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Augusto Pessina,2013

CELLULE STAMINALI E CELLULE STAMINALI E

PROBLEMATICHE CORRELATEPROBLEMATICHE CORRELATE

Università Cattolica Sacro Cuore

28 Febbraio 2013

Augusto PessinaDipartimento Scienze Biomediche, Chirurgiche e Odontoiatriche

Università degli Studi di Milano


Induced Pluripotent Stem Cells(iPSc)NOBEL PRIZE 2012

Ci sono alternative agli embrioni?

Cosa sono le IPSc

Quali problemi pongono?

Una nota antropologica


ALTERNATIVES TO EMBRYO ALTERNATIVES TO EMBRYO

Do Do theythey existexist? Are ? Are theythey ethicalethical??•Amniotic fluid ( De Coppi)

•Placenta (Parolini ; Heustschleger, Vien,De Coppi )

•Pluripotent spermatogonial stem cells in testis of neonatal and adult mice(Shinohara 2004; Guan 2006 ( Multipotent ? Seandel 2007)

•2006 Robert Lanza : basta un blastomero per ottenere cellule pluripotenti (si ma… l’embrione muore??)

•Bovine oocyte extract , Artificial cytoplast ( EDI et al…)

PARTHENOGENESIS•Stimulation of monkey oocytes >>Blastocyst >>cyno-1 (?) >> neural cells and epithelial cells, cardiomyocytes(Vrana et al, Pnas 2003).•Activation of human oocytes to blastocystis (Brevini et al.,2005)•Healthy mice ( 2 /371 tries) from paired mature-immature oocytes donor immature oocyte with a knockout of imprinting control region on chr 7 ( Kawahara M et al, Nature 2007)


Gurdon, J.B. (1962). The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. Journal of Embryology and Experimental Morphology10:622-640.

Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126:663-676.

PREMI NOBEL PER LA FISIOLOGIA E LA MEDICINA 2012

44 anni = l’età di Yamanaka


CLONAZIONE DI J.B. GURDON ,1962

Xenopus laevis


CLONAZIONE DI WILMUT , 1997

( Dolly)

Augusto Pessina,2013Dolly viva


Dolly morta


C: plasmidtarnsfection

B: adenovirustransduction

D: transposone

based transfection

A: retro/ lentivirus transduction


Figure 1. Identification of a c.70del20 mutation in a patient with unilateral

microphthalmia. A: Photograph of Patient 1 with SOX2anophthalmia syndrome.

Note right microphthalmia (prosthesis in place) and prominent ears.

B: Sequence fragments showing the c.70del20 region in the patient (p), his mother (m)

and his father (f). The position of the deletion is indicated with a red arrow. Note

normal SOX2sequence in the patient’s parents consistent with their unaffected status.

Molecular Vision 2010; 16:768-773 <http://www.molvis.org/molvis/v16/a86>

Received 2 January 2010 | Accepted 21 April 2010 | Published 28 April 2010


A scheme of the generation of induced pluripotent stem (iPS) cells.

1. Isolate and culture donor cells.

2. Transfect stem cell-associated genes into the cells by viral vectors.

3. Harvest and culture the cells according to ES cell culture, usingfeeder cells(lightgray).

4. A small subset of the transfected cells become iPS cells and generate ES-like colonies


The most stringent method to evaluatethe pluripotency of iPSCs is to injectthe ES cells into host blastocysts toassay if viable chimeras are produced . By using an appropriate reporter system or cell

markers, cells from the iPSC lineage can be

traced throughout the whole body of chimeric

mice. However, chimera formation is not a

practical approach for human cells, nor even for

mouse cells, as this is time-consuming and not

applicable to most research laboratories

A less stringent method to assessthe pluripotency of iPSCs isteratoma formation assay. In this assay, iPSCs injected under the

skin of nude mice should develop

teratomas with the distinct structure of all

three germ layers (ectoderm, mesoderm,

and endoderm). The teratoma assay

requires a threshold level of cells to prove

successful, though the exact number has

not yet been identified.


.

The more frequently used method for assessing the pluripotency of iPSCs is to differentiate in vitro the putative iPSCs into various celltypes and assay for cell markersThese include gene expression markers, antigen markers, and epigenetic markers (DNA methylation and histone modification patterns). For human iPSCs, frequently used stem cell expression markers are AP1, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, and TRA-2-49/6E. For mouse iPSCs, AP1, Nanog, and SSEA-1 are often used. Human and mouse iPSCs have been differentiated in vitro into neural stem cells, neurons, cardiomyocytes, etc. Specific expression and antigen markers are available for each of these celltypes.


Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated by enforced expression of defined sets

of transcription factors in somatic cells. It remains controversial whether iPSCs are molecularly and

functionally equivalent to blastocyst-derived embryonic stem (ES) cells. By comparing genetically

identical mouse ES cells and iPSCs, we show here that their overall messenger RNA and microRNA

expression patterns are indistinguishable with the exception of a few transcripts encoded within the

imprinted Dlk1-Dio3 gene cluster on chromosome 12qF1, which were aberrantly silenced in most of

the iPSC clones. Consistent with a developmental role of the Dlk1-Dio3 gene cluster, these iPSC

clones contributed poorly to chimaeras and failed to support the development of entirely iPSC-derived

animals ('all-iPSC mice').

In contrast, iPSC clones with normal expression of the Dlk1-Dio3 cluster contributed to high-grade chimaeras and generated viable all-iPSC mice. Notably, treatment of an iPSC clone that had silenced Dlk1-Dio3 with a histone deacetylase inhibitor

reactivated the locus and rescued its ability to support full-term development of all-iPSC mice.

Thus, the expression state of a single imprinted gene cluster seems to distinguishmost murine iPSCs from ES cells and allows for the prospective identification of iPSC clones that have the full development potential of ES cells.

Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome

12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells. Stadtfeld

M, Apostolou E, Akutsu H, Fukuda A, Follett P, Natesan

S, Kono T, Shioda T, Hochedlinger K. Nature. 2010 May

13;465(7295):175-81. Epub 2010 Apr25


Genomic instability in iPS: time for a breakM.A Blasco et al, The EMBO Journal (2011) 30, 991 - 993

• Recent works have revealed that transcriptional and epigeneticreprogramming is often incomplete, which has raised some concerns on the nature of iPS.

• Inevitably, now the genome itself of iPS has been scrutinized; and the reports come with an unexpected twist: the presence of mutations in the genome of iPS.Stem cells: The dark side of induced pluripotency

Martin F. Pera, Nature,471:46–47,2011Induce pluripotent stem cells have great therapeutic potential. But genomic and

epigenomic analyses of these cells generated using current technology reveal

abnormalities that may affect their safe use.

Induced Pluripotency and Oncogenic Transformation Are Related ProcessesRiggs et al.Stem Cell Dev. 2012 Oct 26. [Epub ahead of print]

Taken together, these findings support a model in which OF and iPSCs are related, yet distinct cell types, and in which induced pluripotency and induced tumorigenesis are similar processes

I PROBLEMI BIOLOGICI DELLE IPSc

( MOLTO SIMILI A QUELLI DELLE CELLULE EMBRIONALI)


Genomic instability in iPS: time for a breakM.A Blasco et al, The EMBO Journal (2011) 30, 991 - 993

• Recent works have revealed that transcriptional and epigeneticreprogramming is often incomplete, which has raised some concerns on the nature of iPS.

• Inevitably, now the genome itself of iPS has been scrutinized; and the reports come with an unexpected twist: the presence of mutations in the genome of iPS.

Stem cells: The dark side of induced pluripotencyMartin F. Pera, Nature,471:46–47,2011

Induced pluripotent stem cells have great therapeutic potential. Butgenomic and epigenomic analyses of these cells generated using currenttechnology reveal abnormalities that may affect their safe use.

Induced Pluripotency and Oncogenic Transformation Are Related ProcessesRiggs JW, Barrilleaux BL, Varlakhanova N, Bush KM, Chan V, Knoepfler PS. Stem Cells Dev. 2012 Oct 26. [Epub ahead of print]

Taken together, these findings support a model in which OF and iPSCs are related, yet distinct cell types, and in which induced pluripotency and induced

tumorigenesis are similar processes


The mechanisms underlying the low efficiency of reprogramming somatic cells into induced pluripotentstem (iPS) cells are poorly understood.

There is a clear need to study whether the reprogramming process itself compromises genomicintegrity and, through this, the efficiency of iPS cellestablishment.

Remarkably, expansion of human iPS cells in culture selects rapidly against mutated cells, driving the linestowards a genetic state resembling human ES cells.

Copy number variation and selection duringreprogramming to pluripotency

(S.M Hussein et al, Nature,471:58–62 ,2011)


-La privacy-Il consenso-I diritti del donatore-La proprietà intellettuale-Uso etico delle ips-Traslazione clinicaReference: Zarzeczny et al., iPS Cells: Mapping the Policy Issues . Cell, 139:1032.1037.

iPSCProblemi di natura etica,legale ,sociale


Privacy• Il fingerprint del DNA contiene informazioni sul donatore

,un uso inappropriato può violare la privacy individuale

• De-identificare/ anonimizzare i risultati è una soluzione?

- futuri usi clinici potrebbero rendere necessarie informazioni sullo stato di salute del donatore

- le tecnologie “single nucleotide polymorphisms” possono identificare il donatore

• Che fare di dati inattesi di cui si viene a conoscenza durante la ricerca? (es. predisposizioni genetiche del donatore a patologie specifiche).


Interrogativi circa il consenso• Un consenso generico (per ricerche biologiche o banking)

non è accettabile

• Occorre enumerare rigorosamente le ricerche e gli usi cui il consenso è riferito ( come includere i dati e l’uso non prevedibile a priori?).

• Occorre un consenso per ogni nuovo progetto di ricerca? (Es.: derivazione di gameti,produzione di chimere umane-animali,ricerche sulla fertilità ,ricerche di base , trapianti e altri usi clinici ,ecc….)

• Possono i genitori decidere per la donazione di cellule di un figlio?

• Se perdura il diritto del donatore all’informazione su dati che lo riguardano deve durare il diritto al ritiro del consenso dato?

• Fino a quando un donatore può ritirare il consenso dato? Si deve prevedere il diritto di distruzione su richiesta del donatore dopo che una linea iPS è creata?


DIRITTI DEL DONATORE

• Il donatore ha diritto a benefici finanziari per l’uso commerciale di una linea di sue cellule? (negli USA i tribunali hanno rigettato tale richiesta per “public policy reasons”)

• Il diritto di autonomia e dignità del donatore deve riguardare il suo genoma? e quindi le informazioni sulla sua salute individuale possono essere utilizzate?

• Una linea cellulare manipolata è da considerare un prodotto nuovo o no ? ( dal momento che ha una certa quantità di caratteri unici del donatore?


Proprietà intellettuale

• Cosa si può brevettare ? La linea cellulare o la procedura per ottenerla o il suo utilizzo ? (Negli

USA le strategie di brevetto sono alquanto aggressive. In Europa sono più restrittive se riguardano la distruzione di embrioni )

• Ogni tecnica di riprogrammazione è di per sé una nuova procedura brevettabile?

• La proliferazione dei brevetti pluri-patents (con piùpropreitari ) non può complicare e rendere costoso la negoziazione di tecnologie e diminuire la ricaduta dei benefici sociali e personali?


USO ETICO DI iPS cells• La questione cruciale :le iPS sono equivalenti delle hESC ?

Per rispondere a questa domanda si rende necessario sperimentare su cellule embrionali umane!

• La tecnica di “tetraploid complementation” potrebbe permettere la clonazione umana (con iPS introdotte in una blastocisti tetraploide si genera un animale geneticamente identico al donatore della cellula somatica anche per il DNA dei mitocondri!!)

• L’uso a scopi riproduttivi (derivazione di gameti) pone gravi questioni etiche sia in relazione al consenso che alla sicurezza e introduce alla possibilità di clonazione

• La funzionalità di gameti derivati in vitro dovrànecessariamente essere verificata mediante la produzione e la conseguente distruzione di embrioni .


Nature Genetics

(a) IVF in the mouse (control). (b) Tetraploid

complementation: electrofusion of two-cellembryo (4N) followed byculture to blastocyst stage and injection of ESCs (2N) derived from fertilizedembryos (fESCs). The resulting pup is 2N; the placenta is 4

(c) Tetraploid complementationwith injection of ntESCs, showing similar efficiencyto fESCs.

(d) Nuclear transfer results in only 1%–2% termdevelopment; most havelarge placentas (98%–99% die in utero).

Nature 461, 86-90 (3 September 2009) | doi:10.1038/nature08267; Published online 23 July 2009

iPS cells produce viable mice through tetraploid complementationXiao-yang Zhao1,2,5, Wei Li1,2,5, Zhuo Lv1,2,5, Lei Liu1, Man Tong1,2, Tang Hai1, Jie Hao1,2, Chang-long Guo1,2, Qing-wen Ma3,

Liu Wang1, Fanyi Zeng3,4 & Qi Zhou1


Translazione clinica

• Per poter utilizzare ips in terapia sarà necessario passare attraverso modelli animali aprendo altri problemi etici come la produzione di chimere uomo-animale.

• Le prospettive sembrano assai complesse. Occorre la messa a punto di standards di riferimento che siano accettabili

• Le agenzie regolatorie possono applicare i criteri già usati per altri prodotti cellulari? Ogni nuova linea iPS è da considerare un prodotto individuale nuovo e quindi non assimilabile ad altri?

• Sembra improbabile che i processi standardizzati e approvati per alcune cellule staminali possano essere applicati anche alle iPS.!


Inoltre

• La forte pressione commerciale suscitata dalle iPSrappresenta oggi un impedimento pratico alla condivisione di criteri standardizzati per la loro produzione

• Ancor più grave se si pensa agli aspetti terapeutici.

• Un esempio dagli USA:

• Trials clinici in lesioni al midollo spinale eseguiti dalla Geron con progenitori oligodendrocitici derivati da hESC

• …i dati sulla efficacia, sulla sicurezza e sulle procedure di produzione restano confidenziali tra la Ditta e la FDA.

• Nessuno può imparare da questi studi che sono destinati ad essere ripetuti con ulteriore dispendio di risorse e di embrioni umani.


ARIANNA BONOMI

VALENTINA COCCE’

FRANCESCA SISTO

LOREDANA CAVICCHINI

LABORATORIO COLTURE CELLULARI

Dipartimento di Scienze Biomediche,Chirurgiche e Odontoiatriche

Università degli Studi di Milano

Ringraziamenti a

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