tinh thể acid citric được tách bằng ly tâm và làm khô trong hệ thống sấy tầng sôi 2 giai đoạn :

+ Giai đoạn đầu sử dụng khí nóng 900C

+ Giai đoạn 2: khí ở 200C, độ ẩm 30-40% bởi các tinh thể tạo ra rất háo nước

- 20% dịch gốc được pha loãng với nước rửa thiết bị, loại màu và chuyển ngược về bước xử lý bằng

canxi hydroxit

- Phần còn lại dịch gốc được loại màu, loại khoáng và quay về bộ phận kết tinh

- Quy trình tách chiết pha lỏng, acid citric được tách từ dịch lên men sử dụng hỗn hợp trilaurylamine,

n-octanol và C10- hoặc C11- isoparafin.

- Dịch chiết được gia nhiệt và rửa bằng nước theo chiều ngược tạo ra sản phẩm là dịch acid citric

- Dịch thu acid sau đó được xử lý bằng than hoạt tính, cô đặc và kết tinh tạo thành tinh thể acid citric.

1.9. Ứng dụng: [1]

1.9.1. Thực phẩm:- Acid citric là một chất phụ gia thực phẩm, acid citric được dùng làm gia vị, chất

bảo quản thực phẩm và đồ uống, đặc biệt là nước giải khát, nó mang mã số E330. - Acid citric cũng

được cho vào thành phần của kem để giữ các giọt chất béo tách biệt. Ngoài ra nó cũng được thêm vào

nước ép chanh tươi.

1.9.2. Hóa học:- Chất đệm của các phức citrat được dùng để hiệu chỉnh độ pH của chất tẩy rửa và

dược phẩm. - Acid Citric có khả năng tạo phức với nhiều kim loại có tác dụng tích cực trong xà phòng

và chất tẩy rửa. Bằng cách phức hóa các kim loại trong nước cứng, các phức này cho phép các chất tẩy

rửa tạo nhiều bọt hơn và tẩy sạch hơn mà không cần làm mềm nước trước. Bên cạnh đó acid citric còn

dùng để SX các chất trao đổi ion dùng để làm mềm nước bằng cách tách ion kim loại ra khỏi phức

citrat. - Acid citric là một trong những hóa chất cần thiết cho quá trình tổng hợp Hexametylen

triperoxit diamin (HMDT) là một chất dễ phát nổ giống Axeton peroxit, nhạy với nhiệt và ma sát. Ở

một số nước nếu bạn mua một số lượng lớn acid citric bạn sẽ bị liệt kê vào sổ đen của các âm mưu

khủng bố.

1.9.3. Dược phẩm:- Acid citric được sử dụng trong xi-rô, chất làm se, loại viên sủi và loại thuốc bột.

Nó cũng được sử dụng trong truyền máu.