病毒学报 Chinese Journal of Virology

ISSN 1000-8721,CN 11-1865/R

《病毒学报》网络首发论文

题目： 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究 作者： 刘姗姗，陶泽新，王素婷，周楠，林小娟，宋艳艳，徐爱强 DOI： 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356 收稿日期： 2018-01-16 网络首发日期： 2018-04-08 引用格式： 刘姗姗，陶泽新，王素婷，周楠，林小娟，宋艳艳，徐爱强．基于生活污水

监测的诺如病毒分子流行病学研究．病毒学报. https://doi.org/10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356

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发论文视为正式出版。

病 毒 学 报

CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY

基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究

刘姗姗 1，陶泽新 2，王素婷 2，周楠 1，林小娟 2，宋艳艳 1*，徐爱强 1，2*

（1.山东大学 公共卫生学院，济南 250012； 2.山东省疾病预防控制中心 山东大学预防医学研究院 山东省传染病

预防控制重点实验室，济南 250014）

摘要：为了解生活污水中诺如病毒（Norovirus，NoV）检出情况、基因型分布和分子流行病学特征，进一步探索环境

监测技术用于研究病毒性胃肠炎病原区域性流行的必要性，本研究于 2016年 1~12月在山东省济南和临沂两地采

集生活污水，通过阴离子膜吸附洗脱法对收集到的 24份污水样品进行浓缩后，提取核酸，经过逆转录-聚合酶链反

应扩增NoV VP1基因片段，经TA克隆后测序，进行分型和系统进化树分析。结果显示，监测地区生活污水标本中

GI的检出率为 100%，GII为 95.8%。共获得 412条NoV序列，分别属于 6个 GI基因型和 8个 GII基因型，其中 GI.6（32.3%，133/412）、GII.3（14.1%，58/412）和 GII.17（25.7%，106/412）检出数量最多。GII.17检出序列均属于 Ka⁃wasaki 308变异株，而前些年大流行的 GII.4的检出序列占比仅 1.0%，属于 Sydney 2012变异株。本研究描述了

2016年山东省本地流行的诺如病毒基因型分布和序列特征，证明了可以通过对城市污水进行监测来探索人群中循

环的诺如病毒的遗传多样性。

关键词：诺如病毒；急性胃肠炎；分子流行病学；环境监测

中图分类号：R373.2 文献标识码：A

诺如病毒（Norovirus，NoV），属于人类杯状病

毒科（Human Calicivirus，HuCV）诺如病毒属，于

1972年通过免疫电镜技术首次在美国俄亥俄州诺

瓦克地区暴发的流行性腹泻疫情中发现，是首个被

确认的引起人类急性胃肠炎的病毒［1］。NoV基因组

为单股正链 RNA，全长约 7.5 kb，分为三个开放阅

读框架（Open Reading Frames，ORFs），ORF1编码

非结构蛋白，ORF2和 ORF3分别编码主要衣壳蛋

白 VP1和次要结构蛋白 VP2。根据 VP1蛋白编码

的序列不同可分为 7个基因群（GI~GVI），其中GI、GII和GIV可感染人类。

NoV是引起人类急性胃肠炎的主要原因之一，

可导致散发或暴发。在全球范围内，约五分之一的

腹泻病例由 NoV引起［2］。NoV所致胃肠炎虽然属

于自限性疾病，但可导致婴儿和老年人产生严重的

症状甚至死亡。国家突发公共卫生事件信息管理

系统报告，在 2012~2016年间我国 24个省 96个城

市共发生 313次由 NoV引起的暴发事件，其中 2016年 NoV暴发 109次［3］。由于 NoV无症状携带者和

不选择就医的轻症患者较多，所以临床病例的监测

数据不能完全反映病原真正的流行病学特征，生活

污水中检测到的 NoV序列和人群中胃肠炎病例的

NoV序列密切相关［4］。鉴于此，本研究在 2016年对

山东省济南和临沂两地城市污水中的 NoV进行了

监测分析，获取监测地区NoV分子流行病学及其系

统进化特征，以探索胃肠炎病毒环境监测的重要

性，并为当地NoV胃肠炎的防控提供科学依据。

材料与方法

1 污水的采集与浓缩

本研究以山东省济南和临沂两地为监测点，于

2016年 1~12月每月中旬分别采集两地污水处理厂

进水口处的污水标本 1 L，所采水样低温运输至实

验室 4℃保存，于 24小时内采用阴离子膜吸附洗脱

法对采集的污水进行 100倍的浓缩［5］，最终浓缩液

体积为 10 ml，置于-80℃冻存。

2 病毒RNA的提取

使 用 美 国 QIAGEN 公 司 的 QIAamp ViralRNA Mini Kit试剂盒，根据使用说明操作，从 140 μl污水浓缩液中提取总 RNA，加入 1 μl（40 U）RNa⁃sin，置于-80℃冻存。

收稿日期：2018⁃01⁃16；修回日期：2018⁃02⁃25基金项目：泰山学者工程专项经费资助（ts.201511105）；国家自

然科学基金项目（81573209），题目：环境污水中人类胃肠炎病毒的

型别多样性、遗传进化规律及其与人群疾病发生的关系；山东省自

然科学基金项目（ZR2014HM076），题目：基于环境污水监测的诺如

病毒基因型分布和分子流行病学研究。

作者简介：刘姗姗（1993-），女，湖北省襄阳市人，硕士研究生，

主要从事诺如病毒方面的研究，E-mail：shanshanyou@foxmail.com∗ 通讯作者：宋艳艳（1963-），副教授，Tel：0531-88382625，

E-mail：yysong@sdu. edu. cn；徐爱强（1963-），主任医师，Tel：0531-82679606，E-mail：aqxuepi@163.com

DOI：10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356 网络首发时间：2018-04-08 13:23:00网络首发地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1865.R.20180406.1825.008.html

病 毒 学 报

3 逆转录-聚合酶链反应

使用 SuperScript III One-step RT-PCR Sys⁃tem with Platinum Taq一步法试剂盒对 NoV GI和GII的 ORF1和 ORF2部分片段进行基因扩增。扩

增 NoV GI 基 因 组 所 用 引 物 为 G1-SKF（CTGCCC GAA TTY GTA AAT GA）和 G1-SKR（CCA ACC CAR CCA TTR TAC A）；扩 增 NoVGII基因组所用引物为 COG2F（CAR GAR BCNATG TTY AGR TGG ATG AG）和 G2-SKR（CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT）［6］。

RT-PCR 反应体系体积为 50 μL，程序设置为：

50℃ 30 min，94℃ 2 min；94℃ 15 s，50℃ 30 s，68℃ 1min，共 40个循环；68℃ 5 min后转 4℃保存。

4 PCR产物的回收、克隆和测序

NoV GI和 GII的引物扩增的目的片段大小分

别为 330 bp和 387 bp，RT-PCR反应产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，符合上述片段大小的

扩增产物判断为阳性。使用 QIAquick Gel Extrac⁃tion Kit试剂盒对阳性产物进行切胶回收，通过 TA克隆连接到 pGEM®-T Easy 载体中，连接产物通

过热休克法转入至感受态大肠杆菌 JM109细胞中。

再经过蓝白斑筛选，每份标本挑取 GI和 GII的阳性

克隆各 10个，共挑取 480个阳性克隆，送至上海生

物工程股份有限公司测序。

5 基因分型和系统进化分析

使用 BioEdit 5.0.6软件进行序列剪切、比对和

同源性分析，使用NoV在线分型工具（http：//www.rivm. nl /mpf / norovirus / typingtool）对获得的 NoVGI和 GII序列进行分型。使用Mage 5.0软件基于

Neighbor-joining法构建系统发生树，通过 1000 次

重复 bootstrap检验评估建树可靠性。

结 果

1 NoV检出情况与型别分布

本研究在济南、临沂两地采集污水处理厂处理

前污水，每月每地采集 1份标本，从 2016年 1月采集

至 12月，共计 24份污水标本。经 RT-PCR检测分

析，24份标本中有 23份标本均检出 GI和 GII基因

型，济南 9月标本仅检出 GI未检出 GII。送去测序

的 480个克隆中，由于测序不成功损失部分序列，且

获得的序列中有部分为非特异性序列，包括短片段

插入、人类基因组序列、植物病毒序列等，最终获得

的诺如病毒序列为 412条。包括 234个 GI序列和

178 个 GII 序 列 ，分 别 属 于 6 个 GI 基 因 型

（GI.1~GI.6）和 8个GII基因型（GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.5、GII.9、GII.13和 GII.17）（表 1）。GI主要基因型为 GI.6（56.8%，133 /234），其次为 GI.2（9.4%，22 / 234）、GI. 3（10.7%，25 / 234）和 GI. 5（15.8%，37 / 234）。 GII 主 要 基 因 型 为 GII. 17（59.6%，106/178），其次为 GII.3（32.6%，58/178）。

两 地 检 出 较 多 的 基 因 型 依 次 为 GI. 6、GII. 17 和

GII.3。NoV基因型分布存在一定程度的地区差异，在

济南检出 5个 GI基因型和 8个 GII基因型，在临沂

检出 6个 GI基因型和 4个 GII基因型。G1.1仅见于

临沂，GII.1、GII.9、GII.13和GII.15仅见于济南。其

他基因型虽在两地均有分布，但检出频率存在一定

差异，除 GI.2济南较多见外，其他各型均临沂多见，

且GII.17和GII.3更为突出。

总体来看NoV无明显季节分布差异，主要流行

型 GI.6和 GII.17全年均有检出，GII.3多数月份可

检出。GI.1和 GII.4主要见于寒冷季节，但检出频

率较低。

2 同源性比较和序列分析

同源性比较显示，本次研究所获取的各型别

NoV序列氨基酸同源性均较高，大多数同一型别有

较高的核苷酸同源性，少数型别 GI.3、GI.5、GI.6和GII.3的型内核苷酸同源性略低，且该型别在济南和

临沂两地内均显示同源性略低。（表 2）。

本研究选取山东两监测地区 NoV主要流行型

别（GI.6、GII.3和 GII.17）序列与国内外其他参考序

列比较、构建基于 VP1编码区部分序列的系统进化

树，分离地点为同一城市且核苷酸同源性大于 98%的序列仅选取 1条为代表（图 1）。

系统发生学分析显示 GI.6序列可分为两个基

因簇（基因簇 A和基因簇 B），大部分 GI.6序列都属

于基因簇 A，提示该分支是山东 GI.6的主要传播

链。除序列（JN596）和（LY1620）外，GI.6的型内核

苷酸同源性为 97.1%~100.0%。序列（JN596）和

（LY1620）与 GI. 6 其他序列的同源性较低，均为

87.2%~88.8%，与南宁参考序列（KM246916）亲缘

关系较近，处于同一个进化簇内，且与其有较高的

核苷酸同源性，分别为 98.4%和 96.8%。

GII.3序列和广东参考序列（KY407194）核苷酸

同源性为 97.7%~100.0%，与其有较近的亲缘关

·· 2

刘姗姗，等 .基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究

系 。 多 数 GII. 3 序 列 属 于 同 一 个 分 支 ，仅 序 列

（LY540-2）属于另一个分支，该分支序列与广东参

考序列（KY407194）核苷酸同源性为 100%。

本研究共获得 4条 GII.4序列，均属于 Sydney2012变异株，与原型株（JX459908）的核苷酸同源性

为 97.7%~98.0%。

GII. 17 的 型 内 核 苷 酸 同 源 性 为 97.5%~100.0%，GII.17各序列聚集在同一个分支，均属于

Kawasaki 308（LC037415）变异株。大部分序列与

上海参考序列（KU953397、KU953394）亲缘关系较

近，核苷酸同源性为 98.9%~100.0%，数条序列与

珠 海 变 异 株（KT253245）［7］ 、江 苏 变 异 株

（KR270448）［8］和意大利参考序列（KT346356）处于

同 一 个 进 化 簇 内 ，核 苷 酸 同 源 性 均 为 99.6%~100%。 3 条 序 列 （LY542 -2、LY542-3 和

LY818-9）与 Kawasaki 308变异株核苷酸同源性为

100%，分离地点皆为临沂市。

表 1 山东监测地区城市污水中NoV的数量

Table 1 Number of NoV sequences detected in sewage in Shandong Province，China

GI.1

GI.2

GI.3

GI.4

GI.5

GI.6

GII.1

GII.2

GII.3

GII.4

0

1

1

0

0

8

0

0

0

0

0

3

0

0

0

8

1

0

1

0

0

3

0

0

1

8

0

0

1

0

0

2

0

0

2

8

0

0

0

0

0

2

0

0

1

7

0

0

2

0

0

2

0

1

1

6

0

0

1

0

0

1

1

0

1

6

0

0

3

0

0

0

3

0

0

6

0

0

4

0

0

0

3

0

0

4

0

0

0

0

0

0

2

2

5

1

0

0

1

0

0

0

0

0

2

8

0

1

3

2

0

0

0

0

8

2

0

0

8

0

0（0）

14（11.7）

10（8.3）

3（2.5）

21（17.5）

72（60）

1（1.4）

1（1.4）

24（33.3）

2（2.8）

0

0

2

2

0

6

0

0

9

1

0

1

1

1

0

6

0

1

8

1

0

1

2

0

0

6

0

0

3

0

0

0

0

0

3

7

0

0

0

0

0

1

2

0

3

4

0

0

3

0

0

0

1

0

3

4

0

0

2

0

0

0

1

1

3

4

0

0

1

0

0

0

0

0

3

7

0

0

1

0

0

5

0

1

1

3

0

0

1

0

3

0

2

1

0

4

0

0

2

0

5

0

1

0

0

4

0

0

4

0

0

0

3

0

0

6

0

0

0

0

8（7.0）

8（7.0）

15（13.2）

6（5.3）

16（14.0）

61（53.5）

0（0）

1（0.9）

34（3.1）

2（1.9）

8（3.4）

22（9.4）

25（10.7）

9（3.8）

37（15.8）

133（56.8）

1（0.6）

2（1.1）

58（32.6）

4（2.2）

Geno⁃type

Jinan

Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum（%）

Linyi

Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum（%）

Sum（%1）

·· 3

病 毒 学 报

GII.9

GII.13

GII.15

GII.17

Total

0

0

0

2

12

0

0

0

1

14

0

0

0

1

14

0

0

0

2

14

1

2

0

3

18

0

1

0

7

19

0

0

0

7

19

0

0

1

4

18

0

0

0

0

7

0

0

0

8

19

0

0

1

1

18

0

1

0

1

20

1（1.4）

4（5.6）

2（2.8）

37（51.4）

192

0

0

0

0

20

0

0

0

0

19

0

0

0

6

18

0

0

0

7

17

0

0

0

6

19

0

0

0

6

16

0

0

0

5

15

0

0

0

7

18

0

0

0

9

20

0

0

0

8

20

0

0

0

6

20

0

0

0

9

18

0（0）

0（0）

0（0）

69（65.1）

220

1（0.6）

4（2.2）

2（1.1）

106（59.6）

412

续表

Geno⁃type

Jinan

Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum（%）

Linyi

Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum（%）

Sum（%1）

Note：1constituent ratio within a genogroup.

讨 论

本研究监测地区生活污水中 NoV GI和 NoVGII的检出率为 100%，显示 NoV在当地的高流行

态势，与邓丽丽［9］等人对南宁市的监测结果一致。

本次共检出 14种 NoV基因型在山东监测地区的城

市污水管网中循环，其中检出数量最多的两个基因

型为 GI.6和 GII.17，且全年各月份都有检出，表明

GI.6和 GII.17在 2016年山东监测地区有较高的流

行强度。济南检出 8个 GII基因型临沂仅检出 4个GII基因型，说明 NoV在监测地区间型别分布存在

一定的差异。

表 2 山东环境监测地区NoV各基因型VP1核苷酸和氨基酸同源性

Table 2 Nucleotide identities among Shandong sequence

GenotypesGI.1GI.2GI.3GI.4GI.5GI.6GII.1GII.2GII.3GII.4GII.9GII.13GII.15GII.17

Nucleotide identities（%）Jinan/

98.4~10084.7~10098.0~99.084.7~10088.2~100.0

//

96.7~100.098.3/

97.0~99.097.0

98.9~100.0

Linyi99.3~100.098.7~10084.7~10099.0~99.684.7~10087.2~100.0

//

97.0~100.099.3///

98.2~100.0

Jinan and Linyi99.3~100.098.4~100.084.3~100.098.0~99.684.3~100.087.2~100.0

/95.7

94.0~100.097.7~99.3

/97.0~99.097.0

97.5~100.0

Amino acids（%）Jinan/

97.1~10098.0~10097.1~99.097.1~100.096.1~100.0

//

95.0~100.098.0/

98.0~100.093.7

97.8~100.0

Linyi99.0~100.099.0~100.095.2~100.099.0~100.097.1~100.094.2~100.0

//

96.0~100.0100.0///

96.8~100.0

Jinan and Linyi99.0~100.097.1~100.095.2~100.097.1~100.096.1~100.094.2~100.0

/98

89.2~100.097.0~100.0

/98.0~100.093.7

96.8~100.0Note：“/”means“cannot be calculated”.

·· 4

刘姗姗，等 .基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究

核苷酸同源性分析表明，同一地区同一时间获

取的毒株序列、不同地区间或不同时间内获取的毒

株序列的型内核苷酸同源性都可以达到 100%，这

表明一些传播链在人群中存在时空与地域的连续

循环。

有研究表明 GI.6暴发的时间主要在夏季，以食

源性传播为主［10］，本研究检出的 GI.6序列数量最

多，占GI序列总数的 56.8%，且全年各月均有检出。

考虑本研究中的高检出率和当地无相关疫情报道

的情况，认为目前在监测地区 GI.6以散发形式常年

存在。GI.6在所有报道的 NoV疫情暴发中占相对

较小的比例，但在本研究中 GI.6的检出并不少见，

因此对GI.6的监测和防控仍应受到重视。

自 1995年以来，世界上由 NoV导致的胃肠炎

中约 70%由 GII.4引起［11-13］，至少有 9种 GII.4变异

株在全球流行，其中有 6种变异株与 NoV相关的胃

肠炎大流行有关［14］。Sydeny2012变异株仍是世界

上主要的 GII.4变异株。本研究在两个监测地各检

出 2条 GII.4序列全部属于 Sydeny2012变异株，表

明 Sydeny2012变异株仍然是山东监测地区 GII.4的优势毒株，且检出月份为冬季，符合 NoV寒冷季节

流行的特点。

临沂市GII.3序列（LY540-2）与广东参考序列

（KY407194）核苷酸同源性为 100%，且分离时间均

为 2016年，表明两者之间可能存在远距离传播。此

前已有研究表明，将生活污水里的NoV与世界各地

分离株进行核苷酸同源性比较和系统发生学分析，

有助于明确NoV的传播路径，追踪起源［15］。

有研究报道，2014~2015年寒冷季节，在亚洲

部分地区，新型 GII.17是急性胃肠炎暴发的主要原

因［16-18］，表明非 GII.4可能成为引起急性胃肠炎暴

发的主要基因型。本研究检出 GII.17序列 106条，

占 GII序列总数的 59.6%，远多于 GII.4毒株，是 GII的主要基因型，与上述研究中主要引起胃肠炎暴发

的 NoV基因型一致。山东省于 2014年首次检出属

于 Kawasaki 308变异株的序列［19］，至 2016年山东省

检出的 GII.17序列全部属于 Kawasaki 308变异株，

提示该变异株自进入本区域以来在人群中持续传

播，逐步建立起区域性循环，而导致以往大流行的

GII.4分离株检出率极低，说明人群中流行的主要毒

株随着时间的推移而发生改变。研究结果提示了

持续监测的重要性。系统进化分析显示，GII.17部分序列与珠海、江苏腹泻暴发的NoV变异株具有较

高的亲缘关系，说明监测污水中的病毒具有重要的

公共卫生意义。

由于NoV变异速度快，且易导致急性胃肠炎暴

发，在肠道中复制的病毒可随粪便排出体外，进入

城市生活污水，且在污水环境中能长时间保持稳

Notes：Phylogenetic relationship of Shandong and other sequence. GI.6，GII.3 and GII.17 are illustrated in a to c respectively. ● Isolates fromsewage；□ reference sequence

图 1 GI.6、GII.3和GII.17系统进化树

Figure 1 Phylogenetic trees of GI.6，GII.3 and GII.17 sequences

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病 毒 学 报

定。本研究从时空和地域两个层面再次揭示了城

市生活污水中 NoV的广泛存在及其分子流行病学

特征，且揭示了NoV多种基因型共循环特征。

NoV感染通常以隐性和轻型感染为主，且呈自

限性，主动就医较少，目前尚无当地足够的病例资

料，因此不能将生活污水的检测结果与当地感染情

况对照分析。但从生活污水中监测的病毒水平可

间接反映人群中NoV的循环情况，环境监测的数据

可以作为病例监测的有效补充，尤其在当前病毒性

腹泻监测强度和监测数据比较薄弱的情况下，环境

监测可以提供有力的数据。借助分子生物学方法

的污水监测具有高效、省时省力的优点，是监测人

群中 NoV流行情况的有效方法。本研究的数据对

于掌握当地人群中 NoV的循环状况有极为重要的

实际意义。

目前可感染人类的 NoV有 GI、GII和 GIV，由

于 GI和 GII是引起人类急性胃肠炎病毒的主要基

因型，因此本研究只分析了 GI和 GII，未对 GIV进

行探索，为了更全面掌握本地 NoV的流行情况，我

们今后也将GIV纳入监测范围。

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Norovirus Molecular Epidemiology Based on Environmental Sewage Surveil⁃

lance

LIU Shanshan1，TAO Zexin2，WANG Suting2，ZHOU Nan1，LIN Xiaojuan2，SONG Yanyan1*，XU Aiqiang1,2*

（1. School of Public Health，Shandong University，Jinan 250012，China；2. Shandong Center for Disease Control and Prevention；Academy ofPreventive Medicine，Shandong University，Shandong Provincial Key Laboratory of Infectious Disease Control and Prevention，

Jinan 250014，China）

Abstract：To understand the detection，genotype distribution and molecular epidemiological characteristics ofthe Norovirus（NoV） in domestic sewage，and further explore the need for environmental surveillance tech⁃niques to study regional epidemics of viral gastroenteritis，we collected sewage in Jinan and Linyi of Shandongprovince from January to December in 2016. 24 sewage samples were concentrated by anion membrane adsorp⁃tion-elution method，the viral RNA was extracted，and the NoV VP1 gene fragment were amplified by RT-PCR. After TA-cloning and sequencing，the obtained sequences were subjected to genotyping and phylogenet⁃ic analysis. The results showed the detection rate for NoV GI and GII in the sewage samples were both 100%.We obtained 412 NoV sequences totally，which belonged to 6 GI genotypes and 8 GII genotypes. GI. 6（32.3%，133/142），GII.3（14.1%，58/412）and GII.17（25.7%，106/412）were the most frequently detected.GII.17 detection sequences all belonged to the Kawasaki 308 variant. GII.4 sequences，which caused pandemicin previous years，occupied for only 1.0% of total detection，and belonged to Sydney 2012 variant. This studydescribes the genotype distribution and sequence characteristics of local NoV in Shandong province and provesthat the genetic diversity of NoV in the population can be explored through the monitoring of urban sewage.Key words：Norovirus；Acute gastroenteritis；Molecular epidemiology；Environmental surveillance

Funding：The present work was supported by Taishan Scholar Program of Shandong Province（ts. 201511105），the National Natural Science

Foundation of China（81573209）and the Natural Science Foundation of Shandong Province（ZR2014HM076）.

∗ Corresponding author ：SONG Yanyan，E-mail：yysong@sdu.edu.cn；XU Aiqiang，E-mail：aqxuepi@163.com

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