CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE … · 2 chromatographie liquide haute performance hplc technique de...

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1 CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE (CLHP HPLC) PREMIERE PARTIE GENERALITES APPAREILLAGE NOTIONS FONDAMENTALES TECHNIQUES CLHP LES PLUS UTILISEES - Chromatographie d’adsorption - Chromatographie de partage - Chromatographie d’échange d’ions - Chromatographie par appariement d’ions NOUVEAUX DEVELOPPEMENTS DEUXIEME PARTIE ETUDE DES CAS

Transcript of CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE … · 2 chromatographie liquide haute performance hplc technique de...

1

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE

LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE

(CLHP – HPLC)

PREMIERE PARTIE

GENERALITES

APPAREILLAGE

NOTIONS FONDAMENTALES

TECHNIQUES CLHP LES PLUS UTILISEES

- Chromatographie d’adsorption

- Chromatographie de partage

- Chromatographie d’échange d’ions

- Chromatographie par appariement d’ions

NOUVEAUX DEVELOPPEMENTS

DEUXIEME PARTIE

ETUDE DES CAS

2

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

HAUTE PERFORMANCE

HPLC

TECHNIQUE DE SEPARATION DES COMPOSES

EN SOLUTION.

INTERET

- TECHNIQUE NON DESTRUCTIVE

/ PERMET D'ISOLER, DE PURIFIER

DES PRODUITS.

/ ANALYSE DE COMPOSES:

- FORTEMENT POLAIRES

- P.M. ELEVE

- SYSTEME SOUVENT FACILEMENT

AUTOMATISABLE

LIMITE

SENSIBILITE DES DETECTEURS

SAUF SI COUPLAGE AVEC LA

SPECTROMETRIE DE MASSE.

3

LES COMPOSES A SEPARER SONT REPARTIS

ENTRE 2 PHASES.

- UNE PHASE DITE STATIONNAIRE

CONSTITUEE PAR UN ‘’LIT’’ DE MATERIAUX.

- UNE PHASE DITE ’’MOBILE’’ QUI S’INFILTRE

AU TRAVERS DE LA PREMIERE.

LE PROCESSUS CHROMATOGRAPHIQUE

PHENOMENES D’ADSORPTIONS ET DE

DESORPTIONS REPETES.

GENERALITE

4

APPAREILLAGE

SYSTEME ISOCRATIQUE

PHASE MOBILE

POMPE

INJECTEUR

COLONNE

DETECTEUR

TRAITEMENT DES DONNEES

SYSTEME A GRADIENT D’ELUTION

PHASE MOBILE A PHASE MOBILE B

POMPE A POMPE B

PROGRAMMATION DU GRADIENT CHAMBRE DE MELANGE

INJECTEUR

5

PHASE MOBILE

RÔLE ACTIF DANS LE MECANISME DE

SEPARATION

SON CHOIX DEPEND :

- DU TYPE DE CHROMATOGRAPHIE

- DE LA POLARITE DES COMPOSES ETUDIES

- DU TYPE DE DETECTEUR UTILISE

- CONSTITUEE PAR UN OU PLUSIEURS ELEMENTS

- COMPOSITION :

/FIXE : SYSTEME ISOCRATIQUE

/MODIFIEE EN FONCTION DU TEMPS :

SYSTEME A GRADIENT D’ELUTION.

6

PHASE STATIONNAIRE

SON CHOIX DEPEND DE LA TECHNIQUE

CHROMATOGRAPHIQUE UTILISEE.

- LE PLUS SOUVENT PARTICULES

/ DE SILICE SEULES

/ DE SILICE ’’GREFFEES’’

- IMPORTANCE DE LA GRANULOMETRIE

(’’FINESSE’’) DES PARTICULES.

A DEBIT IDENTIQUE DES PARTICULES PLUS

’’FINES’’ LA RESOLUTION ET LE SEUIL

DE DETECTION.

7

NOTIONS FONDAMENTALES

A-) TEMPS DE RETENTION (T.R.)

- SEPARATION DES COMPOSES EN FONCTION

DU TEMPS

tR

t'R

tM

Inj.temps

Produitnon retenu

LE T.R. PEUT-ÊTRE DIVISE EN DEUX TERMES tM ET

t'R.

t'R = tR - tM

t'R = T.R. REDUIT = TEMPS DE SEJOUR D'UN

COMPOSE DANS LA PHASE STATIONNAIRE.

tM = TEMPS DE SEJOUR DANS LA PHASE MOBILE

8

B - FACTEUR DE CAPACITE

° PERMET D’EXPRIMER LE TEMPS DE

“FIXATION” “D’ADSORPTION”, SUR LA PHASE

STATIONNAIRE, DES DIFFERENTS COMPOSES

D’UN MELANGE.

kt

t

t t

t

R

M

R M

M

''

EN PRATIQUE :

1 < k’ <10

9

C - CARACTERISTIQUES D’UN PIC -NOTION

DE PLATEAUX THEORIQUES -

tR

: LARGEUR DU PIC A LA BASE

: LARGEUR DU PIC A MI-HAUTEUR

° NOMBRE DE PLATEAUX THEORIQUES :

ntR

16

2

OU

ntR

5 545

2

,

° UN PIC PEUT - ÊTRE CARACTERISE / PAR SON T.R.

/ PAR SA SURFACE

/ PAR SA HAUTEUR

10

D -SEPARATION

° LA SEPARATION DE DEUX PICS ADJACENTS

PEUT-ÊTRE CARACTERISEE PAR DEUX

PARAMETRES :

- FACTEUR DE SELECTIVITE ()

- RESOLUTION (R)

1)- FACTEUR DE SELECTIVITE

t'R(B)

t'R(A)

t M

A B

t

tempsInj.

produitnon retenu

t

t

k

k

R B

R A

B

A

'

'

'

'

( )

( )

11

12

2-) RESOLUTION

- SEPARATION REELLE DES PICS.

- NOTION DE “FINESSE” DES PICS ET

D’EFFICACITE DE LA COLONNE.

POUR UN FACTEUR DE SELECTIVITE IDENTIQUE

LA RESOLUTION PEUT - ÊTRE DIFFERENTE :

produitnon retenu

produitnon retenu

produitnon retenu

Inj.

Inj.

Inj.

t

1 2

2

21

1

temps

2121

2

2)(

ttR

Faible efficacité

Grande efficacité

13

TECHNIQUES CLHP

LES PLUS UTILISEES

- CHROMATOGRAPHIE D'ADSORPTION.

- CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE.

- CHROMATOGRAPHIE D'ECHANGE D'IONS.

- CHROMATOGRAPHIE PAR APPARIEMENT

D'IONS.

14

CHROMATOGRAPHIE

D'ADSORPTION

PHASES STATIONNAIRES AYANT DES

PROPRIETES ADSORBANTES :

- GELS DE SILICE

- " D'ALUMINE

SEPARATION DE COMPOSES DE

POLARITE FAIBLE OU MOYENNE.

AVEC LES COMPOSES POLAIRES OU

TRES POLAIRES L'ADSORPTION EST

SOUVENT IRREVERSIBLE.

15

STRUCTURE DES GELS DE SILICE

SILICE = DIOXYDE DE SILICIUM QUI SE

PRESENTE SOUS DIFFERENTES FORMES :

Si

OH

O Si

OH

Si

O

O Si

O

H H

Si O Si

O

Si

O

O Si

O

HH

O

H

H

Si

O

O Si

O

HH

H

OH

O

H

H

OH

H

SILANOLS LIBRES SILANOLS LIES

SILANOLS LIBRES HYDRATES

PONT SILOXANE

SILANOLS FORTEMENT HYDRATES

16

MECANISME

° SUITE DE PROCESSUS D’ADSORPTION-DESORPTION.

S(P.M.) + M(a) S(a) + M(P.M.)

S = SOLUTE , M = PHASE MOBILE

EXEMPLE :

O

Si

OH

O

H

H2N R

O C

CH3

CH3

(P.M.)

Si

(S)

- L’ECHANTILLON (S) ADSORBE SUR UN Si-OH EST

HEURTE EN CONTINU PAR LES MOLECULES DE

PHASE MOBILE (P.M.) .

L’ENERGIE A FOURNIR DOIT-ÊTRE SUFFISANTE

POUR DELOGER L’ECHANTILLON ADSORBE ET

L’ENTRAINER JUSQU’A UN GROUPEMENT Si-OH

VOISIN.............

- (S) DOIT AVOIR UNE POLARITE VOISINE DE CELLE

DE (P.M.) .

17

PHASE MOBILE

SOLVANTS APOLAIRES

/ HEXANE

/ ISO-OCTANE

/ CYCLOHEXANE........EN MELANGE

AVEC DES SOLVANTS:

- ACCEPTEURS DE PROTONS

/ ETHER n-BUTYLIQUE

/ " ISOPROPYLIQUE

- DONNEURS DE PROTONS

/ CHLOROFORME

/ FLUOROALCOOLS

- DONNANT DES INTERACTIONS DIPOLAIRES

/ DICHLOROMETHANE

/ DICHLORO-1,2 ETHANE

SOLVANTS UTILISES EN MELANGES BINAIRES OU

TERNAIRES AVEC UNE FAIBLE PROPORTION

DE SOLVANTS POLAIRES : METHANOL ,

ACETONITRILE

18

SOLVANT

NON POLAIRE

-HEXANE

CHOIX D'UNE PHASE MOBILE

SOLVANT DE

POLARITE MOYENNE

-ACETATE D'ETHYLE

SOLVANT

POLAIRE

-METHANOL

MELANGE PRIMAIRE

SOLVANT A

HEXANE

+

ACETATE D'ETHYLE

MELANGE PRIMAIRE

SOLVANT B

ACETATE D'ETHYLE

+

METHANOL

MELANGE TERNAIRE

(FORCE ELUANTE VARIABLE)

HEXANE / ACETATE D’ETHYLE / METANOL

50% 50% 50% 50%

EXEMPLE :

19

EXEMPLE :

° SEPARATION DE 7 DERIVES DE LA

PHENOTHIAZINE.

O

N

H

- PHASE MOBILE:

/ SOLVANT A = 65% [ISO-OCTANE (50%) +

ETHER ISOPROPYLIQUE (50%) +

TRIETHYLAMINE 0,2 %]

/ SOLVANT B = 35% [ETHER ISOPROPYLIQUE

(50%) + METHANOL (50%) +

TRIETHYLAMINE 0,2%]

- COLONNE : SILICE TYPE SPHEROSIL 6-7 um

(L:15 cm x DI:0,6 cm), DEBIT: 1 ml/min.

20

° DOSAGE DU 5-FU.

N

N

O

O

H F

H

- PHASE MOBILE:

/ SOLVANT A = 75% [HEXANE] + AMMONIAQUE: 1%

/ SOLVANT B = 25% [ETHANOL] + AMMONIAQUE:1%

-COLONNE : SILICE TYPE PORASIL 10 m

(L:30 cm x DI:0,39 cm), DEBIT: 1 ml/min.

INJECTION : 1 g

5-FU5-BrU

5-FU5-BrU

6.44 7.48A B

21

DOSAGE DU 5-FU.

N

N

O

O

H F

H - PHASE MOBILE:

/ SOLVANT A = 21% [HEXANE

(50%) + ETHER ISOPROPYLIQUE (50%)

+ TRIETHYLAMINE 0,05 %]

/ SOLVANT B = 79% [ETHER

ISOPROPYLIQUE (50%) + METHANOL

(50%) + TRIETHYLAMINE 0,05%]

- COLONNE : SILICE TYPE

LICHROSPHER Si 60 5m (L:25 cm x DI:0,4

cm), DEBIT: 1 ml/min.

INJECTION : 50 ng

8.79

22

CHROMATOGRAPHIE

DE PARTAGE

LA SEPARATION DEPEND DES DIFFERENCES DE

SOLUBILITE DES SOLUTES DANS LA PHASE MOBILE

ET DES DIFFERENTES INTERACTIONS DES SOLUTES

AVEC LES GROUPEMENTS ORGANIQUES GREFFES SUR

LA PHASE STATIONNAIRE.

ON DISTINGUE :

- LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE "NORMALE "

AVEC PHASE STATIONNAIRE POLAIRE ET PHASE

MOBILE APOLAIRE OU PEU POLAIRE.

- LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE A POLARITE DE

PHASE STATIONNAIRE INVERSEE (APOLAIRE) ET PHASE

MOBILE POLAIRE.

23

PHASE STATIONNAIRE

- PHASES NORMALES

O

Si

O

NH2

O

Si

O

(CH2)3 NH2

O

Si

O

O

Si

O

C N C N

O

Si

O

(CH2)3

O

Si

O

(CH2)3 O CH2 CH CH2

OH

OH

; ;

; ;

- PHASES INVERSEES

O

Si

O

C8H17

O

Si

O

C18H37

OCTADECYLEOCTYLE

;

24

PHASE STATIONNAIRE “NORMALE”

O

Si

O

NH2

O

Si

O ...............

- PHASE MOBILE

/ SOLVANTS APOLAIRES :

- HEXANE, ISO-OCTANE.......

+

/ SOLVANTS PEU POLAIRES OU POLAIRES: - CHCl3, CH2Cl2, THF, ETHANOL, METHANOL

ACETONITRILE......

SOLVANTS POLAIRES = MODIFICATEURS POLAIRES

° LE T.R. LORSQUE LE % EN SOLVANT POLAIRE .

° L’ORDRE D’ELUTION DEPEND DE LA POLARITE DES

SOLUTES:

LE T.R. AVEC UNE DE LA POLARITE

DU PRODUIT ETUDIE.

25

PHASE STATIONNAIRE INVERSEE

O

Si

O

C8H17

O

Si

O

C18H37;

- PHASE STATIONNAIRE APOLAIRE

- PHASE MOBILE POLAIRE

° ‘’SOLVATATION’’ DES CHAINES ALKYLE DE LA

PHASE STATIONNAIRE PAR LE SOLVANT

ORGANIQUE DE LA PHASE MOBILE :

UN LIQUIDE VISQUEUX DANS LEQUEL

LES SOLUTES PEUVENT DIFFUSER.

° LES SOLUTES PEUVENT INTERAGIR:

-AVEC LE SOLVANT ORGANIQUE DE LA

PHASE MOBILE,

-AVEC LES CHAINES ALKYLE DE LA

PHASE STATIONNAIRE.

/ SOLUTES APOLAIRES, SURTOUT, EN INTERACTION

AVEC LES CHAINES ALKYLE.

/ SOLUTES POLAIRES, PLUTÔT, EN INTERACTION

AVEC LE SOLVANT ORGANIQUE DE LA PHASE

MOBILE.

26

MECANISME

EXEMPLE:

- PHASE STATIONNAIRE: C18

- PHASE MOBILE: H2O/MeOH

- SOLUTE:

/ SOLUTE PLUTÔT APOLAIRE SURTOUT EN

INTERACTION AVEC LES CHAINES C18.

- DU % EN MeOH DONNE DE LA

SOLUBILITE DANS LA PHASE MOBILE,

DONC DES INTERACTIONS AVEC LE

SOLVANT ORGANIQUE CE QUI CONDUIT A

UNE DU T.R.

- INVERSEMENT UNE DU % EN H2O

CONDUIT A UNE DU T.R.

D’OU :

COMPOSES POLAIRES ELUES AVANT

COMPOSES APOLAIRES.

27

- RÔLE DE LA PHASE STATIONNAIRE

° LE T.R. ET LE k’ AVEC LE NOMBRE DE

CHAÎNES ALKYLE GREFFEES.

° VARIATION LINEAIRE DU T.R. ET DE k’ AVEC

LA LONGUEUR DE LA CHAÎNE.

- RÔLE DE LA PHASE MOBILE

° GENERALEMENT : MELANGES H2O OU

TAMPON / MeOH, CH3CN, ETHANOL.....

° PARFOIS : AJOUT, EN FAIBLE PROPORTION,

D’UN 3ème SOLVANT, LE PLUS SOUVENT, DU

T.H.F. :

FORTE INTERACTION AVEC LES CHAÎNES

ALKYLE - MODIFICATION DE LA FORCE

D’ELUTION -.

28

RÔLE DU THF

EXEMPLE: SEPARATION DU PHENOL ET DE L’ALCOOL

BENZYLIQUE.

- COLONNE : C18

(30 cm x DI 0,4 cm), 10 m

- PHASE MOBILE : H2O/MeOH (60%/40%) + THF

EN PROPORTION VARIABLE

29

° PLUS LE SOLUTE EST IONISE PLUS LE T.R.

EST FAIBLE (FORTE SOLUBILITE DANS H2O).

° NECESSITE DE CONTROLER LE pH DE LA

PHASE MOBILE SI LES COMPOSES ETUDIES

POSSEDENT DES GROUPEMENTS ACIDES OU

BASIQUES .

/ UN COMPOSE ACIDE SERA ANALYSE A

UN pH = pKa - 2

/ UN COMPOSE BASIQUE SERA ANALYSE A

UN pH = pKa + 2

30

°CHROMATOGRAPHIE DE COMPOSES BASIQUES

‘’TRAINEES’’ EN SORTIE DE PICS, LE PLUS SOUVENT, A CAUSE

D’INTERACTIONS AVEC LES SILANOLS RESIDUELS DES

PHASES STATIONNAIRES.

POUR REDUIRE LE PHENOMENE :

- AGIR SUR LE pH DE LA PHASE MOBILE

(3,5 < pH <5,5) – (SELS DE POTASSIUM 0,01- 0,1 m).

- UTILISER UN MODIFICATEUR TEL QUE

LA DIETHYL OU LA TRIETHYLAMINE (0,05-0,1 M).

31

° EXEMPLE :

MELANGE : o-TOLUIDINE (1)

m-TOLUIDINE (2)

p- TOLUIDINE (3)

a-PHASE MOBILE: H2O/MeOH (40v/60v)

b-PHASE MOBILE : “ “ “ +

TRIETHYLAMINE 1%

32

APPLICATIONS

TRES NOMBREUSES.

LA SIMPLICITE DES PHASES MOBILE

(POLAIRES) UTILISEES ET LA QUALITE DES

SEPARATIONS EXPLIQUENT LE SUCCES DE LA

CLHP AVEC PHASE STATIONNAIRES INVERSEES

C8, C18.

EXEMPLE :

DOSAGE DU DIPYRIDAMOLE

(TRAITEMENT DE CERTAINES AFFECTIONS

CARDIAQUES).

N

N

N

N

N

N

N

N

CH2

CH2H2C

H2

CH2C

CH2

CH2

OH

HO

HO

H2COH

- DETERMINATION DIRECTE A PARTIR DU

PLASMA.

-TEMPS D’ANALYSE COURT: COLONNE C8

-ETALON INTERNE : NAPHTOL

-DETECTION : FLUORIMETRIE

33

-PHASE MOBILE:

H2O [TAMPON pH 7,4 (0,01M)]/CH

3CN

(60v/40v)

-COLONNE : C8 TYPE LICHROSORB RP8 10m

(L: 15 cm x ID : 0,48 cm)

34

CHROMATOGRAPHIE

D'ECHANGE D'IONS

PRINCIPE

- LA PHASE STATIONNAIRE EST UN ECHANGEUR

D'IONS CONSTITUE PAR DES ELEMENTS

PORTANT DES CHARGES EXCEDENTAIRES

POSITIVES OU NEGATIVES.

° CES CHARGES SONT COMPENSEES PAR DES

IONS DE POLARITE OPPOSEE:

IONS - COMPENSATEURS (APPORTES PAR LA PHASE MOBILE).

° CES IONS PEUVENT ÊTRE REMPLACES PAR

DES MOLECULES DE SOLUTE DE MÊME CHARGE.

35

- PHASE STATIONNAIRE :

POLYMERES DE HAUTE MASSE MOLAIRE OU

GEL DE SILICE SUR LESQUELS SONT GREFFES

DES GROUPEMENTS IONIQUES.

° ECHANGEURS DE CATIONS

/ GROUPEMENTS ACIDE SULFONIQUE

(ECHANGEUR FORT)

/ GROUPEMENTS ACIDE CARBOXYLIQUE

( ECHANGEUR FAIBLE)

° ECHANGEURS D’ANIONS

/ GROUPEMENTS AMMONIUM QUATERNAIRE

36

MECANISME

ECHANGEUR DE CATIONS

Si CH2 CH2 SO3

Na+ -

OOCH

H3C CH COOH+NH3

SOLUTE

ION COMPENSATEUR

TAMPON ACIDE pH4

37

ECHANGEUR D’ANIONS

Si CH2

-OH

SOLUTE

ION COMPENSATEUR

TAMPON BASIQUE

pH

CH2 CH2 N

CH2

H3C CH3

+

CH3COO- +

NH4

38

EXEMPLE :

EXTRATION DE GLUCURONOCONJUGUES

(FONCTION COOH)

URINE (O,1-1 ml)

LAVAGE ETHER

ETHYLIQUE

PHASE AQUEUSE

RESINE ANIONIQUECOLONNE (5 x 20 mm)

FIXATIONACIDE FORMIQUE (0,01N)

LAVAGES : CHCl3, H2O, ETHER ETHYLIQUE

ELUTIONCH3COOH (0,3M) DANS METHANOL

EVAPORATION

RESIDU

CLHP

39

CHROMATOGRAPHIE DE

PAIRES IONS

(OU D'INTERACTIONS D'IONS)

ASSOCIATION DE DEUX IONS DE CHARGE OPPOSEE DUE

:

- A DES INTERACTIONS ELECTROSTATIQUES .

- A DES EFFETS HYDROPHOBES

DES IONS ORGANIQUES DE GRANDE TAILLE

COMPORTANT UNE PARTIE APOLAIRE ET UN

GROUPEMENT IONIQUE S'ASSOCIENT EN

''PAIRES D'IONS'' EN SOLUTION AQUEUSE

° UTILISEE POUR CHROMATOGRAPHIER DES

SUBSTANCES IONISEES OU IONISABLES.

40

PRINCIPE

-PHASE STATIONNAIRE :

O

Si

O

C8H17

O

Si

O

C18H37

OCTADECYLEOCTYLE

;

- PHASE MOBILE :

MELANGE :

/ TAMPON (pH APPROPRIE) / MeOH,

ACETONITRILE.......

+ CONTRE - IONS = ION ORGANIQUE

COMPORTANT UNE OU PLUSIEURS

CHAÎNES HYDROPHOBES.

41

EXEMPLE :

A pH 6 - 7 L’ANION D’UN ACIDE CARBOXYLIQUE

RCOO- EN PRESENCE D’UN CATION AMMONIUM

QUATERNAIRE, TETRABUTYL AMMONIUM PAR

EXEMPLE

CH2 CH2 CH2 4 N

+H3C

CONDUIT A LA FORMATION DE “PAIRES D’IONS”

EN PHASE AQUEUSE EN RAISON DU CARACTERE

HYDROPHOBE DU CATION AMMONIUM.

RCOOe-+ Bu4Ne

+RCOO

- +NBu4 RCOO

- +NBu4e a

e = PHASE AQUEUSE

a = PHASE ORGANIQUE

42

43

44

RÔLE :

DE LA PHASE MOBILE, DU CONTRE-IONS,

DE LA PHASE STATIONNAIRE

° LE T.R. DONC LE FACTEUR DE CAPACITE (k’) :

- AUGMENTE ,

/ AVEC LA CONCENTRATION DU CONTRE -IONS .

/ AVEC LA LONGUEUR DE LA CHAÎNE ALKYLE

DU CONTRE - IONS.

/ AVEC LA LONGUEUR DE LA CHAÎNE ALKYLE

DE LA PHASE STATIONNAIRE.

- EST D’AUTANT PLUS ELEVE QUE LE SOLUTE EST

PLUS HYDROPHOBE.

- DIMINUE AVEC UNE AUGMENTATION DU % EN

SOLVANT ORGANIQUE.

45

RÔLE DU pH

° POUR UN COMPOSE ACIDE ON OBTIENDRA LE T.R.

MAXIMUM EN TRAVAILLANT A UN :

pH pKa + 2

° POUR UN COMPOSE BASIQUE ON OBTIENDRA LE T.R.

MAXIMUM EN TRAVAILLANT A UN :

pH pKa - 2

46

IONS COMPENSATEURS LES PLUS UTILISES

- COMPOSES BASIQUES ANALYSES A L’AIDE DE

SELS SODIQUES D’ALCOYLSULFONATE.

EXEMPLE :

° HEPTANE SULFONATE DE SODIUM

C7H15SO3

- Na

+

- COMPOSES ACIDES ETUDIES AVEC DES

PHOSPHATES OU DES NITRATES D’AMMONIUM

TETRABUTYLE.

EXEMPLE :

° TETRABUTYLAMMONIUM NITRATE

CH2 CH2 CH2 4 N

+ NO3

-H3C

° CONCENTRATION EN IONS COMPENSATEURS DE

0,003 M A 0,05 M.

47

EXEMPLE :

DOSAGE DE GLUCURONOCONJUGUES DE

BENZODIAZEPINES (METABOLITES DE PHASE II).

STRUCTURES :

N

NO

Cl

CH3

O

O

HO

OH

OH

COOH

N

NO

Cl

O

HO

OH

OH

COOH

H2C

H2C O

F

A

B

48

° CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

- PHASE MOBILE:

H2O (TAMPON pH 4,6 [NaH

2PO

4 (0,025 M)]/MeOH

(60v/40v).

-COLONNE : C18

TYPE BONDAPAK 10 m

(L:25 cm x DI:0,46 cm), DEBIT: 1 ml/min.

EXTRACTION A PARTIR DE 2 ml D’URINE

A + B + impuretés

49

° CHROMATOGRAPHIE D’APPARIEMENT D’IONS

- PHASE MOBILE:

H2O (TAMPON pH 4,6 [NaH

2PO

4 (0,025 M) + CONTRE

IONS : TBAN (0,0025M)]/MeOH

(60v/40v).

-COLONNE : C18

TYPE BONDAPAK 10 m

(L:25 cm x DI:0,46 cm), DEBIT: 1 ml/min.

EXTRACTION A PARTIR DE 2 ml D’URINE

A

B

50

ANALYSE QUANTITATIVE

EN CLHP

°ESSENTIELLEMENT PAR ETALONNAGE INTERNE

° PRECAUTIONS:

- LE SOLVANT D’INJECTION DOIT ASSURER UNE

SOLUBILISATION TOTALE DE L’ECHANTILLON.

- LA SOLUTION INJECTEE

/ DOIT ÊTRE LIMPIDE

/ DOIT ÊTRE COMPATIBLE AVEC LA

PHASE STATIONNAIRE ET LA PHASE

MOBILE.

- IL EST PREFERABLE DE SOLUBILISER

L’ECHANTILLON DANS LA PHASE MOBILE

AVANT INJECTION.

51

° RESULTATS PLUS REPRODUCTIBLES :

- SI ELUTION EN REGIME ISOCRATIQUE.

- ELUTION PAR GRADIENT PRESENTE SOUVENT

LES INCONVENIENTS SUIVANTS :

/ DERIVE DE LA LIGNE DE BASE.

/ APPARITION DE PICS PARASITES DUS AUX

SOLVANTS ET/OU A L’EXTRACTIF.

/ NECESSITE UN REEQUILIBRAGE DE LA

COLONNE AVANT CHAQU’ANALYSE.

- IL EST IMPORTANT DE SELECTIONNER DES

COLONNES MECANIQUEMENT TRES

RESISTANTES ET STABLES DANS LE TEMPS.

STABILITE ET RESISTANCE PAR AJOUT D’UNE

PRECOLONNE.

52

° UNE BONNE STABILITE DE LA PHASE MOBILE EST

INDISPENSABLE .

- TOUTE VARIATION DU DEBIT OU DE LA

COMPOSITION DE LA PHASE MOBILE

ENTRAINE UNE MODIFICATION DU T.R. ET DE

LA FORME DES PICS.

/ VARIATION DANS LA COMPOSITION DE LA

PHASE MOBILE A CAUSE :

- DE LA VOLATILITE D’UN SOLVANT

- DE LA NON-REPRODUCTIBILITE D’UN

GRADIENT D’ELUTION.

53

ANALYSE DES TRACES

QUANTITES ALLANT DE 1 g/ml A QUELQUES pg/ml.

A CE NIVEAU PROBLEMES DUS :

- A LA DETECTION

- A L’ISOLEMENT DES COMPOSES (EXTRACTION)

- AUX INTERFERENCES ( PRODUITS ENDOGENES....)

LA QUANTITE MINIMALE DETECTABLE DEPEND :

- DE LA SENSIBILITE DU DETECTEUR

- DE LA DILUTION APPORTEE PAR LA COLONNE

CONDITIONS IDEALES :

- T.R. FAIBLE AVEC UNE COLONNE

/ COURTE

/ DE FAIBLE DI

/ UNE PHASE A GRANULOMETRIE FINE (3 m-1,8m)

- TRAVAILLER AVEC UNE COLONNE CAPILLAIRE.

54

- AMELIORATION DE LA SENSIBILITE

° ANALYSE AVEC DE GRANDS VOLUMES:

INJECTION DE GRANDS VOLUMES SI

SOLVANT DE FORCE ELUANTE > A

CELLE DE LA PHASE MOBILE

MINIMISE LA DILUTION APPORTEE

PAR LA COLONNE.

° PRECONCENTRATION DU SOLUTE

ECHANTILLON EN SOLUTION DANS UN

SOLVANT DE TRES FAIBLE FORCE

ELUANTE QUI DONNE DES T.R. ELEVES.

( H2O SI ON TRAVAILLE EN PARTAGE)

55

NOUVEAUX DEVELOPPEMENTS

-RAPIDE CLHP

-CLHP HAUTE RESOLUTION

COLONNES COURTES ET OU DE FAIBLE DIAMETRE

GRANULOMETRIE : 1,8 µm

PRESSION DE COLONNE : 600 A 1000 BARS

POMPES BINAIRES

SYSTEMES A FAIBLE VOLUME MORT

NOUVELLES APPROCHES

POUR AUGMENTER LA SENSIBILITE

56

RESOLUTION

METHODE UTILISEE:

C18 (150mm4.6[3,5µm])

HAUTE RESOLUTION

C18 (150mm4.6[1,8µm])

57

RAPIDE CLHP

METHODE UTILISEE:

C18 (150mm4.6[3,5µm])

NOUVELLE METHODE

C18 (100mm2.1[1,8µm])

58

N SO3

CH3

CH3

N SO3

CH3

CH3

N SO3

CH3

CH3

-(S

iO)-

COLONNE HILIC (HYDROPHILIC INTERACTION LIQUID

CHROMATOGRAPHY)

COMBINAISON DES CARACTERISTIQUES DES 3 TYPES DE

COLONNES LES PLUS UTILISEES EN CLHP :

- PHASE INVERSE

- PHASE NORMALE

- PHASE IONIQUE

PHASE MOBILE : EAU OU TAMPON LEGER/ACETONITRILE -

METHANOL (PROPORTION ELEVEE EN SOLVANT ORGANIQUE)

NOUVEAUX DEVELOPPEMENTS

59

EXEMPLE : MELANGE URACIL-NAPHTALENE

A

B

A : COLONNE 1254 mm, C18, 3 m

B : COLONNE 1254 mm, HILIC, 3 m

PHASE MOBILE : H2O/ CH3CN; 10v/90v

DEBIT : 1ml/min.

1 : URACIL

2 : NAPHTALENE

60

DETECTEUR DE LA CLHP

- DOIT FONCTIONNER SUR UNE PHASE MOBILE

ANIMEE D’UN MOUVEMENT CONTINU.

- CUVE DE FAIBLE VOLUME : 5 A 10l

- LA RESOLUTION ET LA SEPARATION DONNEES PAR

LA COLONNE DOIVENT ÊTRE CONSERVEES PAR LE

DETECTEUR.

61

° UN BON DETECTEUR DOIT SE CARACTERISER :

- PAR UNE LIGNE DE BASE PLANE, SANS DERIVE

- PAR UN BRUIT DE FOND AUSSI FAIBLE QUE

POSSIBLE.

- LE PLUS PETIT PIC DETECTABLE CORRESPOND

EN GENERAL A UN RAPPORT SIGNAL / BRUIT

DE FOND EGAL A 2d.

d

2d

62

PRINCIPAUX DETECTEURS

A - DETECTEUR UV-VISIBLE

- A LONGUEUR D’ONDE VARIABLE 190-600 nm.

- A BARETTES DE DIODES (190-600 nm).

63

B - DETECTEUR DE FLUORESCENCE

FLUORESCENCE = RAYONNEMENT EMIS PAR

CERTAINS COMPOSES EXCITES PAR UNE

RADIATION LUMINEUSE.

ON ENVOIE UNE LONGUEUR D’ONDE

D’EXCITATION ET ON MESURE L’EMISSION.

(EXCITATION < EMISSION)

FLUORESCENCE NATURELLE SI :

- GROUPEMENTS AROMATIQUES

- DOUBLES LIAISONS FORTEMENT CONJUGUEES

SOUVENT SENSIBILITE 1000 FOIS > A L’UV.

64

° CERTAINS COMPOSES PEUVENT ÊTRE RENDUS

FLUORESCENTS PAR REACTION CHIMIQUE.

EXEMPLE :

COMPOSES POSSEDANT DES FONCTIONS AMINES

PRIMAIRES, SECONDAIRES.

SO2Cl

N

CH3H3C

+ CH

R

H2N

COOH

O2S

N

CH3H3C

CH

R

HN

COOH

O

O

O

O O

O

O

O

OH

N

O

O

CH

R

H2N

COOH

CH

RHN

COOH

HO

CHR

COOH

CHLORURE DE DANSYLE

FLUORESCAMINE

65

C - DETECTEUR ELECTROCHIMIQUE

- TRES SENSIBLE, TRES SELECTIF.

- PRINCIPE :

PHENOMENES D’OXYDATION ET DE

REDUCTION PAR ELECTROLYSE SOUS

L’INFLUENCE D’UN POTENTIEL APPLIQUE

ENTRE DEUX ELECTRODES.

- EXCELLENTS RESULTATS AVEC :

/ LES PHENOLS

/ LES CATECHOLAMINES

/ LES NITROSAMINES

/ LES ACIDES ORGANIQUES

- LIMITES :

- LA PHASE MOBILE :

/ DOIT-ÊTRE RENDUE CONDUCTRICE PAR

AJOUT D’UN SEL, CE QUI EXCLU LA

CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTION.

/ NE DOIT CONTENIR NI OXYGENE NI

CONTAMINANTS METALLIQUES, NI

HALOGENURES QUI LE BRUIT DE FOND.

- LE POTENTIEL DOIT-ÊTRE FAIBLE POUR

EVITER UNE ELECTROLYSE DE LA PHASE

MOBILE.

66

D - DETECTEUR DE RADIOACTIVITE (DETECTEUR DE SCINTILLATION)

-PRINCIPE :

TECHNIQUE DE SCINTILLATION = LUMIERE EMISE

PAR UN COMPOSE PHOSPHORESCENT SOUS

L’INFLUENCE D’UN PHENOMENE IONISANT.

PHOSPHORESCENCE = EMISSION DE LUMIERE PAR

L’EXCITATION DUE A DES RADIATIONS.

A LA DIFFERENCE DE LA FLUORESCENCE NE

PEUT SE FAIRE QUE PAR APPORT D’ENERGIE

EXTERIEURE.

67

UTILISATION DES RADIOELEMENTS

EN PHARMACOCINETIQUE

ETUDE DU METABOLISME

LE MARQUAGE DOIT ÊTRE :

ISOTOPES UTILISES : 3H, 14C, 35S, 32P, 125I

-SPECIFIQUE : SITES DE MARQUAGES PRECIS

ET EXCLUSIFS.

-QUANTITATIF : LE PLUS ELEVE POSSIBLE

ET CONNU AVEC PRECISION.

68

ETUDE DU METABOLISME

1ère ETAPE : INCUBATION DU MEDICAMENT

AVEC DES HEPATOCYTES, DES

MICROSOMES OU DES LIGNEES

CELLULAIRES BIEN DEFINIES.

SOIT UN MEDICAMENT RADIOMARQUE P :

2ème ETAPE : RECUEIL DU MILIEU INTRA ET/OU

EXTRACELLULAIRE.

3ème ETAPE : ANALYSE PAR CLHP.

69

P

M4

M3

M2

M1

INJ

P M1

M2 M3

M4

INJ

P

M1

M2

M3

M4

INJ

30 min

P

INJ

1H

2H

Produit marqué

CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

P

70

RECHERCHE DE METABOLITES DE

GLUCURONOCONJUGAISON

1- CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

2- CHROMATOGRAPHIE PAR APPARIEMENT D ’IONS

(AJOUT DE TBAN A LA PHASE MOBILE)

P

M4

M3

M2

M1

INJ

2H

INJ

M4

M2

M3 M1

P

2H

71

CONFIRMATION DE LA PRESENCE D’UN METABOLITE

DE GLUCURONOCONJUGAISON

- CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

ACTION DE LAb-GLUCURONIDASE

P

M4

M3

M2

M1

INJ

2H

COLLECTE DU PIC

INJ

M2