Ciclo di Calvin

The Calvin “Lollipop” for exposing algae to 14CO2

Esperimenti di marcatura (pulse and chase) hanno messo in evidenza che il primo composto dove viene incorporata la CO2 radioattiva è un C3 (il 3-PGA, acido 3-fosfoglicerico)

Come inizia la fotosintesi?

La marcatura si sposta molto velocemente su diversi altri composti (la vita media è bassa) problemi di rifornimento

Il ciclo di Calvin è suddiviso in tre fasi:

RuBP + CO2 2 x 3-PGA

Ribulose 1,5-bisphosphate(RuBP)

O H

H2C

CH

C

C

O HH

H2C O P O 32-

O P O 32-

O

O H

H2C

CH

COO

O P O32

3-phospho- glycerate

Rubisco

C5 + C1 = 2 x C3

Carbossilazione/Riduzione

Fase di riduzione

O H

H2C

CH

COO

O P O32

O H

H2C

CH

COP O 3

2 O

O P O32

O H

H2C

CH

C H O

O P O32

ATP ADP NADPH NADP+

Pi

1,3-bisphospho - glycerate

3-phospho - glycerate

glyceraldehyde- 3-phosphate

Phosphoglycerate kinase

Glyceraldehyde 3 -phosphate dehydrogenase

ATP e NADPH sono prodotti nella fase luminosa

Il carbonio carbossilico è ridotto a carbonile (aldeide)

Rigenerazione

2 GAP diventano F1,6P e poi F6P

Rigenerazione (2)

F6P + GAP = Xilulosio5P + Eritrosio5P

Eritrosio5P + GAP = Sedoeptulosio1,7BP

Rigenerazione (3)

Sedoeptulosio7P + GAP = R5P + Xylulosio5P

Bilancio del ciclo

Per ogni CO2 vengono prodotte due molecole di 3-PGA– 2 x ATP– 2 x NADPH

• 2 elettroni per NADPH• 2 fotoni per elettrone• 2x2x2 = teoricamente 8 fotoni per CO2 (se ATP è prodotto

in quantità sufficiente)

• 1 ATP aggiuntivo per ogni CO2 richiesto nella reazione della Fosforibulokinasi

3 CO2 + 9 ATP + 6 NADPH + 6 H+ + 8 H2O C3H6O3-P + 9 ADP + 8 Pi + 6 NADP+ + 3 H2O + 3 O2

Bilancio energetico per 1 Glucosio-P

I prodotti della fase luminosa quanta energia possiedono?–18 x ATP e 12 x NADPHCorrispondono a quanti Joule? In totale: 3126 kJ/mol18 x 29 kJ/mol 12 x 217 kJ/mol

Quanta energia in 8 moli di fotoni di luce rossa (x 6 CO2)? 6 x 8 x 175 kJ/mol = 8400 kJ

6 CO2 + 18 ATP + 12 NADPH + 12 H+ C6H12O6-P + 18 ADP + 17 Pi + 12 NADP+ + 6 H2O

Quanta energia deriva dalla combustione di una mole di esoso?2804 kJ (ed è la quantità minima richiesta per sintetizzarla)

Efficienza

Energia ricavata / energia investita

3126 / 8400 = 33 % Efficienza della fotosintesi

2804 / 3126 = 83 % Efficienza del Calvin

Tappa Enzima ΔG°’ (kJ/mol) ΔG (kJ/mol)

1 Fosforibulo kinasi (PRK) -21.8 -15.9

2 RuBisCO -35.1 -41.0

3+4 PGlyKinasi + GAP-DH +18 -6.7

5 TriosoP isomerasi -7.5 -0.8

6 Aldolasi -21.8 -1.7

7 Fruttosio BPasi -14.2 -27.2

8 Transketolasi +6.3 -3.8

9 Aldolasi -23.4 -0.8

10 Sedoeptuloso BPasi -14.2 -29.7

11 Transketolasi +0.4 -5.9

12 PentosoP isomerasi +0.8 -0.4

13 RibosioP isomerasi +2.1 -0.4

**

**

****

La termodinamica del ciclo di Calvin

Alcune reazioni mostrano un differenza in energia libera molto grande e negativa e saranno spostate decisamente verso i prodotti

Secondo la biochimica classica queste sarebbero le reazioni che regolano il flusso

Rubisco ID card

• Enzima composto da 8 subunità grandi e 8 subunità piccole (L8S8)

• Subunità L codificata dal genoma plastidiale e porta il sito attivo (all’interfaccia tra due subunità L)

• Sububità S codificata dal genoma nucleare e non catalizza la reazione (nessun residuo partecipa al sito attivo)

Figure 8.2.A   A model for the structure of rubisco in chloroplasts from higher plants. Rubisco consists of 8 large (L) and 8 small (S) subunits arranged as 4 dimers. Small subunits are shown in red (only four of the small subunits are seen), large subunits are shown in blue and green, in order to show the boundaries of the dimers. (From Malkin and Niyogi 2000.)

LS L

Altre 4 subunità S si trovano dall’altra parte

RuBP Carboxylase – meccanismo postulato:

Estrazione di un H+ dal C3 del ribulosio-1,5-bisfosfato promuove la formazione di un intermedio enediolato.

Un attacco nucleofilo sulla CO2 porta alla formazione di

un intermedio -keto acido, che reagisce con acqua per formare 2 molecole di 3-phosphoglycerate.

O H

H 2 C

CH

C

C

O HH

H 2 C O P O 32

O P O 32

O

O H

H 2 C

CH

C

C

O H

H 2 C O P O 32

O P O 32

O

H +O H

H 2 C

CH

C

C

O

H 2 C O P O 32

O P O 32

H O C O 2

C O 2

O H

H 2 C

CH

C

O P O 32

O O

H 2 O

1

5

4

3

2

r ib u lo se -1 ,5 - e n e d io la te -k e to 3 -p h o sp h o g ly c e ra te b isp h o sp h a te in te rm e d ia te in te rm e d ia te (2 )

I due substrati sono simili (lineari e con una estremità identica) per cui è difficile discriminare

La molecola di O2 risulta più piccola di CO2 per cui è difficile che non entri nel sito attivo

La Rubisco in realtà catalizza due diverse reazioni

Perchè un’attività apparentemente dannosa?

L’attività ossigenasica della Rubisco è un male evitabile? (Occorrerebbe quindi solo cercare varianti dell’enzima capaci di discriminare meglio tra i due substrati).

Oppure l’attività è inevitabile (dal punto di vista catalitico) o addirittura necessaria perché svolge qualche funzione importante?

E’ probabile che sia inevitabile e ultimamente utile:

inevitabile perché la CO2 è molto meno abbondante dell’O2

Gas P (aria) Conc (aria) Conc (H2O) Conc in H2O al p.c. CO2

CO2 350 μbar 16 μM 11.7 μM 1.5 μMO2 210 mbar 9.4 mM 265 μM 265 μM

Concentrazione dei gas a 25°C

La CO2 pur essendo a bassa concentrazione nell’aria, si arricchisce (scioglie preferenzialmente) nell’acqua

210/0.35 = 600 265/11.7 = 22.6

Come varia [CO2] con la temperatura?

[CO2] (in μM) = Pp. CO2 α 106/22.4 α = α (T)

All’aumentare della temperatura, la solubilità di O2 e CO2 scende, ma quella della CO2 scende più velocemente

Ciclo fotorespiratorio

Immagini da: Buchanan et al. Biochemistryy and Molecular Biology of Plants

Il ciclo fotorespiratorio è un ciclo parassita!!

Ciclo fotorespiratorio

Compartimenti, enzimi e reazioni

Glutamate synthase (GOGAT-glutamine 2-oxoglutarate aminotransferase)

Cosa succede se blocchiamo il ciclo?

Es. mutanti nella Glutammato Sintetasi cloroplastica (Fdx dipendente) crescono ad alta CO2 ma non in aria (clorosi).

Mutanti alterati negli enzimi del ciclo accumulano gli intermedi e hanno un fenotipo caratteristico

Nella fotorespirazione si accumula NH3

Esempi di mutanti che richiedono alta CO2:

Phosphoglycolate phosphatase

Catalase

Serine trans-hydroxymethylase

Dicarboxylic acid translocator

Glu synthase

Gln synthase

Ser/Glyox amino transferase

Rubisco Attivasi

I mutanti mostrano tutti clorosi a [CO2] ambientale. La semplicità dello screening (clorosi in aria, ma non ad alta CO2) ha permesso l’isolarmento di molti mutanti.

E’ stato di fatto l’isolamento e lo studio dei mutanti che ha permesso di delucidare il ciclo fotorespiratorio

Il ciclo PR è necessario per riciclare il fosfoglicolato & intermedi

Che peso ha in vivo la fotorespirazione?

Per temperature superiori ai 30°C, l’assimilazione netta può diminuire del 60% per una pianta C3

[CO2](ppm) 21%O2 2%O2

110 10 150 320 565 1076 640 804 1144

Assimilazione netta in funzione di [CO2] e [O2]

Valore vicino a quello naturale

La differenza è imputabile alla fotorespirazione

Come avviene la competizione tra CO2 e O2?

SK

SVv

m

M

Il valore di Km viene aumentato: Km’=Km(1+I/Ki)= Km • α

L’inibizione si annulla aumentando la concentrazione del substrato

SK

IK

SVv

im

m

)1(

La competizione tra CO2 e O2 per il complesso Rubisco-enediolato si traduce in cinetica standard di inibizione competitiva tra i due gas

La Vm nell’inibizione competitiva

è la stessa!!!

SKI

KK

SV

SKI

K

SVv

imm

m

im

m

)1(

imim

im

KSIKKK

KSV

Poniamo:C = [CO2] O = [O2]

Vc= VmaxCarbossilazione Vo= Vmax

Ossigenazione

Kc= KmCO2 = KI

Oss. Ko= KmO2 =KI

Carb.

ococ

occ KCOKKK

KCVv

coco

coo KOCKKK

KOVv

O

CS

O

C

KV

KV

KOV

KCV

v

vrel

co

oc

co

oc

o

c

Fattore di specificità relativo Srel (φ)

Se riusciamo a calcolarci vc/vo per un dato rapporto di CO2/O2, allora riusciamo a ricavare il valore di Srel (indicato come φ nel libro) che sarà poi utilizzabile come costante.

A=d[CO2]/dt = 0

A = Assimilazione = vc- 0.5vo- Rd

Quando A=0 siamo al punto di compensazione della CO2

Per ogni RuBP ossigenato si libera una glicina e quindi solo 0.5 molecole di CO2

La respirazione al buio (Rd, Dark Respiration) è in genere bassa alla luce (e comunque difficile da misurare quando la fotosintesi funziona) per cui si trascura.

Punto di compensazione della CO2A

ssim

ilaz

ione

Punti di compensazione della CO2

(per una C4 e una C3 rispettivamente)

Trascurando Rd e con A=0 abbiamo:

vc = 0.5 vo vo = 2 vc

Quanto vale la [CO2] al punto di compensazione?

Vedi diapositive 18 e 19 [CO2] (in μM) = Pp. CO2 α 106/22.4 =1.5

O

CS

v

vrel

o

c c

crel

o

c

v

vS

v

v

2265

5.1

oc vv 5.0O

C

v

v

o

c 88

In vivo: O

C

v

v

o

c 88

Se la Rubisco funzionasse in aria:

14.010210

35088

3

o

c

v

voc vv 14.0

co vv 1.7

Su 8 eventi: 7 Ossig. e 1 Carb.

In acqua in equilibrio con aria (0.035%): oc vv 8.3

ocvv 5.0In acqua al p.c. CO2 (0.0045%):

http://www.uib.es/depart/dba/plantphysiology/Grup%20de%20recerca/Tesi%20Jeroni%20en%20PDF/14%20Chapter10.%20Biochemistry%20of%20Rubisco.pdf

Valori di Srel

C’è una relazione tra Srel e Kcat?

• Rubisco is surprisingly inefficient (Kcat=2-8 s-1)• Srel varies between 20 and 280 (80-100 for

higher plants)• A trade off: aumentare la velocità della reazione

comporta una perdita di specificità• Quanto più l’enediolo nel sito attivo è in una

configurazione contorta, tanto più la reazione è specifica per la CO2 e tanto più è difficile rilasciare i prodotti (enzima lento)

Vedi Tcherkez et al. (2006) PNAS 103:7246-7251

Regolazione della Rubisco

L’attività della Rubisco viene regolata a diversi livelli:

* Quantità di enzima sintetizzato

* Stato di attivazione (Rubisco attivasi, regolata a sua volta)

* Presenza di inibitori

…

* Anche la disponibilità dei substrati influenza la reazione

L’attività della Rubisco (e di diversi altri enzimi) deve essere regolata, altrimenti… I substrati tendono a scomparire e i prodotti ad accumularsi

Stato di attivazione della Rubisco

• La Rubisco presente in cellula non è attiva al 100% ma solo in parte

• Può essere attivata incubando con alta CO2 e Mg++ (attività totale)

• La % di attivazione cambia in base a fattori ambientali (illuminazione, disponibilità di acqua…)

Carbamilazione della RuBisCO

La RuBisCO viene attivata per carbamilazione di un residuo di lisina da parte di una molecola di CO2 che non interagisce con il sito attivo; la reazione viene favorita da [H+] bassa e [Mg++] alta.

Lys 201

(spinacio)

La reazione è favorita dalla pesenza di Rubisco attivasi

RuBisCO attivasi

La RuBisCO attivasi aiuta il rilascio del substrato (o di inibitori) che impediscono la carbamilazione. La reazione è ATP dipendente

Valori: (stroma)

Buio Luce

pH 7.3 8.0

Mg++ 1-3 3-6

Trdx (% red) 8-30 62-77

La reazione è favorita alla luce

Quando aumenta la luce la Rubisco viene attivata

La CO2 agisce sia da attivatore (modulazione) o da substrato (catalisi) per la rubisco

Forma attiva

Forma inattiva

Transition state analogs of the postulated -keto acid intermediate bind tightly to RuBP Carboxylase and inhibit its activity.

Il 2-carboxyarabinitol-1,5-bisphosphate (CABP)

2-Carboxyarabinitol-1,5-bisphosphate (inhibitor)

OH

H2C

CH

C

C

OHH

H2C OPO 32

OPO 32

HO CO2

Proposed -keto acid intermediate

OH

H2C

CH

C

C

O

H2C OPO 32

OPO 32

HO CO 2

Alcune piante sintetizzano al buio degli inibitori della Rubisco. Sono analoghi dello stato di transizione, (es. CABP o carboxyarabinitol-1-phosphate CA1P).

La Rubisco attivasi facilita il rilascio di CA1P dalla Rubisco, quando viene attivata in condizioni di illuminazione dal sistema della tioredossina.

Intermedio di reazione

Analogo dell’intermedio di reazione

CABP

La regolazione tramite sulfidrili

Enzimi regolati tramite Tioredossina:

FBPasi SBPasi PRK NADP-GAPDH Rubisco Attivasi NADP-MDH CF1-ATPasi Phe-ammonia lyase ADP-G PPasi

G6P-DH PFK?

+

Ciclo fotorespiratorio

Il ciclo produce H2O2 che deve essere detossificata

la catalasi è necessaria per il ciclo

Il ciclo produce NH3 che deve essere detossificata (è un disaccoppiante)

la Glutamina Sintasi (come la Glutamato Sintasi) è necessaria per il ciclo

Cosa succede in assenza di CO2 e con poco ossigeno alla catena di trasporto degli elettroni?

2% O2

21% O2

L’ossigeno aiuta a sostenere a catena di trasporto degli e- in assenza di CO2

Kozaki e Takeba (1996) Nature 384:557-560

Le piante differiscono per l’attività della Gln sintasi e quindi per la capacità fotorespiratoria (la GS serve per reincorporare l’ammoniaca)

Il trasporto fotosintetico di elettroni viene ridotto drasticamente

In assenza di CO2 e con poco ossigeno la FR funziona poco e quindi il consumo di ATP e di NADPH è molto ridotto

La fotorespirazione conferisce un vantaggio (i mutanti che ne sono privi infatti muoiono)

in condizioni di CO2 limitante

Freddo

Caldo

La fotorespirazione mantiene attiva la catena di trasporto degli elettroni in assenza di CO2

O2 riceve gli e- in assenza di CO2

Three pathways cooperate in the metabolism of P-glycolate in Synechocystis: a plant-like C2 cycle, a bacterial-like glycerate path and a decarboxylation pathway

Photorespiration redesigned

Kebeish et al., (2007) Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nat Biotechnol. 25:593-9.

Più che sulla eliminazione della FR conviene puntare su un ciclo più corto: piante che contengono gli enzimi 10 e 12 riciclano il gliossalato più efficientementeplant-like C2 cycle

Bibliografia

* Kozaki e Takeba (1996) Photorespiration protects C3 plants from photooxidation Nature 384:557-560

Introduz. generale: Buchanan, Gruissem & Jones (2001) Biochemistry and Molecular Biology of Plants

capitoli 8 (glutamato sintasi, p. 363-370) e 13

Rubisco e il calvin:http://3e.plantphys.net/chapter.php?ch=8

Rubisco e fattore di specificità vedi:http://www.uib.es/depart/dba/plantphysiology/Grup%20de%20recerca/Tesi%20Jeroni%20en%20PDF/14%20Chapter10.%20Biochemistry%20of%20Rubisco.pdf* Tcherkez et al. (2006) PNAS 103:7246-7251* Griffith (2006) Nature 441:940-941