CDU 577.482:62137:631.461.5^33.31 AGRIS F21 F22 ' F30 F40 1953

FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO EM ALFAFA (Medicago sativa L). COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS DA DIFERENÇA, DA DILUIÇÃO DE

ISÓTOPO E DA REDUÇÃO DE ACETILENO *

HÉLIO A. BURITY Engenheiro Agrônomo. Pesquisador da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA/IPA). Professor Credenciado do Curso de Mestrado de Botânica da UFRPE.

MOHAMED A. FARIS Engenheiro Agrônomo. Pesquisador-Agriculture Canadá, Ottawai Research Station, Forage Crop Section, Ottawa, Canadá.

BRUCE E.COULMAN Engenheiro Agrônomo. Professor-Departament of Plant Sciense, MacDonald College of McGill University, Quebec, Canadá

TRUNG C. TA Engenheiro Agrônomo. Pesquisador-Plant Research Centre, Central Experimental Farm, Research Branch, Ottawa, Canadá.1

Em vista ao crescente interesse em se produzir uma maior quantidade de proteína com melhor qualidade e menor utilização de energia externa, a atenção tem sido focalizada sobre a fixaçáo bioló- gica de nitrogênio (N) pelas plantes leguminosas. Intensivas pesquisas sobre a fixação de N foram realizadas nesta última década. Contudo, muito escassas são as informações disponíveis sobre a quantidade absoluta de Ng - fixado pela simbiose leguminosa - Rhizobium. O presente trabalho foi realizado com o propósito de comparar os métodos mais usados de avaliação da fixação biológica de N2 pela alfafa em monocultura e em associação com gramfnea. Resultados provenientes das con- dições de casa de vegetação e campo, mostram que o método da diferença (MB) e o método da di- luição de isótopo (Dl) forneceram estimativas que foram bastante similares e superiores significativa- mente as estimativas de N2 - fixações derivadas do método da redução de acetileno (RA). Em geral, as estimativas de N2 - fi) ado pelos MD e Dl foram bastantes aproximadas, mas o método Dl mostrou um erro padrão da média reduzido demonstrando uma maior precisão em comparação ao MD. Assim, foi concluído» que o método Dl é o indicado para medir a fixação de N2, quando mensurações preci- sas são requeridas. Por outro lado, o MD poderá ser utilizado em condições em que os recursos para a Dl são limitantes. Quanto ao método da RA poderá ser usado, em estudos que visem dimensionar a atividade da enzima nitrogenase em períodos específico.

* Trabalho conduzido pelo pnmeiro autor na Estação Experimental de Ottawa, Canadá. Apresentado na Sixth Eastern Forage Improvement Conference, llhaca, New York, August 3 to 8,1985.

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. Em vista ao crescente interesse em se produzir uma maior quantidade de

protefna com melhor qualidade e menor utilização de energia externa, a atenção tem sido focalizada sobre a fixação biológica de nitrogênio (N) através da sim- biose leguminosa-Rhizobium. Uma sbrie de estudos sobre fixação biológica de N foram realizados nesta última década. A maioria dos resultados tem se baseado na aplicação do método da redução de acetileno.lRA), como técnica usada para estimar a fixação de N2. Contudo, as avaliações de N2 fixado através da RA têm sido conflitantes, devido as inumeras variáveis incontrolaveis quando esta técni- ca 6 utilizada (LARUE & PATTERSON, 1981 e MARTENSSON & LJUNGGREN, 1984). A principal hipótese deste método envolve a redução de etileno (C2H2) para acetileno (C2H4) em relação a fixação do N molecular. Mas a relação entre acetileno formado e fixação de N2 é variável, em virtude da evoluaçáo de pro- tons metabolizados pela enzima hidrogenase. Assim, valores superiores a razão teórica de conversio de C2H4 : N2 (3:l) podem ser observados (SCHOLLHORN & BURRIS, 1967; HARDY et alii, 1973 e SCHUBERT & EVANS, 1976). Em adição a variação do fator de conversão, outras variáveis de difícil controle são enume- radas como : variaqáo diurna da atividade enzimática da nitrogenase (BERGER- SEN, 1970 e CARRAN et alii, 1982), variabilidade entre plantas e colheita parcial dos nódulos (RENNIE, 1984) e ao fato de 4ue usualmente as plantas são destrui- das (simples avaliação) (RENNIE, 1984).

Métodos álternativos para estimar a fixação simbiótica de N pelas legumi- nosas, baseados na aplicaçáo da técnica de isótopos sáo disponiveis. Como, a in- cubação das plantas em ambiente atmosférico enriquecido com I ~ N ~ , método de alta precisão e teoricamente recomendável. A incorporação de N enriquecido é diretamente proporcional a atividade da enzima nitrogenase (BURRIS, 1972). Todavia, consideráveis dificuldades práticas são encontradas nesta técnica, no que concerne à incubação por períodos mais extensos, durante o desenvolvi- mento da planta (MARTENSSON & LJUNGGREN,\ 1984). O método da di- luição isotópica, a qual utiliza fertilizante enriquecido com 15N é uma excelente alternativa, devido ao fato de que esta técnica integra a fixaçáo de N2 em u m in- tervalo de tempo especifico. A diluição de isótopo estima a concentração de 1 5 ~ no tecido da leguminosa discriminando o 1 5 ~ proveniente do solo e 1 4 ~ oriun- do da atmosfera em relaçáo a uma espécie de planta que utiliza somente N do solo (HAUCK & BREMNER, 1976).

A técnica diluiçáo isotópica (15N) para estimar a fixaçáo de ~2 A baseada sobre as consideraçóes do uso de nutrientes de duas fontes: solo e atmosfera. Primeiramente, foi desenvolvida e aplicada por NEWTON et alii (19531, mas so- mente utilizado diretamente nos estudos de assimilação de N por FRIED &

'MIDDELBOE (1977). McAULIFFE et aln (1958), modificou o mét%do oriçinal da diluição de isótopoç, adaptando-o a pesquisa agronomica e estimou a fixaçáo

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INTRODUÇÃO

Em vista ao crescente interesse em se produzir uma maior quantidade de proteína com melhor qualidade e menor utilização de energia externa, a atenção tem sido focalizada sobre a fixação biológica de nitrogênio (N) através da sim- biose leguminosa-fí/j/zob/um. Uma série de estudos sobre fixação biológica de N foram realizados nesta última década. A maioria dos resultados tem se baseado na aplicação do método da redução de acetileno.IRA), como técnica usada para astimar a fixação de N2. Contudo, as avaliações de N2 fixado através da RA têm sido conflitantes, devido as inúmeras variáveis incontrolaveis quando esta técni- ca é utilizada (LARUE & PATTERSON, 1981 e MARTENSSON & LJUNGGREIM, 1984). A principal hipótese deste método envolve a redução de etileno (C2H2) para acetileno (C2H4) em relação a fixação do N molecular. Mas a relação entre acetileno formado e fixação de N2 é variável, em virtude da evoluação de pro- tons metabolizados pela enzima hidrogenase. Assim, valores superiores à razão teórica de conversão de C2H4 : N2 (3:1) podem ser observados (SCHOLLHORN & BURRIS, 1967; HARDY et alii, 1973 e SCHUBERT & EVANS, 1976). Em adição a variação do fator de conversão, outras variáveis de difícil controle são enume- radas como : variação diurna da atividade enzimática da nitrogenase (BERGER- SEN, 1970 eCARRÀN et alii, 1982), variabilidade entre plantas e colheita parcial dos nódulos (RENNIE, 1984) e ao fato de que usualmente as plantas são destruí- das (simples avaliação) (RENNIE, 1984).

Métodos alternativos para estimar a fixação simbiótica de N pelas legumi- nosas, baseados na aplicação da técnica de isótopos são disponíveis. Como, a in- cubaçâo das plantas em ambiente atmosférico enriquecido com 15n2, método de alta precisão e teoricamente recomendável. A incorporação dê N enriquecido é diretamente proporcional a atividade da enzima nitrogenase (BURRIS, 1972). Todavia, consideráveis dificuldades práticas são encontradas nesta técnica, no que concerne a incubação por períodos mais extensos, durante o desenvolvi- mento da planta (MARTENSSON & LJUNGGREN, \ 1984). O método da di- luição isotópica, a qual utiliza fertilizante enriquecido com 15N é uma excelente alternativa, devido ao fato de que esta técnica integra a fixação de N2 em um in- tervalo de tempo específico. A diluição de isótopo estima a concentração de no tecido da leguminosa discriminando o proveniente do solo e oriun- do da atmosfera em ralação a uma espécie de planta que utiliza somente N do solo (HAUCK & BREMNER, 1976).

A técnica diluição isotópica (I^N) para estimar a fixação de N^ é baseada sobre as considerações do uso de nutrientes de duas fontes: solo e atmosfera. Primeiramente, foi desenvolvida e aplicada por NEWTON et alii (1953), mas so- mente utilizado diretamente nos estudos de assimilação de N por FRIEO & MIDDELBOE (1977). McAULIFFE et alíi (1958), modificou o método original da diluiçáo de isótopos, adaptando-o a pesquisa agronômica e estimou a fixação

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biológica de N2 em Tntoiium repens L. e Medicdgo sativa L. de acordo com a fórmula:

Fração do total da N na leguminosa derivado % de átomo 15N em excesso-legummosa

do N? atmosférico = 1 rr — x 100 % de átomo 'bN em excesso-grammea

A principal limitação deste método é que a espécie referencial (não fixadora) de- ve estar presente e a absorção de N c!o solo pode ser diferente entre as espécies teste e referência, levando asoim a um erro considerável.

O terceiro método para calcular a fixação de N2 pela leguminosa é o clás- sico método da diferença, baseado na comparação entre o rendimento total de N das espécies fixadora e a controle. A desvantagem desta técnica está relacionada a espécie controle, a qual pode manifestar uma atividade --adicular diferente, re- sultando em uma absorção anormal de N do solo.

O presente trabalho foTl realizado com o propósito de comparar os méto- dos mais utilizados de estimar a fixação biológica de nitrogênio pela alfafa em monocultura e em associação com gramínea em casa de vegetação e em campo. Os métodos foram; diluição de isótopo, redução do acetileno e diferença total de N.

MATERIAL E MÉDOTO

Aspectos Gerais dos Experimentos

Foram conduzidos dois experimentos, um em casa de vegetação e outro em condições de campo, na Estação Experimental de Ottawa, Canadá Agricultu- ra, Ontário, Canadá. O experimento de casa de vegetação foi instalado em feve- reiro de 1984 e concluído em agosto de 1984. As sementes pré-germinada de al- fafa (Medicago sativa L.) cultivar 'Saranac', timothy (Phleum pratense L.) cultivar 'Climax', bromegrass (Bromus inermis Leyss.) cultivar 'Tempo' e orchardgrass (Dactylis glomerata L.) cultivar 'Kay' foram transplantadas em vaso plástico de 20 cm de altura. Na sameadura, foram colocadas oito plântulas por vaso em mono- cultura, e oito plântulas em associação (50% leguminosa - 50% gramínea). O meio de crescimento foi uma mistura de vermiculita (70%, v/v) e areia lavada (30%, v/v) esterelizada a seco, à 120oC, por 48 horas. O experimento foi irrigado depois da semeadura e a cada quatro dias, forneceu-se às plantas uma solução nutritiva isenta de nitrogênio (tabela 1). As adições de água foram feitas uma ou duas vezes por dia, baseando-se no peso de dez vasos.de cada repetição, sor- teados ao acaso. Uma semana após o transplante, uma mistura de estirpes Rhi- zobium meliloti L-6, 1-26, C7 - Balzac e 102F70 (Nitragin Co. Wisconsin, EUA), em solução, foi aplicado em todos os vasos. Ao mesmo tempo, foi feita uma adu-

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bação básica com 10 ppm de K na forma de KCL e 10 ppm na forma de Ca(H2P04)2. Quando as plântulas estavam bem estabelecidas, dez dias após o transplante, 5mg de (NH4)2S04 enriquecido com 99% de átomo de 1 5 ~ dissol- vido em solução de água deionizada, foram aplicadas na superfície de cada pote. Após o segundo corte 2 m g de (NHqI2S04 enriquecido (99% do átomo de 1 5 ~ em excesso) foram adicionados em cada pote.

As unidades experimentais foram colhidas quando a alfafa atingiu ao es- tadio de 5O0I0 de floração, ou seja, a cada cinco/ a seis; semanas.; Quatro colhei- tas foram obtidas durante o experimento. Em cada colheita, as plantas de u m vaso foram utilizadas para a determinação da redução de acetileno, em seguida foram secadas em estufa a 70 - 800C, até atingirem peso constante. A concen- tração de N total foi determinada atravfis do método micro-Kjeldahl segundo BREMNER (1965) e a %átomo de 1 5 ~ na planta tecido foi analisado por emissão optica espectroscópica de acordo com PRESTON et alii (1987).

O experimento consistiu de quatro tratamento em monocultura e três tra- tamentos em associação, arranjado em u m delineamento experimental de blo- cos ao acaso, com quatro repetições.

O experimento de campo, foi instalado em maio de 1983 em u m solo are- no-argiloso com boa drenagem natural na Estação Experimental de Ottawa, Ontário, Canadá. A área experimental tinha sido anteriormente cultivada com a cultura da cevada e os restolhos incorporados após a colheita. A an8lise química do solo apresentou níveis adequados de P e Mg. Contudo, levando em conside- ração a reação inicial do solo (pH = 5,l) e o nível mfidio de K disponível (98 ppm), potássio e calcário foram aplicados antes da semeadura a uma taxa de 30 kg.ha-1 e 3000 kg.ha-1 na forma de cloreto de potássio (KCI e calcário dolomíti- co (CaMg(C03)2), respectivamente. Espécies e cultivares idênticas, inoculadas com Rhizobium meliloti estirpes 102F20 e L-26 (Nitragin Co. Wisconsin, EUA) fo- ram usadas no experimento de campo. A taxa de semeadura para alfafa em mo-- nocultura foi 13 kg.ha-1 e em associação foi 11 kg.ha-1, enquanto para timothy foi 6.0 kg.ha-1, e para orchardgrass e bromegrass foi 9,O kg.ha-1. A mesma taxa de plantio para as gramíneas foram utilizadas em monocultura e em associação (MINISTRY AGRICULTURE AND FOOD, 1982).

Em cada unidade experimental (1.60 m x 6,O m) estabeleceu-se uma mi - cro-parcela (1,O mz), aproximadamente no centro da parcela. Uma solução de l g de (NHqI2S04 enriquecida com 99% de átomo de 1 5 ~ dissolvido em'1,Ol de água deionizada foi aplicada na superfície do solo da micro-parcela. Uma outra solução, contendo 0.25 m g de (NHq)S04 enriquecido com 99% de átomo de 1 5 ~ foi adicionada em cada micro-parcela, anualmente, na primavera. As unidades, experimentais foram colhidas quando a alfafa atingiu plena floração. Obteu-se duas colheitas durante0 ano de estabelecimento (1983) e no subseqüente (1984) e três colheitas no terceiro ano do experimento (1985). Em cada colheita, as plantas foram colhidas a 3 cm do nível do solo e secadas, em estufa entre 70 - 80°C, até atingirem peso constante. As rnensurações realizadas foram idgnticas a do experimento em casa de vegetação.

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bação básica com 10 ppm de K na forma de KCL e 10 ppm na forma de Ca(H2P04)2. Quando as plântulas estavam bem estabelecidas, dez dias após o transplante, 5mg de (1^4)2804 enriquecido com 99% de átomo de 15N dissol vido em solução de água deionizada, foram aplicadas na superfície de cada pote. Após o segundo corte 2 mg de (NH4)2S04 enriquecido (99% do átomo de 15IM em excesso) foram adicionados em cada pote.

As unidades experimentais foram colhidas quando a alfafa atingiu ao es- tádio de 50% de floração, ou seja, a cada cincol a seis! semana!. Quatro colhei tas foram obtidas durante o experimento. Em cada colheita, as plantas de um vaso foram utilizadas para a determinação da redução de acetileno, em seguida foram secadas em estufa a 70 - 80oC, até atingirem peso constante. A concen- tração de N total foi determinada através do método micro-Kjeldahl segundo BREMNER (1965) e a % átomo de na planta tecido foi analisado por emissão óptica espectroscópica de acordo com PRESTOIM et alii (1981).

O experimento consistii1 de quatro tratamento em monocultura e três tra- tamentos em associação, arranjado em um delineamento experimental de blo- cos ao acaso, com quatro repetições.

O experimento de campo, foi instalado em maio de 1983 em um solo are- no-argiloso com boa drenagem natural na Estação Experimental de Ottawa, Ontário, Canadá. A área experimental tinha sido anteriormente cultivada com a cultura da cevada e os restoihos incorporados após a colheita. A análise química do solo apresentou níveis adequados de P e Mg. Contudo, levando em conside- ração a reação inicial do solo (pH = 5,1) e o nível médio de K disponível (98 ppm), potássio e calcário foram aplicados antes da semeadura a uma taxa de 30 kg.ha"1 e 3000 kg.ha'1 na forma de cloreto de potássio (KC1) e calcário dolomíti- co (CaMg(C03)2), respectivamente. Espécies e cultivares idênticas, inoculadas com Rhizobium meliloti estirpes 102F20 e L-26 (Nitragin Co. Wisconsin, EUA) fo- ram usadas no experimento de campo. A taxa de semeadura para alfafa em mo-., nocultura foi 13 kg.ha"1 e em associação foi 11 kg.ha"1; enquanto para timothy foi 6.0 kg.ha"1, e para orchardgrass e bromegrass foi 9,0 kg.ha"1. A mesma taxa de plantio para as gramíneas foram utilizadas em monocultura e em associação (MINISTRY AGRICULTURE AND FOOD, 1982).

Em cada unidade experimental (1,60 m x 6,0 m) estabeleceu-se uma mi- cro-parcela (1,0 m^), aproximadamente no centro da parcela. Uma solução de 1g de (NH4)2S04 enriquecida com 99% de átomo de 15n dissolvido em" 1,01 de água deionizada foi aplicada na superfície do solo da micro-parcela. Uma outra solução, contendo 0,25 mg de (NH4)S04 enriquecido com 99% de átomo de 1^N foi adicionada em cada micro-parcela, anualmente, na primavera. As unidades experimentais foram colhidas quando a alfafa atingiu plena floração. Obteu-se duas colheitas durante o ano de estabelecimento (1983) e no subseqüente (1984) e três colheitas no terceiro ano do experimento (1985). Em cada colheita, as plantas foram colhidas a 3 cm do nível do solo e secadas, em estufa entre 70 - 80oC, até atingirem peso constante. As mensurações realizadas foram idênticas a do experimento em casa de vegetação.

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raoeia l - Composição química da solução nutritiva livre de nnrogémo utilizada

Composição

Química

Quannoaoe oa So- Concentração lução Estoque Usa

da (p/l)

KH2PO4 MgS04. 7H20 K2S04 CaCi2. 2H20 Frdg NaH2-EDTA KCI h3b03 MnCI2. 4H20 ZnS04. 7H20 C0SO4. 5H20 H2M0S04. H2

34,00q/l 123,00g/l

65,00g/l 147,00g/l

0,84g/l 1.70g/l 0,75g/l

I24,00mg/1 67,00mg/l 46,00mg/l IO.OOmg/1 2,00mg.l

Solução nutritiva baseada em MUNNS (1968). Ajustada a pH 6.5 através da adição IN de KOH.

Redução de Acetileno

Na determinação da atividade nitrogenase utilizou-se o método da re- dução do acetileno em raízes destacadas, segundo TURNER & GIBSON (1980). Após a detectação da atividade nitrogenase, foi calculado a quantidade de fi- xado, usando a taxa de conversão de C2H2:N2 (3:1), integrando os valores diá- rios a estação de crescimento e ajustando estes valores a variação cirradiana da função da enzima nitrogenase. Plantas de cada tratamento e repetição foram removidas entre dez e doze horas. No trabalho em casa de vegetação, após a remoção cuidadosa das plantas e corte da parte aéie. na altura do colo, asraí es foram cuidadosamente manipuladas, evitando qualquer dano ^o s^teroa radicu- lar. Em condições de campo, foram retiradas em redor das plantas, arr istras de s Io de 20 cm de profundidade. Estas amosf as foram,submergiuas .inr jgua por vários minutos, de modo a permitir a separação do s^tema radicu r de bloco o e so- lo cc 10 míni rjo de perda de nódulos e distúrbios do sistema radicular. Em segui- da as raízes foram colocadas em vidros de 1.01, quo foram fechados h rmeti- lamente ^om rolhas de borracha, e 100 ml de ar do vidro foram substituídos por mesmo volume dè acetileno equivalente a uma concentração de 10%. Acetileno foi produzido in situ pela a reação do cloreto de cálcio com água, r^mo descrito por SIROIS & PETERÇON (1982. Depois de uma hora de incubação em tem-

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peratura ambiente, quatro amostras de 0,5 ml do gás1 foram retiradas do vidro através de seringa. A quatidade de etileno foi determinada em um cromatógrafo GC 9700 - TM equipado com detector de ionizaçáo de chama. Os compostos fo- ram separados em uma coluna poropak N operada a 72 7 I0C, com N2 como gás carregador. 0 s resultados das amostras foram comparados com 0,1% estan- dar de etileno, similar ao descrito por TURNER 81 GIBSON (1980). O estandar de etileno foi obtido com amostras de conteúdo conhecido de acetileno.

Diluição de Isótopo

A técnica de diluiçáo de isótopo (DI) foi epecutada com a aplicação de uma solução de (15NH412S04 contendo 99% de átomo de I~N, equivalente a 1 g/m2, uma semana após a semeadura. A percentagem de N na planta derivada da at- mosfera foi estimada baseada, nas hipóteses: a) a planta fixadora de Np e a tes- temunha náo fixadora absorveu na mesma proporção N mineralizado do solo e o 15N enriquecido durante a estação de crescimento: b) qualquer entrada de N não proveniente do sistema solo é igual para ambas espécies.

A quantidade de N2 fixado pela alfafa estimado pela diluiçáo de is6top0, seguiu os seguintes cálculos:

% de N2 derivado c- % de átomo 1 5 ~ em excesso - alfafa da atmosfera =

% de átomo 1 5 ~ em excesso - gramínea !IX 10.

% de N derivado da atmosfera N2 - fixado = x Total N-alfafa

1 O0

Para o método da diferença (MD), o total de N2 fixado foi estimado através da seguinte relação:

Total N21derivado da = Rendimento total de N - Rédimento total de N Fixado (leguminosa) (graminea)

,Experimento em Casa de Vegetação

Na tabela 2, podem ser vistos os dados referentes a quantidade absoluta de N2-fixado estimado pelos diferentes métodos. A interação entre métodos e sistema cultural náo foi significativa, assim os valores apresentados são os efei-

'tos principais para ambos parâmetros. Os metodos da diferença (MD) e da di- luição de isótopo (DI) se destacaram com maior estimativa de Nq-fixado em re- lação 8 redução de acetileno (RA), que apresentou menor estimativa da quanti- dade de N2-fixado por planta. MD e DI deram estimativas de N2-fixado que não

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peratura ambiente, quatro amostras de 0,5 ml do gás| foram retiradas do vidro através de seringa. A quatidade de etileno foi determinada em um cromatógrafo GC 9700 - TM equipado com detector de ionízação de chama. Os compostos fo- ram separados em uma coluna poropak N operada a 72 + 10C, com N2 como gás carregador. Os resultados das amostras foram comparados com 0,1% estan- dar de etileno, similar ao descrito por TURNER & GIBSON (1980). O estandar de etileno foi obtido com amostras de conteúdo conhecido de acetileno.

Diluição de isótopo

A técnica de diluição de isótopo (Dl) foi executada com a aplicação de uma solução de (15nH4)2S04 contendo 99% de átomo de ISn, equivalente a 1 g/m2, uma semana após a semeadura. A percentagem de N na planta derivada da at- mosfera foi estimada baseada, nas hipóteses: a) a planta fixadora de IM2 e a tes- temunha não fixadora absorveu na mesma proporção N mineralizado do solo e o enriquecido durante a estação de crescimento: b) qualquer entrada de N não proveniente do sistema solo é igual para amoas espécies.

A quantidade de N2 fixado pela alfafa estimado pela diluição de isótopo, seguiu os seguintes cálculos:

% de N2 derivado

da atmosfera

N2 - fixado

Para o método da diferença (MD), o total de N2 fixado foi estimado através da seguinte relação:

Total N2(lderivado da = Rendimento total de N - Rèdimento total de N

Fixado (leguminosa) (gramínea)

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Experimento em Casa de Vegetação

Na tabela 2, podem ser vistos os dados referentes a quantidade absoluta de N2-fixado estimado pelos diferentes métodos. A interação entre métodos e sistema cultural não foi significativa, assim os valores apresentados são os efei- tos principais para ambos parâmetros. Os métodos da diferença (MD) e da di- luição de isótopo (Dl) se destacaram com maior estimativa de N2-fixado em re- lação a redução de acetileno (RA), que apresentou menor estimativa da quanti- dade de N2-fixado por planta. MD e Dl deram estimativas de N2-fixado que não

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% de átomo 15N em excesso - alfafa A 1 ^ Ix 100

% de átomo 15|m em excesso - gramínea /

% de N derivado da atmosfera x Total N-alfafa

diferem estatisticamente. Embora as estimativas pelo MD excederam aqueles produzidos pelo DI em 5,7% em média. Isto sugere que atravbs do MD se obtém valores representativos de Np-fixado, a onde, as condiçóes de meio ambiente permite u m desenvolvimento apropriado da espécie referencial. De modo geral, a quantidade de N2-fixado avaliadas pelos métodos MD e ID seguiram a mesma tendência durante o experimento com exceção do corte 4, com DI excedendo a estimativa do MD. Todavia, no corte 1, as estimativas produzidas pelos DI e MD foram iguais (16,20mg de Nlplanta), independendo do sistema cultural utilizado.

LEGG & SLOG ER (19751, depois de incorporar fertilizante enriquecido com I~N, verificaram uma relação entre os mbtodos FAD e DI, através de todo período experimental. W!LLIAMS et alii (19771, determinaram a correlação entre os dois métodos de medir a fixação de nitrogênio e encontraram que estes mé- todos estáo correiacionodos linearmen?e f r = 0,981. Prévios valores de N2-fixado medidos pelo MD em leguminosas antlais, podem subestimar a fixação em cerca de 40% (HOLLAND et alii, 1969). MARTENSSON & LJUNGGREN (1984). com- pararam os va!ores de N derivado da atrriosfera em ambos métodos e concluí- ram que o método DI forneceu estimativas de Np-fixado significativamente infe- riores ao MD. Por outro lado, COALE et alii (1985). quantificaram a percentagem de N derivado da ( atmosfera e a quantidade absoluta de N2-fixado e não evi- denciaram existência de diferença significativa entre os MD e Df. Contudo, houve uma significante diferença em termos de precisáo do método usado. O m6todo da diluição, consistentemente apresentou um menor desvio padrão que o MD para ambos parâmetros mensurados. RENNIE (1984) afirmou que MD foi u m método confiSvel de avaliação de N2-fixado em experimentos com níveis baixos de N do solo, assim a espécie referência mostrou sinais de deficiência de N. O autor concluiu que o MD pode ser usado com confiança para estimar Nq-fixado, quando a eficiência de uso de fertilizantes são 1 idênticas para O sistema fixador e a espécie referência. Outros autores, RUSCHEL et alii (19791, TALBOTT et alii (1982) e BROADBENT et alii (1982) concluíram que a DI oferece maior precisão, quando comparado ao MD, sendo uma das vantagens em mensurar baixa taxa de N2-fixado. RENNIE & RENNIE (1983) e RENNIE, (1984) concluíram que em adiçáo a precisáo, o método DI apresenta uma elevada capacidade de estimar a fixâçáo bioldgica, c?evidojprincipaimente,ao fato dos valores obtidos serem inde- pendentes da produçio da média seca.

As estimativas de N2-fixado proveniente do método da RA foram sempre inferior significativamen:e que aquelas oriundas dos outros métodos em quest5o. A quantidade absoluto de N2-fixado estimadas alcançou valores entre 5.46 mg de Nlplanta e 9.37 mg de Nlplanta, dependendo do corte. Assim, o mé- todo RA deram as menores estimativas de N2-fixado. A explicação para estes resliltados pode vir da sugestão de CARRAN et alii (1982) de que fatores asso- ciados a atividades nitrogenase, particularmente a variabilidade entre as plantas do alfafa. TOUGH & CRUSH (1979), sugerem que a variação da atividade da en- zima nitrogenase pode ser explicada com a mistura de estirpes de Rhizobium usada e a variação genética que ocorre dentro da população de alfafa. Apesar das variações mencionadas, a RA mostra-se u m teste proveitoso para estudar a

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diferem estatisticamente. Embora as estimativas pelo MD excederam aqueles produzidos pelo Dl em 5,7% em média. Isto sugere que através do MD se obtém valores representativos de N2-fixado, aonde, as condições de meio ambiente permite um desenvolvimento apropriado da espécie referencial. De modo geral, a quantidade de N2-fixado avaliadas pelos métodos MD e ID seguiram a mesma tendência durante o experimento com exceção do corte 4, com Dl excedendo a estimativa do MD. Todavia, no corte 1, as estimativas produzidas pelos Dl e MD foram iguais (16,20mg oe N/planta), independendo do sistema cultural utilizado.

LEGG & SLOGER (1975), depois de incorporar fertilizante enriquecido com 15n/ verificaram uma relação entre os métodos MD e Dl, através de todo período experimental. WILLIAMS et alii (1977), determinaram a correlação entre os dois métodos de medir a fixação de nitrogênio e encontraram que estes mé- todos estão correlacionados linearmente <r = 0,38). Prévios valores de N2-fixado medidos pelo MD em leguminosas anuais, podem subestimar a fixação em cerca de 40% (HOLLAiMD et alii, 1S69). MARTENSSON & LJUMGGREN (1984), com- pararam os valores de IM derivado da atmosfera em ambos métodos e concluí- ram que o método Dl forneceu estimativas de N2-fixado significativamente infe- riores ao MD. Por outro lado, COALE et alii (1985), quantificaram a percentagem de N derivado da | atmosfera e a quantidade absoluta de N2-fixado e não evi- denciaram existência de diferença significativa entre os MD e Dl. Contudo, houve uma significante diferença em termos de precisão do método usado. O método da diluição, consistentemente apresentou um menor desvio padrão que o MD para ambos parâmetros mensurados. RENNIE (1984) afirmou que MD foi um método confiável de avaliação de N2-fixado em experimentos com níveis baixos de N do solo, assim a espécie referência mostrou sinais de deficiência de IM. O autor concluiu que o MD pode ser usado com confiança para estimar IM2-fixado, quando a eficiência de uso de fertilizantes são I idênticas para o sistema fixador e a espécie referência. OuTos autores, RUSCHEL et alii (1979), TALBOTT et alii (1982) e BROADBEÍM f et alii (1982) concluíram que a Dl oferece maior precisão, quando comparado ao MD, sendo uma das vantagens em mensurar baixa taxa de [M2-fixado. RENNIE & RENNIE (1983) e RENNIE, (1984) concluíram que em adição a precisão, o método Dl apresenta uma elevada capacidade de estimar a fixação biológica, devido^principalmente^o fato dos valores obtidos serem inde- pendentes da produção da média seca.

As estimativas de N2-íixado proveniente do método da RA foram sempre inferior significativamente que aquelas oriundas dos outros métodos em questão. A quantidade absoluta de N2-fixado estimadas alcançou valores entre "4.46 mg de N/planta e 9,37 mg de N/planta, dependendo do corte. Assim, o mé- todo RA deram as menores estimativas tíe N2-fixado. A explicação para estes resultados pode vir da sugestão de CARRAN et alii (1982) de que fatores asso- ciados a atividades nitrcgenase, particularmente a variabilidade entre as plantas de alfafa. TOUGH & CRUSH (1979), sugerem que a variação da atividade da en- zima nitrogenase pode ser explicada com a mistura de estirpes de Rhizcbium usada e a variação genética que ocorre dentro da população de alfafa. Apesar das variações mencionadas, a RA mostra-se um teste proveitoso para estudara

Cad. £ nega Umv Fed. Rural PÉ. Sér. Biol., Recife. (2):63-76,1987

atividade da enzima nitrogenase no período inicial de seleção para melhorar a fi- xação de nitrogênio (VIANDS, 1983).

As estimativas de fixação de Nz da alfafa em associação foram superiores significativamente àquelas obtidas, quando alfafa se desenvolveu em monocul- tura. Os resultados podem sugerir que as gramíneas pode estimular a fixação de Nq da leguminosa, quando ambas espécies crescem em associação. Isto é, pro- vavelmente devido a utilização pela gramínea do N excretado dentro do meio pela alfafa (BURITY et alii 19851.; Uma compreensiva revisão da associação le- guminosa-gramínea, mostrou que a leguminosa tem a propriedade de excretar composto nitrogenado solúveis que são eficientemente absorvidcs petas gramí- neas associadas (SIMPSON, 1965 e HAYSTEAD & MARRIOTT, 1979).

Tabela 2 - Fixação dc nitrogênio (N2) pela alfafa em monocultura e em associação com gramíneas, em oortes periódicos. ss!imada por diferentes técnicas. em condições de casa de vege- tação. Os va!ores entre parênteses são desvio padrão da média para cada método

TÉCNICA

OU

SISTEMA CULTURAL

N2 FIXADO CORTE+

1 2 3 4 ~éd ia+++ mg , Nfplanta

Redução de Ace!ileno(RA)

Diluição de Isbtopo(Dl)

SIS'TEhllA CULTURAL Alfafa em monocultura

Alfafa em associação

Valores da coluna seguidos da mesma letra não diferem eslatisticamente pelo teste de Duncan. ao ni- vel de 5% de probabilidade. + Corte 1 realizado em 23 de maio de 1984; corte 2 realizado em 15 de junho de 1984; Corte 3 reali-

zado em 17 de julho de 1984 e Corte 4 realizado em 24 de agosto de 1984. + + MBdias comparadas horizontalmente. +++ Médias comparadas verticalmente.

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atividade da enzima nitrogenase no período inicial de seleção para melhorar a fi- xação de nitrogênio (VIANDS, 1983).

As estimativas de fixação de IM2 da alfafa em associação foram superiores significativamente àquelas obtidas, quando alfafa se desenvolveu em monocul- tura. Os resultados podem sugerir que as grãmíneas pode estimular a fixação de N2 da leguminosa, quando ambas espécies crescem em associação. Isto é, pro- vavelmente devido a utilização pela gramínea do N excretado dentro do meio pela alfafa (BUR1TY et alii 1S85).! Uma compreensiva revisão da associação le- guminosa-gramínea, mostrou que a leguminosa tem a propriedade de excretar composto nitrogenado solúveis que são eficientemente absorvidos pelas gramí- neas associadas (SIIViPSOiM, 1965 e HAYSTEAD & MARRIOTT, 1979).

Tabela 2 - Fixação do nitrogênio (N2) pela alfafa em monocultura e em associe ção com gramíneas, em cortes periódicos, estimada por diferentes técnicas, em condições de casa de vege- tação. Os valores entre parênteses são desvio padrão da média para cada método

TÉCNICA N2 FIXADO

OU CORTE+

1 2 3 4 Média+++

SISTEMA CULTURAL mg N/planta

Redução de Aretileno(RA) 9,37b 6.01b 5,54b 4,46b 6,35b (3,22) (2,23) (2,09) (1,72)

Diluição de Isótopo(DI) 16,20a 16,22a 15,50a 21,26 16,54a (2,23) (2,12) (2,07) (2,07)

Método da Diferença(MD) 16,20a 17,42a 17,63a 18,74a 17,49a (2,92) (2,20) (3.62) (2,90)

SISTEMA CULTURAL Alfafa em monocultura 11,74b 11,30b 11,24a 12,02b 11,57b

(1,74) (1,62) (1,09) (1,36

Alfafa em associação 16,09a 15,13a 12,53a 17,62 13,46a (1,94) (2,02) (1.15) (2,15)

Média+ + 13,91a 12,21ab 11,89b 14,82a 13,46 + SE 1,70 1,53 2,22 2,60 2,72

Valores da coluna seguidos da mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan, ao ní- vel de 5% de probabilidade. + Corte 1 realizado em 23 de maio de 1984; corte 2 realizado em 15 de junho de 1984; Corte 3 reali-

zado em 17 de julho de 1984 e Corte 4 realizado em 24 de agosto de 1984. + + Médias comparadas horizontalmente. + + + Médias comparadas verticalmente.

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Experimento de Campo

De modo geral, a fixação de N2 no experimento de campo (tabela 3) se- guiu as mesmas tendências dos resultados obtidos em casa de vegetação. Devi- do ao fato de haver diferença significativa entre métodos de avaliação, sistema cultural e interaçáo entre as variáveis em questão, os dados apresentados repre- sentam efeito principal de ambas variaiveis. Os métodos da diferença e de isóto- po tiveram avaliações de Np-fixado superiores significativamente em relação a RA. No ano de estabelecimento das culturas houve uma diferença significativa entre as estimativas de N2-fixados pelos MD e DI. No entanto, nos anos sub- seqüentes as estimativas foram muito aproximadas. Todavia as estimativas de DI apresentaram u m desvio padrão menor, demonstrando que este método foi mais preciso em estimar a quantidade absoluta de N2-fixado. Geralmente, as es- timativas de Np-fixado pelo MD excedeu aquelas oriundas do DI (MARTENS- SON & LJUNGGREN, 1984 e RENNIE, 1984). O MD assume que ambas as espé- cies, fixadora e referência, apresentam u m padrão igual ou muito similar de ab- sorção de N do solo. No presente trabalho, durante o ano de estabelecimento o MD subestimou significativamente a fixação biológica de N2 em comparação ao método D l i entretanto nos anos seguintes as estimativas entre MD e DI não mostraram'uma diferença significativa. Estes resultados podem ser atribuidos a uma maior eficiência no uso do N do solo por parte da leguminosa no período inicial de estabelecimento da simbiose. BOLE & RENNIE (1983) afirmaram que o MD geralmente subestimou a fixação de N2 quando comparado com o método DI.

MARTENSSON & LJUNGGREN (1984) compararam a percentagem de nitrogênio derivada da atmosfera nos MD e DI, e concluiram que DI apresentou estimativas significativamente menores de Np-fixado.

BODDEYet alii (1 984) observaram queas mensurações de Np-fixado para so- ja foram geralmente superiores pela técnica dadiferença total de N, já que houve uma alta absorção de N do solo pelas plantas noduladas em comparação com as, plantas de soja que não nodularem. WAGNER & ZAPATA (1982) também en- contraram uma alta absorção de fertilizantes nitrogenados pelas plantas nodula-' das de soja, determinando assim uma super estimação da fixação de N2 pelo1 MD. A absorção relativa de fertilizante elou N do solo pelas plantas fixadoras e referências depende do solo, fatores ambientais e práticas de manejo (DEIBERT et alii, 1979 e VASILAS & HAM, 1985).

Independentemente do sistema de cultivo, as estimativas de N2-fixado através do MD, depois do inicial período de estabelecimento excederam as men- surações realizadas pela DI por uma percentagem média de 4,15% e 8,43% em 1984 e 1985, respectivamente. Essas diferenças não alcançaram os níveis de sig- nificação. Assim, os resultados apresentados nas tabelas 2 e 3, sugerem que as

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Experimento de Campo

De modo geral, a fixação de N2 no experimento de campo (tabela 3) se- guiu as mesmas tendências dos resultados obtidos em casa de vegetação. Devi- do ao fato de haver diferença significativa entre métodos de avaliação, sistema cultural e interação entre as variáveis em questão, os dados apresentados repre- sentam efeito principal de ambas variáveis. Os métodos da diferença e de isóto- po tiveram avaliações de IM2-fixado superiores significativamente em relação a RA. No ano de estabelecimento das culturas houve uma diferença significativa entre as estimativas de N2-fixados pelos MD e Dl. No entanto, nos anos sub- sequentes as estimativas foram muito aproximadas. Todavia as estimativas de Dl apresentaram um desvio padrão menor, demonstrando que este método foi mais preciso em estimar a quantidade absoluta oe N2-fixado. Geralmente, as es- timativas de N2-fixado pelo MD excedeu aquelas oriundas do Dl (MARTENS- SON & LJUNGGREN, 1984 e RENN1E, 1984). O MD assume que ambas as espé- cies, fixadora e referência, apresentam um padrão igual ou muito similar de ab- sorção de N do solo. No presente trabalho, durante o ano de estabelecimento o MD subestimou significativamente a fixação biológica de N2 em comparação ao método Dl,j entretanto nos anos seguintes as estimativas entre MD e Dl não mostraram uma diferença significativa. Estes resultados podem ser atribuídos a uma maior eficiência no uso do N do solo por parte da leguminosa no período inicial de estabelecimento da simbiose. BOLE & RENNIE (1983) afirmaram que o MD geralmente subestimou a fixação de N2 quando comparado com o método Dl.

MARTENSSON & LJUNGGREN (1984) compararam a percentagem de nitrogênio derivada da atmosfera nos MD e Dl, e concluíram que Dl apresentou estimativas significativamente menores de N2-fixado.

BODDEY et alii (1984) observaram que as mensurações de ^-fixado para so- ja foram geralmente superiores pela técnica da diferença total de N, já que nouve uma alta absorção de N do solo pelas plantas noduladas em comparação com as plantas de soja que não nodularem. WAGNER & ZAPATA (1982) também en contraram uma alta absorção de fertilizantes nitrogenados pelas plantas nodula- das de soja, determinando assim uma super estimação da fixação de N2 peloí MD. A absorção relativa de fertilizante e/ou N do solo pelas plantas fixadoras e referências depende do solo, fatores ambientais e práticas de manejo (DEIBERT et alii, 1979 e VASILAS & HAM, 1985).

Independentemente do sistema de cultivo, as estimativas de N2-fixado através do MD, depois do inicial período de estabelecimento excederam as men- surações realizadas pela Dl por uma percentagem média de 4,15% e 8,43% em 1984 e 1985, respectivamente. Essas diferenças não alcançaram os níveis de sig- nificação. Assim, os resultados apresentados nas tabelas 2 e 3, sugerem que as

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estimativas de N2-fixado pelo MD são suficientemente confiáveis e representati- vas quando as seguintes condições são observadas: condições ambientais que permitem razoável desenvolvimento da espécie referência; não existir diferença marcante na eficiência de absorção de N do solo ou de fertilizante nitrogenado entre as espécies em teste.

A quantidade de N2-fixado estimada pela RA foi sempre bastante inferior a dos outros métodos (tabela 3), alcançando valores de 24,22 kg de N/ha e 25,13 kg de N/ha em 1983 e 1984, respectivamente. Esses baixos valores obtidos po- dem ser explicados pelos fatos mencionados pela mistura de estirpes de Rhizo- bium meliloti utilizada, juntamente com a variabilidade genét ja da população da leguminosa (TOUGH & CRUSH, 1979), associados a perdas e danos dos nódulos durante o processo de separação do sistema radicular do solo, em condições de campo. Aliados a estes pontos citados, pode-se observar na tabela 2, que o mé- todo da RA subestimou a fixação em ralação ao MD no percentual médio de 64%. Neste experimento, não houve o envolvimento da espécie no cálculo da fi- xação, devido ao meio de crescimento isento de N. Assim, os resultados impli- cam que a taxa de conversão de C2H2:N2 foi aproximadamente 1:1, a qual é aproximadamente a mesma para soja de acordo com HERRIDGE, (1982). Contu- do, apesar da subestimativa do N2-fixado em ambas as condições ambientais utilizadas e outras limitações enfatizadas, o método RA mostra ser um teste ra- cional e útil em estudos relativos a atividade de enzima nitrogenase em período específico.

A estimativa de N2-fixado proveniente do sistema cultural, alfafa em asso- ciação foi significativamente superior 'aquelas estimadas em monocultura, no ano de estabelecimento do ensaio. Nos mos subsequentes contudo, as estimati- vas não apresentaram diferenças estatísticas. A tendência foram as mesmas do experimento em condições mais controladas. Estes dados evidenciam que a as- sociação, alfafa-gramínea, não teve efeito prejudicial na capacidade fixadora da leguminosa e talvez estimule a fixação de N2, quando ambas crescem em asso- ciação. CRAIC et alii (1981) reportaram que a inclusão de gramíneas em m aturas com leguminosas aumentou a fixação de N2 na legun nosa. Os autores explica- ram que a diminuição de N disponível no solo para a legumi osa foi devido ã rápida absorção pela gramíneas que pode estimular a fixação de N2 na legumi- nosa.

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Tabela 3 - Fixação de nitrog6nio (N2) pela alfafa em monocultura e em associação com gramineas. durante os anos de 1983 a 1985. estimada por diferentes tbcnicas em condições de cam- po. Valores ente parênteses são desvio padrão da media para cada m6todo

TÉNICA ou SISTEMA CULTURAL!

Redução de Acetileno(RA)

Diluição de Idtopo(DI)

Mbtodo da Diferença(MD)

N2-FIXADO A N O

1983 1984 1985 kg Nlha

SISTEMA CULTURAL

Alfafa em monocultura

Alfafa em associação

DMS (5%) 3.87 44,14 54,82 C.V.(%) 18.04 1 5.20 13,47

C.V. Coeficiente de variação.

0 s resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que os métodos da diluição de isótopo e da diferença total de nitrogênio são adequados para quan- tificar a fixação simbiótica de N2. Devido a maior precisão e sensibilidade da di- luição de isótopo este metodo deverá ser escolhido quando mensuraçóes mais rigorosas são requeridas. Contudo, os custos adicionais associados ao método diluição de isótopo com aplicação e análises (átomo % I~N), evidenciam que o método da diferença seja preferido em várias situações. Apesar das limitaçóes apresentadas pelo método da redução de acetileno, seu uso è proveitoso em ca- so de estudos fenoldgicos da atividade enzimática da nitrogenase em períodos específicos.

Cad. &nega Univ. Fed. Rural PE. SBr. Biol., Recife, (2):63-76, 1987

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Taoeia 3 - Fixação de rmrogènio (Ng) pela alfafa em monocultura e em associação com gramíneas, durante os anos de 1983 a 1985, estimada por diferentes técnicas em condições de cam- po. Valores entre parênteses são desvio padrão da média para cada método

TÉ NICA OU SISTEMA CULTURAL. 1983

N2-FIXADO ANO 1984 1985

kg N/ha

Heaução de Acetileno(RA) 24,22 (4,9)

25,23 (4.7)

-

Diluição de Isótopo(DI) 99,88 256,67 215,09

Método da Diterença(MD) 86,64 (21,8)

267,78 (32,8)

234,89 (33,9)

SISTEMA CULTURAL Alfafa em monocultura 58,55

(9.7) 194,07 (17,1)

221,85 (31.1)

Alfafa em associação 82,11 (11,0)

192,31 (19,8)

228,13 (28.1)

DMS (5%) C.V.(%)

3,87 18,04

44,14 15,20

54,82 13,47

C.V. (%), Coeficiente de variação.

CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que os métodos da diluição de isótopo e da diferença total de nitrogênio são adequados para quan- tificar a fixação simbiótica de N2. Devido a maior precisão e sensibilidade da di- luição de isótopo este método deverá ser escolhido quando mensurações mais rigorosas são requeridas. Contudo, os custos adicionais associados ao método diluição de isótopo com aplicação e análises (átomo % 15(\j)i evidenciam que o método da diferença seja preferido em várias situações. Apesar das limitações apresentadas pelo método da redução de acetileno, seu uso è proveitoso em ca- so de estudos fenológicos da atividade enzimática da nitrogenase em períodos específicos.

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In view of the increasing interest in producing high-quality protein with less input of externa1 energy. attention has been focused on biological nitrogen (N) fixation by legurninous plants. Intensive research on biological N fixation has taken place during the past decade. However, very few measurernents on absolute arnount of N2 - fixation are available. The present work was camed out with the purpose of cornparing the rnost used rnethod for evaluating total N2 - fixation by alfalfa in pure and rnixed siand with grass. Field and greenhouse :estirnates df N2 - fixation using the N difference rnethod (DM) and l 5 ~ dilution method (ID) were fairly similar for the two techniques and significantly larger than N2 - fixation values estirnated by acetylene reduction (AR). In general, the estirnates by these two rnethods were close, however, the ID showed lower standard errors than DM, dernonstating that the ID was more precise to assess N2 - fixation in cornparison with DM. So, it is concluded that 1 5 ~ dilution technique is the rnethod of choice when precise measurernents of N2 - fixation are required. The DM rnay be used when resources for isotopes technique are lirniting. In spite of the lirnitations presented by AR, this rnethod should be used for studying the relative actvity of the nitrogenase enzyrne at a specific time.

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ABSTRACT

In view of me .ncreasing mierest in prcducing nigh-quality protem wíth less mpul ot externai energy, attention has been focused on bioloqical nitrogen (N) fixation by leguminous plants. Intensive research on biological N fixation has taken place during the past decade. However, very few measurements on absolute amount of N2 - fixation are available, fhe present work was ramed ouf with the purpose of romparin 3 the most used method for evaluating total N2 - fixation by alfafia in pure and mixed stand with grass. Field and greenhouse estimates òf N2 - fixation usng the N difference method (DM) and 15N dilution n.ethod 'JD) were fairly similar for the twn techniques and significantly largar than N2 - fixation values estimated by acetylene reduction (AR). In gem ral the estimates by these two methods were dose, however, the ID ,howed lower standard errors than DM, demonstrating that the ID was more precise to t-ssess N2 - fixation in comparison with DM. So, it is concluded that 1 t>N dilution lechnique is the method of choice when precise neasurement, of N2 - fixation are required. The DM may be used when resources for isotopes teohnique are limiting. In spite of the limitations presented by AR, this method should be used for studying the relative advity of the nitrogenase enzyme al a spentic time.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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