CAROLINE DUPERRONcollectionscanada.gc.ca/obj/s4/f2/dsk3/ftp05/mq25567.pdf · CAROLINE DUPERRON...
104
CAROLINE DUPERRON PRÉVEWTION DE LA TC'MORIGEXÈSE PULMONAIRE CHEZ LA SOURIS MJ PAR L'ASPIRINE ET LE SULINDAC Mémoire présenté à la Faculte des études supérieures de l'Université Laval pour l'obtention du grade de maître ès science (M. Sc.) JUIN 1997 QCaroline Duperron, 1997
Transcript of CAROLINE DUPERRONcollectionscanada.gc.ca/obj/s4/f2/dsk3/ftp05/mq25567.pdf · CAROLINE DUPERRON...
CAROLINE DUPERRON
PRÉVEWTION DE LA TC'MORIGEXÈSE PULMONAIRE CHEZ LA SOURIS MJ
PAR L'ASPIRINE ET LE SULINDAC
Mémoire
présenté
à la Faculte des études supérieures
de l'Université Laval
pour l'obtention
du grade de maître ès science (M. Sc.)
JUIN 1997
QCaroline Duperron, 1997
oftc&ada a
du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bibliographie Services services bibliographiques 395 Wellington Street 395, nie Wellington Ottawa ON K1A ON4 Ottawa ON Kt A ON4 Canada Canada
The author has granted a non- L'auteur a accordé une licence non exclusive licence allowing the exclusive permettant à la National Library of Canada to Bibliothèque nationale du Canada de reproduce, loan, distriiute or sel1 reproduire, prêter, distn'buer ou copies of this thesis in microform, vendre des copies de cette thèse sous paper or electronic formats. la fome de microfiche/nIm, de
reproduction sur papier ou sur format électronique.
The author retains ownership of the L'auteur conserve la propriéte du copyright in this thesis. Neither the droit d'auteur qui protège cette thèse. thesis nor substantial extracts fkom it Ni la thèse ni des extraits substantiels may be printed or othenivise de celle-ci ne doivent être imprimés reproduced without the author's ou autrement reproduits sans son permission. autorisation.
De nombreuses études, effectuées surtout chez trois espèces animales, démontrent que les anti-
inflammatoires non stéroïdiens (A[NS) peuvent inhiber ou, du moins, retarder le développement
du cancer. Nous avons déterminé si l'aspirine pouvait inhiber la tumorigenèse pulmonaire
induite par la NNK, une N-nitrosamine spécifique au tabac, chez la souris A/J. L'aspirine
commerciale, formulation non tamponnée, et l'acide acétytsalicylique ont diminué le nombre de
tumeurs, alors que la formulation tamponnée de l'aspirine commerciale n'a pas eu d'effet
inhibiteur. Nous avons confinné que le sulindac inhibe la tumorigenèse pulmonaire induite par
la NNK chez la souris M. Nous n'avons pas obtenu d'inhibition de celle-ci lorsque du BHT
était administré en même temps que le sulindac. De plus, la tumorigenèse induite par le B(a)P
n'a pas été inhibée par le sulindac. In vitro, nous avons observé que le sulindac et ses deux
métabolites, mais non I'aspirine et son métabolite, inhibaient I'activation de la NNK par le P-450
1A2 humain. Nous avons conclu que l'aspirine et le sulindac, et leur métabolites, peuvent agir
comme agents de chimioprévention, mais qu'ils different par leur mode d'action-
André Castonguay, P h-D. Caroline Duperron
AVANT-PROPOS
Ce mémoire est présenté à la Faculté des études supérieures pour le grade de M. Sc. en pharmacie. Il est présenté sous la forme d'un mémoire-article. Dans ce projet, j'ai effectué l'ensemble du travail, incluant les soins des animaux et leur sacrifice. Dans la première partie d u document, le lecteur trouvera une introduction sur le sujet, des résultats non inclus dans l'article et une conclusion générale. Dans la section méthodologie, une attention spéciale est portée sur la description du dosage biologique, afin de servir d'outil de référence. La deuxième partie du mémoire est constituée d'un article rédigé en anglais (Carcinogenesis, vol. 1 8 n05, pp. 1 00 1 - 1 006, 1997). Il e n précédé d'un résumé en fiançais.
La réalisation de ce projet a été rendu possible grâce à une subvention de la Société de Recherche sur le Cancer du Canada Inc. Toutes les manipulations effectuées su . les animaux et mentionnées dans ce mémoire ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de l'Université Laval et supem-sées par la vétérinaire de l'animalerie.
Mes premiers remerciements vont à mon directeur de recherche, le Dr André Castonguay, pour sa disponibilité et son encadrement tout au long de mon programme de maîtrise.
Je remercie également le Dr Pierre-Maxime Bélanger pour ses précieux conseils sur le HPLC et le Dr MarIène Brouillon pour son aide en culture cellulaire.
Enfin, je tiens a remercier Denise Lévesque, vétérinaire, ainsi que le personnel de l'animalerie pour leur soutient et leurs conseils lors du dosage biologique.
Mon dernier merci va a ceux qui me sont chers et qüi m'ont soutenu et encouragé sans relâche.
I * * RESUME. ............. ...RESUME..................................RESUME.................................. RESUME.................................. .- RESUME.................................. . RESUME.................................. RESUME..................................RESUME.................................. RESUME..................................RESUME.................................. RESUME.................................. ..- - -. .. . .... RESUME.................................. RESUME................................... RESUME.................................. . . RESUME..................................RESUME..................................RESUME..................................RESUME.................................. . RESUME..................................RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME..................................RESUME.................................. . RESUME.................................. RESUME..................................RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME..................................RESUME..................................RESUME..................................RESUME....................................RESUME.................................. ... RESUME.................................. . RESUME..................................RESUME..................................RESUME.................................. ... . . .. RESUME................................... RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME.................................. . .RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME..................................RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME..................................RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME.................................. . . RESUME.................................. RESUME..................................RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME..................................RESUME.................................. RESUME..................................RESUME.................................. . . . . RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME..................................RESUME.................................. RESUME.................................. .. . RESUME.................................. RESUME.................................. RESUME.................................. 11
-. . AVANT-PROPOS.. . . . . .AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ . AVANT-PROPOS............................ . AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ . . AVANT-PROPOS.............................AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ . AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ AVANT-PROPOS............................ . . . . . . . . . . ... .. .. . . . - --. -- --. - . . . . -. . -. . -. .-. . . . . *. . . . . . . . . . . - -. -. . . . . . . . . . . I I i . TABLE DES MATIERES. ... ..... . ......................................... ..--.-..-..-.. ..... .. ...... .....--.- .. .-. .... .---... iv-v
. . LISTE DES FIGURES ............. - -..--..........-.-*...-......-.... ..VII
INTRODUCTION I .
I .O CANCEROGENESE PULMONAIRE.. .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . .. . . . . - . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .-. . . . - 1
1 . 1 Epidémiologie ...................................................................................................... 1 ' .
3 1.2 Etiologie ............................................................. .... .............-........-.+-...............-
1.3 Mécanisme de cancéropnèse. .. . . . . . - .. . .....-. . .-. ... . . -. . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . -. . . . -. . -4
1 -4 Métabolisme de Ia M. .. .... . .. .,. ..... ...................... ..,., .. . ......... .. ..... ... .. ... . . .. ..... .. ..S
1.5 Benzo(a)pyène .................................................................................................... 7
1.6 BHT ...................................................................................................................... 8
7.0 ANTI-~AMMATOIRES NON-STERO~DIRIS (AM S ). . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . ............ . . -9
2.1 Consommation, ctassification et utilisations des A N S ................. ...........-.-.... .. ..9
2.2 Aspirine ........-... ..-................-.. . .......................... . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1
3.3.1 Consommation, utilisation et propriétés pharmacologiques .................. 1 1
2 - 2 2 Chimioprévention chez I'humain ........................................................... 12
3-23 Chimioprévention du cancer chez les animaux.. .. . . . . . . . . -. . . . . . . . . . . . . .-. . . . . . . 1 4
2.3 Sulindac.. , . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . .. . . . . . .-. .. . . .. .. . .. . . . . . . -. . .-. . -. . . . . . . . -. - - ... -. . . . . . . .. + -. 1 5
Z3.l Consommation, utilisation et propriétés pharmacologiques ...-.-............ 15
2.3 -2 Chimioprévention du cancer chez l'humain.. . . . . . . . . .. . .. . .. . .-. . . . . . . . . . . . .. . . . .. . 1 6
2.3 -3 Chimioprévention du cancer chez les animaux.. . .. . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . - -. . . -. -. . . 1 6
3.0 CHIMIOPRÉVENTION DE LA CANCÉROGENÈSE PULMONAIRE.. . . . . . . . - -. -. . . - 1 7 . . . - ,
3.1 Principes de chimioprevention ...---. .. ..-........... ........ .......... .. . .. ........ ..... ... ...... . . ......... .. - 1 7
3.2 Relation entre cytochromes P450, A I N S et chimioprévention ......................... 20
3.3 Avantages du dosage biologique et du système cellulaire in vitro .................... 22
3.0 BUT ET OBJECTIFS DU PROJET .......................................................................... 23 3 ............. 4.1 But général ... ................................................................................... -22
. * . . 4 2 Objectifs specifiques ........................................................................................ - 2 4
CWITRE I: RÉSCTLTATS . 1.0 RESULTATS NON PUBLIES .......................................................
1 -1 Introduction ........................................................................................................ 35
1 -2 Méthodologie .................................................................................................... 2 5
1 -3 Résultats ............................................................................................................. 40
1 -4 Discussion et conciusion .............. ... ............................................................ 44
2.0 CKEMOPREVENTTVE EFFICACES OF ASPEI'N AND SULINDAC AGAINST
LUNG TUMOREENESIS IN Ad MICE ............... ... .............. .. ................................ 47
7.1 Résumé français ................................................................................................. 47
3-2 Article ................................................................................................................. 38
2.3 Références bibliographiques de l'article ..................................................... .. ..... 67
I r
CONCLCSION GEXERALE .................................................................................................. 73 . .
REFERENCES DU MEMOIRE .............................................................................................. 74
ANNEXES .................................................................................................................................. 85
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Classification des A I N S ............................................................................................... 10
Tableau II: Stratégies de traitements avec un cancérogène et un agent potentiellement chimiopréventif (XXX), pour déterminer à quel moment ce dernier serait le plus
.......................................................................................................................................... efficace 1 9
Tableau m: Dosage biologique.. ................................................................................................. -3 7
Tableau IV: Ratio foie/ poids corporel de la souris (mg), après l'administration d'AINS pendant 6 semaines ...................................................................................................................................... 40
Tableau V: Effets du sulindac et du BKT sur la turnorigenèse pulmonaire induite par la NNK ou le B(a)P.- ................................................................................................................-..........-...........- -4 1
Tableau VI: Effets des A N S sur la tumorigenèse gastrique induite par la NNK ou le ..... B( A)P.. ., .................................................................................................................................... -42
Tableau Vn: Évaluation de la stabilité de l'aspirine dans la . diete. ............................................................................................................................................... 43
Liste des tableaux de l'article
Ta bIe 1: Effects of feeding NSAIDs on Iung tumorigenesis induced by NNK in A/J mice ........ ..64
Table II: Metabolism of NNK by hlA2 v2 cells cultured with or without salicylates .............. A 5
Table III: Metabolism of NNK in hIA.2 v2 cells cultured with or without sulindac, with its sulfide and sulfone metabolites. ................................................................................................... .A6
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Formation des N-nitrosamines spécifiques au tabac ........................................................ 3
Figure 2: Voies d'activation et de désactivation métabolique de la NNK ...................................... 7
Figure 3: Structures du B(a)P et du BHT ........................................................................................ 8
Figure 4: Smctures de l'acide acétylsalicylique ( M S ) et de son métabolite, l'acide salicylique (AS) ................................................................................................................................................. 11
Figure 5: Structures du sulindac et de ses métabolites sulfide et sulfone ..................................... 15
Figure 6: Structure schématique du cytochrome P-450 ................................................................ 20
................................................................................................. Figure 7: Identification des souris 28
Liste des figures de I'article
Figure 1: Biotransformation of ASA and sulindac to their metabolites ....................................... 61
Figure 2: Metabolic pathways of NNK in hlA2 v2 cells ............................................................. 62
Figure 3: Kinetic of ASA hydrolysis with or without h l A2 v2 cells ........................................... 63
LISTE DES ABRÉVIATIONS
AINS = anti-inflammatoire non stéroldien
AAS = acide acétylsalicylique
AS = acide salicylique
ASA = acetylsalicylic acid
ASP-A = Aspirine ~ a ~ e r @ formulation non tamponnée
8 ASP-B = Aspirine Bayer formulation tamponnée
ASP-S = acide acétylsalicylique de la compagnie Sigma Chernical Co
B(a)P = benzo(a)pyrene
BHT = 3,s-di-tert-butyl-4 hydroxytoluène
D!MT = dose maximale tolérée
NAB = IV-nitrosoanabasine
NAT = N-nitrosoanatabine
NXAL = 4-(mtthy1nitrosamino)- 1 -(3-pyidy1)- 1 -butano1
NNK = 4-(méthy1nitrosamino)- 1-(3-pyn'dyl)-l -butanone
hih' = X-nitrosonornicotine
PGEz = prostaglandine EL
p.p.m. = parties par million
SA = salicylic acid
INTRODUCTION
Ce mémoire traite de la prévention de la tumongenèse pulmonaire par l'aspirine et le
sulindac, chez le modèle animal de la souris M. Nous débuterons cette introduction avec une
discussion sur la cancérogenèse pulmonaire et le rôle de la NNK, un cancérogène N-nitrosaminé
spécifique au tabac, dans ce processus. Nous enchaînerons ensuite avec les anti-inflammatoires
non-stéroïdiens (AINS) , en particulier l'aspirine et le sulindac, en présentant leurs propriétés et
leur rôle chimiopréventif chez les animaux et I'humain. Nous enchainerons avec la
chimioprévention et le rôle des cytochromes P-450 dans celle-ci, en relation avec les AINS.
Enfin, nous terminerons cette introduction en énonçant le but et les objectifs de ce projet-
En cancérogenèse, il est important de faire la distinction entre épidémiologie, I'étude des
populations, et étiologie, l'étude des causes. Nous nous attarderons plus spécifiquement au
tabagisme, un facteur épidemioloçique et étiologique important dans Ia cancérogenese
pulmonaire. De plus, nous verrons le rdle du métabolisme de la NM(, une N-nitrosamine
dérivée de la nicotine, dans la cancérogenese pulmonaire.
L'épidémiologie est l'étude des facteurs déterminant la fréquence et la distribution des
maladies dans les populations humaines. Parmi les facteurs épidémiologiques les plus courants
du cancer, on retrouve l'âge, le sexe, la distribution géographique et le mode de vie (1, 2). Par
exempie, en 1995, il était estime que 72% des nouveaux cas de cancer surviendraient chez les
Canadiens de plus de 60 ans (3) . Chez la femme, les trois cancers les plus fréquents sont les
cancers du sein (30%), du rectum et côlon (13%) et du poumon (12%). Chez l'homme, on
retrouve en premier le cancer de la prostate (24%), suivi du poumon (19%) et du rectum et côlon
(1 3%). Selon les estimés les plus récents, 1 Canadien(ne) sur 3 développerait un cancer au cours
de sa vie, dont 1 sur 4 en mourrait.
Selon Statistique Canada, le cancer du poumon demeurait la principale cause de décès par
cancer chez les Canadiens, hommes et femmes, en 1995. Depuis les années 60, le tabagisme a
sensiblement diminué chez l'homme, ce qui explique la diminution de l'incidence et de la
mortalité pour le cancer du poumon, à partir du milieu des années 80. Mais, chez la femme,
I'incidence et la mortalité par cancer du poumon sont à la hausse. Cela s'explique par le fait que
de plus en plus de femmes ont commencé à fumer dans les années 50-60, au moment ou les
hommes diminuaient progressivement leur consommation de tabac (4). Rappelons quoil y a une
période de latence d'environ 25 ans entre les effets du tabagisme et l'apparition du cancer du
poumon. P m i les provinces canadiennes, le Québec possède l'incidence et la mortalité par
cancer du poumon les plus élevés (3).
Pour le cancer du poumon, quelques décennies séparent le moment de l'exposition et
ce1 ui de I 'apparition des premiers symptômes, car le processus de cancérogenèse chimique
impliqué dans celui-ci évolue lentement. De plus, le cancer du poumon est difficile à traiter. Au
Québec, Ie t a u relatif de survie après cinq ans a été estimé a 15% chez les hommes et 20% chez
les femmes: tous les âges compris (3) . Le taux relatif de survie après cinq ans se définit comme
étant le taux de s m i e observé corrigé en fonction de I'espérance de vie normale de la population
en générale (3). Les nombreuses campagnes antitabac ne semblent pas diminuer la popularité du
tabagisme. malgré les conséquences mortelles et les coilts élevés en soins hospitaliers qu'il
entraîne. Une alternative à explorer est la chimioprévention du cancer, qui peut diminuer les
risques et le coût des soins.
1.2 Étiologie
L'agent étiologique le plus important dans le cancer du pournon est. sans aucun doute, le
tabagisme. Un rapport du Chirurgien Générai américain, daté de 1982, a conclu qu'il existait une
relation directe entre la consommation de cigarettes par adulte, Le. plus de 20 cigarettes par jour,
et le taux de mortalité par cancer du poumonoumon (15 à 25 fois plus élevé) ( 5 ) . Les agents
toxiques professionnels (amiante, hydrocarbures, pesticides, etc.), la pollution atmosphérique et
la susceptibilité génétique sont autant de facteurs étiologiques qui peuvent agir en synergie avec
le tabac et augmenter son effet nocif (2 ,6 ) .
La fumée de cigarette est constituée d'environ 4000 composantes et est séparée en deux
courants majeurs (7-9). Le courant principal de la fumée est aspire directement par la bouche du
fumeur, après avoir traversé la colonne de tabac sur sa Iongueur et le filtre (si présent). Le
courant secondaire provient du bout incandescent de la cigarette et est aspiré autant par le fumeur
que par ses voisins. Le courant principal est composé de la phase gazeuse et de particules de plus
de O. I pm de diamètre (partiellement arrêtées par le filtre).
Les constituants majeurs de la phase gazeuse sont des gaz tels que NI, 02, COZ et CO. [L
s'y retrouve également diverses particules de 0.1 pm de diamètre. La phase gazeuse est aussi
constituée d'agents biologiquement actifs, dont O ont été identifiées comme cancérogéniques.
Parmi ceux-ci, on retrouve des N-nitrosamines spécifiques au tabac, dont quatre à des taux
relativement élevés (8). Ces dernières sont formées lors du séchage de la feuille de tabac et Ion
de sa combustion. Une des plus connues est la 4-(méthylni~osamino)-I-(3-p~dy1~~-butanone
(NNK), qui est dérivée de la nicotine. Les trois autres sont la NNN, dérivée de la nicotine et de
la nomicotine, la NAB, dérivée de I'anabasine, et la NAT, dérivée de l'anatabine (Fig. 1). La
NNK et la NNN sont, parmi les quatre, les nitrosamines dont le potentiel cancérogène a été
démontré chez des modèles animaux de tumongenèse utilisant la souris, le rat ou le hamster (10,
11). De plus, des études menées avec des explants de tissu de bronche, de poumon périphérique
et de muqueuse buccale humaines ont montre qu'ils avaient la capacité de métaboliser la NNI;
(12, 13).
NNK NAT WAB
Figure 1: Formation des wnitrosamines spécifiques au tabac (tirée de la réfërence 8).
La NNK est présente dans le courant principal de la b é e des cigarettes commerciales.
Les niveaux de NNK varient de 6 a 197 ng, pour les cigarettes américaines, et de 6 a 97 ng, pour
les cigarettes canadiennes (14, 15). Le fumeur est donc directement exposé à de forts taux de
NNK. Cette dernière jouerait donc un rôle important dans l'étiologie du cancer du poumon,
compte tenu de son taux élevé dans la fumée, de son organospécificité pour le poumon et de la
capacité des tissus humains à l'activer ( i 1-1 5).
1.3 Mécanisme de csncérogenèse
Le cancer est un processus évolutif a long terme. Son développement s'échelonne sur une
période de quelques mois a plusieurs années chez un organisme vivant. Les cellules cancéreuses
se distinguent des autres par leur prolifération anomale (tumeur) et par leur capacité d'envahir et
de coloniser des tissus environnants etlou éloignés (métastases). Une tumeur est dite bénigne
tant que les cellules néoplasiques demeurent encapsulées dans du tissu conjonctif fibreux ( 16).
L'excision de la tumeur bénigne se fait facilement par chirurgie. À partir du moment où la
capsule est brisée et que les cellules néoplasiques envahissent le tissu environnant, on parle de
tumeur maligne. En effet, les cellules cancéreuses malignes se différencient des bénignes par
leurs caractéristiques phénotypiques, telles que la perte d'inhibition de contact9 l'immortalité
cellulaire, leur indépendance vis-a-vis les facteurs de croissance, etc ( 1 6, 1 7). Les cellules
cancéreuses malignes, lorsqu'elles empruntent la circulation sanguine ou les vaisseaux
lymphatiques, sont des métastases. L'endroit où elles iront se fixer et proliférer se nomme "foyer
secondaire". Une tumeur maligne avec métastases est beaucoup plus difficile à traiter. Plus il y
a de foyers métastatiques, plus les chances de guérison sont faibles.
Trois classes d'agents sont impliqués dans le développement du cancer: les agents
chimiques, physiques (dont les rayonnements ionisants) et viraux. Dans le cadre de ce travail,
seule la première classe est considérée. Les hydrocarbures polycycliques aromatiques, les N-
nitrosamines, les amines aromatiques, les aflatoxines et les métaux lourds sont les principales
classes de cancérogènes chimiques. Certains, comme les N-nitrosamines, possèdent une
spécificité pour un ou plusieurs tissus chez une espéce donnée, peu importe le mode
d'administration. Par exemple, il a été démontré, chez la souris A/J, que la NNK induit des
tumeurs pulmonaires, qu'elle soit administrée per os ou par injection intrapéritoneale (1 81. Tous
ont en commun, lonqu'ils sont sous leur forme activée, d'être électrophile et de réagir avec
l'ADN. De plus, ils sont généralement peu toxiques avant d'être bioactivés.
Il existe trois types de cancérogènes chimiques: procancérogènes, cancérogènes et
cocancérogenes. Les procancérogènes doivent être métabolisés par l'organisme pour devenir
cancérogènes. C'est le cas de la NNK et du benzo(a)pyrène (B(a)P). Les cancérogènes, comme
la P-propiolactone et la N-méthyl-N-nitrosourea, sont déjà sous leur forme active lorsqu'ils sont
absorbés par I'oqanisme. Enfin, les cocancérogènes accélèrent l'effet des procancérogènes ou
des cancérogenes. En soi, ils n'induisent pas de cancer mais ils favorisent le développement
tumoral. Le phénobarbital et les oestrogènes ne sont que quelques exemples.
Le processus de cancérogenèse chimique comprend quatre étapes: l'initiation, la
promotion, la conversion et la propagation. L'initiation est l'étape ou le cancérogène induit au
moins une mutation dans le génome d'une cellule. Cette étape est déterminante: si la cellule ne
corrige pas ceae erreur, cette dernière sera conservée et transmise à la prochaine génération
cellulaire. En second lieu, suMent la promotion. La cellule, initiée à I'étape précédente, se met
a proliférer de façon exponentielle sous l'action d'agents de promotion. Le nombre de mutations
du génome est amplifié. 11 se crée ainsi un site de cellules anormales, a croissance accélérée. La
conversion est Ioétape à laquelle les cellules initiées et en réplication subiront des mutations
additionnelles. Les cellules deviennent malignes et favorisent 1 'angiogenèse, la production
d'enzymes protéolytiques et la motilité cellulaire. À cene étape, la croissance cellulaire respecte
moins une courbe exponentielle. L'oxygénation, la vascularisation et la pression physique sont
des facteurs lirnitants pour la croissance cellulaire. Enfin, la dernière étape est celle de la
propagation. Certaines cdlules quittent la masse tumorale et empruntent la circulation sanguine
ou les vaisseaux lymphatiques pour migrer vers d'autres tissus et former des foyers
métastatiques. À ce stade de la maladie, les chances de survie de l'hôte sont très faibles.
1.4 Mkta bolisme de la h7VK
La NNK est une N-nitrosamine présente exclusivement dans le tabac. Elle est formée lors
du séchage des feuilles du tabac et Ion de la combustion de la cigarette. C'est un
procancérogène. Elle acquiert son potentiel cancérogène par bioactivation. Ceci a été démontré
avec des cellules et dans divers tissus en culture, de provenance humaine ou de rongeurs ( 10, 12,
19). Cette activation est produite, en majeure partie, par le système de monooxygénase du P-450.
Des études Nt vitro ont démontré que les cytochromes humains P-450 1A2 (surtout celui-ci), 2A6,
2D6 et ZE 1 pouvaient activer la NNK (20-25).
II existe trois voies métaboliques de la NNK (19). Elles sont illustrées à la Figure 2. La
première voie est celle de la réduction du carbonyle, où la NNK est réduite en NNAL dans les
poumons. Dans les poumons de souris, le NNAL peut être réoxydé en NNK (19). La seconde
voie métabolique est la N-oxydation du noyau pyridine en métabolites NNK-N-oxyde (#1) et
NNAL-Nsxyde (#2). La NNK serait détoxiquée par cette voie (1 9). Nous n'élaborerons pas sur
cette voie. Enfin, la voie la plus importante est celle de I'hydroxylation des carbones a au
moupement N-nitroso. Elle mène a l'activation de la NNK en intermédiaires réactifs Ci
diazohydroxydes (#7 et 9) et aldéhydes électrophiles (#8 et HCHO) (26). Ils induisent des
dommages à I'ADN en modifiant les bases. La fomation d'adduits est le résultat de l'alkylation
de la purine de ces dernieres. La 06-méthylwanine est l'adduit le plus important dans la
tumorigenese pulmonaire induite par la NNK chez la souris NJ (27). En effet, Peterson el coll.
ont démontré que la formation et la persistance de cet adduit étaient cruciales pour l'initiation de
tumeurs par la NNK. Les intermédiaires réactifs étant difficiles a isoler et à doser, il est possible
d'étudier le métabolisme de la NNK à I'aide des métabolites #12 à #15. La présence de ces
derniers confirme qu'il y a eu fomation des intermédiaires réactifs #7, 8,9 et HCHO.
Figure 2: Voies d'activation et de désactivation métabdique de la NNK (tirée de la
référence 1 3). Les stnictures entre crochet sont des intermédiaires hypothétiques
de réaction,
Le bento(a)pyrène (B(a)P) est un hydrocarbone polycyclique aromatique formé lors de la
combustion de produits industriels, de la cigarette et de la cuisson d'aliments sur le charbon de
bois (Fig. 6) (8, 28). La concentration de B(a)P dans le courant principal de la fumée d'une
cigarette sans filtre est de 20 a 40 ng (8). Une fois inhalé, le B(a)P est activé métaboliquement
par le système de monooxygénase du cytochrome P-450, en particulier le P-450 1Al dans le
poumon de souris, et forme des époxides réactifs (28, 29). Ces derniers réagissent avec l'ADN
pour former des adduits. Des études menées chez la souris A/J ont montré que le B(a)P induit
des tumeun pulmonaires, peu importe Ie mode d'administration (30, 31). Cette tumongenèse
pulmonaire est inhibée entre autre par les isothiocyanates, l'acide ellagique et le myo-inositol
(31-35). Le sulindac inhibe la turnorigenese induite par la NNK, un procancérogène retrouvé
dans la fumée de cigarette (8). Mais son efficacité vis-à-vis d'autres cancérogènes du tabac.
comme le B(a)P, n'a pas encore été démontrée.
Figure 3: Structures du B(a)P et du BHT (tirées des références 40 et 1 12).
1.6 BHT
Le 3,s-di-tert-buqd-4 hydroxytoluène (BHT) est un antioxydant qui prévient l'oxydation
des lipides (Fig. 6) (36). 11 est utilisé comme agent de conservation dans les cosmétiques et les
aliments. En effet aux États-unis seulement, environ 20 millions de livres de BHT sont
produites chaque année, dont la moitié se retrouve dans la nourriture comme préservatif (37).
Bien que des études in vitro et chez les animaux aient montré que le BHT pouvait être toxique,
les compagnies alimentaires continuent à l'utiliser, car les doses ayant servi aux études
expérimentales étaient de beaucoup supérieures à celles ingérées par les humains (36). II est
maintenant connu que le BHT promeut la tumorigenèse pulmonaire seulement lorsqu'il est
administré en même temps ou suivant un cancérogène (36, 38, 39). Pour que le BHT soit un
promoteur tumoral, il faut, en premier lieu, que la cellule ait été initiée, Le. qu'un cancérogène
ait induit des mutations dans l'ADN de la cellule. Ensuite, le BHT doit être administré de façon
répétée et à courts intervaux (36). Le BHT stimule temporairement la division cellulaire et
l'expression de gènes transformés. 11 augmente ainsi les chances qu'une cellule potentiellement
tumorale se multiplie. Des études menées chez la souris semblent démontrer que la promotion
tumorale n'est pas due directement au BHT, mais à des métabolites réactifs de ce dernier,
comme le 6-ter~-butyl-2-(hydroxy-tert-butyl)-4-methyIphenol (BHT-OH) (36, 40, 4 1 ). Cette
activation du BHT est catalysée par le système de monooxygénase du cytochrorne P-450,
notamment les P-450 2B 1 et 2B3 (40,41). Nous sommes les premiers a avoir évaluer le potentiel
antipromoteur du sulindac sur le BHT.
Dans cette section, un aperçu général sera donné sur la consommation, la classification,
l'utilisation et les propriétés pharmacologiques des anti-inflammatoires non-stéroïdiens ( N N S ) .
Une attention spéciale sera portée a l'aspirine et au sulindac, car ils font partie des AINS les plus
prescrits et font ['objet de cette étude. L'implication des AINS dans la chimioprévention du
cancer, en particulier l'aspirine et le sulindac, sera présentée, basée sur des études
expérimentales (animaux; humain) et cliniques (humain).
2.1 Consommation, classification et utilisation des GINS
Les ARuS sont parmi les médicaments les plus prescrits (42 j. Knodel et col/. rappoRent
qu'environ 2?G des Nord Américains utilisent des A N S quotidiennement (43 ). De plus, Clive er
col/. affirment qu'en 1984, près de un Américain sur sept était traité avec des AINS (14). Ils sont
principalement prescrits pour soulager des douleurs diverses, comme celles reliées à l'arthrite et
au rhumatisme, et comme antipyétiques.
Les AINS sont classes en deus groupes, dont le premier est divisé en cinq sous-groupes
(voir Tableau 1) (45, 46). II est à noter que la majorité des AINS font partie de la classe des
composés acides. Les AINS utilisés en chimioprévention sont inscrits en majuscule.
TabIeau 1: Classification des AINS (45.461
COMPOSES ACIDES COMPOSES
Acides i Acides i Acides i Acides i Acides i Amdes acniques i urboxyliques i cnoLqws i f d q u e s i phénulacétiques i propioniques
NON ACIDES
Pour notre étude, I'aspirine et le sulindac ont été retenus, étant des A M S largement
prescrits (voir sections 2.2 et 2.3). Dans le cas de I'aspirine, il a été démontré qu'elle était
efficace dans la prévention du cancer colorectal et dans la prevention du développement de
polypes dans la polypose familiale (47-51). Des données préliminaires. tirées d'une étude
prospective de Schreinemachers et col/-, semblent montrer un lien entre l'utilisation de l'aspirine
et la prévention du cancer du poumon (52). Jalbert et mil. avaient étudié les effets des A I N S sur
la tumorigenèse pulmonaire induite par la NNK, chez la souris k ! J (53)- Cette étude comprenait
le sulindac, I'ibuprofëne, le piroxicarn et le naproxen mais non l'aspirine. Considérant
l'ensemble de ces données et I'utilisation répandue de l'aspirine, il nous paraissait important d'en
évaluer le potentiel chimiopréventif contre la cancérogenèse pulmonaire. Le sulindac a été
choisi comme contrôle positif Il est connu que le sulindac inhibe la formation de polypes
colorectales chez l'humain, s'il est pris régulièrement (54-56). Chez la souris A/J, il a été
démontré que le sulindac pouvait inhiber la tumorigenèse pulmonaire induite par la NNK (53,
2.2 Aspirine
2.2.1 Consomma tioa, utilisation et propriétés pharmacologiques
L'aspirine a acquis ses lettres de noblesse avec le temps. A ce jour, elle est l'anti-
inflammatoire le plus utilisé au monde. Aux ~tats-unis, il se consomme 10 a 20 mille tonnes
d'aspirine par année (58). Ce qui fait la popularité de l'aspirine, ce sont ses propriétés
antipyrétiques, analgésiques, anti-inflammatoires et antiplaquettaires (58, 59). Elle soulage les
maux de tête et les douleurs associées à I'arthnte et aux blessures musculaires.
L'acide acétylsalicylique, ou aspirine, fait partie de la famille des salicylates (Fig. 3). Sa
nature acide est incommodante pour plusieurs personnes. L'intolérance gastro-intestinale se
caractérise par une augmentation de l'acidité gastrique, causant ainsi de l'irritation et des ulcères
d'estomac. L'industrie a résolu le problème en offiant sur le marché des formulations
tamponnées ou à enrobage entérique. Cet enrobage du comprimé se dissout dans le petit intestin,
où le pH est neutre, plutôt que dans l'estomac. Les formulations tamponnées, quant a elles,
contiennent un tampon qui élève le pH gastrique? contrebalançant l'effet additif de l'acidité du
comprimé et de l'estomac (59).
AAS
Figure 4: Structures de I'acide acétylsalicylique ( U S ) et de son métabolite,
l'acide salicylique (AS).
L'aspirine est absorbée par difision passive au niveau de I'estomac. L'absorption est
optimaIe lorsque le pH se situe entre 2.15 et 4.10 (60). Le pH acide de I'estomac favorise le
passage de la forme non ionisée, l'aspirine étant un acide faible avec un pKa de 3.5 (61).
Plusieurs facteurs peuvent iduencer l'absorption, comme la désintégration et la dissolution du
comprimé, le pH gasmque et le temps de vidange de l'estomac. Une fois absorbée, le temps de
demi-vie de l'aspirine dans le sang est de 15-20 minutes (58, 60, 61). L'aspirine perd son
groupement acétyl par l'action hydrolysante d'estérases non spécifiques. Le groupement acétyl
ainsi libéré peut alors se fixer sur une enzyme et en modifier la conformation et la fonction
biologique.
L'acétylation de certaines enzymes peut avoir des conséquences très importantes. Par
exemple, la prostaglandine synthéthase perd son activité de cyclooxygénase lorsqu'elle est
acétylée par l'aspirine (62, 63). Cette inactivation est irréversible. Le site actif de l'enzyme est
bloqué, empêchant ainsi l'acide arachidonique d'entrer dans la cascade métabolique menant à la
formation de prostaglandines, comme la PGE2. Dans une étude menée chez la souris A&
Bilodeau et c d . ont observé une relation entre l'efficacité chimiopréventive de certains A N S ,
comme le sulindac, et le faible niveau de PGEz plasmatique (64). Ils ont émis i'hypothèse que la
prévention, par les M N S , de la tumorigenèse pulmonaire chez la souris k?l est reliée à une
inhibition de la synthèse de prostaglandines.
Pour le dosage bioologique, nous avons choisi d'administrer I'aspirine pcr os aux souris,
mélangée a la diète, afin de reproduire le plus fidèlement possible ce qui se passe chez I'humain.
Comme analgésique et antipyrétique, pour un adulte, la dose maximale recommandée d'Aspirine
~ a ~ e r ' (325 mg) est de un ou deux comprimés par voie orale aux quatre heures (60). Nous
utilisions donc l'équivalent de cette dose pour les souris, ce qui correspondait à 291 mg
d'aspirine! kg de diète (ou 32 mg d'aspirine; kg de poids corporel). Le choix de la dose et le
mode d'administration refletent la posologie recommandée chez l'humain.
2.2.2 Chimioprévention chez I'humain
Le cancer colorectal est très fréquent en Amérique du Nord. Au Canada seulement,
environ 1 personne sur 16, homme ou femme, sera atteinte du cancer du côlon et du rectum au
cours de sa vie (3). Ce cancer vient en 3ième place chez l'homme, après la prostate et le
poumon, et en seconde place chez la femme, demère le cancer du sein. De plus en plus, la
recherche sur le cancer du côlon s'oriente vers la prévention. Une voie d'avenir semble être la
chimioprévention du cancer colorectal par les AINS, en particulier l'aspirine et le sulindac.
De nombreuses études (rétrospectives et prospectives) ont démontré que l'aspirine, prise
sur une base régulière, diminuait le risque de développer un cancer colorectal (47,48, 50-52,65,
66). Suh et d l . ont évalué le risque de développer un cancer colorectal par une étude
épidémiologique qui comparait un groupe témoin à un groupe a risque (65). Le groupe témoin
était divisé en patients sains et en patients ayant eu des symptômes ressemblant à ceux du cancer.
Le groupe à risque comprenait trois sous-groupes. Le premier était constitué de patients atteints
d3.m cancer du côlon au stade primaire; le second regroupait des patients atteints du cancer du
rectum au stade primaire; enfin, le dernier groupe comprenait des patients atteints de polypes du
côlon ou rectaux, mais sans cancer malin. Les patients recevaient régulièrement un questionnaire
auquel ils devaient répondre. Sur celui-ci, les évaluateurs demandaient au patient, entre autre,
d'évaluer sa consommation d'aspirine. Ils ont observé une baisse appréciable du risque de
cancer colorectal. tant chez les sujets sains que chez les sujets atteints qui affirmaient prendre
régulièrement de I'aspirine. Cette baisse était proportionnelle à la quantité d'aspirine prise. Les
essais cliniques sont peu nombreux, mais arrivent aux mêmes conclusions (67). Greenberg et
coli. ont suivi. sur une période d'un an, des patients ayant eu un ou plusieurs adénomes du gros
intestin enlevés par chirurgie. Ils ont observé une réduction de 48% du risque de développer de
nouveau adénomes chez les patients prenant régulièrement de 1 'aspirine ( 67).
II y a eu nés peu d'éîudes sur I 'utilisation de l'aspirine comme agent de prévention du
cancer du poumon. Pourtant, au Canada, le cancer occasionnant le plus haut taux de mortalité
est celui du poumon, avec 33% chez les hommes et 21% chez les femmes (3). Le mécanisme de
chimioprévention de l'aspirine n'est pas encore bien connu et les quelques données disponibles
sont contradictoires. Certains affment que la prise quotidienne d'aspirine réduit l'incidence du
cancer du poumon (52), alors que d'autres n'ont pas observé de réduction notable (49). Ces
résultats contradictoires ne sont pas surprenants. Souvent lors de ces études, les données sont
tirées d'un questionnaire que le patient remplit volontairement chez lui. II est donc dificile de
contrôler si les informations inscrites sont exactes. Cette méthode entraîne des difficultés au
niveau de l'estimation du tabagisme et de la consommation de A I N S . C'est pourquoi les
modèles animaux de tumorigenèse et les expériences in vitro sont essentiels. Ils permettent de
choisir un ou plusieurs facteurs et de les faire varier, tout en contrôlant les autres paramètres. Les
résultats obtenus sont reproductibles et orientent de façon plus précise les recherches chez
I 'humain.
2.2.3 Chimioprevention du cancer chez les animaux
L'utilisation d'un modèle animal de tumorigenèse permet I'etude du mécanisme de
chimioprévention par l'aspirine. Comme ceux chez l'humain, la majorité des travaux effectués
avec l'aspirine chez les animaux concerne le cancer du côlon (68-70) et de la vessie (71-73). Le
rat est la principale espèce animale utilisée pour observer l'effet inhibiteur de l'aspirine lorsque
différents cancérogènes sont utilisés. Reddy et coll. ont observé I'effet inhibiteur de l'aspirine
sur la cancérogenèse du côlon induite par l'azoxyméùiane (68). Ils ont d'abord déterminé la dose
maximale tolérée (DMT) d'aspirine. Elle se définit comme étant la plus haute dose d'aspirine ne
causant pas de mortalité et moins de 10% de retard de gain de poids corporel. Pour ce faire, ils
ont mélange à la diète cinq quantités d'aspirine variant de 62.5 à 1000 p.p.m. Ils ont déterminé
que la DMT de l'aspirine se situait a 500 p.p.m. Par la suite, ils ont étudié la relation entre la
dose d'aspirine administrée et l'effet inhibiteur de celle-ci sur la cancérogenèse du côlon induite
par làzoxyméthane. Les résultats obtenus ont démontré une diminution du nombre
d'adénocarcinomes du côlon, sans qu'il y ait de relation dose-effet. En effet, ils ont observé qu'a
200 et 400 p.p.m. d'aspirine dans la diète, ils obtenaient 57 et 57% d'inhibition de la multiplicité
tumorale, respectivement.
L'efficacité de l'aspirine dans la prévention de la cancérogenese pulmonaire, chez les
animaux, est peu documentée. Adriaenssens et coll. ont étudié l'effet de l'aspirine sur la
formation d'adénomes pulmonaires et d'adduits a l'ADN, induits par le benzo(a)pyrène, chez la
souris AMeJ (74). ils n'ont pas obtenu une diminution significative du nombre de tumeurs et du
nombre d'adduits du benzo(a)pyrene à I'ADN. Ils ont conclu que l'aspirine n'avait pas d'impact
sur la tumorigenèse pulmonaire induite par le benzo(a)pyrène. La NNK et le benzo(a)pyrene
étant deux cancérogènes pulmonaires différant par leur voie d'activation métabolique, il est
possible que I'effet de l'aspirine sur la tumorigenèse pulmonaire induite par la NNK ne soit pas
le même que sur celle induite par le benzo(a)pyrène.
2.3.1 Consommation, utilisation et propriétés pharmacologiques
Le sulindac possède des propriétés anti-inflammatoires, antipyrétiques et analgésiques
reconues. 11 est surtout prescrit dans les cas d'arthrite rhumatoïde et d'ostéoarthrite (75). Le
sulindac, sous sa forme non métabolisée, est une prodrogue, donc inactif. Une fois absorbé par le
tractus gastro-intestinal et amivé dans le sang, le sulindac est métabolisé en deux métabolites
majeurs, ou excrété tel quel dans l'urine (Fig. 4). Le premier est formé lors de l'oxydation
irréversible du groupement sulfoxide et donne le métabolite sulfone (75, 77). Il constitue la voie
majeure d'excrétion du sulindac et n'a aucune propriété anti-inflammatoire (78).
Sulfide metabolite Sulindac Sulfone meta botite
Figure 5: Stmctures du sulindac et de ses métabolites sulfide et sulfone.
Par contre, la réduction du groupement sulfoxide donne le deuxième métabolite, le
sulfide, et est réversible (76, 77). Cette réversibilité permet la réoxydation du sulfide en
sulfoxyde, ce qui facilite son excrétion. En effet, il y a très peu de métabolite suIfide excrété
dans l'urine. II doit être réoxydé en sulindac pour son élimination. Mais ce sont les propriétés
anti-inflammatoires du sulindac sulfide qui sont d'intérêt (79). Duggan et col!. ont démontré,
chez le rat et le chien, que les propriétés anti-inflammatoires provenaient du métabolite sulfide et
non du sulindac (79).
Chez l'humain, la dose per os recommandée de sulindac est de 150 à 200 mg, deux fois
par jour (75). Les temps de demi-vie plasmatique élevés du sulindac (7 heures) et du sulindac
sulfide (16.4 heures) font que la dose de sulindac n'a pas à être renouvellee trop fréquemment
(76). Pour le dosage biologique avec les souris AD, nous avons utilisé 123 mg de sulindacl kg de
diète (OU 15 mg de sulinciad kg de poids corporel), me dose déterminée par des études
précédentes comme étant efficace à inhiber la tumorigenèse pulmonaire induite par la NNK et
plus élevée que celle recommandée chez I'hurnain (53,57).
2.3.2 Chimioprévention du cancer chez I'hurnain
En plus de ses propriétés anti-inflammatoires, le sulindac semble jouer un rôle important
dans la prévention du cancer du côlon et du développement de polypes chez les patients atteints
de polypose familiale (54-56, 80). En 1983, Waddell el COU. ont rapporté que le sulindac
réduisait la taille et le nombre des polypes rectaux chez des patients souffrant du syndrome de
Gardner et qui avaient subi une ablation d'une partie du côlon (54). Puis, en 1989, ces mêmes
auteurs ont observé que le sulindac était aussi efficace chez les patients atteints du syndrome de
Gardner n'ayant pas eu de chirurgie (80). De plus, ils ont démontré que l'effet du sulindac était
réversible. En effet, lonqu'on arrêtait le traitement, le nombre et la taille des polypes
réaugrnentaient. Ces observations ont été confirmées par Rigau el c d . (81). Plusieurs autres
études amvent aux mêmes conclusions (55,56,82, 83).
2.3.3 Chimioprévention du cancer chez les animaux
Chez les modèles du rat et de la souris, des études ont été menées afin de déterminer
I'efZet chirniopréventif du sulindac contre les cancers du côlon et du poumon (84, 85, 53, 57).
Skinner er coll. ont induit des tumeurs du côlon, chez des rats, avec le 1,2-dimethylhydrazine afin
de vérifier le potentiel préventif du sulindac (84). Dans les groupes ayant reçu du sulindac
pendant la période d'administration du cancérogène, ils ont observé une inhibition du
développement des tumeurs, ce qu'ils n'ont pas obtenu lorsque le sulindac était donné après le
cancérogène. Rao e/ CU//. sont parvenus aux mêmes conclusions, à savoir que le sulindac inhibait
le développement des tumeurs lorsqu'administré avant le cancérogène et poursuivi par la suite
(85 j. De plus, ces derniers ont évalué si cette réponse était dosedépendante. A 160 et 320
p.p.m. de sdindac dans la diète, correspondant a 40 et 80% de la DMT, ils ont obtenu une
réduction de la multiplicité tumorale de 55 et 71%. Ils ont donc conclu que l'effet du sulindac
était dose-dépendant.
Pepin et coll. ont évalué l'effet du sulindac sur la tumorigenese pulmonaire induite par la
NNK, chez la souris A/J (57). Ils ont commencé à donner 130 mg de sulinciad kg de diète deux
semaines avant l'administration de la NNK, et ont poursuivi jusqu'au sacrifice des animaux. Ils
ont obtenu une inhibition de 53% du nombre de nimeurs pulmonaires. Jalbert ef coll. ont étudié
a quel moment, lors d'un dosage biologique, le sulindac démontrait une plus grande efficacité à
inhiber la tumongenèse pulmonaire induite par la NNK (53). Les souris ont été divisées en trois
groupes. La période d'administration de la NNK correspondait aux semaines O à 1-7. Le premier
groupe recevait le sulindac des semaines -2 à +7, c'est-à-dire 2 semaines avant le début de la
NNK et pendant I'administration de celle-ci. Le deuxième groupe recevait l'anti-inflammatoire
des semaines +7 à +23, suite au traitement à la NNK. Enfin, le sulindac était donné au troisième
groupe pendant tout le dosage, des semaines -2 a +23. Les résultats obtenus ont révélé que le
sulindac était beaucoup plus efficace lorsqu'il était administré durant tout l'essai (51%
d'inhibition), qu'avant (7896) ou après (12%). À la lumière de ces résultats, nous avons donc
choisi de donner I'aspirine durant tout I'essai, c'est-à-dire des semaines -2 à +23.
Dans cette section, nous définirons la chimioprévention. Puis, nous verrons l'implication
de I'inhibition des cytochromes P-450 dans le processus chimiopréventif et leur relation avec les
A N S . Enfin, les avantages des deux protocoles utilisés pour cette étude seront détaillés.
3.1 Principes de chimioprévention
La cancérogenèse pulmonaire est un processus à long terme. La période de latence, qui se
définit comme le temps écoulé entre la première exposition au cancérogène et l'apparition des
tumeurs, s'échelonne sur plusieurs années. La prévention se fait en deux étapes. La première est
la prévention primaire (86). À cette étape, les causes du cancer sont connus et il appartient à
chaque individu de minimiser son exposition aux cancérogènes. La seconde étape est la
chimioprévention. Celle-ci se définit comme étant l'administration régulière d'un agent
chimique non toxique à un patient sain, mais à risque très élevé de cancer, afin d'inverser ou
d'inhiber le processus de cancérogenèse (86). La plupart des substances soupçonnées d'être
chimiopréventives ont été étudiées dans des modèles animaux de tumongenèse, puis appliquées à
I'humain dans des essais cliniques. Ces substances Som extraites directement des aliments ou
synthétisées chimiquement.
Selon le moment ou ils inteMement dans le processus de cancérogenèse, les agents de
chimioprévention sont classés comme (i) inhibiteurs de la formation de cancérogènes, (ii) agents
bloquants, ou (iii) agents supprimants (87,88). Dans la catégorie (i), on retrouve des composés,
tels que l'acide ascorbique et l'acide caféique, qui empêchent la formation de nitrosamines à
partir d'amines secondaires et de nitrite (89, 90). Les agents bloquantso quant à eux, inhibent la
phase d-initiation. Ils procèdent de trois façons: soit qu'ils inhibent l'activation d'un
cancérogène en sa forme active; soit qu'ils augmentent l'activité des systèmes enzymatiques
capables de détoxiquer; soit qu'ils réagissent directement avec les formes réactives des
cancérogènes. De bons exemples seraient le diallyl sulfide, les isothiocyanates et I'acide
ellagique (9 1-93). Les agents supprimants agissent lors de la promotion et de la progression d'un
cancer. Ils sont efficaces lorsqu'ils sont donnes apres I'exposition a un cancérogène. Les mieux
connus sont Ies rétinoïdes et les AIFIS (73,9496).
La stratégie la plus courante pour déterminer a quel moment l'effet chimiopréventif sera
maximal se retrouve au Tableau 11 (97). L'administration de l'agent potentiellement
chimiopréventif est séparée en trois étapes (avant, pendant et apres le cancérogène). Ensuite,
I'agent potentiellement chimiopréventif est administré à une étape seule ou combinée à d'autres.
Par exemple, un premier groupe sert de contrôle sans cancérogène ni agent potentiellement
chimiopréventif (non inclus au Tableau II). Un second groupe reçoit le cancérogène seul. A
partir des résultats obtenus avec ce groupe, il est possible de déterminer, par comparaison' si un
agent augmente, diminue ou demeure sans effet sur la cancérogenèse. Dans les groupes suivants,
diverses combinaisons de périodes ou l'agent chimiopréventif est donné sont effectuées.
Tableau II: Stratégies de traitements avec un cancérogène et un agent potentiellement
chimiopréventif (XXX), pour déterminer à quel moment ce dernier serait le plus efficace.
Groupe Cancérogène
- Présent
.-..-----*----*-
Présent
..-.-----*-..------- Présent
Présent
- - - - - - -- - - -
Administration de I'agent potentiellement chimiopréventif (XXX)
Pendant Apres
Par exemple, on obtient une inhibi~ion du nombre de tumeurs dans la situation (D), mais
non dans la situation (E), avec l'agent potentiellement chimiopréventif X (ou produit X). On
peut donc déduire que le produit X inhibe la formation de cancérogènes réactifs ou qu'il induit la
détoxication par le système enzymatique. Un autre exemple serait de I'inhibition seulement dans
la situation (H). On pourrait alors conclure que le produit X doit être administré sans arrêt tout
au long de I'étude pour obtenir l'effet escompte.
Chaque fois qu'un produit nouveau est introduit dans une étude, il est bon de vérifier si la
dose utilisée n'est pas toxique et qu'elle n'induit pas de tumeurs. Dans un test de toxicité, on
évalue différentes doses d'un même produit. Une baisse de poids corporel et une
hépathornégalie sont des indices de toxicité. Ceci permet de déterminer la dose maximale
tolérée @MT). Les doses pour les études de chimioprévention devront être inférieures ou égales
a Ia DMT.
3.2 Relation entre cytochrornes P-450, AINS et chimioprévention
Le cytochrome P-450 est une hémoproteine associée principalement à la membrane du
reticulum endoplasmique lisse (98-100). II est impliqué dans le métabolisme des médicaments et
des stérofdes, de même que dans l'activation et la désactivation de cancérogènes (98, 99). On
retrouve aussi des P450 mitochondriaux, mais en plus faibles proportions (100). Ces derniers
sont surtout impliqués dans la synthèse de stéroïdes.
L'action catalytique du P450 est médiée par la molécule d'hème de I'hémoprotéine (Fig.
6) (98). En premier lieu, le substrat vient se fixer dans une poche hydrophobe située près de
['hème. Une fois la molécule d'hème réduite par la NADPH-cytochrome P-450 réductase, il y a
fixation d'oxygène moléculaire sur celle-ci. Par Ia suite, l'oxygène est scindé en ses deux atomes
constitutifs. Un des ces atomes se fixe sur le substrat (oxydation) et le second atome se combine
avec deux atomes d'hydrogène pour former une molécule d'eau. L'activité du cytochrome P-450
est donc dépendante du NADPH, ou du NADH si le NADPH n'est pas disponible, et de
l'oxygène moléculaire (99, 100). La forme réduite de I'hémoprotéine peut fixer le monoxyde de
carbone et ainsi donner un spectre d'absorbante à 150 nm, d'où son nom ( 10 1, 102).
d'une cysteine
MEMBRANE - DU RETiCULUM ENDOPLASMIQUE
Figure 6: Structure schématique du cytochrome P-450 (tirée de la référence 98).
Le rôle premier des P-450 est d'oxyder les substances endogènes (stéroïdes, acides gras et
prostaglandines) et exogènes (médicaments et produits chimiques) (103, 104). La plus forte
concentration de P-450 se retrouvant dans le foie, ceci explique que ces substances y sont
rnétabolisées (98,99). On en retrouve également en plus petites quantités dans les intestins, les
reins et les poumons. Les isoentymes P-450 1Al, 1A2, 2B, 3A2,4B 1 et ?El ont été identifiées
dans les poumons ( 105).
Le second rôle des cytochromes P-450 est de rendre inoffensives les substances toxiques
circulant dans l'organisme. Par exemple, en hydroxylant un médicament, un P-450 rend celui-ci
plus facilement eliminable dans l'urine ou la bile (100). 11 arrive aussi qu'au lieu de désactiver
une substance, le P-450 l'active. C'est le cas avec les métabolites réactifs cancérogènes; par
exemple, a partir d'arènes ou d'alcènes, il peut y avoir formation d'époqdes instables. La
grande famille des cytochrornes P-450 se compose de différentes isoenzymes ayant les mêmes
propriétés catalytiques, mais dont les substrats diffèrent (98, 100). Les sous-familles 1, 2 et 3
sont responsables de l'activation des cancérogènes (106). Par exemple, I'isoenzyme P-450 1A2
est induite par la fumée de cigarette et par l'ingestion d'aliments cuits sur le charbon de bois
( 106, 107).
Comme mentionné à la section 1.4, la NNK doit être activée métaboliquement pour être
cancérogene ( l0,1?_ 19). Cene activation se produit via le système de monooxygénase du P450
( 108). Des études m vifro ont démontré l'implication d'isoenzyrnes des cytochromes P-450, en
particulier les P-150 humains 1A2 (surtout celui-ci), 2A6, 2D6 et ZEl (20-25). 11 existe trois
méthodes courantes pour identifier des formes spécifiques de P-450 impliques dans ['activation
d'un cancérogène donné. La première méthode utilise un système reconstitué de
monooxygénases microsomales, préparé a partir d'un P-450 purifié (109). Avec ce système, il
est possible d'identifier avec exactitude quel Pd50 est impliqué dans le métabolisme d'un
cancérogène. La seconde est un test d'inhibition de l'activité de biotransformation dans les
microsomes. Ce test d'inhibition implique que l'on doit posséder un inhibiteur chimique ou un
anticorps spécifique à un isoenzyme du P-450 étudié (1 10). Le microsorne est surtout constitué
d'un fiaCrnent de reticulum endoplasmique ayant conservé toutes ses propriétés. S'il y a
inhibition de l'activation du cancérogene, cela indique quel P-450 est impliqué. Enfin, la
dernière méthode se sert de cellules en culture, dans lesquelles on retrouve un ADNc qui exprime
un seul P-450 voulu ( l I l ) . Si celui-ci est impliqué dans I'activation d'un cancérogène, il sera
possible d'identifier des métabolites de ce dernier dans le milieu de culture. Cette méthode
possède comme avantage que toutes les variables du système sont contrôlées ( 1 12). De plus, les
problèmes d'éthique en relation avec l'utilisation de cancérogènes chez les animaux et l'humain
sont évités. C'est cette approche qui a été retenue pour la deuxième partie notre projet de
chimioprévention, 1 'étude in vitro.
Des essais biologiques avec des souris A/J ont démontré que le sulindac diminuait
d'environ 51% le nombre de tumeurs pulmonaires induites par la NNK (53, 57). 11 est
maintenant connu que le P-450 1A2 est impliqué dans l'activation de la NNK (22, 25, 29). Pour
empêcher les cytochromes P-450 d'être impliqués dans l'activation des cancérogènes, il faut soit
inhiber l'enzyme, en le modifiant ou en le complexant, soit créer une compétition pour le site
actif (1 13). Nous avons donc voulu vérifier si I'effet chimiopréventif du sulindac, sur la
tumorigenèse pulmonaire induite par la NNK, était dû à l'inhibition de l'activation de ce
cancérogène par le P-450 1A.2.
3.3 Avantages du dosage biologique et du système cellulaire in vitro
Dans cette courte section, les principales raisons ayant motivé le choix du dosage
biologique et du système cellulaire in vitro comme outils de recherche sont présentées.
Le choix d'un modèle animal de tumongenèse permet d'étudier l'ensemble des effets
d'un produit sur un être vivant. L'utilisation d'animaux vivants comporte certains problèmes,
comme les diffërences interindividuelles, la maladie, la mortalité imprévue, etc., qui peuvent
influencer les résultats. L'avantage majeur du dosage biologique est que I'effet du produit tient
compte de l'ensemble des interactions se produisant dans un organisme vivant. Ceci permet,
entre autre, d'évaluer si les effets bénéfiques sont plus importants que les effets secondaires
possib t es.
Le modèle in vivo de tumorigenèse peut servir, en premier lieu, pour déterminer le
potentiel chimiopréventif d'un agent. Divers agents connus pour être chimiopréventifs peuvent
être ajoutés comme contrôles. Un exemple serait d'inclure un AINS dont l'effet de
chimioprévention est connu, comme le suiindac dans le cas présent, et de comparer l'effet de
I'agent à l'étude avec celui-ci. Un autre exemple serait de varier les cancérogènes à l'étude afin
de vérifier si I'agent est spécifique a un seul ou a plusieurs cancérogènes.
Une fois le potentiel chimiopréventif déterminé, l'étape suivante est d'étudier son mode
d'action. C'est ici que le système cellulaire in vitro devient utile. Il permet d'élucider les
mécanismes d'action, en procédant par étape. L'avantage du système cellulaire est qu'il permet
de varier chaque facteur qui le compose, un à la fois, selon le besoin. Par exemple, on peut
déteminer si l'effet observé (activation ou inhibition) est dû à I'agent et/ou à son (ses)
métabolite(s). II sufit de changer I'agent à l'étude par son métabolite et d'observer quel sera le
résultat. Ainsi, s'il n'y avait pas d'inhibition avec l'agent, mais qu'il y en a avec le métabolite,
cela suppose que ce dernier est responsable de l'effet observé.
4.0 BUT ET OBJECTIFS DU PROJET
4.1 But général
Le domaine de la chimioprévention par les AINS est en pleine expansion. De nombreuses
équipes de chercheurs travaillent a évaluer leur efficacité chimiopréventive et à en comprendre le
mécanisme. P m i les A N S courants, tels que le sulindac, le naproxen, I'ibuproféne et le
piroxicam, seul l'efficacité chimiopréventive de l'aspirine n'a pas été évaluée dans la
tumongenèse pulmonaire induite par un cancérogène chez la souris NJ. Le but de cette étude
était donc de combler cette lacune. Nous avons évalué le potentiel chimiopréventif de l'Aspirine
~ a ~ e r ' , formulation régulière et tamponnée, de même que le produit non formulé, l'acide
acétylsalicylique. Le sulindac servait de contrôle positif De plus, nous avons vérifié si l'activité
chimiopréventive du sulindac était efficace contre le benzo(a)pyene, un cancérogène autre que
la NNK et capable d'induire des tumeurs pulmonaires. Nous avons a w i vérifié I'efficacité
chimiopréventive du sulindac dans un système comprenant un promoteur tumoral comme le
BKT. À partir des résultats positifs obtenus lors du dosage biologique, nous avons étudié I'effet
de l'aspirine et du sulindac, et de leurs métabolites, sur l'activation de la NNK par le P-450 1A2
in vitro.
4.2 Objectifs spécifiques
Déterminer l'efficacité préventive de l'aspirine contre la tumorigenèse pulmonaire induite par
la NNK chez la souris NJ. L'étude comprenait deux formulations commerciales, Aspirine
~ a ~ e r * régulière et tamponnée, et l'acide acétylsalicylique pur. Les résuitats furent comparés
a ceux obtenus avec le sulindac, utilisé comme contrôle positif
Déterminer l'efficacité préventive du sulindac contre la tumorigenèse pulmonaire induite par
le benzo(a)pyrène, chez la souris NJ.
Vérifier les résultats d'une étude antérieure concluant que le sulindac ne peut prévenir la
tumorigenèse pulmonaire induite par la NNK, en présence d'un promoteur tumoral, comme le
BHT.
Démontrer que le cytochrorne P450 1Al humain, exprimé dans les cellules lymphoblastoïdes
AHH-1 TK si-, métabolise la NMC
Comparer I'inhibition du métabolisme de la NNK par l'acide acétylsalicylique, I'acide
salicylique, le sulindac et ses métabolites sulfide et sulfone.
1.1 Introduction
Dans cette première section du chapitre, le dosage biologique effectué avec les souris IVJ
est décrit en détails. Le lecteur peut y retrouver toute I'infonnation nécessaire concernant
l'arrivée des animaux et les soins qui en découlent, de même que les problèmes de santé les plus
courants. En ce qui concerne le dosage lui-même, tout est bien décrit, incluant les mesures de
sécurité, les calculs des concentrations du cancérogène et des agents de chimioprévention, de
même que le test de toxicité pour ces derniers.
Le lecteur peut lire, à la suite du dosage, une description de l'évaluation de la stabilité de
l'aspirine dans la diète. Cene étape permet de vérifier que le mode de préparation et
l'entreposage de la diète contenant de l'aspirine n'affectait pas la stabilité de cette dernière.
À la suite de cette section, les résultats non publiés d'expériences préliminaires sont
présentés. Enfin* une discussion sur ces résultats termine ce sous-chapitre.
1.2 Méthodologie
Dosage bioloqiaue
Le dosage biologique est une méthode visant à déteminer in vivo, ii court terme. le
potentiel cancérogénique de diverses substances chimiques et à identifier des inhibiteurs de
cancerogenèse (1 14). Au corn des dernières années, de nombreux cancérogènes ont ainsi été
identifiés ( 18, 1 15). L'utilisation de souris de souche établie permet d'obtenir des données
quantitatives et reproductibles d'une expérience à l'autre. La souche de souris AU, en particulier,
a été choisie pour sa susceptibilité a développer des tumeurs pulmonaires ( 1 14, 1 15). Ce modèle
permet aussi I'étude de la chimioprévention de la cancérogenèse pulmonaire.
L'efficacité chimiopréventive d'un produit se reflète par une réduction dans la multiplicité
et/ou de I'incidence tumorale. Les résultats des groupes traités sont comparés B ceux d'un groupe
contrôle. La multiplicité tumorde est la moyenne du nombre de tumeurs par souris, pour un
groupe. L'incidence tumorale, quant a elle, est donnée par le rapport entre le nombre de souris
survivantes ayant au moins une tumeur pulmonaire et le nombre total de souris survivantes. La
description de la procédure du dosage biologique chez les souris A/J, telle que détaillée dans ce
mémoire, sera d'une grande utilité dans £es projets fiiturs, au laboratoire du Dr Castonguay.
Cette description constituera un outil de travail précieux pour les fiiturs étudiants dans ce
laboratoire et assurera une constance dans la méthodo1ogie et une reproductibilité des résultats.
a) Test de toxicité
Pour étudier les effets d'un agent chimiopréventif sur un animal, il est utile de connaître la
dose maximale tolérée (DMT). Elle se définit comme étant la plus haute dose d'un agent qui ne
causera pas ptus de 10% de retard dans le gain de poids corporel d'un groupe donné, comparé au
groupe qui ne reçoit aucun traitement. De plus, la DMT ne doit pas causer de mortalité ni rendre
les animaux malades. Reddy et coll. ont décrit comment déterminer la DMT de l'aspirine chez le
rat (voir détails section 2.2.3) (68). La DMT étant toujours inférieure à la LDjo (dose létale
causant 50% de mortalité dans une population donnée), cette dernière sert de point de repère car
c'est la dose maximale que l'on peut administrer dans la détermination de la DMT.
Prenons l'aspirine comme exemple, dont la LDx, per os est de 1 100 mg/ kg de poids
corporel chez la souris (1 16). L'évaluation de la DMT s'échelonne sur une période de 6
semaines. 11 faut procéder a l'aide de trois groupes ou plus. Le premier groupe est le témoin; il
ne reçoit aucun traitement. Le second groupe reçoit l'agent à tester, ii la dose correspondant à la
LDm Enfin, les autres groupes reçoivent des doses intermédiaires aux deux premiers. L'agent à
tester est mélangé a la diète. Pendant six semaines, on suit l'évolution hebdomadaire du poids
corporel de chaque animal. Une diminution de celui-ci nous suggère un certain niveau de
toxicité. Une autre façon de vérifier la toxicité est le ratio poids du foie/poids corporel. Les
données sont prises au moment du sacrifice. Le ratio plus élevé d'un groupe traité comparé au
groupe témoin indique qu'il y a hépatotoxicité.
b) 1. Arrivee des animaux
Les souris, des femelles de souche AU âgées de 6-7 semaines, proviennent de chez Jackson
Laboratory (Bar Harbor, ME). Une fiche de santé de la colonie est fournie avec chaque envoi.
Bien que les souris de chez Jackson soient infectées par Pasteurella pneumotropica et par des
protozoaires intestinaux, on les considère comme acceptables pour le dosage, car les effets sur la
réponse tumorale sont considérés comme négligeables. Les résultats de la fiche de santé sont
portés à l'attention du vétérinaire, qui décide de ce qui est acceptable. C'est ce dernier qui
indique aussi les précautions a prendre avec les animaux et la marche a suivre dans l'animalerie.
Tout au long du protocole, le chercheur doit porter un sarrau, un masque de chirurgie (ou
Confo II durant le traitement à la NNK) et des gants de latex pour manipuler les souris. Ceci
évite une contamination des animaux eVou du manipulateur. À leur amivée, il est extrêmement
important que le technicien du service animalier s'assure du sexe de chaque souris. La présence
d'un m5le a pour conséquence 1 'exclusion de la cage où il se trouve, car les femelles peuvent être
fécondées. Les souris sont hébergées 5 par cage (de type "shoebox") dans une salle a température
(2 1 -Z°C), humidité (45-594 humidité relative) et cycle de lumière ( l2W12h) contrôlés.
La distibution des souris dans les cages se fait de façon à ce que le poids d'un groupe de
cinq souris soit comparable d'une cage à l'autre, afin de minimiser les variations. En moyenne.
une souris pèse 19.9 1.4 grammes à l'âge de 6-7 semaines. A l'aide d'un poinçon, on identifie
les souris d'une mime cage sur les oreilles selon le code simple suivant: H, aucun trou; +l, un
trou, et $3, deux: trous, sur l'oreille droite; #4, un trou, et #5, deux trous, sur l'oreille gauche (Fig.
7). On doit préparer un fichier contenant une fiche d'identification pour chaque souris (Annexe
A). Sur chaque fiche, il faudra retrouver les renseignements suivants: numéros de groupe, de
cage et de souris; date de la nécropsie; agent chimiopréventif et/ou cancérogène (et leur dose) s'il
y a lieu; poids de l'animal; tissus prélevés (dans le cas du foie, il faut le peser).
Figure 7: Identification des souris.
Dans chaque cage, on retrouve une litière de type Sam-chips (P.J. Murphy Forest Products
Corps, Montville NJ), une bouteille d'eau avec bouchon à bille, ce qui réduit les pertes d'eau, et
deux pots de diète AIN-76A en poudre (Harlan Teklad, Madison WI). Cette diète est un mélange
contenant 50% de sucrose, 20% de caséine purifiée, 15% de fécule de mais, 5% d'huile de mais,
5% de fibres, 3'5% d'un mélange de minéraux, 1% d'un mélange vitaminique, 0,3% de DL-
méthionine et 0,2% de choline bitartrate. 11 faut prévoir un délai minimum de 4 à 6 semaines
pour la livraison de la diète.
2. Santé animale
Au cours d'un dosage biologique avec des souris A./& trois problèmes de santé sont assez
courants. Le premier, et le plus fréquent, est le phénomène d'alopécie, i.e. la perte de poil, un
processus normal chez les souris A/J. En général, l'apparition de petites plaques de peau nue
autour des yeux et sur le sommet de la tête en marque le début. Par la suite, la perte de poils
s'étend au reste du corps. 11 arrive même que la souris devienne totalement nue. n faut la
surveiller plus attentivement, car elle est alors plus vulnérable aux morsures de ses congénères.
L'alopécie n'a pas d'autre infiuence sur la santé de l'animal. Le second problème est d'ordre
génétique. 11 affecte environ 10% de ta population. Il s'agit de la microphtahie, une fermeture
partielle ou complète d'un seul oeil. Les premiers symptômes apparaissent vers l'âge de 10
semaines. mais ils n'affectent pas la santé ou le comportement de l'animal.
Le troisième problème auquel le chercheur peut avoir à faire face est une diarrhée causant
un prolapse rectal. Ce dernier peut dégénérer en ulcères situés autour de l'anus et à la base de la
queue. La surveillance de I'animal doit se faire de façon très attentive, afin de déceler les
premiers signes. Une diarrhée légère s'estompera en quelques jours. Par contre, il faudra
sacrifier l'animal si la maladie persiste et que le prolapse s'ulcère. Un autre problème qui peut
survenir est la nécrose de la queue, communément appelée "ring tail". Cette dernière débute a
l'extrémité de la queue par un processus d'annelation et d'inflammation. Ceci indique qu'il y a
un problème d'humidité (trop basse) ou de température (trop élevée) (1 17). II est très important
de corriger immédiatement la situation. 11 faut surveiller attentivement l'animal car, tant que le
problème n'est pas réglé, la nécrose de la queue évoluera. Le sacrifice de l'animal s'impose en
présence d'une nécrose avancée.
Les deux derniers problèmes susmentionnés nécessitent une surveillance de I'état de santé,
qui se fait en collaboration avec le vétérinaire. Ce dernier décide également si le sacrifice de
l'animal s'impose, en respect des critères d'euthanasie Eut-O 1 (Annexe B). L'administration de
médicaments aux animaux n'est pas recommandée. Elle peut introduire une variable qui
interfère avec les effets observés, du produit a l'étude, sur la cancérogenese. Dans tous les cas;
un animal malade qui ne guérit pas rapidement doit être retiré de l'essai.
C) Déroulement du dosage biologique
Le dosage comprend quatre phases. Les semaines -7 a O servent à la fois de période de
conditionnement et d'acclimatation pour les souris et à débuter I'administration de l'agent
chimiopréventif, qui se poursuivra tout au long du dosage. Le cancérogène est donné dans l'eau
à boire au cours des semaines O à +7, où les tumeurs commenceront a se développer. Les
semaines +7 à +23 permettent aux tumeurs de grossir, afin qu'elles soient visibles à 1-oeil nu lors
du prélèvement des poumons. Enfin, les souris sont euthanasiées au C02/OT durant la semaine
+23. Le coeur, les poumons et l'estomac sont prélevés. Ils sont conservés dans 10% fomal ine
(estomac) ou dans le fixatif de Tellysniczy (coeur et poumons) pour les comptes ultérieurs de
tumeurs. La composition de celui-ci est donnée à l'Annexe C.
Au cours du dosage, les muris d'une même cage sont pesées ensemble une fois par
semaine. Il en est ainsi pour toutes les cages. À chaque semaine, la balance doit être recalibrer a
l'aide d'un poids étalon. L'eau et la nourriture sont renouvelées deux fois par semaine. De
même, l'évduation de la consommation de diète se fait en trois fois: au début (semaine O), au
milieu (semaine + 1 1) et vers la fin du dosage (semaine +22). II suffit de peser les pots pleins de
nourriture avant de tes placer dans la cage, puis les peser de nouveau lonqu'on les retire après 3
ou 4 jours. Ainsi, la consommation de nourriture par jour par souris, pertes incluses, peut être
déduite. Le même procédé est employé pour évaluer la consommation d'eau, assumant qu'un
millilitre d'eau pèse un gramme.
Lorsqu'un dosage se poursuit sur une aussi longue période et avec autant de souris, les
coûts (animaux, nourriture, soins animaliers, location de salle, etc.) peuvent devenir très élevés.
Il est primordial d'éviter toute contagion bactérienne, virale ou parasitaire pouvant interférer
avec les risdtats expérimentaux. Il est donc très important de procéder à un suivi de l'état de
santé de la colonie. C'est ici qu'entre en jeu les animaux "sentinelles". Ce groupe est
généralement constitué de dix souris, réparties en deux cages. Les sentinelles ne reçoivent aucun C
traitement chimiopréventif ou cancérogénique. Elles sont hébergées et nourries de la même
façon que les autres souris du dosage. L'état de santé de ces animaux reflète celui de la colonie.
Pour déterminer la présence de bactéries, vins ou parasites dans la colonie, une sérologie et une
parasitologie sont recommandées. La procédure courante est une ponction sanguine au niveau du
sinus orbital sur deux sentinelles, toutes les sis a huit semaines, effectuée par le technicien en
santé animale ou par le vétérinaire. Ce dernier se charge d'envoyer le sang pour analyse
susmentionnée à une firme spécialisée, Charles River Laboratories (Wilmington, MA).
À la fin du dosage, les souris sont euthanasiées au CO& par groupe de cinq, après avoir
été mises a jeun douze heures auparavant. Chaque souris est pesée et le poids noté sur les fiches
individuelles d'identification (Annexe A). Ces mêmes fiches serviront lors du compte de
tumeurs. Après la pesée, l'abdomen et la cage thoracique sont incisées et ouvertes. Les poumons
sont prélevés en premier. Il suffit de dégager doucement le coeur, auquel les poumons sont
rattachés, avec des pinces. Les vaisseaux sanguins sont coupés rapidement pour éviter que le
sang se répande dans les poumons. Une fois dégagés, le coeur et les poumons sont déposés dans
Pour un environnement sécuritaire dans et hors de la salle, des mesures particulières
doivent être prises. En premier lieu, des fiches sont apposées sur la porte de la salle indiquant
qu'il y a présence de cancérogène, quel équipement de sécurité à porter, les numéros de
téléphone des personnes à rejoindre en cas d'urgence et que la salle est à accès limité (Annexes
D et E). Ces fiches sont généralement foumies par le vétérinaire. Deuxièmement, le Comité des
risques biologiques (Université Laval) foumit des boîtes et des sacs jaunes identifiés "danger
biorisques", d'une contenance maximale de I3,6 kg. Une de ces boîtes est installée a l'extérieur
de la salle, alon qu'une autre est placée à l'intérieur. Un sac est placé dans cette dernière, afin
de récupérer la litière souillée, la diète non consommée, les gants, les papiers brus et tout autre
matériel solide ayant été en contact réel ou supposé avec le cancérogène. Lorsque le sac est
plein, il est fermé solidement puis déposé dans la boite (doublée d'un sac) a l'exzéneure de la
salle. Le tout est refermé, puis la boîte est identifiée avec le nom du chercheur, son numéro de
téléphone et le nom du cancérogène. Les carcasses des souris traitées sont placées dans un sac,
doublé d'un second sac, bien identifié et déposé dans le congélateur prévu à cet effet A
l'animalerie, où une compagnie spécialisée viendra les récupérer pour incinération.
Enfin, le manipulateur doit se protéger en portant un bonnet et des pantoufles de
chinirgien' des lunettes de sécurité, un tablier imperméable, deux paires de gants et des
manchons, sans oublier le plus important, un masque Confo II avec cartouches GMC-H (MSA,
Ville Lasalle). Alors que le reste de l'équipement est revêtu dans la salle. il est essentiel d'avoir
mis le masque avant d'entrer. C'est la seule pièce d'équipement qui peut entrer et sortir de la
salle. La deuxième paire de gants doit être changée chaque fois que l'on soupçonne un contact
avec la solution de cancérogène, afin d'éviter de tout contaminer. Les mesures de sécurité
doivent être maintenues la semaine suivant la fin du traitement, car les animaux peuvent encore
excréter des traces du cancérogène dans l'urine ou les fèces.
Prudence et sécurité sont les mots d'ordre Ion de la préparation de la solution concentrée
de NM(. Tablier, manchons, lunettes de sécurité, deux paires de gants et masque Confo II sont
de mise. II ne faut jamais manipuler un pot ouvert de NNK en poudre hors de la hotte chimique.
La quantité voulue de NNK est prélevée sous la hotte et déposée dans un via1 dont le poids est
connu. Après l'avoir bien fermé, le via1 est pesé de nouveau. La différence équivaut à la
quantité de NNK. Pour éviter des manipulations inutiles, il s'agit d'être le plus près possible du
poids voulu, puis d'ajuster le volume d'eau en conséquence. Les étapes suivantes décrivent la
façon de procéder pour les calculs des concentrations de NNK et d'agents chimiopréventifs.
e) Calculs des concentrations de NNK et d'agents chimioprévention
1. Solution concentrée de NNK
Pour qu'une cage de cinq souris ait sufisamment d'eau à boire pour 3 ou 4 jours, il faut 60
et 70 ml d'eau dans la bouteille, respectivement. Ces données tiennent compte de la
consommation, des pertes et du volume mort de la bouteille. Ce dernier se définit comme étant
le volume résiduel auquel les souris n'ont pas accès, la bouteille étant placée à angle. Durant les
deux semaines précédant le début du traitement avec le cancérogène, la consommation
journalière d'eau par souris a été évaluée à 2,1 ml. La dose totale de NNK à administrer à me
souris est de 9,I mg pendant 7 semaines (49 jours).
(A) 9,1 me NNIC/ souris x 1 = 87,4 pg M m 1
49 jours 1,I ml eaw'soun's/j
(B) 87,4 pg W m l x 60 ml eau = 5'24 mg NNK
Lëquation (A) donne la concentration de NNK dans la bouteille d'eau. L'équation (B)
permet de dtterrniner la quantite de M qui est nécessaire d'ajouter à une bouteille pour
atteindre cette concentration. La concentration de la solution de départ est donnée en rapportant
la valeur de 5-24 mg NNK par 1 ml d'eau. Ainsi, pour les 3 premiers jours, il suffit de prélever 1
ml de la solution concentrée de NNK, de la déposer dans la bouteille d'eau et de compléter le
volume à 60 ml pour obtenir une concentration en NNK égale a 87,4 pglrnl. L'équation (C)
permet de calculer la quantité de NNK nécessaire (toutes cages comprises} pour tout le protocole,
alon que l'équation (D) permet de calculer le volume total d'eau dans lequel elle devra être
diluée pour constituer la solution concentrée. Le volume d'eau nécessaire à une cage de cinq
souris pour une semaine est de 130 ml (60 + 70 ml).
(C) 130 ml eau/sem./cage x 7 Sem x 87,4 pg W m I x "Z" cages = X mg NNK
(D) X mn NNK = Y ml eau bidistillée
5,24 mg NNK/rnl
N.B.: Z = nombre de cages avec NNK dans 1 'eau
X = quantité de NNK requise pour traiter toutes les sowis
La sotution concentrée non utiiisée est conservée à -80°C et celle en cours d'utilisation a 4°C.
2. Ajustement des doses journalières de NNK
L'objectif du traitement consiste a administrer 9,1 mg de NNK par souris, sur une période
de sept semaines (49 jours). Le but est d'obtenir une administration du cancérogène la plus
uniforme et constante possible. Ceci requerra une évaluation régulière de la dose cumulative et
un calcul de I'ajustement de la dose réelle en fonction de la dose théonque. Le jour JO est celui
oii l'on donne pour ta première fois la NM( dans l'eau a boire. Afin d'éviter la manipulation de
grandes quantités de solution diluée, on mesure a l'aide d'un cylindre gradué la quantité d'eau
qui devra être ajoutée dans la bouteille pour compléter le volume de solution concentrée. Cette
dernière est prélevée à l'aide d'un pipetteur de précision ( "Pipetman"). Par exemple, pour 4
jours, il faudrait 1,17 ml de solution mère de NNK (5,24 mgfml) et 68,8 ml d'eau. La bouteille
est pesée avant d'être placée dans la cage. Elle sera pesée de nouveau après 3 jours (ou 4, selon
le cas), puis vidée. La différence de poids donne le volume bu.
A l'aide de cette information, il est possible de calculer ce que les souris ont réellement
consommé de NNK. Afin de s'assurer qu'une souris a consommé 9,1 mg de NNK sur une
période de 49 jours, il faut extrapoler le degré de consommation, selon ce qui a été consommé
auparavant. Les équations (E), (F) et (G) montrent comment faire ce calcul. Les valeurs (*) sont
à titre d'exemple et ont été arrondies a un ou deux chiffres après la virgule, selon le cas. Lors des
calculs réels, il faut garder au moins quatre chiffres après la virgule. La quantité de NNK étant
évaluée en pg, chaque chiffre a son importance.
(E) Quantité de NNK consommée par cinq souris de JO à 54
5.24 me NNWmI x 1.1 7 ml sol. conc. NNK* = 87,58 pg W m I *
70 ml total*
87,58 pg NNK/ml* x 67,3 ml (vol. bu durant 4 jours)* = 5894,3 pg NNK*
(F) Extrapolation de la consommation de 54 a 57, à partir de celle de JO à 54
9100 pg W s o u i i s x 5 souris = 45500 pg NNK pour 49 jours
NNK consommée de JO (49 jours) à J4 (45 jours) = 5894,3 pg * Consommation de NNK attendue de 54 à 57 (42 j) :
5894.3 DE NNK* x 3 j = 4420,7 pg Cg*
jj
Consommation de NNK a 57
= consommation réelle totale (54) + consommation estimée (54-7)
= 5894,3 pg NM(* -+ 4420,7 pg NNK*
= 10315,O pgNNK*
(G) Ajustement du volume de solution concentrée, selon ce qui reste de M\n< a administrer
45500pgNNK(49j) - 10315,0pgNM(*(7j) = 35185pgNNK*(42j)
35185ueNNK* x 3j x 1 = 479,6 pl*
47 j 5240 pg NNWml
II faudra donc ajouter 479,6 pl* de solution concentrée de W, pour un volume final de 60 ml.
De cette manière, il est possible de suivre la consommation de NNK tout au long du traitement et
de procéder aux ajustements nécessaires au bon moment. L'utilisation d'un graphique ou l'on
retrouve la courbe théorique et les courbes réelles de chaque groupe nous permet de vérifier si
l'ajustement est adéquat. Un exemple de ce genre de graphique est donné à IyAnnexe F.
3. Calcul de l'agent chimiopréventif
Pour une première étude, on veut utiliser chez la souris une dose d'anti-inflammatoire
équivalente à la dose quotidienne maximale recommandée pour un homme pesant 70 kg. Dans
cette étude, nous avons utilisé la dose antipyrétique équivalente à 3-6 grammes d7aspirine/jour et
avons considéré que le poids moyen d'une souris était de 20 g. La consommation journalière a
été déterminée a 3'5 g de diète lors d'une étude antérieure. Voici un exemple de calcul:
(H) 3600mgaspirine/j x 20e(soun's) = 1,03 mg aspirineij
70000 g (homme)
(1) 1 ,O3 mg aspirineij x 1 = 294 mg aspirine! kg diète
3,5 g diète/j
Les formules (H) et (1) nous donnent la quantité d'anti-inflammatoire qui devra être mélangée à
un kilogramme de diète AIN-76A. Le temps de mélange varie selon la quantité de diète. Par
esemple, 90 minutes sont suffisantes pour 2 kg de diète. 11 faut tenir compte qu'un comprimé
dàspirine est composé de 725 mg de principe actif, plus une certaine quantité de liants. Par
exemple, un comprimé d'Aspirine ~ a ~ e r ' ordinaire pèse environ 420 mg. Sachant qu'il contient
325 mg de principe actif, il y a donc 95 mg de liant. Ce facteur devra être pris en considération
Ion de la pesée de I'anti-inflammatoire Si on a besoin de 294 mg d'aspirine, il faudra peser 380
mg. Ceci ne s'applique qu'aux comprimés.
Tableau III: Dosage biologique
souris vention!
Promoteur
Dose cancérogène rng/souris
Dur& administration agent chimio-
preven tion (# semaine)
Agent chimioprkvention etfou promoteur
mgkg dise AIN-76~
Sacrifice (# sem.)
Aucune
Aucun n ? (négatif) ( 10
I 3 (positif) 1 25 7 semaines
7 semaines 1 Sulindac eau à boire 1
7 semaines 1 ASP-s eau à boue
7 semaines ASP-A eau à boire
7 semaines ASP-B eau à boire
lx i,p. Aucun
lx i.p. Sulindac
gavage Sulindac 3x 2rnglsouns
2 semaines interval1 e
gavage 3x 2rnglsouns
2 semaines intervalle
Aucune (huile de
mais comme véhicule)
Aucun
gavage 2xO,Sr1Vsouris
2 semaines intende
Aucun
Le Tableau III résume le dosage biologique. Les détails concernant les groupes 3 à 7
(résultats et discussion) se retrouvent dans l'article à la section 2.0. La NNiS, en solution à 4 mg/
ml d'eau bidistillée stérile, est donnée par une seule injection intrapérïtonéale (0.5 ml) aux
groupes 8 à 10. Le BHT est mélangé à la diète de la même manière que les AINS. Le B(a)P est
mis en solution dans le benzène (point d'ébullition 80,1 OC), puis de l'huile de maïs est rajoutée
afin d'obtenir une concentration de 4 mg B(a)P/ ml d'huile. Le benzène est évaporé sous
évaporateur rotatif afin que le B(a)P soit transféré dans l'huile. Les quantités dépendent du
volume total requis. Dans cette étude, 40 1,00 mg de B(a)P, 100,OO ml de benzène et 100,25 ml
d'huile de mais ont été nécessaire. La solution de B(a)P ainsi obtenue est administrée par gavage
aux souris, a raison de 3x 0,5 ml à deux semaines d'intervalle.
~valuation de la stabilité de l'aspirine dans la diète
L'évaluation de la stabilité de làspirine dans la diète est effectuée par HPLC (Hi$
Pressure Liquid Chrornatography). Il est constitué d'une pompe Waters 501, d'un détecteur UV
Waters 441, d'un injecteur Etheodye 7125, d'un intégrateur Hewlett Packard 3390A et d'une
colonne Cl* mondapak (3.9 x 300 mm; Waters, Milford, MA). La phase mobile est constituée
de O.35N acide acétique et de méthanol, dans des proportions 75% v/v. Les solutions pour la
courbe standard (AAS et AS), de même que l'échantillon à analyser, sont injectées 100 pl à la
fois dans le système, à une vitesse d'élution de 1.2 ml/ min., pendant 20 min. Les résultats sont
enregistres a 280 m. Les remps de rétention sont de 1 1 min pour l'aspirine et de 16 min pour
l'acide salicylique.
La diète contenant les AINS est préparée et conservée a 4OC, à la noirceur, sur une période
maximale de trois semaines. Le mélangeur employé ne permet pas la préparation de plus de 2 kg
de diète. Lors de l'essai biologique, l'aspirine est donnée à raison de 294 mg/ kg de diète, ou 294
pg/g. Donc, 1 g de diète dissout dans 1 ml de solution donne 294 pg d'aspirine/ ml. Après avoir
injecté diversa concentrations d'aspirine, la limite de détection de l'appareil s'est révélée
inférieure à 15 pg d'aspirine/ ml de phase mobile. Les courbes standards sont préparées a partir
de solutions à 40 pg! m1 d'acide acétylsalicylique ou d'acide salicylique. Les courbes varient de
0 à 40 pgl ml.
Les poids des comprimés de 325 mg d'Aspirine E3ayerg, formulation régulière et
tamponnée, sont respectivement de 420 et 740 mg. Une fois réduit en poudre, il faut peser 19,O
mg d'un comprimé de 420 mg, pour obtenir 14,7 mg d'aspirine. On mélange le 14,7 mg
d'aspirine avec 50 g de diète. Le rapport aspirine/ diète est le même que celui du dosage
biologique, sauf que les quantités sont moins élevées. L'extraction se fait immédiatement ou
après trois semaines. On extrait l'aspirine de la diète avec de l'acétate d'éthyle. De cet extrait,
2,O ml sont conservés auxquels est ajouté 0,1 ml de standard interne, I'hydrochlorothiazide
(Sigma) ii 50 pp/ ml. Puis, le tout est filtré sur un Minisart 0,45 pm (Sartorius). On évapore sous
N1 (,, et I'échantillon est conservé à -20°C jusqu'à son utilisation. Quelques minutes avant
d'injecter l'échantillon, celui-ci est dégelé rapidement à 37°C. Ensuite, l'échantillon est
ressuspendu dans 50 pl de méthanol, suivi d'une addition de 180 p1 d'acide acétique 0,35N.
1.3 Résultats
Test de toxicité de I'aspirine
Les résultats au Tableau IV semblent indiquer qu'il n'y a pas d'hépatotoxicité aux doses
d'aspirine testées. Nous voulions vérifier, en même temps, si l'acide acétylsalicylique pur et le
tamponnage du comprimé commercial pouvaient influencer la toxicité.
Tableau IV: Ratio foie/ poids corporel de la souris (mg), après
l'administration d'AMS pendant 6 semaines
2 (n=j) 1 AspHne a tamponnée 294 1 54,s 2 4.6
Groupe
1 (n=S)
'--.--"".."""" """"""""" ....*.***--..Y"..~~~~*Y"Y"Y".Y"*Y"Y"Y"*Y"Y"Y"Y".Y"~Y"Y"Y".Y" " ' - ' - " - " ' - ~ ~ ~ - * Y " Y " Y " Y " * Y " Y " . Y " . Y " Y " Y " . Y " Y " . Y " Y " . . . Y " Y " Y " Y " Y " Y " Y " Y " * Y " Y " Y " Y " Y " * Y " Y " Y " Y " Y " * Y " . Y "
3 ( ~ 5 ) 1 Aspirine Bayer tamponne% 588 1 55.0 2 4.8
AINS ( mg/ kg diète)
Aucun
*-..-.**********-**. ..*-****.*.*.*-*.*-..*****...+.-------.----------------------------* --*--*.---.--------------*----*-------------.-*--.4---------------------------
5 (n=5) 1 Acide acétylsalicylique 588 1 43.1 5 5.9
Foie (mg)/ p. corp. (mg) (moyenne f SD)
55.3 2 6.7
4 ( n=5)
Dosage bioiorricrue
Le sulindac a diminué le nombre des tumeurs pulmonaires induites par la h W . Le
nombre de tumeurs/ souris a changé de 9-5 2 0,9 pour le groupe 8 a 7,8 2 0'8 pour le groupe 9.
Mais le sulindac n'est pas parvenu a contrer l'effet de promotion tumorale du BHT, la
multiplicité tumorale pulmonaire ayant atteint 23,2 5 I,6 tumeurs/ souris pour le groupe 10. De
plus, le sulindac n'a pas inhibé la tumorigenèse induite par le B(a)P (groupes 11 à 13).
Acide ac&ylsalicylique 294 55.6 -+ 4.7
Tableau V: Effets du sulindac et du BHT sur la tumongenèse pulmonaire induite par la NNK ou le B(a)P
I
Groupe Survivant Cancérogène /initiai (mode
administration)
1 (sentinelle) 10/1 0 -
2 (néyatif) 10AO -
8 (positif) 24/25 WK (i-p.)
9 23/25 h W (i-p.)
10 25/25 3X (i.p.)
1 1 (positif) 33/30 BaP (gavage)
huile mais 13 (n6gatif) 1 515 1 (véhicule; mava e)
Dose Promoteur/ MuItipiicité Incidence cancérogène Agent tumorale tumorale
rng/souris chimioprévention pulmonaire pulmonaire (mgkg diète) (moyenne + SE)
3 x 2.0 - 6.47 = 0.66 3 0!3 O 2 semaines intervaHe
3 x2 .0 /Sulindac 123 6.15 = 0.54 27/27 3 semaines intemalle
Les estomacs de souris ont été examinés pour véritier si la NNK et le B(a)P avaient induit
des Nmeun gastriques. Les résultats sont présentes au Tableau VI. Les groupes 8 a 10, qui ont
reçu la NNK par injection intrapéritonéale, n'ont pas développé de tumeun gastriques. Par
contre, tous les groupes ayant reçu le cancérogène (NNK ou B(a)P) per os ont développé des
tumeurs gastriques. L'incidence tumorale était plus élevée chez les animaux traités au B(a)P
(groupes I 1 et 12) que chez ceux traités a la NNK (groupes 3 à 7).
2 x 0 . 5 nù 2 semaines intervalle
- 0.0 + 0.0 015
Tableau VI: Effets des AINS sur la turnorigenèse gastrique induite par la NNK ou le B(a)P
Asp-S : acide ac6thyfsalicilique AspA : Aspirine ~ a ~ e r ' Asp-B : Aspirine ~ a ~ e r * tamponnée
1
r Groupe
I
I (sentinelle)
2 (népatif)
3 (positif)
4
S u ~ v a n t l initial
1 O/] O
1 O/ 10
24/25
25/25
1 1 (positif)
12
13 (négatif)
Cancérogène (mode
administration)
-
-
NRiK (eau)
h W (eau)
301'30
27/30
Z/5
Dose cancérogène (mgkouris)
- -
9.1
9.1
- BaP (,gavage)
BaP (gavage)
huile maïs (véhicule; gavage)
Promoteur/ Agent
chimioprévention (mglkg diète)
- -
-
/Sulindac 1 23
3 x 2.0
3 x 2.0
2u
Multiplicité tumorale gastrique
(moyenne * SE)
-
0.0 10.0
0.17 0.13
O. 12 i 0.09
-
/Sulindac 123
-
Incidence tumorale fw=hue
-
0/10
3/24
3/25
2.63 I 0.41
2.59 = 0.43
0.0 I 0.0
30130
2727
0/5
Évaluation de la stabilité de I'as~inne dans la diète
Les résultats du dosage de l'aspirine dans la diète sont donnés au Tableau W. Dans ce
dernier, Aspirine ~ a ~ e r ' formulation régulière est abrégée par AspA et formulation tamponnée
par AspB. L'acide acétylsdicylique est abrégé par AspS. Les lemes muiuscuies (a à f)
indiquent des prélèvements d'une même préparation, et les chifies 1 et 2 indiquent des
préparations différentes. Si l'aspirine est extraite immédiatement, plus de 96% de celle-ci est
récupérée. Dans la deuxième section du tableau, les résultats obtenus suite a un entreposage de
la diète pour trois semaines à 4OC, à la noirceur, suivi de 4 jours à température pièce et à ia
lumière sont retrouvés. Autour de 75% de la quantité d'aspirine est récupérée.
Tableau W: Évaluation de la stabilité de l'aspirine dans la diète
-
Dosage
Extraction immédiate
(après mise en solution)
Entreposage de 3 semaines
.. Echantillon
Asp-A a Asp-A b ASP-A c ASP-A d Asp-A e ASP-A f
Asp-A 1 a ASP-A 1 b Asp-A 2a Asp-A 2b Asp-B 'la ASP-B 1 b Asp-8 2a Asp-B 2b Asp-S 1 a Asp-S 1 b Asp-S 2a ASP-S 2b
pg Asp / pg Sal % de récupdration Asp
Notes: a) 100% Sal = 11,27pg
1.4 Discussion et conclusion
Avant d'entamer un dosage biologique avec des AINS, il est nécessaire d'évaluer à quelle
dose ces derniers peuvent être toxiques pour les animaux. Dans le cas du sulindac, la DMT chez
le rat et la souris était connue et la dose utilisée avait déjà fait l'objet d'études (53, 57, 85). Dans
le dosage biologique, nous voulions utiliser une dose d'aspirine équivalente à la dose
antipyrétique maximale chez l'humain, sur une base de poids corporel. Cette dose équivalente
était inférieure à la LDso, mais nous ne possédions aucune information nous indiquant si elle
avait une influence sur la santé des souris ( 116).
Une étude de toxicité a donc été jugée utile. Sur les trois types d'aspirine inclus au dosage,
ont été évalués ceux jugés potentiellement toxiques ou dont la composition pouvait avoir une
influence sur les animaux. L'étude prévoyait la dose retenue comme étant équivalente a la dose
antipyrétique chez l'humain, pour le dosage biologique, et le double de celle-ci. Dans tous les
cas- il y a absence de toxicité hépatique (Tableau IV). Si cela avait été le cas, la masse du foie
aurait été proportionnellement beaucoup plus élevée que la masse corporelle, augmentant ainsi le
ratio. Ces résultats indiquaient que la dose d'aspirine choisie n'influençait pas la santé des
souris.
La NNK et le B(a)P sont activés métaboliquement par des cytochromes P-450 différents,
tels que le P-450 1A2 et le 1A1, respectivement (23, 35, 29). Parmi les m S , le sulindac est un
des meilleurs inhibiteurs de la tumorigenèse pulmonaire induite par la NNK, chez la souris k/T
(53). Mais, lorsque la tumorigenèse est induite par le B(a)P, le sulindac ne semble plus avoir de
potentiel chimiopréventif (Tableau V). Une hypothèse, qui pourrait se vérifier par des études in
vitro, serait que I'effet chimiopréventif du sulindac est dû à une inhibition de P-450 particuliers.
comme le 1A2-
Le sulindac, lorsqu'il est administré conjointement avec le BHT, ne peut empêcher l'effet
de promotion tumorale de ce dernier (Tableau V). Le métabolisme du BHT passe par deux voies,
dont une implique les P-450. La première voie conduit à l'oxydation des groupes alkyls du BHT:
c'est la voie d'élimination de ce dernier (36). La seconde voie, suite à l'oxydation de la fonction
phénolique du BHT, mène à la formation de métabolites intermédiaires pouvant être activés par
un P-450, comme le 2BlDB2 (36, 40, 41). Ce sont ces métabolites intermédiaires qui sont
soupçomés d'agir comme promoteurs tumoraux (36,40,4 1 ).
Dans le cas présent, le sulindac et le BHT ont été administré après la NNK. Ce qui
implique que les cellules avaient été initiées par cette dernière, une étape importante pour la
promotion tumorale. Le sulindac ne semble pas avoir empêché la promotion tumorale par le
BHT, tout comme dans une étude préliminaire (non publiée) effectuée au laboratoire du Dr A.
Castonguay. Voici ce qu'ils avaient obtenu comme multiplicité tumorale pulmonaire: 9,9 + 1,1
pour la NNK seule; 8,4 2 0,9 pour la NNK plus sulindac; 2 1,4 2 1,9 pour la NNK plus BHT; 28,2
+ 3,9 pour la NNK plus sulindac et BHT. Donc, si le sulindac n'a pas d'effet direct sur le BHT - lorsqu'administré en même temps que celui-ci, il faudrait vérifier ce qui en est lonque le
sulindac est donné avant le BHT. Le suiindac empêchant l'initiation de la cellule par le
cancérogène, alors le BHT ne devrait plus avoir d'effet de promotion tumorale.
La NNK n'induit pas de tumeurs gastriques lorsqu 'elle est administrée par injection
intrapéritonéale (Tableau VI). Par contre, lorsqu'elle est administrée per os, la NNK induit
légèrement la tumongenèse gam-que. La multiplicité tumorale obtenue dans ce cas (Tableau
VI), lonque le sulindac est présent, est comparable a celle déjà publiée (53) . Avec le B(a)P, qui
peut induire la tumongenèse gastrique, la multiplicité tumorale obtenue est comparable à celles
d'études publiées (32, 35). Le vehicuk utilisé, l'huile de maïs, n'induit pas de huneun
eastiques. Y
Enfin, il a fallu évaluer I'effet de l'entreposage sur la stabilité de l'aspirine dans la diète.
Pour préparer quotidiennement le mélange diète-AINS, cela nécessitait de très petites quantités
d0AINS et ces dernières étaient hors de la précision des balances du laboratoire. Ceci impliquait
qu'en préparant une plus grande quantité du mélange MM-diète, il faudrait l'entreposer pour
une période déterminée. Le problème majeur que l'on entrevoyait était une hydrolyse de
l'aspirine en acide salicylique, due à l'humidité de la diète. La question était de savoir si, au bout
de trois semaines, l'aspirine demeurait a un niveau appréciable dans la diète. Au Tableau W,
les résultats démontrent une légère hydrolyse de l'aspirine lorsqu'elle est mise en contact avec la
diète (96041 de la quantité initiale demeure intacte). Au bout de trois semaines, environ 75?/0* de
la quantité d'aspirine initiale est encore présente, sauf pour la formulation tamponnée qui se
retrouve a 69%' (comparé à 96%' *P I 0,0001, Student's t-test). Le fait d'entreposer la diète
peut donc affecter la stabilité de I'aspirine, en particulier avec la formulation tamponnée. Ceci
pourrait expliquer en partie la faible inhibition, par l'aspirine tamponnée, de la himorigenese
puIrnonaire induite par la NNK (voir
En conclusion, l'aspirine n'est pas toxique, à 294 mg/ kg de diète, mais sa stabilité est
affectée par l'entreposage. L'effet de chimioprévention du sulindac semble être spécifique a
certains cancérogènes. En présence d'un agent de promotion moral, le sulindac ne semble pas
avoir d'effet chimiopréventif Une voie à explorer pour la chimioprévention par les AINS serait
1' inhibition des P-450 qui activent métabol iquement les cancérogènes.
2-0 CEEMOPREVENTIVE EFFICACES OF ASPlRIN AND SULINDAC AGAINST
LUNG TUMORIGENESIS IN A/J M K E
2-1 Résumé français
Les anti-infiammatoires non stéroïdiens (AINS) sont parmi les médicaments les plus
prescrits. Dans cette étude, nous démontrons l'efficacité de l'aspirine à inhiber la tumongenèse
pulmonaire chez la souris A/J. Les himeurs pulmonaires (9.9 tumeurs/souris) ont été induites par
une nitrosamine spécifique au tabac, la 4-(méthy1nitrosamino)- 1 -(3-pyridy1)- 1 -butanone (NNK),
administrée dans l'eau a boire entre les semaines O à +7. Quatre groupes de souris ont été nomis
avec la diète AM-76A contenant soit du sulindac (123 mgkg diète), de l'acide acétylsalicylique
(AAS; 294 rnglkg), de ~ ' ~ s ~ i r i n e " régulière (294 mgkg) ou de l '~s~ i r ine@ tamponnée (294
mgkg), de la semaine -2 jusqu'a la fin du dosage biologique (semaine +23). Ces doses sont
comparables aux doses maximales recommandées chez l'humain. L'AAS et ~ ' ~ s ~ i n n e *
régulière ont été les inhibiteurs les plus efficaces et ont réduit les multiplicités pulmonaires de 60
et 62%, respectivement. Le sulindac a inhibé la multiplicité tumorale pulmonaire de 52%.
L'inhibition de 18% par 17~spirineC tamponnée n'est pas statistiquement significative. Nous
avons évalué I'efticacité des AINS à inhiber l'activation de la NNK par les cellules hlA2 v2
exprimant le P-450 1A2 humain. L'acide salicylique et l'acide acétylsalicylique, aux doses de
500 p.M et 1 mM, n'ont pas inhibé le métabolisme de la NNK Le sulindac et ses métabolites
sulfide et sulfone ( 1 mM) ont inhibé le métabolisme de la NNK de 90, 92 et 6596,
respectivement. Nous avons observé une inhibition de 76% avec le SKF 525A, un inhibiteur des
P-450. L'ensemble de ces résultats indiquent que les salicylates et le sulindac peuvent être des
agents de chimioprévention efficaces mais qui différent dans leur mode d'action.
2.2 Article
Chemopreventive efficacies of as pi^ and sulindac
against lung tumorigenesis in A/J mice
Caroline Duperron and Andre ~ a s t o n ~ u a ~ l
Laboratory of Cancer Etiology and Chemoprevention, School of Pharmacy,
Laval University, Quebec City, Canada, G 1K 7P4
Key words: Anti-inflarnmatory agents; cytochrome P-450; N-nitrosamines; tobacco
1 Corresponding author: Dr Andre Castonguay
Laboratory of Cancer Etiology and Chemoprevention
School of Pharmacy, Laval University
Quebec City, Canada GI K 7P4
Running title: Efficacies of aspirin and sulindac
Published in: Carcinogenesis (vol. 1 8 n05, pp. 100 1 - 1006, 1 997)
A bbreviations
NSAIDs : non-steroidal anti-infiammatory dmgs
NNK : 4-(methy1nitrosamino)- 1 43-pyridy1)-1 -butanone
ASA : acetylsalicylic acid
SA : sdicylic acid
A bstract
Non-steroidai anti-inflanmatory drugs (NSAIDs) are among the most widely prescnied dnigs.
In this study, we demonstrated the efficacy of aspirin to inhibit lung tumorigenesis in A/J mice.
Lung tumon (9.9 tumordmouse) were induced by the tobacco-specific nitrosamine, 4-
(methylnitrosamino)-I-(3-pyridy1)- l - b u t a n (NMC), administered in drinking water between
week O and week +7. Groups of mice were fed sulindac (123 mgkg diet), aceîylsalicylic acid
(ASA; 294 mg/kg), non-buffered ~ s ~ i r i n @ (294 rng/kg) or buffered ~ s ~ i r i n @ (294 mgkg) in
AIN-76A diet from week -2 to the end of the bioassay (week +23). These doses are comparable
to the maximal doses recommanded for humans. ASA and non-buffered ilspirina were the most
effective inhibitors and reduced lung multiplicities by 60 and 62%- respectively. Sulindac
inhibited lung tumor multiplicity by 52%. Miiiition by buffered ~ s ~ i r i n @ was not statistically
significant. We evaluated the eficacies of NSAlDs to inhibit NNK activation by hlA2 v2 cells
expressing human P-450 1A2. Salicylates, at doses of 500 p M and 1 mM, had no effect on NM(
activation. Sulindac and its sulfide and sdfone metabolites (1 rnM) inhibited NNK metabolism
by 90, 92 and 6596, respectively. We observed a 76% inhibition with SKF 5 2 5 q a P-450
inhibitor. Taken together, these results indicate that salicylates and sulindac could be equally
effective as chemopreventive agents, but they could differ in their mode of action.
Introduction
Aspirin is a non-steroidal anti-idammatory drugs (NSAIDs) extensively used for its analgesic,
anti-pyretic and anti-rheumatic properties ( 1). Retrospective and prospective epidemiological
studies (reviewed in 2) concluded that regular use of aspirin reduces the risk of colorectal cancer.
In a large US cohon study, participants were asked about their intake of aspirin dm-ng the month
before the initial interview. The results reveaied a reduced incidence of lung cancer associated
with increased aspirin use (3). In a prospective study, Thun and al. (4) observed no association
between aspirin use and the risk of respiratory cancer. The debate on the effectiveness of aspirin
in preventing or delaying lung cancer development needs to be explored M e r . Data fiom
laboratory studies c m provide rationales and incentive for investîgating the efficacy of aspirin in
lune cancer prevention.
Sulindac is a prodrug that is absorbed rapidly fiom the human gastrointestinal tract and
metabolized mainly in the liver to sulfide and sulfone intermediates (5 -6 ) . Structures of suiindac
and its two metabolites are show in Figure 1. The sulfide metabolite has analgesic, anti-pyretic
and anti-inflarnmatory properties (5 ) . Rend elimination of sulindac occurs via ils sulfone
metabolite (5, 7). This metabolite exhibits no anti-infiammatory property (8). h addition to its
anti-inflammatory properties, sulindac is a chemopreventive agent, that causes regression of
large-bowel polyps in patients with familial polyposis (9).
In parallet with clinical studies, numerous models of animal turnon were used to
demonmate the inhibition of chemically induced cancers by various NSAIDs, such as piroxicam
(colon), indomethacin (esophagus, pancreas, tongue, mammary gland, uterine c e ~ x ) , ibuprofen
(colon) and sulindac (colon) (1 0-16). Reddy er al. (1 7) demonstrated that aspirin inhibits colon
carcinogenesis in rats by 70%. Sakata et al. (18) observed that aspirin CO-administered with N-
[4-(5-nitro-2-furyl)-2-thiaz01yl]formamide inhibits the incidence of bladder carcinoma in rats bp
80%. Our research group was the fint to show that NSAIDs, and especidly sulindac, are
effective against lung tumongenesis in laboratory animals ( 19,20). We reported that sulindac, in
non-toxic doses reduced the multiplicity of lung himon in A/J mice by 50% (1 9, 20). Aspirin
was not included in our previous studies.
Tobacco smoke contains over 4000 compounds, 43 of which are known to be carcinogens
(2 1 ). One of these carcinogens is a nicotine-derived nitrosamine, 4-(methy1nitrosamino)- 1 4 3 -
pyridyl)-1-butanone (NNK). NNK is present in mainstream smoke of commercial cigarettes at
levels ranging from 6 to 197 ng in Arnerican cigarettes (22,23) and from 6 to 97 ng in Canadian
cigarettes (24). Hecht and Hoffmann suggested a causal relationship between NNK and
pulmonary carcinogenesis related to tobacco smoking (25). NNK is a potent lung carcinogen in
laboratory animals, such as A/J mice (26, 27). Studies with microsomes prepared either fiorn
hurnan liver and lung tissues or fkom transfected human ce11 lines demonmated that NNK is a
pro-carcinogen activated by cytochrome P-450 isoenzymes 1A2, 2A6, 2D6 and 2E1 (28-32).
Pathways of NNK activation by a-carbon hydroxylation are show in Figure 2. Smith et ai. (33)
demonstrated that purïfied human cytochrome P450 1 A2 incorporated into a reconstituted
system can catalyze the activation of N N K .
The aims of this study were: i) to determine the efficacy of aspirin as a chemopreventive
agent of lung carcinogenesis; ii) to investigate NM( metabolism in cells expressing human P-450
1 s ; iii) to compare, in these cells, the inhibition of NNK activation by aspirin, sulindac and its
sulfide and sulfone metabolites.
Materials
Chernicals
NNK (98%
and methods
purity) and [S~WNNK (2.4 Ci/mrnole, h 97.4% purity) were purchased from 1
Chemsyn Science Lab. (Lenexa, KS). Sulindac and acetylsalicylic acid (ASA) were purchased
from Sigma Chernical Co (Mississauga, Ont., Canada). Bayer non-buffered ~spi r in@ and Bayer
buffered ~spi r in@ (Sterling Winthrop Inc., Ont., Canada) were purchased in a local market in
October 1993.
Lung tumor assay in A J mire
Female A/J mice (6-7 weeks old) were obtained £tom Jackson Labonitories (Bar Harbor, ME).
They were housed in groups of five per cage and kept under standard conditions (22 * Z°C; 45 * 5% relative humidity; 12: 12h light-datk cycle). They were sorted out on weight basis into six
groups and given tap water and powdered AIN-76A diet from Harlan-Teklad (Madison, W) ad
libitum. Powdered NSAIDs were mixed with the diet and two feeders were placed in each cage;
diet consumption and spillage were monitored three times before and afier carcinogen treatment.
Stock solutions of NNK were prepared in distilled water (3.49 mg/ml) and diluted in tap water.
The initial concentration of NNK was 87,4 pg/ml and was adjusted thereafter for each cage
according to water consurnption. Water consurnption which was monitored twice a week for 7
weeks.
Details of the treatment with NM( and the chemopreventive agents are included in Table
1. Group 1 received the diet without a chemopreventive agent and were given water ad [ibirum.
Groups 2-6 received NNK in drinking water for 7 weeks. Group 2 was fed AM-76A without
NSAIDs. Groups 3-6 were fed NSAIDs 2 weeks before the treatment with MW and throughout
the whole assay. Group 3 was fed AIN-76A supplemented with sulindac at a dose of 123 mgkg
of diet, which is below the maximal tolerated dose as detemined previously (20). Groups 4, 5
and 6 were given diets containing ASA, non-buffered ~ s ~ i r i n @ and buffered ~ s ~ i r i n @ ,
respectively. Doses of ASA were less than 50% of the maximal tolerated dose.
At 16 weeks after the end of the NNK treatment, the mice were fasted ovemight, killed by
CO2 asphyxiation and wcropsied Lungs were fixed in Tellyesniczky's fixative for 7 days before
counting the number of surface adenornas larger than 1 mm. Stomachs were fixed in situ with
0.5 ml of 10% fornalin, excised and stored in fornialin. Papillomas larger than 1 mm were
counted.
Ceils c u h e
AHH TK+/- human lymphoblastoid ce11 lines (cHol and hlA2 v2) were purchased from Gentest
Corporation (Woburn, MA). cHol, the negative control, is a ce11 line containing
extrachromosomal plasmid vectors that confer resistance to L-histidinol. This ceIl line expresses
low level of P-450 activities. Tne hlA2 v2 ce11 line expresses hurnan CYPlA2 with basal
CYPl Al activity. The cells were maintaineci in culture in RPMI 1640 medium (Gentest) and
supplemented with hone serum 9% v/v (Gentest), L-glutamine (292 pg/mI) and gentarnicin (50
pg/ml) (Sigma Chernical Co.).
Assuy of .WTK merabolism
The cells 1 3 x 1 0 ~ 1 3 ml) of the 25 cm2 Falcon tissue culture flask were incubated with 8 [5-
3~~ ( L9.2 @ / m l ) without NSAIDs or with: 1 mM ASA; 1 mM salicylic acid (SA); 1 mM
sulindac; 1 mM sulindac sulfide; 1 m . sulindac sulfone; 100 pM SKF 525A (a P-450 inhibitor).
Afier 48 h of incubation, the cells and the media were centrifuged at 1500 g and harvested. The
medium \vas filtered with a 0.45 pm Minisart filter (Sartonus, Germany) and fiozen at -20°C
until its analysis.
The medium was analyzed for NNK and NNK metabolites on a reverse-phase HPLC
system, using a Spherisorb ODS 2, 5 pm column 4.6 x 250 mm (Jones Chromatography Inc,
Columbus, OH). Aliquots of 750 jd of the filtered medium and 7 pI of the NNK metabolites
standards were CO-injected and eluted with a pH 6.0 sodium acetate buffier and methanol as
descnbed previously (34). The eluent was monitored at 254 nm and 1 ml hctions were
collected. Aliquots of 5 ml of Scintiverse II (Fisher Scientific, Montreal, Canada) was added to
each fraction and radioactivity was measured.
Kinetzc of ASA hydrolysis
Stock solution of ASA 10 rnM was prepared with 9-0 1 mg AS& 0.4 ml o f 2% NaHCO3 and 4.6
ml of culture medium. ASA (1 mM) was added to 3 ml o f ce11 culture media (with lx10~/rnl or
without cells). Incubations were performed at penods ranging fiom O min to 48 h. As descnbed
above, cells and media were then harvesîed.
Levels of ASA and SA in culture media were measured by a reverse-phase HPLC. The
HPLC system consisted of a Waters 501 pump, Rheodyne 7125 injecter, Waters 441 UV
detector, Hewlett Packard 3390A inte-ptor and a C l 8 pl3ondapak column (3.9 x 300 mm;
Waters, Milford, MA). Aliquots of 100 pl of the filtrate were injected and eluted with an 0.35N
acetic acidxnethanol mobile phase (7525, v/v) during a 20-minute period at a flow rate of 1.2
mvmin. The eluent was rnonitored at 280 nm- Retention tirne was I l min for ASA and 16 min
for SA. Results were calculated frorn the linear regression cuve, which related peak areas and
the given concentrations of ASA and SA. Concentrations of salicylates in culture medium were
compared by a split-plot statistical analysis.
Results
Lung adenornas assay
The numbers o f tumors induced by NNK with or without NSAIDs are shown in Table 1. The
total dose of NNK was 9.1 mg per mouse. The number of lung m o r s in untreated rnice was
low (0.2 tumor/mouse) and comparable to previous snidies (35). Treatment with NNK induced
9.92 tumors/mouse, but this number ivas reduced to 4.72 ~ o r s / m o u s e (52% inhibition) in rnice
treated with sulindac. ASA and non-buffered ~s~irin@ reduced lung nimor multiplicity to 3.93
(60%) and 3.7 1 nunon/mouse (62%), respectively. In contrast, buffered Aspirin@ had negligible
effects on lung tumorigenesis. Body weight gains of NNK-treated mice were 1 1 to 2 1 % lower
than the untreated mice (Table 1). Therefore, giving NNK in drinking water for 7 weeks delays
the gain of body weight. m e r the end of NNK treamient, body weight gains resumed Body
weight gains of NNK- and NNK+ NSAIDs-treated rnice were not significantly diflerent.
Metabolrsm ofh(7trK
In the presence of hlA2 v2 cells, about 50% of NNK were converted to NNAL after 48 h (data
not shown). Metabolic activation of NNK is initiated by a-carbon hydroxylation (Figure 2). The
four end products of this activation are the metabolite numbers 10, 1 1, 12 and 13. These
numben refer to structures in Figure 2. The sum of the NNK metabolites reflect the extent of the
total activation of NNK. The extent of NNK metabolism and its inhibition by salicylates,
sulindac and the two sulindac metabolites are shown in Table II and III respectively. Results
shown in Table II indicate that neither ASA nor SA (500 phd or 1 mM) inhibits NNK a-carbon
hydroglation. As shown in Table III, sulindac and its sulfide and sulfone metabolites at 1 mM
concentrations inhibited NNK metabolism by 90,92 and 65%, respectively. SKF 5 2 5 q a P450
inhibitor, was used as a positive control and inhibited the metabolism of NM( by 76%.
Rate ofASA hydrolysis
Results of the stability of ASA in the culture media over a 48-h penod, in the presence and
absence of hlA2 v? cells, are shown in Figure 3. Hydrolysis occurred linearly with time. Mer
18 h, aimod al1 ASA had been hydroIysed to SA. The extent of hydrolysis of ASA to salicylates
was higher with rather than without hlA2 v2 cells between O and 12 h (P < 0.00 1).
Discussion
The incidences of lung cancer among the Canadian population reached 22% in men and 11% in
women (36). Considering the low 5-year suxvival rate (8-12%) of lung cancer, prevention
becomes a realistic alternative. The use of NSAIDs in clinical trials on the chemoprevention of
colorectai cancer has s h o w promising results, but no information on the effectiveness of these
agents against lung cancer is available. Obviously, a better understanding of the mechanism of
the action of NSAIDs wodd help in the design of chemoprevention clinical trials.
This midy is the first one to demonstrate the effectiveness of aspirin in inhibiting lung
tumorigenesis in laboratory animals. This observation is particularly signifiant considering that
it has been estimated that 10-20 thousand tons of aspirin are consumed in the USA every year ( 1 ).
The doses of NSAIDs used in this study are comparable to the maximal recommended daily
doses for humans. In this study, we used non-buffered ~ s ~ i r i n @ at a dose of 3 1.7 mgkg of body
weight, while the recommended maximal anti-pyretic and anti-inflamrnatory doses are 55.7 and
83.6 mgkg of body weighf respectively. These results lead to the hypothesis that regular use of
aspirin might reduce the risk of lung cancer in srnokers.
Previous studies in our laboratory (19, 20) have shown that NSAIDs other than aspirin
inhibit pulmonary carcinogenesis. These studies demonstrate that the extent of inhibition vanes
depending on the type of NSkID. While sulindac was effective against NM(-induced lung
tumorigenesis, ibuprofen and piroxicarn were less effective and naproxen had no effect In this
study, we observed 52% inhibition with the use of sulindac. This result is comparable to the
percentage inhibition previously reported (51 and 53%) (19, 20). ASA and non-buffered
~ s ~ i r i n @ reduce by 60 and 62%, respectively, the number of lung tumors (Table 1). Our results
demonstrate that aspirin is as effective as sulindac in preventing lung carcinogenesis.
One of the major side effects of ASA is its mc toxicity. Vanous formulations of
aspirin, such as non-buffered, buffered and enteric-coated formulations, have been developed to
eliminate this problem. The absorption of ASA can be infiuenced by many factors: tablet
solubility, gamic pH, rate of disintegration and food ingestion. In a study on aspirin
phmacokinetics in rats, Fu et al. (37) compared the bioavailability of buffered and unbuffered
ASA. The unbuffered formulation was found to give higher AUC (area under curve) than the
buffered formulation. Fu et al. attributed this difference to the shift of the absorption of the
aspirin from the stomach to the intestine (where the aspirin may be more hydrolysed). Our
results show that while non-buffered ~s~irin@ and ASA reduce the lung tumor multiplicity,
buffered ~ s ~ i r i n @ has no significant effect (Table 1). An increased gastric pH, related to the
buffer and food absorption could have reduced or delayed aspirin absorption. Our results
demonstrate that the fomulation of NSAJDs has an impact on their chemopreventive eficacies
in A/J mice.
A previous study has demonstrated that a-carbon hydroxylation of NNK is catalysed by
various P-450s, including human P-450 1A2 (30). Our results confirm these observations.
Human lymphoblastoid cells that express human P-450 1A2 catalyze a-carbon hydroxylation
(activation pathway, Table LI) but not pyridine N-oxydation (detoxification pathway) of NNK
(data not shown). We observed no inhibition of NNK metabolism even at relatively high
concentrations of ASA (500 pM and 1 mM) or SA (1 mM). These results correlate with other
studies that show that aspirin does not affect the metaboiism of NNK (38, 39). Using rat lung
rnicrosomes, Smith et a!. (38) observed a 0-9% inhibition of the NNK metabolism by aspifin at
concentrations varying from 30 to 300 W. With rat liver microsomes, Guo et al. (39) observed
no inhibition of NNK metabolism with a 100 p M aspirin. We conclude that inhibition of
turnorigenesis by aspirin could not involve an inhibition of NMC activation by P-450 1A2.
Aspin'n is hown to be an inhibitor of prostaglandin synthesis (40). Bilodeau er al. (4 1 )
reported that sulindac reduces plasma levels of PGE2 by 5 1 %, and that naproxen has no effect.
Considering that PGE2 favors clonal expansion of initiated cells, Bilodeau et al. (41) suggested
that lower levels of PGE2 would delay tumor development. Further studies by our research
group are focusing on the role of the inhibition of prostaglandin synthesis, which is a crucial
element in lung cancer chemoprevention.
In order to study the effect of ASA on NNK metaboIism, our research group decided to
dissolve ASA in a culture medium at pH 7.6. However, Thiessen (42) has reported that ASA is
quickly hydrolysed to SA in aquous solutions. As a result, we also had to determine the rate of
ASA hydrolysis by hlA2 v2 cells. h the first part of the curve (hm O to 18 h), we observed a
difference between results with cells and results without cells. This difference was probably due
to a cellular absorption of ASA. These results show that we still had half of the initial amount of
ASA after 12 hours.
Sulindac is an anti-inflammatory prodrug that has to be reduced to a sulfide to exhibit
anti-idammatory effectiveness. Sulindac sulfone, a second metabolite, is formed by an
irreversible oxidation of the sulfoxide function. In this study, we observed that sulindac and its
two metabolites, at a concentration of 1 mM, inhibited the metabolism of NNK in hlA2 v2 cells.
Results in Table III show that sulindac sulfide is more effective in inhibiting NNK metabolism
than sulindac sulfone is (92% vs 65%). SKF 525A, a P-450 inhibitor, inhibited NNK metabolism
(see Table III). Because the P-450 1A2 is the only P-450 in the hlA2 v2 cells, we c m conclude
that sulindac and its sulfide metabolite act by inhibiting this P-450 isoform, which activates
NNK. These results are in line with our previous study showing that the metabolism of NNK by
mouse lung tissues was inhibited by sulindac sulfide (43).
In summary, the results of this study show that aspirin is a lung chemopreventive agent
that is as effective as sulindac in N J mice; aspinn does not inhibit N N K activation by the human
P-450 1A2,
Acknowledgments
We gratefully acknowledge Dr Marlene Bouillon for her precious advise. We also thank Dr D.
Lévesque and R. De La Durantaye for their technical assistance in the tumor inhibition study.
This study was supported by a gant from the Cancer Research Society Inc. (Canada).
ASA
Sulf ide metabolite Sulfone metabolite
Fig. 1 . Biotransfonnation of ASA and sulindac to their metabolites.
9 1 + HCHO
Fig. 2. Metabolic pathways of NNK in hlA2 v2 cells. Structures in brackets are hypothetical
intermediates.
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2 Time (hour)
O 5 10 15 20 2 5 30 35 4 0 4 5 5 0 Tirne (hour)
Fig. 3. Kinetic of ASA hydrolysis with or without hlA2 v2 cells. B, ASA; a, ASA with hlA2
v2 cells; 0, SA; O, SA with h 1 A2 v2 cells. Each point corresponds to the mean * SD ( ~ 3 ) .
Table III. Metabolism of NNK in hlA2 v2 cells cultured with or without sulindac, with ils sulfide
and sulfone metabolites NSAlDs Metabolites (prno~lrnl)~
No. 1 able No. 1 1 No. l Z e No. 13e 10+11+12+13e
NoneC (n= 1 ) 1 2 N. D, 4,3 4,9 1 0,4
~ o n e ~ (n=4) 20,6 I 8,6 7,3 * 2,O 18,317~5 29,9113~1 76,O i 24,9
Sulindac 1mM (n=2) N.D! 2,5 * 3,5 3,3 I4,7* 1,8 I 2,5* 7,5 &10,6*
Sulindac sulfide N.D. 3,3 î 4,7 2,8 I 3,9* N. D, 6,1 * 8,6* 1 mM (n=2)
Sulindac sulfone N. D. 12,8 k 1,8 8,5 f 12,O 5,5 * 7,7* 26,8 I 6,1* 1 mM (n=2)
SKF 525A 100pM(n=3) 2,2 I 3.8" 133 * 5,6 2,O h 3,5* N.0, 18,l k 1,8*
a Mean S,D, Numbers refer to Figure 2. cHol (control cells not transfected).
d hlA2 v2 (transfected cells). Statisticalty different from hlA2 v2 transfected cells ('P < 0,05, Student's t-test).
f N.D., not detected (4 ,7 pmollml).
2.3 Références bibliographiques de l'article
1 .Goodman Gilman, A., Goodman, L.S. and Gilman, A. (1990) Analgesic-antipyretics,
antiinflammatory agents: the salicylates. In Goodman Gilrnan, A., Goodman, L.S. and
Gilrnan, A. (eds), The pharmacoZogica2 Baris of Therapeutzcs, 8th edn. Macmillan
Publishing Co, New YorK, pp. 644-654.
2.Tmjill0, M.A., Garewalà, HS. and Sampliner, R.E. (1994) Nonsteroidal antiinflamrnatory
agents in chemoprevention of colorectal cancer: at what cost? Dig. Dis. Sri., 39,2260-
2266.
3.Schreinemachers, D.M. and Everson, R.B. ( 1994) Aspinn use and lung, colon, and
breast cancer incidence in a prospective study. EpidemioL, 5, 138-1 46.
4.Thur1, M.J., Namboodin, M.M., Calle, E.E., Flanden, W.D. and Heath, C. W.Jr.
( 1 993) Aspinn use and risk of fatal cancer. Cancer Res., 53,13224327-
S.Brogden, RN., Heel, R.C., Speight, T.M. and Avery, G.S. (1978) Sulindac: a review of its
pharmacological properties and therapeutic eficacy in rheumatic diseases. Drugs, 16,
97- 1 14.
6.Duggan, D.E. (1 98 1 ) Sulindac: therapeutic implications of the prodrug/pharmacophore
equilibrium. Dmg Merab. Rev., 12,325-337.
?.Strong, H.A., Warner, N.J., Renwick, A.G. and George, CF. (1985) Sulindac metabolism:
The importance of an intact colon. C h Pharmacol. Ther., 38, 3 87-393.
8.Va.n Arman, CG., Risley, E.A., Nuss, G. W., Hucker, H.B. and Duggan, D.E. ( 1 976)
Pharmacoiogy of sulindac. In Huskisson, E.C. and Franchimont, P. (eds), CIinoriZ in the
treutment ofrheumat ic disorders: A new nonsteroidal mtiinfammato ry 'analgesic agent.
Roceedings of a Symposium Vm European Rheumatology Congress, Helsinski 1-7 june
1975. Raven Press, New York, p.9.
9. Waddell, W-R and Loughry, R.W. (1983) Sulindac for p o l p s i s of the colon. J. Surg.
Once[., 24,8347.
10-Reddy, B.S., Maruyama, H. and Kelloff, G. ( 1987) Dose-related inhibition of colon
carcinogenesis by dietary piroxicam, a nonsteroidal antiinflammatory dnig, during
different stages of rat colon tumor developrnent Cancer Res., 47,5340-5346.
I 1 .Rubio, C.A. (1 98.1) Antitumoral activity of indomethacin on experimental esophageal
tumors. J. Nat!. Cancer Insr., 72, 705-707.
12.Takahashi, M., Funikawa, f , Toyoda, K., Sato, H., Hasegawa, R., Irnaida, K. and Hayashi, Y.
( 1 990) Effects of various prostaglandin synthesis inhibiton on pancreatic carcinogenesis
in hamsters after initiation with N-nitroso bis(2-oxopropyl)amine. Carcinogenesis, 1 1,
393-395.
13.Tanaka, T., Nishikawa, A., Mon, Y., Morishita, Y. and Mori, H. ( 1989) Inhibitory efFects of
non-steroidal anti-inflarnmatory drugs, piroxicam and indomethacin on 4-nitroquinoline
1 -o?lide-induced tongue carcinogenesis in male ACVN rats. Cancer Leu., 48, 1 77- 1 82.
14.Carte, C.A., Milholland, R.J., Shea, W. and Ip, M.M. ( 1 983) Effect of the prostanglandin
synthetase inhibitor indomethacin on 712-dimethyiberu(rr)anthracene-induced mammary
tunorigenesis in rats fed different levels of fat. Cancer Res., 43,3559-3562.
I S.Rao, A.R. and Hussain, S.P. ( 1988) Modulation of rnethylcholanthrene-induced
carcinogenesis in the uterin cem-x of mouse by indomethacin. Cancer Letr., 43, 15- 19.
16.Ra0, C.V., Rivenson, A., Simi, B., Zang, E., Kelloff, V.S. and Reddy, B.S. ( 1995)
Chemoprevention of colon carcinogenesis by sulindac, a nonsteroidal anti-
infiammatory agent. Cancer Res., 55, 1464-1472.
17.Reddy, B.S., Rao, C.V., Rivenson, A. and Kelloff, G. (1993) Inhibitory effect of aspirin on
azoxymethane-induced colon carcinogenesis in F344 rats. Cmcinogenesis, 14, 1493-
1497.
I8.Sakata, T., Hasegawa, R-, Johansson, S.L., Zenser, T.V. and Cohen, S.M. (1 986) Miibition
by aspirin of N-[4-(5-ni~o-2-~l)-2-t~azoIyI]fomiaide initiation and sodium sacchanen
promotion of winary bladder carcinogenesis in male F344 rats. Cancer Res., 46,3903-
3906.
19.Pepin, P., Bouchard, L., Nicole, P. and Castonguay, A. (1992) ERects of sulindac and
oltipraz on the tumongenicity of 4-(methylnitrosamino)- 1-(3-pyridyl)- I -butanone in A/J
mouse lung. Carcinogenesrs, 13,34 1 -348.
20.Jalbert, G. and Castonguay, A. ( 1992) Effects of NSALDs on NNK-induced pulmonary and
gasm'c turnongenesis in NJ mice. Cancer Leu. , 66,7 1-28.
2 1 .U.S. Department of Health and Human Services. ( 1989) Reducing the health consequences
of smoking, 25 years of progress. Office on Smoking and Health. DHHS Publication No
CDC-89-84 1 1, 79- 10 1.
22.Adams, J.D., Lee, S.J., Vinchkoski, N., Castonguay, A. and Hoffmann, D. ( 1983) On the
formation of the tobacco-specific carcinogen 4-(methy1nitrosamino)- 1 -(3-pyridyl)- 1 - butanone during smoking. Cuncer Lett., 17,339-346.
23.Fischer, S., Spiegehdder, B., Eisenbarth, J. and Preussmann, R. (1990) Investigations on the
origin of tobacco-specific nitrosamines in mainstrearn smoke of cigarettes.
Carcinogenes is, 1 1,723 -73 O.
24.Fischer, S., Castonguay, A-, Kaïserman, M., Spiegelhalder, B. and Preussmann, R. (1990)
Tobacco-specific nitrosamines in Canadian cigarettes. J. Cuncer Res. C h Oncol., 1 16,
563-568.
ZS.Hecht, S.S. and Hoffmann, D. (1 989) The relevance of tobaccu-specific nitrosamines to
human cancer. Cancer S u n , 8,273-294.
26.Hecht, S.S. and Hoffmann, D. (1988) Tobacco-specific nitrosamines, an important group of
carcinogens in tobacco and tobacco smoke. Carcznogeneszs, 9,875-884.
Z7.Belinshy7 S.A., Stefanski, S.A. and Anderson, M.W. (1993) The A/J mouse h g as a mode1
for developing new chernointervention strategies. Cancer Res., 53,4 10-4 16.
28.Gonzale~ F.J., Crespi, C.L. and Gelboin, H.V. ( 1 99 1 ) cDNA-expressed human c'ochrome
PJSOs: a new age of molecular toxicology and human risk assessment. Mutuf. Res., 247,
113-127.
Zg.Yamazaki, H., Inui, Y., Yun, CH., Guengerich, F.P. and Shimada, T. ( 1992)
Cytochrome P450 2E 1 and 2A6 enzymes as major catalysts for metabolic activation of
N-nitrosodial~lamines and tobacco-related nitrosamines in human liver microsomes.
Carcinogenesis, 13, 1 789- 1 794.
30.Srnith, T.J., Guo, Z., G o d e z , F.J., Guengerich, F R , Stoner, G.D. and Yang, CS. (1992)
Metabolim of 4-(methylnitrosmino)- 1 -(3-pyridy1)- 1 -butanone in human lung and liver
microsomes and cytochromes P-450 expressed in hepatoma cells. Cancer Res., 52, 1 757-
1763.
3 1 .Penman, B.W., Reece, J., Smith, T., Yang, C S . , Gelboin, H.V., Gonzalez, F.J. and Crespi,
CL. (1993) Characterization of a human ce11 line expressing high levels of cDNA-
derived CYP2D6. Plzarmacogenetics, 3 ,2 8-3 9.
32.Smith, T.J., Stoner, G.D. and Yang, C.S. (1995) Activation of 4-(methylnitrosarnino)-I-(3-
pyridy1)-1-butanone (NNK) in human lung microsomes by cytochromes P450,
lipoxygenase, and hydroperoxides. Cancer Res., 55,55664573-
33.Smith, T.J., Guo, Z-Y., Guengerich, F.P. and Yang, C.S. ( 1995) Metabolism of 4-
(methylnitrosamino)- 1 -(3-pyridyl)- 1 -butanone (NNK) by human cytochrome P450 1 A2
and inhibition by phenethyl isothiocyanate (PEITC). P roc. Am. Assoc. C'ancer Res., 36,
153.
34.Jorquera7 R., Castonguay, A. and Schuller, H.M. ( 1992) Effects of pregnancy and ethanol
treatment on the metabolism of 4-(methy1nitrosamino)- 1 -(3-pyridy1)- 1 -butanone by
hamster liver and lune microsomes. Drug 1Cferab. Dispos., 20, 5 1 0-5 1 7.
35.Shimkin, M.B. and Stoner, G.D. ( 1975) Lung m o n in mice: application to carcinogenesis
bioassay. A h : Cancer Res., 21, 1-58.
36.National Cancer Institute of Canada. (1992) Cunadian Cancer Sfatzstics 1992. Toronto,
Canada, p. 14.
3 7 . F ~ C.J., Melethil, S. and Mason, W.D. (199 1) The pharrnacokinetics of aspirin in rats and
the effect of buffer. J. Pharmacokzn. Biopham., 1 9, 1 5 7- 1 73.
38.Smith, T.J., Guo, Z., Hong, J.Y., Ning, SM., Thomas, P.E. and Yang, C.S. (1 992) Kinetics
and enzyme involvernent in the metabolism of 4-(methy1nitrosarnino)-1-(3-pyridy1)-1-
butanone (NNK) in microsornes of rat lung and nasal mucosa. Carcznogeneszs, 13, 1409-
1414-
39.Gu0, Z., Smith, T.J., Thomas, P.E. and Yang, C.S. (1992) Metabolism of 4-
(metbylnitrosarnino)- I -(3-pyridyI)- l -butanone by inducible and constitutive cytochrome
P450 enzymes in rats. Arch Biochem Biophys., 298,279-286.
40.Mmett, L.J. (1992) Aspinn and the potential role of prostaglandins in colon cancer.
Cancer Res., 52, 5575-5589.
4 1 .Bilodeau, J.F., Wang, M., Chung, F.L. and Castonguay, A- (1995) Effects of nonsteroidal
antiinflammatory drugs on oxidative pathways in PL/J mice. Free Rud Bioi. Med, 18,
47-54.
42.Thiesser1, J.J. ( 1 982) Phannacokinetics of salicylates. In Barnett, H.J.M., Hirsh, J. and
Mustard, J.F. (eds), Aceylsahqviïc acid: new usesfor an old d q . Raven Press, New
York, pp.49-6 1.
43.Bouchard, L. and Castonguay, A. ( 1993) Inhibitory effects of nonsteroidal antiinflammatory
drugs (NSAIDs) on the metabolism of 4-(methy1nitrosamino)-1-(3-p*dyl)- I -butanone
( N N K ) in rnouse lung explants. Bng Metab. Disp., 21,793-398.
CONCLUSION GÉNÉRALE
Les résultats obtenus laissent présager que l'aspirine pourrait prévenir la cancérogenèse
pulmonaire humaine induite par la N M , un cancérogène de la fumée de cigarette. Bien que nos
observations aient été faites chez la souris, des études épidémiologiques chez l'humain laissent
aussi sous-entendre que l'aspirine pourrait être bénéfique dans le cas du cancer du poumon. Le
problème de ces études est que l'effet préventif de l'aspirine sur le cancer du poumon n'était pas
le but principal de l'étude, mais un à-côté. Donc, si des résultats similaires sont obtenus avec
l'aspirine dans des études subséquentes chez la souris, ceci confirmerait la validité et la
constance des obsenations. faudrait d o n penser à mener une étude épidémiologique centrée
sur la prise quotidienne d'aspirine et son impact sur la cancérogenese pulmonaire.
Chez l'animal, l'effet préventif de l'aspirine s'observe à une dose comparable à celle
administrée quotidiennement a un humain. Suite à l'absence d'inhibition de la tumongenèse
pulmonaire par la formulation tamponnée, il serait intéressant d'évaluer l'absorption, la
distribution et la clairance de l'acide acétylsalicylique (avec et sans tampon) et des comprimés
commerciaux dans le sang des souris A/J. Ceci fournirait des informations sur I'influence
possible du tampon dans le dosage biologique. Un autre champ de recherche intéressant serait
d'identifier de quelle façon I'inhibition, par l'aspirine, de la synthèse des prostaglandines pourrait
être reliée au processus de cancérogenese.
In vivo et in virro, le sdindac est très efficace a inhiber le métabolisme de la NNK. Mais il
ne semble pas être aussi efficace lorsqu'un agent de promotion tumoral ou un autre cancérogène
est présent. Dans les cas de la NNK et du B(a)P, I'activation métabolique peut ê e due à un P-
450 différent. 11 serait utile, dans le fùtur, d'étudier si les P-450 impliqués dans I'activation de
ces cancérogènes peuvent être inactiver par un A M S comme le sulindac. Une autre possibilité
serait de vérifier si I'immunosupression est un facteur important dans la chimioprévention, par le
sulindac, de la tmnorigenèse pulmonaire. En effet, la NM( est irnmunosupressante et non le
B(a)P. Enfin, pour s'assurer que le sulindac est vraiment sans effet contre la promotion
tumorale, il faudrait administrer ce dernier aux souris avant la NNK et le BHT, pour voir s'il
empêche l'initiation des cellules pulmonaires.
1 Chahinian, A.P. and Chrétien, J. ( 1 976) Present incidence of lung cancer: epiderniologic data
and etiologic factors. In Israel, L. and Chahinian, A.P. (eds), Lung cuncer. Naturul
hzsfow prognoszs, and rherapy. Academic Press, New York, pp. 1-5.
1. Jacquillat, C., Khayat, D., Weil, M. and Band, P.R (1 986) In Maloine (ed), Les cuncers.
Guide clinique. pronostique et thérupeutique. Décarie Inc, Ville Mom Royal, pp. 193-
194,357-358.
3.Institut national du cancer du Canada. ( 1995) S~utistiques canadiennes sur k cuncer. 1995.
Toronto, Canada, pp. 1 1-69.
4.Roy. L. ( 1985) Le pu& sur 2e.s hahirudes de vie: Ze tabac. Gouvernement du Québec, Conseil
des affaires sociales et de la famille, Québec, pp.69-84.
Department of Health and Hurnan Services. ( 1982) n e health consequences of smoking.
Cancer. a report of the Surgeon General. DHHS Publication No PHs-83-50 179. pp. 29-
63.
o.Fraumeni_ J.F.Jr, Hoover, R.N., Devesa, S.S. and Kinlen, L. J. ( 1 993) Epidemiology of cancer.
In Devita, V.T.Jr, Hellman S. and Rosenberg, S.A. (eds), C'uncer: prznciples and
prrrclke ofoncolop. J.B. Lippincott Company, Philadelphia pp. 1 70-1 79.
7.Dube. M.F. and Green C.R. (1981) Methods of collection of smoke for analyticai purposes.
Recmt A h . Tob. Sci. ,8,43- 1 02-
8.Intemationai Agency for Research on Cancer ( 1986) I.1RC Monogrupl~s on the Eva/uation of
the Ckrcznogenic Rzsk of Chernicals /O Human. I=oL 38. Tobacco Smkzng. IARC, Lyon,
France: pp. 84-124.
9.U.S. Department of Health and Hurnan SeMces. ( 1989) Reducing the health consequences of
smoking, 25 years of progress. Office on Smoking and Health. DHHS Publication No
CDC-89-84 1 1, pp. 79- 10 1.
1 O.Hofian.n, D. and Hecht, S.S. ( 1 985) Nicotine-denved N-nitrosamines and tobacco-related
cancer: current statu and future directions. Cancer Res., 45,935-9.
1 1 .Hecht, S.S. and Hoffmann, D. (1988) Tobacco-specific nitrosamines, an important group of
carcinogens in tobacco and tobacco smoke. Curcinogeneszs, 9,875-884.
12.Castonguay7 A-, Stoner, G.D., Schut, H.A.J. and Hecht, S.S. (1983) Metabolism of tobacco-
specific Knitrosamines by cultured human tissues. Proc. Natl. Ac& Scz. USA, 80,6694-
6697.
13.Liu, Y., Sundqvist, K., Belinsky, S.A.,Castonguay, A-, Tjalve, H. and Grafstram, R.C. (1993)
Metabolism and macromolecular interaction of the tobacco-specific carcinogen 4-
(methy1nitrosamino)- 1 -(3-pyridyl)- 1 -butanone in cultured explants and epithelial ce1 1s of
human buccal mucosa Carcinogenesis, 14,23832388.
14.Fischer, S., Spiegeihalder, B., Eisenbaa J. and Preussmann, R. ( 1990) Investigations on the
origin of tobacco-specific nitrosamines in mainstream smoke of cigarettes.
Carcinogeneszs, 1 1, 723-730.
1 S.Fischer, S., Castonguay, A., Kaiserman, M., Spiegelhalder, B. and Preussmann, R. ( 1 990)
Tobacco-specific nitrosamines in Canadian cigarettes. Cuncer Res. Clin. Oncol., 116,
563-568.
16-Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Watson, J.D. (1990) Le cancer. In
Médecine-Sciences (ed), Biologre mol&cu[aire de Ia cellule, îième édition. Flammarion.
Paris, pp. 1187-1218.
17.Kaplan- J.-C. and Delpech, M. ( 1990) In Médecine-Sciences (ed). Biologre mofr'cuhire et
médecine. Flammarion, Paris, p. 34 1 .
18.Castonguay, A., Pepin, P. and Stoner, G.D. ( 199 1 ) Lung tumorigenicity of NNIi given orally
to ALI mice: its application to chemopreventive efficacy studies. Esp. Lung Res., 17.185-
499.
19.Castonguay. A., Lin, D., Stoner, G.D., Radok. P., Furuya- K.. Hecht. S.S.. Schut? H.A.J. and
Klaunig, J.E. ( 1983) Comparative carcinogenicity in A/J mice and metabolism by
cultured mouse penpheral lung of hF-nitrosonornicotine, 4-(methylnitrosamino)- i -(3-
pyridy1)- 1-butanone, and their analogues. Cancer Res., 43, 1223- 1229.
10.Gonzalez, F.J., Crespi, C.L. and Gelboin, H.V. (199 1 ) cDNA-expressed human cytochrome
P450s: a new age of molecular toxicology and human risk assessment. M m t . Res., 247,
113-127.
2 1 .Yamazaki, H., Inui, Y., Y un, C.H., Guengerich, F.P. and Shimada, T. ( 1992) Cytochrome
P450 2E1 and 2A6 enzymes as major catalysts for metabolic activation of N-
nitrosodialkylamines and tobacco-related nitrosamines in human liver microsomes.
Ccircinogenesis, 13, 1789-1794.
22.Srnith, T.J., Guo, Z., Gonzalez, F.J., Guengerich, F.P., Stoner, G.D. and Yang, C.S. ( 1992)
Metabolim of 4-(methy1nitrosamino)- 1 -(3-pyridy1)-1 -butanone in human lung and liver
microsomes and cytochromes P-450 expressed in hepatoma cells. Cancer Res., 52, 1757-
1763.
Z3-Peman, B.W., Reece, J., Smith, T., Yang, C.S., Gelboin, H.V., Gonzalez, F.J. and Crespi,
CL. (1 993) Characterization of a human ce11 line expressing hi@ levels of cDNA-
derived CYP2D6. P?mnnacogener~cs, 3,2 8-3 9.
24.SmitL T.J., Stoner, G.D. and Yang, C. S. ( 1995) Activation of 4-(methy1nitrosamino)- 1 43-
pyridyl)-1-butanone (NNK) in human lung microsomes by cytochromes P450,
lipoxygenase, and hydroperoxides. Cancer Res., 55,5566-5573.
25.Smith7 TL, Guo, 2-Y., Guengench, F.P. and Yang, C.S. (1995) Metabolism of 4-
(methy1nitrosamino)- 1 -(3-pyidyI)- 1 -butanone (NNK) by human cytochrome P450 1 A3
and inhibition by phenethyl isothiocyanate (PEITC). Proc. AM. Assoc. Cuncet Res., 36,
153.
XHecht, S.S., Young, R. and Chen, C.B. ( 1980) Metabolism in the F344 rat of 4-(N-methyl-N-
nitrosamino)- 1 -(%pyridyl j- 1 -butanone, a tobacco-specific carcinogen. Cuncer Res, 40,
4144-4150.
?i.Peterson, L A . and Hecht, S.S. ( 1991 ) ~ ~ ~ e t h ~ l g u a n i n e is a critical determinant of 4-
(methylnitrosamino)- 1 -(3-py~idy1)- 1 -butanone tumongenesis in iVJ mouse Iung. Cuncer
R ~ s . , SI, 5557-5564.
28.h Hodgson, E., Mailman, R.B. and Chambers, J.E. (eds), Dictronay of toxicolo~- ( 1998)
Macmillan Press Ltd, London, pp.54-55.
29,Guengerich- F.P. ( 1992) Metabolic activation of carcinogens. P hurmac. Ther., 54, 1 7-6 1.
30.Stoner7 G.D. ( 199 1) Lung tumors in strain A mice as a bioassay for carcinogenicity of
environmental chemicals. Exp. Lzmg Res., 17.405423.
31 Gunning, W.T., Castonguay, A., Goldblatt, P.J. and Sroner, G.D. (1991) Strain AU mouse
lung adenorna growth patterns Vary when induced by different carcinogens. Taxicol.
Putho(., 19, 168-175.
32. Wattenberg, L. W. ( 1987) Inhibitory effects of benzyl isothiocyanate administered shortly
before diethylnitrosamine or benzo(a)pyrene on pulmonary and forestornach neoplasia in
A/J mice. Curcinogenesis, 8, 197 1 - 1 973.
33.Lin, LM., Amin, S., Tmshin, N. and Hecht, S.S. (1993) Effects of isothiocyanates on
tumongenesis by benzo(a)pyrene in murine tumor rnodels. Cancer Letr., 74, 15 1-1 59.
34.Dixit, R., TeeI, RW., Daniel, F.B. and Stoner, G.D. (1985) Mubition of benzo(a)pyrene
and benzo(a)pyene-fr~ns-7, &di01 metabolism and DNA binding in mouse lung explants
by ellagic acid Cancer Res., 45,295 1-2956.
35.Estensen, RD. and Wattenberg, L. W. ( 1993) Studies of chemopreventive effects of mvo-
inositol on benzo(a)pyrene-induced neoplasia of the lung and forestornach of female A/J
mice. Carcinogenesis, 14, 1975- 1977.
36. Witschi, H., Mallcinson, A.M. and Thornpson, I.A. (1993) Metabolism and pulmonary
toxicity of butylated hydroxytoluene. In Gram, T.E. (ed.), Metabolic Activation and
Toxiciv ufChernicul Agents to Lung Tissue and Celk Pergamon Press, United Kingdom,
185-212.
37.Food and Dnig Administration ( 1973) Evduarion of the Health Aspecis of Butyhted
Ifvdr~~y~oluene as o Food lngredien~. Washington, D .C.
X.Matnnger, S.A., Gunning, W.T., You, M. and Castonguay, A. (1994) Ki-ras mutation in 4-
(methy1nitrosamino)-1 -(3-pyridyl)- I -butanone-initiated and butylated hydroxytoluene-
promoted lung tumon in A'J mice. A M . Carcinogeneszs, 11,4248.
39. Witschi, HP. ( 1986) Separation of early diffuse alveolar ce11 proliferation from enhanced
tumor development in mouse lung. Cuncer Res., 46,76752679.
30.Bolton. J.L. and Thompson, J.A. ( 199 1 ) Oxidation of butylated hydroxytoluene to toxic
metabolites: Factors influencing hydroxylation and quinone methide formation by hepatic
and pulmonav microsomes. Drug .44efab. Disp., 19,467472.
4 1 .Bolton, J.L., Thornpson, J.A., Allentoff, A.J., Miley, F.B. and Malkinson, A.M. ( 1993)
Metabolic activation of butylated hydroxytoluene by mouse bronchiolar Clara cells.
Toxicoi. Appl. PlzannacoL , 123,4349.
4Z.National Centre of Drugs and Biologies (1 982) Drug u~zIiza~zon in fhe United States by
caregories 1981. 3rd annual review. Washington DC, p. 17.
43.Knode1, L.C., Rousch, M.K. and Barton, T.L. (1 992) Nonsteroidal anti-inflammatory drugs.
C h . Pediatr. Med Surg., 9,30 1 -3 25.
44.Ciive. D.M. and Stoff, J.S. (1984) Renal syndromes associated with nonsteroidal anti-
inflammatory dnigs. New Engl. J. Med., 310,563-572.
45.Brouwers7 J.RB.J. and Smet, P.A.G.M. (1 994) Pharmacokinetic-pharmacodynamie dmg
interactions with nonsteroidal anti-inflammato~y dmgs. ClNi. Phamcokznet., 27,462-
485.
46.BrooksY P.M. and Day, R.O. (1 99 1 ) Nonsteroidal antiinfl ammatory drugs - differences and
similarities. N. Engl. J. Med, 324, 171 6-1 725.
47.Peleg LI., Maibach, KT., Brown, S.H. and Wilcox, C.M. ( 1994) Aspirin and nonsteroidal
anti-infiammatory dmg use and the risk of subsequent colorectal cancer. Arch Intem.
Med, 154,394-399.
48.Logan, R.F.A., Little, J., Hawtin, P.G. and Hardcastle, J.D. (1993) Effect of aspirin and non-
steroidal anti-infiammatory drugs on colorectal adenomas: case-control study of subjects
participating in the Nottingham faecal occult blood screening programme. Br. A4ed J.,
307,285-289.
49.Thun, M.J., Namboodin, M.M., Calle, E.E., Flanden, W.D. and Heath, C. W . k ( 1993)
Aspinn use and risk of fatal cancer. Cancer Res., 53, 1 353- 1 327.
50-Thun, ML, Namboodiri, M.M. and Heath, C. W.Jr. ( 1 99 1 ) Aspinn use and reduced nsk of
fatal colon cancer. hrew En,@ J. bled., 325, 1593- 1 596.
5 1 .Tmj illo, M.A., Garewald, H.S. and Sarnpliner, R.E. ( 1994) Nonsteroidal antiinfiarnmatory
agents in chemoprevention of colorectal cancer: at what cost? Dzg. Dis. Sci., 39,2260-
2266.
52.Sclireinemachers. D.M. and Everson, R.B. ( 1994) Aspirin use and lung, colon. and breast
cancer incidence in a prospective study. Epideniiol., 5, 13 8- 146.
SXJalben, G. and Castonguay, A. ( 1992) Effects of NSAIDs on NNK-induced pulrnonary and
gastric tumorigenesis in A/J mice. Cuncer Lett., 66,2 1-28.
54.Waddel1, W.R. and Loughry, R.W. (1983) Sulindac for polyposis of the colon. Surp.
Oncol., 24, 83-87.
55.Labayle, D., Fischer, D., Vielh, P., Drouhin, F., Pariente, A., Bories, C. et al. ( 199 1 ) Sulindac
causes regression of rectal polyps in familial adenornatous polyposis. Gastroenterolop,
101,635-639.
56.Giardiell0, F.M., Hamilton, S.R., Krush, A.J., Piantadosi, S., Hylind, L.M., Celano, P. et al.
( 1993) Treatrnent of colonic and rectal adenomas with sulindac in familial adenornatous
polyposis. N. Engl. J. Med, 328-13 13-13 16.
57.Pepin7 P., Bouchard, L., Nicole, P. and Castonguay, A (1992) Effects of sulindac and
oltipraz on the tumorigenicity of 4-(methylnitrosarnino) 1 -(3-py~idy1)- I -butanone in A/J
mouse lung. Crrrcinogenesis, 13,34 1-348.
58.Goodman Gilman, A., Goodman, L.S. and Gilman, A. (1 990) Analgesic-antipyretifs,
antiinflarnmatory agents: the salicylates. In Goodman and Gilman's (eds), The
pharmacologicul Busis of Therapeurics, 8th edn. Macmillan Publishing Co, New York,
pp. 644-654.
59.Dromgoole, S.H. and Funt, D.E. ( 1992) Salicylates. In Evans, W.E., Schentag, J.J. and
Jusko, W. J. (eds), Applied Parmucokineiics: P rinciples of Therupeutic Drug Monztorzng,
3rd edn. Applied Therapeutics Inc, Vancouver, WA, pp. 32.1 -32.34.
6O.Chpendium des produits et spécrulzfés phormoceutiques, 30 ième éd. ( 1995) Association
Pharmaceutique Canadienne, Ottawa, Canada, pp. 146-1 47.
6 1 . Thiessen, J.J. ( 1982) Phamacokinetics of salicylates. In Barnett, H.J.M., Hirsh, J. and
Mustard, J.F. (eds), Ace~~salzcylic uczd: nrw mesfir an old dmg. Raven Press. New
York, pp.49-6 1 .
62.Mmetf L. J. ( 1 993) Aspirin and the potential role of prostaglandins in colon cancer. Cirncer
Rcs., 52.5575-5589.
63 .Roth G. J. and Chester, J. S. ( 1 978) Acetylation of the NH2-terminal senne of prostaglandin
synthetase by aspirin. J. Biol. Clrem., 253,57824784-
64.Bilodeau, J.F., Wang, M., Chung, F.L. and Castonguay, A. ( 1995) Effects of nonsteroidal
antiinflammaton dmgs on oxidative pathways in N.T mice. Free R d Biol. .%fecr',, 18.47-
54.
65.Suh, O., Menlin, C. and Petrelli, N.J. ( 1993) Aspirin use, cancer, and polyps of the large
bowel. Cancer, 72, 1 1 7 1 - 1 177.
66.Thun, M.J., Calle, E.E., Namboodiri, M.M., Flanden, W.D., Coates, R.J., Byen, T., Boffetta,
P., Garfinkel, L. and Heath Jr, C. W. ( 1 992) Risk factors for fatal colon cancer in a large
prospective study. J. Natl Cancer Irzs?. ,84, 149 1 - 1 500.
67.Greenberg, EX., Baron, LA., Freeman Jr, D.H., Mandel, J.S. and Haile, R. ( 1993) Reduced
risk of large-bowel adenornas among aspirin users. J. N a l Cmcer Insr., 85,9 12-9 16.
68.Reddy, B.S., Rao, C.V., Rivenson, A. and Kello- G. (1993) Inhibitory effect of aspirin on
azoxymethane-induced colon carcinogenesis in FM4 rats. Carcinogenesis, 14, 1493-
1497.
69.Meret0, E-, Frencia, L. and Ghia, M. ( 1994) Effect of aspirin on incidence and growth of
aberrant crypt foci induced in the rat colon by 1,2-dimethyl hydrarine. Cancer Lett., 76,5-
9.
70.Wargovich, M.J., Chen, CD., H-s, C., Yang, E. and Velasco, M. (1995) Inhibition of
aberrant crypt growth by non-steroidal anti-inflarnmatory agents and differentiation agents
in the rat colon. Int. J. Cancer, 60-5 15-5 19.
7 1 .Sakata, T., Hasegawa, R., Johansson, S.L., Zenser, T.V. and Cohen, S.M. ( 1 986) Inhibition
by aspirin of N-[4-(5-nitro-2-fury1>-2-thiazolyl]fommide initiation and sodium saccharin
promotion of urinary bladder carcinogenesis in male F344 rats. Cancer Res., 46,3903-
3906.
iZCohen, S.M., Zenser, T.V., Murasaki, G., Fukushima, S., Mattammal, M.B., Rapp, N.S. and
Davis, B.B. ( 198 1 ) Aspinn inhibition of hr-[4-(5-nitro-2-furyl )I-thiazol yl] formamide-
induced lesions of the urinary bladder correlated with inhibition of metabolism by bladder
prostaglandin endoperoxide synthetase. Cancer Res., 41, 3355-3359.
7XMurasaka, G., Zenser, T.V., Davis, B.B. and Cohen, S.M. (1984) Inhibition by aspirin of X-
[4-(5-nitro-2-furyl)-2-thiazolyl]forrnarnide-induced bladder carcinogenesis and
enhancement of forestornach carcinogenesis. Carcinogenesis, 5, 53-55.
74Adriaenssens, P.L, Sivarajah, K., Boorrnan, G.A., Eling, T.E. and Anderson, M. W. ( 1 983 )
Effect of aspinn and indomethacin on the formation of benzo(a)pyrene-induced
pulmonary adenornas and DNA adducts in AMeJ mice. Cancer Res., 43' 476204767.
75.Pl1~sician IV Drug Handbook, 5th edn. ( 1993) Springhouse Corporation, Springhouse, PA,
pp.97-98, 100 1-1 003.
76.Brogden, R.N., Heel, R.C., Speight, T.M. and Avery, G.S. ( 1978) Sulindac: a review of its
phamacological properties and therapeutic efficacy in rheumatic diseases. Drugs, 16,
97-1 14.
77.Duggan7 D.E. ( 198 1 ) Sulindac: therapeutic implications of the prodruglphamacophore
equilibriurn. Dmg Metab. Rev., 12,325-337.
78.Van Arman, CG., Risley, E.A., Nuss, G. W., Hucker, H.B. and Duggan, D.E. ( 1976)
Pharmacology of sulindac. In Huskisson and Franchimont (eds), CIznorii in the rrearmenr
of rheunmfic disordersr A new nonsteroidal anriinfumma~ory analgesic agenf.
Proceedings of a Symposium VIII European Rheumatology Congress, Helsinski 1-7 june
1975. Raven Press, New York, p.9.
79.Duggan, DE., Hooke, K.F., Risfey, E . k , Shen, T.Y. and Van Arman, C.G. (1977)
Identification of the biologically active form of sulindac. J. P hamacol. Exp. Tlzer., 201,
8-13.
80. Waddell, W.R., Gasner, G.F., Cerise, E.J. and Loughry, R. W. ( 1989) Sulindac for polyposis
of colon. Am. J. Surg. , 157, 175- 1 78.
8 1.Rigaq J., Pique, J.M., Rubio, E., Planas, R., Tarrech, J.M. and Bordas, J.M. ( 199 1 ) Effects
of long-term sulindac therapy on colonic polyposis. Ann. Intern. Med, 115, 952-954.
82.Spagnesi7 M.T., Tonelli, F., Dolara, P., Cademi, G., Valamno, R., Anastasi, A. and
Bianchini. F. ( 1991) Rectal proliferation and polyp occurrence in patients with familial
adenomatous polyposis after sulindac treatment. Gasiroenierolugy, 106,367-366.
82. Winde, G., Gurnbinger, HG., Osswald, H., Kemper, F. and Bunte, H. ( 1993) The NSAID
sulindac reverses rectal adenomas in colectomized patients wivith familial adenomatous
polyposis: clinical results of a dose finding study on rectal sulindac administration. Inr. J.
Colorecz. Diis., 8, 13-1 7.
84Skinner. S.A., Penney, AG. and O'Brien, P.E. ( 199 1 ) Sulindac inhibits the rate of growth
and appearence of colon turnor in the rat. Arch Surg., 126, 1094-1096.
85.Rao. C.V., Rivenson, A., Simi, B., Zang? E., Kelloff, V.S. and Reddy, B.S. ( 1995)
Chemoprevention of colon carcinogenesis by sulindac, a nonsteroidal anti-idammatory
agent. Cuncer Res., 55, 14644472.
86.Castonguay, A. ( 1992) Methods and snategies in lung cancer control. Cancer Ra. fszrppl.).
52,264 1 S-265 I S.
87. Wattenberg L. W. ( 1 985) Chernoprevention of cancer. Cancer Res., 45, 1 -8.
88.Morse, M.A. and Stoner, G.D. (1993) Cancer chemoprevention: principles and prospects.
Carcinogenesis, 14, I 73 7- 1 746.
89.MiMsh7 S.S. ( 198 1 ) Ascorbic acid inhibition of N-nitroso compound formation in chernical,
food and biological systems. In Zedeck, M.S. and Lipkin, M. (eds), Inhibition ofTumor
Induction und DevcZoprnent. Plenum Publishing Corp., New York, pp. 101-126.
90.Kuenzig, W., Chau, J.. Norkus, E., Holowaschenko, H., Newmark, H., Mergens, W. and
Conney, A.H. (1 984) CafFeic acid and ferulic acid as blockers of nitrosamine formation.
Càrcinogenesis, 5,309-3 14.
9 1-Wargovich, M.J. ( 1987) Diallyl suifide, a flavor component of garlic (.4llium saiivum),
inhibits dimethylhydran'ne-induced colon cancer. Carcinogcnesis, 8,487-489.
92.Gu0, Z., Smith, T.J., Wang, E., Sadrieh, N., Ma, W., Thomas, P.E. and Yang, C.S. (1992)
Effects of phenethyl isothiocyanate, a carcinogenesis inhibitoqon xenobiotic-
metabolizing enzymes and nitrosamine metabolism in rats. Carcinogenesis, 13,2205-
22 1 O.
93. Wood, A. W., Huang, M.-T., Chang, R.L., Newrnark, H.L., Lehr, R.E., Yagi, H., Sayer, J.M.,
Jerina, D.M. and Conney, A.H. (1 982) Inhibition of the mutagenicity of bay-region diol-
epoxides of polycyclic arornatic hydrocarbons by naturally occumng plant phenols:
exceptional activity of ellagic acid. Proc. Natl. Acad Scz. USA, 79,55 13-55 1 7.
94.Moon, R.C., Rao, K.V.N., Derrisac, C.J. and Kelloff, G.J. (1992) Retinoid chemoprevention
of lung cancer. In Wattenberg, L., Lipkin, M., Boone, C.W. and Kelloff, G.J. (eds),
Cancer Chemoprevenrion CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 83-93.
95.Reddy, B.S., Maruyama, H. and Kelloff, G. (1987) Dose-related inhibition of colon
carcinogenesis by dietary piroxicam, a nonsteroidal antiinflamrnatory cimg, during
different stages of rat colon tumor development. Cancer Res., 47,5340-5346.
96.Narisawa. T., Sato, M., Tani, M., Kudo, T., Takahashi, T. and Goto, A. ( 198 1 ) Inhibition of
development of methylnitrosourea-induced rat colon turnon by indomethacin. C'uncer
Res., 41, 1954-1957.
97.Wattenberg LW. (1990) In Kuroda, Y., Shankel, D.M. and Waters, M.D. (eds),
A nt in1 ufugenesis an J an[ icarcinogenesis, Meclmzsms II. Plenum Publ ishing Corp., New
York, pp. 1 55-1 66.
98.Pessayre, D. ( 1 993) Cytochromes P450 et formation de métabolites réactifs. Rôle dans
I'hépatotoxicité des médicaments. Thtrupze, 48. 537-548.
99.Baron, J. and Voigt, J.M. (1990) Localization, distribution, and induction of xenobiotic-
metabolizing enzymes and aryI hydrocarbon hydroxylase activity within lung. Phunnac.
Tlter., 47,4 1 9-445.
1 OO.Gonzalez, F.J. ( 1990) Molecular genetics of the P-450 superfamily. Pharmac. Ther., 45, 1 - 38.
1 0 1 .Omura, T. and Sato, R. ( 1964) The carbone monoxide-binding pigment of liver
microsomes. 1. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem., 239,2370-2378.
102.0mura, T. and Sato, R. ( 1964) The carbone monoxide-binding pigment of liver
microsomes. 2. Solubilization, purification, and properties. J. Biol. Chem., 239,3379-
2385.
103.Guengerich, F.P. (1 989) Characterization of human microsomal cytochrome P-450
enzymes. Ann R a . PlzamcoL Toxicol., 29,241-264.
104.Guengerich, F.P. ( 1988) Roles of cytochrome P-450 enzymes in chernical carcinogenesis
and cancer chemotherapy. Cancer Res., 48,2946-2954.
1 05.i(ikkawa7 Y. ( 1992) Diverse role of puimonary cytochrome P-450 monooxygenase. Lab.
Imest., 67,535-539.
106.Kawajiri7 K. and Fujii-Kuriyama, Y. (199 1) P450 and human cancer. Jpn. J. Cancer Res.,
82, 1335-1335.
107.Guengerich7 F.P. and Shimada, T. ( 199 1 ) Oxidation of toxic and carcinogenic chernicals by
human cytochrome P-450 enzymes. Chem. Res. Taxicol., 4,39 1 -407.
1 08.Hecht7 S.S. (1994) Metabolic activation and detoxification of tobacco-specific
ni6osamines: a mode1 for cancer prevention strategies. Dmg Metab. Rev., 26,373-390.
109.Karnataki, T. and Kato, R. ( 1985) Activation of carcinogenic compormds by purifieci
cytochrorne P-450 in reconstituted systems. Gonn hlomogr. Cancer Res., 30,8 1-9 1.
1 lO.Tagashira, Y., Yonekawa, H., Watanabe, J., Hara, E., Hayashi, LI., Gotoh, 0. and Kawajiri,
K ( 1985) Merabolic activation of chernical carcinogens by two rnolecular species of
cytochrome P-450. Gunn ,2./omogr. Cuncer Res., 30,69-79.
1 11 Battula, N., Sagara, J. and Gelboin, H.V. ( 1987) Expression of P+O and P3450 DNA
coding sequences as enrymatically active cytochromes P-450 in mammalian cells. Proc.
Abri. ,4~& Sci C'SA, 84,4073-4077.
1 1 LOkey, A.B. ( 1990) Enzyme induction in the cytochrome P450 system. Plzurnzac. Ther., 45.
24 1-298.
L 13.Ortiz de Montellano, PX. and Reich. N.O. (1986) Inhibition of cytochrome P-450 enzymes.
In Ortiz de Montellano, P.R. (ed.), Cyrochrorne P-450: Structure. Mechanism rrnd
Bioclzemistry. Plenum Press, New York, pp.273-3 14.
114.Shimlrin, M.B. and Stoner, G.D. (1975) Lung tumors in mice: application to carcinogenesis
bioassay. .4& Cancer Res., 21, 1-58.
1 1 S.Stoner, GD., Adam-Rodwell, G. and Morse, M.A. ( 1993) Lung turnors in strain A mice:
application for studies in cancer chemoprevention. J. CeU. Biochem., suppl. l 7F, 95- 1 03.
1 16.111 Borchard, R E , Barnes, C.D. and Eltherington, L.G. (eds), Drug Dosage in Laborutory
Animafs; a Handbook, 3rd ed. ( 1990) Telford Press Inc, NJ, pp.39-40.
1 17.The experimental animal in biomedical research. ( 1990) In Rolling7 B.E. and Kesel, M.L.
(eds), A Survey of Screntrfic und Erhical Issues for Imes~igators, vol. 1. CRC Press, Boca
Raton, FL, pp. 1 16- 1 1 8.
..Annexe A - Chemopreven tlve ageri t:
Gruup *: Cage *: flics *T Wefgbt:
Date sacrlffce: Ager Weeks Dose curn.(NNKl~ -
TISSUES EXISED; G R O S OBSERVATIONS.
HUNBER OF LUHG TUMORS.
Left Iungr
T o t a l lung tumors
Observatoc
H UNIVERSITÉ LAVAL
P R O C ~ U R E NORMALE DE RÉGE ET D*OPEUTTON
Responsables:
"Si. m cours d'un prococole. on aninal C?rouve de vives souifances s a s qu'on ?uisse !e souiager. on doit sans dé!= y mecae fin O= iine mkthoac Ceubnuie ~ p t e i p m v p e r une inconscience npiae."
"3ans 1s passt. ceruins prorocoies ant 3u exiger !2 ?oursuice i 'une exdnence jusqu'3 ia mor t de I'snirnal. comme par enenpie 32s :=SU ies suosunces :oxiques ou biologiquement acrives. r u des moa?!cs ie cmcer su d'infection. T~ucsiois. !e cr;&re mort-sumie utilisé dans ce c y ~ : 'cxgnezcr cst de moins en xoins ;cccpc<! aujourd'hui. Do~navmr . chaque :ois que des animaux p&cnrenc an k i t rnûnbond [ C s t soouussanc presqu'i coup sur : !a mon). on doit j '~:'for~C
de vouver une façon acceptable de respecter A la fois les exigences exphmentaies et les besoins de l'mimai,"
I l est bien reconnu que la m o n comme point final d'une expérience esr dans la plupan des C; inutile et même indesirable. En effet un mauvais &ac de sante ou de la douleur et de la deues: peuvent. au même titre qu'une mauvaise régie ou un probléme infecueux, i n t e d h r granaeme avec l'interpretation des résultats. Ces variables sont indesirables et peuvent nuire à reproductioilie des rt5sultaü d'une expérience à I'auue ou d'un laboratoire à un autre. Dans pLuoart des etudes. les données obtenues d'un animai vivanr sont beaucoup plus utiles que celh abcnues d'un animal m o n ou d'organes en décomposition. La m o n comme point finai d'ul sxpC?.ence nVappone que aes notions de doses ! t M c s "50" (DLjg) ou encore de temps médian c survie. L'eurhanasie dz l'animai 2 i'aiaz de crikres normaiisés. pourra permerue au chercheur c procede: A d i E r e n e s analyses qui conuibueront de façon zppréciable à l'avancement scientifou Par exempie, aes dosages enzymatiques ou biociiirniques sur des cissus frais ou Pu sang. ur tvaluacion hisro-padiologique d'organes cibles tels reins. foie, poumons ou rate. etc. De plus. dt donnes de '-temps" peuvent toujours Ztre obtenues g e c r des criteres f i e s et objectifs tout e i'assuranr d'une obsewauon vigilanre er conswre des animaux. Plusieilrs agences d'approbatic aes medicamenrs pour uriüsation humaine onc citailleurs ce& d'sxiger des crieres comme la -'Do: lthalz j0'-.
Ce:? procJdiire vise donc 2 iaentifier !es c n t h s généraux d'euriiuiasie des rongenrs impLiqui
véennaire de Ifinstitution,
CRITÈRES D'ECTHANASIE:
1) L'ne p c z de poids. rapide ou progressive. de plus de 15 à 30%. Ln tel amaigrissement signal une réducuon i m p o m r e de la prise d'alimenrs liquides ec solides.
2) Une pene de poids ininterrompue pendant pius de cinq jours, menanr A des signes kvident d'Cmaciation ou d'auop hie musculaire.
3) Pour les animaux poneurs de tumeur:
- mas= tumonle excCdan~ 10% du poids corporel. - tumeur inrerfhnt avec ktivitd de b u dc 1';inirnal (cx. dimenurion, locomotion), - :umcur ulctfdc. inkct& ou ndcrotique.
La présence d'un seul de ces trois critères justifie l'euthanasie de l'animal. Cc signes dc dtt&riorriuon de la condition physiquc de ['animai piluvsnt Suc accornprign& d'un oi
plusieurs des probitmes suivmrs. Si iel est le cas. cela nous indidue la evenrr! de la dWfiorauc de I'animal. et l'urgence de prendre Irs mesures qui s'imposent pour metue fin aux souffrances c ce dernier.
,Mauvais Ctat du pelage (ex. poil Cboumfé. perte excessive de poils) Pâleur des ext&mités ou des yeux Coloration anomale du pelage ((urine. seiles. Iarmes, sang) Hemorragie. pertes sanguines Autom uuiation ?m bkmes respiratoires uâies. sifflements. es-) Ecodement nasal Disiznsion abdominale Position r e c o u r ~ k (dos voûté) Vocalisauon Réauc5on de l'azuviré. faiblesse. incoordination rnoolce DZI'icuité à se renir debout. aembiemenrs. paralysie Diminurion de ia tempéranue corporelle (l'animal est froid au mucher) IXs hydrauuon Eüiargie. Ctat de choc. inconsciene
Finalement nous nous devons d'insisrer sur le suivi de l'animal (f&pence des obsemations) et sr. !a formation de i'observarrur. 1l est évidemment difficile d'&due: ce qui est .. anormal si l'on n cornait pas le comportement normal de l'espece écudi&. mt donc qu 11 air une yrsonq w o n s a b l e dCsizqé- mur chacun des ?roiers de recherche couver6 s u cP:re procédure, Ctn ?ersonne doit être idenciri& ciurernenr au cornit6 de protecuon des animaux tr au ve&Mai.re d I'insnrution. On doit aussi s'assurer que celle-ci soir familière -- zvec le prorocole de recherche : l'espéce .-?imaiit é~udiie. De p!us. eile doit connaiue lee:ret 2scornpti dcs diff6rents produits O u5ttrr,,-nrs sur ia s ~ x t ue l'mimai.
7 - ?sur ci. +i e x de la frquence des observations. elle peuc varier seion it s u d = expZrimenra1. Li
ininirnurn d'une fois par jour esr toujours nécessaire Lorsqu'on approche du temps criuque dl i'cxp6riencr (apparirion des critères A.B.C). les animaux doivent C r t visites deux fois par joui Selon les types de protocoles et la vitesse de déterioration de i'Crar des animaux. plusieur obsemations quotidiennes peuvent Èrre necessaires. II faut évier qu'un manque d'observation conduise 3 la mon d'un animal.
Approbation:
-
Vice-rectorat à larecherche Da~e Présideni Date Corniré de proceccion des
animaux (CPALZ)
Références:
Bac!zy. RJ.. ileberc, W J , a d Poole. T.B. "The Disturbance Index: -4 Behaviourd Met!!oa O .Usessing Cie Sevcriry of Cornmon Laboratory P:ocrdures on Rodenrs". 1988. LTAW . h m a We!fue Resezch No. 1. hiversiries .%aenucn-for .Lniirnal Wdfue ; Engla~S. 35 p.
Cacsc:! canaEien dc ?roecuon des mimnux. "Princi?cs dgisstnc !2 recherche sur les animaux" oc:obre 1989.
Conxi! canadien de prorec:ion cks animaux. Xmuel sur le soin t r l'utiiisation des animau? d'expt5rirnznr;ition". volume 1.2e edition. 1993.
Federaùon of European Labontory h i m a l Science Associauons IFELASA) Working Group or Pain and Disuess. "Pain and Disrress in Laboratop Rodenu and Lqomorphs". Labornroq Animais ( 2 5 ) . pp. 97- 1 12. 1994.
Inrcragcncy Ressarch Animai Cornmime ( IRAC\. "iR.AC Rccnrnmïndation on LD 51) Testing" lLAR Ssws. volumc 35 (3-4). pp. 56-58. IY93.
hrs: 08 mars 199:
Revu:
Laborarory Animal Science Association Working Pany. "The Assesmrx and Conuol of ri Szvenry of Scienufic Procedures on Laboratory Animais*'. Labora~ory Xnirnals (24). pp. 9' 130. i990.
.Montgomery, C.A. Jr. "Oncologic and Toxicoiogic Research: Alleviation and Convol of Pain ar Disvess in Laborarory Anima&-, The Cancer Bulletin. volume 42 (4). pp. 230-237. 1990.
Monon, D.B. and Griffidi. P.H.M. "Guidelines on the Recognition of Pain and Discornfort Ex~erimencd Animai and m Hypodiesis for &sesmeni', Ver Rec.. voiurne ! 16. ?p. 43 1-43
'i'auocai Rtsezc,i Caünci. 'Zducaÿon =a Raming in rhe Car2 and L'sz of Laimatory .airnd Sztionai .I\caaemy Press. 199 1.
Offen E.D. "Defining an Acceptable Endpoinr in Invasive Experimenrj". CALAS/ACIXL. vc 27 (3, pp. 131-1331, 1993.
Portm. D.E. "Ethical scores for Animai Experimenrs". ';anire. voi. 356. p p . 101402. i992.
Xedgatc. E.S., Deursch. M. ana Boggs. S.S. Reliabiy Predic~ca bp Baày Wright-Loss .:3). ??- 169-173. i991.
'Time of dearh of C M Turnor-Bearing Can 1 Panènis". Laboratory . a i m d Science. volume -:
Rodenr Protection Tes: Working Party. "Guidelines for die W e i f v c of .Ammals in Rode Procztuon Tests", Laboratory -mais (38). pp. 15-18, 1994
"LKCCCR Guiaeiines for the Weifare of Animais in Expcrimenrai Ne~plasia'~. LM3 Sew volume 3 i (3) . ?p. 16-23. 1969.
Fixatif de Teilvsniakv
Eau distillée Éthanol 99% Acide acétique giaciaf Fo mialdéhyde
Bien mélanger. Conserver a 4°C. Pour la conservation des poumons. ATIZNTION: poner des gants de latex et non de vinyle lorsqu'on travaille avec ce fixat8.
PORTEZ DES
Annexe F
Jours
Exemple d'un suivi ae la dose réelle de NNK reçue par cinq souns d'une même cage.
cornoaré à la uose thénque de NNK.
APPLIED I W G E . Inc - = 1653 East Main Street - -* - Rochester, NY 14609 USA -- -- - - Phone: 71ôI482-0300 -- -- - - Fax: 716/28&5989
O 1993. App(ied Image. lm. All Rlghis Resenied
