PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINHKHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

NỘI DUNG CHƯƠNG 2

2.1. Nguyên tắc và phân loại các phương pháp sắc ký lỏng

2.2. Pha tĩnh và pha động trong sắc ký lỏng

2.3. Thiết bị trong sắc ký lỏng và sắc ký lỏng cao áp

2.4. Ứng dụng của sắc ký lỏng

2.1. Nguyên tắc và phân loại các phương pháp sắc ký lỏng

GIỚI THIỆU VÀ PHÂN LOẠI

ĐỘ PHÂN CỰC CỦA PHA

• Pha thường hay còn gọi là pha thuận

(normal phase): pha tĩnh phân cực

dung môi không phân cực

• Pha đảo (reverse phase): pha tĩnh không

phân cực dung môi phân cực

Sắc ký lỏng – lỏng (LLC)sắc ký lỏng - rắn (SLC)

• SLC: Pha tĩnh là chất rắn, phổ biến nhất là silicagel pha này thuộc dạng pha thường

• LLC: Pha tĩnh là chất lỏng có phủ một lớp chất rắn bảo vệ (giống cột nhồi trong GC)

• Pha tĩnh trong LLC có thể phân cực hoặc không phân cực, pha động thì ngược lại

• LLC ít được sử dụng

CỘT ÁP SUẤT THẤP

• Áp suất thấp: cột mở (open tubular), cho đến nay vẫn còn sử dụng loại cột này tuy nhiên chỉ tách được các mẫu tương đối đơn giản– Đường kính– Cột: > 1cm– Hạt > 37m

CỘT ÁP SUẤT CAO

• Cột kín, hạt nhỏ và đồng nhất (< 12m)

• Độ phân giải cao nhưng thiết bị đắt

• Áp suất lên tới 5000 psi

THUẬN LỢI CỦA HPLC

Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN I- Introductory classifications

Example of high speed HPLC

Example of high resolution HPLC

Example of high sensitivity HPLC

BẤT LỢI CỦA HPLC

Isocratic và gradient elution

• Isocractic elution: chế độ chạy đẳng dung môi

• Gradient elution: chế độ chạy theo chương trình dung môi, thông thường sẽ thay đổi từ hệ dung môi có năng suất rửa giải thấp tới cao. – Sử dung cho những mẫu phức tạp– Hỗn hợp các chất có ái lực khác nhau– Giảm được thời gian phân tích

Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN I- Introductory classifications

Analysis of a complex mixture :

Isocratic modeGradient mode

First few peaks : too close of dead peak

too strong mobile phase

Last peaks : short and broad, long tR

too weak mobile phase

Solution = gradient elution

Begin with a weaker solvent and gradually increase the solvent strength

Resolution of ealier peaks improved

Widths of later peaks drecreased and heights increased

2.2. Pha tĩnh và pha động trong sắc ký lỏng

PHA TĨNH

Silica gel

• Đường kính của hạt• 1 - 12m (nhỏ hơn

GC)• Cỡ hạt từ 5 – 400nm• Kích thước hạt nhỏ

áp suất cột tăng cho cột ngắn lại

Average velocity

Pressure drop (bar)

Flow rate

PHA ĐẢO

Synthesis of RP Packings

RP Column Preparation

Common RP Packings

RP Mechanism (Simple)

PHA ĐỘNG TRONG HPLC

BẢNG SO SÁNH ĐỘ MẠNH CỦA DUNG MÔI TRÊN NỀN Al2O3

Một số thông tin về dung môi

QUAN HỆ GIỮA CÁC CHẤT HẤP THỤ KHÁC

Những thông số quan trọng trong pha đảo

• Độ mạnh của dung môi

• Sự chọn lựa dung môi

• pH của pha động

• Hoạt tính của silanol

Độ mạnh của dung môi

• Nước là dung môi yếu

• Tăng dung môi hữu cơ giảm tR

• Dung môi HC này phải hòa tan trong nước

Hiệu quả tách của dung môi

ảnh hưởng của pH

• Ảnh hưởng của hợp chất ion hóa

– Axit hữu cơ

– Bazơ hữu cơ

• Trong HPLC-RP cần phải ngăn chặn quá

trình này

• Cần thiết phải điều chỉnh đúng giá trị pH

pH ảnh hưởng tới tR

1. Salicylic acid

2. Phenobarbitone

3. Phenacetin

4. Nicotine

5. Methylampohetamine

30x0.4 cm C-18, 10 m, 2 mL/min, UV 220 nm

Snyder and Kirkland, Introduction to ModernLiquid Chromatography, Wiley, 1979, p. 288.

Sử dụng dung dịch đệm

• Ph của dung dịch đệm chọn sao cho

– Sử dụng được: pH = pKa ± 1

– Tốt nhất là: pH = pKa

• Tính đệm phải yếu (100 mM hoặc nhỏ hơn)

• Kiểm tra tính tan của chúng

MỘT SỐ ĐỆM PHỔ BIẾN

Buffer compatible with detectorCommon concentration of buffer : 10-50 mM

Hoạt tính của silanol

• RP chiếm khoảng 50% nhóm –OH của silicagel

• Có tính axit yếu

Bề mặt Silica

CÁCH CHỌN DUNG MÔI

• Độ phân cực thích hợp

• Độ nhớt thấp

• Tương thích với detector

• Tính bay hơi

Cột của một số hãng

MỘT SỐ KÝ TỰ VIẾT TẮT

• ODS: octadecylsilylated

• TMS: trimethylchlorosilane

• THF: tetrahydrofolate

MỘT SỐ VÍ DỤ

• Sườn silica gel

• ODS - silica gel

• TMS – silica gel

ION PAIR HPLC (IPC)

Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN II- Classification of HPLC modes

Distinction between : - short alkyl chain ion pair reagents as sodium octanesulfonate

- long alkyl chain ion pair reagent as sodium dodecylsulfate, hexadecyl

trimethyl ammonium bromide : surfactant properties and CMC

‘surfactant’ or ‘soap’ chromatography

2 proposed mechanisms :

- first model : ion pairs formed in mobile phase nonionic moieties

with the same behavior than other molecules in RPLC (distribution

between stationary and mobile phase)

SM + CIM (CI-S)M

SM + CIS (CI-S)S

S : solute

CI : counterion

VÍ DỤ

Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN II- Classification of HPLC modes

Most common ionic sites (cation and anion types) :

Cation exchanger Anion exchanger

Strongly acidic weakly acidic

sulfonate

--SO3-

sulfopropryl (SP):

--CH2CH2CH2SO3-

carboxylic

--CO2-

Carboxymethyl (CM)

--CH2CO2-

Strongly basic weakly basic

IVry ammonium I, II, III protonated

amine--NR3

+

triethylmammonium

--N(CH3)3+

Diethylaminoethyl (DEAE)

--CH2CH2N+H(CH2CH3)2

--N+HR2

Limit of usable pH for weak exchangers :

- 6 for cation resins

- 8 for anion resins

Capacity of resins determined by number of ionic sites on the resin: typical

values 2-5 mequiv/g small enough samples

2.3. Thiết bị trong sắc ký lỏng và sắc ký lỏng cao áp

THIẾT BỊ HPLC

DUNG MÔI

• Tất cả các dung môi trong HPLC phải là dạng “grade”.

• Khi sử dụng phải lọc qua cục lọc 0.2m

• Việc lọc sạch dung môi giúp kéo dài tuổi thọ của cột và bơm.

• Đuổi khí trước khi sử dụng, vì các bọt khí khi qua cột và detector sẽ gặp vấn đề

BỘ TIÊM MẪU(INJECTOR)

• syringe: kim tiêm

• Loop

• injector

SYRINGE

LOOP

LOOP

INJECTOR

LOAD (the sample loop)

Inject (move the sampleloop into the mobilephase flow)

INJECTOR

INJECTOR

CỘT BẢO VỆ (GUARD COLUMN)

CỘT PHÂN TÍCH

CÁC LOẠI CỘT

BƠM CAO ÁP

DETECTOR HPLC

Electrochemical

8%Others

5%Refractive

Index 5%

DETECTOR UV-VIS

DETECTOR HUỲNH QUANG

DETECTOR DAD

DETECTOR MS

2.4. Ứng dụng của sắc ký lỏng