Ciclo Celular
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Ciclo CelularCiclo Celular
El ciclo celular es una serie El ciclo celular es una serie ordenada de eventos ordenada de eventos macromoleculares que lleva hasta macromoleculares que lleva hasta la división celular y a la la división celular y a la producción de dos células, cada producción de dos células, cada una conteniendo un número una conteniendo un número idéntico de cromosomas a la idéntico de cromosomas a la célula madre.célula madre.
El ciclo celular es una serie El ciclo celular es una serie ordenada de eventos ordenada de eventos macromoleculares que lleva macromoleculares que lleva hasta la división celular y a la hasta la división celular y a la producción de dos células, cada producción de dos células, cada una conteniendo un número una conteniendo un número idéntico de cromosomas a la idéntico de cromosomas a la célula madre.célula madre.
ObjetivosObjetivos
1.1. Mostrar como la unión de varios estudios Mostrar como la unión de varios estudios independientes generó el conocimiento independientes generó el conocimiento base sobre el ciclo celular.base sobre el ciclo celular.
2.2. Presentar diferentes técnicas moleculares Presentar diferentes técnicas moleculares utilizadas para la disección de los utilizadas para la disección de los mecanismos de control de un proceso mecanismos de control de un proceso fisiológico, en este caso el ciclo celular.fisiológico, en este caso el ciclo celular.
3.3. Mostrar el conocimiento actual la Mostrar el conocimiento actual la regulación del ciclo celular en plantas.regulación del ciclo celular en plantas.
4.4. Transducción de señales de los Transducción de señales de los principales reguladores de crecimientoprincipales reguladores de crecimiento
IntroducciónIntroducción
1.1. Teoría Celular, 1838, Schleiden y SchwanTeoría Celular, 1838, Schleiden y Schwan1.1. Todos los organismos están compuestos de célulasTodos los organismos están compuestos de células2.2. Toda célula se origina a partir de otra célulaToda célula se origina a partir de otra célula
2.2. ¿Cómo originar célula nueva?¿Cómo originar célula nueva?1.1. Información de cómo realizarloInformación de cómo realizarlo2.2. Capacidad de síntesis de todos los Capacidad de síntesis de todos los
componentes (duplicar todo)componentes (duplicar todo)3.3. Mecanismo de control del procesoMecanismo de control del proceso
1.1. AvanceAvance2.2. Asegure la fidelidad del procesoAsegure la fidelidad del proceso
G1 12 horasS 6 horasG2 6 horasM 0.5 horas
Rae, P. N., & Johnson, 1970 Johnson and Rae, 1970
1. Orden de etapas2. Núcleo emite instrucciones3. M: induce a G1, S, G2 a
avanzar en orden (ALTERNAMIENTO)
4. Etapas deben finalizar antes de iniciar otras (TERMINACIÓN)
5. S induce G1 a duplicar ADNl6. S no induce a G2 a replicar
Block a re-duplicación
Experimentos de Fusión de células de Mamíferos:
Análisis bioquímico del ciclo Análisis bioquímico del ciclo celular celular (estudio en células (estudio en células
embrionarias)embrionarias)
Xenopus laevis
• Células grandes 1mm• Posible obtener en gran
número, 1 hembra produce miles
• Gran número en espacio reducido
• Gran número en corto tiempo• Divisiones iniciales son
sincronizadas
Ciclo de vida de Xenopus laevis
Células del Folículo
Detiene en Metafase II
DESCUBRIMIENTO DEL MPFMPF
(FACTOR DE PROMOCIÓN DE LA MITOSIS/MADURACIÓN)
Masui, Y., & Markert, C. L., 1971.
Gerhart, ., Wu, M., & Kirschner, M.J. ,1984
Medición de MPF en proceso de oocito a blástulaMedición de MPF en proceso de oocito a blástula
MPF también induce mitosis
Actividad MPF independiente de
ensamblaje del huso (nodoconazole)
síntesis de DNA (afidicolina)
Xlt: independiente del estado del núcleo!???
Motor del ciclo celulatodas las reacciones que inducen la activación o inactiviación de MPF
Eventos secundariosEventos inducidos por la
act.o inactiv. de MPF
Motor del CC
Alta MPF
Baja MPF
Eventos secundarios
Eventos secundarios
Descubrimiento de la CICLINA
Evans, T., Rosenthal, E. T., Youngblom, J.. Distel, D.. & Hunt, T.1983
Evidencias de estudios Evidencias de estudios bioquímicos bioquímicos
Ambos ensayos (exp. de inyección y de fusión) prueban que Ambos ensayos (exp. de inyección y de fusión) prueban que las células mitóticas tiene un factor inductor dominante las células mitóticas tiene un factor inductor dominante
Oocitos, MPF oscila aún si DNA no está replicado, no en Oocitos, MPF oscila aún si DNA no está replicado, no en exp. de fusiónexp. de fusión
Se creyó que ambos sistemas poseían regulación diferente.Se creyó que ambos sistemas poseían regulación diferente.
Sistema de inyección en oocytos (maduración) permitió Sistema de inyección en oocytos (maduración) permitió tener un sistema para purificar MPF pero:tener un sistema para purificar MPF pero:
MPF difícil de purificarMPF difícil de purificar Experimento era difícil de realizarExperimento era difícil de realizar Se creía que control de meiosis era diferente de mitosisSe creía que control de meiosis era diferente de mitosis
Análisis genético del ciclo Análisis genético del ciclo celularcelular
(estudio en levaduras)(estudio en levaduras) Dos tipos de levadurasDos tipos de levaduras
Saccharomyces cerevisiae (pan, vino, cerveza) levadura Saccharomyces cerevisiae (pan, vino, cerveza) levadura de fisiónde fisión
Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe) levadura Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe) levadura de gemaciónde gemación
VentajasVentajas Rápido crecimiento (división cada 90 min)Rápido crecimiento (división cada 90 min) Medio de crecimiento sencilloMedio de crecimiento sencillo Genoma pequeñoGenoma pequeño Fácil de detectar etapas del ciclo celular (tamaño de gema)Fácil de detectar etapas del ciclo celular (tamaño de gema)
Inicio de gemación coincide con paso por INICIO (START)Inicio de gemación coincide con paso por INICIO (START) UnicelularesUnicelulares Sistema ampliamente estudiado desde 1960’sSistema ampliamente estudiado desde 1960’s
Diferencias con células Diferencias con células embrionariasembrionarias
Se detectan dos Puntos de Control Se detectan dos Puntos de Control Entrada a S, regula tamaño de célulaEntrada a S, regula tamaño de célula Entrada a M, chequea duplicación del ADNEntrada a M, chequea duplicación del ADN
Mitosis es cerrada (no se rompe memb. Mitosis es cerrada (no se rompe memb. Nucl.Nucl.
Ensamblaje de huso inicia antes de finalizar Ensamblaje de huso inicia antes de finalizar duplicación de DNAduplicación de DNA
Difícil detectar el ingreso MDifícil detectar el ingreso M Tamaño de gema indica etapa del CCTamaño de gema indica etapa del CC
Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe)Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe) levadura de gemación levadura de gemación Budding yeastBudding yeast
Budding yeast
Identificación de Identificación de mutantes del CCmutantes del CC
32 mutantes cdc “cell division cycle”
Budding yeast
Mapa de MutantesMapa de Mutantes
Hartwell, L. It, Culotti. J., P J. R., & Reid, 1974
Budding yeastv
•Proteína esencial para el avance del CC
•No permite ingreso a S, este punto del cc se define como INICIO (START), no permite ningún evento secundario
•Luego de este punto la célula esta comprometida a completar el CC
•La célula coordina crecimiento y motor del cc
•La célula evalúa estado nutricional, si es pobre detiene CC (diferente a embriones)
Budding yeast
Quién es cdc28?Quién es cdc28?
Tendrá alguna Tendrá alguna relación con MPF?relación con MPF?
Saccharomyces cerevisiae (levadura Saccharomyces cerevisiae (levadura común)común)Levadura de fisión (método de Levadura de fisión (método de división)división)Fission yeastFission yeast
Fission yeastFission yeast
Regulación del tamañoRegulación del tamaño
División ocurre siempre a un tamaño dadoDivisión ocurre siempre a un tamaño dado Longitud del ciclo celular es mayor en Longitud del ciclo celular es mayor en
células hija que en células madre (By).células hija que en células madre (By). Falta de nutrientes detiene CC en INICIO Falta de nutrientes detiene CC en INICIO
ByBy y en ENTRADA A MITOSIS en y en ENTRADA A MITOSIS en FyFy
Lo anterior refleja una evaluación del Lo anterior refleja una evaluación del ambiente externo para permitir la ambiente externo para permitir la continuación del CCcontinuación del CC
Enzimas que controlan CCEnzimas que controlan CC
2 modelos:2 modelos: Xenopus, motor del CC sin control, Xenopus, motor del CC sin control,
embriog.embriog. Levaduras, alto regulación del CC, Levaduras, alto regulación del CC,
somáticasomática Mutantes:Mutantes:
wee1wee1 cdc 25cdc 25
Wee1+Wee1+
wee1- (ts): wee1- (ts): Mutante de FyMutante de Fy células se dividen a un tamaño menorcélulas se dividen a un tamaño menor Posible inhibidor de avance del CC hasta alcanzar Posible inhibidor de avance del CC hasta alcanzar
tamaño adecuado, al mutarse pierde su actividad tamaño adecuado, al mutarse pierde su actividad como inhibidor como inhibidor
Actividad en INICIO o en ENTRADA A MITOSISActividad en INICIO o en ENTRADA A MITOSIS Al aumentar temperatura se da explosión de M no de S, Al aumentar temperatura se da explosión de M no de S,
se elimina control de tamaño para M, ahora punto de se elimina control de tamaño para M, ahora punto de control es en INICIOcontrol es en INICIO
Se reflejan 2 puntos deControl:
ENTRADA A MITOSIS
INICIO
Fission yeastFission yeast
cdc25+cdc25+
cdc25 (ts): cdc25 (ts): Mutante de FyMutante de Fy Detienen ciclo antes de M pero continuan Detienen ciclo antes de M pero continuan
creciendocreciendo Mutación puede ser rescatada por wee1- Mutación puede ser rescatada por wee1-
Fission yeastFission yeast
cdc2+cdc2+
cdc2 (ts): cdc2 (ts): Mutante de FyMutante de Fy Detienen ciclo antes de M pero continuan Detienen ciclo antes de M pero continuan
creciendocreciendo Mutación no puede ser rescatada por Mutación no puede ser rescatada por
ninguna otra mutaciónninguna otra mutación
Fission yeastFission yeast
Detiene en G2
Mutacióndominante
cdc13 mismo fenotipo que cdc2 ts
Russell, P., & Nurse, P. (1987).
Clonaje de genes por complementaciónClonaje de genes por complementación
La unión de ambos estudiosLa unión de ambos estudios
Integración de By y FyIntegración de By y Fy
Es posible complementar cdc2 con Es posible complementar cdc2 con cdc28 y viceversacdc28 y viceversa
63% de identidad en la secuencia de aa63% de identidad en la secuencia de aa Cdc2 ENTRADA A MITOSIS y Cdc2 ENTRADA A MITOSIS y
cdc28 INICIO ?cdc28 INICIO ? Homólogo de cdc2 en humanos, capaz Homólogo de cdc2 en humanos, capaz
de rescatar cdc2 Fy => sistema de rescatar cdc2 Fy => sistema conservadoconservado
Integración de mutantes y Integración de mutantes y MPFMPF
Se logra purificar MPF Se logra purificar MPF 1 L huevos pocos ug de MPF1 L huevos pocos ug de MPF 2 bandas 34 KDa y 46 KDa2 bandas 34 KDa y 46 KDa
Se supuso que era cdc2 y cdc13 Se supuso que era cdc2 y cdc13 (ciclina)(ciclina) Anticuerpos lo demostróAnticuerpos lo demostró
MPF tenía actividad kinasaMPF tenía actividad kinasa Sustrato Histona H1Sustrato Histona H1
La ciclina y el ciclo celularLa ciclina y el ciclo celular
Es la ciclina la única proteína involucrada Es la ciclina la única proteína involucrada en la oscilacion del CCen la oscilacion del CC
Sistema Sistema in vitroin vitro de ciclo celular de ciclo celular
Murray, A. W., & Kirschner, M. W.(1989)
Adición de mRNA de ciclina es capaz de restaurar divisionesAdición de mRNA de ciclina es capaz de restaurar divisiones
ANTISENSE mRNA
Eliminación de un fragmento Eliminación de un fragmento de 90 aa (caja de de 90 aa (caja de destrucción) del terminal destrucción) del terminal amino del gen de ciclina: amino del gen de ciclina: destrucción necesaria para destrucción necesaria para salir de mitosis.salir de mitosis.
Inhibición de síntesis de Inhibición de síntesis de proteínaproteínacicloheximidacicloheximida
Mitad de interfaseInicio de interfase
Ciclina requerida para entrar en M
Incremento de MPF depende de otros factores
Más ciclina no acelera CC
Más MPF si acelera CC
Más cdc25 si aceleraMenos wee1 si acelera
FosforilaciónFosforilación
La modificación más común de postTDLa modificación más común de postTD Actúan sobre aa-OHActúan sobre aa-OH Activa o inactiva proteínasActiva o inactiva proteínas Participa en cascada de señalesParticipa en cascada de señales 3 tipos: Ser/Thr, Tyr y Ser/Thr/Tyr3 tipos: Ser/Thr, Tyr y Ser/Thr/Tyr Diferentes Kinasas diferente sustratoDiferentes Kinasas diferente sustrato
Wee1 solo actúa sobre cdc2Wee1 solo actúa sobre cdc2 MPF actúa sobre muchos sustratosMPF actúa sobre muchos sustratos
Las proteínas pueden tener varios sitios de Las proteínas pueden tener varios sitios de fosforilaciónfosforilación
Fosfatasas: también clasificadas por su especificidad Fosfatasas: también clasificadas por su especificidad aaaa
Mutante del cdc2 en residuo Tyrosina 15al parecer es un sitio de regulación negativase divide en un tamaño menorno responde a daños en DNA
Cdc2: también fosforilado en Thr 161regulación positiva
Cdc25 -: detiene ciclo en G2muestra alta fosforilación de
Tyr15en cdc2 F15D: no puede
ejercer fosforilaciónes fosforilado para activarse
Degradación de la ciclinaDegradación de la ciclina
Se requiere para inactivar MPFSe requiere para inactivar MPFSe asocia a moléculas de ubiquitinaSe asocia a moléculas de ubiquitinaUbiquitina es activada por MPFUbiquitina es activada por MPFLos residuos de ubiquitina se unen a caja de destrucciónLos residuos de ubiquitina se unen a caja de destrucción
Autocontrol de MPF
Estructura deMembranaNuclear: filamentos de lamina
Sustratos de MPF
¿Tarea,otros sustratos?
Mutantes en otras kinasasotras kinasas
Wee1: fosforila Tyr 15Mik1: fosforila Tyr 15 (redundante)Wee1-mik1: catástrofe
Aspergilus nidulans:Aspergilus nidulans:
Nim: never in mitosisNim: never in mitosis Bim: blocked in mitosisBim: blocked in mitosis
nimA: kinasa, actividad alta en mitosis y luego caenimA: kinasa, actividad alta en mitosis y luego cae nimA++: entrada temprana en M, aún sin duplicar DNAnimA++: entrada temprana en M, aún sin duplicar DNA nimA-: ciclo se detiene en G2, pero mantiene alta MPFnimA-: ciclo se detiene en G2, pero mantiene alta MPF
nimT: homólogo de cdc25nimT: homólogo de cdc25 nimT-: baja MPF, detiene ciclo en G2nimT-: baja MPF, detiene ciclo en G2 nimT: alta actividad kinasa de nimAnimT: alta actividad kinasa de nimA
nimA y MPF: se requieren para MnimA y MPF: se requieren para M
O’Donnell, K., Pu, R. T., & Osmani, (1991).
Actividad kinasa asociada a NimA y mitosisActividad kinasa asociada a NimA y mitosis
Ciclo Celular en MamíferosCiclo Celular en Mamíferos
Kaldis y Aleem, 2005
Concepción comúnCDK2 + CYC A or CYC E en G1/SCDC2 + CYCB en Mitosis
NuevoCDC2 + CYCE, B o A en G1/SCDC2 o CDK2 en G1/S
Hartig and Beck, 2005
Ciclo Celular en PlantasCiclo Celular en Plantas
Hartig and Beck, 2005
Jager et al., 2007Jager et al., 2007
Plantas: 49 ciclinas, 10 clases: A, B y D en CCPlantas: 49 ciclinas, 10 clases: A, B y D en CC CDK´s: A, BCDK´s: A, B
CDKA/CYCD y CDKB/CYCDCDKA/CYCD y CDKB/CYCD CDKA: constitutiva, genera actividad Kinasa en G1CDKA: constitutiva, genera actividad Kinasa en G1 CDKB: actividad kinasa en S y MCDKB: actividad kinasa en S y M
CiclinasCiclinas CYCD5: pico en G1CYCD5: pico en G1 CYDD4: pico en G1/SCYDD4: pico en G1/S CYCD++: G1 se acortaCYCD++: G1 se acorta Regulación de CYCD:Regulación de CYCD:
CYCD3: muy inestable v1/2: 7.5 min x ubiq, transducción CYCD3: muy inestable v1/2: 7.5 min x ubiq, transducción de señales (nutrientes, hormonas)de señales (nutrientes, hormonas)
CYDD2: más estable, regulada a nivel de actividad de CYDD2: más estable, regulada a nivel de actividad de kinasakinasa
Regulación de CDKRegulación de CDK Por asociación a ciclinaPor asociación a ciclina Por fosforilación (CAK: CDK Por fosforilación (CAK: CDK
activ.kinasas)activ.kinasas) CDKD/CYCHCDKD/CYCH CDKFCDKF Inhibidores de CDK (KRP´s)Inhibidores de CDK (KRP´s)
Jager et al., 2007Jager et al., 2007
ENTRADA en SENTRADA en S
CYCD/CDKA inactiva RB (via P)CYCD/CDKA inactiva RB (via P) CYC D se une a RB vía motivo LxCxECYC D se une a RB vía motivo LxCxE RB asociado a diferenciaciónRB asociado a diferenciación
RBRB RB/E2F:inactiva a E2FRB/E2F:inactiva a E2F RB fosforilado no puede inactivar E2F (se da duplicación del ADN)RB fosforilado no puede inactivar E2F (se da duplicación del ADN)
E2FE2F Factor de ElongaciónFactor de Elongación Activos durante S asociados a Activos durante S asociados a endoreduplicaciónendoreduplicación Regulan genes de sintesis y replicación de DNARegulan genes de sintesis y replicación de DNA 5700 genes con sitios de unión para E2F (20 % genoma)5700 genes con sitios de unión para E2F (20 % genoma) TiposTipos
E2F heterodiméricoE2F heterodimérico DPDP E2F monomérico (indep de RB)E2F monomérico (indep de RB)
ELP, E2Fd, E2Ff, E2F, DELELP, E2Fd, E2Ff, E2F, DEL
Jager et al., 2007Jager et al., 2007
Modelo de la Transición G1/SModelo de la Transición G1/Sen plantasen plantas
Dewitte and Murray, 2003
Ciclinas tipo ACiclinas tipo A
10 tipos en Arbd, 3 subclases: A1, A2 y A310 tipos en Arbd, 3 subclases: A1, A2 y A3 Expresión secuencial A3 -> A1 -> A2Expresión secuencial A3 -> A1 -> A2 CYCA3/CDKA: requerida p´re-entrar CC en CYCA3/CDKA: requerida p´re-entrar CC en
SS A1 y A2 durante S y G2/MA1 y A2 durante S y G2/M
Jager et al., 2007Jager et al., 2007
G2/MG2/M
Control ppal por CYCBControl ppal por CYCB Arbd: 9 tipos, 3 subclases B1, B2, B3Arbd: 9 tipos, 3 subclases B1, B2, B3 TC alta en G2 y pico al inicio de MTC alta en G2 y pico al inicio de M TC regulada por MybA1, A2 y BTC regulada por MybA1, A2 y B
MybA1 y A2: activadoresMybA1 y A2: activadores MybB: represorMybB: represor
Jager et al., 2007Jager et al., 2007
Ciclinas tipo BCiclinas tipo B
Los niveles muy regulados por proteólisis Los niveles muy regulados por proteólisis en metafase/anafaseen metafase/anafase
CYCB++: daños en mitosisCYCB++: daños en mitosis CDKA/CYCB: colocaliza en PPB, huso, CDKA/CYCB: colocaliza en PPB, huso,
cromatina, fragmoplasma: dinámica de cromatina, fragmoplasma: dinámica de microtúbulosmicrotúbulos
No se ha indentificado homólogos deNo se ha indentificado homólogos de Wee1 identificado en plantasWee1 identificado en plantas cdc25: no ¿regulación?cdc25: no ¿regulación?
Jager et al., 2007Jager et al., 2007
Estudio de genes del CC en Estudio de genes del CC en plantasplantas
http://http://jxb.oxfordjournals.org/cgi/reprint/51/352/1789