CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA...
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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEN-INTI Materia de Especialización CEBI_E4b Ingeniería Genética y Metabólica Módulo Ingeniería Metabólica Docente a cargo: Dra. Ana Paula Domínguez Rubio
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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEN-INTI
Materia de Especialización CEBI_E4b
Ingeniería Genética y Metabólica
Módulo Ingeniería Metabólica
Docente a cargo: Dra. Ana Paula Domínguez Rubio
Organismos transgénicos
involucrados en Biotecnología
•BACTERIAS (i.e.: Escherichia coli)
•HONGOS (i.e.: Saccharomyces cereviseae)
•ALGAS (i.e.: Chlamydomonas reinhardtii)
•PLANTAS
• CULTIVOS CELULARES de INSECTOS
•ANIMALES: PECES, AVES y MAMÍFEROS (bovinos, caprinos, ovinos, porcinos).
- HUMANOS: Transgénesis parcial Terapia Génica
- TAMBIÉN CULTIVOS CELULARES
¡Proteínas necesitan modificaciones postraduccionales!
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
• Los sistemas en procariótas son generalmente más baratos, pero…
…las proteínas eucariotas producidas en procariotas son inestable o
poseen falta de actividad biológica debido a que no se pliegan
correctamente o no poseen modificaciones postraduccionales
Además poseen contaminantes inaceptables luego de la purificación
Producción de proteínas heterólogas en células eucariotas
Organismos transgénicos
involucrados en Biotecnología
¡Proteínas necesitan modificaciones postraduccionales!
¡No siempre un polipéptido recién sintetizado e suna proteína funcional!
Organismos transgénicos
involucrados en Biotecnología
¡No siempre un polipéptido recién sintetizado e suna proteína funcional!
Además de un correcto plegamieno y la posible formación de puentes
disulfuro (estructura terciaria) hay diversas reacciones químicas que son
necesarias para que sean funcionales…
• Ruptura protéolítica (clivaje)
• Enlaces disulfuro: mediante la enzima disulfuro isomerasa presente
en las células eucariotas que cataliza la oxidación de los grupos
sulfhidriloo grupos tiol (-SH2) entre residuos cisteína
• Agregado de grupo químico:
- Acetilación
- Metilación
- Fosforilación
- Lipidación
- Glicosilación ligada a O- o N-
Alrededor del 30% de las proteínas eucarióticas son
glicosiladas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Algunas modificaciones postraduccionales
• Para todas estas posibilidades se han desarrollado vectores, muchos de
ellos disponibles comercialmente.
• Todos tienen ventajas e inconvenientes, y la elección de uno u otro viene
determinada por los requerimientos de la proteína a expresar.
• Esto es así porque la actividad adecuada de una proteína es el resultado
de una síntesis sin errores, acompañada de la generación de una
estructura que puede requerir modificaciones postraduccionales
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Vector de expresión
Compatibles con el huésped
• Luego de seleccionar el organismos a utilizar elección del vector
a utilizar
Los microorganismos más utilizados para la síntesis de proteínas recombinantes
son las bacterias, más concretamente la especie Escherichia coli.
- Fácil de cultivar y de modificar genéticamente.
- Síntesis de proteínas de alto rendimiento, y puede acumular proteínas
recombinantes en una proporción que puede llegar hasta el 80% de su peso
seco, lo que hace que sea la primera posibilidad que se tiene en cuenta
cuando se quiere expresar proteínas recombinantes.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Síntesis en bacterias
Las bacterias son ideales para producir proteínas de pequeño
tamaño que no requieran modificaciones postraduccionales.
Síntesis en bacterias
No son tan idóneas para sintetizar proteínas de gran tamaño o procedentes
de organismos eucariotas.
Las proteínas eucariotas poseen plegamientos complejos que incluyen muchos
puentes disulfuro o que necesitan la intervención de chaperonas celulares en
el plegamiento, características no presentes en los procariotas.
Además, muchas de estas proteínas requieren para su función la inclusión de
modificaciones tras su síntesis, que no pueden llevarse a cabo en organismos
procariotas. Un ejemplo de ello es la glicosilación, esencial para la función de
muchas proteínas eucariotas.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
La glicosilación no siempre es necesaria para la actividad de
una proteína (por ejemplo, el interferón gamma comercial
producido en bacterias no está glicosilado), pero hay casos en
los que es esencial; de hecho, es la razón por la que muchos
anticuerpos producidos en bacterias no reconocen su diana
eucariota.
Síntesis en bacterias
Un efecto colateral experimentado por las bacterias cuando son forzadas a
producir una proteína a concentraciones elevadas es la generación de cuerpos
de inclusión, que no son más que agregados citoplasmáticos insolubles de
dicha proteína.
Las proteínas que forman los cuerpos de inclusión son inactivas y además
suelen mostrar artefactos estructurales, como puentes disulfuro no nativos, tanto
intra como intermoleculares y cisteínas libres no habituales.
Para estos casos se han desarrollado métodos de procesamiento de cuerpos de
inclusión, con el fin de aislarlos, solubilizarlos con agentes desnaturalizantes,
eliminar los puentes disulfuro y renaturalizar la proteína a su forma activa.
Como alternativa, se han desarrollado también aproximaciones para reducir la
producción de cuerpos de inclusión, que incluyen el direccionamiento de la
proteína hacia el espacio periplásmico y el crecimiento de las bacterias a
temperaturas inferiores a las estándar.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Síntesis en bacterias
Los bacilos Gram-positivos (género Bacillus) son también buenos productores de
proteínas a nivel bacteriano.
Además, no producen cuerpos de inclusión, no generan exo ni endotoxinas (lo
cual los hace interesantes para la producción de proteínas de utilidad médica) y
suelen excretar las proteínas sintetizadas directamente al medio de cultivo,
facilitando mucho su posterior purificación.
Una desventaja de estos microorganismos es la generación de gran
cantidad de proteasas que a veces destruyen la proteína que se quiere
producir.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Las levaduras
Las levaduras presentan muchas de las ventajas en cuanto a crecimiento de las
bacterias (alto rendimiento, estabilidad de la cepa productora, crecimiento a alta
densidad, productividad, crecimiento en medios baratos y químicamente
definidos).
Además, al ser eucariotas son capaces de glicosilar y de plegar proteínas
complejas, incluyendo aquellas que tienen un número elevado de puentes
disulfuro, ya que su proceso de producción es muy similar al de las células de
mamífero.
La adición de un péptido señal en el gen permite la excreción de la proteína al
medio de cultivo.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Las levaduras
Además, algunas levaduras, como S. cerevisiae, tienen
una larga historia de utilidad en procesos de fermentación
industrial (GRAS).
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Pueden darse casos de hiperglicosilación que también pueden influir
negativamente en la actividad de la proteína a producir.
Las levaduras
Otro aspecto en el que las levaduras se muestran como valiosos productores de
proteínas recombinantes es la disponibilidad de algunos promotores muy
fuertes y de regulación muy precisa, sobre todo en las levaduras metilotrofas,
como Pichia, Candida, o Hansenula.
Entre otras ventajas de los metilotróficas ya explotadas o en estudio, destacan
su capacidad para crecer en soluciones de metanol, eliminando virtualmente
otros microorganismos competidores o contaminantes y la posibilidad de
integrar múltiples copias del vector en su genoma, dando lugar a transformantes
estables.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
En los últimos años, ha habido un interés creciente en la explotación de
microalgas en la biotecnología industrial.
Potencialmente, estos eucariotas fototróficos podrían ser utilizados para la
síntesis de bajo costo de metabolitos bioactivos y proteínas recombinantes.
El cloroplasto de las algas representa un
objetivo atractivo para ingeniería genética
resulta en un alta expresión de proteínas
de expresión estable
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Las ventajas clave cuando se comparan con una o más de las plataformas
heterotróficas tradicionales tales como Escherichia coli, levadura o células CHO
incluyen:
(i) el cultivo fototrófico de bajo costo del alga en fotobiorreactores estériles
controlados utilizando un medio simple y económico;
(ii) el estado generalmente reconocido como seguro (GRAS) de varias especies
de algas, Chlamydomonas reinhardtii, posibilitando la administración oral de
productos bioactivos en algas enteras y, por lo tanto, evitando la costosa
purificación; y
(iii) el orgánulo del cloroplasto como un compartimento de biosíntesis y
almacenamiento ya que contiene su propio sistema de síntesis
Origen de célula eucariota
DNA del cloroplasto: plastoma
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Uso del cloroplasto para la expresión de proteínas recombinantes
en lugar del núcleo
Varios beneficios:
- inserción precisa en el genoma del cloroplasto (o "plastoma") a través de la
recombinación homóloga
- expresión de alto nivel que no está sujeta a mecanismos de silenciamiento
génico
- posibilidad de expresar transgenes múltiples como operones
- acumulación de las proteínas recombinantes en un compartimiento donde la
formación de enlaces disulfuro ocurre fácilmente pero se evitan las
glicosilaciones indeseables
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Uso del cloroplasto para la expresión de proteínas recombinantes
en lugar del núcleo
Desventajas:
Necesidad de desarrollar herramientas moleculares mejoradas que aborden
algunas de las limitaciones técnicas actuales en la generación de líneas
transgénicas de C. reinhardtii
Específicamente, hay una necesidad de un un método simple y confiable para
generar rápidamente líneas transgénicas y, a su vez, que evite el uso de genes
bacterianos de resistencia a antibióticos
Actualmente, la transformación típicamente implica el bombardeo con
micropartículas recubiertas de ADN (biobalística) que es costoso y el uso de
genes bacterianos aadA o aphA6 como marcadores seleccionables que confieren
resistencia a espectinomicina y kanamicina, respectivamente
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Nueva cepa y vectores de expresión:
1) Transformación se logra mediante un método de agitación simple y barato: un
suspensión de ADN / célula con perlas de vidrio (no métodos de biobalística)
- mutación cw15 nuclear que da como resultado un fenotipo deficiente en la
pared celular
2) Selección basada en el rescate fototrófico (no uso de antibióticos)
- cepa ΔpsbH (gen esencial del fotosistema II psb)
- vectores de expresión llevan el marcador psbH y están diseñados para
permitir la clonación simple de un GOI con el promotor y la región 5 'no
traducida (UTR) de varios genes de cloroplastos.
- Estrategia sencilla de PCR para confirmar tanto la integración correcta del GOI
Para validar estas nuevas herramientas, hemos creado una línea transgénica
que expresa un gen sintético que codifica la hormona del crecimiento humano
(hGH) y muestra que hGH es biológicamente activo.
Algas transgénicas: Estrategia para la generación de algas transformantes sin
tener que seleccionarlas con antibióticos
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Cepa a transformar
Cepa transformada
-Bloqueada la capacidad
fotosintética y dependientes de
acetato
-Resistente a espectinomicina
Las flechas rojas indican el conjunto
de tres cebadores utilizado para
determinar la homoplasmia
El plásmido transformante
contiene el casete de gen de
interés (GOI) que comprende un
promotor de cloroplasto/elemento
5'UTR de un gen de
cloroplasto/secuencia de
codificación del GOI/elemento
3'UTR de un gen de cloroplasto.
gen esencial del fotosistema II psb
-Capacidad fototrófica
-No resistente a espectinomicina
Ya se parten de una cepa sin pared celular
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
a Se construyeron diferentes vectores que contenían un promotor/región 5'UTR
de diferentes genes de cloroplastos: pASapI (atpA), pSRSapI (psaA-exón 1),
pPSapI (psbA) y pCSapI (chlL).
Diseño de vectores de expresión y esquema de clonación
b El posicionamiento del sitio SapI en el
vector y en cualquier gen de interés
permite una fusión perfecta para el codón
de inicio ATG
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Los cebadores fueron F1, R1 y R2 .
La presencia de una banda de 1134 pb
confirma la integración exitosa de ereB
La ausencia de la banda de 880 pb que surge
de las cepas transformadas son
homoplásmicas
GOI: resistencia eritromicina (ere)
b Crecimiento de algas transformandas: control
careciendo de ereB (TN-C) y tres transformadas
con el gen de resitencia a ereB en placas de agar
que contienen concentraciones crecientes de
eritromicina
PCR a partir de DNA genómico de algas transformadas
a. Confirmación por PCR de integración del GOI y homoplasmia de algas
transformantes
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
control de carga
E. coli
C. reinhardtii
C. reinhardtii
Western Blot expresión
PCR: integración génica
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
TN72 :: pSRSapI-hGH (TN-hGH) se comparó con un extracto de control
TN72 :: pSRSapI (TN-C) control. Le agregan hGH al lisado celular control por si
la proteína está interfiriendo con otros compuestos celulares.
Western Blot
control de carga
Cepa control + hGH
Algas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Actividad de hGH
Ensayo de proliferación celular en las células Nb2-11
Las células fueron privadas de alimento durante 24 horas. Se añadió hGH
provenientes de extractos de C. reinhardtii recombinante y se midió
proliferación celular a las 96 h.
TN72 :: pSRSapI-hGH (TN-hGH) se comparó con un extracto de control
TN72 :: pSRSapI (TN-C) control.
Sistemas de expresión en células de insecto
La inmensa mayoría de polipéptidos excretados por eucariotas están
glicosilados, pero hay que tener en cuenta que el patrón de glicosilación de un
determinado polipéptido es específico de especie, tejido y célula. De hecho
se habla muchas veces de la glicosilación como un nivel adicional de
especificidad en ciertas interacciones protéicas.
Las células de insecto son capaces de llevar a cabo modificaciones
postraduccionales mucho más complejas que las levaduras, abarcando no
sólo glicosilaciones más específicas, sino también fosforilaciones,
procesamiento de péptidos señal, procesamientos proteolíticos correctos,
acilaciones, carboximetilaciones, etc.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Sistemas de expresión en células de insecto
Además, tienen la mejor maquinaria disponible para el plegamiento de proteínas
de mamífero (aparte de los propios mamíferos)
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Sistemas de expresión en células de insecto
Las células de insecto son transformadas mediante vectores basados en
baculovirus, que son virus patógenos específicos de insectos y otros
artrópodos.
Un vector de este tipo infecta fácilmente cultivos de células larvarias de insectos
de manera muy específica. Los vectores de insecto aprovechan el fuerte
promotor de la polihedrina del virus, una proteína no esencial para la infectividad
del virus y que puede eliminarse sin problemas del constructo.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Sistemas de expresión en células de insecto
Entre las desventajas de este sistema de expresión se cuentan la necesidad de
establecer empíricamente los patrones de procesamiento postraduccional para
cada construcción, la necesidad de añadir en determinados casos señales
específicas de insecto para asegurar la secreción.
A pesar de ser mejor que en levaduras, en muchos casos no es la
requerida para el correcto funcionamiento de la proteína.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Células de mamífero como factorías de producción.
El uso de cultivos celulares de mamífero, concretamente de células de ovario
de hámster chino (CHO) comenzó en los primeros tiempos de la
biofarmacéutica, a raíz de la necesidad de producir eritropoyetina y activador
tisular de plasminógeno. Desde entonces, las células CHO se han constituido
como los sistemas preferidos para la producción de anticuerpos monoclonales
y otras proteínas recombinantes.
El número y especie de células productoras ha ido aumentando con el tiempo.
Actualmente se utilizan mielomas de ratón (NS0), de riñón de hámster (BHK),
de simio y de humano (BHK).
Los biofármacos producidos a partir de sistemas de mamífero alcanzaron en
2006 ventas superiores a los 20 millones de dólares. Entre las especies
moleculares producidas se cuentan hormonas (como la gonadotropina
coriónica o la hormona luteinizante) y anticuerpos, quizá las proteínas de más
difícil expresión a gran escala, debido a sus requerimientos de plegamiento y
glicosilación.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Células de mamífero como factorías de producción.
Si bien parecen ser las únicas opciones viables para proteínas complejas en las
que la estructura y posterior modificación son críticas, los sistemas basados en
cultivos celulares adolecen de un rendimiento bajo comparado con los
procariotas y las levaduras.
Además, el cultivo y mantenimiento de cultivos celulares de este tipo es caro, al
requerir condiciones más restrictivas en cuanto a ambiente y sistema de cultivo.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Esto repercute en el precio final del producto. Validar
las plantas de producción de estos sistemas es
también caro y presenta requerimientos adicionales
de bioseguridad para conseguir la aprobación por
parte de las agencias reguladoras, ya que cualquier
contaminante de un cultivo celular de mamífero es
susceptible de pasar al paciente que recibe la
medicación.
Células de mamífero como factorías de producción.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Dificultades suplementarias
• Las células animales necesitan condiciones de asepsia muy estrictas
• Mayor tiempo de división que procariotas
• Adhesión obligatoria: ciertas líneas de células de mamíferos necesitan un
soporte para ser viables presenta un problema de escalado
• Insumos muy complejos caros: medio de cultivo, suero fetal
Células de mamífero como factorías de producción.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Animales transgénicos
Los animales producen secreciones susceptibles de ser utilizadas como vehículo
para la expresión de proteínas heterólogas.
De hecho, se están utilizando animales transgénicos que producen proteínas
recombinantes en la leche, la clara de huevo, la sangre, la orina, el plasma e
incluso en los capullos de seda.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
La idea básica es sencilla: aprovechar los
mecanismos de producción de estos fluidos para
incluir en los mismos la proteína de interés, con la
ventaja de una purificación sencilla y un bajo coste.
Además, en la mayoría de los casos la proteína
producida es tan activa como la nativa.
Animales transgénicos
El uso de las glándulas mamarias para producir proteínas en la leche ha sido uno
de los más explorados. Normalmente, la proporción de proteína recombinante con
respecto a la total de la leche es baja. Pero, haciendo algunos números, si
tenemos en cuenta que una vaca puede producir en un día treinta litros de leche,
con 35 gramos de proteína total por litro (o sea, un kilo de proteína por día), una
producción de proteína de interés de sólo dos gramos por litro se traduce en unos
asombrosos diez kilos por año de proteína recombínate.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Entre las proteínas producidas podemos contar el
activador tisular de plasminógeno en leche de cabra,
alfa-1-antitripsina en leche de oveja, o la proteína C
humana en leche de cerdo.
Animales transgénicos
Sin embargo, la generación de un animal transgénico es muy costosa. Se necesita
personal muy cualificado e instalaciones especiales y además, las tasas de éxito
son bajas.
A nivel industrial, la desventaja principal en el caso de los animales transgénicos
es el tiempo para asegurar niveles de producción que van desde los tres a los 32
meses dependiendo de la especie, tiempo en el cual hay que mantener a los
animales sin que produzcan beneficios.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Además hay que tener en cuenta los gastos en cuanto a
alimentación e instalaciones para conseguir mantener
una cabaña de animales sostenible en el tiempo, que
además cumpla con los criterios de las agencias.
Por todas estas razones, la industria de los animales
transgénicos productores no ha sufrido el despegue
esperado.
Las plantas transgénicas.
Las plantas, en comparación con los animales y los cultivos procedentes de
animales, ofrecen una producción más segura y rápida, que requiere menos
tiempo y es más ventajosa en términos de almacenamiento y distribución.
En cuanto a seguridad, presentan menos riesgo de contaminación con patógenos
animales, ya que no son infectadas por virus animales y los virus vegetales a su
vez no son transmisibles al ser humano.
El escalado es mucho más barato: se necesita únicamente agua, fertilizantes y sol
para lograr cultivos a gran escala. Por si fuera poco, el producto es susceptible de
producirse envasado de forma natural (en los frutos o las hojas) para su
transporte y conservación estable.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Las plantas transgénicas.
Las plantas son capaces incluso de producir proteínas complejas de varias
subunidades, como anticuerpos funcionales.
Otros productos que se han producido con éxito son la beta-D-glucuronidasa, la
avidina y la tripsina, así como antígenos para vacunas como el antígeno de
superficie del virus de la hepatitis B.
Sin duda la síntesis de proteínas recombinantes a partir de plantas es aún un
camino en vías de explotación.
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Plantas transgénicas
No sólo producción de proteínas eucarioas producción de proteínas procariotas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Antiparasitarios
Bacillus thuringiensis
Cristal de proteínas (cuerpo paraesporal)
denominadod endotoxina. Tóxica para
algunos insectos principalmente:
coleópteros, lepidopteros y dípteros.
Clasificación por forma del cristal o por espectro de acción:
Cry I son tóxicos para lepidópteros
CryII son tóxicos para lepidópteros y dípteros
Cry III son tóxicos para coleópteros
Cry IV son tóxicos para dípteros. Interés especial en mosquitos.
B.popillae;B.sphaericus;B.morati TEM of B. thuringiensis, spore (S), and
crystal (C). Magnification 40.000x.
Plantas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Mecanismo de acción
Insectos ingieren toxinas diseminadas en hojas o en el ambiente.
Proteínas Cry producidas como protoxinas. Procesadas por proteasas
presentes en el intestino de insectos susceptibles.
Selectividad de las toxinas Cry:
Interacción con receptores específicos
presentes en las microvellosidades de
células del intestino larval.
Toxinas se insertan en la membrana,
formando un poro lítico.
Plantas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Plantas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
PCR analysis of untransformed and putative chloroplast transformants using two
primer sets.:(B) 1P1M and (C) 3P3M.
pLDBD Cry2Aa2 operon (9.8 kb) with PCR primer binding sites and expected
fragment sizes.
Chloroplast expression vector
Lane 1, 1 kb ladder;
Lane 2, untransformed;
lanes 3–7, pLD-BD Cry2Aa2
operon putative transformants;
lane 8, pLD-BD Cry2Aa2 operon
plasmid DNA.
Vector de integración
Plantas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
10% SDS–PAGE gel stained with R-250 Coomassie blue.
Loaded protein concentrations are provided in parentheses.
Lane 1, prestained protein standard;
lane 2, partially purified Cry2Aa2 protein from E. coli (5 µg);
lane 3, single gene-derived Cry2Aa2 pellet extract solubilized in 50 mM NaOH (22.4 µg);
lane 4, single gene-derived Cry2Aa2 supernatant (66.5 µg);
lane 5, operon-derived Cry2Aa2 pellet extract solubilized in 50 mM NaOH (22.9 µg);
lane 6, operon-derived Cry2Aa2 supernatant (58.6 µg);
lane 7, untransformed tobacco pellet extract solubilized in 50 mM NaOH (29.8 µg);
lane 8, untransformed tobacco supernatant (30.4 µg).
Crystalline Cry2Aa2 inclusion
bodies are solubilized at high
alkaline pH
Plantas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Protein quantification by ELISA in young, mature, and old transgenic leaves.
(B) Operon-derived Cry2Aa2 expression
shown as a percentage of total soluble
protein.
(A) Single gene-derived Cry2Aa2
expression shown as a percentage of total
soluble protein.
Plantas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Transmission electron micrographs.
Operon-derived
Cry2Aa2 leaf
sections in
young (A),
mature (B, D), and
old, bleached leaf
(C).
E) Single gene-derived Cry2Aa2 mature leaf;
(F) Mature untransformed leaf.
Plantas transgénicas
Producción de proteínas heterólogas
en células eucariotas
Insect bioassays
(A–C) bioassays with Heliothis virescens;
(D–F) bioassays with Helicoverpa zea;
(G–I) bioassays with Spodoptera exigua.
(A, D, G) Untransformed tobacco leaves;
(B, E, H) single gene-derived Cry2Aa2 transformed leaves;
(C, F, I) operon-derived Cry2Aa2 transformed leaves.
