Chaperone-Assisted Crystallography(CAC)

Serdar Uysal

University of Chicago, Department of Biochemistry and Molecular Biology

ISFI

Outline

• CAC concept and philosophy• Chaperone scaffolds and phage display

libraries• HTP phage display library sorting• CAC for high-hanging fruits

Chaperone-Assisted Crystallography (CAC)

Several different chaperones

Phasing Chaperone

Molecular Scaffolds

Fab (Herceptin) VH FN3

size (a.a.) ~220x2 ~130 ~95

libraries synthetic synthetic synthetic

affinity +++ ++ ++

expression 1~10 mg/liter ≥ 20mg/L ~100 mg/L

disulfide bonds 4 or 5 1 0

shelf life + +++ +++

crystallizationfriendly

++ + +

Phasing options MR MR + MAD MR + MAD

(U of C + Gtech)

(U of C)VH (Gtech)

Chaperone Library

Sorting

Chaperone Production

Crystallization & Structure Determinationof Target-Chaperone Complex

Targets

The Pipeline

Soluble proteins, RNAs, membrane proteins

Single Herceptin Fab Scaffold(i.e. no natural scaffold diversity allowed)

1L7I

1S781TZH

1TZI

1ZA3 2H9G

91 92 93 94 95 96

YS YS YS YS PL FILV

29 30 31 32 33 34

FILV YS YS YS YS IM

50 51 52 52a

53 54 55 56 57 58

YS I YS PS YS YS GS YS T YS

94 95 96 97 98 99 100

100a

100b

100c

101

R X X X X X X X AG FILM D

CDR-L3

CDR-H3

CDR-H2

CDR-H1

Synthetic Fab Libraries

X=Y,S,G (50%) and equal mixture of remaining amino acids

Why Y,S?

Library Sorting Pipeline 12 Targets in Parallel

1 week

1 weeks

1 week

1 week

Total: 4 weeks

Target validation and prep

automated sorting using a robot (3 rounds);

Confirm success of sorting

Transfer a mixture of clones to expression vector

HTP protein production and BIAcore assay

• 1H NMR analysis ("simple targets)• Phage binding• Biotinylation

• Expression level• Affinity

6 chaperones for each target

kon koff Kd

Fab(x104 s-1M-1) (x10-3s-1) (nM)

91 92 93 94 94a

94b

95 96 29 30 31 32 33 34 50 51 52 52a

53 54 55 56 57 58 94 95 96 97 98 99 100

100a

100b

100c

100d

100e

100f

100g

100h

100i

100j

100k

100l

100m

101

D10 18.2 <0.1 <1 Y Y S S - - L I I Y S S Y M Y I S S Y S G Y T S R E Y T Y G I G L - - - - - - - - - - - DD11 9.0 <0.1 <1 Y Y S S - - L F V Y Y S Y I S I S P Y S G Y T S R E S H Y G Y G L - - - - - - - - - - - DD12 20.0 0.5 2.3 S S Y Y S S L F V Y S S S M S I Y S S S G S T Y R L Y I E W N S Y S V D Y A M - - - - - DD13 10.6 0.7 6.6 S S Y Y S S L F V Y S S S M S I Y S S S G S T Y R L Y I E W N S Y S D Y A M - - - - - - DD14 10.8 7.7 70.7 S S S Y S S R I L Y Y S Y I S I Y P F Y G S T Y R G D Y Y S Y G L - - - - - - - - - - - D

D15 29.3 <0.1 <1 X X X X X X X X V Y S S S I S I Y S Y S G S T S R S S W Y S Y S F Y R G W V G L - - - - DD16 20.4 <0.1 <1 Y S S Y - - L I I S S Y S I S I S P S Y G S T Y R Y G L Y I Y S Y Q F Y F Y M Y G L - - DD17 20.1 0.8 4.2 S S S Y - - P F F S Y S S I S I Y S Y Y G S T S RX X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X- - - - - - - - - - - DD18 17.0 1.5 8.8 Y Y Y S S - L L I Y Y S S I S I Y P Y Y S Y T S R Y G Y S Y E Y G M - - - - - - - - - - D

D19 49.1 0.6 1.1 Y Y S S Y S L V F S S S Y I Y I S S Y S G S T S R Q W W G Y H G I - - - - - - - - - - - DD20 28.1 1.4 4.9 S Y S Y - - P F F Y Y S S I S I Y S Y Y G S T Y R P R G Y G G F A S G V N S S Y A L - - DD21 9.3 0.5 5.3 S S S Y S - L F L S S S Y I S I Y S S Y S S T Y R Y H S Q Y V R Y Y F W F S G A L - - - DD22 17.1 1.1 6.3 S Y Y S S - P I V Y S S Y M S I Y S S S S Y T S R W W L G G Y G I - - - - - - - - - - - DD23 6.1 0.4 7.0 Y S Y S Y S L L L S Y S Y I S I S S S Y S Y T S R S F Y R H P Y Y Y Y S Y E G F - - - - DD24 13.3 1.2 8.7 Y Y S Y - - P V V S S Y S I S I Y S Y S G S T Y R Y G G G Y Y Y E H N H Y Y Y G G Y A M DD25 26.0 2.7 10.5 S Y S Y - - P F I Y S Y S M S I Y S Y S G S T Y R Y Y E W N N G L - - - - - - - - - - - DD26 33.9 5.0 14.7 S Y S Y - - P F V Y S S S I S I Y S Y Y G S T Y R Y Y T Y W P Y I F R A I - - - - - - - D

D27 35.4 0.7 1.9 S Y Y Y - - P I V Y S Y Y M S I S S Y S S Y T S R E F S Y L W G Y G I - - - - - - - - - DD28 43.4 0.8 1.9 Y Y S S - - L F F S Y Y Y I S I S S Y Y G S T S R E Y Y G W G Y S A M - - - - - - - - - DD29 39.0 1.9 4.8 S Y Y S - - L L F S S S Y I Y I S P Y S G S T Y R E R Y D S W Y M A G I - - - - - - - - DD30 36.8 2.2 5.9 Y Y S S - - L F F Y Y S Y I S I Y P Y Y G S T Y R E N S H W G M S A M - - - - - - - - - DD31 25.0 1.5 6.0 S Y S S - - L L F S S Y Y I S I Y P S S G Y T Y R E R Y F I Y F Y N F W A M - - - - - - DD32 60.6 4.8 7.9 Y Y S S - - L F F S S Y Y I S I S S S S S Y T Y R E Y M N Y M L Q E A F - - - - - - - - DD33 20.0 2.2 11.2 S Y S S - - L F V Y Y S Y I S I Y S S S G S T S R E S H I Y M Y S V F W S G M - - - - - DD34 12.6 5.5 44.0 Y S S Y Y S L I I S S S Y I S I S P Y S S S T S R K R Y Y K M M S A L - - - - - - - - - D

D35 86.1 2.1 2.5 S S Y Y S S L L F S Y S S I S I Y S S S S S T S R S S S S P Y Y F Y S Y Y K M M - - - - DD36 61.2 1.8 3.0 S Y S Y S - P L I S Y S S I S I Y S S Y G S T Y R S Q S W Y Y K I Y Y S M A M - - - - - DD37 102.8 3.3 3.2 S Y S Y S - L V V S Y Y S M S I Y P S S S S T S R F S L W K I D G W Y P S Y Y K A L - - DD38 55.7 2.4 4.2 S S S S - - P F L Y Y S S I S I S P S S S Y T Y R R S G Y S V Y P S P G Y Y Y G M - - - DD39 63.1 3.0 4.8 S Y Y S Y - P I L Y S Y S M S I S S S Y G Y T S R Y G Y S G W Y P S Y Y G L - - - - - - DD40 33.0 3.0 9.0 S Y S Y Y S P V X X X X X X Y I S S Y Y S Y T S R S S S F W S W P H Y D Y D P A F - - - DD41 79.4 7.6 9.6 S S Y Y Y S P V F Y S S S I S I S P Y Y G S T S R Y G F G G V - - - - - - - - - - - - - DD42 16.9 7.0 41.4 Y S Y Y S - L F V Y Y Y S M S I S S Y S G Y T Y R G G S F Y A Y E Y W V D G I - - - - - D

CDR-L3 CDR-H2 CDR-H3CDR-H1

A

B

C

D

E

Fab clones for MCSG targets

Targets provided by H. Li, F. Collart, and A. Joachimiak (MCSG)

Benchmarking the Fab CAC pipeline with 17 MCSG Targets

Fellouse et al. JMB, in press

Successful Examples of CAC for High Hanging Fruits

Buried surface area: 1316 Å2

Crystal structure of FAB2-C209 (1.95 Å)

Jingdong Ye, Valya Tereshko, Joe Piccirilli

KcsA with Fab fragment

Crystal lattice of the KcsA+ channel in complex with a proteolytic FAB fragment (PDB code 1k4c)

KcsA

?8 binders produced

-5 0 5 10 15 20 25 30 35-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

-5 0 5 10 15 20 25 30 35-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

-5 0 5 10 15 20 25 30 35-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2A

u

Volume (ml)

KcsA:FAB2 1:1

KcsA:FAB10 1:1

KcsA wt (VVR)

-5 0 5 10 15 20 25 30 35

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

-5 0 5 10 15 20 25 30 35

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

-5 0 5 10 15 20 25 30 35

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

KcsA wt (VVR)

Au

Volume (ml)

KcsA:FAB2 2.5:1 KcsA:FAB10 2.5:1

-5 0 5 10 15 20 25 30 35

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

-5 0 5 10 15 20 25 30 35

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

-5 0 5 10 15 20 25 30 35

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

KcsA wt (VVR) KcsA:FAB10 1:2.5

Au

Volume (ml)

KcsA:FAB2 1:2.5

-5 0 5 10 15 20 25 30 35

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

-5 0 5 10 15 20 25 30 35

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

-5 0 5 10 15 20 25 30 35

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Au

Volume (ml)

KcsA wt (Sudha)

KcsA:FAB2 1:6 KcsA:FAB10 1:6

Res=3.7A°

Rwork=34%

Rfree=28%

Reinterpretation of Closed Conformation

Packing and Challenges

C-terminal domain at 2.6A°

2X Binding Fab_10

4X Binding Fab_2

4-Helix Bundle C-terminal Domain

Conclusions

• Synthetic libraries based on restricted AA diversity.• HTP pipeline for chaperone engineering.• High-affinity chaperones for membrane proteins,

functional RNAs and protein complexes.• Novel structures using the CAC strategy.

AcknowledgmentsThe Univ of ChicagoTony KossiakoffShohei Koide

Magda BukowskaVince CancasciKaori EsakiRyan GilbrethJames HornAkiko KoideBrenda LeungJames RaptisValya TereshkoJohn WojcikJingdong YeValeria Vazquez

Joe PiccirilliEduardo Perozo

Genentech, Inc.Dev Sidhu

Fred FellouseSara BirtalanPierre Barthelemy

UC Core FacilitiesFlow Cytometry FacilityDNA sequencing Facility

Advanced Photon Source/ANL

Funding: NIH (NIGMS, NIDDK), HHMI, UC Cancer Research Center

Tertiary complex