CATALAZA Peroxid de Hidrogen:Peroxid de Hidrogen Oxidoreductaza
Transcript of CATALAZA Peroxid de Hidrogen:Peroxid de Hidrogen Oxidoreductaza
CATALAZA Peroxid de hidrogen:peroxid de hidrogen oxidoreductaza
(EC 1.11.1.6)
Sursa de obtinere: celule aerobeLocalizare : peroxizomiFunctie: protectia celulelor de efectele toxice ale peroxidului de hidrogen prin catalizarea reactiei de descompunere a acestuia in oxigen molecular si apa, prevenind formarea radicalilor liberi Structura cuaternara: tetramer alcatuit din 4 holosubunitatiMasa moleculara: 220.000 – 350.000 kD Grupare prostetica: 1 molecula hem / subunitate Cofactor: suplimentar NADH/NADP in cazul unor specii
Reactie totala: 2 H2O 2 ------> 2 H2O +O2
Mecanism propus:
H2O2 + Fe(III)-E --> H2O +O=Fe(IV)-E (1) H2O2 + O=Fe(IV)-E --> H2O + Fe(III)-E (2)
CATALAZA (EC 1.11.1.6),
Escherichia coli Proteus mirabilis
Biosinteza catalaza de origine microbianaSursa de obtinere : celule de Micrococcus lysodeikticus Bacterie Gram + Sensibilitate la actiunea lizozimului (muramidaza-EC 3.2.1.17) asupra peptido- glucanului din peretele celular ce actioneaza asupra legaturilor -1,4 dintre acidul muramic si resturile glucozamidiceParametrii biosintezei volum de lucru raport inoculare temp de lucru debit de aer in perioada de lag si in urmatoarele ore agitare pH mediu initial antispumant durata procesuluiProcedee de conditionare a albusului de ou
DeshidratareLiofilizare in absenta de conservanti/stabilizatori in prezenta de zaharoza 10% in prezenta zaharoza 10% si gelatina 20%Atomizare
SCHEMA DE LUCRUMod de lucru
Preinocul pe tuburi cu geloza inclinata24 h 370 C
Inocul: cultura agitata pe mediu la 300 C, 24 h
Mediu minimal de geloza
Mediu nutritiv agarizatColonii izolate din cultură conservata prin liofilizare
Selectie naturala in functie de capacitatea de biosinteza a catalazei
Biosinteza in cultura submersa, la 300 C, 18-20h
Separare prin centrifugare
Purificare parţială Celule
Mediu de cultura sterilizat
Liza enzimatica Lizozim
Tampon fosfat de sodiu 0,1M pH 7,0 in prezenta de NaCl 0,5-2%
Celule Micrococcus lysodeikticus
Precipitare fractionata cu alcool etilic 50-80% v/v
Conditionare albus de ouTemp 370 C
Centrifugare
Supernatant
Proteine balast
Debriuri celulare
Temp 250 C
Temp 50 C
Precipitare fractionata cu alcool etilic 0-50% v/v
Centrifugare
Supernatant 80% alcool etilic
Precipitat
Alcool etilic 90% v/v
Alcool etilic 90% v/v
Recuperarealcool etilic
Solubilizare
Omogenizare prin agitare magnetica
Centrifugare Particule insolubile
Solutie de catalaza
Conditionare
Produs finit: CATALAZA
Aspect: lichid de culoare bruna, fara rezidii de decantare
Proprietati fizico-chimice: complex solubil in apa
Activitate catalazica: min 50.000 UI
Proprietati microbiologice : nu se admite prezenta germenilor patogeni
Filtrare sterila
Glicerina
Apa distilata
Metoda colorimetrica de dozarea activitatii catalazeiPrincipiul metodei: bicromatul de potasiu in mediu acid este redus de peroxidul de hidrogen la acetat cromic, care poate fi colorimetrat la 570 nm.
Catalaza2H2O2 ------> 2H2O +O2
+K2Cr2O7(mediu acid)----->acetat cromic
Reactivi si solutii:1.Reactiv bicromat-acid acetic glacial2. Tampon fosfat de potasiu 0,01 M pH 73. Solutie H2O2 0,08 M (solutie stoc pentru construirea curbei etalon)
Determinarea activitatii enzimaticeProba Martor Blanc
Preparat enzimatic (ml) 0,1 - -
Apa distilata - - 0,1
Tampon (ml) 0,4 0,4 0,4
Solutie apa oxigenata 0,16M (ml)
0,5 0,5 0,5
Timp de reactie 30 secunde
Reactiv bicromat (ml) 2,0 2,0 2,0
Preparat enzimatic (ml) - 0,1 -
Incubare 10 min pe baia de apa la fierbere
Racire probe la temperatura camerei
Colorimetrare la 570 nm
Calculare rezultate pe baza curbei de etalonare si exprimarea activitatii in moli H 2O2 consumat/ml preparat enzimatic/min