UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA

TRATAMENTO EXPERIMENTAL DE CES NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE NEUROLGICA

COM O USO DE RIBAVIRINA E DIMETIL-SULFXIDO (DMSO)

SIMONE HENRIQUES MANGIA

BOTUCATU SP 2008

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA

TRATAMENTO EXPERIMANTAL DE CES NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA

CINOMOSE NA FASE NEUROLGICA COM O USO DA RIBAVIRINA E DIMETIL-SULFXIDO (DMSO)

SIMONE HENRIQUES MANGIA

Dissertao apresentada junto ao Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria para obteno de ttulo de Mestre em Medicina Veterinria

Orientador: Prof. Ass. Dr. Antonio Carlos Paes

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FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA SEO TCNICA DE AQUISIO E TRATAMENTO DA INFORMAO

DIVISO TCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECRIA RESPONSVEL: Selma Maria de Jesus

Mangia, Simone Henriques. Tratamento experimental de ces naturalmente infectados com o vrus da

cinomose na fase neurolgica com o uso da Ribavirina e Dimetil-Sulfxido (DMSO) / Simone Henriques Mangia. Botucatu : [s.n.], 2008

Dissertao (mestrado) Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Botucatu, 2008.

Orientador: Antonio Carlos Paes Assunto CAPES: 50501062

1. Co - Doenas 2. Cinomose - Tratamento

CDD 636.70896

Palavras-chave: Ces; Cinomose; Dimetil-Sulfxido; Encefalite; Morbillivirus; Ribavirina; Tratamento

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Nome do Autor: Simone Henriques Mangia

Ttulo: TRATAMENTO EXPERIMENTAL DE CES NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE NEUROLGICA COM O USO DA RIBAVIRINA E DIMETIL-SULFXIDO (DMSO).

COMISSO EXAMINADORA

Prof. Ass. Dr. Antonio Carlos Paes Presidente e Orientador Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica FMVZ UNESP Botucatu

Profa. Ass. Dra. Regina Kiomi Takahira Membro Departamento de Clnica Veterinria FMVZ UNESP Botucatu

Prof. Associado I Dr. Rogrio Tortelly Membro Departamento de Patologia e Clnica Veterinria Faculdade de Veterinria UFF

Data da Defesa: 07 de maro de 2008

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Dedicatria

Dedico esta pesquisa minha me, Sandra da Cunha Henriques, por

ter me apoiado e orientado em todos os momentos da minha vida. Esta

dedicatria serve como agradecimento para tudo que recebi na minha

trajetria.

Dedico esta pesquisa ao meu orientador, Prof. Ass. Dr. Antonio

Carlos Paes, por ser o idealizador deste estudo, que me fez aprender a

superar e criar opes em momentos de dificuldade.

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Agradecimentos

Agradeo a Deus pela oportunidade de enriquecer meus conhecimentos nesta inestimvel universidade e por ter feito tantos amigos aqui.

Agradeo a minha me e av, Sandra e Dilma, por todos os valores que me ensinaram, pelo amor e dedicao, alm de toda compreenso pela minha ausncia. Tambm sinto muita a falta de vocs! Obrigada por toda a ajuda que me deram nesse perodo, permitindo que eu pudesse terminar mais uma fase da minha vida.

Agradeo a toda famlia Mangia, principalmente meus padrinhos, Eunice e Marciano, por estarem sempre por perto nos momentos mais importantes da minha vida, pelos ensinamentos e amor que sempre recebi. Obrigada pelo apoio e compreenso!

Agradeo aos meus tios, Marcos e Aparecida e os primos, Anna Luiza e Marcos Jr., por toda a ajuda que me ofereceram, pelos momentos de alegria vividos e pela compreenso da minha ausncia.

Agradeo s minhas amigas cariocas, Danielle, Mirian e Cheryl pelo apoio que recebi durante todo esse perodo, pelos maravilhosos e inesquecveis momentos de diverso e pelo apoio nas horas tristes. Vocs so eternas!

Agradeo s minhas amigas de Botucatu, Fernanda, Andreza e Ana Paula, por estarem sempre do meu lado, nos momentos bons e ruins, pelos conselhos e pela ajuda que me ofereceram aos finais de semana para a boa execuo do experimento.

Agradeo ao meu orientador, Prof. Ass. Dr. Antonio Carlos Paes, por confiar em mim para execuo desta pesquisa, pelos ensinamentos e orientao profissional. Obrigada pela convivncia agradvel.

Agradeo Profa. Regina Kiomi Takahira, Eduardo Cirrose e todos os residentes do Laboratrio Cnico Veterinrio da UNESP Botucatu, pela realizao dos exames complementares pesquisa, trabalhos cientficos e boa convivncia.

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Agradeo Profa. Jane Megid por disponibilizar os exames de imunofluorescncia direta, me dando a oportunidade de melhorar os resultados desta pesquisa, por incentivar em outras pesquisas e boa convivncia. Foi muito bom te conhecer melhor neste perodo!

Aos professores, Hlio Langoni, Mrcio Garcia Ribeiro, Jane Megid, Rafael Modolo, Paulo Francisco Domingues, agradeo pelos ensinamentos, por me aceitarem no departamento e por apoiarem nessa pesquisa.

Agradeo s amigas, Amanda Keller Siqueira e Tatiana Salerno, pela companhia na hora do caf, que significou momentos de descontrao, conselhos, idias de novos trabalhos e at alguns desabafos.

Agradeo aos dois grandes amigos, Roberto Bolsanello e Andr Luiz Mangia, um em cada lugar diferente, mas considerados irmos, pelo apoio e pelos momentos de alegria durante este perodo.

Aos amigos, Aruaque e Guilherme e todos os colegas do forr que conheci em Botucatu, obrigada pelos momentos de diverso.

Aos amigos de ps-graduao, Accia Elias, Ana Paula Contente, Ana Paula Flamnio, Andr Peres Barbosa, Audrey Renn, Fbio Shimabukuro,Gustavo Lara, Janana Biotto, Juliana Machado, Juliano Sorovar, Luciano Eloy, Marcela Zampolli Trocarelli, Melissa Hartmann, Rodrigo Costa da Silva, Vanessa Salgado, Veruska Maia, Walkria Prado e todos os ps-graduandos do departamento, obrigada por colaborarem com a realizao deste experimento com amizade e auxlio.

Aos residentes da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais, Rodrigo, Jeniffer, Camila, Marta e Suzan, agradeo por colaborarem com o desenvolvimento da pesquisa, pois sem vocs no teria conseguido concluir o experimento.

Aos residentes da Disciplina de Zoonoses, Leila, Felipe, Dulce, Haroldo, obrigada pela ajuda e orientao no diagnstico de toxomplasmose.

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Agradeo aos tcnicos e funcionrios, Fernando, Tnia, Adriana, Rodrigo Carreira, Adilson (Pardal), Carlos Eduardo (Kadu), Josiane, Benedito e Marcus, pela amizade, momentos de descontrao e todo apoio.

Wander e Serginho, obrigada pela convivncia agradvel, apoio e momentos de descontrao que auxiliaram na conduta do experimento.

Aos funcionrios da ps-graduao, do arquivo, da biblioteca obrigada pela inestimvel ajuda.

Agradeo ao Prof. Aristeu Vieira da Silva a ajuda na realizao e interpretao das anlises estatsticas desta pesquisa.

Agradeo a BIOLUNIS Farmacutica Ltda. por ceder o medicamento antiviral, essencial para a realizao da pesquisa.

Clnica Veterinria Pharmazoo, agradeo por me receber como parte da equipe, pelo apoio e compreenso e pelo crescimento profissional, permitindo que conseguisse me manter em Botucatu para a realizao da pesquisa.

Capes pelo apoio financeiro e importante para realizao da pesquisa.

A todos aqueles que me ajudaram e por um lapso de memria no citei, muito obrigada!

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Epgrafe

Aproveite bem, o mximo que puder, o poder e a beleza da juventude. Ou ento, esquece. Voc nunca vai entender mesmo o poder e a beleza da juventude at que

tenham se apagado. Mas pode crer, daqui a vinte anos, voc vai evocar as suas fotos e perceber de um jeito que voc nem desconfia hoje em dia quantas, tantas alternativas se escancaravam sua frente. E como voc realmente estava com tudo em cima. Voc

no est gordo, ou gorda. No se preocupe com o futuro. Ou ento preocupe-se, se quiser, mas saiba que pr-ocupao to eficaz quanto mascar chiclete para tentar resolver uma equao de

lgebra. As encrencas de verdade em sua vida tendem a vir de coisas que nunca passaram pela sua cabea preocupada, que te pegam no ponto fraco s quatro da tarde

de uma tera-feira modorrenta. Todo dia enfrente pelo menos uma coisa que te meta medo de verdade.

Cante.

No seja leviano com o corao dos outros, no ature gente de corao leviano. Use fio dental.

No perca tempo com inveja. s vezes, se est por cima; s vezes, por baixo... A peleja longa e, no fim, s voc contra voc mesmo.

No esquea os elegios que receber, esquea as ofensas. Se conseguir isso, me ensine. Guarde as antigas cartas de amor. Jogue fora os extratos bancrios velhos.

Estique-se.

No se sinta culpado por no saber o que fazer da vida. As pessoas mais interessantes que conheo no sabiam aos 22 o que queriam fazer da vida. Alguns dos quarentes

mais interessantes que conheo ainda no sabem. Tome bastante clcio. Seja cuidadoso com os joelhos: voc vai sentir falta deles.

Talvez voc case, talvez no. Talvez tenha filhos, talvez no. Talvez se divorcie aos 40, talvez dance ciranda em suas bodas de diamante. Faa o que fizer, no se auto-

congratule demais e nem seja severo demais com voc. As suas escolhas tm sempre metade das chances de dar certo. assim para todo mundo.

Desfrute de seu corpo, use-o de toda maneira que puder mesmo. No tenha medo de seu corpo ou do que as outras pessoas possam achar dele. o mais incrvel instrumento

que voc jamais vai possuir. Dance... Mesmo que no tenha onde, alm de seu prprio quarto.

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Leia as instrues, mesmo que no v segui-las depois. No leia revistas de beleza. Elas s vo fazer voc se achar feio.

Dedique-se a conhecer os seus pais. impossvel prever quando eles tero ido embora, de vez. Seja legal com os seus irmos. Eles so a melhor ponte com o seu passado e,

possivelmente, quem vai sempre mesmo te apoiar no futuro. Entenda que amigos vo e vm. Mas nunca abra mo de uns poucos e bons. Esforce-se de verdade para diminuir as distncias geogrficas e destinos de vida, porque quanto mais velho voc ficar, mais voc vai precisar das pessoas que conheceu quando jovem. More uma vez em Nova Iorque, mas v embora antes de endurecer. More uma vez no

Hava, mas se mande antes de amolecer. Viaje. Aceite certas verdades inescapveis: os preos vo subir, os polticos vo saracotear, voc tambm vai envelhecer. E quando isso acontecer, voc vai fantasiar que quando

era jovem os preos eram razoveis, os polticos eram decentes e as crianas respeitavam os mais velhos.

Respeite os mais velhos. No espere que ningum segure a sua barra. Talvez voc arrume uma boa

aposentadoria privada, talvez case com um bom partido, mas no esquea que um dos dois pode, de repente, acabar.

No mexa demais nos cabelos, seno quando voc chegar aos 40, vai aparentar 85. Cuidado com os conselhos que comprar, mas seja paciente com aqueles que os

oferecem. Conselho uma forma de nostalgia. Compartilhar conselhos um jeito de pescar o passado do lixo, esfreg-lo, repintar as partes feias e reciclar tudo por mais

do que vale.

Publicado no jornal americano Chicago Tribune em 1 de junho de 1997 Autora: Mary Schmich

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LISTA DE TABELAS

Tabela 01 - Relao de animais que compuseram os dois grupos experimentais, com idade, sexo, raa e resultado da reao de imunofluorescncia direta no esfregao sangneo........................ 88

Tabela 02 - Tempo de evoluo dos sinais neurolgicos entre os grupos......... 89

Tabela 03 - Resultado da reao de imunofluorescncia direta de esfregao sangneo dos animais nos gurpo 1 e 2.......................................... 89

Tabela 04 - Evoluo da cinomose na fase neurolgica entre os grupos.......... 90

Tabela 05 - Relao entre a evoluo da doena com o histrico vacinal dos animais............................................................................................ 91

Tabela 06 - Relao entre a evoluo da doena frente ao tempo de desenvolvimento dos sinais neurolgicos at o incio do tratamento....................................................................................... 92

Tabela 07 - Relao dos sinais clnicos neurolgicos encontrados nos diferentes grupos, no momento que foram atendidos no Hospital Veterinrio......................................................................................

94

Tabela 08 - Relao das leses neurolgicas nos grupos e a evoluo da doena............................................................................................. 95

Tabela 09 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia da contagem de hemcias.........................................................................................

98

Tabela 10 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia da concentrao de hemoglobina...................................................................................

99

Tabela 11 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia do volume globular...........................................................................................

100

Tabela 12 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia na contagem de plaquetas.........................................................................................

101

12

Tabela 13 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia entre os grupos com relao contagem total de leuccitos........................................................................................

101

Tabela 14 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia entre os grupos com relao contagem de linfcitos.........................................................................................

103

Tabela 15 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia na contagem de moncitos........................................................................................

104

Tabela 16 - Mdia e desvio padro dos valores encontrados nos dois grupos na dosagem de uria no soro...........................................................

105

Tabela 17 - Representao mdia dos valores de protena na urina entre os dois grupos e nvel de significncia....................................................................................

108

Tabela 18 - Relao do nmero de hemcias no sedimento urinrio nos dois grupos e nvel de significncia.......................................................

109

Tabela 19 - Relao do nmero de leuccitos no sedimento urinrio nos dois grupos e nvel de significncia.......................................................

110

Tabela 20 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia dos valores de protena no lquor dos dois grupos.................................................

112

Tabela 21 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia da contagem de clulas nucleadas no lquor dos animais dos dois gurpos..............

113

Tabela 22 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia da porcentagem de linfcitos no lquor dos animais dos dois grupos...........................

115

Tabela 23 - Mdiana e nvel de significncia da contagem diferencial de linfcitos no lquor dos animais dos dois grupos, nos diferentes momentos........................................................................................

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LISTA DE FIGURAS

Figura 01 - Representao grfica da avaliao clnica diria dos animais dos dois grupos experimentais.......................................................

90

Figura 02 - Representao grfica da variao das mdias da contagem de hemcias entre os dois grupos........................................................

98

Figura 03 - Representao grfica da variao das mdias da contagem total de leuccitos entre os dois grupos..................................................

102

Figura 04 - Representao grfica da variao das mdias da contagem de linfcitos entre os dois grupos........................................................

103

Figura 05 - Grfico representando as variaes das mdias de protena, albumina e globulina do soro dos dois grupos............................... 106

Figura 06 - Representao grfica da contagem de clulas nucleadas no lquor nos dois grupos....................................................................

114

Figura 07 - Representao grfica da porcentagem de linfcitos no lquor nos dois grupos..............................................................................

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LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

% - porcentagem m nanmetro

C graus Celsius < - menor que

> - maior que

L microlitro

mg miligramas

mL - mililitros

dL - decilitro - marca registrada - alfa

ALT alanina-aminotransferase

ATP adenosina trifosfato CPK creatinina fosfo-quinase

CDV vrus da cinomose DL 50 dose letal 50 DMSO Dimetil Sulfxido DMS dimetil sulfoxide DMF dimetil formamide DMSO2 dimetil sulfone DMS dimetil sulfide EDTA cido etilenodiaminotetractico ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay F protena de fuso FA fosfatase alcalina

Fc receptor de anticorpos de alta afinidade de macrfagos FDA Food and Drug Administration g gama

G1 grupo 1

G2 grupo 2 GC grupo controle

GGT gama-glutamiltransferase

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GSH Gonadotropina corinica humana GTP guanosina tri-fosfato

g/Kg gramas por quilo HA hemaglutinina

IFD imunofluorescncia direta IFN interferon

IgA imunoglobulina A IgG imunoglobulina G IgG1 imunoglobulina G1 IgG2 imunoglobulina G2 IgM imunoglobulina M IL interleucina

IMP inosina mono-fosfato

IND Investigated new drugs L polimerase ou grande LCR lquido cefalorraquidiano mg/Kg miligramas por quilo g/mL microgramas por militro

M protena de membrana MHC Complexo de histocompatibilidade principal MMP matrix metaloproteases

mRNA RNA mensageiro

NADPH2 nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato, forma reduzida NC nervo craniano NP nucleoprotena

P fosfoprotena

PBS Soluo salina tamponada PCR reao em cadeia pela polimerase PGE2 prostaglandina E2 pH presso de hidrognio ROS radicais livres de oxignio RT-PCR reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa rpm rotao por minuto

SLAM molcula sinalizadora da ativao de linfcitos

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SNC Sistema nervoso central spp. espcie

SRD sem raa definida SSPE paencefalite subaguda esclerosante U.S. United States TIMP inibidores tissulares da matrix metaloproteases TNF fator de necrose tumoral

* Em virtude do uso consagrado na literatura tcnica, algumas abreviaturas seguem sua grafia no ingls.

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SUMRIO RESUMO............................................................................................................. 19 ABSTRACT......................................................................................................... 20 INTRODUO................................................................................................... 21 REVISO DE LITERATURA.......................................................................... 27 1 ESTRUTURA VIRAL............................................................. 28 2 RESISTNCIA VIRAL........................................................... 29 3 TROPISMO VIRAL................................................................ 29 4 EPIDEMIOLOGIA.................................................................. 30

5 PENETRAO CELULAR.................................................... 32 6 PATOGENIA........................................................................... 32 7 PATOGENIA DA IMUNOSSUPRESSO............................. 33 8 NEUROPATOGENIA............................................................. 34

8.1 ENCEFALITE DO CO VELHO............................... 38 8.2 DESMIELINIZAO................................................. 39 9 SINAIS CLNICOS.................................................................. 42 10 ENFERMIDADES RELACIONADAS COM O VRUS DA

CINOMOSE.............................................................................

44

11 PATOLOGIA CLNICA.......................................................... 45 12 ACHADOS ANTOMO-PATOLGICOS............................ 47 13 PROGNSTICO...................................................................... 51 14 DIAGNSTICO....................................................................... 51 15 TRATAMENTO...................................................................... 54 16 PROFILAXIA.......................................................................... 56 17 RIBAVIRINA FRENTE AOS Paramyxovirus........................ 59 18 MECANISMO DE AO....................................................... 60 19 PROPRIEDADES DA RIBAVIRINA..................................... 61 19.1 Viramidine: Pr-droga da ribavirina............................ 63 20 RIBAVIRINA E O SISTEMA IMUNE................................... 64 21 CONTRA-INDICAES E EFEITOS COLATERAIS DA

RIBAVIRINA..........................................................................

64 22 DIMETIL SULFXIDO COMO SOLVENTE DE

NUCLEOTDEOS....................................................................

66

18

23 PROPRIEDADES DO DIMETIL SULFXIDO.................... 66 23.1 DMSO e membranas celulares..................................... 66 23.2 Captura de radicais livres............................................. 66 23.3 Solvente orgnico......................................................... 67 23.4 Protetor tecidual, antinflamatrio e antisqumico........ 68 23.5 Efeitos no Trato Gastro-intestinal................................ 69 23.6 Antimicrobiano............................................................ 70 23.7 Antifngico................................................................... 70

23.8 Indicaes aprovadas para uso..................................... 70 23.9 Efeitos no sistema nervoso........................................... 71 23.10 Metabolismo e excreo.............................................. 71 24 DIMETIL SULFXIDO E OS ERITRCITOS...................... 71 25 EFEITOS COLATERAIS E CONTRA-INDICAES DO

DIMETIL SULFXIDO..........................................................

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OBJETIVOS........................................................................................................ 74 MATERIAIS E MTODOS............................................................................... 76 1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL................................... 77 2 ANIMAIS.................................................................................. 77

3 GRUPOS EXPERIMENTAIS.................................................. 78 4 DOSES E DROGAS EXPERIMENTAIS................................ 79 5 AMBIENTE E ALIMENTAO DOS CES........................ 80 6 EXAMES COMPLEMENTARES........................................... 80 6.1 Hemograma.................................................................. 82 6.2 Anlises bioqumicas................................................... 82 6.3 Urinlise....................................................................... 83 6.4 Anlise do lquor.......................................................... 83 7 REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA DIRETA............. 84 8 ANLISE ESTATSTICA....................................................... 85 RESULTADOS.................................................................................................... 86 1 ANIMAIS................................................................................. 87 2 AVALIAO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS............... 89 3 EVOLUO DA DOENA FRENTE AOS DADOS

EPIDEMIOLGICOS..............................................................

91

19

4 EVOLUO DA DOENA FRENTE AOS SINAIS CLNICOS E AS LESES NEUROLGICAS.......................

92 5 EXAMES COMPLEMENTARES........................................... 97 6 EFEITOS COLATERAIS......................................................... 116 DISCUSSO......................................................................................................... 118 CONCLUSES.................................................................................................... 135 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................... 137 ARTIGO PARA PUBLICAO....................................................................... 153

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MANGIA, S. H. Tratamento experimental de ces naturalmente infectados com o

vrus da cinomose na fase neurolgica com o uso da Ribavirina e Dimetil-Sulfxido (DMSO). Botucatu, 2008. 152p. Dissertao (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista.

RESUMO

Este estudo teve por objetivos testar a eficcia da ribavirina em ces acometidos de cinomose na fase neurolgica; avaliar os efeitos colaterais da mesma atravs do monitoramento hematolgico e provas bioqumicas; avaliar a resposta imunolgica no sistema nervoso central dos ces atravs do exame de lquor; adaptar uma dose e via de administrao adequada da ribavirina em ces e testar a eficcia do DMSO como permeante de membranas biolgicas atuando como vetor da ribavirina. Foram utilizados 20 ces com sinais clnicos neurolgica, divididos em dois grupos de tratamento, sendo que um grupo recebeu a ribavirina e outro a associao da ribavirina e o DMSO, sem distino de sexo e raa, com idades at seis anos e tempo de evoluo mximo de 10 dias. Todos os animais foram avaliados clinicamente e realizado o teste de imunofluorescncia direta de sangue para incluso no estudo. Os exames complementares foram realizados de forma rotineira, o lquor foi colhido antes e aps o tratamento, as drogas foram administradas durante 15 dias consecutivos e realizada a avaliao clnica diria dos animais. Pelos resultados observamos que a ribavirina demonstrou atividade efetiva contra o vrus da cinomose, exercendo leves efeitos colaterais na medula ssea, sistema imune e sistema gastro-intestinal. No lquor observamos diminuio da produo de anticorpos e verificamos que o DMSO tornou a ao da ribavirina mais eficaz.

PALAVRAS-CHAVE: Ces; Cinomose; Dimetil-Sulfxido; Encefalite; Morbillivirus; Ribavirina; Tratamento

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MANGIA, S. H. Experimental treatment of naturally infected dogs with canine

distemper virus, in neurological stage, using Ribavirin and Dimethylsulphoxide (DMSO). Botucatu, 208. 152p. Dissertation (Master) College of Veterinary Medicine and Animal Science, Campus of Botucatu, So Paulo State University.

ABSTRACT

This study aimed to test the ribavirin efficacy in dogs infected with canine distemper virus in neurological stage; to evaluate this collateral effects by hematological and biochemical evaluation; to evaluate the immunological response on dogs central nervous system (CNS) by cerebrospinal fluid (CSF) analysis; to adapt a dose and an adequate administration route of ribavirin in dogs and to test the efficacy of dimethylsulphoxide (DMSO) in increasing the permeability of biological membranes acting as ribavirin vector. Twenty dogs with neurological signs, divided in two treatment groups, without sex and breed distinction, till six years old and a maximum evolution time of 10 days were used. All animals were selected based on clinical sings and the blood direct fluorescent test (DFA). The hemogram, biochemical and urinalsis test were carried out. At the complementary tests, CSF was collected before and after the treatment, and ribavirin and its association with DMSO were administered during 15 days, consecutive, and the animal clinical evaluation was carried out daily. Based on the results, ribavirin demonstrated effective activity against canine distemper virus, besides its light collateral effects in bone marrow, immune and gastrointestinal systems. In CSF, the lowering of antibody production, and the positive effects of DMSO on ribavirin efficacy were observed.

KEYWORDS: Dogs; Canine Distemper; Dimethylsulphoxide; Encephalitis; Morbillivirus; Ribavirin; Treatment.

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Introduo

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Segundo Spinola, a cinomose foi observada na Europa desde a segunda metade do sculo XVIII, proveniente da sia. Sua natureza contagiosa j era reconhecida desde meados do sculo XIX, porm, foi Carr quem, aps uma srie de estudos, considerou-a como enfermidade ocasionada por vrus (CORRA & CORRA, 1992). Os estudos de Carr no foram aceitos, pois todos os pesquisadores e profissionais atribuiam os sinais e sintomas encontrados patogenicidade da B. brochiseptica. Aps os trabalhos de Laidlaw e Dunkin, 1926, foi aceita a etiologia viral da enfermidade (CORRA & CORRA, 1992 apud CARR, 1905). No entanto, outros autores relatam que a cinomose uma enfermidade conhecida desde 1760, altamente contagiosa e febril, de carter aguda ou subaguda (SHIN et al., 2004 apud MURPHY et al., 1999). A partir de 1930, a enfermidade passou a ser perfeitamente conhecida em suas formas clnicas e etiolgicas (CORRA & CORRA, 1992). Appel & Summers (1999), relatam que na primeira metade do sculo XX, a cinomose foi considerada uma das doenas fatais mais comuns em ces em todo o mundo. Posteriormente, nos anos 60 e com o surgimento de vacinas especficas, este quadro modificou-se (TIPOLD et al., 1992). Durante sculos, as infeces pelos Morbillivrus tm tido imenso impacto na vida de humanos e animais. Entre os carnvoros, o vrus da cinomose causa srias enfermidades em vrias espcies, selvagens e domsticas. Mesmo sendo controlada com vacinao em ces domsticos e animais de cativeiro, uma doena de difcil erradicao j que o vrus possui distribuio global e ampla variedade de hospedeiros (BARRETT, 1999). Diferentes espcies da ordem Carnvora, como Ailuridae, Canidae, Hyaenidae, Mustelidae, Procyonidae, Ursidae, Viverridae e Felidae so relatadas como susceptveis infeco pelo vrus da cinomose e a mortalidade varia bastante entre as espcies (APPEL & SUMMERS, 1995). Em 1955, uma grande quantidade de focas do gnero Lobdon carcinophagus morreram na proximidade de uma base na Antrtica, onde havia uma matilha de ces. Os ces no eram vacinados contra cinomose e foi sugerido que os mesmos transmitiram a infeco para as focas. Bengtson et al. (1991) atravs de testes sorologgicos confirmaram alta prevalncia de anticorpos contra o vrus da cinomose nestas focas.

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Desde a epizootia em focas nos anos de 1988 e 1989 no Mar do Norte da Europa, descobriu-se que os Morbillivirus podiam acometer mamferos aquticos (HASS & BARRETT, 1996). Nos anos de 1987 e 1988, o vrus da cinomose foi responsvel pela morte de cem focas (Phoca sibirca) no Lago Baikal na Rssia (GRACHEV et al., 1989) e foi isolado em outro tipo de foca no Canad (LYONS et al., 1993). O vrus da cinomose foi responsvel pela morte de focas do gnero Phoca caspica, em junho de 1997. As mortes foram observadas prximo ao Azerbaijo, ao leste no Mar Cpsio. A anlise da amostra de uma das focas revelou a presena do cido nuclico do vrus da cinomose (FORSYTH et al., 1998). A relao gentica entre as cepas virais de diferentes partes do mundo pde ser estabelecida atravs das tcnicas de biologia molecular e permitiu traar com mais certeza a origem de novos surtos. Vrios laboratrios relataram estudos similares para diferenciar geograficamente linhagens distintas do vrus da cinomose que acomete animais domsticos e selvagens (BARRETT, 1999). Em 1992, diversas espcies de grandes feldeos morreram com cinomose nos zoolgicos da Amrica. Dois anos aps, lees do Parque Nacional do Serengeti na Tanznia, morreram em grande nmero, e a cinomose foi identificada como causa (BARRETT, 1999). O estudo retrospectivo de Myers et al. (1997), utilizando amostras de lees e tigres que morreram em zoolgico da Sua entre os anos de 1972 a 1992, revelou que 19 das 42 amostras eram positivas ao antgeno do Morbillivirus. Atualmente, a cinomose rara em vrios pases devido vacinao, mas ainda considerada uma enfermidade importante por acometer vrias espcies da famlia Felidae e pode ocorrer eventualmente na populao canina vacinada (VAN MOLL et al., 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Em regies endmicas, como no Brasil, crescente o nmero de mortes de ces vtimas da cinomose. Alm disso, a mesma tem sido considerada como re-emergente em pases onde j esteve controlada (SILVA et al., 2007). Embora a vacinao contra a cinomose venha sendo utilizada amplamente por vrias dcadas, a doena ainda importante e surtos foram recentemente relatados em vrios pases, como Dinamarca, Estados Unidos, Japo, Finlndia e Alemanha (JZWIK & FRYMUS, 2005; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). No Brasil, alguns relatos clnico-patolgicos e sorolgicos indicam a elevada presena da infeco na populao canina (HEADLEY & GRAA, 2000; SILVA et al., 2004). Alguns

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fatores como a persistncia do vrus no ambiente e em animais portadores, o aparecimento de novas cepas e o desenvolvimento de infeco e doena mesmo em animais vacinados tm contribudo para a manuteno do carter enzotico da virose e a ocorrncia ocasional de surtos (BHM et al., 2004). Alguns achados sugerem que existam diferenas antignicas em reas geogrficas distintas, nos tipos virais selvagens com relao s cepas vacinais, responsveis pelo ressurgimento da doena. O sequenciamento gentico e anlise filogentica so mtodos que no indicam a relao evolucionria entre amostras coletadas em diversas regies geogrficas, mas ajudam a entender as diferenas antignicas entre amostras biolgicamente diferentes (CASTILLO et al., 2007). A reao cruzada imunolgica entre os vrus do sarampo e da cinomose foi descrita pela primeira vez em 1957. No mesmo ano, Polding & Simpson e Goret et al., apresentaram evidncias da relao imunolgica entre a cinomose e a peste dos ruminantes. Em 1953, o soro e a gama-globulina de um adulto humano demostraram a presena de anticorpos especficos neutralizantes para o vrus da cinomose. Alteraes citopticas produzidas pelo vrus da cinomose em culturas celulares de fgado de co eram semelhantes s causadas pelo vrus do sarampo. No estudo realizado por Imagawa et al. (1960), foi relatado que o soro anti-cinomose poderia neutralizar o vrus do sarampo.

Em 1979, foi relatado por Stephenson & Meulen a relao antignica entre os vrus do sarampo e da cinomose atravs da comparao entre a resposta imune de humanos e animais. As anlises comparativas do polipeptdeo L do vrus do sarampo e do vrus da cinomose mostravam reao cruzada antignica e demonstraram as funes das outras protenas estruturais. O vrus da cinomose pertence famlia Paramyxoviridae, gnero Morbillivirus, e apresenta relao antignica com os vrus do sarampo, da peste bovina e da peste de pequenos ruminantes (TIPOLD et al., 1992; HASS & BARRETT, 1996; BARRETT, 1999). O sarampo considerado uma doena sria em todo mundo, com mortalidade aproximada de 800.000 crianas por ano, sendo primariamente associado com desnutrio e infeco secundria por bactrias e protozorios. A infeco pelo vrus do sarampo tambm pode ocasionar complicaes no sistema nervoso central (SNC) com apresentaes distintas: encefalomielite aguda desmielinizante, encefalite do sarampo com corpsculos de incluso e panencefalite subaguda esclerosante (RIMA & DUPREX, 2006).

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No existe agente antiviral especfico para o tratamento da cinomose e mesmo com vacinao permanece como a pior doena em ces. A ribavirina uma alternativa de tratamento, pois mostrou alguma eficcia contra Vrus Respiratrio Sincicial, Vrus da Febre de Lassa e Vrus do Sarampo (ELIA et al., 2007). O interesse na quimioterapia antiviral comeou em 1950, quando a pesquisa de agentes anti-tumorais gerou interesse em inibidores da sntese de DNA e foram produzidos vrios compostos capazes de inibir a sntese de DNA viral. Agentes antivirais foram administrados pela primeira vez com sucesso nos anos 1960, quando Bauer impediu doenas administrando thiosemicarbazone (methisazone) em pacientes expostos varola e Kaufman obteve melhora de pacientes com herpes utilizando idoxirudine tpico (BEAN, 1992). Em 1970, a ribavirina foi sintetizada pela primeira vez como parte de esforo intensivo de buscar por novos agentes antivirais. No primeiro momento, surgiu para ser um anlogo a nucleotdeo capaz de abrir o anel de pirimidina, porm, estruturalmente e funcionalmente mais parecido a guanosina (BEAN, 1992). Nestas pesquisas iniciais, envolvendo poucos agentes antivirais com eficcia, muitos tinham apenas efetividade in vitro. Entretanto, a ribavirina (1--D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxamide) um agente antiviral que mostrou atividade in vitro contra grande variedade de DNA e RNA vrus (GILBERT & KNIGHT, 1986). A ribavirina foi aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para o tratamento peditrico da infeco pelo vrus sincicial respiratrio e sua combinao com alfa-interferon para infeco crnica pelo vrus da hepatite C. Recentemente, benefcios teraputicos do antiviral esto sendo avaliados para o tratamento de sndrome respiratria severa aguda e infeco do vrus da varola, em casos de bioterrorismo (WU et al., 2005). O registro histrico do dimetil sulfxido (DMSO) foi iniciado em 1867 quando o qumico russo, Alexander Saytzeff descreveu a oxidao do dimetil sulfide, identificou o produto e descreveu algumas propriedades solventes extraordinrias do DMSO. Houve pouco interesse nas descobertas at 1950, quando essas propriedades foram exploradas em vrios processos industriais. Pesquisadores de indstrias descobriram que servia como solvente para vrios herbicidas, fungicidas, antibiticos e hormnios de plantas, nas quais aumentava a penetrao e a eficcia. Cientistas trabalharam com DMSO e relataram outras propriedades incomuns: penetrava rapidamente na pele sem

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causar danos; sua aplicao tpica em qualquer parte do corpo rapidamente resultava em distinta e agressiva halitose lembrando alho ou ostra, devido ao odor do metablito dimetil sufide. O DMSO capaz de carrear vrios solutos atravs da pele, sendo necessrio cuidado no manuseio e conhecer as solues ou compostos com potencial txico, tambm capaz auxiliar na cura de queimaduras lenta ou rapidamente e aliviar dor e edema de injrias. Essas observaes estimularam novas pesquisas com o DMSO para outras aplicaes mdicas e biolgicas. Robert Herschler da companhia de papel Crown Zellerbach, e Stanley Jacob da Universidade de Oregon Medical School, foram fortes proponentes para o incio dos estudos do DMSO como agente teraputico. O primeiro relato de investigao laboratorial do DMSO em sistemas orgnicos de mamferos foi publicado em 1959 (BRAYTON, 1986; ALI, 2001). Lovelock e Bishop mostraram que o DMSO superior ao glicerol para

criopreservao de espermatozides bovino e eritrcito humano e observaram que a soluo de DMSO era capaz de manter a motilidade espermtica por vrias horas em temperatura ambiente, o que sugeria baixa toxicidade celular (BRAYTON, 1986). O primeiro relato do DMSO como agente farmacolgico foi publicado em 1964 e a condio para investigao de novas drogas (IND) foi garantida pela Food and Drug Administration (FDA). Em novembro de 1965 a FDA terminou seus estudos clnicos sobre o DMSO, pois Rubin demonstrou que induzia as alteraes lenticulares em alguns animais de laboratrios. Em 1966, a mesma moderou o policiamento para permitir evoluo nas pesquisas para tratamento de condies srias como escleroderma, infeco persistente de Herpes Zoster e severa artite reumatide, para as quais no havia teraputica satisfatria. Em 1968, foi permitida sua utilizao tpica por at 14 dias de tratamento. Em 1970, a FDA aprovou a utilizao na veterinria em doenas musculares em cavalos e em 1972 foi aprovado para uso em ces. No ano de 1978, a FDA autorizou o uso da soluo de 50% de DMSO nos casos de cistite intersticial em humanos e em maio de 1980 estabeleceu regulamentos especficos nos testes clnicos do DMSO (BRAYTON, 1986; ALI, 2001).

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Reviso de Literatura

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A cinomose uma enfermidade infecto-contagiosa, causada por um RNA-vrus do gnero Morbillivirus, famlia Paramyxoviridae, ordem Mononegavirales. Possui trs formas de apresentao clnica: aguda, subaguda e crnica, com manifestaes gastroentricas, respiratrias e neurolgicas. So descritas trs formas de encefalite causada pelo vrus da cinomose: encefalite dos ces jovens, encefalite em ces adultos e encefalite do co velho (CORRA & CORRA, 1992). Os Morbillivirus receberam esse nome do diminutivo morbus, que significa praga, e historicamente, o termo foi utilizado para diferenciar o sarampo da varola e da escarlatina. Como um dos seis gneros da famlia Paramyxoviridae, os Morbillivirus so responsveis por vrias doenas graves em humanos e animais (RIMA & DUPREX, 2006).

1 Estrutura viral

O vrus da cinomose possui dimetro varivel (150-250 m) com genoma constitudo por uma fita simples de RNA contendo aproximadamente 15.690 nucleotdeos (VON MESSLING & CATTANEO, 2002). O genoma envolto por nucleocapsdeo helicoidal, que consiste na nucleoprotena (NP), associado protena matrix e ao complexo polimerase, incluindo as protenas P (fosfoprotena) e L (polimerase ou grande). A protena de membrana (M) est localizada na face interna do envelope e exibe as duas glicoprotenas, hemaglutinina (HA) e protena de fuso (F), que so responsveis pela fixao na membrana dos plasmcitos (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; MARTELLA et al., 2007).

A HA possui atividade de hemoaglutinao, sendo responsvel pela fixao do vrus na clula hospedeira e pelo tropismo celular, tambm reconhecida atualmente por possui mais variaes antignicas. A protena F proporciona a ligao entre a

membrana celular do hospedeiro e o envelope viral e a formao de sinccios (STERN et al., 1995; WILD et al., 1995; LAN et al., 2006). Essas glicoprotenas so derivadas da membrana da clula hospedeira na formao de novos vrions (HASS & BERRETT, 1996).

A protena matrix dos paramyxovirus ocupa um papel crucial nos processos de montagem e produo de novas partculas virais (BELLINI et al., 1986). As protenas P e L possuem a funo de transcrio e replicao viral (BARRETT, 1999), ao mesmo passo que a NP a principal reguladora da replicao viral e da transcrio, e

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consequentemente, a primeira protena exposta ao sistema imune que estimula a

produo de anticorpos nos primeiros estgios da infeco (LATHA et al., 2007). Imhoff et al. (2007), afirmam que o colesterol est envolvido na formao e manuteno de membranas celulares e consequentemente para a formao das protenas HA e F do envelope viral. Os autores demonstraram que a reduo do colesterol do envelope viral reduz a infectividade do vrus da cinomose, e quando este interage com clulas de menor teor de colesterol h diminuio na formao de sinccios.

2 Resistncia viral

O vrus sensvel ao ter e aos solventes lipdicos, instvel a pH menor que 4,5 e inativado pelo calor em uma hora a 55C e em 30 minutos a 60C. Em climas quentes no sobrevive nos canis aps os enfermos terem sido retirados, pois vivel apenas por uma hora a temperatura de 20C e por 20 minutos nos exsudatos. inativado com formol a 0,5% em quatro horas, com fenol a 0,75% em 10 minutos a 4C e com desinfetantes constitudos por amnia quartenria a 0,3% em 10 minutos (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

3 Tropismo viral

A molcula sinalizadora da ativao de linfcitos (SLAM) tem mostrado ser um receptor eficiente para as cepas selvagens, considerada um membro da superfamlia das imunoglobulinas, podendo controlar a induo de polissacardeos na produo de IL-12, fator de necrose tumoral (TNF) e xido ntrico pelos macrfagos. Estudos por imunohistoqumica demonstraram que a expresso da SLAM no SNC limitada quando comparada com tecidos linfides. Por isso, sugere-se que existam outros receptores para o vrus (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; YANAGI et al., 2006). Todos os Morbillivirus apresentam forte linfotroprismo relacionado ao receptor SLAM, o que sugere a penetrao do vrus no SNC atravs de clulas mononucleares de sangue perifrico (RUDD et al., 2006). Plattet et al. (2005) demonstraram que na ausncia do receptor SLAM, a protena HA tem um papel importante na fuso celular. Foi sugerido no referido estudo que a presena ou ausncia do receptor SLAM pode determinar a citlise ou a infeco persistente in vivo, porm ainda falta identificar o receptor do SNC ao vrus da cinomose em ces.

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No estudo realizado por Von Messling et al. (2006), a replicao da cepa selvagem do vrus da cinomose foi demonstrada em clulas epiteliais do trato respiratrio nos estgios tardios da infeco, sugerindo que o acometimento do epitlio pulmonar precedido pela proliferao nos rgos linfides. Foi sugerido por esses autores que o vrus inicialmente induz a expreso da SLAM em linfcitos e macrfagos encontrados nas tonsilas e, posteriormente, utiliza outro receptor ainda desconhecido para infectar clulas epiteliais.

O vrus da cinomose pantrpico, porm, existem diversas cepas, algumas mais neurotrpicas e virulentas que outras; sendo as mais patognicas, a Snyder Hill e R252, que so altamente neurotrpicas e imunossupressoras (CORRA & CORRA, 1992; MORO & VASCONCELOS, 1998; ALVES et al., 2006).

4 Epidemiologia

Enfermidade de ocorrncia mundial afeta animais das famlias Canidae, Mustelidae, Hyaenidae, Procyonidae, Ailuridae, Viverridae, Felidae, Ursidae, Phocidae, Tayassuidae, e Cercopithecidae. A patogenicidade da infeco pelo vrus da cinomose varia de acordo com a espcie e pode resultar em infeces inaparentes ou causar alta mortalidade. No entanto, o mais importante agente infeccioso que acomete a populao canina, devido alta morbidade e mortalidade (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; VAN MOLL et al., 1995; HEADLEY & GRAA, 2000; GEBARA et al., 2004; CHO & PARK, 2005). Todos os vrus isolados pertencem a um mesmo sorotipo. As vrias amostras isoladas produzem enfermidades com durao e sinais clnicos distintos: algumas causam enfermidade de mediana patogenicidade, enquanto outras causam enfermidade aguda, altamente mortal, com ou sem encefalite aguda, e outras, ainda, causam encefalite tardia, aps uma enfermidade branda, ou mesmo aps a recuperao da enfermidade aguda. H ainda aquelas que levam muito tempo para exteriorizar seus efeitos encefalitognicos, como o que ocorre na encefalite do co velho ou na hard pad disease (CORRA & CORRA, 1992). As estirpes Onderstepoort e Rockborn so as mais utilizadas em todo o mundo para a elaborao de vacinas contra o vrus da cinomose (MOCHIZUKI et al., 2002). A estirpe Snyder Hill, por apresentar grande potencial neurotrpico, a mais utilizada em experimentos de inoculao intracerebral,

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tanto em estudos da patognese viral quanto em desafio ps-vacinal (NEGRO et al., 2006 apud SLATER, 1970).

A encefalomielite considerada causa comum na morte de ces e aproximadamente 15% de todas as inflamaes do SNC so causadas pelo vrus da cinomose, sendo que essa porcentagem pode ser mais alta em regies endmicas (SAITO et al., 2005). Estudos realizados por Silva et al. (2007) confirmam que aproximadamente 12% dos ces necropsiados morreram devido s complicaes neurolgicas causadas pelo vrus da cinomose.

A cinomose pode ocorrer em qualquer poca do ano, mas no inverno h elevao na ocorrncia da enfermidade. O co representa o principal reservatrio para o vrus da cinomose e serve como fonte de infeco para animais selvagens. No h diferena de susceptibilidade da infeco entre machos e fmeas, no entanto, ces das raas dolicoceflicas so mais afetados que os braquioceflicos (CORRA & CORRA, 1992; GRANCHER et al., 2004; GREENE, 2006).

A idade de maior incidncia da cinomose nos ces coincide com a poca em que diminui a taxa de anticorpos maternos passivamente transmitidos, isto , entre 60 e 90 dias de idade, demonstrando a relao entre susceptibilidade e a idade, porm, o vrus da cinomose pode acometer animais de todas as idades (CORRA & CORRA, 1992; BIAZZONO et al., 2001; GEBARA et al., 2004).

Mais de 50% das infeces so subclnicas ou com sinais clnicos moderados (SILVA et al., 2007), ou seja, a taxa de infeco maior do que o nmero dos animais que manifestam a enfermidade, estimando-se em at 75% de ces suscetveis que eliminam o vrus sem qualquer sinal clnico da doena (CORRA & CORRA, 1992; GEBARA et al., 2004). Acima de 30% dos ces exibem sinais de envolvimento neurolgico durante ou aps a infeco sistmica pelo vrus da cinomose e a maior parte dos carnvoros selvagens que morrem pela doena possui evidncias de infeco no SNC (RUDD et al., 2006).

A transmisso ocorre principalmente por aerossis e gotculas que contm os vrus, atravs de secrees respiratrias, fezes e urina (CORRA & CORRA, 1992).

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5 Penetrao celular

O mecanismo de fuso de membrana caracterizado pela ao das glicoprotenas virais. A quebra e a ativao destas, em alguns Paramyxovirus e Ortomyxovirus, dependem de proteases tissulares especficas, que determinam o tropismo restringindo a fuso para tecidos selecionados. O processo de fuso comea com o contato do receptor celular com a protena HA, esta muda sua conformao transmitindo lateralmente um sinal para a protena F, que sofre quebra e ativao, expondo o peptdeo de fuso hidrofbico e inserindo-o na membrana plasmtica. O peptdeo reduz o espao entre a membrana e o envelope, promovendo a fuso (VON MESSLING et al., 2001; VON MESSLING et al., 2004b; YANAGI et al., 2006).

A entrada especfica do Morbillivirus em linfcitos o receptor universal SLAM, determinante da imunossupresso. O SLAM encontrado nas clulas T, timcitos imaturos, uma poro das clulas B, moncitos ativados e clulas dendrticas, permitindo a disseminao viral no sistema linfide (VON MESSLING et al., 2005).

6 Patogenia

Durante a exposio natural, o vrus da cinomose se propaga por gotas de aerossis e entra em contato com o epitlio do trato respiratrio superior. No perodo de 24 horas, as partculas virais se replicam nos macrfagos e se disseminam pela via linftica local, para as tonsilas e linfonodos bronqueais (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; MORO & VASCONCELOS, 1998; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006).

O estudo de imunohistoqumica realizado por Daimn et al. (2005), mostrou que o vrus se replica primeiro nos macrfagos alveolares, seguidamente nos pneumcitos do tipo II e epitlio respiratrio.

Com dois a quatro dias ps-infeco, o nmero de partculas virais aumenta nas tonsilas, linfonodos retrofarngeos e bronqueais, mas um nmero baixo de clulas mononucleares infectadas encontrado em outros rgos linfides. No perodo de quatro a seis dias ocorre a replicao viral no sistema linfide, medula ssea, timo, bao, linfonodos mesentricos, placas de Peyer, clulas estomacais, clulas de Kupffer e clulas mononucleares ao redor dos vasos pulmonares e bronqueais. A ampla proliferao viral nos rgos linfides induz um aumento inicial na temperatura

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corporal, entre o segundo e o sexto dia, ocorrendo leucopenia, causada por danos virais nas clulas linfides, afetando as clulas T e B (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; MORO & VASCONCELOS, 1998; GREENE, 2006).

A disseminao do vrus no epitlio e nos tecidos do SNC ocorre no perodo de oito a dez dias ps-infeco, por via hematgena ou pelo lquor dependendo da resposta imune humoral ou celular do animal (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; JONES et al., 2000; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006).

Nos ces com nveis intermedirios de resposta imune mediada por clulas e com ttulos de anticorpos que aparecem tardiamente aps nove a 14 dias, o vrus se dissemina pelos tecidos. Os sinais clnicos podem desaparecer com o aumento da titulao de anticorpos e o vrus eliminado da maioria dos tecidos, assim que os ttulos de anticorpos aumentam, mas podem persistir por longos perodos em tecidos uveais e neurnios e tegumentos, bem como nos coxins plantares. A recuperao da infeco est associada com a imunidade a longo prazo e interrupo da replicao viral. A proteo pode ser comprometida se o co for exposto a cepa altamente virulenta, dose infectante elevada e/ou sofrer imunossupresso (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

7 Patogenia da imunossupresso

Um quadro proeminente da infeco de ces gnobiticos com vrus da cinomose a linfopenia prolongada e depleo linfide sistmica. A infeco fatal pelo vrus da cinomose esta associada depleo sistmica de reas de linfcitos T e B. A infeco resulta em leucopenia devido linfopenia que se inicia uma semana aps a infeco (MORO & VASCONCELOS, 1998). Segundo Schobesberger et al. (2005) a queda significativa de linfcitos foi observada antes da viremia, trs dias ps-infeco.

A causa da linfopenia em animais infectados pelo vrus da cinomose ocorre provavelmente devido a habilidade do vrus em se replicar e destruir os tecidos linfides. A replicao viral causa extenso perodo de imunossupresso, durante o qual podem ocorrer infeces oportunistas que agravam o quadro clnico. Simultneamente ocorre a perda de resposta dos linfcitos aos agentes mitognicos. A infeco pelo vrus in vitro e in vivo reduz drasticamente a habilidade dos macrfagos e moncitos de

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produzir IL-1 e aumenta a sntese de prostaglandina E2 (PGE2). Sabe-se que a PGE2 um agente imunossupressor, com capacidade de inibir a produo de IL-2 e interferon gama (IFN-g) (MORO & VASCONCELOS, 1998).

Entretanto, nos relatos atuais foi observado que a cintica da infeco viral no est correlacionada com a da depleo de linfcitos e a morte celular. No perodo de trs a seis dias aps a infeco, h um aumento na apoptose, porm o vrus no detectvel. Esses efeitos podem ser mediados pela produo de citocinas inflamatrias, que afetam a homeostasia dos linfcitos (KUMAGAI et al., 2004; SCHOBESBERGER et al., 2005). J nos relatos de Kajita et al. (2006), foi descrito o mecanismo utilizado pela cepa Onderstepoort, capaz de induzir apoptose atravs da utilizao de mediador de apoptose de clulas de mamferos (caspase-3), o qual faz uma cascata com transmisso de sinais proteolticos. Baseado nos relatos de Schobesberger et al. (2005), a determinao do nmero de linfcitos tem um valor prognstico no desenvolvimento da doena.

Na cinomose aguda, as clulas Th1 e CD4+ representam o principal alvo para o vrus. A infeco ltica de CD4+ pode ter inmeras conseqncias, pois essa clula tem papel importante na induo e regulao da resposta imune. A depleo de clulas CD4+ associada atrofia de folculos secundrios pode ser relevante para imunossupresso (MORO & VASCONCELOS, 1998; KUMAGAI et al., 2004). Como conseqncia da infeco, a arquitetura do bao e linfonodos so parcialmente destrudas; observando-se drstica infeco nas placas de Peyer e tonsilas sugerindo comprometimento da resposta de anticorpos da mucosa (IgA), que protege contra patgenos que atravessam barreiras epiteliais (VON MESSLING et al., 2004b).

A imunossupresso e resposta imune anormal contribuem na susceptibilidade s infeces secundrias, que podem influenciar bastante na morbidade e mortalidade da doena (HASS & BARRETT, 1996; KAJITA et al., 2006).

8 Neuropatogenia

Alguns estudos sugerem que a infeco do SNC ocorre precocemente, na fase sistmica da doena. Neste caso, a cinomose progride da doena sistmica para neurolgica, aparentemente por falha do sistema imune na invaso viral no crebro e na medula espinhal (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995).

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Os sinais da cinomose quando acomete o SNC so polimrficos. O curso clnico e neuropatolgico da encefalomielite est relacionado com a variedade da cepa viral e a idade do animal afetado (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995).

Os resultados encontrados por Silva et al. (2007) permitiram concluir que a diferena entre o tipo de leso desenvolvida por filhotes e adultos pode ser tnue, e que embora possa haver maior freqncia de desmielinizao em filhotes deve-se levar em considerao que filhotes tambm desenvolvem leses mais crnicas, assim como ces adultos podem desenvolver leses mais agudas.

A difuso viral depende do grau de resposta imune sistmica do hospedeiro e a presena de anticorpos antivirais. Alm disso, a deposio de imunocomplexos pode facilitar a sua difuso no endotlio vascular do SNC. Livre ou associado s plaquetas ou linfcitos, o vrus penetra nas clulas endoteliais vasculares das meninges, nas clulas do plexo coride do quarto ventrculo e nas clulas ependimrias lineares do sistema ventricular (GREENE, 2006). A freqente ocorrncia de leses periventriculares e subpiais, e o fato do vrus ser encontrado facilmente nas clulas do plexo coride e do epndima, sugerem que penetre nos tecidos cerebrais atravs do lquor. Neste, o agente pode ser encontrado em clulas monucleares fundidas com clulas ependimrias (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995).

A infeco do epitlio do plexo coride tem mostrado ser produtiva atravs de todo o curso de infeco com o vrus continuamente sendo produzido. A propagao do vrus atravs das vias do SNC, provavelmente explica a precoce distribuio de leses em reas subependimrias, tais como o crtex cerebral, trato ptico e nervos, velo medular rostral, pednculos cerebelares e medula espinhal (GREENE, 2006).

No entanto, nos estudos de Rudd et al. (2006) foram encontradas evidncias de que o vrus penetra atravs do bulbo olfatrio e se dissemina pela rota olfatria at o SNC, nos casos de infeco por via aergena, diferente do que foi proposto anteriormente.

Quando uma efetiva resposta imune antiviral neutralizante ausente na fase aguda da cinomose, anticorpos IgM anti-vrus da cinomose aparecem nas duas primeiras semanas da infeco. Apesar da ausncia de manguitos perivasculares, numerosas clulas CD8+ so encontradas nas leses agudas desmielinizantes e tambm distribudas difusamente no parnquima cerebral, correlacionado de forma desigual com reas de infeco viral. No lquor destes animais altos ttulos de IL-8 foram

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encontrados, isto sugere que a ativao inicial das clulas da micrglia serve como uma alavanca para a invaso de clulas T no SNC (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

A IL-1 importante na patognese de todos os tipos de leses neurolgicas causadas pelo vrus da cinomose. responsvel por estimular a proliferao de astrcitos, que pode significar o incio das leses, como as encontradas na cinomose no inflamatria subaguda, que evidenciam frequentemente astrogliose reativa. Encontrada principalmente nos espaos perivasculares da inflamao subaguda e nas leses crnicas, a IL-1 age de forma importante na propagao da doena (GRNE et al., 2000).

A encefalite aguda, que ocorre inicialmente no curso da infeco em animais jovens ou imunossuprimidos, caracterizada por injria viral direta (SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). O vrus causa leso multifocal nas substncias cinzenta e branca. Leses na substncia cinzenta so resultados de infeco neuronal e necrose, e podem levar a uma poliencefalomalcea predominante. Leses na substncia branca so caracterizadas por danos mielnicos e esto associados com replicao viral nas clulas da glia. Mudanas inflamatrias so mnimas devido imunodeficincia resultante de imaturidade fisiolgica do sistema imune e/ou decorrente da imunossupresso viral induzida (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006).

Durante a fase inicial da encefalite a expresso do RNA mensageiro (mRNA) e da protena viral so altas nas reas afetadas e uma possvel conseqncia o aumento da produo do Fator de Necrose Tumoral (TNF) pelos astrcitos. A sua importncia na progresso das leses cerebrais tambm sustentada pela abundncia do vrus na forma imunorreativa presente nas leses no inflamatrias, que se caracterizam pela

desmielinizao. O TNF tem sido evidenciado como causa da destruio de oligodendrcitos e perda de mielina (GRNE et al., 2000).

A encefalite multifocal em ces adultos acomete frequentemente animais entre quatro e seis anos, com curso crnico. Esta enfermidade no precedida nem coincidente com os sinais sistmicos que so vistos nos ces jovens (CORRA & CORRA, 1992). O antgeno do vrus fica restrito a poucos astrcitos e a expresso do MHC proeminente em todas as clulas da micrglia, sendo responsvel pela desmielinizao contnua e disseminada infiltrao mononuclear perivascular. As alteraes iniciam com hiperplasia dos astrcitos e proliferao microglial em estruturas

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subpiais e subependimrias na substncia branca. Esta forma tambm est associada com a concentrao alta de anticorpos antimielnicos, podendo ser uma reao secundria ao processo inflamatrio. Anticorpos contra o vrus interagem com macrfagos infectados em leses no SNC, causando sua ativao com liberao de radicais livres de oxignio, do tipo superxido. Esta atividade por sua vez pode levar destruio de oligodendrcitos e bainha de mielina (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006; STEIN et al., 2006).

Os estudos de Brge et al. (1989) demonstraram que os anticorpos antivirais estimulam a produo de radicais livres de oxignio (ROS) em culturas cerebrais de ces infectadas com o vrus da cinomose. O mecanismo de produo de ROS depende da expresso do antgeno viral na superfcie de clulas infectadas marcadas com receptores Fc (receptor de anticorpos de alta afinidade) nos macrfagos. Os ROS fazem degradao de fosfolipdios na parte cortical do crebro, destruindo protenas da bainha de mielina e interferindo na produo da mesma.

Nesta fase da doena, nos infiltrados perivasculares encontramos CD8+, CD4+ e linfcitos B, e citocinas pro-inflamatrias, IL-1, IL-6 e IL-12, indicando uma resposta imune-mediada (WNSCHMANN et al., 1999; MARKUS et al., 2002).

A produo de TNF e tambm de IL-1 e IL-6 pelas clulas locais importante na induo de molculas de adeso endotelial, como pr-requisito para a migrao de clulas inflamatrias para o SNC e a progresso das leses no estgio crnico, caracterizado por inflamao severa. Alm disso, a produo de TNF por clulas inflamatrias no responsvel apenas pelo processo de desmielinizao pela destruio direta de oligodendrcitos resultando na perda de mielina, mas pode levar ao recrutamento de mais leuccitos (GRNE et al., 2000).

Os estudos realizados por Vandevelde & Zurbriggen (1995) mostraram que o vrus persiste em reas na camada branca fora das leses inflamatrias desmielinizantes. Isto acontece no desenvolvimento progressivo da doena crnica se a resposta imune for mais lenta do que a replicao viral. A persistncia viral a chave para a patognese das leses crnicas (ZURBRIGGEN et al., 1995a; ZURBRIGGEN et al., 1995b; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

possvel que o vrus reduza sua expresso nestas reas do SNC, em analogia a panencefalite subaguda esclerosante em humanos. A persistncia est associada com a diminuio da regulao dos genes que codificam protenas de membrana e superfcie, diminuindo, desta forma, a sua expresso na superfcie celular. Estas clulas

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persistentemente infectadas podem continuar a sobreviver, pois a infeco restrita e a difuso viral no provoca lise celular (ZURBRIGGEN et al., 1995a; ZURBRIGGEN et al., 1995b; MEERTENS et al., 2003; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

No estudo ultra-estrutural de Meertens et al. (2003), foram encontrados relativamente pequenos indcios do vrus nas clulas persistentemente infectadas, mesmo que o nucleocpsdeo seja encontrado em grandes quantidades e as glicoprotenas expostas. O autor demonstra a diferena entre as cepas Onderstepoort e A75/17 com relao persistncia viral. A cepa A75/17 foi capaz de diminuir a expresso de suas protenas de superfcie (H e F) em relao Onderstepoort, com isso, pode-se observar caractersticas distintas entre as cepas virais com relao a persistncia viral.

Foi sugerido que a infeco de astrcitos pelo vrus da cinomose no inicia uma reao inflamatria, ocorre por uma ao viral em limitar o seu desenvolvimento, diminuir a destruio celular, no liberar protenas virais e debris celulares no meio extracelular. A persistncia do vrus nos casos de cinomose favorecida pela estratgia do mesmo, que se dissemina com impedimento ou retardamento da sua deteco pelo sistema imune, de maneira similar ao que props Oldstone e Rall para outros sistemas virais (ZURBRIGGEN et al., 1995a; ZURBRIGGEN et al., 1995b; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

8.1 Encefalite do Co Velho ou Old Dog Encephalitis

A encefalite do co velho comumente observada em ces com mais de seis anos e se caracteriza por ser principalmente uma panencefalite. uma forma rara, crnica, de carter inflamatrio progressivo na camada cinzenta dos hemisfrios cerebrais e do tronco enceflico, resultante da persistncia viral nos neurnios aps infeco aguda pelo vrus da cinomose. Esta enfermidade acomete animais que so imunocompetentes e que apresentam a persistncia viral no SNC, com leses restritas e caracterizadas por infiltrao perivascular disseminada com linfcitos e plasmcitos, proliferao difusa da micrglia, astrogliose, degenerao neuronal e neuronofagia. Estas leses esto em todo crtex cerebral e tambm no ncleo basal, tlamo e hipotlamo. A resposta imune dominada por infiltrado de clulas T e aumento da regulao do MHC classe II (CORRA & CORRA, 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). Geralmente o cerebelo no acometido nesta forma (CORRA & CORRA, 1992).

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8.2 Desmielinizao

O incio das leses desmielinizantes ocorre aproximadamente trs semanas ps-infeco e durante o perodo de intensa imunossupresso e ausncia de inflamao. A desmielinizao coincide com a replicao viral nas clulas da glia, com predileo por algumas regies como cerebelo, sistema ptico e medula espinhal (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

O sistema matrix metaloproteases (MMP) est envolvido na patognese da desmielinizao, por abrir a barreira hemato-enceflica pela quebra de componentes da membrana basal, favorecendo a migrao de clulas inflamatrias para o interior do SNC, desencadeando a liberao de TNF-, que desintegra a bainha de mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE, 2004).

A reconstituio da matrix extracelular ocorre sob o controle do fator de crescimento por equilibrar a secreo de MMP e seus inibidores tissulares (TIMP). Ento, um desbalano entre MMP e TIMP resulta em incio e progresso das leses. Uma reduo de TIMP nas leses crnicas com aumento do nvel de expresso de MMP favorece a hiptese para a progresso das leses na encefalite desmielinizante da cinomose (MIAO et al., 2003).

No estudo realizado por Khuth et al. (2001) foi possvel observar a expresso de MMP e TIMP, que esto com a regulao aumentada em locais especficos, ocorrendo principalmente na regio rostral do crebro, crtex, hipocampo e hipotlamo. Concomitantemente h um aumento da regulao ou induo de citocinas pro-inflamtrias, havendo uma relao entre a replicao viral no SNC, a produo citocinas inflamatrias e essa a quantidade de MMP e TIMP. Sugere-se que a induo de citocinas inflamatrias causada pela replicao viral, sendo responsveis pela regulao de MMP e TIMP.

O exato mecanismo do incio das leses da mielina no estgio agudo imunossupressor da cinomose ainda est incerto (STEIN et al., 2004; VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Segundo Grne et al. (2000), as reas com desmielinizao recente e sem inflamao so consideradas uma conseqncia da replicao viral no interior de oligodentrcitos levando a destruio celular e a perda de

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habilidade para manter a bainha de mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

A explicao bvia segundo Vandevelde & Zurbriggen (1995) para o fenmeno de desmielinizao a infeco de oligodendrcitos, que so clulas produtoras de mielina. Porm, em estudos de microscroscopia ptica, observaram que a maioria das clulas infectadas so astrcitos. Estudos realizados em microscpios eletrnicos revelaram que a infeco de oligodentrcitos rara na cinomose. Concluram em seus estudos que o vrus causa uma infeco discreta nos oligodentrcitos, que mesmo assim pode ser responsvel pelo fenmeno de desmielinizao.

Estudo ultra-estrutural revelou microvacuolizao e perda de organelas por degenerao de oligodentrcitos. As mudanas morfolgicas so precedidas por disfunes metablicas nestas clulas, com a diminuio drstica da atividade da cerebrosdeo sulfo-transferase (uma enzima especfica de oligodentrcitos) aps infeco do vrus. possvel que a transcrio do vrus interfira nas funes especializadas destas clulas, que so necessrias para manuteno das membranas mielnicas (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

Nos achados de Stein et al. (2004), o vrus induziu a ativao das clulas da micrglia, que podem ter um importante impacto na patognese de desmielinizao aguda da cinomose, devido a um difuso aumento da regulao do MHC na camada branca. A ativao destas clulas libera fatores txicos que podem induzir a destruio da mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; STEIN et al., 2006).

A formao de radicais livres de oxignio (ROS) pela micrglia pode alterar a transmisso sinptica e destruir diretamente os neurnios. Esta formao de ROS pode ser considerada responsvel pela atividade convulsiva em alguns animais (STEIN et al., 2006).

A desmielinizao crnica coincide com a recuperao do sistema imune, seis a sete semanas ps-infeco, manguitos perivasculares linfocitrios, plasmcitos e

moncitos ocorrem inicialmente nas leses induzidas pelo vrus no crebro. A reao inflamatria nas leses desmielinizantes pode levar a progresso da destruio do tecido. Citocinas pro-inflamatrias esto aumentadas, mas as citocinas antinflamatrias permanecem em nveis normais. possvel que astrcitos, o primeiro alvo do vrus,

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participem da amplificao desta resposta imune (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

Leses crnicas desmielinizantes so caracterizadas pela reduo ou possvel perda das protenas virais, com aumento da regulao do MHC e infiltrao massiva de CD8+, CD4+ e clulas B (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE, 2004).

O estgio crnico da doena est caracterizado por complicaes imunolgicas. A inflamao est associada com a sntese de anticorpos citotxicos-dependentes, que podem induzir a desmielinizao por ao dos anticorpos anti-mielina. Vandevelde & Zurbriggen (1995) concluram que as reaes auto-imunes na cinomose so provavelmente um epifenmeno e que no so primrias neste processo de desmielinizao (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE, 2004).

O experimento realizado por Krakowka et al. (1973) descreve a presena de anticorpos anti-mielina no soro de ces infectados apresentando encefalomielite desmielinizante. Baixos nveis de anticorpos (

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destri culturas de oligodentrcitos, que so ricos em compostos ferrosos (VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

Existem algumas evidncias experimentais que o vrus induz alteraes nas funes de macrfagos. A produo de IL-1 por macrfagos in vitro pode diminuir e de prostaglandina E aumentar como resultado de infeco viral. A fagocitose, dependente ou independente de receptores Fc, assim como a habilidade de liberar ROS e a atividade procoagulante dos macrfagos tambm alterada aps a infeco. Considerando a relao entre o sistema de coagulao e funes inflamatrias, essas observaes mostram que a infeco pelo vrus da cinomose pode desencadear um potencial destrutivo dos macrfagos e providenciar, alm disso, suporte para a hiptese que a desmielinizao espectadora ocorra na cinomose crnica (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995).

9 Sinais Clnicos

Os ces clinicamente acometidos encontram com as seguintes caractersticas: falta de vacinao ou doses incompletas, vacinas inapropriadas, colostro da me com ttulos inadequados de anticorpos, imunossupresso e histria de exposio a ces infectados (GREENE, 2006).

Podero ocorrer sinais clnicos digestivos, respiratrios, ou neurolgicos, isoladamente, conjuntamente ou alternadamente. s vezes surgem sinais neurolgicos diretamente, o que no comum (CORRA & CORRA, 1992).

Aps perodo de incubao de seis dias ou mais, surge a primeira fase clnica da doena, que corresponde ao pico febril e localizao nos rgos linfides, onde ocorre hipertermia at 41C, anorexia, congesto conjuntival discreta e corrimento seroso ocular e nasal, sendo que geralmente esta fase passa despercebida ao proprietrio. Seguem-se dois a trs dias, onde tudo parece voltar ao normal, mas se houver progresso do vrus por falta de anticorpos, haver disseminao para as clulas epiteliais e ocorrendo o segundo pico febril com sintomas caractersticos (CORRA & CORRA, 1992).

Os sinais no sistema respiratrio so: rinite, conjuntivite, descarga nasocular serosa e mucopurulenta, pneumonia intersticial no incio e posterior evoluo para

broncopneumonia devido infeco secundria, caracterizada por tosse estridente,

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mida e produtiva, alm de crepitaes na auscultao (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

No sistema gastrointestinal h ocorrncia de vmitos intermitentes, anorexia, diarria pastosa a lquida, escura, com ou sem presena de sangue, ocorrendo desidratao em poucos animais (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

Os sinais neurolgicos so mltiplos e conseqentes da replicao viral em neurnios e clulas gliais, refletindo desta forma, a distribuio do vrus e as conseqentes leses no SNC. Estes podem apresentar-se tardiamente, semanas, meses ou anos aps a recuperao de infeces inaparentes, ou da cinomose aguda (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006), porm, esta apresentao tardia rara com intervalos de meses ou anos.

Hiperestesia e rigidez cervical e para-espinhal podem ser encontrados em ces como resultado de inflamao das meninges, entretanto, sinais de leses enceflicas so predominantes em relao aos sinais meningeais (GREENE, 2006).

Quando h acometimento da medula espinhal sinais como paresia e incordenao de membros so os nicos achados neurolgicos. Outros sinais comuns incluem a doena vestibular com movimento de cabea, nistagmo, dficits em outros nervos cranianos e da propriocepo; e na doena cerebelar encontraramos ataxia com hipermetria e cabea pendente. Cegueira uni ou bilateral, s vezes com midrase, ocorrem devido o freqente envolvimento do trato e nervo pticos. Atrofia muscular generalizada rara como apresentao clnica de leso focal no crtex (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

Podem ocorrer convulses parciais ou generalizadas, porm, a convulso do tipo goma de mascar, classicamente associada com a infeco pelo vrus da cinomose, frequentemente ocorre em ces que desenvolvem poliencefalomalcea nos lobos temporais (GREENE, 2006).

Outros sinais neurolgicos incluem: apatia, estupor, alteraes de comportamento, reflexos espinhais anormais, hiperestesia, mioclonias e incontinncia

urinria (MORO et al., 2003). As mioclonias ou contraes tnico-clnicas so sinais comuns da cinomose e

podem estar presentes quando no h outros sinais neurolgicos. Acometem um nico msculo ou grupo de msculos, como auriculares, temporais, reto-abdominal, flexores dos membros (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). O mecanismo neural para as mioclonias se origina com

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irritao local de neurnios motores da medula espinhal ou do ncleo do nervo craniano. considerado um sinal patognomnico da cinomose, porm tambm pode ser observada em outras doenas inflamatrias do sistema nervoso dos ces (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

Silva et al. (2007) demonstram que a mioclonia foi o sinal neurolgico mais prevalente com 38,4% dos ces afetados. Segundo estes autores, a cinomose sempre deve ser considerada a primeira opo no estabelecimento dos diagnsticos diferenciais frente a um co com mioclonia.

Na encefalite do co velho, o sinal neurolgico mais comum a diminuio visual. uma enfermidade progressiva e acompanhada pelo desenvolvimento de depresso mental, andar compulsivo em crculos, mioclonias, hipercinesia e obstinada vontade de querer manter a cabea pressionada contra paredes ou objetos. O animal afetado pode manifestar uma mudana de personalidade e falha em reconhecer pessoas, objetos e outros animais (CORRA & CORRA, 1992; SUMMERS et al., 1995; VITE, 2005).

10 Enfermidades relacionadas com o vrus da cinomose

Silva et al. (2007) demonstraram que a toxoplasmose a enfermidade mais freqentemente associada cinomose, no entanto, dos 620 casos estudados apenas cinco apresentaram a co-infeco e em apenas um animal foi observado leses no encfalo. Poucos estudos mencionam a presena do antgeno do vrus da cinomose ou do RNA viral na medula ssea e suas leses em ces infectados. Contudo, o RNA do vrus da cinomose tem sido demonstrado na doena de Paget em tecidos da medula em humanos. Em ces, observa-se uma osteoesclerose metafsica em 42% dos ces infectados com o vrus. Esta leso foi encontrada em metfises de mero, rdio, ulna, fmur, tbia e fbula, com aumento da densidade medular. As leses podem variar de moderada a severa e pode ser encontrada em animais com sintomatologia sistmica ou neurolgica (BAUMGRTNER et al., 1995). Em ces experimentalmente infectados, as alteraes foram detectadas com oito dias aps a infeco e se caracterizam por necrose de osteoclastos. Entre 23 e 32 dias aps a infeco, necrose e atrofia de osteoblastos e de clulas da medula ssea esto presentes. As clulas da medula, osteoclastos e osteoblastos sofrem uma reduo moderada a severa, principalmente nas metfises. A tcnica de imuno-histoqumica

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demonstra a presena do antgeno viral no citoplasma e ncleo de clulas mielides, osteoblastos, osteoclastos e, ocasionalmente, em ostecitos. No so encontradas leses em animais velhos e no h indcios de persistncia viral nos tecidos da medula ssea ou alteraes permanentes na membrana (BAUMGRTNER et al., 1995).

11 Patologia Clnica

Sabe-se que a resposta hematolgica varia de um indivduo para outro, bem como a fase da infeco viral (SILVA et al., 2005).

A anemia pode ser atribuda ao aumento da destruio dos eritrcitos ou pela diminuio de sua produo. A destruio determinada pela presena do vrus no eritrcito ou pela deposio de imunocomplexos na membrana destas clulas. A queda da produo pode ser atribuda falncia da medula ssea devido ao estresse desencadeado pela doena. Na maioria dos casos, os eritrcitos apresentam-se normocticos e normocrmicos e no h sinais de regenerao medular, como hemcias nucleadas, policromasia, anisocitose ou corpsculos de Howell-Jolly (SILVA et al., 2005).

Os achados hematolgicos freqentes so linfopenia, s vezes combinado com leucopenia ou leucocitose, anemia, monocitose e raramente trombocitopenia (TIPOLD et al., 1992). O leucograma a caracterstica mais varivel e as infeces bacterianas oportunistas no trato digestivo e respiratrio podem ser observadas, justificando a leucocitose por neutrofilia e o desvio a esquerda (SILVA et al., 2005).

A linfopenia uma caracterstica consistente, mas pode estar ausente em alguns casos. Em estudos, Silva et al. (2005) obervaram que ces jovens infectados experimentalmente com o vrus da cinomose desenvolveram marcada linfopenia, achado freqente e relevante no experimento.

Segundo Corra & Corra (1992) a linfopenia absoluta causada pela depleo dos tecidos linfides e depende da cepa viral ser mais ou menos imunossupressora e ocorre, principalmente, em ces jovens que desenvolvem rapidamente a enfermidade sistmica ou sinais neurolgicos precoces.

Nas observaes encontradas por Silva et al. (2005), a trombocitopenia um achado freqente. Os autores sugerem que na infeco por Morbillivirus ocorre aumento de anticorpos anti-plaquetas e a trombocitopenia imunomediada com remoo das plaquetas pelo sistema reticulo endotelial.

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As incluses citoplasmticas denominadas corpsculo de Lentz ou Sinigaglia-Lentz, que aparecem em algumas clulas do sangue, em pequeno nmero nos linfcitos, neutrfilos e hemcias, possuem particular relevncia no diagnstico clnico da cinomose. A ocorrncia dessas incluses em leuccitos evidencia a presena do vrus, mas quando no encontradas possuem pouco valor na determinao da ausncia do vrus, j que so observadas somente na fase virmica da doena (CORRA & CORRA, 1992; JONES et al., 2000).

No exame bioqumico os achados no so especficos para a infeco, porm, pode ocorrer hipoalbuminemia ou hiperglobulinemia. Evidente hipoglobulinemia encontrada em filhotes infectados antes de nascer ou neonatos com imunossupresso persistente causada pelo vrus (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

Segundo Silva et al. (2005), leses no epitlio intestinal causadas pelo vrus, com conseqente diarria, alm da prpria apatia determinada pela doena levam o animal a recusar o alimento. Desta forma, a diminuio da ingesto protica bem como o comprometimento intestinal so fatores determinantes na reduo dos nveis sricos da albumina na cinomose. A elevao plasmtica das globulinas freqente em vrias reaes inflamatrias e, em particular, o componente alfa 2 aumenta significativamente

nas infeces bacterianas e vricas, notadamente na cinomose. O lquido cefalorraquidiano (LCR) um fluido aquoso e incolor que ocupa o

espao subaracnide, os ventrculos cerebrais e o canal central da medula. Possui funes de proteo do sistema nervoso contra agentes infecciosos, permitindo a distribuio de elementos de defesa como leuccitos e anticorpos, e auxilia na troca de metablitos entre o sangue e o crebro (FEITOSA et al., 1997a; GAMA et al., 2005).

A anlise do LCR um dos melhores mtodos de diagnstico das afeces do encfalo e da medula espinhal. O exame do LCR est indicado em todo paciente com doena neurolgica, na qual no h diagnstico bvio, incluindo casos com suspeita de afeco intracraniana (PELLEGRINO et al., 2003).

Segundo Gama et al. (2005), as caractersticas fsico-qumicas do lquor tais como, colorao, aspecto, densidade, pH e glicose, no foram capazes de contribuir para indicar qualquer anormalidade liqurica nas diferentes fases da cinomose. Por outro lado, o componente protico e a celularidade liqurica mostraram alteraes importantes na presena de sinais neurolgicos, porm na ausncia destes, no adicionam informaes capazes de levar a deteco precoce de leses do SNC em colaborao ao diagnstico da referida enfermidade.

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A turbidez no lquor ocorre geralmente devido a um aumento na celularidade da amostra, com presena de 500 ou mais clulas/L. No entanto, como demonstrado no estudo de Feitosa et al. (1997b) a turbidez no pode ser creditada exclusivamente a esse aumento do nmero de clulas, j que algumas amostras de lquor lmpido apresentavam 380 leuccitos/L, enquanto outras, uma discreta turbidez com 400 leuccitos/L. Desta forma, afirmaram que o aspecto do lquor no um bom indicativo da sua normalidade.

Feitosa et al. (1997a) constataram diferenas estatsticas significantes entre os nveis de CPK no lquor de ces saudveis e com cinomose. Segundo a literatura existente, leses no tecido nervoso podem levar a um aumento na concentrao liqurica de CPK, alm disso, a degenerao da bainha de mielina tambm pode ser responsvel por essa elevao. Foi observada correlao positiva entre os nveis de CPK no lquor e no soro, que pode estar relacionada com casos de convulses, quando ocorre aumento da atividade da CPK srica devido aos movimentos musculares intensos e pela liberao das enzimas contidas nos msculos esquelticos. No entanto, nem todos os animais manifestam episdios convulsivos, sugerindo que este aumento no se deva somente ocorrncia de movimentos musculares intensos, mas tambm a um decbito prolongado, decorrente de paresia de membros manifestada em muitos animais.

Durante o estgio de desmielinizao aguda no ocorrem reaes inflamatrias, e consequentemente, as protenas e as clulas do lquor podem estar normais (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

No estgio crnico com a inflamao, ocorre aumento de protena (acima de 25 mg/dL), principalmente representado por IgG antivrus e aumento de clulas (mais que 10/l) com predomnio de linfcitos (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006).

O aumento dos anticorpos anti-vrus no lquor oferece evidncia da encefalite pela cinomose, pois estes anticorpos so produzidos no local, e o aumento no encontrado em animais vacinados ou na cinomose sistmica sem alteraes neurolgicas (GREENE, 2006).

12 Achados antomo-patolgicos

No sistema respiratrio, pode ser detectado um exsudato purulento ou catarral nas mucosas nasal e da faringe. Nas seces microscpicas, com freqncia so

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observados corpsculos de incluso citoplasmticos e intranucleares nas clulas associadas ao exsudato (JONES, et al., 2000).

No pulmo, as leses podem se manifestar por broncopneumonia purulenta onde brnquios e alvolos adjacentes apresentam-se repletos de neutrfilos, mucina, e debris teciduais. No primeiro estgio o exsudato pode conter sangue, neutrfilos e clulas mononucleares que revestem as paredes alveolares constituindo a nica evidncia da infeco. Em alguns casos formam clulas gigantes multinucleadas no revestimento brnquico, nos septos alveolares e livremente nos alvolos. So encontradas incluses citoplasmticas e, menos freqentemente, intranucleares nessas clulas gigantes, em

clulas mononucleares e nas clulas epiteliais dos brnquios e bronquolos (JONES, et al., 2000). Segundo Damin et a. (2005), as leses no pulmo so caracterizadas por bronquiolite necrotizante, necrose em pneumcitos do tipo II, pneumonia intersticial e broncopenumonia supurativa. Entretanto, o vrus causa imunossupresso, permitindo a associao com outros vrus e com as bactrias, Bordetella bronchiseptica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella pneumonae e Escherichia coli.

Na pele, particularmente no abdomen, pode ocorrer dermatite vesicular e pustular. As vesculas e pstulas esto confinadas camada de Malpighi da epiderme, mas comum alguma congesto da derme subjacente, e ocasionalmente ocorre infiltrao por linfcitos. Corpsculos de incluso nucleares ou citoplasmticos podem estar presentes no interior das clulas epiteliais, especialmente as das glndulas sebceas. Nos coxins plantares, a intensa proliferao da camada de queratina da epiderme resulta numa leso clinicamente identificvel e caracterstica (JONES, et al., 2000).

O epitlio do trato urinrio, particularmente da pelve renal e bexiga, pode conter vasos congestos e corpsculos de incluso citoplasmticos ou intranucleares (JONES, et al., 2000).

O estmago e intestinos podem conter grande nmero de incluses citoplasmticas e intranucleares no epitlio de revestimento. No intestino grosso, h excesso de exsudato mucoso, podendo demonstrar congesto e infiltrao de linfcitos na lmina prpria (JONES, et al., 2000).

Em alguns casos, corpsculos de incluso podem ser observados no epitlio da conjuntiva (JONES, et al., 2000).

A cinomose no causa leses significativas no fgado, embora incluses possam estar presentes no epitlio biliar (JONES, et al., 2000).

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No SNC as leses podem ser detectadas somente por meios de estudos microscpicos. A substncia branca subcortical do crebro habitualmente poupada e as leses caracterizam-se por reas de destruio com ntida delimitao, particularmente nos tratos mielinizados. Grande nmero de micrglia, astrcitos e linfcitos so encontrados nos espaos de Virchow-Robin em torno dos vasos e esto associados ao aspecto esponjoso da camada branca. Ocasionalmente, clulas gitter esto reunidas em torno de reas de necrose na substncia branca. Estas grandes clulas fagocitrias so originadas da micrglia e possuem citoplasma distendido com grnulos de lipdios, caractersticas de algumas leses cerebrais. Incluses intranucleares no interior dos astrcitos multinucleados e micrglias constituem um achado caracterstico dessa leso. possvel observar incluses intranucleares no interior de astrcitos multinucleados e de micrglias, constituindo um achado caracterstico. No entanto, raramente podem ser detectados nos neurnios corpsculos de incluso citoplasmticos ou nucleares (SUMMERS et al., 1995; JONES et al., 2000).

No crebro, a leso um tanto parecida, mas a caracterstica microscpica mais notvel o aparente aumento de capilares. Esse aspecto pode ser resultante da proliferao de capilares, ou mais provavelmente, da distenso e congesto de vasos sangneos e da perda do parnquima circundante,