CEBI E11 Rup Cel 2 2012
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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Especialización CEBI_E11
RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS
Docente a cargo: Mariano GRASSELLI
CEBI_E11_2 : Ruptura celular
Objetivos
• Maximizar la liberación del producto
• Evitar la desnaturalización y/o inactivación
• Evitar la degradación térmica
• Evitar las alteraciones secundarias
• Evitar la formación de partículas submicronicas
• Maximizar la velocidad de liberación
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Factores que afecta la disrupción
• Medio de cultivo en que creció
• Tipo de microorganismo
• Estado fisiológico
• Tamaño
• Forma
• Velocidad a la que ha crecido
Microorganismo
• Sensibilidad al calor
• Sensibilidad al shear
• Localización dentro de la célula
Producto
Métodos
• Métodos físicos
• Métodos químicos
• Métodos biológicos
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Métodos físicos
• Mecánicos• Agitación con abrasivos
• Homogeneización a alta presión
• Extrusión por presión
• Microfluidizadores
•••• No Mecánicos• Shock osmótico
• Congelamiento – descongelamiento
• Sonicado
• Secado
Molino de bolillas (bead mill)
Motor
Correa
transmisión
Cámara Eje impulsor
Paletas
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Paletas
Cámara
dR/dt = k * [células sin romper]
dR/dt = k . (Rm-R)
dondeR= ruptura
Rm= ruptura máxima
La forma integrada de la ecuación de velocidad que describe la
disrupción microbiana es :
∫ 1/(Rm-R) dR = ∫ k dt
ln (Rm / (Rm –R)) = k.t
ln (Rm - R) - ln Rm = - k.t
ln (Rm - R) = - k.t + ln Rm
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La constante de velocidad k representa la eficiencia de
ruptura celular,
y es función de :
• Velocidad de agitación
• Concentración de células•rango de 30-60 % de sólidos (peso húmedo)
• Concentración de bolillas de vidrio•70 y 90 % v/v del volumen de la cámara
• Diámetro de las bolillas• > 0,5 mm para levaduras,
• < 0,5 mm para bacterias.
• Temperatura
• Diseño del molino de bolillas
0
1
2
3
4
5
0 20 40 60 80 100
Tiempo (min)
ln (100 - R)
ln (Rm - R) = - k.t + ln Rm
Si Rm es 100% :
ln (100 - R) = - k.t + 2,3 . log 100
ln (100 - R) = - k.t + 4,6
Tiempo necesario
para liberar el 99%
de la proteína
t r = 4,6
k
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French Press
de laboratorio (batch)
APV-1000
Condiciones de trabajo
• Muestra enfriada
• 4 pasajes a 800 atm (22 L/h)
Homogeneizador de alta presión
www.apv.com
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Funcionamiento del Homogeneizador
HOMOGENISED
PRODUCT
BASIC
PRODUCT
Anillo de
impacto
Entrada del
Producto
Producto
Homogeneizado
UPPER UPPER UPPER UPPER
PARTPARTPARTPARTVálvula
800 atm
1 atm
1) Cuando las células entran en la válvula de
descarga, colisionan sobre el piston
2) Luego, la suspensión es acelerada a través de
un canal angosto que une el asiento de la
válvula y el pistón. En este punto el fluido
alcanza velocidades por encima de 300
m/seg cuando golpea el anillo de impacto.
3) Finalmente, la suspensión fluye a través del
espacio anular entre el anillo de impacto y el
pistón hacia la válvula de salida, y sufre una
abrupta caída de presión
Funcionamiento del Homogeneizador
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Salidas de 1 válvula
Salidas de 2 válvulas
Acero inox cromado (h/ 200 bar)
Carburo de tungsteno (h/ 600 bar) Cerámicas (> 600 bar)
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ln (Rm / (Rm–R)) = k.N.Pa
Rm= cantidad maxima de proteína soluble que puede ser liberada.
R = cantidad de proteína liberada.
k = constante de velocidad temperatura-dependiente.
N = numero de pasajes de la suspensión celular por el homogeneizador.
P = presión de operación del homogeneizador.
a = exponente de presion, que depende del microorganismo y del estado
metabólico en que se encuentre.
para levaduras aprox 3
para bacterias entre 1,5 y 3
ln (Rm -R) = - k.N.Pa + ln Rm
Si Rm (liberación máxima) es 100% :
ln (100 - R) = - k.N.Pa + 2,3 . log 100
ln (100 - R) = - k.N.Pa + 4,6
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4 5
N
ln (100 - R)
Nro teórico de
ciclos para R =
99%
t r = 4,6
k.Pa
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Std DNA P1P0 P2 P3 P4
Ladder 500 pb
Gel Agarosa (DNA)
Degradación mecánica de DNA
Alto PM
Bajo PM
Nro de pasajes
El calor generado durante el proceso de homogeneización es
debido a la descompresión adiabática,
Puede elevar la temperatura del sistema en 1-2 ºC por cada
1000 psi (60 atm) de presión.
Otros problemas más frecuentes:
• Generación de aerosoles
• Desgaste de válvula
Técnica de ruptura celular mas frecuentemente usada para
la gran escala.
No es recomendada para microorganismos filamentosos
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Microfluidizadores
Funcionan por el choque de un chorro de líquido (jet) de alta
velocidad de una suspensión (caldo) sobre una placa.
• De choque
• un chorro de líquido de 80 µm de diámetro choca contra una placa metálica enfriada
• Microfluidizador• dos corrientes de líquido de 2x100 µm se encuentran en una cruz
• De choque en contracorriente: • dos chorros de líquido de 180 µm de diámetro se chocan entre si de frente (evita la erosión de los materiales)
• Dejan residuos de mayor tamaño (más fácil la posterior
separación sólido-líquido)
• Son eficientes a bajo contenido de biomasa (2% peso
húmedo de biomasa)
• Mejor enfriamiento
• Permiten trabajar a bajos flujos (2-20 l/h para trabajos
continuos integrados con la fermentación).
• Se pueden usar volúmenes pequeños (30 ml)
• Son compactos
Ventajas
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Model LAB 8H
Hydraulic pressure intensifier
Capacity 8 L/hr.
Maximum pressure 1600 bar
Nanojet Models LAB 15H & LAB 30H
Model LAB 15H
Hydraulic pressure intensifier
Capacity 15 L/hr.
Maximum pressure 1600 bar
Model LAB 30H
Hydraulic pressure intensifier
Capacity 30 L/hr.
Maximum pressure 2000 bar
Ultrasonido
•Es un equipo muy utilizado a escala laboratorio por
• Simplicidad
• Efectividad en pequeñas muestras.
•El equipo consta de una punta metálica conectada a un generador de
ultrasonidos (ondas acusticas de 15-20 kHz de frecuencia).
•El mecanismo de ruptura es la cavitación:
•generación de microburbujas que al colapsar generan una onda
expansiva que se propaga por el medio (variando la presión)
• Cinética de primer orden y la k es proporciónal a la potencia acústica del
amplificador.
•NO se utiliza a escala piloto o industrial porque la mayor parte de la
energía se transforma en calor.
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Como medir la ruptura?
Directamente
• Turbidez
• Recuento en microscopio
Indirectamente
• Concentración de proteínas
• Actividad enzimática
Métodos químicos
• Tratamiento con álcali
• Tratamiento con solventes
• Tratamiento con detergentes
• Tratamiento con ácidos
• Tratamiento con sustancias caotrópicas
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Métodos biológicos
• Lisis enzimática
• Inhibición de la síntesis de pared celular
• Fagos
• Virus
Diferencias en la pared celular de bacterias
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Composición química de la pared celular
de bacterias gram +
Bacterias Gram (-)
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Levaduras
Las paredes celulares de levaduras tienen 2 capas principales :
a) Capa externa de complejo proteína-manano
b) Capa interna de glucano
Bacterias Gram (+)
Bacterias Gram (-)
Levaduras
Hongos filamentosos
Peptidoglicano
Peptidoglicano
Pared externa
Mananos parcial/
entrecruzados por
fosfodiésteres
Glucanos y proteínas
Glicoproteínas
Quitina
α y β glucanos
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Tratamiento con álcali
• Requerimientos– Producto estable a pH altos (10,5 a 12,5)
• Ventajas• Económico y escalado fácil
• Elimina microorganismos viables
• Inactivación de proteasas
• Reduce la contaminación con piretógenos
• Desventajas• Posible desnaturalización
• Posible degradación
Tratamiento con solventes
• Mecanismo– Extracción del componente lipídico de las membranas
– Autólisis
• Ventajas• Económico y escalado fácil
• Elimina microorganismos viables
• Inhibe el crecimiento microbiano (contaminante)
• Estabiliza proteínas (Solventes miscibles con agua en baja cc.)
• Desventajas• Desnaturalización
• Liberación de proteasas
• Solventes inflamables
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β-D-galactosidasa
proteasas
Biomasa + Solvente (etanol)
Biomasa + Buffer
Incubación y separación
Solvente % de liberación después de
15 h con buffer
Etanol 90
Metanol 90
Isopropanol 85
Butanol 2
t-butanol 90
Acetona 20
Metil etil cetona 20
Tolueno 15
Metil isobutil cetona 15
Liberación de β-D-galactosidasa de Kluveromyces fragilis.Tabla de diferentes solventes. para liberar posteriormente la enzima en buffer.
La concentración final de solvente fue 80% y se dejó incubando durante 90
min con la biomasa.
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Autólisis y Extracción química
• Ventajas• Económico y escalado fácil
• Desventajas• Tiempos largos de reacción
• Bajos rendimientos
Condiciones a optimizar• Temperatura
• pH
• Tiempo de incubación
• Molaridad del buffer
• Estado metabólico de las células
a 50°C en 0,1 M de
buffer acetato pH 5
a 50°C en buffer fosfato 0,1 M pH 5,9
30°C (cuadrados) 50°C (círculos)
+ L-cisteína
Liberación de Inulasa de K. fragilis (de espacio periplásmico)
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Tratamiento con detergentes
• Mecanismo• Solubilización de las membranas
• Permeabilización celular
• Ventajas• Evita la excesiva fragmentación de la pared celular
• Evita la liberación de DNA
• Fácil escalado
• Efecto sinérgico con agentes caotrópicos
• Desventajas• No es económico
• Contaminante posterior en la purificación
• Produce inactivación
• Disminuye el rendimiento
• pH y temperatura son factores críticos
Reactivo Concentración
Proteína total
solubilizada (%)
SCN de guanidinio 6 M 84
SCN sodio 6 M 42
Cl guanidinio 6 M 13
Br de cetilpiridinio 2 % 61
Deoxicolato de sodio 2 % 41
Tritón X-100 2 % 54
SDS (dodecil sulfato de sodio) 2 % 82
Urea 6 M <4
Tiourea 2 M <4
Solubilización de proteínas de membrana de E. coli
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VENTAJAS
• Rápido y sencillo
• Condiciones de trabajo suaves
• Proteasas específicas
• Lisis selectivas
DESVENTAJAS
• No es económico
• No hay disponibilidad
• Microorganismo debe ser sensible
• Liberación de ADN
• Eliminación en pasos posteriores de purificación
• La lisis está marcadamente afectada por el buffer, pH y temperatura
Métodos enzimáticos
•Glicosidasas
• cortan cadenas de polisacáridos
•Acetilmuramil-L-alaninamidasas,
• clivan la unión entre proteínas y polisacáridos
•Endopeptidasas,
• clivan cadenas polipeptídicas.
Lisozima
Tipos de enzimas bacteriolíticas
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Los sistemas enzimáticos para la lisis de levaduras
• β (1-3) glucanasa• Proteasa específica
• β (1-6) glucanasa• Mananasa
• Kitinasa
Sistemas enzimáticos del
Cytophaga sp.
Oerskovia xanthineolytic
Lisis de B. subtilis (10 g/L peso seco)
Se agrega un sobrenadante crudo del complejo
enzimático Cytophaga sp. en una concentración de
3-30% v/v
Lisis de levaduras
hasta 110 g/L peso seco de biomasa en reactores de
disrupción.
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pH:
circulo ... pH 6
Triángulo ... pH 6,9
Cuadrado ... pH 8
Molaridad de buffers:
Claros ... 50 mM
Oscuros ... 100 mM
Fosfato
Fosfato + EDTA
Fosfato + Lisozima
Fosfato + EDTA
+ Lisozima
EDTA 1 mM
Lisozima 0,03 mg/ml
Lisis de un cultivo de P. putida