Chronic Swelling and Abnormal Chronic Swelling and Abnormal MyelinationMyelination

during Secondary Degeneration during Secondary Degeneration after Partial Injuryafter Partial Injury

to a Central Nervous System Tractto a Central Nervous System TractSophie C. Payne,1,2 Carole A. Bartlett,1,2 Alan R. Sophie C. Payne,1,2 Carole A. Bartlett,1,2 Alan R.

Harvey,1,3 Sarah A. Dunlop,1,2 and Melinda Fitzgerald1,2Harvey,1,3 Sarah A. Dunlop,1,2 and Melinda Fitzgerald1,2

JOURNAL OF NEUROTRAUMA 28:1077–1088 (June 2011)JOURNAL OF NEUROTRAUMA 28:1077–1088 (June 2011)Factor de impacto de la revista en su área: 1,6Factor de impacto de la revista en su área: 1,6

ÍndiceÍndice

1)1) AntecedentesAntecedentes2)2) HipótesisHipótesis3)3) MetodologíaMetodología4)4) ResultadosResultados5)5) ConclusionesConclusiones6)6) CríticaCrítica

ÍndiceÍndice

1)1) AntecedentesAntecedentes2)2) HipótesisHipótesis3)3) MetodologíaMetodología4)4) ResultadosResultados5)5) ConclusionesConclusiones6)6) CríticaCrítica

Lesión primariaLesión primaria

Degeneración Degeneración secundariasecundaria

Lesión parcial del Lesión parcial del SNCSNC

Transepción parcial del nervio Transepción parcial del nervio ópticoóptico

Seccionar la cara dorsal Seccionar la cara dorsal del nervio óptico (lesión del nervio óptico (lesión primaria), y estudiar los primaria), y estudiar los axones separados de la axones separados de la

lesión primaria. lesión primaria.

Neurotoxicidad Neurotoxicidad del glutamatodel glutamato

Degeneración Degeneración secundariasecundaria

Pérdida de la homeostasis iónicaPérdida de la homeostasis iónica

Flujo tóxico de calcio intracelularFlujo tóxico de calcio intracelular

Disfunción mitocondrialDisfunción mitocondrial

Agotamiento de la energíaAgotamiento de la energía

Estrés oxidativo de la energíaEstrés oxidativo de la energía

Formación de radicalesFormación de radicales

ÍndiceÍndice

1)1) AntecedentesAntecedentes

2)2) HipótesisHipótesis3)3) MetodologíaMetodología4)4) ResultadosResultados5)5) ConclusionesConclusiones6)6) CríticaCrítica

2) Hipótesis2) Hipótesis

La degeneración secundaria aumenta, no solo la La degeneración secundaria aumenta, no solo la desmielinización, sino también aumenta la desmielinización, sino también aumenta la mielinización anormal.mielinización anormal.

ÍndiceÍndice

1)1) AntecedentesAntecedentes

2)2) HipótesisHipótesis3)3) MetodologíaMetodología4)4) ResultadosResultados5)5) ConclusionesConclusiones6)6) CríticaCrítica

3) Metodología3) MetodologíaProcedimientos animales y quirúrgicos:Procedimientos animales y quirúrgicos:

Transección parcial del nervio óptico: Transección parcial del nervio óptico: •Se tomaron ratas de 150-200 g.Se tomaron ratas de 150-200 g.•Se anestesian con 50 mg/kg de clorhidrato de ketamina y 10 Se anestesian con 50 mg/kg de clorhidrato de ketamina y 10 mg/kg de clorhidrato de xilazina. mg/kg de clorhidrato de xilazina. •Exposición del nervio óptico derecho para hacer una incisión Exposición del nervio óptico derecho para hacer una incisión dorsal reproducible, a 200 micras de profundidad, y a 1 mm por dorsal reproducible, a 200 micras de profundidad, y a 1 mm por detrás del ojo. detrás del ojo.

PerfusiónPerfusión Microscopia Microscopia electroonicaelectroonica

InmunohistoquimicaInmunohistoquimica

ControlControl 33 33 5-65-6A 1 mes A 1 mes 33 33 5-65-6A 3 mesesA 3 meses 33 33 5-65-6

3) Metodología3) MetodologíaMicroscopía electronica de transmisión Microscopía electronica de transmisión

Preparación del tejido Preparación del tejido 1)1)Perfusión del tejido.Perfusión del tejido.2)2)Fijación con 1% de osmio durante 90 minutos en agitación. Fijación con 1% de osmio durante 90 minutos en agitación. 3)3)Deshidratada con series de etanol y óxido de propileno.Deshidratada con series de etanol y óxido de propileno.4)4)Curación con resina epoxi 24 h.Curación con resina epoxi 24 h.5)5)Secciones transversales de 1 Secciones transversales de 1 m a intervalos de 50 m a intervalos de 50 m. m. 6)6)Desplastificación con solución saturada de NaOH en etanol.Desplastificación con solución saturada de NaOH en etanol.7)7)Tinción durante 15-30 seg a 95 ° C en solución acuosa al 1% Tinción durante 15-30 seg a 95 ° C en solución acuosa al 1% de azul de toluidina en un 1% de bórax .de azul de toluidina en un 1% de bórax .8)8)Identificación y evaluación de la sección con amplificación Identificación y evaluación de la sección con amplificación de 20 x.de 20 x.9)9)Cuantificación con Cuantificación con Image JImage J. . 10)10)Análisis de varianza (ANOVA) y test de Bonferroni-Dunn Análisis de varianza (ANOVA) y test de Bonferroni-Dunn con un nivel de significación de p ± 0,05. con un nivel de significación de p ± 0,05. 11)11)Los cortes ultrafinos (100 nm) fueron teñidas con acetato Los cortes ultrafinos (100 nm) fueron teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo y montado en redes de cobre.de uranilo y citrato de plomo y montado en redes de cobre.

Análisis de axones y mielinaAnálisis de axones y mielina1)1)Se analizaron axones dentro de 5 campos de visión en el Se analizaron axones dentro de 5 campos de visión en el N.O. central y 5 campos de visión en el N.O. ventral.N.O. central y 5 campos de visión en el N.O. ventral.2)2)Toma de imágenes con una magnificación de 5800x.Toma de imágenes con una magnificación de 5800x.3)3)Calculo de los espesores de la vaina de mielina, mediante Calculo de los espesores de la vaina de mielina, mediante la relación g con la ayuda la relación g con la ayuda Image JImage J. . 4)4)Calcula del cociente g. Calcula del cociente g. 5)5)Los datos se expresaron como el error estándar de la Los datos se expresaron como el error estándar de la media. Las diferencias entre el grupos se determinó media. Las diferencias entre el grupos se determinó mediante un ANOVA y con test de Bonferroni-Dunn con un mediante un ANOVA y con test de Bonferroni-Dunn con un nivel de significación de p ± 0,05. nivel de significación de p ± 0,05. 6)6)Los ANOVAS se constrastaron con la prueba F, usando Los ANOVAS se constrastaron con la prueba F, usando Statview.Statview.

3) Metodología3) MetodologíaLa inmunohistoquímica y la tinción con FluoromyelinLa inmunohistoquímica y la tinción con Fluoromyelin

1) Fijación en paraformaldehído al 4% durante la noche. Crioprotección por 1) Fijación en paraformaldehído al 4% durante la noche. Crioprotección por inmersión en sacarosa al 15% en PBS. inmersión en sacarosa al 15% en PBS. 2) Inmunohistoquímica: Se secaron al aire las secciones, se rehidrataron en 2) Inmunohistoquímica: Se secaron al aire las secciones, se rehidrataron en PBS durante 5 min y con PBS con 0,2% de Triton-X100 durante 10 min. PBS durante 5 min y con PBS con 0,2% de Triton-X100 durante 10 min. Incubar durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario. Visualizó con un Incubar durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario. Visualizó con un anticuerpo secundario de anti-conejo Alexa Fluor 488.anticuerpo secundario de anti-conejo Alexa Fluor 488.3) Tinción con verde de Fluoromyelin de las muestras: rehidratandolas con 3) Tinción con verde de Fluoromyelin de las muestras: rehidratandolas con PBS, e incubandose en PBS + 0,2% de Triton-X100 durante 20 minutos. A PBS, e incubandose en PBS + 0,2% de Triton-X100 durante 20 minutos. A continuación, en fluoromyelin (1:300 en PBS + 0,2% de Triton-X100) durante continuación, en fluoromyelin (1:300 en PBS + 0,2% de Triton-X100) durante 20 minutos y se enjuagó 3 veces, durante 10 min cada vez, en PBS. 20 minutos y se enjuagó 3 veces, durante 10 min cada vez, en PBS. •Las muestras se vieron usando microscopía de fluorescencia. Las muestras se vieron usando microscopía de fluorescencia. •Se hicieron controles, sólo con el anticuerpo secundario. Se obtubo una Se hicieron controles, sólo con el anticuerpo secundario. Se obtubo una fluorescencia mínima.fluorescencia mínima.•Cuantificación con ImageJ. Datos se expresaron mediante medias, ANOVA y Cuantificación con ImageJ. Datos se expresaron mediante medias, ANOVA y test Bonferroni-Dunn, con un nivel de significación del p ± 0,005test Bonferroni-Dunn, con un nivel de significación del p ± 0,005

3) Metodología3) MetodologíaLa cuantificación de los axones mielinizados, amielínicas, y La cuantificación de los axones mielinizados, amielínicas, y

anormalmente mielinizadas-anormalmente mielinizadas-Las imágenes TEM se utilizaron para cuantificar y clasificar los Las imágenes TEM se utilizaron para cuantificar y clasificar los

axones y los grados de mielinización anormal.axones y los grados de mielinización anormal.

Tipo de Tipo de axones axones

Grados de mielinización anormalGrados de mielinización anormal CompactaciónCompactación ImagenImagen

Clase 1Clase 1 Ligeramente mielinizadosLigeramente mielinizados CompactoCompacto Baja electrodensidadBaja electrodensidad(apariencia gris)(apariencia gris)

Clase 2 Clase 2 Mielinizados: Mielinizados: vaina formada por vaina formada por multipes capas finas de mielinamultipes capas finas de mielina

DescompactadosDescompactados Moderada electrodensidadModerada electrodensidad

Clase 3Clase 3 Mielinizados: Mielinizados: Una proporción del Una proporción del axón está envuelto en una capa axón está envuelto en una capa espesa de mielina. espesa de mielina.

Parcialmente Parcialmente descompactadosdescompactados

Alta electrodensidadAlta electrodensidad

Clase 4Clase 4 Excesivamente-mielinizadasExcesivamente-mielinizadas Capa muy gruesa y Capa muy gruesa y compactacompacta

Alta electrodensidad Alta electrodensidad (apariencia oscura)(apariencia oscura)

ÍndiceÍndice

1)1) AntecedentesAntecedentes2)2) HipótesisHipótesis3)3) MetodologiaMetodologia

4)4) ResultadosResultados5)5) ConclusionesConclusiones6)6) CriticaCritica

4) Resultados4) ResultadosÁrea de sección transversal del nervio óptico después de la Área de sección transversal del nervio óptico después de la

transección parcialtransección parcial

4) Resultados4) ResultadosDiámetro del axón, espesor de la mielina, y la relación g de Diámetro del axón, espesor de la mielina, y la relación g de

axones vulnerables a la degeneración secundariaaxones vulnerables a la degeneración secundaria

4) Resultados4) ResultadosDisminución de la mielina en el nervio óptico vulnerable a la Disminución de la mielina en el nervio óptico vulnerable a la

degeneración secundariadegeneración secundaria

4) Resultados4) ResultadosDensidad de axones normalmente mielinizadas y el aumento de Densidad de axones normalmente mielinizadas y el aumento de

los axones anormalmente mielinizadas vulnerables a la los axones anormalmente mielinizadas vulnerables a la degeneración secundariadegeneración secundaria

Clase 1Clase 1

Clase 2Clase 2

Clase 3Clase 3

Clase 4Clase 4

4) Resultados4) ResultadosDensidad de axones normalmente mielinizadas y el aumento de Densidad de axones normalmente mielinizadas y el aumento de

los axones anormalmente mielinizadas vulnerables a la los axones anormalmente mielinizadas vulnerables a la degeneración secundariadegeneración secundaria

PoblaciónPoblación Densidad de Densidad de población población total total axons/mmaxons/mm2 2 (p (p ±± 0,05 0,05))

Axones Axones mielinizados mielinizados normalmente normalmente

Axones mielinizados anormalmente Axones mielinizados anormalmente Clase 1Clase 1 Clase 2Clase 2 Clase 3Clase 3 Clase 4Clase 4 Axones Axones

desmili-desmili-nizadosnizados

TotalTotal

ControlControl 673.612 673.612 ±± 49.61849.618

96,7%96,7% 1,6%1,6% 0,2%0,2% 0,5%0,5% 0,1%0,1% 0,9%0,9% 3,3%3,3%

1 mes1 mes 447.912 447.912 ± ± 64.19264.192

90%90% 3,9%3,9% 0,4%0,4% 0,7%0,7% 1,0%1,0% 3,6%3,6% 10%10%

3 meses3 meses 423.112 423.112 ± ± 45.23445.234

85%85% 1,9%1,9% 1,9%1,9% 8,5%8,5% 0,3%0,3% 2,3%2,3% 15%15%

Índice

1)1) AntecedentesAntecedentes2)2) HipótesisHipótesis3)3) MetodologiaMetodologia4)4) ResultadosResultados

5)5) ConclusionesConclusiones6)6) CriticaCritica

5) Conclusiones5) Conclusiones• La transección parcial del nervio óptico da lugar a la La transección parcial del nervio óptico da lugar a la

inflamación de la lesión primaria dorsal. inflamación de la lesión primaria dorsal. • En la zona vulnerable a la degeneración secundaria se reduce la En la zona vulnerable a la degeneración secundaria se reduce la

mielina debido a la pérdida de axones, y aumentan las mielina debido a la pérdida de axones, y aumentan las anomalías en la vaina y su compactación. Esto contribulle a la anomalías en la vaina y su compactación. Esto contribulle a la perdida crónica de función.perdida crónica de función.• El aumento del diámetro de axón obserbado a los 3 meses El aumento del diámetro de axón obserbado a los 3 meses

indica inflamación.indica inflamación.• De todos los axones sobreviven mejor los que tienen calibres De todos los axones sobreviven mejor los que tienen calibres

grandes.grandes.

5) Conclusiones5) Conclusiones• La falta de una disminución significativa de la MBP a los 3 meses (en La falta de una disminución significativa de la MBP a los 3 meses (en

contraste con la tinción Fluoromyelin), puede ser debido a alteraciones en contraste con la tinción Fluoromyelin), puede ser debido a alteraciones en la inmunorreactividad con la descompactación.la inmunorreactividad con la descompactación.

• Un hallazgo importante es la demostración del aumento de anomalías en la Un hallazgo importante es la demostración del aumento de anomalías en la mielina a medida que progresa la degeneración secundaria, con un mielina a medida que progresa la degeneración secundaria, con un aumento crónico en la mielina parcialmente descompactada.aumento crónico en la mielina parcialmente descompactada.

5) Conclusiones5) Conclusiones

•Se ha demostrado que la Se ha demostrado que la inflamación del axón, junto inflamación del axón, junto con mayores anomalías en con mayores anomalías en la mielina contribuyen a la la mielina contribuyen a la disfunción crónica del disfunción crónica del nervio óptico dañado. nervio óptico dañado.

ÍndiceÍndice

1)1) AntecedentesAntecedentes2)2) HipótesisHipótesis3)3) MetodologíaMetodología4)4) ResultadosResultados5)5) ConclusionesConclusiones

6)6) CríticaCrítica

6) Crítica6) Crítica• Le confiere demasiada importancia en la pérdida de Le confiere demasiada importancia en la pérdida de

función, en la degeneración secundaria, a las función, en la degeneración secundaria, a las anomalias de la mielina y muy poco a la muerte de las anomalias de la mielina y muy poco a la muerte de las neuronas.neuronas.

¡¡¡Muchas gracias por su ¡¡¡Muchas gracias por su atención!!!atención!!!