Chương I: GIỚI THIỆU · Xin cảm ơn các cô và các em ở Bộ môn Bệnh học thủy...

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THU DUNG

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY

BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO

(Pseudapocryptes elongatus)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Cần Thơ, 2016

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THU DUNG

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY

BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO

(Pseudapocryptes elongatus)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

PGS.TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

Cần Thơ, 2016

i

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành các nội dung cơ bản trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố

gắng học hỏi của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ không nhỏ từ nhiều tổ

chức, cơ quan và cá nhân.

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và chân thành biết ơn tới Ban

Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản, quý

thầy, cô Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập,

nghiên cứu và nâng cao trình độ trong thời gian qua.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS. TS Đặng

Thị Hoàng Oanh đã trực tiếp, hướng dẫn, tận tình dìu dắt và đóng góp ý kiến quý

báu để giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Xin cảm ơn các cô và các em ở Bộ môn Bệnh học thủy sản đã nhiệt tình

giúp đỡ tôi trong quá trình học tập cũng như làm đề tài tại Bộ môn. Cám ơn các

em học viên Cao học và các em sinh viên lớp Bệnh học thủy sản đã hỗ trợ tôi

trong quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Sở Nông nghiệp & PTNT, Trung tâm Khuyến

nông Khuyến ngư Bạc Liêu đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành chương trình học

tại Trường Đại học Cần Thơ.

Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp

những người đã góp ý, chia sẻ chân thành, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời

gian hoàn thành khóa học.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và

bạn bè đã tạo mọi điều kiện để tôi vượt qua khó khăn, trở ngại trong suốt quá

trình học tập và làm việc.

TÁC GIẢ

ii

TÓM TẮT

Bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus) đã gây thiệt

hại rất lớn cho người nuôi. Qua kết quả điều tra phỏng vấn trực tiếp 90 hộ nuôi ở

Bạc Liêu cho thấy, mật độ nuôi cá bống kèo dao động từ 100 – 150 con/m2, trong

suốt thời gian nuôi hầu hết các hộ nuôi không thay nước mà chỉ cấp thêm nước,

xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi trường nuôi. Cá tập trung bệnh ở

giai đoạn 02 tháng tuổi với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên thân, tại các vi và

hậu môn với tỉ lệ chết cao và trên diện rộng, ảnh hưởng đến năng suất và lợi

nhuận của người nuôi.

Kết quả phân lập vi khuẩn sau 6 lần thu mẫu đã thu được 252 khuẩn lạc,

tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của vi khuẩn cho thấy vi khuẩn

thu được là vi khuẩn Gram (+), hình tròn, không di động, oxidase và catalase âm

tính. Sau khi tiến hành định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep và phương pháp

giải trình tự gen 16S rRNA đã xác định vi khuẩn gây bệnh là Streptococcus

dysgalactiae. Quy trình PCR sử dụng đoạn mồi STRD-DyI/dys-16S-23S-2 được

chuẩn hóa để chẩn đoán nhanh S. dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống

kèo.

Kết quả xác định liều lượng gây chết LD50 của vi khuẩn là 4,25 x 104

CFU/ml. Vi khuẩn S. dysgalactiae gây bệnh trên cá bống kèo nhạy cao với kháng

sinh florfenicol và doxycycline. Kết quả điều trị trong phòng thí nghiệm cho thấy

khi gây cảm nhiễm cá bống kèo bằng chủng vi khuẩn B1-6T với liều lượng vi

khuẩn 4,25 x 104

CFU/cá, sử dụng 02 loại thuốc kháng sinh florfenicol và

doxycycline ở liều lượng 20 mg thuốc/kg trọng lượng cá, sau 21 ngày theo dõi cả

hai loại kháng sinh trên (ở dạng nguyên liệu và thành phẩm) đều cho tỷ lệ điều trị

đạt cao, tỉ lệ sống của cá đạt từ 65,56 % – 71,11 %, giá trị RPS (%) đạt từ

45,27% – 61,16 %.

iii

ABSTRACT

Hemorrhagic disease has caused huge losses in the cultured mudskipper

(Pseudapocryptes elongates). Result interviewed 90 farmers in Bac Lieu

province showed that the farmers culture mudskipper density from 100-150

fish/m2, almost no change water but they add water in the pond, they use

chemical processing and microbiology for improving farming environment. Fish

concentrate disease stage 02 months old with clinical signs of hemorrhage in the

body, at the fin and anal with a high mortality rate and widespread, affecting the

productivity and profitability of farmers.

Results were obtained sampling 252 colonies after 6 times collecting

bacteria sample, examined some basic biochemical indicators of bacteria showed

that bacterial is Gram (+), cocci, non-motile, oxidase and catalase-negative. After

conducting identification of bacteria by API 20 Strep kit and method of 16S

rRNA gene sequence analysis has identified the bacteria is Streptococcus

dysgalactiae. PCR using primers STRD-DYI/dys-16S-23S-2 is standardized to

provide rapid diagnosis pathogenic S. dysgalactiae in hemorrhage mudskipper.

The results determine the LD50 in lethal doses of bacteria is 4.25 x 104

CFU/ml. S. dysgalactiae bacteria were sensitized with florfenicol and

doxycycline. The results of treatment in the laboratory showed that when the

mudskippers are causing susceptibility by strain B1-6T with dose 4.25 x 104

CFU/fish, use florfenicol and doxycycline in dose 20 mg/kg fish, after 21 days,

the result of the experiment showed that two kinds of antibiotics (materials and

products) are for reaching higher treatment rates, survival rate is from 65.56% -

71.11%, the value RPS (%) was from 45.27% - 61.16%.

iv

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu

của tôi trong khuôn khổ của đề tài ‟Nghiên cứu bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

(Pseudapocryptes lanceolatus) nuôi thương phẩm và đề xuất giải pháp phòng,

trị” (Mã số: B2013- 16-29) do Bộ Giáo dục và Đào tạo tài trợ. Đề tài có quyền sử

dụng kết quả luận án này để phục vụ cho đề tài.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2016

Tác giả

Nguyễn Thu Dung

v

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm tạ ............................................................................................................... i

Tóm tắt ................................................................................................................... ii

Abstract ................................................................................................................. iii

Cam kết kết quả .................................................................................................... iv

Chƣơng I: Giới thiệu ........................................................................................... 1

1.1 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2

1.2 Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 2

1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2

1.4 Giới hạn nghiên cứu ......................................................................................... 3

1.5 Ý nghĩa nghiên cứu .......................................................................................... 3

1.6 Điểm mới của luận án ...................................................................................... 3

Chƣơng II: Tổng quan tài liệu ............................................................................ 4

2.1 Phân loại cá bống kèo ...................................................................................... 4

2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới và trong nước ................................. 4

2.2.1 Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới ...................................................... 4

2.2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trong nước ........................................................ 5

2.3 Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo...................................................... 5

2.4 Bệnh xuất huyết ở cá........................................................................................ 6

2.4.1 Dấu hiệu bệnh lý ........................................................................................... 6

2.4.2 Đặc điểm mô bệnh học ................................................................................. 6

2.4.3 Đặc điểm huyết học ...................................................................................... 7

2.5 Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá ......................................... 8

2.5.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio ............................................................................... 8

2.5.2 Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas ................................................................. 10

2.5.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus ................................................................. 11

2.5.4 Bệnh do vi khuẩn Flexibacter ..................................................................... 12

2.5.5 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas ..................................................................... 13

2.5.6 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ................................................................. 15

2.6 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Streptococcus trên cá nước lợ, mặn ........... 16

2.6.1 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae........................................................ 17

2.6.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ............................................... 18

2.6.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae ........................................... 19

2.6.4 Cơ chế gây bệnh.......................................................................................... 20

2.6.5 Phương thức lây truyền bệnh trong môi trường nuôi ................................. 20

2.6.6 Phương thức chẩn đoán .............................................................................. 21

2.7 Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá ... 21

vi

2.8 Chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá .................................................................... 22

2.9 Phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá .................................................................. 23

2.9.1 Hóa chất ...................................................................................................... 23

2.9.2 Thuốc kháng sinh ........................................................................................ 23

2.9.3 Vắc xin ........................................................................................................ 25

Chƣơng III: Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................ 27

3.1 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 27

3.1.1 Dụng cụ ....................................................................................................... 27

3.1.2 Hóa chất ...................................................................................................... 27

3.1.3 Môi trường .................................................................................................. 27

3.1.4 Thuốc kháng sinh ........................................................................................ 28

3.1.5 Địa điểm và thời gian thực hiện .................................................................. 28

3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 28

3.2.1 Điều tra phỏng vấn ...................................................................................... 28

3.2.2 Phương pháp thu mẫu cá............................................................................. 29

3.2.3 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng ........................................................... 29

3.2.4 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn ........................................................ 29

3.2.5 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ................................. 32

3.2.6 Phương pháp mô bệnh học ......................................................................... 33

3.2.7 Phương pháp huyết học .............................................................................. 33

3.2.8 Phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết ........................................ 34

3.2.9 Phương pháp lập kháng sinh đồ .................................................................. 37

3.2.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................. 38

3.3 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 41

Chƣơng IV: Kết quả và thảo luận .................................................................... 42

4.1 Khảo sát tình hình nuôi cá bống kèo ............................................................. 42

4.1.1 Kỹ thuật nuôi cá bống kèo .......................................................................... 42

4.1.2 Tình hình bệnh trên cá bống kèo nuôi thương phẩm .................................. 49

4.2 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo ........................................... 50

4.3 Phân lập và định danh vi khuẩn trên cá bống kèo bệnh xuất huyết .............. 51

4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn .......................................................................... 51

4.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa vi khuẩn gây bệnh

trên cá bống kèo .......................................................................................... 52

4.3.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep .................................... 53

4.3.4 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ..................... 53

4.4 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo................... 55

4.4.1 Xác định đặc điểm bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ................ 55

4.4.2 Đặc điểm mô bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ......................... 58

4.4.3 Đặc điểm huyết học trên cá bống kèo bệnh ................................................ 63

vii

4.5 Phát triển quy trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo

bằng phương pháp sinh học phân tử ............................................................. 69

4.5.1 Kết quả chiết tách DNA trực tiếp từ mô thận cá ........................................ 69

4.5.2 Kết quả chiết tách DNA vi khuẩn ............................................................... 69

4.5.3 Kết quả khảo sát cặp mồi cho qui trình PCR phát hiện

Streptococcus dysgalactiae ......................................................................... 69

4.5.4 Kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của qui trình PCR

phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae .............................................................. 70

4.5.5 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình PCR

phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae .............................................................. 71

4.6 Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................................................... 72

4.6.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của

thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ....... 72

4.6.2 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ................................................................... 77

4.6.3 Kết quả thí nghiệm xác định giá trị LD50 ................................................... 80

4.6.4 Kết quả thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mô phòng thí nghiệm .................... 82

Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất ......................................................................... 86

5.1 Kết luận .......................................................................................................... 86

5.1.1 Kết quả điều tra ........................................................................................... 86

5.1.2 Kết quả nghiên cứu ..................................................................................... 86

5.2 Đề xuất ........................................................................................................... 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 88

1. Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................ 88

2. Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................... 100

PHỤ LỤC .......................................................................................................... 106

Phụ lục A: Phiếu điều tra ao nuôi ...................................................................... 106

Phụ lục B: Hóa chất và phương pháp phân tích mẫu......................................... 108

Phụ lục B.1: Phương pháp xác định khả năng tan huyết của vi khuẩn .............. 108

Phụ lục B.2: Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep ............. 108

Phụ lục B.3: Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của

thuốc kháng sinh .......................................................................... 109

Phụ lục C: Số liệu nghiên cứu ........................................................................... 112

Phụ lục C.1: Kết quả điều tra ............................................................................. 112

Phụ lục C.2: Kết quả thu mẫu và phân lập vi khuẩn ......................................... 121

Phụ lục C.3: Định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep ................................... 141

Phụ lục C.4: Kết quả giải mã gen và định danh vi khuẩn .................................. 142

Phụ lục C.5: Kết quả quan sát mẫu mô cá bống kèo ......................................... 154

Phụ lục C.6: Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ..................................................... 157

viii

Phụ lục C.7: Kết quả thí nghiệm LD50 ............................................................... 158

Phụ lục C.8: Kết quả thí nghiệm điều trị ........................................................... 160

ix

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của một số loài vi khuẩn Vibrio ............................. 9

Bảng 2.2 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas .............................. 10

Bảng 2.3 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Streptococcus ............................... 12

Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Flexibacter ................................... 13

Bảng 2.5 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Aeromonas ................................... 14

Bảng 2.6 Đặc điểm sinh hóa của E. tarda và E. ictaluri ..................................... 15

Bảng 3.1 Thuốc thử và cách đọc kết quả phản ứng test API 20 Strep ................ 32

Bảng 3.2 Đường kính vô trùng của một số kháng sinh ....................................... 38

Bảng 4.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo ........................................... 42

Bảng 4.2 Diện tích nuôi cá bống kèo ................................................................... 43

Bảng 4.3 Các bước chuẩn bị ao ........................................................................... 45

Bảng 4.4 Mật độ thả giống .................................................................................. 46

Bảng 4.5 Tỷ lệ cá chết ......................................................................................... 50

Bảng 4.6 Cường độ và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên cá bống kèo ................... 51

Bảng 4.7 Số lượng vi khuẩn phân lập từ các cơ quan qua các đợt thu mẫu ........ 52

Bảng 4.8 Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự vi khuẩn phân lập trên cá

bệnh xuất huyết với vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI ..... 54

Bảng 4.9 Mật độ hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh xuất huyết ............... 65

Bảng 4.10 Số lượng bạch cầu trên cá bống kèo ................................................... 67

Bảng 4.11 Kết quả so sánh các loại bạch cầu ở cá bống kèo .............................. 67

Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ .......................................................... 74

Bảng 4.13 Kết quả MIC của 4 dòng vi khuẩn S. dysgalactiae

trên 3 loại kháng sinh FFC, DO và AML ........................................... 77

Bảng 4.14 Tỉ lệ chết của 4 chủng vi khuẩn S. dysgalactiae

ở thí nghiệm cảm nhiễm ..................................................................... 77

Bảng 4.15 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn phân lập

từ cá bống kèo gây cảm nhiễm ........................................................... 79

Bảng 4.16 Kết quả xác định tỉ lệ gây chết của hai chủng B1-6T và B2-5G ........ 81

Bảng 4.17 Tỷ lệ sống (%) của cá ở thí nghiệm điều trị ....................................... 84

x

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cá bống kèo ............................................................................................ 4

Hình 4.1 Tần suất cho ăn ..................................................................................... 47

Hình 4.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá bống kèo ở Bạc Liêu ...... 48

Hình 4.3 Cá bống kèo bị bệnh ............................................................................. 49

Hình 4.4 Tỷ lệ xuất hiện bệnh trong ao nuôi cá bống kèo thương phẩm ............ 49

Hình 4.5 Hình dạng vi khuẩn Gram (+) hình liên cầu (100X) ............................ 52

Hình 4.6 Kết quả kiểm tra tan huyết và khả năng phát triển

trong môi trường TSB (+6,5%NaCl) ...................................................... 53

Hình 4.7 Kết quả test API 20Strep 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G ........... 53

Hình 4.8 Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài của cá bống kèo bệnh xuất huyết ............. 56

Hình 4.9 Dấu hiệu bệnh lý bên trong của cá bống kèo bệnh xuất huyết ............. 56

Hình 4.10 Mẫu thận cá bống kèo phết kính (Wright & Giemsa, 100X) ............. 58

Hình 4.11 Mô mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ..................... 59

Hình 4.12 Mô thận cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ....................... 61

Hình 4.13 Mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ........................ 63

Hình 4.14 Hình dạng tế bào máu ở cá bống kèo (100X) ..................................... 64

Hình 4.15 Máu cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (100X) ..................................... 64

Hình 4.16 Các loại bạch cầu (100X) ................................................................... 66

Hình 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Streptococcus dysgalactiae

bằng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 .......................................... 69

Hình 4.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình .. 70

Hình 4.19 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ nhạy của qui trình .......... 71

Hình 4.20 Kết quả PCR 10 chủng vi khuẩn......................................................... 71

Hình 4.21 Kết quả PCR từ mẫu thận cá bống kèo bệnh xuất huyết .................... 72

Hình 4.22 Kết quả tách ròng và nhuộm gram các chủng vi khuẩn sử dụng trong

thí nghiệm kháng sinh đồ ................................................................... 73

Hình 4.23 Kết quả kháng sinh đồ với vi khuẩn S. dysgalactiae .......................... 73

Hình 4.24 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ........................................................... 78

Hình 4.25 Kết quả PCR 4 chủng vi khuẩn........................................................... 80

Hình 4.26 Kết quả thí nghiệm LD50 của vi khuẩn B1-6T và B2-5G ................... 81

Hình 4.27 Dấu hiệu bệnh lý của cá trong thí nghiệm điều trị .............................. 82

Hình 4.28 Kết quả định danh chủng vi khuẩn tái phân lập

từ thí nghiệm điều trị .......................................................................... 83

Hình 4.29 Tỷ lệ sống của cá ở thí nghiệm điều trị............................................... 84

xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long

Sở NN&PTNT Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn

NCBI National Center for Biotechnology Information

TSA Tryptic Soy Agar

TSB Tryptic Soy Broth

NB Nutrient Broth

NA Nutrient Agar

TCBS Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar

BHIA Brain Heart Infusion Agar

MHA Mueller Hinton Agar

TH-CR Todd Hewitt – Congo Red

LD50 Lethal Dose 50

RPS Relative Percent Survival

O/F Oxidation – Fermentation

PCR Polymerase Chain Reaction

dNTPs Deoxynucleoside Triphosphates

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

DNA Deoxyribonucleic Acid

GCS Group C Streptococci

GLS Group L Streptococci

GCSD Group C Streptococcus dysgalactiae

MIC Minimum Inhibitory Concentration

N Neomycin

FFC Florfenicol

CIP Cirprofloxacin

GM Gentamicin

DO Doxycycline

CZ Cefazolin

AMP Ampicillin

AML Amoxicillin

xii

SXT Trimethoprim + sulfamethoxazole

TE Tetracycline

NOR Norfloxacin

ENR Enrofloxacin

RBC Red Blood Cell

NT Nghiệm thức

BC Bạch cầu

1

Chƣơng I: GIỚI THIỆU

Cá bống kèo (Pseudapocryptes elongates) là một loài cá bản địa với

nguồn giống tự nhiên phong phú và là nguồn thực phẩm được nhiều người ưa

chuộng. Hiện nay, cá bống kèo là loài thủy đặc sản có giá trị kinh tế cao, được

tiêu thụ rộng rãi trong nước và có giá trị xuất khẩu. Tuy nhiên, trong những

năm gần đây, nghề nuôi cá bống kèo gặp trở ngại lớn do bệnh xuất hiện và lây

lan trên diện rộng làm ảnh hưởng đến sản lượng nuôi trồng và thu nhập của

người dân.

Cá bống kèo được nuôi tập trung ở một số tỉnh vùng Đồng Bằng Sông

Cửu Long (ĐBSCL) như Cà Mau, Bạc Liêu và Sóc Trăng, trong đó Bạc Liêu

là tỉnh có diện tích nuôi khá lớn, diện tích nuôi đạt 405 ha vào năm 2011 (Sở

Nông nghiệp & PTNT tỉnh Bạc Liêu, 2012). Tuy nhiên từ năm 2007 đến nay

cá bống kèo nuôi thương phẩm bị bệnh với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên

thân, tại các vi và hậu môn với tỉ lệ chết cao và chết trên diện rộng. Xuất huyết

là dấu hiệu bệnh lý do nhiều tác nhân gây ra như virus, vi khuẩn và do môi

trường.

Tác nhân gây xuất huyết được mô tả nhiều nhất là do vi khuẩn. Điển

hình như tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi (Oreochromis spp.) ở

một số tỉnh miền Bắc Việt Nam được Phạm Hồng Quân và ctv., 2013 xác định

là do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra. Vi khuẩn này cũng gây bệnh

xuất huyết ở cá điêu hồng (Oreochromis spp.) (Đặng Thị Hoàng Oanh và

Nguyễn Thanh Phương, 2012). Bệnh xuất huyết còn do tác nhân là vi khuẩn S.

iniae, theo kết quả nghiên cứu của Trần Vĩ Hích và Nguyễn Hữu Dũng (2011)

thì tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm (Latex calcarifer) là vi khuẩn S.

iniae, vi khuẩn này còn là tác nhân gây bệnh trên cá bơn Nhật Bản

(Paralichthys olivaceus), cá đù đỏ (Sciaenops ocellates) (Eldar et al., 1999).

Ngoài ra, bệnh xuất huyết trên cá còn do vi khuẩn S. dysgalactiae, vi khuẩn

này gây hội chứng xuất huyết, bơi xoắn, mất phương hướng ở cá đối (Liza

alata, Liza haemotocheila) (Qi et al., 2013), cá tầm (Acipencer schrenckii)

(Yang và Li, 2009), cá nâu (Mugil cephalus) và cá bớp (Rachycentron

canadum) (Abdelsalam et al., 2009).

Tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá còn được tìm thấy do nhiều loài vi

khuẩn khác như Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Loan và ctv.,

2009), Vibrio parahaemolyticus và V. alginolyticus gây bệnh trên cá mú giống

và cá mú thịt, (Leong tak Seng, 1994; Somkiat Kanchanakhan, 1996; Nguyễn

Thị Thanh Thùy và ctv., 2009 được trích dẫn bởi Võ Văn Nha, 2012).

2

Do tác nhân gây bệnh đa dạng, nên việc phòng trị bệnh xuất huyết ở

động vật thủy sản chỉ có hiệu quả khi tác nhân và nguyên nhân gây bệnh được

xác định chính xác. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu chính thức nào về bệnh

xuất huyết ở cá bống kèo, nhằm cung cấp thông tin cho các đơn vị quản lý, các

nhà chuyên môn khuyến cáo người nuôi phòng, trị bệnh một cách hiệu quả. Vì

thế, đề tài “Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống

kèo (Pseudapocryptes elongatus)” sẽ góp phần vào việc kiểm soát dịch bệnh

ở cá bống kèo nói riêng và ở thủy sản nuôi trong vùng nói chung ngày càng

hiệu quả hơn.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu trƣớc mắt: Khảo sát và đánh giá tình hình xuất hiện bệnh xuất

huyết trên cá bống kèo nuôi tại tỉnh Bạc Liêu. Xác định đặc điểm bệnh học

của tác nhân gây bệnh ở cá bống kèo từ đó đề xuất giải pháp phòng và trị bệnh

hiệu quả.

Mục tiêu lâu dài: Cung cấp thông tin làm cơ sở cho các giải pháp phòng

trị bệnh ở cá bống kèo hướng đến nghề nuôi cá bống kèo bền vững.

1.2 Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu tập trung vào phân lập, định danh,

xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên cá bống kèo nuôi. Đồng thời phát

triển qui trình chẩn đoán bệnh và thử nghiệm phòng trị bệnh xuất huyết ở cá

bống kèo ở qui mô phòng thí nghiệm.

1.3. Nội dung nghiên cứu

Luận án tập trung nghiên cứu các nội dung sau:

1. Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

nuôi thương phẩm.

1.1 Điều tra, khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo nuôi.

1.2 Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống

kèo.

2. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo.

2.1 Xác định đặc điểm bệnh học.

2.2 Xác định đặc điểm mô học.

2.3 Xác định đặc điểm huyết học.

3. Phát triển qui trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng

phương pháp sinh học phân tử.

4. Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết ở cá bống kèo ở qui mô phòng

thí nghiệm.

4.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của

thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo.

3

4.2 Bố trí thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mô phòng thí nghiệm.

1.4 Giới hạn nghiên cứu

Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi

thương phẩm tại tỉnh Bạc Liêu.

1.5 Ý nghĩa nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu nhằm đáp ứng cho quá trình đa dạng vật nuôi thủy

sản và góp phần gia tăng sản lượng động vật thủy sản. Thông tin từ kết quả

khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo và qui trình phòng trị bệnh sẽ góp

phần hạn chế thiệt hại trong quá trình nuôi cá bống kèo mang lại hiệu quả về

năng suất và kinh tế, tăng thu nhập cho người nuôi.

1.6. Điểm mới của luận án

Lần đầu tiên xác định được tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá bống

kèo là vi khuẩn Streptococcus dysagalactiae và các thời điểm bệnh thường

xuất hiện ở cá bống kèo nuôi trong ao.

Hoàn chỉnh qui trình phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae để ứng dụng

chẩn đoán sớm, nhanh và đặc hiệu tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo

bằng phương pháp PCR.

Đề xuất một số loại kháng sinh điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo.

4

Chƣơng II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Phân loại cá bống kèo

Hiện nay cá bống kèo được gọi phổ biến là Pseudapocryptes elongatus.

Tên tiếng Việt là cá bống kèo hay cá bống kèo vẩy nhỏ. Tên tiếng Anh là

Lanceolate goby. Theo Cuveir (1816), cá bống kèo được phân loại:

Bộ: Perciformes

Họ: Gobiidae

Giống: Pseudapocryptes

Loài: Pseudapoccryptes lanceolatus (Bloch & Schneider, 1801)

Pseudapocryptes elongatus (Cuveir, 1816)

Hình 2.1: Cá bống kèo

2.2. Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới và trong nƣớc

2.2.1. Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới

Cá bống kèo là loài cá phân bố rộng ở những vùng cửa sông hay trong hệ

sinh thái rừng ngập mặn và bãi bùn ở Ấn Độ, Banglades, Campuchia, Nhật

Bản, Trung Quốc, Việt Nam…(Abid et al., 2014). Đây cũng là một trong

những đối tượng được quan tâm phát triển nghề nuôi trên thế giới do cá dễ

nuôi và có giá trị dinh dưỡng cao, có 34 giống cá bống thuộc họ Gobiiidae

được tập trung nuôi ở các nước như Banglades, Trung Quốc, Đài Loan, Thái

Lan, Philippines và Việt Nam (Polgar và Lim, 2011).

Theo Hong và Zhang (2004) thì Trung Quốc đã sinh sản nhân tạo thành

công một loài cá bống có tên khoa học là Boleophthalmus pectinirostris và đã

phát triển nuôi đối tượng này với mật độ nuôi từ 4,5 – 7,5 con/m2, năng suất

trung bình đạt từ 750 đến 975 kg/ha. Diện tích nuôi loài cá này ở Trung Quốc

đạt khoảng 13.000 ha ở (Hong et al., 2007). Đây cũng là loài cá bống được

nuôi phổ biến ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan (Takeshi, 2008).

Một loài cá bống khác là cá bống kèo Pseudapocryptes elongates cũng

được phát triển mạnh ở một số nước Châu Á, điển hình như Đài Loan và Việt

5

Nam, đây là loài cá được nuôi ở dạng mô hình nuôi thâm canh và bán thâm

canh (Dinh et al., 2007) với năng suất nuôi đạt bình quân 0,8 tấn/ha ở mật độ

thấp và 6,4 tấn/ha ở mật độ nuôi cao (Trương Hoàng Minh và Nguyễn Thanh

Phương, 2011)

2.2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trong nƣớc

Cá bống kèo là một trong những đối tượng thủy sản được các tỉnh vùng

ven biển ĐBSCL quan tâm phát triển nuôi trong những năm gần đây. Cá bống

kèo (Pseudapoccryptes elongatus) là loài cá bản địa, đây là một đối tượng nuôi

còn khá mới, diện tích nuôi đối tượng này không đáng kể, ở những năm đầu

2000 diện tích nuôi dối tượng này chỉ vài ha, tuy nhiên vào những năm 2011,

2012 diện tích nuôi đối tượng này đã tăng 105 ha ở Cà Mau (Sở Nông nghiệp

& PTNT tỉnh Cà Mau, 2013) và 445 ha ở tỉnh Bạc Liêu (Sở Nông nghiệp &

PTNT tỉnh Bạc Liêu, 2013), diện tích nuôi cá bống kèo ở tỉnh Bạc Liêu tập

trung ở 03 huyện trọng điểm đó là thành phố Bạc Liêu, huyện Hòa Bình và

huyện Đông Hải.

Theo Trung tâm Khuyến nông – khuyến ngư Bạc Liêu (2013) thì cá bống

kèo được nuôi ở quy mô thâm canh với diện tích ao nuôi từ 3.000 m2 đến

5.000 m2. Mật độ thả giống cao, trung bình thả nuôi 100 con/m

2, thời gian

nuôi từ 4 – 6 tháng cá đạt trung bình từ 40 – 50 con/kg, năng suất ước đạt từ

10 – 15 tấn/ha, một số hộ nuôi có thể đạt năng suất 20 tấn/ha, lợi nhuận bình

quân từ 100 triệu – 150 triệu đồng/ha. Công trình phục vụ cho quá trình nuôi

đối tượng này khá đơn giản, người nuôi ít tốn công chăm sóc, chủ yếu tập

trung chủ yếu ở giai đoạn cải tạo ao và xử lý nước đầu vụ nuôi còn trong suốt

thời gian nuôi, người nuôi không có hoạt động thay nước trong ao, chỉ cung

cấp thêm nước khi cần thiết và cho cá ăn liên tục trong ngày. Chính những

hoạt động này đã góp phần làm cho môi trường ao nuôi ngày càng xấu đi do

các chất cặn bã tích tụ dưới đáy ao và cũng là nguyên nhân gây ra bệnh trên cá

ảnh hưởng đến năng suất nuôi cũng như lợi nhuận của người sản xuất.

2.3. Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo

Do tốc độ phát triển của nghề nuôi cá bống kèo phát triển nhanh chóng,

cá được nuôi dưới hình thức công nghiệp – bán công nghiệp với mật độ nuôi

cao, lên đến 100 con/m2 (Trung tâm Khuyến nông – khuyến ngư Bạc Liêu,

2013), nhưng kỹ thuật nuôi đối tượng này vẫn chưa hoàn chỉnh, người dân

chưa được trang bị đầy đủ kiến thức về phương pháp quản lý, chăm sóc cũng

như phòng và trị bệnh về cá nuôi. Cá bống kèo được nuôi trong điều kiện ao

nuôi không thay nước, lượng thức ăn được cung cấp liên tục trong ngày tạo ra

một lượng thức ăn dư thừa tích tụ dưới đáy ao, nhưng trong quản lý môi

6

trường ao nuôi người dân ít sử dụng các loại vi sinh cải thiện điều kiện sống

của cá nuôi, kết hợp những yếu tố trên đã làm cho chất lượng môi trường nuôi

ngày càng bị ô nhiễm ảnh hưởng đến sức khỏe của cá, tạo điều kiện cho mầm

bệnh bộc phát.

Mô hình nuôi cá bống kèo thương phẩm là mô hình nuôi mới, diện tích

nuôi của mô hình nhỏ so với tổng diện tích nuôi thủy sản của các tỉnh Cà Mau,

Bạc Liêu và Sóc Trăng, nên không có số liệu thống kê diện tích cá bị thiệt hại

và tỷ lệ thiệt hại chính thức từ các cơ quan chức năng, nhưng những năm

2007, 2008 và 2009 là năm mà nghề nuôi cá bống kèo của tỉnh Bạc Liêu và

các tỉnh lân cận như Sóc Trăng và Cà Mau gặp rất nhiều khó khăn do phát sinh

dịch bệnh, cá bị chết hàng loạt có những ao tỷ lệ chết lên đến 90%, cá biệt có

những ao tỷ lệ cá chết “trắng”, mỗi ngày người nuôi vớt từ 200 – 300 con cá

bống kèo chết trong một ao với dấu hiệu thường thấy là xuất huyết, chướng

bụng, nổ mắt và lở loét (http://vasep.com.vn).

2.4 Bệnh xuất huyết ở cá

2.4.1 Dấu hiệu bệnh lý

Cá bệnh xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết từng mảng đỏ

trên cơ thể, xuất huyết khắp trên da cá, tập trung nhiều ở gốc vây và đuôi, hậu

môn bị viêm hoặc xuất huyết. Hoại tử đuôi, vây, xuất hiện các vết thương trên

lưng, mắt lồi, mờ đục và phù ra. Bụng sưng to, xoang bụng chứa dịch, nội tạng

hoại tử, thận và tỳ tạng sưng to (Từ Thanh Dung và ctv., 2005).

Kết quả nghiên cứu trên cá điêu hồng bị bệnh xuất huyết cho thấy, cá

bệnh có dấu hiệu bệnh lý như bơi lờ đờ, hoạt động chậm chạp, kém linh hoạt,

bơi lội mất phương hướng, mắt lồi và đục, trên thân có những đốm xuất huyết

ở vây ngực và vây bụng, mang tái nhạt, bụng trương to, xoang bụng có chứa

dịch màu vàng, nội tạng bị xuất huyết, mềm nhũn (Đặng Thị Hoàng Oanh và

Nguyễn Thanh Phương, 2012). Kết quả tương tự khi nghiên cứu trên một số

loài cá bị bệnh xuất huyết như cá tầm (Wunging và Aihua Li, 2009), cá đối

(Qi et al., 2013) và cá rô phi (Phạm Hồng Quân và ctv., 2013).

2.4.2 Đặc điểm mô bệnh học

Kết quả nghiên cứu của Trương Đình Hoài và ctv. (2012) trên cá rô phi

(Oreochromis niloticus) bị bệnh xuất huyết cho thấy, mang cá xuất huyết, phù

nề và tăng sinh biểu mô. Mô não bị sung huyết, viêm và thoái hóa ở nhu mô

não. Mô thận cá xuất hiện nhiều vùng bị sung huyết, tụ huyết và thoái hóa,

ống thận bị hoại tử và mất cấu trúc. Mô gan cá xuất hiện nhiều tế bào đại thực

bào, đảo tụy tăng sinh, xuất hiện nhiều vùng sung huyết, tụ máu, thoái hóa và

http://vasep.com.vn/

7

giảm số lượng tế bào gan. Ở mô ruột của cá bị sung huyết, xuất huyết, thoái

hóa nội mạc.

Tương tự khi nghiên cứu trên cá điêu hồng (Oreochromis spp.) bị bệnh

xuất huyết cho thấy có những biến đổi về mô học như bị xuất huyết, có chất

dịch tế bào trên da. Gan, tụy và thận sưng to có hiện tượng sung huyết, xuất

huyết (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Những biến

đổi ở mô mang cá bệnh xuất huyết như các sợi mang bị dính lại, phình to hoặc

mất cấu trúc mang cản trở hô hấp nếu tình trạng bệnh nặng sẽ gây chết cá

(Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011; Trương Đình Hoài và

ctv., 2014).

Kết quả nghiên cứu của Đặng Thụy Mai Thy và ctv. (2012) cho thấy mô

thận cá rô (Anabas testudineus) bệnh xuất huyết bị sung huyết, xuất huyết gây

hoại tử, ống thận bị xơ hóa, quản cầu thận bị biến đổi cấu trúc ảnh hưởng đến

chức năng hoạt động của thận.

Ở cá bệnh xuất huyết, khi quan sát mô gan kết quả cho thấy gan cá bị

sung huyết, xuất huyết gây hoại tử. Mô gan bị nhiễm khuẩn, sự xuất hiện của

các không bào lipid to bất thường, tế bào lympho và tế bào hồng cầu hiện diện

nhiều dẫn đến vùng mô bị xơ hóa nhẹ nếu nặng sẽ hình thành u nang hoặc vôi

hóa cuối cùng gây hoại tử (John và Patricia, 2007).

2.4.3 Đặc điểm huyết học

Tế bào hồng cầu có dạng hình oval hay elip và nhân hình tròn ở giữa. Số

lượng hồng cầu ở cá nước mặn dao động từ 0,9 - 4 triệu tế bào hồng cầu/ml.

Số lượng tế bào hồng cầu trong cơ thể cá bị ảnh hưởng do nhiều nguyên nhân

như tập tính sống của từng loài, cá sống ở tầng mặt sẽ có số lượng hồng cầu

thấp hơn so với các loài cá sống ở tầng giữa và tầng đáy; ở cá đực có số lượng

hồng cầu cao hơn con cái, ngoài ra số lượng hồng cầu còn phụ thuộc vào chất

lượng thức ăn và nhất là khi cơ thể cá bị nhiễm bệnh sẽ làm thay đổi đáng kể

số lượng hồng cầu trong cơ thể cá (Phạm Tân Tiến, 2010).

Bạch cầu là thành phần cơ bản của hệ thống miễn dịch, với chức năng

bảo vệ giúp cơ thể chống lại các tác nhân ảnh hưởng của các yếu tố bên trong

và bên ngoài môi trường sống. Quá trình tạo bạch cầu trong cơ thể được đáp

ứng cho việc bảo vệ cơ thể trong suốt thời kỳ cơ thể gặp tình trạng sốc hoặc

nhiễm bệnh. Bạch cầu là những tế bào máu có nhân, kích thước khác nhau tùy

thuộc vào từng loại bạch cầu. Các loại bạch cầu thường được tìm thấy gồm tế

bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu (Mostafa et

al., 2000).

8

Bạch cầu đơn nhân là tế bào bạch cầu tham gia vào hệ thống miễn dịch

không đặc hiệu với vai trò thực bào, tiêu diệt kháng nguyên và đặc biệt là khả

năng trình diện kháng nguyên và để thực hiện bước khởi đầu của quá trình đáp

ứng miễn dịch đặc hiệu. Bạch cầu trung tính có khả năng thực bào các vật có

kích thước nhỏ như vi khuẩn và có khả năng di chuyển xuyên qua các mao

mạch có chuyển động định hướng đến những nơi bị viêm nhiễm, những nơi bị

viêm có bạch cầu tập trung nhiều nhất (Phạm Tân Tiến, 2010). Sự gia tăng về

tỉ lệ và số lượng bạch cầu trung tính cho thấy hoạt động của hệ bạch huyết gia

tăng để tiêu diệt các vi sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể (Ellis, 1988).

Các tế bào lympho là những tế bào có khả năng miễn dịch. Các bạch cầu

không hạt sản xuất ra các kháng thể β-globulin và nhất là γ-globulin, đây là

kháng thể chống vi trùng rất mạnh. Tế bào lympho có thể sinh ra mọi loại

kháng thể để chống lại mọi kẻ thù (Phạm Tân Tiến, 2010).

Chức năng chính của tiểu cầu là giải phóng chất thromboplastin để gây

đông máu, đặc biệt trong tình trạng viêm nhiễm. Tiểu cầu còn có đặc tính kết

dính nhờ vậy mà góp phần đóng miệng các vết thương. Ngoài ra tiểu cầu còn

tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch (Houston, 1990; Chinabut và ctv.,

1991).

Các chỉ tiêu huyết học ở cá bị bệnh xuất huyết có những thay đổi đáng kể

như số lượng tế bào hồng cầu giảm do bị vi khuẩn phá hủy, số lượng tế bào

bạch cầu tăng đáng kể (Martins et al., 2008), số lượng bạch cầu trung tính ở cá

bệnh tăng cao (Pathiratne và Rajapakshe, 1998) và sự hiện diện của tiểu cầu và

sự gia tăng của tế bào lympho nhằm tăng cường cơ chế phòng vệ của cá bị

nhiễm bệnh (Martins et al., 2008).

2.5. Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá

2.5.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio

Theo Austin (2010), Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là vi khuẩn Gram (-),

có dạng hình que, chuyển động nhờ tiên mao, phản ứng oxydase và catalase

dương tính, có khả năng oxy hóa và lên men trong môi trường O/F. Kích

thước tế bào 0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6µm. Hầu hết Vibrio spp. phân bố trong môi

trường nước mặn, thích hợp ở 20 - 40‰, có loài còn có thể phát triển ở độ

mặn 70‰, nên Vibrio luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi động vật thủy sản.

Vi khuẩn Vibrio có thể phân lập bằng phương pháp vi sinh vật học trên

môi trường nuôi cấy chọn lọc TCBS, ở môi trường này, vi khuẩn Vibrio phát

triển rất nhanh, sau 15-18 giờ, ở nhiệt độ 30-35oC các khuẩn lạc của Virio đã

lớn và phân biệt rõ ràng trên môi trường nuôi cấy (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004).

9

Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của một số loài vi khuẩn Vibrio (Inglis et al.,

1994)

Đặc điểm sinh hóa 1 2 3 4 5 6

Phát triển ở nhiệt độ 4oC

Phát triển ở nhiệt độ 37oC

Phát triển ở 0%NaCl



Nhạy cảm 0/129 (10µg)

Phát triển trên TCBS

Β- galactosidase

Arginine dihydrolase

Lysine decarboxylase

Orinithine decarboxylase

Phản ứng citrate

Sinh H2S

Phản ứng urease

Indole

Voges – Proskauer

Thủy phân gelatin

Axit hóa glucose

Axit hóa mannitol

Axit hóa inositol

Axit hóa sorbitol

Axit hóa sucrose

Axit hóa arabinose

-

+

-

+

-

S

Y

+

+

-

-

+

-

-

+

+

+

+

+

-

+

+

+

-

-

-

+

-

S

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

-

-

+

-

+

-

-

+

-

S

O

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

D

-

-

-

-

-

+

+

+

-

S

Y

+

-

+

-

+

-

-

+

+

+

+

+

-

-

+

-

-

+

-

+

-

S

G

+

-

+

-

+

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

-

-

+

-

+

+

R

Y

-

-

+

+

D

-

-

+

+

+

+

+

-

-

+

- Ghi chú: 1. V. anguillarum; 2. V. ordalii; 3. V. salmonicida; 4. V.cholerae; 5. V. vulnificus;

6. V. alginolyticus. G: màu xanh; Y: màu vàng; D: có phản ứng; O: không biết

Cá khi bị nhiễm khuẩn Vibrio spp. thường có những dấu hiệu điển hình

như xuất huyết trên các vây và mắt lồi, mờ đục giác mạc. Cá lờ đờ biếng ăn,

mang có màu nhợt nhạt do thiếu máu nặng (Toranzo et al., 2005).

Trong họ Vibrionaceae, các loài vi khuẩn gây ra bệnh nghiêm trọng nhất

trên cá biển là V. anguillarum, V. ordalii, V. salmonicida. Vi khuẩn V.

anguillarum phân bố rộng rãi trong môi trường, chúng gây nhiễm trùng huyết

điển hình là bệnh xuất huyết ở các loài cá nước ấm và lạnh có kinh tế quan

trọng, bao gồm cá hồi Thái Bình Dương và Đại Tây Dương (Oncorhynchus

spp. và Salmo salar), cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá bơn

(Scophthalmus maximus), cá chẽm (Dicentrarchus labrax), cá tráp (Sparus

aurata), cá vược (Morone saxatilis), cá tuyết (Gadus morhua), cá chình Nhật

Bản và Châu Âu (Anguilla japonica và Anguilla anguilla), và cá Ayu

(Plecoglossus altivelis) (Toranzo và Barja, 1993; Actis et al., 1999). Vibrio đã

gây thiệt hại trên mô hình nuôi tôm công nghiệp ở Philippin, Ấn Độ và

Indonesia (Austin, 2010).

10

2.5.2. Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas

Vi khuẩn Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadeceae, Gram (-), có dạng

hình que, không sinh bào tử, kích thước tế bào khoảng 0,5 – 1,0 x 1,5 – 5,0

µm, chuyển động nhờ tiên mao. Pseudomonas phát triển trong môi trường đơn

giản và hiếu khí. Đa số loài Pseudomonas có phản ứng oxy hóa, một số ít

không có phản ứng oxy hóa và không lên men trong môi trường O/F. Giới hạn

nhiệt độ phát triển rộng từ 4 – 43oC. Chúng phân bố rộng khắp trong môi

trường, đất và nước, chúng có thể gây bệnh cho người, động vật và thực vật.

Pseudomonas thường gây bệnh xuất huyết trên cá, nhưng gây bệnh chủ yếu ở

cá nước ngọt. Tác nhân gây bệnh ở cá gồm một số loài: P. fluorescens, P.

chlororaphis, P. anguilliseptica, P. dermoalba, P. putida. (Inglis et al., 1994).

Bảng 2.2 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas (Buller, 2004)

Chỉ tiêu

P.

anguilliseptica

P.

chlororaphis

P.

fluorescens

P.

putida

Gram - - - -

Di động + + + +

Phát triển ở 37oC - - - -

Oxidase + + + +

Catalase + + + +

Lysine decarboxylase - v - -

Arginine dihydrolase - + + +

Indole - - - -

Voges - Proskauer - -

Thủy phân aesculin - v - -

Thủy phân gelatin + + + -

O/F - O O O

Arabinose - + + +

Glucose - + + +

Inositol - v -

Lactose - - - -

Mannitol - + + +

Sorbitol - - v -

Sucrose + + v +

Trehalose + v - Ghi chú: (+) phản ứng dương; (-) phản ứng âm.v: phản ứng xảy ra chậm.

Trong số các loài Pseudomonas được phát hiện từ cá bệnh gồm: P.

chlororaphis, P. anguilliseptica, P. fluorescens, P. putida, và P.

plecoglossicida, trong đó vi khuẩn P. anguilliseptica được coi là tác nhân gây

bệnh nguy hiểm nhất cho cá nuôi (Toranzo và Barja, 1993; Austin và Austin,

1999). P. anguilliseptica gây tỉ lệ chết cao trong các ao nuôi lươn ở Nhật Bản

(Wakabayashi và Egusa, 1972). Sau đó là những trại lươn ở Châu Âu, Đài

Loan, Scotland và Đan Mạch (Stewart et al., 1983). Vi khuẩn này cũng được

phân lập từ các loài cá khác như cá tráp đen và cá Ayu ở Nhật Bản (Nakai et

11

al., 1985), cá hồi ở Phần Lan (Wiklund và Bylund, 1990), cá bơn và cá tráp

đen (Lo'pez - Romalde et al., 2009).

Theo Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2009), P. anguilliseptica

được xem là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất. Bệnh xảy ra ở nhiệt độ thấp

(dưới 16oC) vào những tháng mùa đông với biểu hiện là chướng bụng, có

những đốm xuất huyết ở da và nội quan. Ở cá mú, thân bị lở loét, xuất huyết

da, vây và đuôi, mắt lồi và đục. Bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết do

Pseudomonas spp. gây ra và tác động lên cá ở mọi giai đoạn, tỷ lệ cá chết từ

20 – 60%.

2.5.3. Bệnh do vi khuẩn Streptococcus

Vi khuẩn Streptococcus là vi khuẩn hình cầu hoặc liên cầu, Gram (+),

không có khả năng di động trong môi trường lỏng, phản ứng oxidase và

catalase âm tính, không có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện

hiếu khí và kỵ khí, mọc trên môi trường thạch máu (Barrow và Feltham,

1993). Streptococcus sinh trưởng tốt trên môi trường Tryptic soy agar (TSA)

có thêm 0,5% Glucose, môi trường BHIA (Brain heart infusion agar), môi

trường THBA (Todd hewitt broth agar), môi trường thạch máu ngựa (Horse

blood agar). Nuôi cấy ở 20 – 30oC, sau 24 - 48 giờ hình thành khuẩn lạc nhỏ

đường kính 0,5 – 1,0 mm; màu hơi vàng, hình tròn, hơi lồi. Các tế bào vi

khuẩn Streptococcus thường ghép với nhau thành từng chuỗi dài, nên được gọi

là liên cầu khuẩn (Buller, 2004; Salvador et al., 2005).

Dấu hiệu chung khi cá bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus là màu sắc đen

tối, bơi lội không bình thường, mắt cá bị phù mắt hoặc lồi mắt và đục, xuất

huyết trên thân (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Các

vết xuất huyết lan rộng thành lở loét, cá bị bệnh vận động khó khăn, không

định hướng, cá bệnh có hình thức bơi xoắn, thận và lá lách tăng lên về thể tích

do phù nề. Sự thương tổn nội quan là lý do gây chết cá (Bùi Quang Tề và cvt.,

2004).

12

Bảng 2.3 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Streptococcus (Buller, 2004)

Chỉ tiêu S.

agalactiae

S.

dysgalactiae

S.

iniae

S.

phocae

Gram + + + +

Di động - - - -

Phát triển ở 37oC + + +

Oxidase - - - -

Catalase - - - -

Lysine decarboxylase - -

Arginine dihydrolase + + + -

Indole - -

Voges - Proskauer + - - -

Thủy phân aesculin - - + -

Thủy phân gelatin - -

O/F F F F F

Arabinose - - - -

Glucose + + + +

Inositol - - -

Lactose - + - -

Mannitol - - + -

Sorbitol - - - -

Sucrose + + -

Trehalose + + + -

Ribose + + + +

Glycogen + + + -

α-galactosidase - - - -

β- galactosidase - - - -

β-glucuronidase - - + -

Alkaline phosphatase + + + +

2.5.4. Bệnh do vi khuẩn Flexibacter

Vi khuẩn Flexibacter spp. thuộc họ Cytophagacae. Vi khuẩn có dạng

hình que, dài khoảng 0,3 - 0,7 x 4 - 8 µm, bắt màu Gram (-). Vi khuẩn phát

triển trên môi trường Cytophaga agar có khuẩn lạc màu vàng, mép không đều

và dính vào môi trường như khuẩn lạc của nấm. Dưới kính soi nổi (40 lần),

mép khuẩn lạc có dạng rễ cây. Trong môi trường lỏng (Cytophaga Broth) vi

khuẩn phát triển thành chùm hoặc màng mỏng trên bề mặt của môi trường.

Khi lắc nhẹ chúng phát triển đồng nhất (Inglish et al., 1993).

Theo Bùi Quang Tề và ctv. (2004), Flexibacter spp. gây bệnh ở cá nuôi

thường do hai loài: F. columnaris gây bệnh ở cá nước ngọt và gây bệnh trên cá

nước mặn lợ là loài F. maritimus.

Flexibacter được phát hiện trong cá bơn, cá tráp, cá chẽm, cá tráp đỏ, cá

tráp đen (Acanthopagrus schlegeli) và cá hồi. Bệnh tác động ở tất cả các giai

đoạn phát triển từ giai đoạn giống đến giai đoạn thương phẩm nhưng cá nhỏ bị

13

ảnh hưởng nặng hơn. Cá bệnh có dấu hiệu lở loét, xuất huyết miệng, loét và

tổn thương da, vây và đuôi bị cụt và thối (Toranzo, 2004).

Dấu hiệu bệnh đầu tiên xuất hiện các đốm trắng trên thân, đầu, vây,

mang. Các đốm lan rộng thành các vết loét, xung quanh có viền màu đỏ, ở

phần giữa màu vàng hoặc xám, da và vẩy cá có thể bị lột rồi rụng đi, tạo ra vết

loét lan rộng. Các mép vây xơ mòn cụt. Trên mang xuất hiện các vết loét, tơ

mang bị phá hủy làm cá ngạt thở. Bệnh không gây thương tích trong các cơ

quan nội tạng, nhưng độc lực vi khuẩn vẫn có thể làm chết cá (Đỗ Thị Hòa và

ctv., 2004).

Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Flexibacter (Buller, 2004)

Chỉ tiêu F. columnare F.

maritimus

F.

flexilis

F.

canadensis

Gram - - - -

Di động - - - -

Phát triển ở 37oC + - - +

Oxidase + + + +

Catalase + + - +

β-haemolysis - -

Lysine decarboxylase - - -

Arginine dihydrolase - - -

Indole - - - -

Voges - Proskauer - - -

Thủy phân aesculin - -

Thủy phân gelatin + + + +

O/F O O F

Arabinose - - -

Glucose - - + +

Inositol - -

Lactose - - - +

Mannitol - - - -

Sorbitol -

Sucrose - - + -

Trehalose - - -

2.5.5. Bệnh do vi khuẩn Aeromonas

Theo Barrow và Feltham (1993), Aeromonas được chia thành 2 nhóm

dựa trên khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng. Nhóm thứ

nhất gồm những loài Aeromonas có tiên mao và có khả năng di động, bao gồm

A. hydrophila, A. caviae, A. sorbia. Các vi khuẩn có dạng hình que ngắn, kích

thước 0,5 x 1,0 - 1,5 µm, 2 đầu hơi tròn. Mỗi tế bào vi khuẩn có một tiên mao,

nhờ đó có khả năng di động, có phản ứng cytochrom oxidase dương tính, có

khả năng khử nitrate.

14

Vi khuẩn Aeromonas có khả năng vận động, là tác nhân gây bệnh nhiễm

trùng máu, xuất huyết. Cá bị bệnh thường kém ăn hoặc bỏ ăn, nổi lờ đờ trên

tầng mặt. Da cá thường đổi màu tối không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp,

rụng vẩy để lộ da bị xuất huyết. Các đốm xuất huyết màu đỏ xuất hiện trên

thân, các gốc vây, quanh miệng, râu xuất huyết hoặc bạc trắng. Có thể xuất

hiện các vết loét ăn sâu vào cơ, có mùi hôi thối, trên vết loét thường có nấm và

ký sinh trùng ký sinh. Mắt cá bị lồi đục, hậu môn viêm xuất huyết, bụng có thể

chướng to, trên bề mặt nội quan có xuất huyết, xoang cơ thể và ruột tích dịch,

các vây xơ rách, tia vây cụt dần (Barrow và Feltham, 1993).

Bảng 2.5. Đặc điểm sinh hóa của một số loài Aeromonas (Inglis et al., 1994)

Đặc điểm sinh hóa A. hydrophyla A. Caviae A. Sorbia A. salmonicida

Di động

Phát triển ở 370C

β-galactosidase



Tạo H2S

Indole

Voges-Proskauer

Thủy phân Gelatin

Thủy phân Aesculin

Acid hóa: Glucose

Mannitol

Inositol

Sorbitol

Sucrose

Arabinose

+

+

+

+

d

+

+

+

+

+

+

+

-

d

+

+

+

+

+

+

d

-

+

-

+

+

+

+

-

d

+

+

+

+

+

+

d

+

+

d

+

-

+

+

-

d

+

+

-

-

+

+

d

-

-

-

+

+

+

+

-

-

-

+

Nhóm thứ hai là các loài vi khuẩn Aeromonas không di động gây bệnh ở

cá thường gặp là A. Salmonicida (3 loài phụ gồm: A. salmonicida, A.

achromogenes và A. nova). Vi khuẩn có dạng hình que ngắn, không có tiên

mao nên không có khả năng di động và phát triển tốt nhất ở 22°C hoặc thấp

hơn (Barrow và Feltham, 1993).

Vi khuẩn A. salmonicida gây ra bệnh xuất huyết, bệnh lở loét trên một số

loài cá và bệnh Furunculosis ở cá hồi. Cá bệnh thường có dấu hiệu chậm chạp,

kém ăn, thường bơi trên tầng nước mặt, hô hấp khó khăn, trên thân có các

vùng áp xe sâu, xuất huyết trên da và ở các gốc vây, mắt cá bệnh thường bị lồi.

Bệnh có nguy cơ lây nhiễm rất cao, theo nhiều con đường khác nhau, nếu vi

khuẩn tồn tại trong nước, chúng xâm nhập vào cơ thể cá khỏe theo miệng, da

và mang. Sự nhạy cảm của cá với tác nhân sẽ tăng lên khi lớp nhầy trên da cá

bị thương tổn do tác động cơ học hay do ký sinh trùng ký sinh (Toranzo et al.,

1991).

15

2.5.6. Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella

Vi khuẩn Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriaceae, vi khuẩn có dạng

hình que mảnh, Gram (-), kích thước biến đổi, di động hoặc di động yếu, phản

ứng lên men, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, phản ứng indole

và H2S âm tính. (Từ Thanh Dung và ctv., 2005).

Dựa vào dấu hiệu bệnh và phân lập mẫu bệnh phẩm từ gan tụy cá bệnh

trên một số môi trường thông thường như: BHIA (Brain heart infusion agar),

TSA (tryptic soy agar). Trên các môi trường này, khuẩn lạc của Edwardsiella

spp. thường nhỏ, phát triển sau khi nuôi cấy 24 - 48 giờ ở nhiệt độ 30 – 35oC.

Nhiệt độ thích hợp để nghiên cứu đặc điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn

này là 28-30oC. E. ictaluri cho các phản ứng sinh lý, sinh hóa yếu hơn các loài

Edwardsiella khác (Waltman et al., 1986).

Bảng 2.6. Đặc điểm sinh hóa của E. tarda và E. ictaluri (Inglis et al., 1994)

Đặc điểm sinh hóa Edwardsiella ictaluri Edwardsiella tarda

Di động ở 25oC

Di động ở 35oC

β-galactosidase



Ornithine decarboxylase

Tạo H2S

Indole

Voges-Proskauer

Thủy phân Gelatin

Acid hóa: Glucose

Mannitol

Inositol

Sorbitol

Rhamnose

Sucrose

Melibiose

Arabinose

+

-

-

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

+

-

-

+

+

+

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

Họ Enterobacteriaceae gây bệnh trên cá thường gặp hai loài: E. tarda và

E. ictaluri. Cá bị nhiễm E. tarda có dấu hiệu các vết thương tổn nhỏ 3 – 5 mm

trên da, nằm ở mặt lưng và hai bên cơ thể, các vết thương tổn phát triển thành

các vùng bị áp xe, sưng lên rất dễ nhận biết, da cá mất đi sắc tố bình thường.

Cá có mùi hôi thối do các vết thương tổn chứa mô bị hoại tử. Quan sát mô

bệnh học cho thấy các vết thương tổn được đặc trưng bởi sự hoại tử, thường

phát triển ở mô cơ, mô tạo máu và mô gan (Austin và Austin, 1993).

Cá bệnh do nhiễm E. ictaluri thường kém ăn hoặc bỏ ăn, bụng thường

chướng to, xung quanh miệng thường có các đốm xuất huyết, gốc vây xuất

16

huyết, mắt lồi. Giải phẫu bên trong, một số cơ quan nội tạng như gan, lá lách,

thận bị hoại tử, tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,5 – 2,5 mm.

Vi khuẩn E. ictaluri được phân lập lần đầu tiên trên cá nheo. Loài vi khuẩn

này cũng là nguyên nhân gây bệnh nhiễm trùng máu cấp tính (enteric

septicemia of catfish – ESC) trên cá nheo Mỹ với tỷ lệ hao hụt rất cao (Austin

và Austin, 1993).

Hiện nay, hầu như chưa có công trình nghiên cứu nào ở nước ngoài về

bệnh trên cá bống kèo, đặc biệt là bệnh xuất huyết được công bố. Tuy nhiên,

đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh xuất huyết trên các đối tượng nuôi

thủy sản như cá chép, cá nheo mỹ, cá tra, cá rô phi, cá điêu hồng hay lươn

đồng. Tác nhân gây bệnh chủ yếu gây bệnh xuất huyết ở động vật thủy sản

được công bố nhiều nhất là vi khuẩn thuộc giống Aeromonas và

Streptococcus.

2.6 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Streptococcus trên cá nƣớc lợ,

mặn

Bệnh do vi khuẩn Streptococcus là bệnh nguy hiểm thường gặp ở người,

động vật trên cạn và ở động vật thủy sản. Bệnh được phát hiện xảy ra đầu tiên

vào năm 1956 trên cá hồi Oncorhynchus mykiss tại Nhật Bản (Hoshina et al.,

1958). Từ đó, bệnh đã không ngừng lan rộng và trở thành một bệnh vi khuẩn

gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho nghề nuôi trồng thủy sản trên thế giới.

Nhiễm khuẩn liên cầu ở cá được coi là một vấn đề nghiêm trọng do tác

động gây chết hàng loạt cá nuôi trên khắp thế giới (Kitao, 1993; Bercovier,

1997; Romalde và Toranzo, 1999a).

Khi tiến hành định danh cầu khuẩn dựa vào DNA bằng cách giải trình tự

gen 16S rRNA đã xác định một số loài vi khuẩn được xem là tác nhân gây

bệnh: Lactococcus garvieae (syn. Enterococcus seriolicida), Lactococccus

piscium, S. iniae (syn. S. shiloi), S. agalactiae (syn. S. difficile), S. parauberis

và Vagococcus salmoninarum. Vì vậy, streptococcosis trên cá được coi là một

bệnh phức tạp, vi khuẩn có khả năng gây ra tác động lên thần kinh trung ương

gây mủ và viêm màng não (Toranzo et al., 2005).

Trong số các liên cầu khuẩn gây bệnh trên cá, L. garvieae, S. iniae và S.

parauberis có thể được coi là tác nhân chính gây bệnh ở cá biển. L. garvieae

lây nhiễm trên các loài cá nước mặn như cá chỉ vàng tại Nhật Bản và các loài

nước ngọt như cá hồi vân chủ yếu ở Ý, Tây Ban Nha, Pháp, Anh và Úc

(Bercovier et al., 1997). Gần đây, một trường hợp gây nhiễm của L. garvieae

cũng đã được phát hiện ở loài cá biển (Coris aygula) (Colorni et al., 2003).

17

Các chủng vi khuẩn gây bệnh này được phân chia làm 3 nhóm dựa vào

đặc điểm dung huyết: dung huyết α, dung huyết β và dung huyết γ (Baya et al.,

1990). Ngày nay, người ta chia những vi khuẩn này thành hai nhóm dựa vào

độc lực của vi khuẩn theo nhiệt độ. Trong đó, S. parauberis, S. iniae, S.

agalactiae được xem là tác nhân gây bệnh Streptococcosis cho các loài cá

nước ấm ở nhiệt độ trên 15oC. Các vi khuẩn gây bệnh ở vùng nước ấm được

xem là những tác nhân có khả năng gây bệnh cho người (Toranzo et al., 2004).

Khi nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi nuôi

(Oreochromis spp.) tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam của Phạm Hồng Quân

và ctv. (2013) đã tiến hành thu được 60 mẫu cá bệnh có dấu hiệu xuất huyết,

nhóm nghiên cứu đã phát hiện được có 52/60 mẫu cá bệnh do vi khuẩn S.

agalactiae gây ra.

Ngoài ra, khi tiến hành nghiên cứu trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bị

bệnh xuất huyết đã phân lập được vi khuẩn S. iniae (Trần Vĩ Hích và Nguyễn

Hữu Dũng, 2011).

Streptoccosis cũng có thể lây nhiễm sang động vật có vú. Kết quả nghiên

cứu của Toranzo đã xác định Streptoccosis trong cá bơn đã lây sang người đầu

tiên ở phía Tây Bắc của Tây Ban Nha, xảy ra vào năm 1993 (Toranzo et al.,

1994). Trong 02 năm (1995 và 1996), đã có bốn trường hợp nhiễm liên cầu

khuẩn ở con người được xác định trong số các bệnh nhân tại một bệnh viện ở

Ontario (Weinstein et al., 1996). S. iniae, một tác nhân gây bệnh trên cá lại là

nguyên nhân gây ra bệnh ở con người (Eldar et al., 1994; Eldar et al., 1995;

Perera et al., 1995) được phân lập từ cả bốn bệnh nhân trên. Tất cả bệnh nhân

đều có nguồn gốc Trung Quốc và có liên quan đến cá sống, ba trong số các

loài cá liên quan đến bốn bệnh nhân trên là cá rô phi và họ đã bị lây nhiễm khi

tiếp xúc trực tiếp với cá (Weinstein et al., 1996).

2.6.1 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae

Vi khuẩn S. iniae là vi khuẩn hình cầu, có đường kính lên đến 1,5 µm,

các tế bào ghép với nhau tạo thành chuỗi liên cầu. Vi khuẩn phát triển trong

các môi trường tổng hợp như TSA, BHIA, hình thành các khuẩn lạc nhỏ có

đường kính 1-2 mm sau 24 – 48 giờ nuôi cấy ở 15-37oC, trong môi trường

TSB kéo dài thành chuỗi (Bromage et al., 1999). Nuôi cấy trên môi trường

thạch có bổ sung 5% máu cừu cho phản ứng dung huyết dạng α hay β (Eldar et

al., 1995; Bromage et al., 1999).

Tác nhân S. iniae gây bệnh chủ yếu trên các loài cá nước ấm như ở cá rô

phi Oreochromis niloticus x O. Aureus (Al-Harbi, 1994); cá vược sọc lai

Morone saxatilis, cá hồi Oncorhynchus mykis (Evans et al., 2000). Ngoài ra,

18

một số loài cá biển như cá trác sọc vàng Seriola spp. (Kitao, 1982), cá bơn

Nhật Bản (Paralichthys olivaceus), cá chẽm Châu Âu (Dicentrarchus labrax)

và cá đù đỏ (Sciaenops ocellates) (Eldar et al., 1999) ở Israel, cá chẽm (Latex

calcarifer) ở Australia (Bromage et al., 1999) cũng đã phân lập được vi khuẩn

này.

Những loài cá khi bị nhiễm vi khuẩn S. iniae có những dấu hiệu biểu

hiện khác nhau, tuy nhiên chúng đều xuất hiện những dấu hiệu chung bao

gồm: màu sắc đen tối, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các gốc vây và xương

nắp mang, cá mất thăng bằng, bơi lội không bình thường (Bromage et al.,

1999; Eldar et al., 1999; Colorni et al., 2002). Dấu hiệu điển hình của bệnh là

cá bơi lội bất thường, bơi xoắn, không định hướng, xoang bụng chứa dịch,

xuất huyết các cơ quan nội tạng, thận và lá lách sưng to (Bromage et al., 1999;

Suanyuk et al., 2011).

Kiểm tra mô học cho thấy các biến đổi rõ rệt trong gan, thận, tỳ tạng,

tim, mắt và não. Các cơ quan như gan, thận và tim thể hiện bị viêm nghiêm

trọng. Trong mô gan, các mao mạch gia tăng về kích thước, xuất hiện các tế

bào lympho, các tế bào gan xuất hiện nhiều không bào, thoái hóa và hoại tử

(Suanyuk et al., 2011). Màng tim trương to với sự xuất hiện nhiều tế bào

lympho và các trung tâm đại thực bào chứa melanin. Tỳ tạng và não tập trung

các tế bào lympho cao và sự tắc nghẽn nội mạch thường xuyên chứng tỏ sự

suy giảm các sợi fibrin trong các mao mạch (Bromage và Owen, 1999).

Vi khuẩn S.iniae còn được xác định là tác nhân gây bệnh trên cá và động

vật có vú, kể cả con người (Austin và Austin, 1999).

2.6.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae

Vi khuẩn S. agalactiae được gọi là Streptococcus nhóm B là một trong

bốn bêta tán huyết liên cầu khuẩn. Vi khuẩn thuộc nhóm Gram (+), không di

động, sinh trưởng trong các môi trường tổng hợp như TSA, BHIA hình thành

các khuẩn lạc nhỏ có đường kính 1 – 2 mm sau 24 – 48 giờ nuôi cấy ở 15 –

37oC, trong môi trường TSB kéo dài thành chuỗi (Bromage et al., 1999;

Romalde et al., 2009).

Mặt khác vi khuẩn S. agalactiae cho phản ứng voges - proskauer,

alkaline phosphatase và leucine aminopeptidase dương tính nhưng âm tính với

các loại đường, pyrrolidonyl arylamidase, α - galactosidase và nhất là âm tính

với bileesculin. Các đặc tính sinh hóa này giúp phân biệt vi khuẩn S.

agalactiae với các nhóm cầu khuẩn khác và nhất là trong nhóm Streptococcus

(Buller, 2004; Salvador et al., 2005).

19

Bệnh do S. agalactiae gây ra có các dấu hiệu bệnh lý đặc trưng như bỏ

ăn, bơi lội lờ đờ trên mặt nước, mắt lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương

nắp mang. Quan sát mô gan của cá bị nhiễm bệnh có một số biến đổi như cấu

trúc tế bào gan bị phá hủy, nhiều vùng tế bào có hiện tượng xuất huyết, bị biến

đổi cấu trúc và hoại tử. Tỳ tạng xuất hiện những dịch viêm và mất cấu trúc.

Mô thận cá điêu hồng có nhiều vùng bị biến đổi cấu trúc, ống thận bị hoại tử

(Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012).

Hiện tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc, hoại tử và xuất hiện dịch

viêm ở gan, thận và tỳ tạng cho thấy khả năng gây bệnh ở mức tế bào của vi

khuẩn S. agalactiae. Ngành công nghiệp nuôi cá rô phi ở Bazil đã bị thiệt hại

nghiêm trọng do vi khuẩn S. agalactiae vì vi khuẩn này có xu hướng tấn công

cá vào giai đoạn thương phẩm, tỷ lệ chết ở một trang trại nuôi cá có thể lên

đến 90% (Salvador et al., 2005).

2.6.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae

Vi khuẩn S. dysgalactiae thuộc nhóm C Lancefield là vi khuẩn Gram (+),

hình cầu, phản ứng catalase và oxidase âm tính (Buller, 2004). Nhiệt độ tốt

nhất để vi khuẩn S. dysgalactiae phát triển là 37oC, ở nhiệt độ dưới 10

oC và

trên 45oC vi khuẩn không phát triển (Abdelsalma et al., 2013). Cũng với kết

quả nghiên cứu của Abdelsalma et al. (2013) cho thấy vi khuẩn S.

dysgalactiae có phản ứng catalase âm tính nhưng dương tính với oxidase.

S. dysgalactiae được phân thành 02 loài phụ: Streptococcus dysgalactiae

subsp dysgalactiae tác nhân gây bệnh trực tiếp trên động vật và Streptococcus

dysgalactiae subsp equisimilis là tác nhân quan trọng gây bệnh trên người

(Suzuki et al., 2011). Sự phân chia này được Vandamme et al. (1996) dựa vào

quá trình điện di vách tế bào và các kết quả kiểm tra sinh lý, theo đó vi khuẩn

S. dysgalactiae subsp dysgalactiae gây bệnh trên động vật gồm Lancefield

nhóm C Streptococcus (GCS) và nhóm L (GLS).

Theo Nomoto et al. (2004), Lancefield nhóm C S. dysgalactiae (GCSD)

gây bệnh trên cá đầu tiên vào năm 2002 tại Nhật. Vi khuẩn này còn gây bệnh

trên cá bò biển (amberjack Seriola dumerili) và cá chỉ vàng (yellowtail Seriola

quinqueradiata) (Nomoto et al., 2004). Bên cạnh đó, S. dysgalactiae cũng

được tìm thấy là tác nhân gây bệnh trên một số loài cá như: kingfish (Seriola

lalandi), cá đối nâu (Mugil cephalus), cá đối (Liza alata, Liza haemotocheila)

và cá bớp (Rachycentron canadum) (Nomoto et al., 2006; Abdelsalam et al.,

2009; Yang và Li, 2009; Qi et al., 2013).

GCSD gây bệnh trên cá được xác định dựa vào quá trình giải mã trình tự

gen 16S rDNA, phân tích trình tự gen sodA và tuf, điện di và sự tạo nhóm

20

Lancefield. S. dysgalactiae subsp dysgalactiae và S. dysgalactiae subsp

equisimilis là vi khuẩn có thể gây bệnh trên cá và động vật có vú (Nomoto et

al., 2008; Nishiki et al., 2010).

Với kết quả nghiên cứu thành công của Netto et al. (2010) khi xác định

được tác nhân gây bệnh trên cá rô phi Nile là do vi khuẩn S. dysgalactiae và

đây cũng là nghiên cứu đầu tiên phát hiện S. dysgalactiae nhóm C gây bệnh

trên cá nước ngọt.

Ngoài ra, đây cũng là vi khuẩn gây bệnh trên người và một số động vật

khác như ngựa, bò, chó và heo (Anders và Morgens, 2011).

2.6.4 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn S. agalactiae, S. dysgalactiae và S. iniae xâm nhập vào cơ thể

cá thông qua nguồn nước, qua các vết thương trên cơ thể cá (Romalde và

Toranzo, 1999a). Vi khuẩn khi xâm nhập vào cơ thể cá đã gia tăng số lượng và

bị thực bào bởi các đại thực bào. Đại thực bào mang vi khuẩn theo máu trở về

thận và tỳ tạng. Vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi đại thực bào gia tăng số lượng

tại hai cơ quan trên và khi vượt quá sức chống chịu của cơ thể cá, vi khuẩn sẽ

tiếp tục nhiễm vào máu, sau đó được di chuyển đến khắp nơi trong cơ thể gây

nhiễm khuẩn toàn thân (Romalde và Toranzo, 1999a).

2.6.5 Phƣơng thức lây truyền bệnh trong môi trƣờng nuôi

Bệnh do S. agalactiae, S. dysgalactiae và S. iniae lây truyền có thể xảy

ra thông qua nguồn nước hay thông qua thức ăn chứa mầm bệnh. Bệnh cũng

có thể lây truyền khi nuôi chung cá khỏe với cá bệnh, cá mang vi khuẩn trong

tự nhiên vào ao nuôi (Perera et al., 1997).

Một số yếu tố bao gồm nhiệt độ nước cao, mật độ nuôi cao và chất lượng

nước kém như nồng độ amoniac cao hoặc nitrite cao đều liên quan đến việc

bùng phát dịch Streptoccosis trong ao nuôi (Yanong và Francis-Floyd, 2002).

Streptoccosis ảnh hưởng đến các giai đoạn phát triển của cá. Streptococcus có

thể tồn tại hơn 6 tháng trong ao nuôi (Romalde và Toranzo, 1999a).

Theo Pereral et al., 1997 cá có thể bị nhiễm bệnh thông qua phương pháp

tiêm, ngâm hay cho ăn sống với những sinh vật mang mầm bệnh. Các cơ quan

mang, da, hệ thống tiêu hóa, hệ thống khứu giác là những vị trí xâm nhập của

Streptococcus spp.. Tuy nhiên, con đường xâm nhiễm, phát triển và lây lan

bệnh khác nhau tùy theo phương pháp cảm nhiễm và loài cá cảm nhiễm.

Streptococcus có thể gây bệnh trên cá rô phi thông qua phương pháp ngâm hay

cho ăn (Pereral et al., 1997).

21

Nghiên cứu của Evans et al. (2004) về đường lây nhiễm của vi khuẩn S.

agalactiae đã cho thấy, mang là vị trí xâm nhập, vi khuẩn phát triển rất nhanh

sau khi xâm nhập, vi khuẩn xuất hiện trong máu, não và thận của vật chủ sau

12 giờ. Trên cá chẽm, Bromage và Owen (1999) đã tiến hành cảm nhiễm S.

iniae bằng phương pháp ngâm và cho ăn, cá nhiễm bệnh và chết với tỷ lệ cao,

tuy nhiên ở phương pháp ngâm bệnh xảy ra ở dạng cấp tính, phương pháp cho

ăn gây bệnh ở dạng mãn tính.

2.6.6 Phƣơng thức chẩn đoán

Streptococcus là vi khuẩn hình cầu, Gram (+) rất đa dạng về thành phần

loài và kiểu huyết thanh nên dễ nhầm lẫn với những nhóm cầu khuẩn khác về

kiểu hình và đặc tính sinh lý, sinh hóa. Do đó, việc chẩn đoán phát hiện bệnh

nhằm xác định tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá phải dựa vào dấu hiệu bệnh

lý bên ngoài và kết hợp với những xét nghiệm đặc hiệu như phương pháp định

danh vi khuẩn, dựa vào hình dạng, kích thước, các chỉ tiêu hình thái, sinh lý,

sinh hóa; phương pháp ngưng kết miễn dịch để xác định kiểu huyết thanh;

phương pháp mô bệnh học và sử dụng phương pháp phân tử để xác định chính

xác tác nhân gây bệnh trên cá (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh

Phương, 2012).

Rất dễ sai lầm trong nhận dạng vi khuẩn giữa 02 loài S. iniae với S.

uberis (Ravelo et al., 2001). Bên cạnh đó, việc xác định một số loài vẫn còn

khó khăn, nếu chỉ dựa trên kiểu hình và đặc điểm. Gần đây, kỹ thuật phân tử

đã được áp dụng một cách hữu ích trong nghiên cứu dịch tễ học một số tác

nhân gây bệnh Streptoccosis trên cá. Phương pháp sinh học phân tử được áp

dụng để xác định vi khuẩn Streptococcus spp. là Polymerase Chain Reaction

(PCR), Random Amplified đa hình DNA (RAPD), và Ribotyping (RT), và

RAPD được coi là một phương pháp tốt hơn để phân biệt giữa các chủng

Streptococcus (Romalde et al., 1999c).

2.7 Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết

trên cá

Theo Payne et al. (1977) phát hiện các chủng vi khuẩn độc lực và không

độc lực dựa vào sự thay đổi màu sắc trên môi trường thạch Congo red. Một số

vi khuẩn có khả năng hấp thu Congo red. Congo red (C32H22N6Na2O6S2) là

một loại phẩm màu có chứa diazonium, có thể tan trong nước tạo dung dịch

keo màu đỏ hay tan trong dung môi hữu cơ như ethanol. Trong nghiên cứu

dịch tể học, Congo red giúp phát hiện nhanh sự hiện diện độc lực kiểu huyết

thanh 2a của vi khuẩn Shigella flexneri do khả năng kết hợp của Congo red với

lipopolysaccharide của vi khuẩn. Nghiên cứu được thực hiện trên các loài vi

22

khuẩn Shigella, Vibrio cholera, Escherichia coli và Neisseria meningitides

cho thấy các chủng độc lực có khả năng hấp thu Congo red và cho các khuẩn

lạc màu đỏ. Ngược lại, các chủng không hấp thu Congo red và có khuẩn lạc

không màu thì không có độc lực (Payne et al., 1977).

Khi nghiên cứu sự khác nhau giữa các chủng vi khuẩn Yersinia

enterocolitica độc lực và không độc lực của Payne et al., 1977 cho kết quả

tương tự. Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc có màu trên môi trường thạch

Congo red được xác định là vi khuẩn có độc lực.

Độc lực của một số loài vi khuẩn gây bệnh có liên quan đến khả năng

hấp thu Congo red. Theo nghiên cứu của Statner và George (1987) khi tiến

hành thí nghiệm cấy 50 chủng vi khuẩn Aeromonas trên môi trường có chứa

50µg/ml Congo red kết quả cho thấy tất cả các chủng đều phát triển. Mức độ

hấp thu khác nhau giữa các chủng vi khuẩn phụ thuộc vào nhiệt độ ủ, nhiều

nhất ở 37°C và thấp nhất ở 22°C.

Kết quả nghiên cứu của Abdelsalam et al. (2009) cho thấy vi khuẩn S.

dysgalactiae nhóm C phát triển trong môi trường TH-CR agar (môi trường

Todd-Hewitt agar có 30µg/ml Congo red) với các khuẩn lạc có màu cam,

trong khi đó vi khuẩn Lactococcus garvieae phát triển trong môi trường TH-

CR với khuẩn lạc màu trắng hoặc màu cam nhạt. Môi trường TH-CR có thể sử

dụng để phân lập vi khuẩn từ cá bệnh và nhận dạng khuẩn lạc để chẩn đoán vi

khuẩn S. dysgalactiae nhóm C gây bệnh trên cá (Abdelsalm et al., 2009).

2.8 Chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá

Các phương pháp nuôi cấy truyền thống dùng trong chẩn đoán bệnh vi

khuẩn ở cá khi có kết quả thường phải mất vài ngày và không đáp ứng được

tính khẩn cấp trong việc đề xuất giải pháp đối phó với sự lây lan của bệnh.

Một trong những phương pháp kỹ thuật phân tử được sử dụng phổ biến hiện

nay để phát hiện sớm các mầm bệnh ở thủy sản là kỹ thuật PCR. PCR là

phương pháp cho phép phát hiện mầm bệnh vi khuẩn nhanh, chính xác và độ

nhạy cao, có thể phát hiện mầm bệnh vi khuẩn với mật độ rất thấp. Do có tính

chính xác và tính đặc hiệu cao, nên phương pháp PCR là một công cụ hữu

hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh vi sinh vật nói chung và mầm bệnh vi

khuẩn nói riêng (Vantarakis et al., 2000; Del Cero et al., 2002; Bader et al.,

2003). Vì vậy có thể phát triển và sử dụng phương pháp PCR để phát hiện các

mầm bệnh vi khuẩn trong thủy sản.

Khi có nhiều mầm bệnh xuất hiện trong môi trường nuôi thủy sản thì khả

năng phát hiện đồng thời các mầm bệnh này được thực hiện nhờ vào một dạng

biến hóa của PCR là kỹ thuật phức hợp PCR (mPCR) (Del Cero et al., 2002;

23

Panicker et al., 2004). Sử dụng kỹ thuật mPCR còn giảm được chi phí và thời

gian phân tích mẫu. Công bố khoa học gần đây cho biết sử dụng kỹ thuật

mPCR có thể phát hiện đồng thời 3 loài vi khuẩn gây bệnh quan trọng ở cá là

E. ictaluri, A. hydrophila và F. columnare (Panangala et al., 2007).

Ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp PCR và mPCR phát hiện các

mầm bệnh gây bệnh trên động vật thủy sản cũng được phát triển và ứng dụng,

các qui trình được phát triển và chuẩn hóa với thời gian chẩn đoán ngắn và chi

phí phân tích thấp góp phần cho việc phát hiện sớm mầm bệnh ở cá nuôi

(Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Trúc Phương, 2010; Đặng Thị Hoàng

Oanh và Đặng Thụy Mai Thy, 2009; Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng

Oanh, 2010; Nguyễn Hà Giang và ctv., 2010).

Ngoài ra, các kỹ thuật ly trích DNA hiện đại cho phép ly trích DNA của

vi khuẩn trực tiếp mô cá nhiễm bệnh mà không cần phải phân lập và nuôi cấy

vi khuẩn theo phương pháp phân lập truyền thống (Nguyễn Hà Giang và ctv.,

2011).

2.9 Phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá

2.9.1 Hóa chất

Các hóa chất có thể dùng để phòng trị bệnh xuất huyết do vi khuẩn gây

ra như: thuốc tím (KMnO4), muối, formalin, sunfat đồng (CuSO4) và iodine.

Thuốc tím (KMnO4) thuận lợi cho việc sử dụng và đồng thời điều trị bệnh có

hiệu quả cao, tuy nhiên hóa chất này không có hiệu quả khi cá nhiễm bệnh ở

dạng cấp tính (Từ Thanh Dung, 2012).

2.9.2 Thuốc kháng sinh

Thuốc kháng sinh là biện pháp thường được áp dụng nhiều nhất để kiểm

soát bệnh xuất huyết nhất là bệnh do vi khuẩn (Fang et al., 2004). Những loại

thuốc kháng sinh đã được sử dụng để trị bệnh có hiệu quả là furance (Mitchell

và Plumb, 1980), sulfonamide (Bowser et al., 1987), chloramphenicol,

neomycin, sulfamethoxazole-trimethoprim, streptomycin, oxolinic acid,

sarafloxacin (Dixon et al., 1990), rifampicin (Ansary et al., 1992),

oxytetracycline, cephamycin, ciprofloxacin, amoxycillin và enrofloxacin

(Ilhan et al., 2006).

Vi khuẩn Gram (+) rất nhạy cảm với erythromycin (Yanong và Francis-

Floyd, 2002). Bên cạnh đó, phần lớn các chủng Streptococcus spp. cũng rất

nhạy cảm với tetracycline, ampicillin, doxycycline, josamycin (Romalde và

Toranzo, 1999). Kết quả nghiên cứu của Darwish và Griffin (2002) cho thấy

24

khi sử dụng kháng sinh oxytetracycline với hàm lượng 75 – 100 mg/kg cá đã

khống chế được bệnh do vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá rô phi.

Kháng sinh rất cần thiết trong điều trị bệnh do vi khuẩn Vibrio vulnificus

gây ra, các kháng sinh dùng điều trị gồm tetracycline, cephalosporin thế hệ thứ

ba và imipenem (Dijkstra et al., 2009). Kháng sinh được đề nghị để điều trị

bệnh do vi khuẩn Edwardsiella tarda là gentamycin, amoxicillin,

trimethoprim – sulfamethoxazole, cephalosporins và oxyquinolones (Lehane

và Rawlin, 2000).

Việc sử dụng thuốc kháng sinh quá liều và sử dụng trong thời gian dài đã

dẫn đến hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và sự tồn tại dư lượng thuốc trong

sản phẩm thủy sản (Mitchell và Plumb, 1980; Vivekanandhan et al., 2005).

Một số chủng vi khuẩn đã được ghi nhận là kháng với ampicillin,

carbenicillin, erythromycin, gentamicin, penicillin, tetracycline,

nitrofuradantoin, ormetoprim-sulfadimethoxine và sulfamethoxazole-

trimethoprim (Dixon et al., 1990; Ansary et al., 1992; Dixon và Issvoran.,

1993; Ilhan et al., 2006).

Kết quả nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh xuất huyết

trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) của Từ Thanh Dung (2012) cho

thấy, đa số vi khuẩn gây bệnh xuất huyết cá tra (hơn 87% số chủng vi khuẩn)

nhóm vi khuẩn Aeromonas spp. nhạy với florfenicol. Hơn 81% số chủng vi

khuẩn Aeromonas spp. nhạy với doxycycline. So với doxycycline, tetracycline

đã giảm tác dụng chỉ còn 58% số chủng vi khuẩn nhạy. Cũng qua kết quả

nghiên cứu này của Từ Thanh Dung (2012) đã xác định đa số vi

khuẩn Aeromonas spp. gây bệnh trên cá tra kháng với kháng sinh ampicillin,

cefazoline và cefalexine. Thậm chí, vi khuẩn Aeromonas spp. gây bệnh trên cá

tra đã kháng tự nhiên (kháng bẩm sinh) với ampicillin (kháng 100%).

Thuốc kháng sinh được sử dụng rất phổ biến bằng cách trộn vào thức ăn

và người nuôi cá tra thường sử dụng kết hợp nhiều loại kháng sinh và hóa chất

để trị bệnh. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và hóa chất không đúng qui định và

lặp đi lặp lại trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi

khuẩn làm cho việc điều trị ngày càng kém hiệu quả (Đặng Thị Hoàng Oanh

và ctv., 2005; Từ Thanh Dung và ctv., 2008). Bên cạnh sự kháng thuốc thì vấn

đề dư lượng thuốc và hóa chất trong sản phẩm thủy sản còn gây ảnh hưởng

đến sức khỏe người tiêu dùng và điều này gây nhiều trở ngại cho việc xuất

khẩu. Hiện nay việc sử dụng thuốc kháng sinh trong thủy sản phải tuân thủ

theo Thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 17 tháng 3 năm 2009 của Bộ trưởng

Bộ Nông nghiệp & PTNT (Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2014), thông tư này đã

25

quy định chặt chẽ những loại kháng sinh cấm sử dụng cũng như hạn chế sử

dụng trong nuôi trồng thủy sản nhằm tạo sản phẩm sạch bảo vệ sức khỏe

người tiêu dùng.

2.9.3 Vắc xin

Nghiên cứu vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra trên cá

rô phi ở Bazil, kết quả cho thấy việc sử dụng vắc xin đã kiểm soát được mầm

bệnh do vi khuẩn này gây ra, kết quả sau khi sử dụng vắc xin này đạt hiệu quả

khá cao (Salvador et al., 2005). Vắc xin L. Garvieae và S. iniae thử nghiệm

đạt hiệu quả cao trong việc bảo vệ trong cá hồi vân trong thời gian từ 3 - 6

tháng (Eldar et al., 1997; Romalde et al., 2005), nhưng vắc xin cho L.

garvieae và S. parauberis hiển thị mức độ bảo hộ cao khi sử dụng cho cá chỉ

vàng và cá bơn (Toranzo et al., 1995; Romalde et al., 1999b). Tuy nhiên khi

thử nghiệm ngoài thực tế ao nuôi, cả hai loại vắc xin này được cấp phép sử

dụng cho cá hồi ngừa chủng lactococcosis nhưng kết quả vẫn gây thiệt hại

nặng nề cho trang trại nuôi cá (Bachrach et al., 2001).

Một số vắc xin được sử dụng nhằm phòng bệnh do vi khuẩn S. iniae, S.

agalactiae và S. dysgalactiae được nghiên cứu và phát triển. Điển hình như

nghiên cứu của Bercovier et al. (1997), thực hiện tiêm vắc xin bất hoạt

formaline dẫn truyền bằng phương pháp tiêm xoang bụng phòng bệnh do vi

khuẩn S. iniae gây ra trên cá rô phi, đạt hiệu quả bảo vệ cao với RPS đạt 80 -

90%. Kết quả được áp dụng từ năm 1995 đến 1997 khi cá rô phi nuôi đạt 50

g/con tiến hành chủng ngừa bằng vắc xin bất hoạt formaline cho hiệu quả bảo

vệ hơn bốn tháng, với tỷ lệ chết hàng năm gây ra bởi S. iniae đã giảm từ 50%

đến ít hơn 5% (Bercovier et al., 1997).

Trên cá chẽm, vắc xin phòng bệnh S.iniae được nghiên cứu đầu tiên ở

Australia vào năm 2006 với các nghiên cứu của Creeper và Buller (2006),

Delamare - Deboutteville et al. (2006). Các nghiên cứu này đã đạt được kết

quả rất khả quan về khả năng đáp ứng miễn dịch dịch thể trên cá chẽm khi sử

dụng phương pháp tiêm vắc xin bất hoạt ở xoang bụng với một lượng lớn

kháng thể đặc hiệu được tìm thấy trong cả dịch nhầy và huyết thanh sau 21

ngày, ở phương pháp ngâm đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh mẽ được tìm

thấy trong dịch nhầy. Tuy nhiên khi sử dụng vắc xin này vào thực tế ao nuôi

thì gặp một số hạn chế đó là sau khi sử dụng vắc xin phòng bệnh cho cá vài

tuần thì cá bị cảm nhiễm bệnh mà nguyên nhân vẫn chưa xác định được

(Agnew và Barnes, 2007).

26

Đối với bệnh xuất huyết trên cá phi do tác nhân S. agalactiae gây ra, khi

sử dụng vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra đã được thử

nghiệm cho kết quả với tỷ lệ bảo hộ lên đến 60% (Manjaiang et al., 2007)

Kết quả thí nghiệm nghiên cứu sử dụng formalin bất hoạt nhằm phòng

bệnh do vi khuẩn S. dysgalactiae gây ra trên cá đối (Liza Haematocheila) của

Qi et al. (2012) cho thấy formalin bất hoạt đã bảo hộ thành công trên đối

tượng này, tuy nhiên thí nghiệm còn phải kiểm chứng ngoài hiện trường mới

xác định được tác dụng của formalin bất hoạt với vi khuẩn S. dysgalactiae.

Do vậy, để việc phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá nói chung và ở cá

bống kèo nói riêng có hiệu quả cần phải có những nghiên cứu bài bản về tác

nhân và nguyên nhân gây bệnh để phát triển qui trình chẩn đoán sớm rồi từ đó

có biện pháp phòng trị thích hợp.

27

Chƣơng III: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

- Phiếu điều tra: Sử dụng phiếu điều tra để tiến hành điều tra, thu thập

thông tin từ nông hộ (Phụ lục A).

- Nguồn cá thí nghiệm:

+ Cá thu ngoài hiện trường: Thu cá sống trong 34 ao, mỗi ao thu 10 con.

+ Cá thí nghiệm: Cá khỏe từ các ao nuôi ở Bạc Liêu.

- Nguồn vi khuẩn: vi khuẩn trong bộ sưu tập được phân lập qua 06 đợt

thu mẫu để gây cảm nhiễm gồm 4 chủng có ký hiệu là: B1-6T; B2-5G; B2-

3TT; B6-9TT.

3.1.1 Dụng cụ

- Bộ tiểu phẫu, lame, lamen, kính hiển vi.

- Viết lông dầu, viết chì, bình xịt cồn, que cấy, đèn cồn, bật lửa, ống

nghiệm, đĩa Petri thủy tinh, micropipet 1ml, 5ml. Hộp đầu col 1ml, 5ml, cân

điện tử, chai thủy tinh, ống chích, Eppendorf (1,5ml).

- Máy ủ nhiệt, máy ly tâm, máy so màu quang phổ, máy đọc gel Vilber

Lourmat. Máy so màu quang phổ.

- Bể nhựa 60L, hệ thống sục khí.

3.1.2 Hóa chất

- Dung dịch Wright, dung dịch pH 6,2 - 6,8; dung dịch Giemsa.

- Cồn, nước muối sinh lý, nước cất, oxidase, catalase, parafine, dầu xem

kính, crystal violet, ethanol 95%, ammonium oxalate, nước cất; iodine,

potassium iodide, % acetone; safranin, NaCl, chlorine, methanol,

- Ethanol, dung dịch lysis buffer, cồn 70%, TE buffer, MgCl2, dNTPs,

Taq DNA polymerase, mồi xuôi, mồi ngược, gel 1,5% agarose.

- Bộ Kit API 20 Strep (BioMerieux, Pháp).

3.1.3 Môi trƣờng

- Tryptic soy agar (TSA) + 1,5% NaCl; tryptic soy broth (TSB) + 1,5%

NaCl; nitrate broth (NB) thêm 1,5% NaCl.

- Môi trường OF (oxidation-fermentation medium).

- Môi trường máu cừu (bổ sung 1,5% NaCl),.

28

3.1.4 Thuốc kháng sinh

Neomycin (N/30µg), Florfenicol (FFC/30 µg), Gentamicin (GM/10 µg),

Doxycycline (DO/30 µg), Cefazolin (CZ/30 µg), Ampicillin (AMP/25 µg),

Amoxicillin (AML/25 µg), Trimethoprim + sulfamethoxazole

(SXT/1,25/23,75 µg), Tetracycline (TE/30 µg), Norfloxacin (NOR/5 µg),

Cirprofloxacin (CIP/5 µg), Enrofloxacine (ENR/5 µg).

3.1.5 Địa điểm và thời gian thực hiện

- Địa điểm điều tra và thu mẫu: thành phố Bạc Liêu, huyện Hòa Bình và

huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu.

- Thời gian điều tra nông hộ: từ tháng 9 đến 12 năm 2011.

- Thời gian thu mẫu: từ tháng 10/2011 đến 2014.

- Địa điểm phân tích mẫu và bố trí thí nghiệm: Bộ môn Bệnh Học Thủy

Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ.

3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

3.2.1 Điều tra phỏng vấn

3.2.1.1. Số liệu thứ cấp

Dựa vào báo cáo năm 2009, 2010, 2011 của Sở Nông nghiệp & PTNT

tỉnh Bạc Liêu. Số liệu báo cáo của các phòng Nông nghiệp của các huyện,

thành phố và các trạm Khuyến nông – Khuyến ngư tỉnh Bạc Liêu về tình hình

nuôi cá bống kèo thương phẩm trong tỉnh. Số liệu thứ cấp gồm: Tình hình nuôi

trồng thủy sản ở tỉnh Bạc Liêu và tình hình nuôi thương phẩm cá bống kèo

toàn tỉnh và các huyện, thành phố ở tỉnh Bạc Liêu.

3.2.1.2. Số liệu sơ cấp

Tiến hành điều tra 90 hộ nuôi cá bống kèo thương phẩm ở thành phố Bạc

Liêu, huyện Hòa Bình và huyện Đông Hải (Phụ lục A). Số liệu sơ cấp gồm:

Thông tin cơ bản và kinh nghiệm của người nuôi.

Thông tin về kỹ thuật nuôi cá bống kèo gồm: Công trình ao nuôi, cải tạo

và xử lý chuẩn bị môi trường ao nuôi; Nguồn giống, thời gian thả nuôi, mật độ

nuôi; Cách quản lý chăm sóc ao nuôi: cho ăn, quản lý môi trường ao nuôi;

Tình hình sử dụng hóa chất và thuốc kháng sinh trong thời gian nuôi.

Thông tin về bệnh trên cá nuôi: Dấu hiệu bệnh và tỷ lệ thiệt hại; Cách

phòng và trị khi cá bống kèo xuất hiện bệnh.

29

3.2.2 Phƣơng pháp thu mẫu cá

Mẫu cá: thu 254 con cá bống kèo còn sống trong 34 ao nuôi (trong đó:

11 ao cá khỏe, 23 ao cá đang có biểu hiện cá bị xuất huyết). Quan sát ao cá

khỏe là ao có cá biểu hiện bình thường, màu sắc sáng, nhanh nhẹn, ao không

xuất hiện cá chết. Ao cá bệnh là ao cá biểu hiện lờ đờ, phản ứng chậm, cá có

biểu hiện xuất huyết trên da và các vây cá, đang xuất hiện cá chết.

Điều kiện thu mẫu: thu mẫu ao cá bống kèo nuôi thương phẩm giai đoạn

cá nuôi được 2 - 3 tháng tuổi, cá đạt từ 15 – 25 g/con. Thời gian thu mẫu là 7 -

8 giờ sáng.

3.2.3 Phƣơng pháp kiểm tra ký sinh trùng

Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bên ngoài, màu sắc cơ thể cá. Số

lượng mẫu kiểm tra ký sinh trùng là 120 mẫu cá ở 12 ao gồm 04 đợt thu mẫu,

mỗi đợt 03 ao, mỗi ao 10 con.

Kiểm tra trên da và mang: Dùng lame cạo nhẹ lớp nhớt đậy lamen lại và

quan sát dưới kính hiển vi quang học với vật kính có độ phóng đại 10X, 40X.

Kiểm tra ở ruột cá: Cắt đoạn ruột sau, đặt lên lame, lamen lại và quan sát

dưới kính hiển vi quang học với vật kính có độ phóng đại 10X, 40X. Mổ hết

ruột cá để tìm kí sinh trùng có kích thước lớn.

Mức độ cảm nhiễm của ký sinh trùng đặc trưng bằng hai đại lượng là

cường độ nhiễm và tỷ lệ nhiễm:

3.2.4 Phƣơng pháp phân tích mẫu vi khuẩn

3.2.4.1 Phƣơng pháp nhuộm Giemsa

Mẫu phết: phết mẫu thận lên lame. Mẫu được cố định qua dung dịch

Methanol trong 1 phút. Phương pháp nhuộm mẫu theo Humason, 1979 (trích

dẫn bởi Rowley, 1990). Đặt lame mẫu vào dung dịch Wright trong 5 phút.

Chuyển mẫu sang dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 phút. Sau đó cho vào dung

dịch Giemsa trong 30 phút. Cho mẫu vào dung dịch pH 6,2 trong 30 phút. Rửa

sạch mẫu bằng nước cất, để khô tự nhiên. Đọc kết quả dưới kính hiển vi ở vật

kính 100X có giọt dầu.

Con cá/cơ quan/lame/thị trường

Số trùng

Số mẫu nhiễm KST

Tổng số mẫu đã kiểm tra x 100 Tỉ lệ nhiễm (%) =

Cường độ nhiễm =

30

3.2.4.2 Phƣơng pháp phân lập và định danh vi khuẩn

a. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn

Khử trùng mặt ngoài cơ thể cá bằng cồn 70º. Sau khi mổ cá, khử trùng

cơ quan, dùng dao mổ tiệt trùng rạch một đường trên thận. Đặt que cấy vào

nơi vừa rạch, xoay nhẹ để lấy mẫu bệnh phẩm và cấy trên đĩa agar. Ủ các đĩa

môi trường này trong tủ ấm ở nhiệt độ 28°C. Sau 48 giờ, quan sát và ghi nhận

kết quả.

b. Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn

Sau 48 giờ ở 28ºC, tiến hành quan sát hình dạng, màu sắc của khuẩn lạc

để xác định tính ròng của mẻ cấy.

Quan sát hình dạng khuẩn lạc: Một khuẩn lạc do nhiều tế bào vi khuẩn

hợp thành và có đặc điểm hình thái khác nhau tùy theo từng loài vi khuẩn.

Khuẩn lạc có thể có các hình dạng như to, nhỏ, nhỏ li ti, trên mặt agar thì

khuẩn lạc có thể nổi, bằng, khuyết xuống.

Quan sát màu sắc khuẩn lạc: màu trắng trong, trắng đục, kem, vàng …

Quan sát tính di động: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên lame, tiệt trùng

que cấy, lấy một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước. Đậy lamen lại, quan sát ở

vật kính 100X có giọt dầu.

Tiến hành nhuộm Gram: Nhỏ 1 giọt nước cất lên lame, tiệt trùng que

cấy, lấy 1 ít vi khuần trải đều lên giọt nước. Để khô tự nhiên, hơ lướt lame trên

ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn. Tiến hành nhuộm Gram: Nhỏ dung dịch

Crystal violet lên lame, để yên 1 phút. Sau đó rửa lại bằng nước cất. Nhỏ dung

dịch Iodine lên lame, để yên 1 phút. Tẩy màu bằng aceton: nhỏ từ từ aceton

lên lame cho đến khi giọt nuớc trên lame không còn màu tím, rồi rửa lame lại

bằng nước cất. Nhỏ dung dịch Safranin lên lame, để 2 phút. Sau đó rửa lại

bằng nước cất, để khô. Quan sát hình dạng và kích thước ở vật kính 100X có

giọt dầu.

c. Xác định đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn

Kiểm tra tính ròng của vi khuẩn: kiểm tra các khuẩn lạc trên đĩa cấy có

cùng nằm trên đường cấy, đồng nhất về màu sắc và hình dạng. Quan sát tiêu

bản vi khuẩn nhuộm Gram, xem các tế bào vi khuẩn có đồng nhất về kích

thước, hình dạng, màu sắc (tím/hồng).

Phản ứng Oxidase: dùng que cấy nhặt một khuẩn lạc cho tiếp xúc trên

que thử oxidase. Quan sát trong 30 giây và ghi nhận sự thay đổi màu sắc.

31

Phản ứng Catalase: nhỏ 1 giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame. Dùng que

cấy tiệt trùng lấy 1 ít vi khuẩn cho vào dung dịch 3% H2O2.

Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (Phản ứng O/F): Dùng que

cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn trên đĩa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm

chứa môi trường O/F, sau đó phủ 0,5 - 1 ml dầu parafine tiệt trùng vào 01 ống

nghiệm tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm (kiểm tra khả năng lên men

glucose: F), ống còn lại sẽ kiểm tra tính hiếu khí của vi khuẩn (khả năng oxy

hóa: O) và ủ trong tủ ấm 28oC. Đọc kết quả sau 48 giờ.

Khả năng phát triển của vi khuẩn trong môi trường TSB (+ 6,5%NaCl):

Hòa tan môi trường TSB (theo nhãn hướng dẫn) thêm 6,5% NaCl, cho 5ml

vào ống nghiệm, thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Dùng pipet cho 3 giọt

dung dịch vi khuẩn vào ống nghiệm TSB có 6,5% muối ủ trong tủ ấm sau 48

giờ. Vi khuẩn phát triển cho phản ứng (+) với một màu trắng đục và cho phản

ứng (-) khi ống nghiệm trong suốt.

Phản ứng tạo nitrit từ nitrate: Hòa tan môi trường nitrate broth (theo nhãn

hướng dẫn) thêm 1,5% NaCl, cho 5ml vào ống nghiệm, thanh trùng ở 121oC

trong 15 phút. Dùng pipet cho 3 giọt dung dịch vi khuẩn vào ống nghiệm. Ủ

trong tủ ấm ở 28oC sau 2 ngày nhỏ 1 ml thuốc thử A và thuốc thử B vào ống

nghiệm. Phản ứng (+) khi màu đỏ xuất hiện trong khoảng 1 – 2 phút và ngược

lại. (Thuốc thử A: Hòa tan 0,8% Sulphanilic acid trong 5 N- axit acetic và

thuốc thử B: Hòa tan 0,5% α-naphthylamine trong 5N- axit acetic).

Khả năng tan huyết: Xác định khả năng tan huyết của vi khuẩn trên đĩa

môi trường máu cừu (bổ sung 1,5% NaCl) dạng α, β hay γ (Phụ lục B.1).

d. Phƣơng pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep

(Biomérieux, Pháp)

Định danh ngẫu nhiên 32 chủng vi khuẩn trong bộ sưu tập vi khuẩn được

thu qua 06 lần thu mẫu bằng kit API 20 Strep. Phương pháp định danh vi

khuẩn bằng kit API 20 Strep (Biomérieux, Pháp) (Phụ lục B.2), đọc kết quả

theo Bảng 3.1.

32

Bảng 3.1: Thuốc thử và cách đọc kết quả phản ứng test API 20 Strep

Test Kết quả

Âm tính (-) Dƣơng tính (+)

VP VP1+VP2 / đọc sau 10 phút

Không màu Đỏ hồng

HIP NIN / đọc sau 10 phút

Không màu / Xanh nhạt/ Xám nhạt Xanh sẫm / Tím

4 giờ 24 giờ 4 giờ 24 giờ

ESC Không màu/Vàng

nhạt

Không màu/Vàng

nhạt/ Xám nhạt

Đen / Xám Đen

ZYM A + ZYM B / đọc sau 10 phút (PYRA đến LAP)

PYRA Không màu / Cam rất nhạt Cam

αGAL Không màu Tím

βGUR Không màu Xanh

βGAL Không màu / Tím rất nhạt Tím

PAL Không màu / Tím rất nhạt Tím

LAP Không màu Cam

ADH Không màu Đỏ

4 giờ 24 giờ 4 giờ 24 giờ

RIB Đỏ Cam / Đỏ Cam / Vàng Vàng

ARA Đỏ Cam / Đỏ Cam / Vàng Vàng

MAN Đỏ Cam / Đỏ Cam / Vàng Vàng

SOR Đỏ Cam / Đỏ Cam / Vàng Vàng

LAC Đỏ Cam / Đỏ Cam / Vàng Vàng

TRE Đỏ Cam / Đỏ Cam / Vàng Vàng

INU Đỏ Cam / Đỏ Cam / Vàng Vàng

RAF Đỏ Cam / Đỏ Cam / Vàng Vàng

AMD Đỏ Cam / Đỏ Cam / Vàng Vàng

GLYG Cam / Đỏ Vàng

3.2.5 Định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp giải trình tự

3.2.5.1 Phƣơng pháp chiết tách DNA vi khuẩn

Qui trình chiết tách DNA từ vi khuẩn áp dụng theo phương pháp của

Bartie et al. (2006).

Vi khuẩn được nuôi tăng sinh 18 giờ trong 5 ml môi trường Nutrient

Broth (có bổ sung 1,5% NaCl) ở nhiệt độ 28ºC, sau đó được sử dụng để ly

trích DNA bằng cách cho 1,5 ml dung dịch vi khuẩn vào ống ly tâm cùng với

100 µl 10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8.0 (TE). Hỗn hợp được đun nóng

ở 95ºC trong 15 phút, rồi được làm lạnh trong nước đá và ly tâm 2 phút ở vận

tốc 14.000 vòng/phút để tách dung dịch DNA và trữ ở -20ºC.

3.2.5.2 Phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn

Vi khuẩn sau khi được tách ròng đem nuôi tăng sinh trong môi trường

Brain Heat Infusion Broth có bổ sung 1,5% NaCl (BHIB+). 10 mẫu vi khuẩn

33

được chọn từ kết quả phân lập được định danh bằng phương pháp giải trình tự

gen 16S rRNA gồm: B1-6T; B2-5G; B2-3TT; B6-9TT; A1F1; A1F2; A1F4;

A1F6; A1F9; A5F4. Sản phẩm PCR mẫu được gởi đến phòng thí nghiệm NK-

Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa giải trình tự gen 16S rRNA Sản

phẩm giải trình tự được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự ABI

3130XL 16 capillar. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S được so chuỗi bằng

chương trình Blast search trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen của NCBI. So sánh

kết quả sản phẩm giải trình tự đoạn gen 16S định danh loài và giải mã trình tự

của bộ gen vi khuẩn được phân lập.

3.2.6 Phƣơng pháp mô bệnh học

Số lượng mẫu phân tích mô học gồm 127 mẫu cá. Đợt 1 gồm 35 con ở ao

số 1, 2, 3 và 4. Đợt 2 gồm 21 mẫu ở ao 1, 2, 3 và 4. Đợt 3 gồm 24 con ở ao số

1, 2 và 3. Đợt 4 gồm 47 con ở ao số 1, 2, 3, 4, 5 và 6.

Lấy mẫu mô ở mang, gan, thận của cá bệnh và cá khỏe. Mẫu được thu và

cố định trong dung dịch formalin trung tính (10%). Mẫu cố định sau 24 giờ và

chuyển sang cồn 70º.

Mẫu được cắt tỉa với độ dày từ 5 mm, sau đó được xử lý bằng máy xử lý

tự động qua các giai đoạn loại nước, làm trong mẫu và tẩm paraffin. Sau đó

đúc khối mẫu bằng paraffin và sáp ong nóng chảy (1:1), sử dụng máy cắt

microtome để cắt mẫu với độ dày 5 μm và nhuộm mẫu bằng dung dịch

Haematocyline và Eosin (H&E). Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi lần

lượt ở vật kính 10X, 40X, 100X có nhỏ giọt dầu soi kính và chụp lại hình tiêu

bản đặc trưng. Đọc kết quả dựa theo tài liệu của Ferguson (2006) (trích dẫn

bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011).

3.2.7 Phƣơng pháp huyết học

3.2.7.1 Phƣơng pháp phân tích mẫu máu cá

Số lượng mẫu phân tích huyết học gồm 102 mẫu cá. Đợt 1 gồm 30 con ở

ao số 1, 2 và 3. Đợt 2 gồm 19 mẫu ở ao 1 và 2. Đợt 3 gồm 20 con ở ao số 1 và

2. Đợt 4 gồm 33 con ở ao số 1, 2, 3 và 4.

Dùng cồn 70% sát trùng quanh khu vực lấy máu, máu được lấy ở động

mạch chủ ở đuôi cá (Houston, 1990). Phết mẫu máu. Mẫu máu sau khi khô

được cố định bằng cách ngâm trong methanol 2 phút (Rowley, 1990).

3.2.7.2 Định lƣợng hồng cầu

Mẫu cá được pha loãng 200 lần và nhuộm trong dung dịch Natt-Herrick

với 10 µl máu và 1990 µl dung dịch nhuộm hồng cầu trong 3 phút (Natt và

34

Herrick, 1952). Hồng cầu được đếm qua buồng đếm hồng cầu ở vật kính 40X.

Đếm 4 ô lớn (1 ô lớn có 25 ô nhỏ) ở 4 góc của buồng đếm và 1 ô ở trung tâm

buồng đếm.

Công thức tính mật độ hồng cầu:

R = C x 10 x 5 x 200

Trong đó: R: mật độ hồng cầu (tb/mm3)

C: tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm

10: khoảng cách giữa lamelle và buồng đếm là 0,1mm

5: diện tích của mỗi vùng đếm là 0,2 mm2

200: độ pha loãng hồng cầu.

3.2.7.3 Định tính và định lƣợng bạch cầu

Phương pháp nhuộm mẫu: mẫu được nhuộm theo phương pháp Wright’s

& Giemsa (Humason, 1997 trích dẫn bởi Rowley, 1990). Quan sát dưới kính

hiển vi ở vật kính 100X và các loại tế bào bạch cầu sẽ được xác định (theo

Supranee et al., 1991). Phương pháp định lượng các tế bào bạch cầu:

Tổng bạch cầu (TBC): đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu là 1500 tế bào

trên mẫu nhuộm:

Từng loại bạch cầu: đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào.

3.2.8 Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết

3.2.8.1 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ vi khuẩn: (giống 3.2.5.1)

3.2.8.2 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ mô thận cá

Dựa trên phương pháp chiết tách Phenol chloroform của Taggart et al.

(1992) (được điều chỉnh bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai Thy,

2009) để chiết tách DNA thận cá.

Lấy không quá 10% mẫu thận cá/dung dịch chiết tách được trữ trong

ethanol 100% chuyển sang ống eppendorf (1,5ml) có chứa 600µl dung dịch

Lysis buffer (0,5M NaCl, 0,001M EDTA, 1% SDS, 0,8% Triton, 0,1M Tris-

Mật độ từng loại (tb/mm3) =

Số lượng mỗi loại bạch cầu x mật độ TBC

200

TBC (tb/mm3) =

số bạch cầu trong 1500 tế bào x mật độ hồng cầu trên buồng đếm

Số hồng cầu trong 1500 tế bào trên mẫu nhuộm

35

HCl), 40µl SDS 10% và 2,5µl Proteinase K (40µg/µl) và được nghiền nát, lắc

ống 25 lần rồi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 15 phút.

Cho vào 2,5µl Rnase (2µg/µl), lắc ống 25 lần và tiếp tục ủ dung dịch ở

nhiệt độ 37oC trong 30 phút. Cho 600µl Chloroform – Isoamyl (24:1), ly tâm

13.000 vòng/phút trong 15 phút. Protein sẽ lắng xuống thành 1 lớp nhỏ giữa 2

pha. Hút dung dịch phía trên cho vào ống eppendorf 1,5ml mới.

Cho vào 600µl Phenol – Chloroform – Isoamyl (25:24:1), đảo ngược ống

và ly tâm 13.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC. Hút dung dịch phía trên cho vào

ống eppendorf 1,5ml mới. Cho vào 600 µl isopropanol lạnh, ly tâm 13.000

vòng/phút trong 10 phút. DNA lắng ở đáy ống, nhẹ nhàng loại bỏ dung dịch

phía trên.

Cho vào 600µl cồn 70% lạnh, đánh nhẹ eppendorf để rửa DNA. Loại bỏ

cồn phía trên.

Lặp lại bước trên 1 lần nữa.

Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng, hòa tan với 50µl TE buffer (10mM

Tris, 1mM EDTA, pH=7), bảo quản ở -20oC.

3.2.8.3 Phƣơng pháp khuếch đại DNA

Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA được thực hiện dựa theo qui

trình của Nunan et al. (2003). Tổng thể tích phản ứng 50 µl gồm 1X dung dịch

đệm; 2 mM MgCl2; 200 µM dNTPs; 2.5 UI Taq DNA polymerase; 0.22 µM

mồi xuôi (7611F); 0.22 µM mồi ngược (7611R) và 20 ng mẫu DNA. Chu kỳ

nhiệt thực hiện phản ứng là 95ºC trong 2 phút; 95ºC trong 30 giây, 45ºC trong

30 giây, 72ºC trong 2 phút; lặp lại chu kì trên 30 lần; 45ºC trong 1 phút; 72ºC

trong 2 phút. Trọng lượng phân tử đoạn DNA của S. dysgalactiae cần phát

hiện là 1500 bp. Đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S

rRNA được thiết kế bởi Zinniel et al., (2002) có trình tự:

mồi 1: p515FPL 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’,

mồi 2: p13B 5’AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’.

3.2.8.4 Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae

Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 cho phản ứng PCR theo

Hassan et al. (2003).

STRD-DyI: “5′ TGGAACACGTTAGGGTCG 3′”

dys-16S–23S-2: “5′ CTTAACTAGAAAAACTCTTGATTATTC 3′”

Thực hiện qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae dựa trên

phương pháp của Hassan et al. (2003), đối chứng dương sử dụng trong phản

36

ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae là vi khuẩn đã được giải mã định

danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S là vi khuẩn có ký hiệu B2-5G.

Thành phần hóa chất phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae: Tổng thể

tích phản ứng 30 µl, gồm: 1,0 µl mồi xuôi STRD-DyI (10 pmol/l); 1,0 µl mồi

ngược dys-16S–23S-2 (10 pmol/l); 0,6 µl dNTP (10 mmol); 3,0 µl

thermophilic-buffer (10X); 1,8 µl MgCl2 (25 mmol); 0,2 µl Taq DNA

polymerase (5 U/ µl) và 19,9 µl nước cất. Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng

là 94ºC trong 4 phút; 94ºC trong 30 giây, 50ºC trong 60 giây, 72ºC trong 30

giây; lặp lại chu kì trên 30 lần; 72ºC trong 5 phút; giữ ở 20ºC. Trọng lượng

phân tử đoạn DNA của S. dysgalactiae cần phát hiện là 259 bp.

3.2.8.5 Phƣơng pháp điện di

Sử dụng 10 l sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel 1.5% agarose

(ABgene, UK) trong dung dịch đệm 1 TAE (10 mM Tris, 5 mM acetate, 0,1

mM EDTA). Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat

(Pháp). Thang DNA 1 kb plus (Invitrogen) được chạy chung với mẫu để xác

định kích thước của các vạch DNA.

3.2.8.6 Phƣơng pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện

S. dysgalactiae

Độ nhạy của qui trình là giới hạn thấp nhất (nồng độ DNA thấp nhất) để

phát hiện được S. dysgalactiae, độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện S.

dysgalactiae.

Lấy 0,5 g mô thận cá trộn với các mật độ vi khuẩn 25 ng, 50 ng, 100 ng,

200 ng, 400 ng, 800 ng, 1.600 ng và 3.200 ng được dùng cho phản ứng PCR

phát hiện S. dysgalactiae để xác định độ nhạy của qui trình.

3.2.8.7 Phƣơng pháp xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR phát

hiện S. dysgalactiae

Tính đặc hiệu của qui trình PCR chính là độ đặc hiệu của các cặp mồi sử

dụng. Cặp mồi được lựa chọn có khả năng bắt cặp tốt với trình tự ở 2 đầu của

đoạn gen mục tiêu và không phát hiện DNA của các chủng vi khuẩn khác.

Dùng cặp mồi trong phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae để phát

hiện 5 loại vi khuẩn khác bao gồm: Vibrio parahaemolyticus, Edwardsiella

ictaluri, Aeromonas hydrophilla, Streptococcus agalactiae, Flavobacterium

columnare. Trong phản ứng sử dụng 1 đối chứng dương, đối chứng dương là

vi khuẩn S. dysgalactiae đã được giải mã định danh bằng phương pháp giải

trình tự gen 16S là vi khuẩn có ký hiệu B2-5G.

37

3.2.8.8 Khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S.

dysgalactiae

Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình ở 10 dòng vi khuẩn S.

dysgalactiae khác nhau.

Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình trên 10 mẫu cá (A1F1, A1F2,

A1F4, A1F6, A1F9, A5F4, B1-6, B2-3, B2-5 và B6-9) đã được phân lập và

định danh vi khuẩn gây bệnh nhằm xác định khả năng ứng dụng của qui trình.

3.2.9 Phƣơng pháp lập kháng sinh đồ

Phương pháp lập kháng sinh đồ theo phương pháp của Geert Huy, 2002.

3.2.9.1 Phƣơng pháp phục hồi vi khuẩn

Vi khuẩn trữ ở -80oC được phục hồi trên môi trường TSA có bổ sung

1,5% NaCl và ủ sau 24 giờ ở 30oC.

Vi khuẩn được phục hồi, kiểm tra tính thuần bằng cách quan sát sự đồng

nhất về hình đạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và nhuộm Gram, các chỉ

tiêu sinh hóa cơ bản (oxidase, catalase, tính di động, khả năng lên men và oxy

hóa đường glucose) và chạy PCR xác định vi khuẩn.

3.2.9.2 Phƣơng pháp lập kháng sinh đồ

Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm có

chứa 5 ml dung dịch NaCl 0,85% đã tiệt trùng, trộn đều và so sánh độ đục

dung dịch chuẩn 1.0 McFarland (9,7 ml 1% H2SO4 và 0,3 ml 1% BaCl2), xác

định mật độ dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 610 nm với giá trị

OD = 1 thì mật độ vi khuẩn là 109 tế bào/ml, điều chỉnh cho đến khi độ đục

ngang bằng với ống chuẩn Mcfarland.

Dùng pipet hút lần lượt 0,1 ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường

thạch MHA (+ 1,5% NaCl) và trãi đều. Sau đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng

pen tiệt trùng lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri sao cho khoảng cách giữa

hai tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa

kháng sinh với mép đĩa petri khoảng 10 – 15 mm. Mỗi đĩa petri dán 4 đĩa

kháng sinh.

Đặt đĩa vào tủ ấm ở 30oC. Đọc kết quả sau 48 giờ.

Cách đọc: Đo đường kính vô trùng (mm) và dựa vào chuẩn đường kính

vô trùng của nhà sản xuất để xác định độ nhạy, trung bình nhạy và kháng.

38

Bảng 3.2 Đường kính vô trùng của một số kháng sinh

Kháng sinh Chuẩn đường kính vô trùng

(Công ty Biorad & Oxoid) Kháng Trung bình Nhạy

Neomycin (N/30µg)

Florfenicol (FFC/30 µg)

Cirprofloxacin (CIP/5 µg)

Gentamicin (GM/10 µg)

Doxycycline (DO/30 µg)

Cefazolin (CZ/30 µg)

Ampicillin (AMP/25 µg)

Amoxicillin (AML/25 µg)

Trimethoprim + sulfamethoxazole

(SXT/1,25/23,75 µg)

Tetracycline (TE/30 µg)

Norfloxacin (NOR/5 µg)

Enrofloxacine (ENR/5 µg)

≤12

≤16

≤15

≤12

≤12

≤14

≤13

≤13

≤10

≤14

≤12

≤16

13-16

17-19

16-20

13-14

13-15

15-17

14-17

14-17

11-15

15-18

13-16

17-22

≥17

≥20

≥21

≥15

≥16

≥18

≥18

≥18

≥16

≥19

≥17

≥23

(Nguồn: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011)

3.2.9.3 Phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của

thuốc kháng sinh

Phương pháp xác định MIC dựa trên thủ thuật nuôi cấy một chủng vi

khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng với các độ pha loãng khác nhau của một

loại thuốc kháng sinh. Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc trong

ống nghiệm đầu tiên không có vi khuẩn phát triển. Nồng độ ức chế tối thiểu

(MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn được xác định theo phương pháp của

Geert Huys (2002) (Phụ lục B.3).

3.2.10 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm

3.2.10.1 Chuẩn bị bể thí nghiệm

Bể nhựa 500 L được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorine 200 ppm,

phơi khô. Sau đó cấp nước vào khoảng 2/3 bể, có sục khí. Xô nhựa 60 lít cấp

nước khoảng 1/3 bể được đặt trong phòng. Nguồn nước sử dụng là nước máy

có độ mặn 10‰. Các dụng cụ thí nghiệm như: xô, ống sụt khí, vợt, đá bọt...

cũng được vệ sinh kỹ.

3.2.10.2 Nguồn cá thí nghiệm

Cá bống kèo có trọng lượng khoảng 15 - 20 g/con. Cá đồng cỡ, khỏe

mạnh, linh hoạt, da sáng. Cá sau khi mua về được nuôi dưỡng trong bể nhựa

500 L, có sục khí khoảng 1 tuần. Kiểm tra sức khỏe của cá (chọn ngẫu nhiên 5

con) trước khi tiến hành bố trí thí nghiệm.

3.2.10.3 Chuẩn bị vi khuẩn gây cảm nhiễm

Vi khuẩn trữ được phục hồi trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl

(TSA+), ủ ở 28

oC. Sau 48 giờ quan sát hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc và

39

kiểm tra tính thuần thông qua các đặc điểm màu sắc, hình dạng và kích thước

của vi khuẩn (bằng phương pháp nhuộm Gram).

Chọn 2 khuẩn lạc đồng nhất để nuôi tăng sinh trong 100 ml môi trường

TSB bổ sung 1,5% NaCl (TSB+), ủ trong tủ ấm ở 28

oC trong 48 giờ. Sau đó, vi

khuẩn được ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút để thu phần

viên. Vi khuẩn được rửa sạch 2 lần trong nước muối sinh lý và đếm mật độ vi

khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm (OD = 1 tương

đương với mật độ vi khuẩn 1 x 109 CFU/ml). Dung dịch vi khuẩn được pha

loãng 10 lần (1ml dung dịch vi khuẩn 1 x 109 CFU/ml + 9 ml nước muối sinh

lý) để được các mật độ 108, 10

7, 10

6, 10

5, 10

4, 10

3 CFU/ml.

Mật độ vi khuẩn cũng được xác định bằng cách nhỏ 100 µl (lặp lại 3 lần)

dung dịch vi khuẩn lên đĩa TSA+, cho vi khuẩn phát triển trong 48 giờ ở điều

kiện 28oC. Đếm số lượng khuẩn lạc, xác định mật độ vi khuẩn bằng công thức:

Tế bào vi khuẩn (CFU/ml) = Số khuẩn lạc trên đĩa x 10 x Hệ số pha loãng

3.2.10.4 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm cảm nhiễm

Thí nghiệm cảm nhiễm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm

thức là 4 chủng vi khuẩn B1-6T, B2-3TT, B2-5G, B6-9TT với mật độ vi

khuẩn tiêm là 108 CFU/cá và nghiệm thức đối chứng cá được tiêm nước muối

sinh lý. Cá thí nghiệm được tiêm 0,1 ml/cá tại gốc vi ngực. Mỗi nghiệm thức

lặp lại 3 lần với mật độ 10 con cá/bể.

Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 7 ngày.

Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẫu quan

sát dấu hiệu bệnh xuất huyết và tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận và tỳ tạng để

xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa (tái phân lập).

Phương pháp kính phết cũng được phân tích ngay sau khi thu mẫu, cắt

lấy phần thận phết lên lame, nhuộm và quan sát vi khuẩn.

Kết thúc thí nghiệm, ở mỗi nghiệm thức tiến hành thu mẫu mô (3

con/nghiệm thức) ở các cơ quan mang, gan và thận.

Sau khi bố trí thí nghiệm cảm nhiễm tiếp tục tiến hành chọn 2 chủng vi

khuẩn có độc lực cao nhất để bố trí thí nghiệm xác định giá trị LD50.

3.2.10.5 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm xác định LD50

Thí nghiệm xác định LD50 được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên sử dụng 02

chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G với 7 nghiệm thức ở các mật độ vi khuẩn lần

lượt là 102, 10

3,10

4, 10

5, 10

6, 10

7, 10

8 CFU/cá và nghiệm thức đối chứng tiêm

nước muối sinh lý. Cá thí nghiệm được tiêm 0,1 ml/cá tại gốc vi ngực. Mỗi

nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 20 con cá/bể.

Nghiệm thức đối chứng: tiêm nước muối sinh lý.

Nghiệm thức 1: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 102 CFU/cá).


40






Nghiệm thức 8: đối chứng cá tiêm nước muối sinh lý.

Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 14 ngày.

Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẫu quan

sát dấu hiệu bệnh xuất huyết và tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận và tỳ tạng để

xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa. Các chỉ tiêu sinh lý, sinh

hóa của vi khuẩn được thực hiện lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả

có ít nhất 2 lần lặp lại.

Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) được xác định theo

công thức của Reed và Muench (1938):

LD50 = 10 a – p.d

Trong đó:

p.d = (L% - 50%) / (L% - H%)

a: Số lũy thừa mà tại đó vi khuẩn gây chết cá thấp nhất (trên 50%)

H%: Tỷ lệ cá chết cao nhất (dưới 50%)

L%: Tỷ lệ cá chết thấp nhất (trên 50%).

3.2.10.6 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm điều trị bệnh xuất huyết ở

qui mô phòng thí nghiệm

Vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm là chủng B1-6T, mật độ vi khuẩn

tiêm cảm nhiễm là 104

CFU/cá.

Thuốc kháng sinh: DO và FFC sử dụng trong thí nghiệm là thuốc kháng

sinh của công ty UV trong đó: DO và FFC nguyên liệu. DO thành phẩm có tên

thương mại là Rydoxyne. FFC thành phẩm có tên thương mại là UV-Flo.

Thuốc được trộn vào thức ăn cho cá ăn, hàm lượng 20 mg thuốc/kg trọng

lượng cá. Cho cá ăn theo nhu cầu.

Thí nghiệm phòng trị gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức bố trí 30

con, lặp lại 3 lần:

Nghiệm thức 1: dùng thuốc kháng sinh DO ở dạng nguyên liệu, cá được

gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn trộn thuốc vào ngày 3. Cho ăn thức ăn trộn

thuốc liên tục trong 5 ngày.

41

Nghiệm thức 2: dùng thuốc kháng sinh DO ở dạng thành phẩm, cá được


thuốc liên tục trong 5 ngày

Nghiệm thức 3: dùng thuốc kháng sinh FFC ở dạng nguyên liệu, cá được


thuốc liên tục trong 5 ngày

Nghiệm thức 4: dùng thuốc kháng sinh FFC ở dạng thành phẩm, cá

được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn trộn thuốc vào ngày 3. Cho ăn thức

ăn trộn thuốc liên tục trong 5 ngày

Nghiệm thức 5: đối chứng 1: cá được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn

không trộn thuốc.

Nghiệm thức 6: đối chứng 2: cá được tiêm muối sinh lý và cho ăn thức

ăn không trộn thuốc.

Nghiệm thức 7: đối chứng 3: cá không được gây bệnh, không tiêm nước

muối sinh lý, cho ăn thức ăn không trộn thuốc.

Thời gian thí nghiệm là 21 ngày. Theo dõi tỷ lệ cá chết hàng ngày, ghi

nhận và chụp hình dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong. Cá bệnh (còn

sống) được tái phân lập và thu mẫu mô 2 ngày/lần. Cuối thí nghiệm thu mẫu

phân lập vi khuẩn, mô học (3 cá/nghiệm thức).

Hiệu quả điều trị bệnh trong phòng thí nghiệm được đánh giá bằng tỉ lệ

sinh tồn tương đối (RPS) (%) theo công thức (Ellis, 1996):

3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu:

Số liệu điều tra của luận án được thu thập, tổng hợp và xử lý bằng phần

mềm Microsoft Excel. Số liệu huyết học, kết quả thí nghiệm LD50, thí nghiệm

điều trị được xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS version 20. Kết quả giải

trình tự đoạn gen 16S được so chuỗi bằng chương trình Blast search trên cơ sở

dữ liệu ngân hàng gen của NCBI trực tuyến. Luận án được trình bày bằng

phần mềm Microsoft Word.

Giá trị RPS (%) =

% cá chết ở nghiệm thức sử dụng thuốc

1- x 100

% cá chết ở nghiệm thức đối chứng dương

42

Chƣơng IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Khảo sát tình hình nuôi cá bống kèo

4.1.1 Kỹ thuật nuôi cá bống kèo

Tình hình quản lý dịch bệnh trên cá bống kèo nuôi tại tỉnh Bạc Liêu được

ghi nhận qua kết quả điều tra 90 hộ nuôi cá bống kèo thương phẩm. Phần lớn

các hộ được điều tra có kinh nghiệm nuôi từ 2 - 4 năm. Diện tích nuôi cá bống

kèo tập trung từ 1.000 - 5.000 m2. Nguồn giống thả phụ thuộc vào tự nhiên với

mật độ phổ biến từ 100 - 150 con/m2. Vụ nuôi bắt đầu từ tháng 6 - 9 dương

lịch. Các hộ được phỏng vấn không sử dụng ao lắng, lọc mà lấy nước trực tiếp

từ sông và kênh thủy lợi. Trong quá trình nuôi, hầu hết các hộ nuôi không thay

nước mà chỉ cấp thêm nước, xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi

trường nuôi. Bệnh thường xuất hiện trong ao nuôi cá bống kèo thương phẩm là

bệnh xuất huyết (chiếm 78,9%), bệnh lở loét (50%) và bệnh chướng bụng

(50%) đã làm ảnh hưởng đến năng suất nuôi và lợi nhuận của người nuôi. Giai

đoạn cá bị bệnh tập trung nhiều khi cá nuôi được khoảng 2 tháng tuổi và

amoxicillin là loại kháng sinh được người nuôi sử dụng rộng rãi để phòng và

trị bệnh cho cá.

4.1.1.1 Kinh nghiệm của ngƣời nuôi cá bống kèo

Cá bống kèo được người dân chú ý phát triển nuôi từ những năm 2000

nên hầu hết những hộ nuôi đã tích lũy được kinh nghiệm nuôi qua các năm.

Các hộ nuôi được điều tra có kinh nghiệm nuôi cá bống kèo thương phẩm tập

trung ở 2 năm (23,3%) và 3, 4 năm (20%) kinh nghiệm nuôi. Tổng số hộ được

điều tra có kinh nghiệm nuôi từ 5-7 năm chiếm tỷ lệ 27,8% (Bảng 4.1).

Bảng 4.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo

Kinh nghiệm nuôi (năm) Số hộ Tỷ lệ (%)

1

2

3

4

5

6

7

8

21

18

18

12

11

2

8,9

23,3

20

20

13,3

12,2

2,3

Tổng cộng 90 100

Điều này cho thấy nghề nuôi cá bống kèo ngày càng được người dân chú

ý và phát triển, kết quả điều tra phù hợp với số liệu thống kê của Sở

NN&PTNT tỉnh Bạc Liêu, diện tích nuôi cá bống kèo ngày càng mở rộng.

Điển hình là cuối năm 2011, diện tích nuôi cá bống kèo đạt 342,22 ha thì đến

cuối năm 2012 diện tích nuôi đã đạt đến 490 ha, tuy nhiên đến cuối năm 2013

43

diện tích nuôi cá bống kèo lại giảm còn 249,3 ha do tình hình dịch bệnh và giá

cá thương phẩm giảm làm ảnh hưởng đến diện tích và tâm lý người nuôi. Cá

bống kèo là đối tượng nuôi mới, qui trình kỹ thuật nuôi chưa được nghiên cứu

hoàn chỉnh cùng với sự tích lũy kinh nghiệm nuôi còn ít nên rất ít hộ có kiến

thức về nuôi cá bống kèo, điều này ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất và lợi

nhuận từ nghề nuôi cá bống kèo thương phẩm.

4.1.1.2 Diện tích nuôi

Diện tích nuôi cá bống kèo phổ biến từ 1.000 – 5.000 m2 (chiếm 34,5%),

diện tích nuôi trung bình 10.850 m2 (±8.220m

2). Số hộ nuôi có diện tích lớn

chiếm tỷ lệ khá cao cho thấy người nuôi có xu hướng đầu tư lớn (Bảng 4.2).

Tuy qui mô nuôi không đồng đều nhưng nhìn chung kết cấu, qui mô công

trình nuôi đều được người dân thiết kế khá giống nhau, phù hợp với qui mô

nuôi cá bống kèo thương phẩm.

Bảng 4.2 Diện tích nuôi cá bống kèo

Diện tích nuôi (m2) Số hộ Tỷ lệ (%)

≤ 5.000

≤ 10.000

≤ 15.000

≤ 20.000

> 20.000

31

25

12

11

11

34,5

27,8

13,3

12,2

12,2


4.1.1.3 Mùa vụ nuôi và thời gian nuôi

Mùa vụ nuôi cá bống kèo thương phẩm bắt đầu từ tháng 6 kéo dài đến

tháng 2, 3 dương lịch. Người dân có thể thả nuôi 2 vụ/năm. Trước đây khi

nuôi luân canh tôm – cá, thì một năm cá bống kèo chỉ được nuôi 1 vụ. Hiện

nay có hộ nuôi chuyên canh cá bống kèo 2 vụ/năm (22,2%) nhưng phần lớn

chỉ nuôi 1 vụ/năm (77,8%).

Vụ 1 (vụ thuận) (từ tháng 6 – 9 và 10 dương lịch) là những tháng mưa

nên độ mặn trong ao nuôi giảm dần cá lớn khá nhanh, khoảng 3 – 4 tháng cá

có thể đạt được trọng lượng 50 con/kg, cá giống ít hao hụt. Điều này phù hợp

với nhận định của Trương Hoàng Minh và Nguyễn Thanh Phương (2011)

tháng 6 – 9 là mùa vụ thả nuôi cá bống kèo thích hợp là mùa mưa vì nguồn cá

bống kèo giống tự nhiên phong phú, độ mặn thấp (14 – 18‰ vào tháng 5 và 5

– 8‰ vào tháng 8). Vụ 2 (từ tháng 11 – 2 và 3 dương lịch) lúc này độ mặn của

nước tăng dần nên cá lớn chậm thường phải nuôi trong 5 – 6 tháng, cá giống

dễ hao hụt.

Thời gian nuôi cá bống kèo thương phẩm trung bình là 4 tháng (chiếm

91,1%) nhưng có hộ nuôi đến 5 tháng (chiếm 2,2%). Số lượng vụ nuôi và thời

44

gian nuôi bị ảnh hưởng bởi giá cá thương phẩm. Trong những năm gần đây,

giá cá bống kèo thương phẩm không ổn định, nên người nuôi thường căn cứ

vào giá cả cũng như nhu cầu thị trường để quyết định số vụ nuôi trong năm

cũng như thời gian thu hoạch cá nuôi.

4.1.1.4 Kỹ thuật nuôi

a. Chuẩn bị và cải tạo ao

Cá bống kèo là loài có tính ăn thiên về thực vật, cá sống trong môi

trường giàu tảo khuê và mùn bã hữu cơ, nền đáy là bùn hay bùn cát (Trần Đắc

Định và ctv., 2002) vì thế trong quá trình chuẩn bị ao nuôi, cần tiến hành gây

màu nước tạo nguồn thức ăn tự nhiên cho cá giống khi thả nuôi.

Hầu hết các hộ nuôi đều có cải tạo ao trước mỗi vụ nuôi, tùy theo kinh

nghiệm và đặc điểm của từng vùng mà người dân lựa chọn hình thức cải tạo

khô hay ướt. Đa số người nuôi chọn hình thức cải tạo ao bằng cách phơi khô

ao (86,7%) với thời gian phơi ao vài ngày hoặc vài tuần tùy điều kiện thời tiết,

nhưng nhìn chung các hộ đều phơi ao đến khi đáy ao nứt chân chim thì bắt đầu

tiến hành các bước kế tiếp. Một số hộ nuôi chọn cách cải tạo ao bằng cách để

một ít nước trong ao khoảng 10 cm và tiến hành bón vôi (13,3%).

Bón phân gây màu bằng phân hữu cơ hoặc vô cơ để gây màu nước nhằm

tạo nguồn thức ăn tự nhiên cho cá nuôi trong giai đoạn vừa thả giống là cần

thiết, nhưng người nuôi chưa chú trọng đến việc bón phân gây màu trong ao

nuôi cá bống kèo. Có 7 hộ được phỏng vấn (chiếm 7,8%) có bón phân gây

màu cho ao (chủ yếu là NPK với liều 3 kg NPK/1.000 m2), còn lại 83 hộ nuôi

được phỏng vấn không bón phân gây màu nước cho ao nuôi (92,2%). Điều

này là do người dân khi tiến hành nuôi cá với mật độ cao, chủ động cho cá ăn

ngay từ đầu nên không chú trọng đến việc gây màu. Mặt khác, khi bắt đầu

nuôi, mực nước trong ao thấp, các hộ cho cá ăn cám mịn hay thức ăn tự chế,

các loại thức ăn này cũng trở thành nguồn phân bón gây màu nước trong ao.

Diệt tạp và diệt cá dữ cũng được người nuôi rất chú ý. Số hộ sử dụng các

loại thuốc, hóa chất chiếm 61,1% và 16,7% hộ lọc nước để diệt tạp và diệt cá

dữ (Bảng 4.3). Có 50% các hộ được phỏng vấn có tiến hành diệt khuẩn trước

khi bắt đầu vụ nuôi và trong quá trình nuôi nhằm tạo môi trường thuận lợi cho

cá phát triển tốt và 50% hộ có xử lý nước trước khi thả giống bằng một số hóa

chất như iodine, dây thuốc cá, saponin hay BKC.

45

Bảng 4.3 Các bước chuẩn bị ao

Các bước chuẩn bị ao Số hộ Tỷ lệ (%)

Phơi ao Có 78 86,67

Không 12 23,33

Bón vôi Có 64 71,11

Không 26 28,89

Bón phân Có 7 7,78

Không 83 92,22

Diệt cá dữ Có 55 61,11

Không 35 38,89

Diệt khuẩn Có 45 50

Không 45 50

Lọc nước Có 15 16,67

Không 75 83,33

Trong quá trình chuẩn bị ao nuôi, người dân rất lưu ý khâu trị mọi trong

ao. Theo Trần Đắc Định và ctv. (2011), cá bống kèo di cư ra biển mỗi tháng 2

lần tương ứng với 2 kỳ triều trong tháng đó là con nước ròng (ngày 15 âm

lịch) và kỳ con nước rong (ngày 30 âm lịch), khi đó cá di cư với số lượng lớn

và thường xuyên hơn trong thời kỳ con nước rong. Chính vì vậy, theo kinh

nghiệm, các hộ nuôi rất chú trọng đến khâu tu sửa bờ ao, trị mọi trong ao để

đảm bảo rằng công trình ao nuôi đã chắc chắn không còn lỗ mọi, không bị rò

rỉ nhằm tránh thất thoát cá do lỗ mọi. Bên cạnh đó người nuôi cũng rất chú

trọng việc dùng lưới bao quanh bờ ao và giăng lưới hay giăng móc câu để

phòng ngừa hao hụt do thiên địch. Nhìn chung, công tác cải tạo và chuẩn bị ao

của các hộ nuôi thương phẩm cá bống kèo tương đối phù hợp với yêu cầu kỹ

thuật nuôi.

b. Nguồn giống và mật độ thả nuôi

Nguồn giống là vấn đề chủ yếu quyết định thành công của vụ nuôi.

Nguồn cá bống kèo giống hiện nay phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn cá giống tự

nhiên do đó mùa vụ nuôi cá bống kèo cũng chính là mùa xuất hiện con giống

tự nhiên. Cá giống tự nhiên được khai thác từ tháng 4 – 11 và tập trung vào 2

mùa chính là tháng 4 – 5 và các tháng 9 – 11 âm lịch. Cá bống kèo giống xuất

hiện trong mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11 theo những con nước rong hàng

tháng (15 và 30 âm lịch) (Trương Hoàng Minh, 2009).

Do cá giống thả nuôi có kích cỡ nhỏ nên ảnh hưởng rất nhiều đến tỷ lệ

sống, để bù vào lượng cá giống bị hao hụt khi thả, người nuôi luôn có xu

hướng thả cá giống với mật độ cao để bù lại. Kết quả phỏng vấn 90 hộ dân ghi

nhận được mật độ thả nuôi cá bống kèo dao động từ 50 – 200 con/m2, đa số

46

các hộ thả nuôi ở mật độ từ 100 – 150 con/m2 (chiếm 82,2%) (Bảng 4.4). Mật

độ khuyến cáo khi nuôi cá bống kèo thương phẩm là 50 – 80 con/m2, nhưng

nếu có điều kiện thuận lợi mật độ nuôi có thể tăng đến 100 con/m2 (Trung tâm

Khuyến nông Quốc gia, 2009). Như vậy với mật độ nuôi được ghi nhận qua

khảo sát (126,5±31,2 con/m2) và cách chọn cá bống kèo giống như hiện nay

đòi hỏi người nuôi phải có chế độ theo dõi, chăm sóc và quản lý ao nuôi một

cách chặt chẽ để ao nuôi không phát sinh dịch bệnh ảnh hưởng đến năng suất

nuôi.

Bảng 4.4 Mật độ thả giống

Mật độ nuôi (con/m2) Số hộ Tỷ lệ (%)

< 100

100 – 150

> 150

5

74

11

5,56

82,22

12,22


Chất lượng con giống là một vấn đề đáng được quan tâm, do hiện nay

chưa có qui trình kiểm tra chất lượng con giống cá bống kèo nên người nuôi

chủ yếu chọn giống theo cảm quan, kinh nghiệm và chủ yếu dựa vào uy tín

của người bán. 100% người nuôi chọn cá giống bằng cảm quan với một số dấu

hiệu như cá có màu đen, có bụng, có sọc và hoạt động nhanh nhẹn.

Tuy cá bống kèo được thả nuôi với mật độ cao nhưng hệ thống sục khí

không được sử dụng trong suốt quá trình nuôi do cá bống kèo có thể hô hấp tự

nhiên trong nước và ngoài không khí (Ishimatsu et al., 1998, trích dẫn bởi

Trương Hoàng Minh và Nguyễn Thanh Phương, 2011). Khi môi trường thiếu

oxy, cá sẽ gia tăng tần suất trao đổi khí qua mô và giảm tần suất trao đối khí

ngoài mô (Martin và Bridges, 1999).

c. Thức ăn và cách cho ăn

Thức ăn sử dụng cho cá bống kèo nuôi hiện nay chủ yếu là thức ăn công

nghiệp từ các cửa hàng (58,89%) và đại lý bán thức ăn (41,1%). Có hai dạng

thức ăn công nghiệp được người nuôi sử dụng là dạng chìm và dạng nổi. Do

tập tính bắt mồi của cá bống kèo nên tháng đầu tiên sau khi thả giống, người

nuôi sử dụng thức ăn chìm, sau một tháng thì đổi sang thức ăn nổi.

Tần suất cho ăn dao động từ 2 – 5 lần/ngày. Có 56,7% hộ điều tra cho cá

ăn 2 lần/ngày vào lúc sáng sớm và chiều mát. Lượng thức ăn cho cá ăn còn

phụ thuộc vào nhu cầu của cá, nên có hộ cho cá ăn liên tục trong ngày (cách

khoảng 2 đến 3 giờ cho ăn một lần) (chiếm 8,89%). Tần suất cho ăn được trình

bày ở Hình 4.1.

47

Hình 4.1. Tần suất cho ăn

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại thức ăn với nhiều kích cỡ khác

nhau được sử dụng nuôi cá bống kèo. Các hộ nuôi lựa chọn loại thức ăn tùy

theo giá cả và nguồn cung cấp. Thức ăn công nghiệp cho loài cá này chưa

được nghiên cứu, nhưng theo khuyến cáo của Trung tâm Khuyến nông Quốc

gia (2009) thì thức ăn công nghiệp sử dụng nuôi cá bống kèo nên có độ đạm từ

25 – 28%. Khối lượng thức ăn mà người nuôi cho cá ăn dao động từ 15 – 70

kg/ngày/ao. Trung bình mỗi ngày người nuôi cho cá ăn 35,06±13,99

kg/ngày/ao. Số hộ nuôi cung cấp thức ăn > 30 kg/ngày chiếm tỷ lệ khá lớn

(45,6%).

Lượng thức ăn được cung cấp liên tục trong ngày đã gây nên tình trạng

ao nuôi tích lũy một lượng lớn thức ăn dư thừa, gây nên tình trạng ô nhiễm

ngày càng tăng trong ao nuôi, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tồn tại và

phát triển, là một trong những nguyên nhân gây ra tình trạng bệnh trên cá bống

kèo nuôi.

d. Quản lý chất lƣợng nƣớc trong ao nuôi cá bống kèo

Tất cả (100%) các hộ nuôi cá bống kèo được phỏng vấn không sử dụng

hệ thống ao lắng, lọc mà lấy nước trực tiếp từ sông và kênh thủy lợi. Trong

quá trình nuôi, hầu hết các hộ nuôi không thay nước mà chỉ cấp thêm nước

(96,7%), xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi trường nuôi. Một số ít

hộ không thay nước và cũng không cấp thêm nước vào ao nuôi (3,3%). Nguồn

nước cấp thêm có thể từ sông và kênh thủy lợi (92,2%) hay từ nguồn nước

bơm hoặc nước mưa (chiếm 7,8%). Nguồn nước bơm hay nước mưa thường

được sử dụng khi ao nuôi có hiện tượng mực nước trong ao nuôi giảm thấp, độ

mặn trong ao tăng cao nhưng nguồn nước từ sông hoặc kênh thủy lợi không đủ

cấp hoặc không đảm bảo chất lượng. Mực nước trong ao nuôi ở thời điểm thả

giống thường dao động từ 15 – 30 cm, đến khoảng 0,5 – 1 tháng khi cá bắt đầu

nổi thì người dân nâng dần mực nước. Đến khi cá đạt 2 tháng thì mực nước

trong ao đạt mức tối đa là 1-1,5m. Nguồn nước cung cấp vào ao nuôi không

đảm bảo chất lượng và số lượng yêu cầu, kết hợp với việc không thay nước

48

suốt vụ nuôi đã làm cho chất lượng nước trong ao nuôi ngày càng ô nhiễm,

ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cá nuôi, tạo điều kiện tốt cho mầm bệnh phát

triển và gây ra tình trạng cá nuôi bị bệnh, ảnh hưởng đến tỷ lệ sống và năng

suất của cá nuôi.

e. Quản lý sức khỏe cá nuôi

Đa số các hộ nuôi được phỏng vấn đã được tập huấn về kỹ thuật nuôi cá

bống kèo do các cơ quan có chức năng tổ chức. Tuy nhiên, phần lớn các hộ xử

lý các tình huống xảy ra trong quá trình nuôi, sử dụng thuốc, hóa chất và

kháng sinh dựa trên kinh nghiệm và học tập trao đổi lẫn nhau. Do ao cá không

được thay nước và lượng thức ăn dư thừa tồn đọng trong ao đã làm cho chất

lượng môi trường nuôi ngày càng xấu đi và là điều kiện tốt cho mầm bệnh

xuất hiện và lây lan trong ao nuôi. Để phòng ngừa dịch bệnh xảy ra trong ao

nuôi, các hộ nuôi đã chủ động phòng bệnh bằng cách sử dụng thuốc và hóa

chất ngay trong tháng đầu tiên sau khi thả giống. Kết quả điều tra cho thấy số

hộ sử dụng kháng sinh dạng nguyên liệu hay dạng thuốc phòng trị bệnh cho cá

bằng cách trộn vào thức ăn và cho cá ăn liên tục trong suốt thời gian nuôi

(chiếm 84,4%). Trong đó số hộ nuôi sử dụng thuốc kháng sinh amoxicillin

chiếm 81,1%, các hộ còn lại (3,3%) sử dụng các loại kháng sinh khác như

ampicillin, tetracycline, enrofloxacin, cotrim, ciprofloxacin… Số hộ không sử

dụng kháng sinh trong suốt thời gian nuôi chiếm 15,6% (Hình 4.2). Bên cạnh

việc trộn kháng sinh vào thức ăn cho cá nhằm mục đích phòng trị bệnh thì có

hộ nuôi trộn Vitamin C vào thức ăn cho cá nhằm tăng sức đề kháng (chiếm

48,9%). Ngoài ra, các hộ nuôi còn sử dụng men tiêu hóa, B Complex, diệp hạ

châu và một số loại thuốc hỗ trợ gan.

Hình 4.2. Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá bống kèo ở Bạc Liêu

Nhìn chung, nghề nuôi cá bống kèo thương phẩm hiện nay phụ thuộc

nhiều vào nguồn cá giống tự nhiên nên việc chọn giống có chất lượng tốt khi

thả nuôi bị hạn chế, người dân lại thả nuôi với mật độ nuôi khá cao trung bình

126,5±31,2 con/m2, trong quá trình nuôi hầu như các hộ nuôi không thay nước

49

ao mà chỉ cấp thêm nước vào ao nuôi khi mực nước trong ao thấp dưới 100cm.

Việc không thay nước nhằm không xáo trộn các yếu tố môi trường trong ao

nuôi giảm mức độ ảnh hưởng đến cá nuôi, tuy nhiên càng về sau ao nuôi ngày

càng bị ô nhiễm do lượng thức ăn thừa cũng như lượng chất bẩn trong ao tăng

cao, các khí độc ngày càng tích tụ tạo điều kiện cho các mầm bệnh phát triển,

trong điều kiện này chỉ cần cá nuôi sức khỏe bị suy giảm hay bị một tác động

nhỏ sẽ dễ dàng xảy ra dịch bệnh trong ao cá nuôi.

4.1.2 Tình hình bệnh trên cá bống kèo nuôi thƣơng phẩm

Bệnh ở cá bống kèo đã xảy ra vào những năm 2007, 2008 và 2009. Kết

quả điều tra cho thấy 100% số hộ nuôi cá bống kèo gặp trở ngại do bệnh trong

suốt thời gian nuôi, dấu hiệu cá bệnh thường gặp là cá bị cong thân, chướng

bụng, lở loét và bị bệnh đường ruột (Hình 4.3).

Hình 4.3 Cá bống kèo bị bệnh

A: Cá bị cong thân; B: Cá bị chướng bụng; C: Cá bị lở loét; D: Cá bị bệnh đường ruột.

Cá bị bệnh nhiều nhất là các bệnh xuất huyết (chiếm 78,9%), lở loét và

chướng bụng (hay người dân thường gọi là sình bụng, chiếm 50%), gan

(chiếm 25,6%). Bên cạnh đó cá bống kèo trong ao nuôi còn xuất hiện một số

bệnh như tuột nhớt, đường ruột, cong thân (Hình 4.4).

Hình 4.4. Tỷ lệ xuất hiện bệnh trong ao nuôi cá bống kèo thương phẩm

50

Tình trạng bệnh thường xuất hiện khi cá nuôi đạt 2 tháng tuổi (giai đoạn

cá chuyển từ ăn thức ăn chìm sang ăn thức ăn nổi). Tuy nhiên, bệnh cũng xuất

hiện khi cá mới thả được 15 ngày. Những năm trước năm 2007 cá bống kèo có

tỷ lệ chết khi mắc bệnh lên đến 100%. Những năm gần đây, nhất là mùa vụ

năm 2011, tỷ lệ chết đã giảm xuống, trung bình tỷ lệ chết là 18,04±12,17 (%),

(Bảng 4.5).

Bảng 4.5. Tỷ lệ cá chết

Tỷ lệ cá chết (%) Số hộ Tỷ lệ (%)

≤ 10

10 – 20

20 – 30

≥30

Không xác định

25

35

17

12

1

27,78

38,89

18,89

13,33

1,11


Kết quả điều tra cho thấy đa phần cá chết tập trung ở tỷ lệ từ 10% - 20%

(chiếm 38,9% số hộ điều tra), tuy nhiên tỷ lệ cá chết trên 30% cũng chiếm tỷ

lệ khá cao, chiếm 13,33% số hộ điều tra. Hầu hết các hộ nuôi không biết rõ

nguyên nhân cá bệnh cũng như cách phòng và trị bệnh cho cá nuôi. Quá trình

sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh người nuôi sử dụng theo kinh nghiệm

và trao đổi với những người cùng nuôi cá bống kèo thương phẩm lân cận.

Kháng sinh được sử dụng là dạng nguyên liệu hoặc thành phẩm trộn vào thức

ăn cho cá ăn định kỳ. Có 81,1% các hộ điều tra chọn kháng sinh amoxicillin

trộn vào thức ăn (2 – 4 g/kg thức ăn) cho cá ăn định kỳ. Khi cá phát bệnh thì

tăng lượng thuốc (3 – 5 g/kg thức ăn) cho ăn liên tục từ 3-5 ngày, sau đó giảm

lượng thuốc kết hợp với giảm lượng thức ăn. Nếu cá không hết bệnh thì tiếp

tục điều trị.

Hiện nay chưa có những nghiên cứu chuyên sâu về bệnh trên cá bống

kèo nên người nuôi chưa được hướng dẫn cụ thể về phương pháp phòng trị

bệnh hiệu quả cho cá bống kèo nuôi thương phẩm. Việc phòng trị bệnh cho cá

bống kèo theo kinh nghiệm và việc sử dụng thuốc kháng sinh tùy tiện như hiện

nay của người nuôi là vấn đề đáng được quan tâm. Việc sử dụng thuốc và hóa

chất không đúng qui định và lặp đi lặp lại trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình

trạng kháng thuốc của vi khuẩn làm cho việc điều trị ngày càng kém hiệu quả

(Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2005).

4.2 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo

Ký sinh trùng là một trong những tác nhân gây bệnh truyền nhiễm trong

ao nuôi, tiến hành kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo nuôi thương phẩm

nhằm xác định sự hiện diện cũng như khả năng gây bệnh của ký sinh trùng

51

ảnh hưởng đến sức khỏe và tỷ lệ sống của cá bống kèo. Qua các đợt thu mẫu

cho thấy thành phần giống loài ký sinh trùng xuất hiện trên cá bống kèo tương

đối ít, chủ yếu là các ký sinh trùng thuộc ngoại ký sinh (Bảng 4.6).

Bảng 4.6 Cường độ và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên cá bống kèo

Kết quả Bảng 4.6 cho thấy, không tìm thấy ký sinh trùng trong ruột của

cá bống kèo nuôi thương phẩm. Trên da và mang cá tìm thấy 04 loài ký sinh

trùng có hình thái, cấu tạo phù hợp với mô tả của Hà Ký và Bùi Quang Tề

(2007) đó là Chilodonella, Epistylis, Trichodina và Ergasilus. Các loài ký sinh

trùng này hiện diện trên cơ thể cá với cường độ cảm nhiễm thấp (từ 2 – 8

trùng/lame) vả tỷ lệ cảm nhiễm rất thấp (từ 20% – 33,81%). Theo Nguyễn Thị

Thu Hằng (2009), nếu tỷ lệ cảm nhiễm 90-100%, cường độ cảm nhiễm 20 –

30 trùng/10X là gây nguy hiểm cho cá và cá phát bệnh khi cường độ cảm

nhiễm đạt 50 – 100 trùng/10X (được trích bởi Từ Thanh Dung và ctv., 2014),

với kết quả này chứng tỏ sự hiện diện của ký sinh trùng không ảnh hưởng đến

tình hình sức khỏe cá trong ao nuôi, điều này có thể lý giải do mô hình nuôi cá

bống kèo thâm canh, nuôi với mật độ cao, người nuôi thường xuyên sử dụng

các loại vi sinh và hóa chất xử lý môi trường ao nuôi cũng như sử dụng thuốc

kháng sinh trong thức ăn của cá nên đã khống chế sự hiện diện của ký sinh

trùng trong ao nuôi.

4.3 Phân lập và định danh vi khuẩn trên cá bống kèo bệnh xuất

huyết

4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn

Tiến hành thu mẫu cá bống kèo tại 3 điểm gồm: Thành phố Bạc Liêu,

huyện Đông Hải và huyện Hòa Bình, tỉnh Bạc Liêu. Qua 06 đợt, đã thu mẫu cá

ở 34 ao gồm có 23 ao nuôi đang có dấu hiệu bệnh và 11 ao nuôi không có dấu

hiệu bệnh. Khi tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên cá lờ đờ, tấp mé, có biểu hiện bất

thường và mẫu cá khỏe đã phân tích được 254 mẫu cá, trong đó có 128 mẫu cá

bệnh. Các mẫu cá được tiến hành phân lập vi sinh trên gan, thận và tỳ tạng.

Sau 48 giờ để ở 28oC kết quả phân lập đã thu được số mẫu khuẩn lạc trong

Ký Sinh Trùng

Da Mang

CĐN

(Trùng/lame)

TLN

(%)

CĐN

(Trùng/lame)

TLN

(%)

Chilodonella 8 27,24

Epistylis 8 33,33

Trichodina 2 20 6 33,81

Ergasilus 2 20

52

những lần phân lập là 252, tỷ lệ khuẩn lạc thu được từ các cơ quan tập trung

nhiều ở cơ quan thận của cá chiếm 38,1% (Bảng 4.7; Phụ lục C.2)

Bảng 4.7 Số lượng vi khuẩn phân lập từ các cơ quan qua các đợt thu mẫu

Thu mẫu

Cơ quan

Đợt

1

Đợt

2

Đợt

3

Đợt

4

Đợt

5

Đợt

6

Tổng cộng

Số lượng Tỷ lệ (%)

Thận 13 13 6 11 26 27 96 38,1

Gan 15 17 5 0 30 23 90 35,7

Tỳ tạng 6 12 6 0 6 36 66 26,2

Tổng cộng 34 42 17 11 62 86 252 100

4.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa vi khuẩn gây bệnh trên

cá bống kèo

Các chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường TSA+ có hình thái khuẩn

lạc nhỏ, hình tròn có màu trắng đục, kích thước dao động từ 0,4 – 0,8

µm/khuẩn lạc.

Kết quả nhuộm Gram cho thấy đa số các chủng vi khuẩn bắt màu Gram

(+), có dạng hình cầu, ghép với nhau tạo thành chuỗi dài có dạng song cầu,

liên cầu (Hình 4.5).

Hình 4.5 Hình dạng vi khuẩn Gram (+) hình liên cầu (100X)

Trong 252 chủng vi khuẩn thu được có 249 chủng vi khuẩn có hình cầu,

gram (+), không di động, đa số vi khuẩn âm tính với oxidase (231/249 chủng)

và catalase (174/249 chủng). Có 03 chủng vi khuẩn hình que, gram (-), di

động, dương tính với oxidase và catalase. Khi tiến hành kiểm tra chỉ tiêu O/F

của 190 chủng có 179/190 chủng đều cho kết quả (-/-), còn lại có 11 chủng vi

khuẩn cho kết quả O/F là (+/+) (Phụ lục C.2).

Kết quả tiến hành kiểm tra khả năng tan huyết của 15 chủng vi khuẩn

cho thấy 100% các vi khuẩn đều có khả năng phát triển trong môi trường có

chứa 5% máu cừu nhưng không gây tan huyết. Ngoài ra, 15/15 chủng vi khuẩn

đều không phát triển trong môi trường TSB có bổ sung 6,5% NaCl (Hình 4.6).

53

Hình 4.6 Kết quả kiểm tra tan huyết và khả năng phát triển trong môi trường

TSB (+6,5%NaCl)

(A): Vi khuẩn không gây tan huyết trên môi trường chứa 5% máu cừu.

(B): Vi khuẩn không phát triển trong môi trường TSB (+6,5%NaCl).

4.3.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep

Dựa trên đặc tính sinh hóa vi khuẩn của Buller (2004), kết quả định danh

ngẫu nhiên 32 chủng vi khuẩn bằng kit API 20 Strep cho thấy các chủng

dương tính với phản ứng Alkaline phosphatase (chiếm 100%), Leucine

AminoPeptidase (chiếm 100%), Ribose (chiếm 100%), Trehalose (chiếm

100%), hầu hết dương tính với Amygdalin (90,6%), Arginine Dihydrolase

(chiếm 93,7%), β-glucuronidase (chiếm 93,7%). Các chủng phản ứng âm tính

với các chỉ tiêu còn lại (Hình 4.7 và Phụ lục C.3).

Hình 4.7 Kết quả test API 20Strep 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G

Khi so sánh kết quả test API 20Strep của các chủng vi khuẩn thu được

với kết quả nghiên cứu của Nomoto et al. (2004) và Buller (2004) cho thấy có

sự sai khác từ 2 - 4 chỉ tiêu và mức độ tương đồng 80 - 90% với chủng định

danh là Streptococcus dysgalactiae (Phụ lục C.3). Kết quả này phù hợp với

đặc điểm sinh hóa quan trọng của chủng S. dysgalactiae như: dương tính với

alkaline phosphatase, leucine arylamidase, ribose, trehalose, lactose và âm tính

với voges-proskauer, glycogen.

4.3.4 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp giải trình tự

Để xác định danh pháp đến mức loài của các chủng vi khuẩn gây bệnh

xuất huyết trên cá bống kèo, tiến hành giải trình tự nucleotide ở đoạn gen 16S

rRNA của 10 chủng vi khuẩn gồm A1F1, A1F2, A1F4, A1F6, A1F9, A5F4,

54

B1-6T, B2-3TT, B2-5G và B6-9TT. Trình tự nucleotide của 10 chủng vi

khuẩn được chọn sau khi giải mã tiến hành so sánh với các loài vi khuẩn được

lưu trữ từ ngân hàng dữ liệu gen của NCBI với tỉ lệ nucleotide tương đồng lần

lượt là 1003/1004; 1005/1005; 996/997; 971/972; 618/624; 537/546; 608/612;

597/602; 573/575 và 336/345 (Bảng 4.8).

Bảng 4.8 Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự vi khuẩn phân lập trên

cá bệnh xuất huyết với vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI

STT Kí hiệu

chủng

Các loài vi khuẩn

từ ngân hàng dữ

liệu gen của NCBI

Mã số lưu trữ

trong ngân hàng

dữ liệu gen

Mức độ

tương

đồng

Tỉ lệ

nucleotide

tương đồng

1 B1-6T S. dysgalactiae KM077497.1 99% 1003/1004

2 B2-5G S. dysgalactiae KM077497.1 100% 1005/1005

3 B6-9TT S. dysgalactiae KM077497.1 99% 996/997

4

5

6

7

8

9

10

B2-3TT

A1F1

A1F2

A1F4

A1F6

A1F9

A5F4

S. dysgalactiae

S. dysgalactiae

S. dysgalactiae

S. dysgalactiae

S. dysgalactiae

S. dysgalactiae

S. dysgalactiae

KM077497.1

NR043661.1

NR043661.1

NR043661.1

HE858529.1

NR043661.1

NR043661.1

99%

99%

98%

99%

99%

99%

97%

971/972

618/624

537/546

608/612

597/602

573/575

336/345

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

Kết quả tìm kiếm so sánh trình tự nucleotide đoạn gen 16S rRNA trên cơ

sở dữ liệu (NCBI) ngân hàng gen bằng chương trình trực tuyến BLAST

SEARCH cho thấy, chủng B2-5G với chiều dài đoạn gen 16S rRNA được

khuếch đại gồm 1.005 nucleotide tương đồng 100% với đoạn 16S rRNA của

chủng vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae được lưu trữ trong dữ liệu ngân

hàng gen với mã số lưu trữ là KM077497.1 (Phụ lục C.4). Tương tự đối với các

chủng còn lại sau khi giải trình tự gen 16S rRNA, kết quả tìm kiếm so sánh

trình tự nucleotide đoạn gen 16S rRNA trên cơ sở dữ liệu (NCBI) ngân hàng

gen bằng chương trình trực tuyến Blast Search, các chủng đều tương đồng

99% với đoạn 16S rRNA của chủng vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae (Phụ

lục C.4).

Theo Janda và Abbott (2007) đề nghị độ dài trình tự gen 16S khi giải mã

để định danh loài cần ít nhất từ 500 đến 525 bp và lý tưởng nhất khi độ dài đạt

1300 đến 1500 bp và theo Bosshard et al. (1990) thì mức độ tương đồng khi so

sánh trình tự đoạn gen với mức độ tương đồng đạt ≥99% thì xác định chính

xác đến mức độ loài, khi mức độ tương đồng nằm trong khoảng ≥95% và

<99% thì xác định được ở mức độ chi, như vậy với kết quả giải trình tự gen

của 9 chủng với trình tự độ dài gen trên 525 bp và tỉ lệ tương đồng đạt từ 99%

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

55

trở lên đủ tin cậy cho việc định danh loài vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá

bống kèo.

Với kết quả tra cứu trên NCBI, dựa vào mức độ tương đồng trình tự đoạn

gen 16S rRNA ở các chủng được giải trình tự so sánh trên hệ thống ngân hàng

gen cho thấy, cả 10 chủng vi khuẩn khi giải trình tự và so sánh với ngân hàng

dữ liệu gen NCBI đều trùng khớp với các chủng vi khuẩn được xác định là S.

dysgalactiae với mức độ tương đồng trên 97% (Phụ lục C.4), kết quả này nằm

trong khoảng cho phép và chấp nhận, nhất là chủng vi khuẩn B2-5G mức độ

tương đồng với vi khuẩn S. dysgalactiae (ký hiệu KM077497.1) đạt 100%.

Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu giải trình tự gen 16S rRNA

của Streptococcus spp. (Nomoto R. et al., 2004; Nomoto R. et al., 2008;

Abdelsalam et al., 2013) và kết quả định danh vi khuẩn S. dysgalactiae gây

bệnh trên cá rô phi Nile của Costa et al. (2013).

4.4 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo

4.4.1 Xác định đặc điểm bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

4.4.1.1 Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi thương phẩm xuất hiện tập trung

khi cá nuôi đạt 2 tháng tuổi. Cá bị xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý bất thường

như bơi lờ đờ, tấp mé, bỏ ăn, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với

tiếng động.

Dấu hiệu bệnh lý biểu hiện bên ngoài của cá bệnh xuất huyết như màu

sắc nhợt nhạt, xuất huyết trên thân, trên bụng, nắp mang và thường xuất huyết

ở các vi như vi ngực, vi bụng, vi lưng, vi hậu môn, các khối u trên bề mặt cơ

thể, mắt lồi, mờ đục và phù ra. (Hình 4.8).

56

Hình 4.8. Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài của cá bống kèo bệnh xuất huyết

(A): Cá bống kèo tấp mé

(B), (C): Cá bống kèo bị xuất huyết trên các vây và toàn thân

Dấu hiệu bệnh lý bên trong được ghi nhận là xoang bụng cá chứa đầy

dịch nhờn, gan bị xuất huyết hoặc tái nhạt, tỳ tạng bị sưng to hoặc teo nhỏ và

xuất huyết, thận xuất huyết và bị nhũn (Hình 4.9).

Hình 4.9: Dấu hiệu bệnh lý bên trong của cá bống kèo bệnh xuất huyết

(A) Cá bống kèo khỏe; (B) Tỳ tạng sưng to và xuất huyết; (C) Gan cá sưng to và xuất huyết;

(D) Gan cá xuất huyết, tỳ tạng sưng to, thận bị nhũn.

57

Dấu hiệu bệnh lý biểu hiện bên ngoài và bên trong khi cá bống kèo bị

bệnh xuất huyết tương tự như mô tả của Wunging Yang và Aihua Li (2009)

khi quan sát cá tầm A. Schrenckii bị xuất huyết do vi khuẩn S. dysgalactiae

gây ra, cá tầm cũng có những dấu hiệu bệnh lý như cá bị chướng bụng, xuất

huyết trên thân, trên các vây và xuất huyết trên gan, thận. Các dấu hiệu tương

tự cũng được mô tả trên cá đối Liza Haematocheila khi cá nhiễm S.

dysgalactiae cá bơi lờ đờ, tấp mé và có những biểu hiện bệnh tương tự như

xuất huyết trên thân và xuất huyết ở gan và thận (Qi et al., 2013).

Dấu hiệu tương tự như ở một số loài cá khác khi bị bệnh xuất huyết như

cá điêu hồng khi bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae (Đặng Thị Hoàng Oanh và

Nguyễn Thanh Phương., 2012), cá rô phi bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae

(Phạm Hồng Quân và ctv., 2013), cá bớp bị nhiễm vi khuẩn Vibrio

alginolyticus và V. parahaemolyticus (Nguyễn Thị Thúy An và ctv., 2013).

4.4.1.2 Kết quả quan sát tiêu bản mẫu tƣơi thận phết kính

Quan sát 150 tiêu bản phết kính mẫu tươi mô thận cá bống kèo kết quả

cho thấy, đối với những mẫu cá có dấu hiệu bệnh xuất huyết phát hiện thấy sự

xuất hiện nhiều cụm vi khuẩn hình cầu (150/150 mẫu), Gram (+) nằm rải rác

hoặc tập trung thành từng cụm trên vùng mô phết. (Hình 4.10)

Kết quả quan sát cũng cho thấy vi khuẩn tấn công phá vỡ màng tế bào

hồng cầu, tạo ra nhiều khoảng trống trên tế bào chất, vi khuẩn còn tập trung

chung quanh vách tế bào hồng cầu tạo thành một vòng tròn. Ở mẫu cá bệnh

tìm thấy nhiều loại tế bào bạch cầu, đồng thời cũng tìm thấy rất nhiều đại thực

bào, chúng tạo ra nhiều khoảng trống trên tế bào chất của tế bào bạch cầu và tế

bào bạch cầu bị vi khuẩn phá vỡ màng tế bào (Hình 4.10).

58

Hình 4.10. Mẫu thận cá bống kèo phết kính (Wright & Giemsa, 100X)

(A): Mẫu thận cá khỏe; (B): Vi khuẩn phá vở tế bào, tập trung thành cụm; (C): Mẫu đại thực

bào; (D): Vi khuẩn bao quanh và phá vỡ màng tế bào hồng cầu.

Sự hiện diện cầu khuẩn Gram (+) nằm rải rác hoặc tập trung thành từng

đám trên vùng mô thận phết khi nhuộm Wright và Giemsa cũng được

Abdelsalam et al. (2013) mô tả ở cá hồi khi gây nhiễm bằng vi khuẩn S.

dysgalactiae trong phòng thí nghiệm. Tương tự cũng được mô tả ở cá chim

bạc Pampus argenteus và cá điêu hồng khi nhiễm S. agalactiae (Duremdez et

al., 2004). Hiện tượng xuất huyết, tế bào bị biến đổi cấu trúc, hoại tử và xuất

dịch viêm ở gan, thận và tỳ tạng cho thấy khả năng gây bệnh ở mức tế bào của

vi khuẩn S. dysgalactiae. Theo Robert (1989), biểu hiện của sự xuất huyết là

khi cơ quan bị viêm, lúc này cơ thể sẽ huy động một lượng lớn các tế bào

hồng cầu vùng bị viêm, khi quá trình này diễn ra quá mức dẫn đến các mao

mạch bị vỡ, các tế bào máu thoát ra ngoài xen lẫn với các tế bào của cơ quan,

quá trình này kéo dài dẫn đến hoại tử mất cấu trúc.

Trên mẫu cá khỏe không có hoặc có rất ít vi khuẩn khi tiến hành quan sát

mẫu thận phết kính.

4.4.2 Đặc điểm mô bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

Tác nhân gây bệnh bắt đầu xâm nhập vào cơ thể vật chủ sẽ làm biến đổi

các cấu trúc về mô của các cơ quan như mang, gan và thận ở giai đoạn sớm,

quá trình phân tích mô bệnh học là một phương pháp kiểm soát mầm bệnh

hữu hiệu trước khi thiệt hại xảy ra nghiêm trọng (Jiraungkoorskul et al.,

2006).

59

Kết quả phân tích mô bệnh học trên cá bống kèo cho thấy cấu trúc của

các cơ quan mang, thận và gan của cá bệnh xuất huyết có nhiều biến đổi về

cấu trúc, bị hoại tử, có hiện tượng sung huyết và xuất huyết trên vùng mô của

các cơ quan. Kết quả được thể hiện trong Phụ lục C.5.

4.4.2.1 Biến đổi cấu trúc mô học ở mang

Mang cá đóng vai trò quan trọng trong quá trình hô hấp, trao đổi khí, bài

tiết (CO2, NH3 và Ure), cân bằng acid base, điều tiết ion và điều hòa áp suất

thẩm thấu (Steve F. Perry và Pierre Laurent, 1993; Evans et al., 1999). Vòm

mang được cấu tạo từ nhiều cung mang, mỗi cung mang có nhiều tơ mang.

Kết quả quan sát cho thấy có 127/127 mẫu mang cá bống kèo bị bệnh

xuất huyết có hiện tượng phình to tơ mang và sự dính lại của các sợi mang

(Hình 4.11 B và C). Tơ mang phình to và bị xuất huyết, các sợi mang bị dính

lại hoặc mất cấu trúc cả phiến mang. Theo Robert (1989) thì hiện tượng sưng

phồng và dính lại của mang là do khi bị vi khuẩn tấn công tạo nên phản ứng

miễn nhiễm làm cho các tế bào mang sưng lên và khi tế bào mang càng sưng

to sẽ dẫn đến sự tiếp xúc giữa các sợi mang. Từ đó làm suy giảm chức năng

hô hấp và khi bệnh xảy ra, cấu trúc mang bị hủy hoại nghiêm trọng.

Hình 4.11 Mô mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X).

(A) Mang cá bống kèo khỏe: tơ mang (), sợi mang (); (B) Sợi mang phình to, có hiện

tượng tăng sinh biểu mô (), động mạch vào sợi mang bị nhiễm khuẩn (); (C) Sợi mang

dính lại và mất cấu trúc phiến mang (), các tế bào biểu mô tăng kích thước (); (D) Mang

bị mất cấu trúc.

Kết quả quan sát cho thấy có sự tăng kích thước và sinh khối các tế bào

biểu mô làm màng tế bào biểu mô dày lên, sợi mang ngắn lại hoặc thoái hóa,

động mạch vào mang bị xuất huyết và có hiện tượng bị nhiễm khuẩn (Hình

4.11). Hiện tượng các sợi mang bị dính lại do quá trình thực bào của tế bào

bạch cầu khi có vi khuẩn xâm nhập, chúng tiết ra nhiều enzym làm cho các tế

bào giữa các sợi mang sưng lên dẫn đến tiếp xúc nhau, đồng thời mang tiết

http://link.springer.com/search?facet-author=%22Steve+F.+Perry%22

http://link.springer.com/search?facet-author=%22Pierre+Laurent%22

60

dịch nhầy do phản ứng tự vệ của các tế bào miễn dịch không đặc hiệu dẫn đến

các sợi mang dính lại. Khi xảy ra tổn thương nặng mang bị mất cấu trúc cả

phiến mang, làm giảm diện tích tiếp xúc của mang với môi trường, ngăn cản

quá trình hô hấp của cá (Hibiya, 1982).

Những biến đổi ở mô mang cá bị bệnh xuất huyết như các sợi mang bị

dính lại, phình to hoặc mất cấu trúc, có hiện tượng tăng sinh phù hợp với mô

tả về biến đổi ở mô mang của cá điêu hồng bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae

(Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011), cá rô phi nhiễm

Streptococcus spp. (Trương Đình Hoài và ctv., 2014).

4.4.2.2 Biến đổi cấu trúc mô học ở thận

Thận cá bống kèo nằm dọc sống lưng trong xoang cơ thể, thận có màu

đỏ sẫm bao gồm thận trước và thận sau phân chia không rõ ràng. Thận trước

đóng vai trò như cơ quan tạo máu bao gồm các tế bào lympho, tế bào kẻ (mô

tạo máu) và mô nội tiết. Thận sau có chức năng lọc máu, duy trì và tái hấp thu

nước, kích thích tố, chất dinh dưỡng đồng thời bài tiết chất thải (Galit và

Dina, 2012). Đồng thời thận còn có chức năng điều hòa áp suất thẩm thấu.

Tùy theo môi trường sống mà mỗi loài cá có cơ chế hấp thu hoặc loại bỏ nước

và ion khác nhau (Sonia et al., 2007). Cá bống kèo là loài rộng muối nên có

khả năng tự điều hòa áp suất thẩm thấu theo môi trường sống.

Quan sát mô thận cá bệnh cho thấy chủ yếu là hiện tượng xuất huyết,

sung huyết các mao mạch và tĩnh mạch, ống thận xơ hóa và lòng ống giãn nở,

quản cầu thận phình to kèm theo biến đổi cấu trúc, và hoại tử (Hình 4.12).

Theo Đỗ Thị Hòa và ctv. (2004) hiện tượng sung huyết xảy ra là do kích thích

đặc biệt làm cho mao mạch nở ra một lượng máu lớn hơn bình thường được

đưa đến gần ổ viêm. Hiện tượng sung huyết được xem là phản ứng đầu tiên

của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh (Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị

Hoàng Oanh, 2011). Hiện tượng sung huyết ở mô thận cá được ghi nhận ở hầu

hết các mẫu cá bị bệnh, ngoài ra hiện tượng xuất huyết và hoại tử hạt hay hoại

tử hóa lỏng cũng được tìm thấy trên mẫu mô thận của cá bệnh.

Biểu hiện của sự xuất huyết trên mô chính là khi cơ quan bị viêm nhiễm.

Lúc này cơ thể sẽ huy động một lượng lớn các tế bào hồng cầu vùng bị viêm

và khi quá trình này diễn ra quá giới hạn chịu đựng sẽ dẫn đến các mao mạch

bị vỡ làm cho các tế bào máu chảy ra ngoài cùng với các tế bào của cơ quan,

quá trình này kéo dài sẽ dẫn đến hoại tử mất cấu trúc (Robert, 1989).

Mô thận của cá bệnh bị sung huyết, xuất huyết dẫn đến hoại tử và biến

đổi cấu trúc, khi thận bị biến đổi cấu trúc sẽ ảnh hưởng đến chức năng hoạt

động của thận cá. Thận bị hoại tử làm mất những chức năng quan trọng của

61

thận như điều hòa áp suất thẩm thấu, bài tiết, sản xuất hồng cầu cũng như tiết

hormone điều hòa các quá trình sinh lý của cơ thể. Đối với những mẫu cá

bống kèo khỏe, không tìm thấy sự biến đổi cấu trúc mô thận.

Hình 4.12 Mô thận cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X)

(A): Thận cá bống kèo khỏe, ống thận (↓); (B) Mô thận bị xuất huyết (↓), trung tâm đại thực

bào sắc tố (↓); (C): Mô thận bị hoại tử (↓), biến đổi cấu trúc; (D): Mô thận bị nhiễm khuẩn

(↓); (E): Quản cầu thận phình to và biến đổi cấu trúc (↓) (100X); (F): Mô thận có hiện tượng

sung huyết (↓), Quản cầu thận phình to và biến đổi cấu trúc (↓).

Biến đổi cấu trúc mô thận của cá bống kèo bị xuất huyết do vi khuẩn S.

dysgalactiae cũng tương tự như sự biến đổi cấu trúc mô thận của cá điêu hồng

(Oreochromis spp.) khi nhiễm vi khuẩn S. agalactiae (Đặng Thụy Mai Thy và

Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011) hay như cá rô đồng (Anabas testudineus) bị

nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Streptococcus spp. (Đặng Thụy

Mai Thy và ctv., 2012).

4.4.2.3 Biến đổi cấu trúc mô học ở gan

Theo Hibiya (1982), gan là một trong những tuyến tiêu hóa được phát

triển từ ruột nguyên thủ, nó có cấu tạo từ các tế bào gan và lớp mạng giữ chức

năng nâng đỡ gan. Gan của động vật có xương sống đóng vai trò quan trọng

62

trong quá trình chuyển hóa và dự trữ glycogen, là nơi giải độc cho cơ thể và

sản xuất ra kháng thể đồng thời cũng là nơi tiết ra dịch mật, một dịch thể quan

trọng trong quá trình tiêu hóa. Ngoài ra, gan còn đảm nhiệm việc tạo máu khi

cá còn nhỏ (Hibiya, 1982). Gan cá bống kèo là một dạng mô mỡ (Hình

4.13A). Cấu tạo của mô mỡ gồm có các không bào lipid có kích thước tương

đồng, các mao mạch máu và mô liên kết (John và Patricia, 2007).

Kết quả quan sát các mẫu mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết cho

thấy gan có hiện tượng bị nhiễm khuẩn (Hình 4.13E), tĩnh mạch gan bị sung

huyết (Hình 4.13C), không bào lipid phình to, không đồng nhất tạo nên vùng

mô gan bị biến đổi cấu trúc (Hình 4.13E & F), sự xuất hiện của các không bào

lipid to bất thường, tế bào lympho và tế bào hồng cầu hiện diện nhiều trong

mô mỡ dẫn đến vùng mô bị xơ hóa nhẹ nếu nặng sẽ hình thành u nang hoặc

vôi hóa cuối cùng gây hoại tử (John và Patricia, 2007).

Hiện tượng hoại tử xuất hiện nhiều trên tế bào gan, gan hoại tử gần như

hóa lỏng, những vùng sung huyết tế bào máu phân hủy thành dịch viêm, tế

bào hồng cầu bị hủy hoại, nhân tan, tế bào chất trở nên đồng nhất bắt màu

Eosin (Hình 4.13B & D). Hiện tượng sung huyết kéo dài sẽ làm vỡ mạch máu,

giải thoát nhiều enzym tiêu hóa từ các bạch cầu làm cho tế bào ở vùng viêm bị

hủy hoại dẫn đến hoại tử. Những tổn thương diễn ra làm cho gan không còn

chức năng khử độc, lọc máu, chuyển hóa protein, lipid, glucid, tiết dịch mật,

làm cho chất độc không được loại bỏ sẽ tích lũy trong cơ thể kết hợp với

những yếu tố khác làm chết cá (Robert, 1989).

Biến đổi mô học ở gan cũng được tìm thấy ở cá rô phi khi tiến hành gây

cảm nhiễm với vi khuẩn S. dysgalactiae (Nehal et al., 2014), kết quả tác giả

cũng đã phát hiện gan cá xuất hiện tình trạng sung huyết, xuất huyết gây hoại

tử các tế bào gan. Ngoài ra, các hiện tượng biến đổi mô học trên gan cũng

được mô tả nhiều ở các loài cá khác khi bị bệnh xuất huyết như cá đối Liza

Haematocheila bị nhiễm vi khuẩn S. dysgalactiae (Qi et al., 2013); cá điêu

hồng khi bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae (Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị

Hoàng Oanh, 2011), cá rô phi nhiễm Streptococcus sp. (Trương Đình Hoài và

ctv., 2014).

http://vi.wikipedia.org/wiki/Trao_%C4%91%E1%BB%95i_ch%E1%BA%A5t



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Glycogen&action=edit&redlink=1



63

Hình 4.13 Mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X)

(A): Gan cá khỏe, tĩnh mạch gan (↓), không bào lipid (↓); (B) Dịch viêm giữa các tế bào (↓);

(C): Tĩnh mạch gan bị sung huyết (↓); (D): Vùng tế bào gan bị sung huyết (↓); (E): Gan bị

nhiễm khuẩn (↓), không bào lipid phình to (↓), biến đổi cấu trúc tế bào gan (↓); (F): Vùng

mô gan bị biến đổi cấu trúc (↓).

4.4.3 Đặc điểm huyết học trên cá bống kèo bệnh

4.4.3.1 Hình thái tế bào

Quan sát máu cá bống kèo cho thấy tế bào hồng cầu có dạng hình oval

hay elip và nhân hình tròn ở giữa. Số lượng tế bào hồng cầu chiếm nhiều nhất

trong tất cả các tế bào máu. Bốn loại bạch cầu cũng được tìm thấy gồm tế bào

lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu. Tế bào lympho có

kích thước nhỏ hơn hồng cầu, nhân chiếm gần hết tế bào có hình tròn hoặc

hình oval, tế bào chất rất ít và bắt màu xanh đậm. Bạch cầu đơn nhân có kích

thước lớn hơn hồng cầu có nhân bắt màu tím nằm lệch về một phía của tế bào

và tế bào chất có màu xanh, một số tế bào có thể quan sát được không bào

trong tế bào chất. Bạch cầu trung tính có hình tròn hay oval, nhân nằm lệch và

có thể quan sát thấy 2 nhân. Tiểu cầu có hình tròn hay hình thon dài, nhân bắt

màu xanh đậm hay tím đậm, tế bào chất rất ít và bắt màu xanh nhạt khi nhuộm

Giemsa (Hình 4.14).

64

Hình 4.14. Hình dạng tế bào máu ở cá bống kèo (100X)

(A): Hồng cầu (↓); (B): Tiểu cầu (↓); (C): Bạch cầu đơn nhân (↓), Tiểu cầu (↓), Bạch cầu

trung tính (↓), Tế bào lympho (↓); (D): Bạch cầu đơn nhân (↓).

Kết quả quan sát tế bào máu trên mẫu phết kính ở cá bống kèo bị bệnh

xuất huyết cho thấy xuất hiện nhiều cụm vi khuẩn trong máu cá và tế bào máu

bị biến đổi hình dạng (Hình 4.15). Vi khuẩn tấn công làm màng tế bào hồng

cầu bị phá vỡ, bên trong tế bào chất có nhiều khoảng không bào hay không

còn tế bào chất. Bên cạnh đó các loại tế bào bạch cầu cũng thay đổi hình dạng,

cá bệnh cũng tìm thấy bốn loại tế bào bạch cầu.

Hình 4.15 Máu cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (100X)

(A): Vi khuẩn hình cầu tấn công màng tế bào hồng cầu (↓); (B): vi khuẩn tấn công

màng tế bào (↓) và tạo khoảng không bào trong tế bào chất (↓).

Quan sát hình dạng cho thấy màng bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung

tính và tiểu cầu bị biến đổi, xuất hiện nhiều khoảng trống ở tế bào chất của

bạch cầu đơn nhân. Không quan sát thấy sự biến đổi này ở tế bào lympho

(Hình 4.15).Theo Hibiya (1982), máu rất nhạy với các chức năng sinh lý của

cơ thể cũng như các thay đổi bệnh lý ở cá và các thay đổi này khác nhau tùy

loài. Ở cá bệnh số lượng hồng cầu bị giảm dẫn đến hiện tượng thiếu máu được

chứng minh trên cá hồi, cá vàng phản ứng chống lại vi khuẩn A. hydrophila và

bệnh EUS (Rehulka, 1998; Brenden N.B và H.W Huizinga, 1986).

65

Theo Ainsworth (1992), bạch cầu giúp bảo vệ cơ thể chống lại các tác

nhân gây bệnh do vi khuẩn và các yếu tố hóa học. Ngoài đại thực bào thì chức

năng chính của bạch cầu trung tính là thực bào vi khuẩn vì vậy khi vi khuẩn

tấn công thì số lượng tế bào này gia tăng phản ứng lại tác nhân gây bệnh nhằm

bảo vệ cơ thể.

4.4.3.2 Huyết học

Hồng cầu là loại huyết cầu có số lượng nhiều nhất trong các tế bào máu.

Hồng cầu có hình tròn hay hình oval, có một nhân tròn nằm giữa tế bào chất,

nhân bắt màu tím đậm, tế bào chất rất lớn so với nhân và có màu xám xanh,

phân chia rõ ràng với nhân (Hình 4.14A). Do có nhân nên hồng cầu của cá có

mức trao đổi chất cao, tiêu hao lượng oxygen lớn. Đây là dạng hồng cầu

trưởng thành phù hợp với các miêu tả của Hibiya (1982), Chinabut et al.

(1991).

Số lượng hồng cầu trong máu cá dao động từ 6,8 x 106 CFU/ml

đến 28,6

x 106 CFU/ml, có sự khác biệt về số lượng hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá

bệnh xuất huyết (Bảng 4.9).

Bảng 4.9 Mật độ hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh xuất huyết

Ao Mật độ hồng cầu (tế bào x 106/ml)

Ao cá bình

thường

Ao 4 21,45±2,79b

Ao 5 19,49±0,56b

Ao 8 19,80±0,37b

Ao cá bệnh

Ao 1 17,06±4,49ab

Ao 2 14,89±1,57a

Ao 3 16,99±3,04ab

Ao 6 14,42±1,74a

Ao 7 12,73±3,21a

Ao 9 13,16± 2,93a

Ao 10 14,23±1,92a

Ao 11 16,23±3,61a

Các giá trị trong cùng một cột (a, b) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê

(P<0,05) và ngược lại.

Kết quả thu mẫu cho thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa các ao nuôi (Bảng

4.9), ở những mẫu cá bệnh số lượng hồng cầu giảm so với những mẫu cá

khỏe, khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Ở cá bệnh, số lượng hồng cầu

giảm là phản ứng chống lại vi khuẩn xâm nhập cơ thể, điều này cũng đã được

phát hiện ở cá hồi và cá vàng khi cơ thể bị nhiễm khuẩn, số lượng hồng cầu

trong cơ thể cá giảm đáng kể dẫn đến hiện tượng thiếu máu ở cá bệnh, đây là

phản ứng chống lại vi khuẩn của cơ thể (Rehulka, 1998; Brenden và Huizinga,

1986). Khi cá bệnh hồng cầu có một số thay đổi ở quá trình trực phân, phân

chia nhân làm nhân tế bào có 2 thùy hay quá trình phân chia không đều nên

66

nhân có 2-3 phần và xuất hiện hồng cầu không nhân (Hibiya, 1982). Tuy

nhiên, trong quá trình quan sát không thấy xuất hiện tế bào hồng cầu không

nhân, hồng cầu đa nhân và rất ít thấy hồng cầu tiền trưởng thành. Bên cạnh đó

khi quan sát tế bào hồng cầu ở cá bệnh thấy xuất hiện nhiều cụm vi khuẩn và

tế bào hồng cầu bị phá vỡ làm cho số lượng hồng cầu giảm (Hình 4.13).

4.4.3.3 Bạch cầu

Kết quả quan sát được 4 loại tế bào bạch cầu ở cá bống kèo là tế bào

lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu (Hình 4.16).

Không có sự khác biệt về hình dạng của các loại bạch cầu giữa cá khỏe và cá

bệnh. Tương tự như kết quả nghiên cứu của Martins et al. (2008) khi gây cảm

nhiễm cá rô phi với vi khuẩn Enterococcus spp. chỉ phát hiện được 4 loại tế

bào bạch cầu trong máu cá rô phi đó là tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân,

bạch cầu trung tính và tiểu cầu, ngoài ra khi nghiên cứu biến đổi thành phần

huyết học trong cá chép khi bị nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila,

Mostafa et al. (2000) cũng chỉ tìm thấy 4 loại bạch cầu như trên, tương tự với

kết quả của Đặng Thụy Mai Thy (2010) khi nghiên cứu trên cá tra bị nhiễm

Edwardsiella ictaluri cũng chỉ tìm được 4 loại bạch cầu trong máu cá mà

không thấy bạch cầu có hạt ưa bazơ và bạch cầu có hạt ưa acid.

Hình 4.16 Các loại bạch cầu (100X)

(A): Tiểu cầu (↓); (B): Bạch cầu trung tính (↓);

(C): Bạch cầu đơn nhân (↓), Tế bào lympho (↓).

a. Số lƣợng tổng bạch cầu

Kết quả phân tích mẫu cho thấy, số lượng bạch cầu trong máu cá dao

động từ 290.000 – 990.000 tế bào/ml. Đối với ao cá khỏe có tổng số lượng

bạch cầu trung bình 34,2 x 104 tế bào/ml thấp so với các ao nuôi cá đang có

dấu hiệu bệnh xuất huyết có tổng lượng bạch cầu cao trung bình 81,8 x 104

tế

bào/ml. Số lượng bạch cầu ở các ao nuôi cá có dấu hiệu bệnh xuất huyết khác

biệt mang ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Bảng 4.10).

67

Bảng 4.10 Số lượng bạch cầu trên cá bống kèo

Ao Mật độ bạch cầu (tế bào x 104/ml)

Ao cá bình thường

Ao 4 45,80±8,97c

Ao 5 50,25±6,27c

Ao 8 34,28±5,05d

Ao cá bệnh xuất

huyết

Ao 1 82,50±7,25ae

Ao 2 73,40±11,64b

Ao 3 76,70±9,09ab

Ao 6 82,90±5,93ae

Ao 7 84,90±6,33e

Ao 9 85,42±5,74e

Ao 10 84,40±6,39e

Ao 11 85,50±7,42e

Các giá trị trong cùng một cột (a, b, c, d) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống

kê (P<0,05) và ngược lại.

Theo Houston (1990) bạch cầu có vai trò thực bào và đáp ứng miễn dịch

chống lại mầm bệnh xâm nhập và các nhân tố bất lợi khác. Sự gia tăng mật độ

bạch cầu trong máu là cơ chế để vật chủ chống lại tác nhân bên ngoài xâm

nhập (Benli và Yildiz, 2004), bạch cầu của cá luôn tăng lên ở cá nhiễm bệnh,

nhiễm độc ở giai đoạn đầu và giảm dần ở thời điểm về sau do sự suy yếu miễn

dịch. Do đó, sự tăng lên của tế bào bạch cầu trên cá bống kèo bị xuất huyết là

một trong những đặc điểm sinh học bệnh lý và báo động tình trạng sức khỏe

của cá trong ao nuôi.

b. Bạch cầu đơn nhân

Kết quả định lượng cho thấy, bạch cầu đơn nhân trong các ao nuôi cá

bống kèo dao động từ 10.800 – 211.500 tế bào/ml. Số lượng bạch cầu đơn

nhân ớ các ao nuôi có dấu hiệu bệnh cao hơn so với ao nuôi cá khỏe và có sự

khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Bảng 4.11).

Bảng 4.11 Kết quả so sánh các loại bạch cầu ở cá bống kèo

Ao Mật độ các loại bạch cầu (tế bào x 10

4/ml)

BC Đơn nhân BC Trung tính Tiểu cầu Lympho

Ao

cá bình

thường

4 6,18±2,66cd

11,23±6,11bc

15,98±3,47b 12,40±8,51

a

5 8,21±4,61abcd

7,80±4,38b 14,61±2,32

b 19,61±7,06

ac

8 3,16±1,07d

3,28± 4,31b 11,25±1,21

ab 16,58±2,43

a

Ao cá

bệnh

1 13,25±4,53a

36,27±5,22a

17,32±7,94ab

15,66±6,90a

2 8,94±6,35abcd

27,7±13,35acd

12,85±4,13ab

23,88±14,87ab

3 9,84±7,05abcd

19,07±11,88bd

13,50±6,73ab

34,28±10,91bc

6 15,29±5,26a

27,74±7,12ad

16,62±4,52b 23,23±7,58

ad

7 12,06±2,75a

30,54±6,43ad

9,81±1,65a 32,47±5,37

bd

9 10,79±2,97ac

23,14±6,34cd

11,04±1,12a 40,44±5,75

b

10 8,80±2,98ac

24,89±6,53d 11,09±4,08

ab 39,60±6,46

b

11 10,43±3,92ac

24,39±11,86d

14,50±5,96ab

36,15±6,46b

Các giá trị trong cùng một cột (a, b, c, d) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống


68

Qua kết quả Bảng 4.11 cho thấy, số lượng bạch cầu đơn nhân ở ao cá

khỏe khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với ao cá bệnh (trừ ao 5). Mật

độ bạch cầu đơn nhân ở ao cá khỏe thấp hơn mật độ bạch cầu đơn nhân ở ao

có dấu hiệu bệnh lý.

c. Bạch cầu trung tính

Kết quả phân tích, mật độ bạch cầu trung tính của cá bống kèo dao động

khoảng 0,61x104 tb/ml đến 54 x10

4 tb/ml. Số lượng bạch cầu trung tính ở ao

cá khỏe khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với ao cá bệnh (Bảng 4.11).

d. Tế bào lympho

Qua Bảng 4.11 cho thấy, tế bào lympho ở các ao dao động từ 2,2 x 104

đến 47,5 x 104 tế bào/ml, mật độ trung bình cao nhất ở ao cá bệnh số 9 (40,44 ±

5,75 x 10

4 tế bào/ml) và thấp nhất là ở ao cá khỏe số 4 ở mức tế bào lympho

trung bình là (12,40±8,51 x 104 tế bào/ml), kết quả các tế bào lympho ở các ao

cá khỏe (4,5 và 8) khác biệt so với các ao cá bệnh (3, 7, 9, 10 và 11) ở mức ý

nghĩa P<0,05.

e. Tiểu cầu

Kết quả định lượng cho thấy, hai ao cá khỏe 4 và 5 khác biệt so với hai

ao cá bệnh 7 và 9 (P <0,05) (Bảng 4.11). Ở ao cá khỏe có mật độ tế bào tiểu

cầu thấp hơn so với mật độ tế bào tiểu cầu ở các ao cá có dấu hiệu bệnh lý.

Nhìn chung, số lượng các loại tế bào bạch cầu ở những ao cá có dấu hiệu

bệnh xuất huyết gia tăng so với những ao cá khỏe, sự khác biệt này có ý nghĩa

thống kê (P <0,05). Tương tự như kết quả nghiên cứu của Martins et al. (2008)

trên cá rô phi nhiễm vi khuẩn Enterococcus spp. đã tìm thấy số lượng của các

loại tế bào bạch cầu như lympho, bạch cầu trung tính, bạch cầu dơn nhân và

tiểu cầu đều cao hơn so với cá rô phi khỏe.

Toida et al. (2003) cho rằng do sự tập trung nhanh chóng tế bào lympho

ở những vùng bị viêm làm cho quá trình cung cấp bổ sung tế bào này ở vùng

ngoại vi của máu bị giảm. Bạch cầu gia tăng số lượng trong 24 giờ và đại thực

bào trong vòng 3 ngày và có vai trò quan trọng trong việc hình thành hàng rào

bảo vệ chống lại các tác nhân cơ hội gây bệnh. Ngoài ra sự thay đổi số lượng

bạch cầu trong máu cho thấy phần lớn đại thực bào ở những vùng bị viêm di

chuyển từ mạch máu đến phản ứng với tác nhân gây bệnh mặc dù đại thực bào

phân bố khắp cơ thể (Suzuki và Iida, 1992).

69

4.5 Phát triển qui trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo

bằng phƣơng pháp sinh học phân tử

4.5.1 Kết quả chiết tách DNA trực tiếp từ mô thận cá

Kết quả chiết tách, đo hàm lượng DNA và độ tinh sạch DNA từ 16 mẫu

thận cá cho thấy độ tinh sạch ở bước sóng 260 nm là 1,57 – 1,78 và hàm lượng

DNA thận cá nằm trong khoảng 1.675 – 3385 ng/µl.

4.5.2 Kết quả chiết tách DNA vi khuẩn

Kết quả chiết tách từ 49 chủng vi khuẩn phân lập có độ tinh sạch ở bước

sóng 260 nm là 1,3 - 1,9 và hàm lượng DNA khoảng 2.500 – 5000 ng/µl. Từ

kết quả chiết tách cho thấy hàm lượng DNA chiết tách từ vi khuẩn dao động từ

2.765 - 4.855 ng/µl và độ tinh sạch dao động từ 1,7 ng/µl đến 2 ng/µl.

4.5.3 Kết quả khảo sát cặp mồi cho qui trình PCR phát hiện

Streptococcus dysgalactiae

Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đặc hiệu phát hiện vi khuẩn

S. dysgalactiae dựa theo phương pháp của Hassan et al. (2003), đối chứng

dương sử dụng trong phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae là vi

khuẩn đã được giải mã định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S là vi

khuẩn có ký hiệu B2-5G. Kết quả điện di sản phẩm PCR dương tính, phát hiện

S. dysgalactiae khi sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 ở vị trí 259 bp

thể hiện qua Hình 4.17.

Hình 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Streptococcus

dysgalactiae bằng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2

(M): thang DNA; 1: B1-6T; (+): đối chứng dương (B2-5G); (-): đối chứng âm.

Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR hiện vạch DNA đặc hiệu của vi

khuẩn S. dysgalactiae ở vị trí 259 bp. Tương tự với kết quả nghiên cứu của

Nomoto et al. (2004) khi sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 theo

phương pháp của Hassan et al. (2003) cũng đã phát hiện vi khuẩn S.

dysgalactiae ở 259 bp là vi khuẩn gây bệnh trên cá trác sọc vàng (amberjack

Seriola quinqueradiata, Seriola dumerili).

70

4.5.4 Kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của qui trình PCR phát hiện

vi khuẩn S. dysgalactiae

4.5.4.1 Kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn

S. dysgalactiae

Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện S.

dysgalactiae thể hiện qua Hình 4.18.

Hình 4.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình

(M): thang DNA; (1): Vibrio parahaemolyticus; (2): Streptococcus dysgalactiae; (3):

Edwardsiella ictaluri; (4): Aeromonas hydrophilla; (5): Streptococcus agalactiae; (6):

Flavobacterium columnare.

Kết quả điện di (Hình 4.18) cho thấy, qui trình khuếch đại chỉ hiện vạch

đặc hiệu ở 259 bp của vi khuẩn S. dysgalactiae mà không hiện vạch sản phẩm

đối với các chủng vi khuẩn khác. Điều này đã xác định được tính đặc hiệu của

qui trình khi chỉ phát hiện được vi khuẩn S. dysgalactiae mà không phát hiện

được các loài vi khuẩn khác khi sử dụng mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2. Kết

quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hassan et al. (2003) và Nomoto

et al. (2004) khi sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đã phát hiện

chính xác 100% S. dysgalactiae và qui trình cũng chỉ phát hiện được vi khuẩn

S. dysgalactiae ở vạch 259 bp mà không hiện vạch sản phẩm đối với các

chủng vi khuẩn khác.

4.5.4.2 Kiểm tra độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S.

dysgalactiae

Kết quả điện di cho thấy, độ nhạy của qui trình có thể phát hiện vi khuẩn

S. dysgalactiae ở mật độ thấp nhất là 50 ng vi khuẩn và vạch AND xuất hiện

rõ dần ở các mật độ cao thể hiện phản ứng ngày càng rõ hơn. Kết quả xác định

độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae là 50 ng DNA vi

khuẩn/0,5g mô thận (Hình 4.19).

71

Hình 4.19 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ nhạy của qui trình

(M): thang DNA; (1): 25 ng; (2): 50 ng; (3): 100 ng; (4): 200 ng; (5): 400 ng; (6): 800 ng;

(7): 1.600 ng; (8): 3.200 ng.

4.5.5 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi

khuẩn S. dysgalactiae

4.5.5.1 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình từ mẫu vi khuẩn

Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 phát hiện vi khuẩn S.

dysgalactiae dựa theo phương pháp của Hassan et al. (2003) để xác định ngẫu

nhiên 10/250 chủng vi khuẩn còn lại bằng phương pháp PCR, kết quả cho thấy

cả 10/10 chủng (100%) nhạy với cặp mồi STRD-DyI/ dys-16S–23S-2 ở 259

bp (Hình 4.20).

Hình 4.20 Kết quả PCR 10 chủng vi khuẩn

M: thang DNA; (+): đối chứng dương (B2-5G); (1): A1F1-T; (2): A2F3-G; (3): B3K1F2-T;

(4): B1K2F1-G; (5): B3F2-T; (6): F7-T; (7): B1-10TT; (8): B5-8T; (9): B4-6G; (10): B5-3T;

(-): đối chứng âm.

Qua kết quả trên cho thấy cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đã phát

hiện chính xác vi khuẩn S. dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo,

khẳng định khả năng ứng dụng qui trình này trong thực tế.

4.5.5.2 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình từ mẫu thận cá

bống kèo bệnh

Tiến hành kiểm tra ứng dụng qui trình chẩn đoán trên 10 mẫu cá bống

kèo có kí hiệu A1F1, A1F2, A1F4, A1F6, A1F9, A5F4, B1-6, B2-3, B2-5 và

B6-9. Tất cả 10 mẫu này đều có dấu hiệu bệnh lý xuất huyết như xuất huyết ở

các vây, xuất huyết ở gan, thận và tỳ tạng. Trên thận của 10 mẫu cá này đều

72

xuất hiện tình trạng xuất huyết, sung huyết các mao mạch và tĩnh mạch, ống

thận xơ hóa, biến đổi cấu trúc và hoại tử.

Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm khuếch đại đặc hiệu cho vi khuẩn S.

dysgalactiae có kích thước 259 bp không xuất hiện ở các mẫu DNA thận cá

(Hình 4.21).

Hình 4.21 Kết quả PCR từ mẫu thận cá bống kèo bệnh xuất huyết

M: thang DNA; (-): đối chứng âm; (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9): mẫu thận cá; (+): đối chứng

dương.

Như vậy, qui trình PCR chẩn đoán S. dysgalactiae chưa thể ứng dụng để

phát hiện trực tiếp loài vi khuẩn này trên mẫu cá bệnh. Trong một số kết quả

nghiên cứu của Nomoto et al. (2004), Nomoto et al. (2008) và Abdelsalam et

al. (2009) khi sử dụng phương pháp PCR phát hiện tác nhân vi khuẩn gây

bệnh là S. dysgalactiae đều sử dụng trực tiếp DNA của vi khuẩn phân lập

được, chưa có kết quả nào được đưa ra về khả năng phát hiện vi khuẩn này

trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm. Điều này có thể do trong quá trình chiết tách

DNA mẫu thận cá, không định lượng được DNA vi khuẩn trong mẫu đủ để

phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae. Tuy nhiên với kết quả đã xác định ở độ

nhạy của qui trình, sản phẩm PCR sẽ hiện vạch sản phẩm trong kết quả điện di

ở vị trí 259 bp khi hàm lượng vi khuẩn đạt 50 ng.

4.6 Phƣơng pháp điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ở qui mô

phòng thí nghiệm

4.6.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

4.6.1.1 Kết quả kháng sinh đồ

Phục hồi 4 chủng vi khuẩn B1-6T, B2-3TT, B2-5G, B6-9TT. Quan sát

thấy cả 4 chủng vi khuẩn đều có cùng đặc điểm đồng nhất về hình dạng, là

khuẩn lạc nhỏ tròn, trắng đục (Hình 4.22A) và hình cầu, Gram (+) (Hình

4.22B), không di động, âm tính với oxidase, catalase.

73

Hình 4.22 Kết quả tách ròng và nhuộm gram các chủng vi khuẩn sử dụng

trong thí nghiệm kháng sinh đồ

(A): Kết quả tách ròng vi khuẩn; (B): Kết quả nhuộm gram.

Kết quả kháng sinh đồ của 4 chủng vi khuẩn với 12 loại kháng sinh được

thể hiện qua Hình 4.23 và Bảng 4.12.

Hình 4.23 Kết quả kháng sinh đồ với vi khuẩn S. dysgalactiae

Các chủng vi khuẩn S. dysgalactiae trong thí nghiệm có tính nhạy cao

đối với nhóm fenicol, nhóm tetracyclin (3/4 chủng), và giảm tính nhạy xuống

đối với kháng sinh nhóm Aminoglycosides: Neomycin (2/4 chủng),

Gentamycin (0 chủng). Bên cạnh đó nhóm Quinolone, thí nghiệm có sử dụng

kháng sinh Norfloxacin để thử tính nhạy tuy nhiên, ở kháng sinh này cho kết

quả thấp chỉ có 1/4 chủng nhạy với kháng sinh này.

74

Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ

Kháng sinh Đường kính trung bình vòng vô trùng (mm)

B1-6T B2-3TT B2-5G B6-9TT

Neomycin

(N, 30µg)

S 17,5 17

I

R 11,5 16

Florfenicol

(FFC, 30µg)

S 25,5 25,5 23,5

I

R 12

Doxycycline

(DO, 30µg)

S 25,5 26 18

I 15,5

R

Gentamicin

(GM, 10µg)

S

I

R 10,5 8,5 18 16

Cefazolin

(CZ, 30µg)

S

I 17,5 17,5 23,5 13,5

R

Ampicillin

(AMP, 25µg)

S

I

R 12,5 12 13 17

Amoxicillin

(AML, 25µg)

S

I

R 12 11 13,5 17

Tetracycline

(TE, 30µg)

S 25,5 26,5 24

I

R 12

Trimethoprim +

sulfamethoxazole

(SXT,1.25/23.75µg)

S 18 19 21

I

R 11

Norfloxacin

(NOR, 5µg)

S 20,5

I 13 15,5 13

R

Ciprofloxacin

(CIP, 5µg)

S 24,5 24

I 18

R 14

Enrofloxacin

(ENR, 5µg)

S 24

I 20 20

R 13,5

Ghi chú: S: Nhạy; I: trung bình; R: kháng

Từ kết quả Bảng 4.12 cho thấy, 8/12 loại kháng sinh nhạy với 4 chủng vi

khuẩn khảo sát, trong đó có 4 loại kháng sinh có tính nhạy cao gồm có FFC,

DO, TE và SXT với tỷ lệ 75%. Tuy nhiên FFC, TE và SXT đều có tỷ lệ kháng

là 25%, còn DO không có tỷ lệ kháng ở 4 chủng khảo sát. Tương tự với kết

quả nghiên cứu của Wuming Yang và Aihua Li (2009) cho thấy vi khuẩn S.

dysgalactiae được phân lập từ cá tầm Acipenser schrenckii có tính nhạy cao

75

với DO và chloramphenicol. Ngoài ra, kết quả khảo sát của Francis P. M et al.

(2014) khi lập kháng sinh đồ đối với chủng S. iniae cho thấy FFC, DO, TE là

những kháng sinh có độ nhạy cao với S. iniae.

Bên cạnh đó, kháng sinh AML có tỷ lệ kháng cao, kháng với 3/4 chủng

nghiên cứu chiếm tỷ lệ 75%. Theo kết quả khảo sát, do trong quá trình nuôi

người dân có sử dụng kháng sinh AML định kỳ để phòng trị bệnh, đây có thể

là nguyên nhân gây nên hiện tượng kháng AML ở vi khuẩn này. Điều này xảy

ra tương tự kết quả của Phạm Thanh Hương và ctv. (2011) khi nghiên cứu sự

kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas

hydrophila gây bệnh trên cá tra, kết quả cho thấy AML và AMP đã bị hai

chủng vi khuẩn này kháng hoàn toàn.

Ngoài ra, giữa các chủng vi khuẩn thí nghiệm còn xuất hiện hiện tượng

đa kháng thuốc như: chủng B1-6T kháng với 3 loại kháng sinh đó là GM,

AML và AMP; chủng kháng nhiều loại kháng sinh nhất là chủng B2-5G

kháng 4 loại gồm FFC, SXT, AML và AMP.

Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh hay cụ thể là hiện tượng đa kháng

thuốc hiện nay trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam nói riêng hay trên thế

giới nói chung đã không còn xa lạ và rất phổ biến trong hiện tại. Qua kết quả

kháng sinh đồ trên cho thấy, việc kháng thuốc của vi khuẩn trong nuôi trồng

thủy sản là một vấn đề cần phải quan tâm. Bởi cùng một loại kháng sinh

nhưng lại cho kết quả kháng sinh đồ khác nhau rất nhiều trong cùng một loài

cũng như trong các nghiên cứu với nhau. Sự khác biệt trên có thể do phương

thức và mức độ sử dụng thuốc trong quá trình nuôi của người dân giữa các

vùng là khác nhau. Việc kháng thuốc của vi khuẩn là do người nuôi sử dụng

thuốc không đúng qui tắc sử dụng thuốc an toàn và chưa hiểu hết những tác

hại của việc phối hợp thuốc không đúng cách trong điều trị.

FFC là kháng sinh thuộc nhóm fenicol, có phổ kháng khuẩn rộng, là

kháng sinh được dùng để đặc trị bệnh gan thận mủ trong nhiều năm qua, theo

những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy tỷ lệ kháng FFC của vi khuẩn gây

bệnh gan thận mủ là 73% (Phạm Thanh Hương và ctv., 2011). Theo Keyes et

al. (2000), thì FFC được ứng dụng rộng rãi trong ngành thú y và trong nuôi

trồng thủy sản ở châu Á từ những thập niên 1980. Sự gia tăng tính kháng trên

kháng sinh nhóm Fenicol là do vi khuẩn đề kháng thông qua nhiều cơ chế

khác nhau như: đào thải thuốc kháng sinh ra khỏi tế bào thông qua kênh

protein (efflux protein) có trên thành tế bào vi khuẩn (Cloeckaert et al., 2000);

mã hóa gen liên qua đến integron và thông qua plasmid (Keys et al., 2000).

76

Đối với nhóm tetracycline, vi khuẩn kháng với TE chủ yếu qua hai cơ

chế: qua các protein bảo vệ ribosome (RPPs-ribosomal protection proteins) và

hệ thống bơm thải tetracyclin phụ thuộc năng lượng (energy-dependent efflux

pumps) (Roberts, 1996). Hai cơ chế khác cũng được phát hiện là bất hoạt

kháng sinh bởi enzyme (Yang et al., 2004) và thay đổi vị trí đích (target site)

tác dụng của kháng sinh bằng đột biến vùng 16S rRNA (Ross et al., 1998).

DO là kháng sinh thuộc thế hệ mới nhất của nhóm Tetracyclin. Kết quả nghiên

cứu này cho thấy 3/4 các chủng vi khuẩn Streptococcus sp. nhạy với kháng

sinh DO. Sự tác động mạnh mẽ và tiêu diệt vi khuẩn của nhóm kháng sinh này

vẫn còn rất cao. Theo Bùi Kim Tùng (2001), TE là nhóm kháng sinh thường

dùng để trị các bệnh hô hấp ở người, brucella, mycolasma.

Với kết quả trên có thể sử dụng FFC, DO, TE để trị bệnh xuất huyết trên

cá bống kèo nhưng chỉ nên sử dụng khi thật cần thiết để hạn chế tình trạng

kháng thuốc và điều đáng lưu ý cho các nhà quản lý cũng như người nuôi vì

đây là những kháng sinh được khuyến cáo là hạn chế sử dụng theo Thông tư

số 15/2009/TT-BNN ngày 17 tháng 3 năm 2009 của Bộ Trưởng Bộ Nông

nghiệp & PTNT (Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2014), nên trong quá trình sử

dụng cần được quản lý chặt chẽ và ngừng sử dụng trước khi thu hoạch để

tránh tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm.

4.6.1.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Qua kết quả kháng sinh đồ chọn ra 02 loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn

cảm gồm FFC, DO và 01 loại kháng sinh có tỷ lệ kháng cao là AML để xác

định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh với 4 chủng vi khuẩn B1-

6T, B2-3TT, B2-5G, B6-9TT. Xác định MIC đối với các chủng vi khuẩn trên

để tìm ra nồng độ thấp nhất mà kháng sinh có hiệu lực ức chế sự phát triển của

vi khuẩn. Từ đây giúp cho việc sử dụng thuốc với liều lượng thấp nhất nhưng

vẫn có hiệu quả, hạn chế khả năng kháng thuốc của vi khuẩn. Trong 4 chủng,

có 2 chủng B1-6T và B6-9TT thể hiện tính kháng mạnh với AML (256 ppm).

Riêng B1-6T kháng với FFC (4 ppm), DO với nồng độ (4 ppm) đã ức chế

được vi khuẩn nhưng với chủng B6-9TT DO phải ở nồng độ (8 ppm) mới ức

chế được, cho thấy chủng B6-9TT có xu hướng kháng với kháng sinh DO. Kết

quả MIC được trình bày ở Bảng 4.13.

77

Bảng 4.13 Kết quả MIC của 4 dòng vi khuẩn S.dysgalactiae trên 3 loại kháng

sinh FFC, DO và AML

Vi khuẩn

Kháng sinh

Kết quả MIC (ppm) Điểm tới hạn

CLSI, 2012 (M100-S22)

B1.6T B6.9TT B2.5G B2.3TT S R

AML 256 256 128 128 ≤ 8 ≥ 32

FFC 4 4 4 4 ≤ 2 ≥ 8

DO 4 8 4 4 ≤ 4 ≥ 16

Ghi chú: S: Nhạy; I: trung bình; R: kháng

Kết quả cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của AML cao nhất và dao

động từ 128 ppm - 256 ppm. Kế đó là DO có nồng độ thấp hơn (4 ppm - 8

ppm) và cuối cùng là FFC có nồng độ thấp nhất (4 ppm) tương ứng khả năng

kháng khuẩn của FFC mạnh nhất trong 3 loại kháng sinh và yếu nhất là AML.

So sánh với kết quả nghiên cứu của Ellen Portis et al. (2012) cho thấy,

MIC của kháng sinh FFC đối với vi khuẩn Streptococcus spp. là 8 ppm cao

hơn so với nghiên cứu (4 ppm) và nghiên cứu của Aoki T. et al. (1983) thì

MIC của DO là 2 ppm thấp hơn so với kết quả nghiên cứu (4 – 8 ppm), qua so

sánh trên cho thấy, vi khuẩn S. dysgalactiae gây bệnh trên cá bống kèo nuôi

trong thời điểm hiện nay vẫn nhạy với FFC và đã có xu hướng kháng với DO.

4.6.2 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm

Tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm cá bống kèo khỏe với 4 nghiệm thức là

4 chủng vi khuẩn B1-6T; B2-3TT; B2-5G; B6-9TT và nghiệm thức đối chứng

là nước muối sinh lý để xác định tác nhân gây bệnh. Sau 7 ngày theo dõi kết

quả cho thấy, ở tất cả các nghiệm thức tiêm vi khuẩn đều xuất hiện cá chết, có

dấu hiệu xuất huyết ở các vây và xuất huyết ở gan, thận, tỳ tạng giống với

những biểu hiện của cá bệnh thu ở ao nuôi. Chủng vi khuẩn B2-5G cho tỷ lệ

cá chết cao nhất là 86,7%; kế đến là chủng B1-6T có tỷ lệ cá chết là 76,7%;

chủng B2-3TT và chủng B6-9TT có tỷ lệ chết bằng nhau 73,3%; ở bể đối

chứng tiêm nước muối sinh lý có tỉ lệ chết 13,3% (Bảng 4.14).

Bảng 4.14: Tỉ lệ chết của 4 chủng vi khuẩn S. dysgalactiae ở thí nghiệm cảm

nhiễm

STT Chủng vi khuẩn Tỉ lệ chết (%)

1 B1-6T 76,7

2 B2-3TT 73,3

3 B2-5G 86,7

4 B6-9TT 73,3

5 ĐC 13,3

78

Trong quá trình thí nghiệm, ở nghiệm thức đối chứng có xuất hiện cá

chết ở ngày đầu tiên sau khi bố trí thí nghiệm với tỷ lệ chết là 13,3% và những

ngày tiếp theo không xuất hiện cá chết, khi tiến hành phân lập mẫu cá không

có vi khuẩn xuất hiện, như vậy cá chết ở nghiệm thức này có thể là do bị sốc

vì thao tác tiêm nước muối sinh lý và tỷ lệ chết này không đáng kể so với các

nghiệm thức còn lại. Còn ở những nghiệm thức tiêm vi khuẩn, cá bắt đầu chết

từ ngày thứ 2 sau khi cảm nhiễm và tình trạng cá chết kéo dài đến khi kết thúc

thí nghiệm. (Hình 4.24).

Hình 4.24 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm

Tiến hành theo dõi các biểu hiện của cá trong thí nghiệm cho thấy cá lờ

đờ, bơi lội kém linh hoạt, xuất huyết dưới da vào ngày thứ 2 và 3. Đây là dấu

hiệu đặc trưng của bệnh do nhóm vi khuẩn Streptococcus gây ra đã được miêu

tả bởi nhiều tác giả như Bromage (1999); Buller (2006).

Quan sát dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong của mẫu bệnh phẩm và

tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận và tỳ tạng để xác định các chỉ tiêu sinh hóa.

Từ kết quả quan sát và phân tích cho thấy chúng là vi khuẩn hình tròn, màu

trắng đục, kích thước < 1µm, Gram (+), hình cầu hay liên cầu, không di động,

phản ứng âm tính với oxidase và catalase, không có khả năng lên men glucose

trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí. Vi khuẩn có khả năng phát triển trong

môi trường có chứa 5% máu cừu nhưng không có khả năng gây tan huyết. Kết

quả quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng vi

khuẩn phân lập từ cá bống kèo gây cảm nhiễm được trình bày ở Bảng 4.15.

Kết quả định danh bằng kit API 20 Strep cho thấy tất cả các chủng cho

phản ứng dương tính với β-glucuronidase, alkaline phosphatase, leucine amino

peptidase, ribose, trehalose, sorbitol, lactose, amygdaline. Và âm tính với các

79

chỉ tiêu còn lại. Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của các chủng vi

khuẩn trong nghiên cứu này, giống với vi khuẩn S. dysgalactiae (Buller, 2004

và Nomoto et al., 2004).

Bảng 4.15 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ cá

bống kèo gây cảm nhiễm.

Ghi chú: (1): chủng B1-6T; (2): chủng B2-3TT; (3): chủng B2-5G; (4): chủng B6-9TT; (+): dương

tính; (-): âm tính; v: không xác định.

Bên cạnh đó, khi sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đặc hiệu

cho phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae dựa theo phương pháp của Hassan et

al. (2003) để xác định 4 chủng vi khuẩn trên bằng phương pháp PCR, kết quả

cho thấy cả 4/4 chủng (100%) đều dương tính với sản phẩm PCR, cho vạch

sáng ở vị trí 259 bp. (Hình 4.25).

Chủng vi khuẩn

Chỉ tiêu 1 2 3 4 Buller

(2004)

Nomoto et al.

(2004)

Nhuộm Gram + + + + + +

Hình dạng cầu cầu cầu cầu cầu cầu

Di động - - - - - -

Sinh catalaza - - - - - -

Sinh oxidaza - - - - - -

Phản ứng lên men yếm khí - - - - - -

Phản ứng lên men hiếu khí - - - - - -

Mọc trên môi trường máu + + + + + +

Gây tan huyết γ γ γ γ γ γ

Phản ứng Voges-Proskauer - - - - - -

Hippurate hydrolysis - - - - - -

Bile-esculin tolerance - - - - v -

Pyrrolidonyl arylamidase - - - - v -

Sinh α-galactosidase - - - - - -

Sinh β-glucuronidase + + + + + +

Sinh β-galactosidase - - - - - -

Alkaline phosphatase + + + + + +

Leucine AminoPeptidase + + + + + +

Arginine Dihydrolase

Sử dụng đƣờng

- - - - + -

Ribose + + + + + +

Arabinose - - - - - -

Manitol - - - - - -

Sorbitol + + + + - +

Lactose + + + + + +

Trehalose + + + + + +

Inulin - - - - v -

Raffinose - - - - - -

Amygdaline + + + + v +

Glycogen - - - - + -

80

Hình 4.25 Kết quả PCR 4 chủng vi khuẩn

Giếng M: thang; (+): đối chứng dương; (-): đối chứng âm; (1): chủng B1-6T; (2): chủng B2-

3TT; (3): chủng B2-5G; (4): chủng B6-9TT.

Kết quả trên cho phép xác định vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá

bống kèo chính là vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae. Vi khuẩn này cũng đã

được xác định là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên một số loài cá nước lợ mặn

như cá trác sọc vàng yellowtail Seriola quinqueradiata, cá bò biển amberjack

Seriola demerili (Nomoto et al., 2004), cá chim vây vàng Trachinotus ovatus

(Zhou et al., 2007), cá tầm Acipencer schrenckii (Yang và Li, 2009), cá đối

xám Mugil cephalus (Abdelsalam et al., 2009), và cá đối Liza Haematocheila

(Qi et al., 2013).

4.6.3 Kết quả thí nghiệm xác định giá trị LD50

Kết quả theo dõi tình trạng sức khỏe cá trong thí nghiệm cho thấy cá ở lô

đối chứng vẫn hoạt động bình thường, đối với các nghiệm thức tiêm vi khuẩn

thì cá bị nhiễm bệnh và chết với những dấu hiệu bệnh lý bên ngoài như xuất

huyết ở các vây, trên thân và bên trong gan, thận và tỳ tạng của cá bị xuất

huyết và sưng to. Qua những dấu hiệu trên cho thấy, khi cảm nhiễm 02 chủng

vi khuẩn B1-6T và B2-5G thì cá có dấu hiệu bệnh lâm sàng giống với dấu hiệu

cá bệnh xuất huyết thu ngoài ao nuôi.

Sau khi cảm nhiễm cá đến ngày thứ 2 cá bắt đầu chết kéo dài đến ngày

thứ 8 và sau đó cá ngưng chết đến khi kết thúc thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm

cho thấy, vi khuẩn B1-6T gây tỉ lệ chết thấp nhất (38,3%) ở mật độ vi khuẩn

4,25 x 102 CFU/ml và gây tỉ lệ chết cao nhất (88,3%) ở mật độ vi khuẩn 4,25 x

108 CFU/ml. Tương tự ở chủng B2-5G, tỷ lệ gây chết thấp nhất ở mật độ vi

khuẩn 3,5 x 102 CFU/ml là 48,3% và 3,5 x 10

8 CFU/ml là 90%. Cá ở nghiệm

thức tiêm nước muối sinh lý cũng bị chết trong vòng từ 2 – 4 ngày sau khi

tiêm nhưng sau đó không có cá chết, tỷ lệ chết thấp 11,67%, tiến hành phân

lập không có vi khuẩn. Như vậy, cá ở nghiệm thức này chết có thể do bị sốc vì

thao tác tiêm nước muối sinh lý và tỷ lệ chết này không đáng kể so với các

nghiệm thức còn lại (Bảng 4.16).

81

Bảng 4.16 Kết quả xác định tỉ lệ gây chết của hai chủng B1-6T và B2-5G

Mật độ Vi khuẩn

vi khuẩn (CFU/ml)

Tỉ lệ gây chết (%)

Chủng B1-6T Chủng B2-5G Đối chứng

102 38,3 48,3

11,67

103 48,3 58,3

104 50 63,3

105 73,3 71,7

106 78,3 75

107 81,7 81,7

108 90 88,3

LD50 4,25 x 104

3,5 x 103,17

Ở cùng nồng độ 102 CFU/ml vi khuẩn B1-6T gây tỉ lệ chết (38,3%) thấp

hơn chủng B2-5G (48,3%), ngược lại ở mật độ vi khuẩn 108 CFU/ml thì tỉ lệ

gây chết của vi khuẩn B1-6T (90%) cao hơn so với tỉ lệ gây chết của vi khuẩn

B2-5G (88,3%). Như vậy, mật độ vi khuẩn khác nhau tỉ lệ chết của cá trong thí

nghiệm khác nhau theo chiều hướng mật độ vi khuẩn tăng thì tỉ lệ cá chết tăng

(Hình 4.26).

Hình 4.26 Kết quả thí nghiệm LD50 của vi khuẩn B1-6T và B2-5G

Qua kết quả thí nghiệm xác định được nồng độ gây chết của chủng vi

khuẩn B1-6T là LD50 = 4,25 x 104

CFU/ml và chủng B2-5G = 3,5 x

103,71

CFU/ml.

Nồng độ gây chết của vi khuẩn tùy thuộc vào sự mẫn cảm khác nhau của

từng loài cá (Agnew và Barnes, 2007). Khi tiến hành nghiên cứu nồng độ gây

chết của vi khuẩn S. dysgalactiae trên cá tầm (Acipenser schrenckii) của Yang

và Li (2009) đã xác định LD50 = 4 x 108 CFU/ml, tương tự với kết quả nghiên

cứu của Pan et al., (2009) khi xác định LD50 trên cá tầm Siberian (Acipenser

baerii) cũng xác định được là 3 x 108 CFU/ml. Tuy nhiên, đối với cá đối (Liza

Haematocheila), khi Z.T. Qi et al., (2013) nghiên cứu nồng độ gây chết của vi

khuẩn S. dysgalactiae trên cá đối này đã xác định LD50 = 5,4 x 106 CFU/ml.

Và trong kết quả của thí nghiệm xác định LD50 của S. dysgalactiae trên cá

82

bống kèo là dao động 3,5 x 10 3,71

đến 4,25 x 104 CFU/ml. Điều này xác định

tùy thuộc vào từng loài cá mà nồng độ gây chết của cùng một vi khuẩn khác

nhau. Kết quả LD50 của S. dysgalactiae trên cá bống kèo dao động 3,5 x 10 3,71

đến 4,25 x 104 CFU/ml cũng khá phù hợp với nồng độ gây chết của một số

loài vi khuẩn Streptococcus spp. khác như LD50 của vi khuẩn S. agalactiae

trên cá điêu hồng là 4,89 x 104 CFU/ml (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn

Thanh Phương, 2012), vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm nuôi ở Úc là 3,2 x 104

CFU/cá (Bromage et al., 1999).

4.6.4 Kết quả thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mô phòng thí nghiệm

Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm thăm dò xác định được liều LD50 của

chủng S. dysgalactiae B1-6T là 4,25 x 104 CFU/ml. Do đó cá ở các nghiệm

thức 1, 2, 3, 4, 5 được gây cảm nhiễm liều LD50 bằng phương pháp tiêm với

mật độ vi khuẩn là 104 CFU/ml.

Kết quả cho thấy, cá ở nghiệm thức 1, 2, 3, 4 và 5 có dấu hiệu bệnh lý

như cá bơi lờ đờ, da cá nhợt nhạt, một số cá xuất hiện tình trạng xuất huyết ở

các gốc vây và chết từ ngày thứ 3 sau khi gây cảm nhiễm (Hình 4.27A và B).

Tiến hành giải phẫu, quan sát bên trong các cơ quan nội tạng cho thấy

gan bị xuất huyết, thận và tỳ tạng bị sưng to, mềm nhũn (Hình 4.27C và D),

một số con bên trong xoang bụng có dịch hôi, tương tự như dấu hiệu bệnh lý

của những mẫu cá bống kèo bệnh thu được ngoài hiện trường và giống như

một số loài cá bị bệnh xuất huyết khác như cá rô phi khi bị bệnh xuất huyết có

các dấu hiệu như xuất huyết ở vây ngực và vây bụng, xoang bụng chứa dịch

hôi và nội tạng bị xuất huyết và mềm nhũn (Phạm Hồng Quân, 2013). Dấu

hiệu bệnh lý được mô tả tương tự trong nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh

và Nguyễn Thanh Phương (2012) ở cá điêu hồng bị bệnh xuất huyết.

Hình 4.27 Dấu hiệu bệnh lý của cá trong thí nghiệm điều trị

(A): Cá bị xuất huyết ở vây (↓); (B): Cá bị xuất huyết trên thân (↓); (C): Cá bị xuất huyết ở

gan (↓); (D): Tỳ tạng sưng to, xuất huyết (↓), thận bị nhũn (↓)

83

Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh ở các nghiệm thức

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 cho thấy ở nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5 khuẩn lạc có kích thước

nhỏ, hình tròn, màu trắng đục trên môi trường TSA (+1,5% NaCl). Ở nghiệm

thức 6 và 7 không có vi khuẩn phát triển. Tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh

lý của vi khuẩn thu được ở các nghiệm thức 1, 2, 3, 4 và 5 cho thấy chúng là vi

khuẩn hình cầu, gram dương, không di động, tất cả đều cho phản ứng âm tính

với oxidase, catalase.

Định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR theo phương pháp của

Hassan et al. (2003) trên chủng vi khuẩn cảm nhiễm B1-6T và chủng vi khuẩn

phân lập từ cá bệnh ở các nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5 cho kết quả định danh vi

khuẩn gây bệnh là vi khuẩn S. dysgalactiae (Hình 4.28).

Hình 4.28 Kết quả định danh vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm điều trị

(1), (2), (3), (4), (5): vi khuẩn ở nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5; (6): chủng B1-6T; M: thang DNA;

(-): đối chứng âm; (+): đối chứng dương.

Kết quả theo dõi cho thấy, cá bắt đầu chết từ ngày thứ 3 sau khi gây cảm

nhiễm, đến ngày thứ 13 sau khi tiêm cảm nhiễm vi khuẩn cá ở các nghiệm

thức ngừng chết và tỉ lệ sống của các nghiệm thức lần lượt là 65,56%; 71,11%;

67,78% và 70%. Trong khi đó, ở nghiệm thức đối chứng 6 và 7 tỷ lệ sống là

96,67% và 97,78% (Hình 4.29). Giá trị RPS (%) được xác định lần lượt là

45,27%; 61,16%; 56,72% và 59,7%.

84

Hình 4.29: Tỷ lệ sống của cá ở thí nghiệm điều trị

NT1: nghiệm thức dùng thuốc DO nguyên liệu; NT2: nghiệm thức dùng thuốc DO thành

phẩm; NT3: nghiệm thức dùng thuốc FFC nguyên liệu; NT4: nghiệm thức dùng thuốc FFC

thành phẩm; NT5: Đối chứng 1, cá cảm nhiễm, không dùng thuốc; NT6: Đối chứng 2, cá

được tiêm muối sinh lý và cho ăn thức ăn không trộn thuốc; NT7: Đối chứng 3: cá không

được gây bệnh, không tiêm nước muối sinh lý, cho ăn thức ăn không trộn thuốc.

Khi tiến hành so sánh tỷ lệ sống của cá ở các nghiệm thức cho thấy sự sai

khác mang ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng 4.17).

Bảng 4.17: Tỷ lệ sống (%) của cá ở thí nghiệm điều trị

Stt Nghiệm thức Tỷ lệ sống (%)

1 NT1 65,56±1,93a

2 NT2 71,11±1,93b

3 NT3 67,78±1,93ab

4 NT4 70 ±3,33b

5 NT5 25,55±3,85c

6 NT6 96,67±0,00d

7 NT7 97,78±1,93d

Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau (a, b, c, d) thì khác biệt có ý nghĩa thống


Kết quả so sánh thống kê ở Bảng 4.17 cho thấy, đối với các nghiệm thức

cá được gây cảm nhiễm, tỷ lệ sống của cá ở nghiệm thức cá được cho thức ăn

không trộn thuốc khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P<0,05) đối với tỷ lệ sống

ở các nghiệm thức cá được cho ăn thức ăn có trộn thuốc kháng sinh, thể hiện

hiệu quả của việc sử dụng thuốc kháng sinh trong việc điều trị bệnh xuất huyết

trên cá bống kèo trong điều kiện phòng thí nghiệm. Điều này phù hợp với

nhận định của Kitao và Aoki (1979), DO là kháng sinh đã được sử dụng đề

điều trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp. gây ra ở các trang trại nuôi cá

trác sọc vàng ở Nhật Bản. Với liều lượng DO 20 - 50 mg/kg trọng lượng thân

được sử dụng điều trị thành công bệnh do Streptococcus spp. gây ra trên cá

85

trác sọc vàng (Nakamura, 1982). Như vậy với kết quả thử nghiệm thành công

trong thí nghiệm đã xác định được DO và FFC điều trị thành công bệnh xuất

huyết trên cá bống kèo trong điều kiện phòng thí nghiệm.

86

Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1 Kết luận

5.1.1 Kết quả điều tra

Thời gian cá bống kèo xuất hiện bệnh tập trung ở giai đoạn cá đạt 2

tháng tuổi. Một số bệnh xuất hiện trên cá bống kèo nuôi thương phẩm là bệnh

xuất huyết (chiếm 78,89%), bệnh lở loét (50%), bệnh chướng bụng (50%),

bệnh gan (25,56%), tuột nhớt (18,89%), đường ruột (15,56%) và bệnh cong

thân (4,44%). Amoxicillin là loại kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong các

ao nuôi cá bống kèo.

5.1.2 Kết quả nghiên cứu

Vi khuẩn gây ra bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi thương phẩm là

vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae với đặc điểm bệnh lý là cá bị xuất huyết

trên thân và các vi; nội quan của cá với tình trạng gan, thận và tỳ tạng bị sưng

to, xuất huyết đôi khi xuất hiện tình trạng dịch hôi trong xoang bụng và thận bị

nhũn.

Tế bào mô gan, mang và thận của cá khi bệnh xuất huyết có nhiều biến

đổi cấu trúc, xuất hiện nhiều vùng sung huyết và hoại tử.

Tế bào hồng cầu ở cá bống kèo có dấu hiệu bệnh lý có biến động theo

chiều hướng giảm so với cá khỏe. Ngược lại, các loại tế bào bạch cầu ở cá

bệnh lại có chiều hướng biến động tăng so với cá khỏe.

Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đã phát hiện chính xác

100% vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống

kèo thương phẩm.

Kết quả LD50 của 2 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G với giá trị lần lượt

là 4,25 x 104 CFU/ml và 3,5 x 10

3,17 CFU/ml.

Vi khuẩn gây bệnh trên cá bống kèo nhạy với các loại kháng sinh như

FFC, DO và kháng cao với kháng sinh AML và AMP. Nồng độ ức chế tối

thiểu (MIC) của AML cao nhất và dao động từ 128 ppm – 256 ppm và FFC có

nồng độ thấp nhất (4 ppm).

Kết quả điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo bằng FFC và DO cả

với dạng nguyên liệu và thành phẩm cho tỷ lệ điều trị đạt cao, tỷ lệ sống đạt

dao động từ 65,56% - 71,11%. Giá trị RPS (%) dao động từ 45,27% - 61,16%.

87

5.2 Đề xuất

- Nghiên cứu chuẩn hóa qui trình chẩn đoán phát hiện vi khuẩn

Streptococcus dysgalactiae trực tiếp trên mẫu cá.

- Tiếp tục nghiên cứu điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ngoài ao

nuôi thương phẩm bằng kháng sinh DO và FFC với thời gian sử dụng thức ăn

được trộn thuốc kháng sinh liên tục 5 ngày khi phát hiện cá có dấu hiệu bệnh

xuất huyết.

88

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Tài liệu tiếng Anh

Abdelsalam M., Asheg A. and Eissa A. E. (2013). Streptococcus

dysgalactiae: An emerging pathogen of fishes and mammals. International

Journal of Veterinary Science and Medicine (2013) 1, 1-6.

Abdelsalam M., Chen S. C. and Yoshida T. (2009). Surface properties of

Streptococcus dysgalactiae strains isolated from marine fish. Bulletin of the

European Association of Fish Pathologists, 29(1) 2009, 16-24. Journal of

Applied Ichthyology, 25 (2009), 443-446.

Abid A. Ansari, Subrata Trivedi, Shalini Saggu, Hasibur Rehman (2014).

Mudskipper: A biological indicator for environmental monitoring and

assessment of coastal waters. Journal of Entomology and Zoology Studies

2014; 2(6): 22-33.

Actis, L.A., Tolmasky, M.E., Crosa, J.H. (1999). Vibriosis. In: Woo,

P.T.K., Bruno, D.W. (Eds.), Fish Diseases and Disorders, vol. 3 CAB

International Publishing, Wallingford, United Kingdom, pp. 523– 558.

Ahmed H. Al-Harbi. (1994). First isolation of Streptococcus sp. from

hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. aureus) in Saudi Arabia.

Aquaculture. Volume 128:195-201.

Ainsworth, A.J. (1992). Fish granulocytes: morphology, distribution and

function. Annual Review of Fish Diseases. 123-148.

Ambak M.A., Dinh. T.D, Hassan A. (2007). Reproductive biology of the

goby Pseudapocryptes lanceolatus in the coastal mud flat areas of the Mekong

Deltal. Journal of Sustainability Science and Management, 2(2): 21-30.

Ana I. Vela, Enevold Falsen, Isabel Simarro, Eduardo Rollan, Matthew

D. Collins, Lucas Domínguez and Jose F. Fernandez – Garayzabal. (2006).

Neonatal Mortality in puppies due to Bacteremia by Streptococcus

dysgalactiae surbp. Dysgalactiae. Journal of Clinical Microbiology, Feb,

2006, p. 666-668.

Anders Jensen and Morgens Kilian. (2011). Delineation of Streptococcus

dysgalactiae, Its Subspecies, and Its Clinical and Phylogenetic relationship to

Streptococcus pyogenes. Journal of Clinical Microbiology, p 113-126.

Ansary, A., Haneef, R.M., Torres J.L. and Yadav, M. (1992). Plasmids

and antibiotic resistance in Aeromonas hydrophila isolated in Malaysia from

healthy and diseased fish. Journal of Fish Diseases 15, 191-196.

Austin, B. (2010). Vibrios as causal agents of zoonoses. Veterinary

Microbiology, Elsevier, 2010, 140 (3-4), pp.310.

Austin, B. and Austin, D.A. (1987). Motile aeromonads In Bacterial Fish

Pathogens, 1st edn. pp. 171–177. Chichester, UK: Ellis Horwood.

89

Austin, B. and Austin, D.A. (1993). Bacterial fish pathogens: Disease in

farmed and wild fish, 2nd

edn. Ellis Horwood Ltd., Chichester. 384pp.

Austin, B. and C. Adams. (1996). Fish pathogens. In: The genus

Aeromonas. Edited by B. Austin, M. Alwegg, P.J. Gosling and S. Joseph. John

Wiley & Sons Ltd.

Austin, B.; Austin, D. A. (2007). Bacterial fish pathogens: diseases of

farmed and wild fish. 4th

ed. Chichester: Springer, 2007. 552 p

Bachrach, G., Zlotkin, A., Hurvitz, A., Evans, D.L. and Eldar, A. (2001).

Recovery of Streptococcus iniae from diseased fish previously vaccinated

with a streptococcus vaccine. Applied Environmental Microbiology 67: 3756-

3758

Bader, J.A., Shoemaker, C.A., Klesius, P.H. (2003) Rapid detection of

columnaris disease in channel catfish (Ictalurus punctatus) with a new

species-specific 16S rRNA gene-based PCR primer for Flavobacterium

columnare. Journal of Microbiological Methods 52:209–220

Barrow, G.I. and R.K.A. Feltham. (1993). Covan and Steel's manual for

the identification of medical bacteria, 3nd edn. Cambridge University Press,

Cambridge.

Benli, C. K. A and H. Y. Yildiz. (2004). Blood parameters in Nile tilapia

(Oreochromis niloticus) spontaneuosly infect with Edwardsiella tarda.

Aquaculture Research. 35: 1388-1390.

Bercovier, H., Ghittino, C., and Eldar, A. (1997). Immunization with

bacterial antigens: infections with streptococci and related organisms. In:

Gudding, R., Lillehaug, A., Midtlyng, P.J., Brown, F. (Eds.), Fish

Vaccinology. Karger, Basel, Switzeland, pp. 153– 160

Bin, P., Guang-you, Y., Xiao-li, C., Ai-si2, Z. and Ming-li, H. E. (2010).

Isolation and identification on pathogenic bacteria of hemorrhagic septicemia

disease in rice field eels (Monopterus albus). Freshwater Fisheries. 2011-03

Bondad-Reantaso, M.G., R.P. Subasinghe, J.R. Arthur, K. Ogawa,

Chinabut. S, R. Adlard, Z. Tan, M. Shariff. (2005). Disease and health

management in Asian Aquaculture. Veterinary Parasitol. 132: 249-272.

Bosshard, P.P., Abels, S., Zbinden. R., Böttger, E.C. and Altwegg, M.

(2003). Ribosomal DNA sequensing for identification of Aerobic Gram-

Positive rods in the clinical laboratory (an 18-month evaluation). Journal of

Clinical Microbiology, september. 2003. Vol. 41, No. 9, p. 4134-4140.

Bowser, P.R., Falls, W.W. and Maestrone, G. (1987). Potentiated

sulfonamide therapy of Aeromonas hydrophila infection in channel catfish.

Progressive Fish-Culturist 49, 188-191.

Brenden SA. and H.W. Huizinga. (1986). Pathophysiology of

experimental Aeromonas hydrophila infection in goldfish, Carassius auratus.

Journal of Fish Diseases 9:163-167.

90

Bromage, E.S., Thomas, A., and Owens, L.. (1999). Streptococcus iniae

a bacterial infection in barramundi Lates calcarifer. Disease of Aquatic

Organisms. 36, 177– 181

Buller, N. B. (2004). Bacteria from fish and other aquatic animal: a

practice indentification manual, 361pp.

Cees S, Nukul R, Michel H, Sumalika P, Somporn P, Itsara I, Witool C,

Pun Y, Phusit H, Samart D. (1995) The five sympatric mudskippers

(Teleostei: Gobioidea) of Patta Cees S, Nukul R, Michel H, Sumalika P,

Somporn P, Itsara I, Witool C, Pun Y, Phusit H, Samart D. (1995) The five

sympatric mudskippers (Teleostei: Gobioidea) of Patta.

Chinabut, S., C. Limsuwan and P. Kitsawat. (1991). Histology of the

walking catfish, Clarias batrachus. 96pp.

Chowdhury, Md.B.R, (1998). Bacteria in fish disease in Bangladesh.

Department of aquaculture, Facculy of Fisheries. Bangladesh Agriculture

University, Mymensingh, 2002, Bangladesh. 247 pp.

Cipriano, R. C., G. L. Bullock and S. W. Pyle. (2001). Aeromonas

hydrophila and motile Aeromonad septicemias of fish. Revision of Fish

Disease Leaflet 68 (1984).

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2011).

Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;

Twenty-First Informational Supplement, M100-S21 (ISBN 1-56238-742-1).

Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite

1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA.

Colorni, A., Diamant, A., Eldar, A., Kvitt, H., and Zlotkin, A., (2002).

Streptococcus iniae infections in red seacage-cultured and wild fishes. Disease

of Aquatic Organisms. 49, 165– 170

Colorni, A., Ravelo, C., Romalde, J.L., Toranzo, A.E., and Diamant, A.

(2003). Lactococcus garvieae in wild red sea wrasse Coris aygula (Labriidae).

Disease of Aquatic Organisms. 56, 275– 278.

Creeper, H.J and N. B. Buller. (2006). An outbreak of Streptococcus

iniae in barramundi (Lates calcarifera) in freshwater cage culture. Australian

Veterinary Jounal. 84: 408-411

Darwish, A.M., and Griffin, B.R. (2002). Study shows oxyetracycline

controls Streptococcus in tilapia. Global Aquaculture Advocate, 5, 34-35.

Del Cero A, Marquez I, Guijarro JA. (2002). Simultaneous detection of

Aeromonas salmonicida, Flavobacterium psychrophilum and Yersinia ruckeri,

3 major fish pathogens by multiplex PCR. Appllied and Environmental

Microbiology 68:5177–5180

Delamare-Deboutteville J, Wood D, and Barnes AC. (2006). Response

and function of cutaneous mucosal and serum antibodies in barramundi (Lates

91

calcarifer) acclimated in seawater and freshwater. Fish & Shellfish

Immunology. Volume 21, Issue 1, July 2006; 21(1): 92-101.

Dijkstra A., Van Ingen J., Lubbert P.H.W., Haenen O.L.M and Möller

A.V.M. (2009). Fasciitis necroticans ten gevolge van een Vibrio vulnificus

infective in een palingkwekerij [in Dutch]. Nederlands Tijdschrift voor

Geneeskunde, 153 (2009), 408-411.

Dinh T. D, Ambak M. A., Hassan A. and Phuong N. T. (2007). Biology

and population dynamis of the goby Pseudapocryptes elongatus in the coastal

mud flat areas of the Mekong Delta, Vietnam. Pakistan Journal of Biologycal

Sciences, 10 (19): 3284-3294.

Dixon, B.A. and Issvoran, G. (1993). Antibacterial drug resistance in

Aeromonas spp. isolated from domestic goldfish and koi from California.

Journal of the World Aquaculture Society 24, 102-104.

Dixon, B.A., Yamashita, J. and Evelyn, F. (1990). Antibiotic resistance

of Aeromonas spp. isolated from tropical fish imported from Singapore.

Journal of Aquatic Animal Health 2, 295-297.

Duremdez, R., Al-Marzouk, A., Qasem, J.A., Al-Harbi, A. and

Gharabally, H. (2004). Isolation of Streptococcus agalactiae from cultured

silver pomfet, Pampus argenteus (Euphrasen) in Kuwait. Journal of Fish

Diseases 27, 307–310.

Eldar A, Bejerano Y and Bercovier H (1994). Streptococcus shiloi and

Streptococcus difficile: two new streptococcal species causing

meningoencephalitis in fish. Current Microbiology, 28: 139-143.

Eldar A, Frelier PF, Assenta L, Varner PW, Lawhon S and Bercovier H

(1995). Streptococcus shiloi, the name for an agent causing septicemic

infection in fish, is a junior synonym of Streptococcus iniae. International

Journal of Systematic Bacteriology, 45: 840-842

Eldar, A. and Ghittino, C. (1999). Lactococcus garvieae and

Streptococcus iniae infections in rainbow trout Oncorhynchus mykiss: similar,

but different diseases. Disease of Aquatic Organisms. 36, 227– 231

Eldar, A., Horovit CZ, A. and Bercovier, H., (1997). Development and

efficacy of a vắc-xin against Streeptococcus iniae infection in farmed rainbow

trout. Veterinary Immunology and Immunopathology 56: 175-183.

Elina Reinoso, Susana Bettera, Liliana Odierno and Cristina Bogni.

(2007). REP-PCR of Staphylococcus aureus strains isolated from bovina

mastitis in Argentina. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal

Science, v.44, suplemento, p. 115-121.

Ellis, A. E. (1988). General principles of fish vaccination. In Fish

vaccination. A.E. Ellis, editor. Academic Press. San Diego, p. 1-19.

Ellis, A.E (1985). Fish and Shellfish Pathology. Academic press. Lon

don.

92

Esteve, C., Amaro, C., Garay, E., Santos, Y. and Toranzo, A.E. (1995).

Pathogenicity of live bacteria and extracellular products of motile Aeromonas

isolated from eels. Journal of Applied Bacteriology 78, 555–562.

Evan, J.J., Shoemaker, C.A and Klesius P.H. (2000). Experimental

Streptococcus iniae infection of hybir striped bass (Morone chrysops x

Morone saxatilis) and tilapia (Oreochromis niloticus) by nares inoculation.

Aquaculture, v. 189, p.197-210.

Evans, D.H, Claiborne, J.B. and Kormanik, G.A. (1999).

Osmoregulation, Acid-Base Regulation and Nitrogen Excretion. In: Life in

Two Worlds: Ecology, Behavior and Physiology of Intertidal Fishes, ed. Horn,

M.H., Martin, K.L.M., and Chotkowski, M.A., Academic Press, pp. 79-96.

Fang, H.M., Ge, R. and Sin, Y.M. (2004). Cloning, characterisation and

expression of Aeromonas hydrophila major adhesin. Fish & Shellfish

Immunology 16, 645-658.

Francis Pius Mmanda, Suming Zhou, Jiting Zhang, Xiaoye Zheng,

Shuwei An and Guoliang Wang. (2014). Massive mortality associated with

Streptococcus iniae infection in cage-cultured red drum (Sciaenops ocellatus)

in Eastern China. African Journal of Microbiology Research. Vol. 8(16), pp.

1722-1729, 16 April 2014.

Galit Sharon and Dina Zilberg. (2012). Atlas of Fish Histology and

Histopathology. Funded by JCA Charitable Foundation, Ramat Negev and

Central and Northen Arava Research and Development Centers.

Geert Huy. (2002). Antibiotic susceptibility testing of aquaculture

associated bacteria with the broth macrodilution method (MIC Determination),

Laboratory of Microbiology, K.L.Ledeganckstr. 35 B-9000 Gent

(BELGIUM)

Grizzle, J.M. and W.A. Rogers. (1976). Anatomy and histology of the ch

annel catfis.Department of Fisheries and Allied Aquacuture, Auburn Universit

y. 94p.

Herrera, A.A. (1996). Histology of tilapia Oreochromis niloticus.

Published by Bureau of Fisheries and Aquatic Resources, Department of

Agriculture.

Hibiya, T. (1982). An atlas of Fish Histology - Normal and Pathological

Features. College of Agriculture and Veterinary Medicine, Nihon Univ.

Tokyo, Japan, 147pp.

Hong, W.S., Q. Zhang and Shixi Chen. (2007). Farming and fry

production of mudskipper Boleophthalmus pectinirostris in China. Book of

abstract. Asian Pacific Aquaculture, 2007.

Hong, W.S. and Q. Zhang. (2003). Induced nest spawning and artificial

hatching of the fertilized eggs of mudskipper, Boleophthalmus pectinirostris.

Journal of Oceanology and Limnology 22:408-413.

93

Hoshina, T., Sano, T. and Morimoto, Y. (1958). A Streptococcus

pathogenic to fish. Journal of Tokyo University Fisheries 44, 57–58.

Houston, H.A. (1990). Blood and circulation. In: C.B. Schreek and P.B.

Moley. Method for biology. American Fish society Bethesda, Maryland, USA.

665: 273-322.

Hugenholtz, P., Goebel, B. M. and Pace, N. R. (1998). Impact of culture-

independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity.

Journal of Bacteriology, 180, 4765–4774; erratum, 6793.

Huys, G., Coopman, R., Janssen, P. and Kersters, K. (1996).

Highresolution genotypic analysis of the genus Aeromonas by AFLP finger

printing. International Journal of Systematic Bacteriology 46, 572–580.

Ilhan Z., Gulhan T. and Aksakal A. (2006). Aeromonas hydrophila

associated with ovine abortion. Small Ruminant Research 61, 73-78.

Inglis, V., R. J. Roberts and N. R. Bromage. (1993). Bacterial diseases of

fish. Institute of aquaculture, Univesity Press, Cambridge. 312 pp.

Inglis V., Ronald J. Roberts and Niall R. Bromage. (1994). Bacterial

diseases of fish. pp 272-277.

Janda, J.M and Abbott, S.L. (2007). 16S rRNA gene sequencing for

bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, Peril and Pitfalls.

Journal of Clinical Microbiology, Sept. 2007, Vol 45, No 9, p. 2761-2764.

Janda, J.M., S.L. Abbott, S. Kroske-bystrom, W.K.W. Cheung, C.

Powers R.P. Kokka and K. Tamura. (1991). Pathogenic properties of

Edwarsiella species. Journal of Clinical Microbiology 29:1997-2001.

Jeney, G., D.T.H Oanh, T.T. Dung, Z. Jeney, and N.A. Tuan. (1998).

Asocio-economic survey: Fish health management in the Mekong Delta.

Aquaculture Asia. 2: 35-40.

Jiménez, A., Tibatá, V., Junca, H., Ariza, F., Verjan, N. and Iregui, C.

(2011). Evaluating nested-PCR assay for detecting Streptococcus agalactiae

in red tilapia (Oreochromis sp.) tissue. Aquaculture 321, 203–206.

Jiraungkoorskul, W., S. Sahaphong, N. Kangwanrangsan and M.H. Kim.

(2006). Histopathological study: The effect of ascorbic acid on cadmium

exposure in fish (Puntius altus). Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1:

191-199.

John, S.J.B. and M.P. Patricia. (2007). Adipose Tissue. In: Mills, Stacey

E (Editors). Histology for Pathologists, 3rd Edition. Philadelphia: Lippincott

Williams & Wilkins, C2007. United States. Page 13.

Kaper JB, Lockman H, Colwell RR and Joseph SW. (1981). Aeromonas

hydrophila ecology and cytocity of isolation from an estuary. J. Appl.

Bacteriol. 50: 359-377

Khardori, N. and Fainstein, V. (1988). Aeromonas and Plesiomonas as

etiological agents. Annual Review of Microbiology 42, 395–419.

94

Kitao T. and Aoki T.. (1979). Therapeutic studies of doxycycline of

streptococcus of culture yellowtail Seriola sp.. Distribution in seawater and

muds around yellowtail farms. Bulletin of the Japanese Society for Scientific

Fisheries 45:567-572.

Kitao. (1993). Streptococcus infections. Bacterial Disease of Fish.

Chapter 12: 196-210.

Lee, K. K. (1995). Pathogenesis studies on Vibrio alginolyticus in the

grouper, Epinephelus malabaricus, Bloch Schneider. Microbial Pathogenesis

19, 39–48.

Lehane, L. and Rawlin, G.T. (2000). Topically acquired bacterial

zoonoses from fish: a review. The Medical Journal of Australia, 173 (5), 256-

259.

Loan T. T. L., D. N. Nguyen, P. H. Vo and C. V. Doan. (2009).

Hemorrhage Disease of Cultured Tra Catfish (Pangasianodon hypophthalmus)

in Mekong Delta (Vietnam). The Israeli Journal of Aquaculture - Bamidgeh

61(3).

Lom, J. (1970). Protozoa causing diseases in marine fishes. In S. F.

snieszko (Ed), A Symposium on Diseases of Fishes and Shellfishes. Journal of

the American Fisheries Society, Special Publication 5, 101-123.

Lo´pez-Romalde, S., Magarin˜os, B., Ravelo, C., Toranzo, A.E. and

Romalde, J.L. (2009). Existence of two O-serotypes in the emerging fish

pathogen Pseudomonas anguilliseptica. Veterinary. Microbiology. 94, 325–

333.

Ly, T.T.L., D.N. Nguyen, P.H. Vo and Cuong, V.D. (2009). Hemorrhage

Disease of Cultured Tra Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) in Mekong

Delta (Vietnam). The Israeli Journal of Aquaculture - Bamidgeh 61(3).

Manjaiang P, Areechon N, Srisapoome P and Mahasawas S. (2007).

Application of vaccine to prevent disease caused by Streptococcus agalactiae

in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Proceedings of the 45th

Kasetsart

University Annual Conference 2007; 174-82.

Martin, K. L. M., and C. R. Bridges. (1999). Respiration in water and air.

In M. H. Horn, K. L. M. Martin, and M. A. Chotkowski (editors), Intertidal

Fishes: Life in Two Worlds. Academic Press, San Diego. p. 54-78

Martins, ML., Mouriño, JLP., Amaral, GV., Vieira, FN., Dotta, G.,

Jatobá, AMB., Pedrotti, FS., Jerônimo, GT., Buglione-Neto, CC. and Pereira-

Jr, G.. (2008). Haematological changes in Nile tilapia experimentally infected

with Enterococcus sp. Brazilian Journal of Biology., 68(3): 657-661, 2008.

Milton Fingerman and Rachakonda Nagabhushanam. (2000). Marine

biotechnology.

95

Mitchell A.J. and Plumb J.A. (1980). Toxicity and efficacy of Furanace

on channel catfish Ictalurus punctatus (Rafinesque) infected experimentally

with Aeromonas hydrophila. Journal of Fish Diseases 3, 93-99.

Mostafa A. El-Feki, Hanaa E. Fahim, Mamoon M. Gad and Fatehy A.

Abdel-Ghaffar. (2000). Changes in the Haematological parameters Carp

Cyprinus carpio L., induced by Laminarin and Nigella sativa oil during the

motile Aeromonas septicemia disease. Egyptian Journal of Aquatic Biology

and Fisheries, Vol 4, No.2: 43-93 (2000).

Murdy, E.O. (1989). A taxonomic revision and cladistic analysis of the

Oxudercine Gobies (Gobiidae: Oxudercinae). Records of the Australian

Museum (1989) Supplement, 11:1-93.

Nakamura, Y. (1982). Doxycycline. Fish Pathology, 17, 67-76.

Nakai, T., Muroga, K. and Wakabayashi, H. (1985). First record of

Pseudomonas anguilliseptica infection in cultured ayu, Pleco glossus altivelis.

Fish Pathology. 20, 481– 484.

Natt, M.P. and C.A. Herrick. (1952). A new blood diluent for counting

the erythrocytes and leucocytes of the chicken. Poultry Science 31,735-738.

Nehal Mohamed Fawzy, Kamelia Mahmoud Osman, Mai El-Desoky El-

Sayed Ibrahim, Mohamed Naguib, Mohamed Ali and SaharS. Abd-Elrahman.

(2014). Streptococcosis in tilapia: Clinic-pathological picture of

experimentally infected tilpia. Life Science Journal 2014; 11(9).

Nielsen, M. E., L. Hui, A. S. Schmidt, D. Qian, T. Shimada, J. Y. Shen

and J. L. Larsen. (2001). Is Aeromonas hydrophila the dominant motile

Aeromonas species that causes disease outbreaks in aquaculture production in

the Zhejiang Province of China. Diseases of aquatic oraganism. Vol.46: 23-29.

Nishiki, I.; Masahiro, N.; Itami, T. et al. (2010). Homogeneity of

Streptococcus dysgalactiae from farmed amberjack Seriola dumerili in Japan.

Fisheries Science., volume 76, p.661–8, 2010.

Noga, E.J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment.

Nomoto R, Munasinghe LI, Jin DH, Shimahara Y, Yasuda H, Nakamura

A, Misawa N, Itami T and Yoshida T. (2004). Lancefield group C

Streptococcus dysgalactiae infection responsible for fish mortalities in Japan.

Journal of Fish Diseases, 27: 679-686.

Nomoto,

H. Kagawa and T. Yoshida. (2008). Partial sequencing

of sodA gene and its application to identification of Streptococcus

dysgalactiae subsp. dysgalactiae isolated from farmed fish. Applied

Microbiology, 1: 95-100.

Nunan L.M., Poulos B., Redman R., Le Groumellec M. and Lightner

D.V. (2003). Molecular detection methods developed for a systemic

rickettsia-like bacterium (RLB) in Penaeus monodon (Decapoda: Crustacea).

Disease of Aquatic Organisms, 53:15–23

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nomoto%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15575875

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Munasinghe%20LI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15575875

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jin%20DH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15575875

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shimahara%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15575875

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yasuda%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15575875

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nakamura%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15575875

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nakamura%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15575875

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Misawa%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15575875

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Itami%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15575875

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yoshida%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15575875

96

OIE (2006). Manual of Diagnostic Test of Aquatic Animals.

Panangala, V.S., Craig, A.S., Vicky, L.V.S., Kevin, D. and Phillip, H.K.

(2007). Multiplex-PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish

pathogens, Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas

hydrophila. Diseases of Aquatic Organisms 74: 199–208

Panicker, G., Vickery, M.C.L. and Bej, A.K. (2004). Multiplex PCR

detection of clinical and environmental strains of Vibrio vulnificus in

shellfish. Canadian Journal of Microbiology 50:911–922.

Pathiratne, A. and W. Rajapakshe. (1998). Hematological changes

associated with Epizootic Ulcerative Syndrome in Asian cichlid fish, Etroplus

suratensis. Asian Fisheries Science 11:203-211.

Payne, S.M. and R.A. Finkelstein. (1977). Detection and differentiation

of ironresponsive avirulent mutants on congo red agar. Infection and

Immunity 18:94-98.

Perera R.P., Johnson S.K and Lewis D.H. (1997). Epizootiological

aspects of Streptococcus iniae affecting tilapia in Texas. Aquaculture 152. 25-

33.

Perera RP, Johnson SK, Collins MD and Lewis DH (1995).

Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica x T. aurea

hybrids. Journal of Aquatic Animal Health, 6: 335-340

Perera, R.P., Johnson, S.K., Collins, M.D., Lewis, D.H. (1994).

Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica aurea hybrids.

J. Aquat. Anim. Health 6, 335–340.

Philip Hugenholtz. (2002). Exploring prokaryotic diversity in the

genomicera. Genome Biology 2002. © BioMed Central Ltd (Print ISSN 1465-

6906; Online ISSN 1465-6914).

Phuong, D.N. (2007). Non-specific immune responses towards ascorbic

acid supplementation in hybrid catfish (Clarias macrocephalus x C. garieinus)

feed. Master Thesis, University Malaysia Terengganu, Malaysia.

Pillay, T.V.R (1990). Aquaculture, principles and practices.

Polgar G. and Lim R. (2011) Mudskippers: human use, ecotoxicology

and biomonitoring of mangrove and other soft bottom intertidal ecosystems.

pp. 51-86. In: Metras J.N. (ed) Mangroves: Ecology, Biology and Taxonomy.

Nova Science Publishers, Hauppauge. ISBN: 978-1-61728-991-0.

Portis E, Lindeman C and Johansen L. (2013). Antimicrobial

susceptibility of porcine Pasteurella multocida, Streptococcus suis, and

Actinobacillus pleuropneumoniae from the United States and Canada, 2001 to

2010. Jouranl of Swine Health and Production. 2013; 21(1):30-41.

Prpic, J.K., R.M. Robins-Browne and R.B. Davey. (1983). Differentation

between virulent and avirulent Yersinia enterocolitica isolates by using congo

red agar. Journal of Clinical Microbiology 18:486-490.

https://www.novapublishers.com/catalog/product_info.php?products_id=16840%7B5%7D10&osCsid=b

97

Qadri, F., S.A. Hossain, I. Ciznaz, K. Haider, A. Ljungh, T. Wadstrom

and D. A. Sack. (1988). Congo red binding and salt aggregation as indicators

of virulence in Shigella species. Journal of Clinical Microbiology 26:1343-

1348.

Qi ZT, JY Tian, QH Zhang, R Shao, M Qiu, ZS Wang, QJ Wei and JT

Huang. (2013). Susceptibility of Soiny Mullet (Liza Haematocheila) to

Streptococcus dysgalactiae and Physiological response to fomalin inactivated

S.dysgalactiae. The Pakistan Veterinary Journal, 33(2): 234-237.

Rainboth W.J. (1996). Fishes of The Cambodian Mekong, FAO species

identification field guide for fishery purposes, FAO, Rome, page 265.

Ravelo, C., Magariños, B., Toranzo, A.E. and Romalde, J.L. (2001).

Conventional versus miniaturized systems for the phenotypiccharacterization

of Lactococcus garvieae. Bulletin of the European Association of Fish

Pathologists. 21, 136–144

Rehulka J. (1998). Blood indices of the rainbow trout, Oncorhynchus

mykiss (Walbaum) in Aeromonas-induced ulcerous dermatitis. Journal of the

University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences in Brno, Czech 67:317-

322.

Robert R. Sttickney (2000). Encyclopedia of Aquaculture.

Robert, R.J. (1989). Fish Pathology. Instituteof Aquaculture, University

of Striling, Bailliere Tindall, London. 2nd

edition

Robinson, J.A. and Meyer, F.P. (1966). Streptococcal fish pathogen.

Journal of Bacterriology, 92-512.

Romalde JL, Magarinos B, Villar C, Barja JL and Toranzo A.E. (1999c).

Genetic analysis of turbot pathogenic Streptococcus parauberis strains by

ribotyping and random amplified polymorphic DNA. FEMS Microbiol Lett,

179: 297-304

Romalde, J.L., Magariños, B. and Toranzo, A.E. (1999b). Prevention of

streptococcosis in turbot by intraperitoneal vaccination: a review. Journal of

Applied Ichthyology. 15, 153–158.

Romalde, J.L., Ravelo, C., Lo´pez-Romalde, S., Avendan˜o-Herrera, R.,

Magariños, B. and Toranzo, A.E. (2005). Vaccination strategies to prevent

important emerging diseases for Spanish aquaculture. In: Midtlyng, P.J. (Ed.),

Fish vaccinology. Karger, Switzerland, pp. 85– 95.

Romalde, J.L. and Toranzo, A.E. (1999a). Streptococcosis of marine

fish. In: Olivier, G. (Ed.), ICES Identification Leaflets for Diseases and

Parasites of Fish and Shellfish. No. 56. International Council for the

Exploration of the Sea. Copenhagen, Denmark, pp. 1 –8.

Rowley, A.F. (1990). Collection, separation and identification of fish

leucocytes. In: Techniques in Fish Immunology. 2nd

Eds.: J.S. Stolen,

98

T.C.Fletcher, D.P. Anderson, B.S. Roberson, W.B. Van Muiswinkel, SOS

Publication, 113-136.

Salvador, R., Muller, E. E., De Freitas, J.C., Leonhad, J.H., Pretto-

Giurdano, L.G. and Dias, J.A. (2005). Isolation and characterization of

Streptococcus spp. Group B in Nile tilapias (Oreochromis niloticus) reared in

hapas nets and earth nurseries in the northern region of Parana State, Brazil.

Ciencia Rural, Santa Maria, 35 (6): 1374-1378.

Seham Ahmed Ibrahim. (2013). Hematological and histopathological

studies on tilapia fish (Oreochromis niloticus) living in the water of Rosetta

branch, River Nile, Egypt. Global Veterinaria 11 (5): 485-496, 2013.

Sindermann, C. J. (1970). Disease and parasite problems in marine

aquaculture. In W. J. McNeil (Ed.), Marine Aquaculture. Oregon State

University Press, Oregon, pp. 103-134.

Sonia Mumford, Jerry Heidel, Charlie Smith, John Morrison, Beth

MacConnell and Vicki Blazer. (2007). Fish Histology and Histopathology.

U.S. Fish & Wildlife Service.

Statner, B. and W.L. George. (1987). Congo red uptake by motile

Aeromonas species. Journal of Clinical Microbiology. 876-878.

Steve F. Perry and Pierre Laurent. (1993). Environmental effects on fish

gill structure and function. Fish Ecophysiology. Chapman & Hall Fish and

Fisheries series. Volume 9, 1993, pp 231-264.

Stewart, D.J., Woldemariam, K., Dear, G. and Mochaba, F.M. (1983).

An outbreak of bsekiten-byoQ among cultured European eels, Anguilla

anguilla L., in Scotland. J. Fish Dis. 6, 75–76.

Suanyuk, N. and Itsaro, A. (2011). Efficacy of inactivated Streptococcus

iniae vaccine and protective effect of β-(1,3/1,6) - glucan on the effectiveness

of Streptococcus iniae vaccine in red tilapia Oreochromis niloticus x O.

Mossambicus. Songklanakarin Journal of Science and Technology.

Songklanakarin Journal of Science and Technology. 33, 143-149.

Sugita, H., Nakamura, T., Tanaka, K. and Deguchi, Y. (1994).

Identification of Aeromonas species isolated from freshwater fish with the

microplate hybridization method. Applied and Environmental Microbiology

60, 3036–3038.

Supranee Chinabut, Chalor Limsuwan and Praveena Kitsawat. (1991).

Histology of the walking catfish, Clarias Batrachus. Enternational

development research centre Canada.

Suzuki, Y. and T. Iida. (1992). Fish granulocytes in the process of

inflammation. Annual Review of Fish Diseases. 149-160.

Takashi Aoki, Sunao Takeshita and Tadatoshi Kitao. (1983).

Antibacterial action of chemotherapeutic agents against non-hemolytic

Streptococcus sp. isolated from culture marine fish, yellowtail Seriola

99

quinqueradiata. Bullentin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 49 (11),

1673-1677 (1983).

Takeshi Takegaki. (2008). Threatened fishes of the world:

Boleophthlmus pectinirostris (Linnaeus, 1758). Environmental Biology of

Fishes, 81 (4), 373 - 374

Toida, S., K. Kanai and K. Yoshikoshi (2003). The kenetics of leukocytes

and histopathology of red sea bream in artificial infection of Edwardsiella

tarda. Fish Pathologists 38:137-142.

Toranzo, A.E. (2004). Development and validation of a PCR-based

protocol for the detection of Pseudomonas anguilliseptica. Fish Pathologists.

39, 33– 41.

Toranzo, A.E. and Barja, J.L. (1990). A review of the taxonomy and

seroepizootiology of Vibrio anguillarum, with special reference to aquaculture

in the northwest of The Spain Diseases of Aquatic Oraganism 9, 73– 82.

Toranzo, A.E. and Barja, J.L. (1993). Virulence factors of bacteria

pathogenic for cold water fish. Annual Review of Fish Disease. 3, 5– 36.

Toranzo AE., Santos Y., Núñez S. and Braja JL. (1991). Biochemical and

serological characteristics, drug resistance, and plasmid profiles of Spanish

isolates of Aeromonas salmonicida. Fish Pathologists. 26, 55-60.

Toranzo AE, Devesa S, Heinen P, A., R, Núñez S and Barja JL (1994).

Stretococcosis in cultured turbot caused by an Enterococcus-like bacterium.

Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 14: 19-23

Toranzo, A.E., Beatriz Magarinos and Jesús L. Romalde. (2005). A

review of the main bacterial fish diseases in mariculture systems. Aquaculture

246 (2005) 37-61.

Toranzo, A.E., Devesa, S., Romalde, J.L., Lamas, J., Riaza, A., Leiro, J.

and Barja, J.L. (1995) Efficacy of intraperitoneal vaccination and immersion

vaccination against Enterococcus sp. infections in turbot. Aquaculture 134,

17–27.

Torres, J.L., Tajima, K. and Shariff, M. (1993). Numerical taxonomy and

virulence screening of Aeromonas spp. isolated from healthy and epizootic

ulcerative syndrome-positive fishes. Asian Fisheries Sciences 6, 11–16.

Trần Vĩ Hích và Nguyễn Hữu Dũng. (2011). Experimental Streptococcus

iniae infection in barramundi (Lates calcarifer). Book of abstracts symposium

on diseases in Asia Aquaculture 8 (96).

Truong Hoang Minh. (2009). Life history, fisheries and aquaculture of

Mudskipper (Pseudapocryptes elongatus, Cuvier 1816) in the coastal zone of

the Meking delta, VietNam.

Vantarakis A, Komininou G, Venieri D and Papapetropoulou M. (2000).

Development of a multiplex PCR for detection of Salmonella spp., and

Shigella spp. in mussels. Letter of Appllied Microbiology 31:105–109

100

Vivekanandhan G., Hatha A.A.M. and Lakshmanaperumalsamy P.

(2005) Prevalence of Aeromonas hydrophila in fish and prawns from the

seafood market of Coimbatore, South India. Food Microbiology 22, 133-137.

Wakabayashi, H. and Egusa, S. (1972). Characteristics of a

Pseudomonas sp. from an epizootic of pond-cultured eels (Anguilla japonica).

Bulletin of the Japanese Society for Scientific Fisheries. 38, 577–587.

Waltman, W. D., E. B. Shotts and T. C. Hsu. (1986). Biochemical

characteristics of Edwardsiella ictaluri. Applied and Enviromental

Microbiology 51(1): 101 – 104

Weinstein M, Low D and McGeer A (1996). Invasive infection due to

Streptococcus iniae: a new or previously unrecognised disease - Ontario1995-

1996. In: Invasive infection due to Streptococcus iniae: a new or previously

unrecognised disease - Ontario1995-1996. Publisher, 129-132.

Wiklund, T. and Bylund, G. (1990). Pseudomonas anguilliseptica as a

pathogen of salmonid fish in Finland. Disease of Aquatic Organisms. 8, 13–

19.

Wuming Yang and Aihua Li. (2009). Isolation and characterization of

Streptococcus dysgalactiae from diseased Acipencer schrenckii. Aquaculture

294 (2009) 14-17.

Yang, K.Y., Lee, S.Y. and Williams, G.A. (2003). Selective feeding by

the mudskipper (Boleophthalmus pectinirostris) on the microalgal assemblage

of a tropical mudfat. Marine Biology 143:245-256

Yanong RPE and Francis-Floyd R (2002). Streptococcal infections of

fish. Report from University of Florida.

Yii, K.C., Yang, T.I. and Lee, K.K. (1997). Isolation and characterization

of Vibrio carchariae, a causative agent of gastroenteritis in the groupers,

Epinephelus coioides. Current Microbiology 35, 109–115.

Zinniel, D. K., P. Lambrecht, N. B. Harris, Z. Feng, D. Kuezmarski, P.

Highley, C. Ishimaru, A. Arunakumari, G. R. Barletta and A. K. Vidaver.

(2002). Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from

agronomic crops and prairie plants. Applied and Environmental Microbiology.

59, 2198-2208.

2. Tài liệu tiếng Việt

Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2014. Thông tư Ban hành Danh

mục thuốc và hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng. Văn bản

hợp nhất Số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25 tháng 02 năm 2014.

Bùi Kim Tùng, Bùi Kim Hoàng và Bùi Kim Tân. (2001). Thuốc kháng

sinh. Sở Khoa học Công nghệ và Môi trường tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu. 255 trang.

Bùi Quang Tề (2006). Bệnh học Thủy sản.

Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám. (2000). Những bệnh thường gặp ở tôm cá

và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.

101

Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội

(2004). Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp – Tp. Hồ Chí Minh.

Bùi Thị Mỹ Duyên, Lê Xuân Sinh và Trương Hoàng Minh. (2010). Phân

tích chuỗi giá trị cá bống kèo (Pseudapocrytes elongatus) ở tỉnh Sóc Trăng và

Bạc Liêu. Tạp chí khoa học 2010, 13: 401 – 412.

Bùi Thị Tho. (2003). Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong

chăn nuôi. Nhà xuất bản Hà Nội, 323 trang

Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, Temdoung Somsiri,

Supranee Chinabut, Fatinah Yussoff, Mohamed Shariff, Kerry Bartie,

Geert Huys, Mauro Giacomini, Stefania Berton, Jean Swings và Alan

Teale. (2005). Xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập

từ các hộ nuôi thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam. Tạp chí

Nghiên Cứu Khoa Học - Đại học Cần Thơ. 4: 2005, 136-144.

Đặng Thị Hoàng Oanh (2011). Nguyên lý và kỹ thuật chuẩn đoán bệnh

thủy sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp – Tp. Hồ Chí Minh.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai Thy. (2009). Nghiên cứu ứng

dụng qui trình PCR chuẩn đoán vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên thận cá tra

(Pangasianodon hypopthalmus). Báo cáo hội nghị Công nghệ sinh học toàn

quốc. Công nghệ sinh học phục vụ Nông – Lâm nghiệp, Thủy sản, Công

nghiệp, Y-dược và bảo vệ môi trường. Thái Nguyên, ngày 26-27 tháng 11,

2009. Mã số 04-09/ĐHTN – 2009. 289-292.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Đức Hiền. (2012). Phân lập và xác

định khả năng gây bệnh xuất huyết trên lươn đồng (Monopterus albus) của vi

khuẩn A. hydrophila. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 2012:22c

173-182

Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng và

Nguyễn Thanh Phương. (2006). Xác định vị trí phân loại và khả năng kháng

thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm

sú (Penaeus monodon). Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ 4/2006:

42-52. 300 trang.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, (2012). Phân lập và

xác định đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus agalactiae từ cá điêu hồng

(Oreochromis sp.) bệnh phù mắt và xuất huyết. Tạp chí khoa học trường Đại

học Cần Thơ 2012: 22c 203-212.

Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh

Phương. (2006). Sưu tập và phân lập vi khuẩn từ mẫu thủy sản nuôi ở Đồng

bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ 4/2006 (2):

53-61. 300 trang.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Trúc Phương (2010). Phát hiện vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) bằng phương pháp PCR. Tạp chí khoa học trường Đại học

Cần Thơ, 13: 151-159.

102

Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh (2011). Đặc điểm mô

bệnh học ở cá điêu hồng (Oreochromis sp) nhiễm vi khuẩn Streptococcus

agalactiae trong điều kiện thực nghiệm.Kỷ yếu Hội nghị Khoa học thủy sản

lần 4 trường Đại học Cần Thơ năm 2011, 289-301.

Đặng Thụy Mai Thy, Trần Thị Thủy Cúc, Nguyễn Châu Phương Lam,

Nguyễn Đức Hiền và Đặng Thị Hoàng Oanh. (2012). Đặc điểm mô bệnh học

cá rô (Anabas testudineus) nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila và

Streptococcus sp. trong điều kiện thực nghiệm. Tạp chí khoa học trường Đại

học Cần Thơ, 2012: 22c 183-193.

Đặng Thụy Mai Thy. (2010). Nghiên cứu đặc tính gây bệnh của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Luận văn thạc

sĩ khoa học – Đại học Cần Thơ.

Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội.

(2004). Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa nuôi trồng thủy sản - Đại học

Thủy sản Nha trang. 346 trang.

Hà Ký và Bùi Quang Tề, 2007. Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam.

Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

Hứa Thị Phượng Liên. (1998). Luận án Thạc sĩ Ngành Nuôi trồng thủy

sản. Nghiên cứu bệnh xuất huyết trên vi, xoang miệng cá Basa (Pangasius

bocourti) nuôi bè tại An Giang. Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Chính. (2005). Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất

trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở An Giang và Cần

Thơ. Luận văn thạc sĩ khoa học. Khoa Thủy sản, Trường Đại Học Cần Thơ.

Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh. (2010). Phân lập và xác

định khả năng gây bệnh trắng da trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

của vi khuẩn Flavobacterium columnare. Tạp chí khoa học 14:211-220. Đại

học Cần Thơ.

Nguyễn Hà Giang, Trần Việt Tiên và Đặng Thị Hoàng Oanh. (2011).

Ứng dụng qui trình PCR đa mồi phát hiện đồng thời ba loài vi khuẩn

Edwardsiella, Aeromonas hydrophila và Flavobacterium columnare. Kỷ yếu

Hội nghị Khoa học thủy sản lần 4, Trường Đại học Cần Thơ (2011): 241-249.

Nguyễn Hà Giang, Trương Quỳnh Như, Lê Hữu Thôi và Đặng Thị

Hoàng Oanh. (2010). Nghiên cứu ứng dụng qui trình PCR chẩn đoán vi

khuẩn Aeromonas hydrophila trên thận cá tra (Pangasianodon

hypopthalmus) bệnh xuất huyết. Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ. 16a:

136- 142.

Nguyễn Khang. (2005). Kháng sinh học ứng dụng. Nhà xuất bản y học,

Hà Nội. Trang 1-116

Nguyễn Thanh Phương, Trần Thị Tuyết Hoa, Vũ Ngọc Út, Huỳnh

Trường Giang, Cao Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thu Hằng, Phạm Trần Nguyên

Thảo, Đặng Thụy Mai Thy, Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Minh Hậu,

Nguyễn Quốc Thịnh và Đoàn Nhật Phương. (2007). Báo cáo tổng kết đề tài

103

cấp tỉnh: Quan trắc môi trường và xác định tác nhân gây bệnh trên cá da trơn

(cá tra-Pangasius hypophthalmus và basa - P. bocourti) và tôm càng xanh

(Macrobrachium rosenbergii) ở tỉnh An Giang, 125 trang. Khoa thủy sản,

Trường Đại Học Cần Thơ.

Nguyễn Thị Thúy An, Trần Ngọc Hải và Từ Thanh Dung. (2013). Phân

lập vi khuẩn Vibrio trên cá bớp (Rachycentron canadum) bị lở loét. Tuyển tập

Hội nghị Khoa học trẻ ngành Thủy sản toàn quốc lần thứ IV, 2013: 407-411.

Phạm Hồng Quân, Hồ Thu Thủy, Nguyễn Hữu Vũ, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và

Lê Văn Khoa. (2013). Một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Streptococcus

spp. gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.

Tạp chí Khoa học và Phát triển Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội năm

2013, tập 11, số 4: 506-513.

Phạm Tân Tiến. (2010). Cơ sở sinh lý cá và những ứng dụng vào thực tế

sản xuất. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, 2010.

Phạm Thanh Hương, Nguyễn Thiện Nam, Từ Thanh Dung và Nguyễn

Anh Tuấn. (2011). Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và

Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Pangsianodon hypophthalmus) ở

đồng bằng sông Cửu Long. Kỷ yếu hội nghị khoa học thủy sản lần IV, 2011.

Trường Đại học Cần Thơ.

Phạm Thanh Liêm, Ambok Bolong Abol-Munafi, Mohd Azmi Ambak,

Siti Shapor Siraj và Đoàn Nhật Phương. (2008). Khả năng kháng bệnh của cá

trê lai (Clarias macrocephalus x C. gariepinus) thế hệ F1 và con lai sau F1 với

vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ,

2008 (1): 195-203.

Sở Nông nghiệp & PTNT Bạc Liêu. (2012). Báo cáo của Sở Nông

nghiệp & PTNT Bạc Liêu Số 02/BC-SNN ngày 04 tháng 01 năm 2012 về Kết

quả thực hiện kế hoạch năm 2011 và kế hoạch phát triển nông nghiệp, nông

thôn năm 2012 tỉnh Bạc Liêu.

Sở Nông nghiệp & PTNT Bạc Liêu. (2013). Báo cáo của Sở Nông

nghiệp & PTNT Bạc Liêu Số 22/BC-SNN ngày 25 tháng 01 năm 2013 về Kết

quả thực hiện kế hoạch năm 2012 và kế hoạch phát triển nông nghiệp, nông

thôn năm 2013.

Sở Nông nghiệp & PTNT Cà Mau. (2013). Báo cáo của Sở Nông nghiệp

& PTNT Cà Mau Số 77/BC-SNN ngày 28 tháng 02 năm 2013 về Tổng kết

thực hiện kế hoạch năm 2012 và triển khai phương hướng, nhiệm vụ năm

2013.

Trần Đắc Định, Hà Phước Hùng, Nguyễn Trọng Hồ và Nguyễn Văn

Lành. (2002). Nghiên cứu đặc điểm sinh học của cá bống kèo

Pseudapocryptes elongatus (Cuvier, 18160) phân bố ở vùng Đồng Bằng Sông

Cửu Long. Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, Trường Đại Học Cần Thơ, 15

trang.

104

Trần Đắc Định, Võ Thành Toàn và Trần Thị Thanh Lý (2011). Tập tính

di cư của cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus) phân bố ở khu vực ven

biển ĐBSCL. Tạp chí Khoa học 2011:18a 56-64.

Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư Bạc Liêu, 2013. Báo cáo của

Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư Số 103/BC-KNKN ngày 26 tháng 12

năm 2013 về Báo cáo các mô hình sản xuất có hiệu quả năm 2013 - Phương

hướng, giải pháp nhân rộng các mô hình hiệu quả năm 2014.

Trương Đình Hoài, Nguyễn Vũ Sơn, Nguyễn Thị Hoài, Nguyễn Thị Mai

Phương và Nguyễn Thị Hậu. (2014). Đặc điểm mô bệnh học trên cá rô phi

(Oreochromis niloticus) nhiễm Streptococcus sp. nuôi tại một số tỉnh miền

Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Phát triển Trường Đại học Nông nghiệp

Hà Nội năm 2014, tập 12, số 3: 360-371.

Trương Hoàng Minh và Nguyễn Thanh Phương (2011). Tổng quan nuôi

cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus, Cuvier 1816) ở tỉnh Sóc Trăng và

Bạc Liêu. Tạp chí khoa học trường ĐHCT 2011:18b 219-227.

Trương Hoàng Minh, Trương Quốc Phú, Wenresti G. Gallardo và Kou

Ikejma. (2009). Sự phân bố và cường lực khai thác cá bống kèo giống

(Pseudapocryptes elongatus, Cuvier 1816) ở vùng ven biển tỉnh Sóc Trăng và

Bạc liêu. Kỷ yếu hội nghị khoa học thủy sản toàn quốc 19/11/2009, 19: 405-

415.

Từ Thanh Dung (2010). Nghiên cứu về huyết học cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) bệnh trắng gan, trắng mang. Tạp chí khoa học Trường Đại

học Cần Thơ năm 2010: 15b 81-90.

Từ Thanh Dung (2012). Sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh xuất

huyết trên cá tra nuôi thâm canh ở đồng bằng sông Cửu Long. UV – Việt

Nam. Quyển 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp, 2012.

Từ Thanh Dung, M.Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc

Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy. (2004). Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan

trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học trường Đại học Cần

Thơ, 2004: 137-142. 373 trang.

Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005).

Giáo trình Bệnh học thủy sản. Đại học Cần Thơ. 151 trang.

Từ Thanh Dung, Nguyễn Thị Tiên và Nguyễn Anh Tuấn (2012). Nghiên

cứu tác nhân gây bệnh trắng đuôi trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

và giải pháp điều trị. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ 2012: 22c

136-145.

Từ Thanh Dung, Lý Văn Khánh và Trần Ngọc Hải. (2014). Xác định một

số mầm bệnh trên cá chình bông (Anguilla marmorata) nuôi trong bể. Tạp chí

khoa học trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề: Thủy sản (2014) (2): 177-

183.

Võ Văn Nha, (2012). Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp. trong nuôi cá mú thương

phẩm. UV – Việt Nam. Quyển 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp, 2012.

105

Website tham khảo:

1. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

2. http://training.fws.gov/resources/course-resources/fish-histology

3. http://www.moprn.org/moprn2012/fish/fish1.pdf

4. http://vasep.com.vn/Tin-Tuc/666_15515/Bac-Lieu-ca-keo-no-bung-

chet-hang-loat.htm (truy cập ngày 28/9/2011)

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://training.fws.gov/resources/course-resources/fish-histology

http://www.moprn.org/moprn2012/fish/fish1.pdf

http://vasep.com.vn/Tin-Tuc/666_15515/Bac-Lieu-ca-keo-no-bung-chet-hang-loat.htm

http://vasep.com.vn/Tin-Tuc/666_15515/Bac-Lieu-ca-keo-no-bung-chet-hang-loat.htm

106

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: PHIẾU ĐIỀU TRA AO NUÔI

1. Thông tin cá nhân:

- Họ và tên: ............................................................................................................

- Địa chỉ: ...............................................................................................................

2. Thông tin chung về tình hình nuôi cá bống kèo:

2.1 Thông tin chung về sản xuất:

- Quy mô: .............................................................................................................

- Số ao nuôi: .........................................................................................................

- Diện tích ao nuôi (ha): .......................................................................................

- Mật độ nuôi: .......................................................................................................

- Cỡ giống: ...........................................................................................................

- Số vụ nuôi/năm: .................................................................................................

- Năng suất bình quân ..........................................................................................

- Số lần cho ăn/ngày: ............................................................................................

- Kinh nghiệm nuôi (năm): ...................................................................................

2.2 Thông tin về quy trình nuôi:

- Nguồn nước: ......................................................................................................

- Chuẩn bị ao nuôi: ...............................................................................................

Phơi ao .....................................................................................................

Bón vôi .....................................................................................................

Diệt tạp .....................................................................................................

Bón phân ..................................................................................................

Mực nước ao nuôi: ...................................................................................

- Nguồn giống:

Kích cỡ (cm) .............................................................................................

Kiểm tra con giống ...................................................................................

- Thả giống:

Mật độ thả giống (con/m2) .......................................................................

Tỷ lệ hao hụt (con) ...................................................................................

- Quản lý chất lượng nước trong ao nuôi:

Mực nước trong ao từ .................................... cm đến ..............................

Số lần thay nước .......................................................................................

Định kỳ bón phân .....................................................................................

Kiểm tra pH ..............................................................................................

Kiểm tra độ mặn .......................................................................................

Sử dụng hóa chất quản lý môi trường ......................................................

- Quản lý thức ăn:

Các chất thường trộn vào thức ăn ............................................................

Số lần cho ăn trong ngày ..........................................................................

107

2.3 Thông tin về tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo nuôi:

- Thời gian xuất hiện bệnh ...................................................................................

- Kích cỡ cá khi xuất hiện bệnh ............................................................................

- Biểu hiện bệnh ...................................................................................................

- Tỷ lệ hao hụt ......................................................................................................

- Các yếu tố môi trường khi xuất hiện bệnh:

Nhiệt độ ................................................................................................................

pH .........................................................................................................................

Oxy .......................................................................................................................

- Quản lý sức khỏe cá nuôi (Phương pháp điều trị): ............................................

- Kết quả điều trị: .................................................................................................

- Cách xử lý khi ao bị nhiễm bệnh .......................................................................

108

PHỤ LỤC B

HÓA CHẤT VÀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU

Phụ lục B.1: Phƣơng pháp xác định khả năng tan huyết của vi

khuẩn

Vi khuẩn được phân lập trên mẫu cá bệnh, phải được xác định là loài vi

khuẩn gram dương, hình cầu, vi khuẩn nuôi trên đĩa TSA (+1,5%NaCl). Khi vi

khuẩn đã thuần, dùng que cấy nhặt một khuẩn lạc và cấy lên đĩa môi trường

Blood (1,5%NaCl). Sau 48 giờ ở 30 – 320C vi khuẩn phát triển và đọc kết quả.

Đọc kết quả:

- Dạng alpha (α): Streptococcus Pneumoniae và một nhóm liên cầu

khuẩn (Streptococcus viridans hoặc Viridans streptococci) sẽ cho ra kết quả

alpha là tán huyết không hoàn toàn. Nhóm vi khuẩn này làm thay đổi màu sắc

trong môi trường thạch nhưng tán huyết không đầy đủ và tán huyết một phần.

Tán huyết alpha được gây ra do vi khuẩn có khả năng sản xuất ra hydrogen

peroxide làm oxi hóa hemoglobin trong môi trường Blood.

- Dạng beta (β): còn được gọi là tán huyết đầy đủ, dùng để nhận biết

Streptococcus pyogenes hoặc nhóm strep (GAS), nó có khả năng tiết ra

enzyme streptolysin có khả năng gây ra sự tán huyết đầy đủ, làm xuất hiện

một khu vực sáng trên môi trường Blood.

- Dạng gama (γ): khi vi khuẩn không gây ra hiện tượng tán huyết cũng

như môi trường thạch không có gì thay đổi, thường là vi khuẩn Enterococcus

(nhóm D strep) hiển thị sự tán huyết gama.

Phụ lục B.2: Phƣơng pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20

Strep (Biomérieux, Pháp)

- Chuẩn bị:

+ Cho 5 ml nước cất vào trong khuôn nhựa để giữ ẩm khi ủ mẫu và sau

đó đặt kit API 20 Strep vào khuôn nhựa.

+ Dùng que cấy tiệt trùng lấy một lượng nhỏ vi khuẩn cho vào ống chứa

2ml API Suspension Medium (dung dịch gốc). So màu độ đục của vi khuẩn

trong ống API Suspension Medium sao cho tương đồng độ đục ống vi khuẩn

McFacland số 4.

+ Dùng pipet tiệt trùng hút 100 μl dung dịch vi khuẩn của API

Suspension Medium cho đầy vào các ô VP, HIP, ESC, PYRA, αGAL,

βGUR, βGAL, PAL, LAP và 150 μl cho vào đầy nữa giếng ADH.

+ Dùng pipet hút 500 μl dung dịch vi khuẩn từ dung dịch gốc cho vào

dung dịch API GP Medium (dung dịch 1), lắc đều.

109

+ Sau đó hút 150 μl dung dịch vi khuẩn từ dung dịch API GP Medium

cho đầy các ô còn lại (từ ô RIB đến GLYG).

+ Tiếp tục phủ dầu (mineral oil) vào các ô từ ADH → GLYG.

+ Đậy nắp khuôn nhựa, ủ mẫu ở nhiệt độ 36oC+2

oC.

- Sau 4 giờ cho thuốc thử vào và đọc kết quả lần 1 sau 10 phút (Bảng

3.1)

+ Giếng VP: nhỏ vào một giọt VP1 + 1 giọt VP2.

+ Giếng HIP: nhỏ 2 giọt NIN.

+ Giếng PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL và LAP: nhỏ một giọt ZYM

A và một giọt ZYM B,.

- Đem ủ kit thêm đủ 24 giờ, đọc kết quả lần 2 ở các giếng ô ESC, ADH,

RIB → GLYG. Không đọc lại kết quả các ô HIP, PYRA, αGAL, βGUR,

βGAL, PAL, LAP.

Phụ lục B.3: Phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của

thuốc kháng sinh

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn được

xác định theo phương pháp của Geert Huys (2002), các bước tiến hành như

sau:

Ngày thứ nhất và thứ hai

- Chuẩn bị: Đĩa TSA (Tryptic soya agar) + 1,5% NaCl, ống nghiệm 10

ml TSB (Tryptic soy broth) + 1,5% NaCl, chai 50 ml TSB + 1,5% NaCl, nước

muối sinh lý (dung dịch 0,85%NaCl).

- Nuôi vi khuẩn trên môi trường TSA + 1,5% NaCl 24 giờ ở nhiệt độ

30oC bao gồm vi khuẩn cần xác định MIC và vi khuẩn đối chứng (E.coli LMG

8223)

- Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn bằng cách quan sát sự đồng nhất

về hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và nhuộm Gram.

- Chọn 5 khuẩn lạc riêng lẻ trên đĩa TSA + 1,5% NaCl cho vào ống

nghiệm chứa 10 ml TSB + 1,5% NaCl, ủ ở 28oC, 24h (có thể ủ lâu hơn nếu

khuẩn lạc chưa phát triển).

- Mỗi lần xác định MIC chỉ làm tối đa 10 chủng vi khuẩn trong đó có

chủng đối chứng.

Ngày thứ ba

Pha thuốc

- Pha 02 ống nghiệm thuốc gốc, mỗi ống 50 ml (là kháng sinh hay thuốc

cần khảo nghiệm), ống thứ nhất có hàm lượng thuốc là 1024 ppm và ống thứ

hai có hàm lượng thuốc là 256 ppm. Thuốc phải được pha bằng dung môi phù

hợp (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

110

- Pha loãng thuốc với độ pha loãng 2 lần từ 3 – 1024 ppm trong ống

nghiệm 50 ml. Hàm lượng thuốc 512 và 256 ppm phải được pha từ ống thuốc

gốc thứ nhất (1024 ppm) bằng cách thêm nước muối sinh lý. Hàm lượng thuốc

128, 64, 32, 16, 8 và 4 ppm được pha từ ống thuốc gốc thứ hai (256 ppm).

Bảng 1. Thao tác pha loãng kháng sinh (thể tích dùng cho 10 chủng vi khuẩn)

Ống

nghiệm

Nồng độ cần đạt

(ppm) Thể tích của dung dịch kháng sinh

Thể tích nước

muối sinh lý

1 1024 25 ml (dung dịch thuốc gốc 1) -

2 512 25 ml (1024 ppm) 25 ml

3 256 25 ml (512 ppm) 25 ml

4 128 25 ml (dung dịch thuốc gốc 2) 25 ml

5 64 25 ml (128 ppm) 25 ml

6 32 25 ml (64 ppm) 25 ml

7 16 25 ml (32 ppm) 25 ml

8 8 25 ml (16 ppm) 25 ml

9 4 25 ml (8 ppm) 25 ml

Ghi chú: dung dịch thuốc gốc 1 = 1024 ppm, dung dịch thuốc gốc 2 = 256 ppm.

Phải lắc đều dung dịch trước khi pha loãng ở nồng độ tiếp theo. Chú ý ở

mỗi độ pha loãng, hàm lượng thuốc sẽ giảm đi phân nửa sau khi cho dung dịch

vi khuẩn vào (Bảng 1).

Bảng 2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho 01 chủng)

Số MIC Hàm lượng cuối

cùng (ppm) Thể tích dung dịch thuốc

Thể tích vi

khuẩn

1 512 2 ml (1024 ppm, ống 1) 2 ml

2 256 2 ml (512 ppm, ống 2) 2 ml

3 128 2 ml (256 ppm, ống 3) 2 ml

4 64 2 ml (128 ppm, ống 4) 2 ml

5 32 2 ml (64 ppm, ống 5) 2 ml

6 16 2 ml (32 ppm, ống 6) 2 ml

7 8 2 ml (16 ppm, ống 7) 2 ml

8 4 2 ml (8 ppm, ống 8) 2 ml

9 2 2 ml (4 ppm, ống 9) 2 ml

Đo mật độ vi khuẩn

- Đo mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 590 nm

và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường TSB + 1,5% NaCl cho đạt OD

= 0,1 ± 0,02 (khoảng 108

cfu/ml).

- Đối chứng khi sử dụng so màu là môi trường TSB + 1,5% NaCl không

dùng nước cất và không nên cho vi khuẩn vào thuốc lâu hơn 1 giờ sau khi đo

mật độ.

- Cho 2 ml vi khuẩn đã điều chỉnh mật độ vào mỗi ống nghiệm có hàm

lượng thuốc từ 4 – 1024 ppm (bảng 3.9). Lắc đều dung dịch vi khuẩn trước khi

cho vào các ống nghiệm có thuốc.

- Mỗi lần xác định MIC cần phải có: đối chứng âm (2 ml TSB + 1,5%

NaCl + 2 ml nước cất); đối chứng dương (2 ml vi khuẩn + 2 ml nước cất).

111

- Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 280C trong 24 giờ (hoặc lâu hơn đến

khi thấy vi khuẩn trong ống đối chứng dương phát triển).

Mỗi chủng vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ phải được cấy lên môi

trường TSA + 1,5% NaCl để kiểm tra sự thuần chủng và phải được ủ trong

cùng điều kiện với các ống MIC.

Ngày thứ tƣ

Đọc kết quả

- Kiểm tra sự thuần chủng của chủng vi khuẩn xét nghiệm trên đĩa TSA

+ 1,5% NaCl. Nếu thấy phát hiện có sự tạp nhiễm thì không đọc kết quả MIC.

- Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ đục của

mỗi ống MIC với ống đối chứng âm và dương.

- Loại ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục phải

bị loại.

- Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc trong ống nghiệm đầu

tiên không có vi khuẩn phát triển. Trường hợp vi khuẩn phát triển ở tất cả các

nồng độ thì giá trị MIC được xác định ở ống nghiệm có hàm lượng thuốc mà

sự phát triển của vi khuẩn giảm khoảng 80% so với ống trước đó.

112

PHỤ LỤC C

SỐ LIỆU NGHIÊN CỨU

Phụ lục C.1: Kết quả điều tra

Stt Họ và tên

Diện

tích

(m2)

Xử lý nƣớc Mật độ

(con/m2)

Thức ăn

(kg/ngày) Tên bệnh

Giai đoạn

bệnh

(tháng

nuôi)

Xử lý

Tỷ lệ

chết

(%)

1 Dương Hoàng Giáp 2.000 Iodine 130 50 Đường ruột

Xuất huyết 2

Amoxicillin, Vitamin C

Men tiêu hóa 10

2 Trần Văn Đức 2.500 BZT 150 30 Xuất huyết 2 Amoxicillin, Ampicillin

Vitamin C, Men tiêu hóa 30

3 Trần Hữu Tạo 2.000 Diệt khuẩn 70 20

Lở loét

Xuất huyết

Cong thân

2

Amoxicillin, Vi sinh, BZT

Diệt khuẩn BKC, Vitamin

C, men tiêu hóa

10

4 Võ Văn Tây 1.500 Không 130 20 Xuất huyết 2,5 Virkon, Amoxicillin

Vitamin C, men tiêu hóa 30

5 Trần Hữu Tường 7.000 Không 130 50

Xuất huyết

Đường ruột

Lở loét

2 Amoxicillin, Vitamin C

Men tiêu hóa 30

6 Đỗ Minh Toàn 10.000 Saponin 150 50

Xuất huyết

Đường ruột

Cong thân

2

Amoxicillin

Ampicillin

Gentamox

30

7 Thạch Len 4.000 Iodine, Virkon A 100 20 Xuất huyết

Lở loét 2,5 - 3

Vitamin C, men tiêu hóa

Amoxicillin, Iodine 20

8 Quách Thành Khánh 4.000 Dây thuốc cá 160 25

Xuất huyết

Đường ruột

Cong thân

2 Vitamin C, men tiêu hóa

Amoxicillin 35

9 Quách Thành Thi 3.000 Dạy thuốc cá 140 20 Xuất huyết

Cong thân 2-2,5


Amoxicillin, Iodine 10

10 Quách Thanh Cần 8.000 Dây thuốc cá 200 20

Lở loét

Xuất huyết

bụng

1,5-2 Amoxicillin, BKC

Vitamin C, men tiêu hóa 15

11 Huỳnh Dũng Phong 1.000 Saponin 150 20 Lở loét

Xuất huyết 1,5-2


Amoxicillin 10

12 Trần Văn Hưng 11.000 Saponin 110 20 Lở loét

Xuất huyết 1-2

BZT

BKC 5

13 Vũ Văn Hoạt 10.000 Dây thuốc cá 130 50 Đường ruột

Lở loét 1,5-2

Vitamin C

Amoxicillin 5

14 Nguyễn Văn Hiếu 10.000 Dây thuốc cá 100 50

Lở loét

Gan

Xuất huyết

1,5 - 3 Vitamin C, Amoxicillin,

BZT 8

15 Cao Trung Tính 7.000 Dây thuốc cá 100 40

Lở loét

Gan

Xuất huyết

1-3 Vitamin C, Amoxicillin

BZT, Iodine 20

16 Phạm Văn Vượng 7.000 Saponin 150 50

Xuất huyết

Lở loét

Gan

0,5-2 BKC, BZT, Vitamin C 5

17 Phạm Bình Lạc 35.000 Virkon 100 30 Lở loét 1 Virkon 2

113

Gan Vi sinh EM

18 Trần Quốc Đạt 10.000 Dây thuốc cá 140 50

Bể bụng

Lở loét

Xuất huyết

1,5

Virkon

Vi sinh EM

Vitamin C

5

19 Lê Tuyên Phuông 4.000 Dây thuốc cá 80 35 Bể bụng

Gan 1,5

Virkon

Vitamin C 10

20 Ngô Yến Sự 14.000 Dây thuốc cá 80 50 Gan

Xuất huyết 1

BKC

Vitamin C 5

21 Nguyễn Hoàng Thiên 5.000 Dây thuốc cá 100 50

Lở loét

Đường ruột

Xuất huyết

0,5-3

Virkon, Vitamin C, men vi

sinh, Amoxicillin,

Tetracycline

5

22 Trần Văn Do 4.000 Saponin 130 25

Lở loét

Xuất huyết

Gan

2

Vitamin C

Men tiêu hóa

BKC

20

23 Lữ Văn Công 30.000 Saponin, Chlorine 120 20

Bể bụng

Lở loét

Xuất huyết

0,5

Men tiêu hóa

Amoxicillin

Vitamin C

5

24 Dương Quốc Việt 2.500 Dây thuốc cá 100 35 Bể bụng 3 BKC 5

25 Huỳnh Văn Tháo 20.000 Chlorine 140 30

Bể bụng

Lở loét

Xuất huyết

2,5-3

Vitamin C

Men vi sinh

Tetracycline

30

26 Tô Thanh Thảo 18.000 Dây thuốc cá 120 20 Bể bụng

Gan 2

Vitamin C

Virkon 30

27 Lê Văn Hường 12.000 Saponin 130 20

Bể bụng

Gan

Xuất huyết

3

Vitamin C

Virkon

Men tiêu hóa

15

28 Lê Văn Cum 11.000 Dây thuốc cá 100 50 Bể bụng

Lở loét 2

Vitamin C

BKC 15

29 Trương Anh Cẩm 18.000 Dây thuốc cá 100 50 Bể bụng

Lở loét 1

Vitamin C

Virkon 15

30 Lâm Thanh Nhàn 12.000 Saponin 100 50 Lở loét

Gan xuất huyết 1,5

Chlorine

Vi sinh EM 5

31 Phạm Văn Soạn 10.000 Dây thuốc cá 130 50 Gan xuất huyết 1,5 Vitamin C, Tetracycline

BKC, EM 5

32 Nguyễn Thanh Phương 25.000 Lọc nước, Iodine 150 50

Lở loét

Gan xuất huyết

Đường ruột

Phù mắt

60

Vitamin C, Amoxicillin

Men vi sinh 20

33 Nguyễn Văn Thương 8.000 Lọc nước, diệt

khuẩn 150 25

Chướng bụng,

lồi mắt

Gan xuất huyết

1,5 Vitamin C, BZT,

Amoxicillin, Enrofloxacin 10

34 Châu Chí Nhi 9.000 Dây thuốc cá

Iodine, Vi sinh 180 30

Lở loét

Xuất huyết 1

B complex, Amoxicillin

Iodine 5

35 Dương Tấn Trọng Hảo 20.000 Lọc nước,

Iodine, BZT 150 60

Xuất huyết

Phù mắt

Đường ruột

Gan

2 Men vi sinh, Vitamin C

Amoxicillin, BZT 10

36 Nguyễn Thanh Liêm 10.000 Lọc nước 100 50 Xuất huyết 1 Iodine 5

37 Tạ Hùng Cường 25.000 Lọc nước, Iodine 130 20 Gan xuất huyết 2 Amoxicillin 20

114

Lở loét

38 Mã Hữu Công 30.000 Lọc nước, Iodine 150 20 Đường ruột

Xuất huyết 2

Men tiêu hóa

Amoxicillin 4

39 Phan Long Thiên 5.000 Lọc nước, Iodine 180 25 Chướng bụng

Xuất huyết 2

Men tiêu hóa

Amoxicillin 4

40 Tạ Thu Sương 17.000 Lọc nước, Iodine 170 40 Xuất huyết 2 Amoxicillin, Methionin

Sorbitol 10

41 Tạ Hiền Nhân 8.000 Lọc nước, diệt

khuẩn 150 20

Chướng bụng

Lồi mắt

Gan

Đường ruột

Xuất huyết

2

Diệt khuẩn, Vitamin C

Amoxicillin,Enrofloxacin

25

42 Hồng Vũ Kỳ 20.000 Lọc nước 110 50

Trắng đuôi

Tuột nhớt

Chướng bụng

Xuất huyết

Gan

1

Men đường ruột

Cotrim

Amoxicillin

25

43 Quách Văn Duôn 12.000 Lọc nước 120 50

Gan

Đường ruột

Chướng bụng

1,5-2 Amoxicillin 5

44 Nguyễn Văn Út 12.000 Iodine 150 20

Cá xoay vòng

Chướng bụng

Xuất huyết

Gan

2 Amoxicillin

Men đường ruột 5

45 Hồng Văn Vũ 25.000 Lọc nước, Iodine 140 50

Chướng bụng

Gan

Xuất huyết

2 Amoxicillin 5

46 Lê Hồng Hoàng 5.000 Không 100 20

Tuột nhớt

Lở loét

Xuất huyết

2

Amoxicillin

Men đường ruột

Vitamin C, Enrofloxacin

47 Phan Long Hữu 25.000 Không 120 50 Chướng bụng

Xuất huyết 2

Oxytetracycline

Amoxicillin 5

48 Tạ Kim Gấu 16.000 Lọc nước, diệt

khuẩn 150 50 Xuất huyết 2

Amoxicillin, men đường

ruột, Vitamin C, Cotrim 5

49 Trần Việt Tân 6.000 Lọc nước 120 20 Chướng bụng

Xuất huyết 2

Amoxicillin

Men tiêu hóa 15

50 Lê Văn Nhừng 20.000 DAP 150 20

Tuột nhớt

Lở loét

Xuất huyết

2

Iodine

Vi sinh

Amoxicillin

35

51 Nguyễn Văn Đảnh 4.000 Dây thuốc cá

Iodine, vi sinh 150 20

Tuột nhớt

Lở loét

Gan

1,5

B Complex

Amoxicillin

Vitamin C

30

52 Trần Tuyết Giang 9.000 Vi sinh, BZT 100 30

Chướng bụng

Lở loét

Xuất huyết

1,5 Amoxicillin 15

53 Phan Long Lực 15.000 Không 100 60 Chướng bụng

Xuất huyết 1

Amoxicillin

Baymet 10

54 Huỳnh Tấn Phát 5.000 Dây thuốc cá

Diệt giáp xác, 120 20

Chướng bụng

Xuất huyết 2

Kháng sinh 40

115

BKC

55 Đỗ Văn Nơi 6.000 Phân 3 màu Vi

sinh 100 25

Xuất huyết

Lở loét

Gan xuất huyết

Ruột

2 Amoxicillin

Super VS 20

56 Lê Văn Hột 30.000 Dây thuốc cá 150 20-25 Lở loét

Xuất huyết 1 Amoxicillin 20

57 Phạm Ngoan Cường 15.000 Không 180 45

Lở loét

Xuất huyết

Gan

2

Amoxicillin

Sorbitol 40

58 Đặng Thanh Hùng 16.000 Không 170 60 Chướng bụng 2 Amoxicillin 5

59 Đặng Văn Muộn 25.000 Túi lọc 160 50 Chướng bụng

Xuất huyết 1,5

Amoxicillin

Vitamin C 10

60 Đặng Văn Hạnh 15.000 Không 200 60

Xuất huyết

Gan

Lở loét

Đường ruột

2

Amoxicillin

Sorbitol

Oxytetracycline 55

61 Lê Thế Vinh 15.000 Không 180 60 Chướng bụng

Xuất huyết 2

Vitamin C

Amoxicillin 20

62 Lê Minh Tân 3.000 Dây thuốc cá


Lở loét


Amoxicillin, Sorbitol

Oxytetracycline 40

63 Lê Thanh Bình 2.000

Dây thuốc cá,

Zeolite, Iodine,

Vi sinh

125 20 Chướng bụng


Amoxicillin

Ciprofloxacin 15

64 Cao Thanh Xuân 4.000

Dây thuốc cá,

Zeolite, Iodine,

Vi sinh

100 25 Chướng bụng


Amoxicillin

Ciprofloxacin 15

65 Cao Văn Yên 10.000 Iodine, Vi sinh,

Zeolite 100 50 Chướng bụng 2,5-3

Amoxicillin

Ciprofloxacin 20

66 Trần Thanh Quang 8.000

Dây thuốc cá,

Saponin, NPK,

Iodine, BZT

80 - 100 70

Chướng bụng

Tuột nhớt

Lở loét

Xuất huyết

1,5-2

Methionin

Amoxicillin

Biosubtyl

40

67 Phạm Công Quẩn 5.000 Vi sinh, Yucca

Canximax 80 30 Chướng bụng 1,5

Methionin

Amoxicillin

Men tiêu hóa

25

68 Nguyễn Văn Lắm 21.000

Saponin, NPK

Dây thuốc cá

KMnO4, Vi sinh

120 50

Chướng bụng

Tuột nhớt

Lở loét

1,5-2

Methionin

Amoxicillin

Biosubtyl

5

69 Nguyễn Văn Kết 6.000 Dây thuốc cá

Saponin, Vi sinh 150 45

Xuất huyết

Tuột nhớt

Lở loét

2

Methionin

Amoxicillin

Biosubtyl

30

70 Lê Thanh Ngoan 2.000 Dây thuốc cá

Vi sinh, Iodine 100 20

Xuất huyết

Tuột nhớt

Lở loét

2

Methionin

Amoxicillin

Men tiêu hóa

10

71 Hồ Văn Nhiều 4.000 Saponin, Iodine

Decide, Vi sinh 100 30

Tuột nhớt

Lở loét

Chướng bụng

1,5

Methionin

Amoxicillin

Biosubtyl

30

72 Nguyễn Hồng Khang 2.000 Dây thuốc cá 115 20 Tuột nhớt 2-2,5 Methionin 20

116

Vi sinh, Iodine Lở loét

Chướng bụng

Amoxicillin

Men tiêu hóa

73 Nguyễn Tuấn Khanh 4.000

Saponin,

Dolomite

Dây thuốc cá

Vi sinh, Iodine

140 25 Lở loét

Chướng bụng 2

Methionin

Amoxicillin

Biosubtyl

5

74 Nguyễn Tuấn An 3.000

Dây thuốc cá

Saponin, CaCO3

Dolomite, Iodine,

Yucca, Vi sinh

130 25 Lở loét

Chướng bụng 2-2,5

Amoxicillin

Tetracycline

Vitamin C 15

75 Nguyễn Văn Kiệt 4.000

Saponin,

Dolomite

Dây thuốc cá

Vi sinh, Iodine

125 25

Lở loét

Chướng bụng

Xuất huyết

2

Methionin

Amoxicillin

Biosubtyl 10

76 Trịnh Phương Đông 6.000

Dây thuốc cá,

Iodine, Saponin,

Phân lân,

Dolomite, Vi sinh

100 30

Lở loét

Chướng bụng

Xuất huyết

1,5

Methionin

Amoxicillin

Biosubtyl 15

77 Trịnh Minh Mẫn 2.500

Dây thuốc cá

Saponin, Iodine

Yucca, Zeolite

Vi sinh

80 20

Tuột nhớt

Lở loét

Xuất huyết

2-2,5

Methionin

Amoxicillin

Biosubtyl 10

78 Cao Chí Nguyện 2.000

Dây thuốc cá

Iodine, Vi sinh

KMnO4, Zeolite

Xanh Malachite

Dolomite

150 40 Tuột nhớt

Lở loét 2-2,5

Amoxicillin

Vitamin C 25

79 Nguyễn Văn Chính 3.000

Saponin, Iodine

Vi sinh, Vitamin

C

125 20

Tuột nhớt

Lở loét

Chướng bụng

2

Methionin

Amoxicillin

Biosubtyl

25

80 Hồ Văn Khởi 8.000

Saponin, phân 3

màu, dây thuốc cá

KMnO4, Vi sinh

Xanh Malachite

Dolomite,

Diamitine

150 50

Lở loét

Chướng bụng

Xuất huyết

3

Methionin

Amoxicillin

Biosubtyl

20

81 Huỳnh Văn Phương 3.000 Dây thuốc cá 50 30

Nổi đầu

Chướng bụng

Quay vòng

Lật bụng

2

Amoxicillin

Men tiêu hóa

Hỗ trợ gan, ruột

30

82 Nguyễn Trường Thẳng 20.000 Dây thuốc cá

Iodine, Vi sinh 100-120 35

Chướng bụng

Đốm đỏ

Xuất huyết

2

Amoxicillin, Ciprofloxacin

Vitamin C, Men tiêu hóa

Diệp hạ châu

40

83 Giảng Văn Tới 20.000 Dây thuốc cá

KMnO4 100 30

Chướng bụng

Tuột nhớt

Xuất huyết

2

Vitamin C

Amoxicillin

Ampicillin

25

84 Nguyễn Văn Đời 10.000 Dây thuốc cá

Iodine, Vi sinh 100 30 - 40

Chướng bụng

Tuột nhớt

Xuất huyết

2 – 2,5

Men tiêu hóa

Amoxicillin

Lypsin

30

85 Trương Thị Duy 10.000 Dây thuốc cá 80 30 Chướng bụng 2 – 2,5 Men tiêu hóa, Amoxicillin 35

117

Iodine, Vi sinh Tuột nhớt

Xuất huyết

Lypsin, Ciprofloxacin

Cotrim, Vitamin C

86 Nguyễn Văn Thắng 30.000 Dây thuốc cá


Chướng bụng

Tuột nhớt

Xuất huyết

2 - 3

Men tiêu hóa, Amoxicillin

Lypsin, Ciprofloxacin

Cotrim, Vitamin C

15

87 Trần Thanh Hùng 10.000 Dây thuốc cá


Xuất huyết

dưới da 1-2

Amoxicillin, Ciprofloxacin

Vitamin C 40

88 Giang Bé Em 4.000 Dây thuốc cá


Xuất huyết

dưới da 1,5 - 2

Men tiêu hóa,

Amoxicillin Vitamin C 35

89 Trịnh Văn Minh 10.000 Dây thuốc cá


Không

Xuất huyết

Không xác

định

Vitamin C, Cotrim

Diệp hạ châu

90 Phùng Văn Thùy 15.000 Dây thuốc cá


Đốm đỏ

Xuất huyết 3

CuSO4, Men tiêu hóa

Ciprofloxacin, Amoxicillin 40

118

Phụ lục C.2: Kết quả thu mẫu và phân lập vi khuẩn

Đợt 1: 07 ao: 6 ao bệnh – 1 ao khỏe 23 mẫu cá 34 chủng vi khuẩn

Đợt 2: 10 ao 7 ao bệnh – 3 ao khỏe 41 mẫu cá 42 chủng vi khuẩn

Đợt 3: 01 ao 01 ao bệnh 10 mẫu cá 17 chủng vi khuẩn




Tổng cộng: 6 đợt: 34 ao 23 ao bệnh – 11 ao khỏe 254 mẫu cá 252 chủng vi khuẩn

Thu Đợt I (10/2011)

TT Dấu Hiệu

Bệnh Lý

Hình Dạng

khuẩn Lạc

Nhuộm Gram

và hình dạng

Di

động

Oxydase Catalase O F API 20

Strep

PCR

16S

KSD MIC GTT

HỘ SỐ I

Ao Số 1

Cá số 1: Tuột nhớt, bụng

trương to.

A1F1-T: nhỏ li ti,

trắng trong. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) + + +

A1F1-G: nhỏ li ti,

trắng trong. Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Cá số 2: Cong thân.


trắng trong. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)


trắng trong. Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Ao Số 2

Cá số 1:

Xuất huyết vây

bụng, nắp mang,

vây hậu môn. Gan

hơi nhạt.

A2F1-G: nhỏ

tròn, trắng đục. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) + + +

A2F1-T: nhỏ tròn,

trắng đục. Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Cá số 2:

Xây hậu môn xuất

huyết nhẹ, gan

xuất huyết.




trắng trong. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) + + +

Cá số 3:

Xuất huyết ở vây

hậu môn, vây

bụng.

Gan nhạt màu.

A2F3-G: nhỏ

tròn, trắng đục. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)


trắng đục. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Cá số 4:

Xuất huyết nhẹ

vây hậu môn, hậu

môn, bụng. Thân

có đốm trắng.

A2F4-G: nhỏ




Ao Số 3

Cá số 1: Xuất huyết vây

bụng, tuột nhớt.

A3F1-G: nhỏ


A3F1-T: to tròn,

vàng kem. Gram (-), hình que (+) (+) (+) (+) (+)

A3F1-TT: nhỏ


119

Cá số 2:

Xuất huyết vây

hậu môn, hậu

môn,

ruột xuất huyết.

A3F2-G1: to tròn,


A3F2-G2: to tròn,


Cá số 3:

Xuất huyêt nhiều

ở vây bụng, bụng,

nấp hầu. Gan bị

bầm.





A3F3-TT: nhỏ li

ti, trắng trong. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

HỘ SỐ II

Khu I

Ao số 3

Cá Số 2: Xuất huyết các

vây

B3K1F2-G: nhỏ

tròn, trắng đục. Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B3K1F2-T: nhỏ

tròn, trắng đục. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) + + +

B3K1F2-TT: nhỏ

tròn, trắng đục. Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Khu II

Ao số 1

Cá số 1: Gan bị bầm.

B1K2F1-G: nhỏ

tròn, trắng đục. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) +

+ +

B1K2F1-T: nhỏ


Cá số 2: Gan nhợt nhạt,

gan xuất huyết.

B1K2F2-G: nhỏ


Cá số 3: Gan nhợt nhạt,

gan xuất huyết.

B1K2F3-G: nhỏ


B1K2F3-T: nhỏ


B1K2F3-TT: nhỏ


Cá Số 4:

Xuất huyết da,

các vây, hậu môn,

bụng. Gan xuất

huyết nhẹ.

Gan Không có

B1K2F4-T: nhỏ


B1K2F4-TT: nhỏ


Cá Số 5: Xuất huyết vây

hậu môn, da.

B1K2F5-G: nhỏ


B1K2F5-T: nhỏ


B1K2F5-TT: nhỏ


Tổng Kết: 34 chủng

Thu Đợt II (12/2011)

TT Dấu Hiệu

Bệnh Lý

Dạng Khuẩn Lạc Nhuộm Gram Di

Động


Strep

PCR

16S

KSD MIC GTT

HỘ SỐ I

120

Ao số 1

Cá số 1:

Xuất huyết vây

bụng, nắp

mang, gan.

A1F1-G: nhỏ

tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

A1F1-T: nhỏ

tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) +

+ +

Cá số 2:

Xuất huyết vây

bụng, đuôi. Gan

tái nhợt.

A1F2-TT: nhỏ




Ao số 2

Cá số 1:

Xuất huyết vây

bụng, cong

thân. Gan xuất

huyết.

A2F1-G: nhỏ


A2F1-T: nhỏ


Cá số 2:

Xuất huyết các

vây, hậu môn,

bụng, thân.

Xoang bụng

chúa dịch, gan

xuất huyết.

A2F2-G: nhỏ


A2F2-T: nhỏ


Cá số 3:

Xuất huyết vây

bụng, vây đuôi,

hậu môn.


trắng đục. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) +

+ +


trắng trong Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Cá số 4:

Xuất huyết vây

ngực, vây hậu

môn, vây bụng.

Xoang bụng có

dịch nhầy, gan

sẫm màu.

A2F4-T: nhỏ


A2F4-G: nhỏ


Cá số 6:

Xuất huyết vây

bụng, vây ngực,

bụng, thân.

Có dịch nhầy

xoang bụng,

gan xuất huyết.



Cá số 7:

Mắt lồi, xuất

huyết vây bụng,

hậu môn.

Gan xuất huyết.

A2F7-T: nhỏ

tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) + + +

A2F7-TT: nhỏ li

ti, trắng trong Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Ao số 3

Cá số 1:

Có khối u trên

thân, xuất huyết

nhẹ trên thân và

vây hậu môn.

Tỳ tạng sưng to,

bầm.

A3F1-G: nhỏ


A3F1-TT: nhỏ


Cá số 2:

Cong thân, xuất

huyết các vây,

ruột.



A3F2-TT: nhỏ li


Cá số 3: Xuất huyết vây

bụng, hậu môn,

A3F3-TT: nhỏ


121

thân.

U nhọt trên gốc

vây lưng.

A3F3-G: nhỏ


A3F3-T: nhỏ


Cá số 4:

Xuất huyết các

vây, xuất huyết

gan.

A3F4-TT: nhỏ


A3F4-G: nhỏ



trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Cá số 5:

Xuất huyết vây

bụng, u nhọt

nấp mang,

mang nhợt nhạt,

gan xuất huyết.



A3F5-TT: nhỏ li


A3F5-G: nhỏ


HỘ SỐ II

Ao số 1

Cá số 1:

Xuất huyết, mật

và gan nhợt

màu.

B1F1-TT: nhỏ


B1F1-G: nhỏ li ti,


B1F1-T: nhỏ li ti,


Ao số 2

Cá số 2:

Da nhợt nhạt,

mật nhợt màu,

trong

xoang có dịch.

B2F2-T: nhỏ


B2F2-G: nhỏ


B2F2-TT: nhỏ


Ao số 3

Cá số 1: Thân nhợt nhạt,

gan tái nhạt.

B3F1-G: nhỏ


B3F1-TT: nhỏ


B3F1-T: nhỏ


Cá số 2:

Xuất huyết vây

bụng, vây ngực,

vây hậu môn,

vây đuôi, cuống

đuôi.

B3F2-TT: nhỏ


B3F2-T: nhỏ

tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) +

+ +

B3F2-G: nhỏ


HỘ SỐ IV

Ao số 1

Cá số 1:

Cong thân,

xoang chứa

dịch.

D1F1-G: nhỏ


D1F1-TT: nhỏ


Tổng kết : 42 chủng

122

Năm 2011 76 chủng

Thu Đợt III (02/2012)

TT Dấu Hiệu

Bệnh Lý


Động


Strep

PCR

16S

KSD MIC GTT

1 Cong thân, xuất

huyết nặng

F5-G: nhỏ tròn



huyết nặng

F5-T: nhỏ tròn



huyết nặng

F5-TT: nhỏ tròn



huyết nặng

F6-T: nhỏ tròn



huyết nặng

F6-TT: nhỏ tròn



huyết nặng

F7-G: nhỏ tròn



huyết nặng

F7-T: nhỏ tròn

trắng đục. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) +

+


huyết nặng

F7-TT: nhỏ tròn



huyết nặng

F8-G: nhỏ tròn



huyết nặng

F8-T: nhỏ tròn



huyết nặng

F8-TT: nhỏ tròn,



huyết nặng

F9-G: nhỏ tròn



huyết nặng

F9-T: nhỏ tròn



huyết nặng

F9-TT: nhỏ tròn



huyết nặng

F10-G: nhỏ tròn



huyết nặng

F10-T: nhỏ tròn



huyết nặng

F10-TT: nhỏ tròn


Tổng kết 17 chủng

Thu đợt IV (11/2012)

TT Dấu Hiệu

Bệnh Lý


Động


Strep

PCR

16S

KSD MIC GTT

1

Xuất huyết

thân, gan xuất

huyết

A1F1: tròn nhỏ,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) + + +

2 Gan xuất huyết A1F2: tròn nhỏ,




123

4

Xuất huyết

thân, gan xuất

huyết

A1F4: tròn nhỏ,


5 Cong thân, gan

xuất huyết

A1F6: tròn nhỏ,


6 Gan xuất huyết A1F7:tròn to,

vàng kem Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) + + +

7 Xuất huyết các

vây

A1F8: tròn nhỏ,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (+) (+) + + +







11 Xuất huyết da,

gan xuất huyết

A5F4: tròn nhỏ,


Tổng cộng 11 chủng

Năm 2012 28 chủng

Thu đợt V (11/12/2013)

TT Dấu Hiệu

Bệnh Lý


Động


Strep

PCR 16S KSD MIC GTT

Ao 1

A 1-1 Cá bị xuất

huyết ở vây

hậu môn. Gan

cá bị sưng và

xuất huyết

nặng

A1-1G: tròn, trắng

đục

A1-1T: tròn, trắng

đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)


huyết trên thân.

Gan bị sưng


đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)


huyết ở vây

ngực, vây hậu

môn, xung

quanh phần đầu

ngực. Gan bình

thường, tỳ tạng

sưng to


đục




huyết ở vây

lưng, vây bụng,

vây hậu môn.

Gan bị sưng và

xuất huyết


đục


đục

A1-9TT: tròn,

trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)


huyết tòan

thân, lở loét ở

vây bụng và

A1-10T: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

124

hàm dưới. Gan

bị xuất huyết

AO 2

A 2-1 Bụng cá sưng

to, xuất huyết ở

vây hậu môn.

Gan bị teo và

có màu trắng

bệch


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 2-2 Xuất huyết ở

vây ngược,

cuống đuôi,

vây hậu môn,

bụng cá trương

to. Trong

xoang bụng có

dịch, gan trắng

bệch, ruột cá

sưng to


đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)


vây ngược,

cuống đuôi,

vây hậu môn,

bụng cá trương

to. Trong

xoang bụng có

dịch, gan trắng

bệch, ruột cá

sưng to


đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)


vây bụng,

cuống đuôi,

vây hậu môn.

Gan trắng bệch

và thận sưng to


đục



A 2-5 Bụng trương to.

Có dịch nhầy

trong xoang

bụng và bóng

hơi. Gan trắng

bệch và tỳ tạng

sưng to.


đục



A 2-6 Bụng trương to.

Có dịch nhầy

trong xoang

bụng và bóng

hơi. Gan trắng


sưng to.


đục




huyết ở vây

bụng, vây hậu

môn, cá bị lở

loét. Gan có

màu trắng


đục



125

A 2-8 Bình thường A2-8G: tròn, trắng

đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)


huyết ở các

vây. Gan có

màu trắng


đục


đục

A2-9TT: tròn,

trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 2-10 Bình thường A2-10T: tròn,

trắng đục

A2-10TT: tròn,

trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

AO 3


huyết ở thân.

Gan cá bị xuất

huyết


đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 3-2 Bụng cá trương

to. Gan trắng.

Gan và tỳ tạng

sưng to


đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 3-3 Bụng cá trương

to. Gan trắng.

Gan và tỳ tạng

sưng to


đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 3-7 Bình thường.

Gan bị xuất

huyết.




huyết ở vây

bụng. Gan bị

xuất huyết




huyết ở vây

bụng. Gan bị

xuất huyết

A3-10G: tròn,

trắng đục

A3-10TT: tròn,

trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

AO 4

A 4-1 Cá bị cong thân

và xuất huyết

trên thân




huyết trên thân

và vây bụng.

Cá bị cong thân


đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 4-3 Cá bị trương

bụng. Trong

xoang bụng có

dịch




huyết toàn thân

. Có dịch trong

xoang bụng, tỳ

tạng và ruột


đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

126

sưng to


Gan bị xuất

huyết


đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)


Gan bị xuất

huyết


đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 4-7 Bình thường A4-7G: tròn, trắng

đục


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)



Có dịch trong

xoang bụng,

gan bị xuất

huyết


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

AO 5



Trong xoang

bụng có dịch,

gan sưng to và

xuất huyết


đục





Trong xoang

bụng có dịch,

gan sưng to và

xuất huyết


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)



Trong xoang

bụng có dịch,

gan sưng to và

xuất huyết


đục


đục

Ạ5-7TT: tròn,

trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)



Trong xoang

bụng có dịch,

gan sưng to và

xuất huyết


đục


đục

A5-8TT: tròn,

trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)


Thu đợt VI (/2/2014)

TT Dấu Hiệu

Bệnh Lý


Động


Strep

PCR

16S

KSD MIC GTT

B1-6 Bụng cá sưng

to. Bên trong

xoang bụng có

dịch, gan và tỳ

B1-6G: tròn, trắng

đục Gram (+), đơn cầu,

song cầu, liên cầu,

tụ cầu khuẩn

(-) (-) (+) (-) (-)

B1-6T: tròn, trắng

đục (-) (-) (+) (-) (-) + + + + +

127

tạng sưng to B1-6TT: tròn,

trắng đục (-) (-) (+) (-) (-) +

B 1-7 Gan cá bị xuất

huyết, gan và

tỳ tạng sưng to


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B1-7TT: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 1-10 Gan bị teo nhỏ

có màu trắng

bệch

B1-10G: tròn,

trắng đục Gram (+), đơn cầu,

song cầu, liên cầu,

tụ cầu khuẩn

(-) (-) (+) (-) (-)

B1-10T: tròn,

trắng đục (-) (-) (+) (-) (-) +

B1-10TT: tròn,

trắng đục (-) (-) (+) (-) (-)

B 2-1 Bụng cá sưng


vây hậu môn.

Bụng cá sưng


vây hậu môn


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B 2-3 Xuất huyết ở

vây ngược,

cuống đuôi,

vây hậu môn,

bụng cá trương

to. Trong

xoang bụng có

dịch, gan trắng

bệch


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) +

B2-3TT: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) + + + + +

B 2-4 Xuất huyết ở

vây bụng,

cuống đuôi,

vây hậu môn.

Gan bị xuất

huyết


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B2-4TT: tròn,


B2-5 Bụng trương to,

mang trắng. Có

dịch nhầy trong

xoang bụng và

bóng hơi. Gan

trắng bệch và

tỳ tạng sưng to,

thận có màu

trắng


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) + + + + +


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B2-5TT: tròn,


B2-6 Có dịch nhầy

trong xoang

bụng và bóng

hơi. Gan trắng


sưng to, thận có

màu trắng


đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) +


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

B2-6TT: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

B 2-7 Cá bị xuất

huyết ở vây

bụng, vây hậu

môn, cá bị lở


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

128

loét. Gan có

màu trắng

B2-7TT: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B 2-8 Xuất huyết trên

thân


đục Gram (+), hình cầu (-) (+) (+) (-) (-)


đục Gram (+), hình cầu (-) (+) (+) (-) (-)

B2-8TT: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (+) (+) (-) (-)


huyết ở các

vây. Gan có

màu trắng


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B2-9TT: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-)

B 2-10 Bình thường B2-10G: tròn,


B2-10T: tròn,


B2-10TT: tròn,



huyết ở thân, lở

loét. Gan cá bị

xuất huyết

B3-1TT: tròn,


B 3-2 Bụng cá trương

to. Gan trắng.

Gan và tỳ tạng

sưng to


đục Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-) +


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (+) (+)

B3-2TT: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (+) (+)

B 3-3 Bụng cá trương

to. Gan trắng.

Gan và tỳ tạng

sưng to


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (+) (+)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (+) (+) +

B3-3TT: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (+) (+)


huyết ở vây

bụng. Có dịch

trong xoang

bụng


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (+) (+)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (+) (+)

B3-4TT: tròn,


B 4-1 Bình thường B4-1TT: tròn,


B 4-2 Bình thường B4-2T: tròn, trắng

đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B4-2TT: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B4-5TT: tròn,


B 4-6 Bình thường B4-6G: tròn, trắng

đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

129

B4-6TT: tròn,



đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B4-7TT: tròn,




B4-10T: tròn,


B4-10TT: tròn,



đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)




đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B5-3TT: tròn,



trắng đục




đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B5-6TT: tròn,



đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B5-7TT: tròn,



đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B5-8TT: tròn,



đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B5-9TT: tròn,





đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B6-3TT: tròn,



đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

B6-4TT: tròn,


130


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B6-5TT: tròn,


B 6-6 Bình thường B6-6TT Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)


đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

B6-9TT: tròn,

trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) + +



B6-10T: tròn,


B6-10TT: tròn,



G: gan; T: Thận; TT: tỳ tạng; KSD: kháng sinh đồ; GTT: giải trình tự

131

Phụ lục C.3. Kết quả định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep

TT CHỈ TIÊU NHÓM

1 2 3 4

1 Nhuộm Gram + + + +

2 Hình dạng Cầu Cầu Cầu Cầu

3 Di động - - - -

4 Sinh oxidaza - - - -

5 Sinh catalaza - - - -

6 Test O-F -/+ -/+ -/+ -/+

Test API strep

7 Voges-Proskauer - - - -

8 Hippurate hydrolysis - - - -

9 Bile-esculin tolerance - - - -

10 Pyrrolidonyl arylamidase - - - -

11 Sinh α-galactosidase - - - -

12 Sinh β-glucuronidase + + + -

13 Sinh β-galactosidase - - - -

14 Alkaline phosphatase + + + +

15 Leucine AminoPeptidase + + + +

16 Arginine Dihydrolase - - - +

17 Sử dụng đƣờng

Ribose + + + +

Arabinose - - - -

Manitol - - - -

Sorbitol + - - -

Lactose + - - +

Trehalose + + + +

Inulin - - - -

Raffinose - - - -

Amygdalin + + - +

Glycogen - - - -

Nhóm 1: Gồm 21 chủng: A1F1-T; A2F1-G; A2F2-T; B3K1F2-T; B1K2F1-G;

A1F1-T; A2F3-T; A1F3; A1F4; A1F6; A1F8; A1F9; A5F4; B1-6T; B1-6TT; B2-

3TT; B2-5G; B2-6G; B2-7TT; B4-6T; B6-9TT.

Nhóm 2: Gồm 6 chủng: A2F7-T; B3F2-T; F7-T; A1F1; A1F2; B3-2G.

Nhóm 3: Gồm 3 chủng: A1F10; A2F3; B3-3T.

Nhóm 4: Gồm 2 chủng: A1F7; B2-3T

132

Phụ lục C.4 Kết quả giải mã gen và định danh vi khuẩn

1. Vi khuẩn B1-6T

Kết quả giải trình tự gen 16S

TAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCG

TAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACA

ATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGT

TGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGA

GGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG

GAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTC

GAATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGA

CGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTC

CCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGT

TAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGGGG

AGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGA

AAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATT

AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGCCCTTTCCGGGGCT

TAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACT

CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC

GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCTAGAGATAGGCTTTCCCTTCGGG

GCAGGAGTGACAGGTGGTGCATGG

Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae strain TSOD1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

Sequence ID: gb|KM077497.1|Length: 1426Number of Matches: 1 Range 1: 12 to 1015GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Alignment statistics fo r match #1

Score Expect Identities Gaps Strand

1849 bits(1001) 0.0 1003/1004(99%) 0/1004(0%) Plus/Plus Query 1 TAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGC 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12 TAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGC 71

Query 61 GTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGA 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 72 GTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGA 131

Query 121 CAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGACCT 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 132 CAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGACCT 191

Query 181 GCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACC 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 192 GCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACC 251

Query 241 TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 252 TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC 311

Query 301 AGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 312 AGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAA 371

Query 361 GGTTTTCGAATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCA 420

|||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 372 GGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCA 431

Query 421 CCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 432 CCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT 491

Query 481 ACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTT 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 492 ACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTT 551

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=R7X5Z52Z015

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=R7X5Z52Z015&from=12&to=1015

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=R7X5Z52Z015&from=12&to=1015

133

Query 541 AAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTTGA 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 552 AAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTTGA 611

Query 601 GTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGA 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 612 GTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGA 671

Query 661 ACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGG 720

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 672 ACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGG 731

Query 721 GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTA 780

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 732 GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTA 791

Query 781 GGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG 840

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 792 GGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG 851

Query 841 ACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG 900

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 852 ACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG 911

Query 901 TTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCTAG 960

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 912 TTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCTAG 971

Query 961 AGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGGTGGTGCATGG 1004

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 972 AGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGGTGGTGCATGG 1015

2. Vi khuẩn B2-5G


AGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACG

CGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGAC

AATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGACCTGCG

TTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGA

GGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG

GAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTC

GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGA

CGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTC

CCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGT

TAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGGGG

AGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGA

AAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATT

AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGCCCTTTCCGGGGCT

TAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACT

CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC

GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCTAGAGATAGGCTTTCCCTTCGGG

GCAGGAGTGACAGGTGGTGCATG





1857 bits(1005) 0.0 1005/1005(100%) 0/1005(0%) Plus/Plus Query 1 AGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAAC 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 10 AGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAAC 69

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=R7Y1UH0U014

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=R7Y1UH0U014&from=10&to=1014

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=R7Y1UH0U014&from=10&to=1014

134

Query 61 GCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCAT 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 70 GCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCAT 129

Query 121 GACAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGAC 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 130 GACAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGAC 189

Query 181 CTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGA 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 190 CTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGA 249

Query 241 CCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 250 CCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA 309

Query 301 GCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAG 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 310 GCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAG 369

Query 361 AAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATC 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 370 AAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATC 429

Query 421 CACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 430 CACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA 489

Query 481 ATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCT 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 490 ATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCT 549

Query 541 TTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTT 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 550 TTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTT 609

Query 601 GAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAG 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 610 GAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAG 669

Query 661 GAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTG 720

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 670 GAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTG 729

Query 721 GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGT 780

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 730 GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGT 789

Query 781 TAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA 840

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 790 TAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA 849

Query 841 CGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT 900

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 850 CGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT 909

Query 901 GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCT 960

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 910 GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCT 969

Query 961 AGAGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGGTGGTGCATG 1005

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 970 AGAGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGGTGGTGCATG 1014

135

3. Vi khuẩn B2-3TT


AGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAG

GCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGT

AGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAAAGATTAGCTTGCCGTCACC

GGCTTGCGACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATG

ATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAA

CTTAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAC

GACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCCTGCCCCGAAGGGAAAGCCTATCT

CTAGACCGGTCAGGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACC

ACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTAC

TCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTAAGCCCCGGAAAGGGCCTAACACC

TAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT

CGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATAT

CTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTCTCCAGTT

TCCAAAGCGTACAATGGTTGAGCCACTGCCTTTAACTTCAGACTTAAAGAACCGCCTGCGCT

CGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCA

CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTTAGTTACCGTCACA

Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae strain TSOD1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|KM077497.1|Length: 1426Number of Matches: 1 Range 1: 435 to 1406GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match



1790 bits(969) 0.0 971/972(99%) 0/972(0%) Plus/Minus Query 1 AGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACA 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1406 AGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACA 1347

Query 61 AGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTC 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1346 AGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTC 1287

Query 121 ATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAAAGATTAGCTTGCC 180

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||

Sbjct 1286 ATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAGAGATTAGCTTGCC 1227

Query 181 GTCACCGGCTTGCGACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAA 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1226 GTCACCGGCTTGCGACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAA 1167

Query 241 GGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCT 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1166 GGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCT 1107

Query 301 AGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1106 AGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAA 1047

Query 361 CCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCCTGCCCCGA 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1046 CCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCCTGCCCCGA 987

Query 421 AGGGAAAGCCTATCTCTAGACCGGTCAGGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCG 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 986 AGGGAAAGCCTATCTCTAGACCGGTCAGGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCG 927

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=K5ZAA5D501R

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=K5ZAA5D501R&from=435&to=1406

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=K5ZAA5D501R&from=435&to=1406

136

Query 481 TTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAG 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 926 TTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAG 867

Query 541 TTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTAA 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 866 TTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTAA 807

Query 601 GCCCCGGAAAGGGCCTAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATC 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 806 GCCCCGGAAAGGGCCTAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATC 747

Query 661 TAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGC 720

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 746 TAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGC 687

Query 721 TTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCAC 780

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 686 TTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCAC 627

Query 781 TCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTCTCCAGTTTCCAAAGCGTACAATGGTTGAGCCACTGCC 840

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 626 TCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTCTCCAGTTTCCAAAGCGTACAATGGTTGAGCCACTGCC 567

Query 841 TTTAACTTCAGACTTAAAGAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAAC 900

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 566 TTTAACTTCAGACTTAAAGAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAAC 507

Query 901 GCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTTA 960

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 506 GCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTTA 447

Query 961 GTTACCGTCACA 972

||||||||||||

Sbjct 446 GTTACCGTCACA 435

4. Vi khuẩn B6-9TT


AAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTA

ACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCG

CATGACAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATG

GACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGC

CGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGA

GGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAG

TGAAGAAGGTTTTCGAATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGG

AAAATCCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGC

CGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAG

GCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTG

GAGAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA

TATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTC

GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAG

TGCTAGGTGTTAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC

CTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG

GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC

CTGACCGGTCTAGAGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGG

137





1836 bits(994) 0.0 996/997(99%) 0/997(0%) Plus/Plus Query 1 AAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAA 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 9 AAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAA 68

Query 61 CGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCA 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 69 CGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCA 128

Query 121 TGACAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGA 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 129 TGACAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGA 188

Query 181 CCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCG 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 189 CCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCG 248

Query 241 ACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 249 ACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC 308

Query 301 AGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 309 AGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAA 368

Query 361 GAAGGTTTTCGAATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAAT 420

||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 369 GAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAAT 428

Query 421 CCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 429 CCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT 488

Query 481 AATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTC 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 489 AATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTC 548

Query 541 TTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACT 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 549 TTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACT 608

Query 601 TGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGA 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 609 TGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGA 668

Query 661 GGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGT 720

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 669 GGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGT 728

Query 721 GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTG 780

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 729 GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTG 788

Query 781 TTAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT 840

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 789 TTAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT 848

Query 841 ACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG 900

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 849 ACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG 908

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=R81AYS4H014

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=R81AYS4H014&from=9&to=1005

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/691194345?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=R81AYS4H014&from=9&to=1005

138

Query 901 TGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTC 960

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 909 TGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTC 968

Query 961 TAGAGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGG 997

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 969 TAGAGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGG 1005

5. Vi khuẩn A1F1


TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATCAAGTA

GAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGTGTGAGTAAC

GCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACC

GCATAAAAGTGTTTAACCCATGTTAAACATTTAACAGGTGCAACTGCATCACTATG

AGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACG

ATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA

GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACC

GAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTCTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAG

AAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAAATAACCAGAAAGG

GACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGGGGTAATACGTAGGTCCCGAGCTTTGTCCG

GATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCA

GTGGCT CAAC

Streptococcus dysgalactiae 16S ribosomal RNA, partial sequence Sequence ID: gb|AF433167.1|AF433167Length: 1466Number of Matches: 1 Score Expect Identities Gaps Strand

1099 bits(595) 0.0 607/613(99%) 0/613(0%) Plus/Plus Query 12 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 71

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 60

Query 72 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGTGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 131

|||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 61 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 120

Query 132 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCATG 191

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 121 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCATG 180

Query 192 TTAAACATTTAACAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 251

|||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 181 TTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 240

Query 252 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 311

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 241 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 300

Query 312 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 371

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 301 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 360

Query 372 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTCTCGGATCGTAA 431

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||

Sbjct 361 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 420

Query 432 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAAAT 491

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |

Sbjct 421 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 480

Query 492 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGGGGTAATACGTAGGTCCCGAGCT 551

||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||

Sbjct 481 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCG 540

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/17016959?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=13&RID=R58GANXD014

139

Query 552 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAG 611

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 541 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAG 600

Query 612 GCAGTGGCTCAAC 624

|||||||||||||

Sbjct 601 GCAGTGGCTCAAC 613

6. Vi khuẩn A1F2

Kết quả giải trình tự gen 16S TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGT

AGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTTA

CGCGTAGGTAACCTACCTCATACCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATAC

CGCATAGAAGTGTTTAACCCATGTTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTAT

GAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC

GATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC

AGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGAC

CGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGA

GAAG AATGAAGGTG GGATTGGAAA ATCCACCATG TGACGGTAACTTACCAGAAA

GGGAGGGCTA ACTACGTGCC AGCAACCGCG GTTATACGTA GGTCCC



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 72 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTTACGCGTAGGTAACCTACCTC 131

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||


Query 132 ATACCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAGAAGTGTTTAACCCATG 191

||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||


Query 192 TTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 251

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 312 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 371

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 372 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 431

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 432 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGAAGGTGGGATTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 491

|||||||||||||||||||||||| ||||||| |||||||||||||||||||||||||||


Query 492 TACCAGAAAGGGAGGGCTAACTACGTGCCAGCAACCGCGGTTATACGTAGGTCCC 546

|||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||| |||||||||||||

Sbjct 481 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCC 535

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/17016959?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=13&RID=R5962VDE014

140

7. Vi khuẩn A1F4


TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGT

AGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTA

ACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATA

CCGCATAAAAGTGTTTAACCAATGTTTAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTAT

GAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC

GATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC

AGACTCCTACGGAAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGAC


GAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAG

GGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCGGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCC

GGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAGG



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 72 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 131

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 132 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCAATG 191

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||


Query 192 TTTAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 251

|| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 312 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGAAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 371

|||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 432 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 491

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 492 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCGGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCG 551

||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||


Query 552 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAG 611

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 541 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAG 600

Query 612 G 612

|

Sbjct 601 G 601

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/17016959?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=13&RID=R59PV9TU014

141

8. Vi khuẩn A1F6

Kết quả giải trình tự gen 16S CATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAAC

CCATGTTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGT

ATTAGCTAGTTAGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGA

GAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA

GCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGTGTGAGT

GAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGT

GGAAAATCCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACAGCTAACTACGTGCC

AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAG

CGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTAC

GCTCTGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGGAGAGAGTGGAATTCCATGTGTA

GCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAA GC


1085 bits(587) 0.0 597/602(99%) 0/602(0%) Plus/Plus Query 1 CATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCAT 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 120 CATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCAT 179

Query 61 GTTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTA 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 180 GTTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTA 239

Query 121 GTTAGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGG 180

||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 240 GTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGG 299

Query 181 CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCG 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 300 CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCG 359

Query 241 GCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGTGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTA 300

|||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 360 GCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTA 419

Query 301 AAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAAC 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 420 AAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAAC 479

Query 361 TAACCAGAAAGGGACAGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGC 420

||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 480 TAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGC 539

Query 421 GTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAA 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 540 GTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAA 599

Query 481 GGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTCTGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGGAGAGA 540

||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| ||||

Sbjct 600 GGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGA 659

Query 541 GTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAA 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 660 GTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAA 719

Query 601 GC 602

||

Sbjct 720 GC 721

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/17016959?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=43&RID=R567S158014

142

9. Vi khuẩn A1F9



AGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTA

ACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATA

CCGCATAAAAGTGTTTAACCCATGTTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTA

TGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGA

CGAAACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCC

CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGATTCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGAC


GAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAG

GGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCC

GGA TTTATTGGGC GTAAA



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 72 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 131

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 192 TTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 251

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 252 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGAAACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 311

||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||


Query 312 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGATTCTTCGG 371

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 432 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 491

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 492 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCG 551

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 552 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAA 575

||||||||||||||||||||||||

Sbjct 541 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAA 564

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/17016959?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=13&RID=R56V7BSG015

143

10. Vi khuẩn A5F4



AGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGGACGGGTGAGTAC

CGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATAC

CGCATAAAAGTGTTTAACCCATGTTAAACATTTACAAGGTGCAACTGCATCACTAT

GAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAAGTAACGGCTCACCAAGGTGAC

GATACATAGCCGACCTGAGAGAGTGATCGGCCAAACTGGGACTGAAACACGGCCC

AGCCT CCTAC

Streptococcus dysgalactiae 16S ribosomal RNA, partial sequence Sequence ID: gb|AF433167.1|AF433167Length: 1466Number of Matches: 1


568 bits(307) 3e-158 325/334(97%) 0/334(0%) Plus/Plus Query 12 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 71

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 72 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGGACGGGTGAGTACCGCGTAGGTAACCTACCTC 131

|||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| |||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 192 TTAAACATTTACAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 251

||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Query 252 TTGGTGAAGTAACGGCTCACCAAGGTGACGATACATAGCCGACCTGAGAGAGTGATCGGC 311

||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| |||||||||


Query 312 CAAACTGGGACTGAAACACGGCCCAGCCTCCTAC 345

|| ||||||||||| ||||||||||| |||||||

Sbjct 301 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC 334

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/17016959?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=15&RID=R57RWMZC014

144

Phụ lục C.5 Kết quả quan sát mẫu mô cá bống kèo

Ao Cá Mang Gan Thận

ĐỢT 1

1 A1F1 Sợi mang thứ cấp dính

lại, biến đổi cấu trúc

phiến mang, tăng sinh

tế bào biểu mô, có hiện

tượng nhiễm khuẩn,

động mạch vào sợi

mang thứ cấp bị sung

huyết

Sung huyết

tĩnh mạch gan,

biến đổi cấu

trúc mô

Sung huyết và xuất

huyết vùng mô, quản

cầu thận biến đổi cấu

trúc, phình to hoặc teo

nhỏ và nhiễm khuẩn

A1F2

A1F3

A1F4

A1F5


lại, sợi mang thứ cấp

phình to hoặc thoái hóa

và ngắn lại

Sung huyết

tĩnh mạch gan,

biến đổi cấu

trúc mô






A2F2

A2F3

A2F4

A2F5

A2F6

A2F7

A2F8

A2F9

A2F10




và ngắn lại

Biến đổi cấu

trúc mô






A3F2

A3F3

A3F4

A3F5

A3F6

A3F7

A3F8

A3F9

A3F10




và ngắn lại

Biến đổi cấu

trúc mô


huyết vùng mô. A4F2

A4F3

A4F4

A4F5

A4F6

A4F8 Sợi mang thứ cấp dính

lại

Biến đổi cấu

trúc mô



A4F10

ĐỢT 2


lại

Biến đổi cấu

trúc mô



A6F3

A6F4

A6F6 Sợi mang thứ cấp dính

lại

Biến đổi cấu

trúc mô



A6F8

145

A6F9

A6F10








huyết

Sung huyết

tĩnh mạch gan,

biến đổi cấu

trúc mô






A7F2

A7F3

A7F4

A7F5

A7F6

A7F7

A7F8

A7F9

A7F10


lại

Biến đổi cấu

trúc mô


huyết vùng mô.


lại

Biến đổi cấu

trúc mô


huyết vùng mô.

ĐỢT 3

1 A10-1 Sợi mang thứ cấp dính

lại

Biến đổi cấu

trúc mô


huyết vùng mô. A10-2

A10-3

A10-6 Sợi mang thứ cấp dính

lại

Biến đổi cấu

trúc mô




lại

Biến đổi cấu

trúc mô


huyết vùng mô.

2 A11-1 Sợi mang thứ cấp dính

lại

Biến đổi cấu

trúc mô


huyết vùng mô.

A11-3

Sợi mang thứ cấp dính

lại

Biến đổi cấu

trúc mô


huyết vùng mô.

A11-4

A11-5

A11-6

A11-7

A11-8

A11-9

A11-10

3 A12-1

Sợi mang thứ cấp dính

lại

Biến đổi cấu

trúc mô


huyết vùng mô.

A12-2

A12-3

A12-4


lại

Biến đổi cấu

trúc mô



A12-8

A12-9

A12-10

ĐỢT 4

1 B1-1 Sợi mang thứ cấp dính




Sung huyết

tĩnh mạch gan,

biến đổi cấu

trúc mô





B1-2

B1-3

B1-4

146

B1-5 tượng nhiễm khuẩn,



huyết


B1-6

B1-7

B1-8

B1-9

B1-10


lại

Biến đổi cấu

trúc mô


huyết vùng mô.

B2-3 Sợi mang thứ cấp dính



và

ngắn lại

Biến đổi cấu

trúc mô


huyết vùng mô. B2-4

B2-5

B2-6

B2-7

B2-8

B2-9

B2-10



phình to

Biến đổi cấu

trúc mô



B3-3

B3-4



phình to

Biến đổi cấu

trúc mô



B4-3

B4-4

B4-5

B4-6

B4-7








huyết

Sung huyết

tĩnh mạch gan,

biến đổi cấu

trúc mô






B5-2

B5-3

B5-4

B5-5

B5-6

B5-7

B5-8

B5-9

B5-10



phình to

Biến đổi cấu

trúc mô



B6-5

B6-6

B6-9 Sợi mang thứ cấp dính


phình to

Biến đổi cấu

trúc mô



Ký hiệu: A: ao cá bệnh, F: cá; T: Thận, G: gan; TT: tỳ tạng ; K: ao cá khỏe

147

Phụ lục C.6 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm

Ngày

Đối chứng B1-6T B2-3TT B2-5G B6-9TT

L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

1 1 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 1 1 2 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

3 1 1 2 3 2 2 1 1 2 3 4 2 1 1 1

4 1 1 2 5 4 4 4 3 4 5 6 6 5 3 2

5 1 1 2 6 5 5 6 5 7 7 8 7 6 4 6

6 1 1 2 7 7 7 7 6 8 9 9 8 7 8 7

7 1 1 2 7 8 8 7 7 8 9 9 8 7 8 7

Tổng cá chết 4 23 22 26 22

Tỷ lệ (%) 13,3 76,7 73,3 86,7 73,3

148

Phụ lục C.7 Kết quả thí nghiệm LD50

Số liệu cá thí nghiệm LD50 với chủng vi khuẩn B1-6T

Ngày

Ngiệm thức 1 Ngiệm thức 2 Ngiệm thức 3 Ngiệm thức 4 Ngiệm thức 5 Ngiệm thức 6 Ngiệm thức 7 Đối chứng

L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3

20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 4 4 2 0 0 0 1 3 1 1 1

3 1 2 1 2 1 2 2 4 2 2 3 2 6 6 5 5 3 1 3 3 6 1 2 2

4 3 4 3 5 1 3 5 6 4 7 5 5 11 9 10 10 5 4 6 10 11 2 2 3

5 5 5 4 7 2 4 8 8 5 13 10 7 15 12 13 14 9 7 12 15 16 2 2 3

6 6 6 5 11 5 8 11 9 7 14 13 10 16 13 15 17 11 13 14 19 18 2 2 3

7 7 8 6 13 8 8 12 9 8 16 15 11 16 15 16 18 12 14 16 19 18 2 2 3

8 7 9 7 13 8 8 13 9 8 16 16 12 16 15 16 18 14 15 17 19 18 2 2 3

9 7 9 7 13 8 8 13 9 8 16 16 12 16 15 16 18 15 16 17 19 18 2 2 3

10 7 9 7 13 8 8 13 9 8 16 16 12 16 15 16 18 15 16 17 19 18 2 2 3

11 7 9 7 13 8 8 13 9 8 16 16 12 16 15 16 18 15 16 17 19 18 2 2 3

12 7 9 7 13 8 8 13 9 8 16 16 12 16 15 16 18 15 16 17 19 18 2 2 3

13 7 9 7 13 8 8 13 9 8 16 16 12 16 15 16 18 15 16 17 19 18 2 2 3

14 7 9 7 13 8 8 13 9 8 16 16 12 16 15 16 18 15 16 17 19 18 2 2 3

Tổng cá chết 23 29 30 44 47 49 54 7

Tỷ lệ (%) 38,3 48,3 50 73,3 78,3 81,7 90 11,67

Nghiệm thức 1: 4,25 x 102 CFU/ml; Nghiệm thức 2: 4,25 x 10

3 CFU/ml; Nghiệm thức 3: 4,25 x

104 CFU/ml; Nghiệm thức 4: 4,25 x 10


6 CFU/ml; Nghiệm

thức 6: 4,25 x 107 CFU/ml; Nghiệm thức 7: 4,25 x 10

8 CFU/ml; Nghiệm thức đối chứng: cá

tiêm nước muối sinh lý.

Số liệu cá thí nghiệm LD50 với chủng vi khuẩn B2-5G

Ngày

Ngiệm thức 1 Ngiệm thức 2 Ngiệm thức 3

Ngiệm thức

4 Ngiệm thức 5 Ngiệm thức 6 Ngiệm thức 7 Đối chứng

L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3

20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 1 1 0 1 2 3 1 0 1 0 0 2 0 2 0 1 0 1 1 1 1

3 2 2 1 2 2 1 2 2 8 2 2 2 5 4 4 1 4 2 3 4 2 1 2 2

4 3 3 3 2 5 2 4 3 10 6 3 2 8 6 8 4 8 4 7 10 6 2 2 3

5 4 4 6 3 7 3 7 6 11 10 7 4 8 8 12 7 13 8 9 14 9 2 2 3

6 6 7 8 5 9 6 9 8 12 12 8 7 9 9 14 9 16 11 15 16 12 2 2 3

7 11 9 8 7 12 10 11 12 13 14 10 10 9 13 15 13 18 15 16 19 16 2 2 3

8 12 9 8 10 13 12 11 14 13 16 11 12 10 13 15 14 19 16 17 20 16 2 2 3

9 12 9 8 10 13 12 11 14 13 16 13 13 11 13 15 14 19 16 17 20 16 2 2 3

10 12 9 8 10 13 12 11 14 13 16 13 13 14 13 15 14 19 16 17 20 16 2 2 3

11 12 9 8 10 13 12 11 14 13 16 13 13 15 13 15 14 19 16 17 20 16 2 2 3

149

12 12 9 8 10 13 12 11 14 13 16 13 13 16 13 15 14 19 16 17 20 16 2 2 3

13 12 9 8 10 13 12 11 14 13 16 13 14 17 13 15 14 19 16 17 20 16 2 2 3

14 12 9 8 10 13 12 11 14 13 16 13 14 17 13 15 14 19 16 17 20 16 2 2 3

Tổng

cá chết 29 35 38 43 45 49 53 7

Tỷ lệ chết

(%) 48,33 58,33 63,33 71,67 75 81,67 88,33 11,67

Nghiệm thức 1: 3,5 x 102 CFU/ml; Nghiệm thức 2: 3,5 x 10

3 CFU/ml; Nghiệm thức

3: 3,5 x 104 CFU/ml; Nghiệm thức 4: 3,5 x 10


6

CFU/ml; Nghiệm thức 6: 3,5 x 107 CFU/ml; Nghiệm thức 7: 3,5 x 10

8 CFU/ml;

Nghiệm thức đối chứng: cá tiêm nước muối sinh lý.

Phụ lục C.8. Kết quả thí nghiệm điều trị

Ngày

thí nghiệm

NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0

4 2 2 3 4 3 2 4 3 2 2 3 2 5 4 4 0 1 0 1 0 0

5 3 4 2 2 3 3 2 3 2 3 3 3 4 5 4 1 0 0 0 1 0

6 1 2 1 1 2 1 1 2 2 2 1 2 4 3 4 0 0 1 0 0 0

7 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 2 1 2 3 2 0 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 2 2 0 0 0 0 0 0

9 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0

10 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 2 0 0 0 0 0 0

11 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0

12 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

13 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tổng cộng

cá chết 10 11 10 9 9 8 9 10 10 9 10 8 21 23 23 1 1 1 1 1 0

Số cá còn

lại 20 19 20 21 21 22 21 20 20 21 20 22 9 7 7 29 29 29 29 29 30

Tỉ lệ cá

chết

% 33,33 36,67 33,33 30 30 26,67 30 33,33 33,33 30 33,33 26,67 70 76,67 76,67 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 0

150

Tỉ lệ

cá sống

(%) 66,67 63,33 66,67 70 70 73,33 70 66,67 66,67 70 66,67 73,33 30 23,33 23,33 96,67 96,67 96,67 96,67 96,67 100

NT1: cá được gây cảm nhiễm và cho ăn thức ăn trộn kháng sinh DO nguyên liệu từ ngày thứ 3 và cho ăn liên tục trong 05 ngày

NT2: cá được gây cảm nhiễm và cho ăn thức ăn trộn kháng sinh DO thành phẩm từ ngày thứ 3 và cho ăn liên tục trong 05 ngày

NT3: cá được gây cảm nhiễm và cho ăn thức ăn trộn kháng sinh FFC nguyên liệu từ ngày thứ 3 và cho ăn liên tục trong 05 ngày

NT4: cá được gây cảm nhiễm và cho ăn thức ăn trộn kháng sinh FFC thành phẩm từ ngày thứ 3 và cho ăn liên tục trong 05 ngày

NT5: cá được gây cảm nhiễm và cho ăn thức ăn không trộn thuốc

NT6: cá được tiêm nước muối sinh lý và cho ăn thức ăn không trộn thuốc

NT7: cá không được gây cảm nhiễm, không tiêm nước muối sinh lý và cho ăn thức ăn không trộn kháng sinh

Chương I: GIỚI THIỆU · Xin cảm ơn các cô và các em ở Bộ môn Bệnh học thủy...

Documents

Transcript of Chương I: GIỚI THIỆU · Xin cảm ơn các cô và các em ở Bộ môn Bệnh học thủy...