Cardiovascular microRNA WebinarCardiovascular microRNA WebinarRecent Work & Current Methods

In Cardiovascular microRNA Research

2012‐12‐04

Christoph Eicken, PhDHead of Technical Services – Microarrays

Agendag

Recent Studies

miRNA Intro

Current methods

Q & A

Case Studies

Q

microRNAs ‐What We Know

1. All miRNAs are small non‐coding RNAs, usually consisting of  20–22 nucleotides for animals and 20 24 nt for plantsnucleotides for animals and  20–24 nt for plants.

2. All miRNA precursors have a well‐predicted stem loop hairpin structure, and this fold‐back hairpin structure has a low free energy p gy

3. Many miRNAs are evolutionarily conserved, some from worm to human in animals, or from ferns to core eudicots or monocots in plants

4. Bind to complementary mRNA molecules and act as negative regulators of translation

5. High copy number

6. Expression is tissue (and developmental stage) specific

microRNAs ‐What We Know

1. Currently  ‐ 25,141 mature miRNAs across 193 plant, animal, and y , p , ,

virus species (miRBase 19, Aug. 2012).

2. Mechanism is far reaching and complex – each miRNA may control many g p y ygenes and it is estimated that miRNAs regulate expression of up to 1/3 of all human genes.

3 O t b f t h th i d h i3. Operate by one of two hypothesized mechanisms:

– Complete pairing mRNA is degraded ‐ predominant in plantsg p p

– Imperfect pairing translation is repressed but mRNA remains intact ‐ predominant in animals

Milestones1993 – Lin‐4 was shown to encode two small RNA molecules (not protein) 

• Small RNAs control developmental timing in C. elegans through negative regulation of lin‐14 gene. • Lee RC et al. 1993 The C. elegans heterochronic gene lin‐4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin‐14. Cell 

75(5):843‐54. [article] 5(5) 8 3 5 [a t c e]

1998 – RNAi is observed for the first time – leads to Nobel Prize (2006)• Fire A, Mello CC et al. 1998 Potent and specific genetic interference by double‐stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 

1998; 391:806‐811. [article]

Challenge to the Central Dogma of BiologyDNA > transcription > RNA > translation > protein

2000 L t 7 id tifi d i h d D hil ( h l l k l )2000 – Let‐7 was identified in humans and Drosophila. (Reinhart et al., Slack et al.)

2001 – Bartel, Tuschl, Ambros ‐ Discover large class of small regulatory RNAs, name them microRNA (miRNA)( )

• Lau NC et al. 2001 An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 294(5543):858‐62. [abstract] 

• Lagos‐Quintana M et al. 2001 Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science 294(5543):853‐8. [abstract] • Lee RC et al. 2001 An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science 294(5543):862‐4. [abstract] 

2002 – Identification of Drosha reveals complete microRNA biogenesis pathway•pri‐miRNAs > Drosha > pre‐miRNAs (~70nt) > Dicer > mature miRNAs (~22nt) •Lee Y et al. (2002) The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature 425(6956):415‐9. [abstract]

Milestones2004 – Microarrays are used to profile miRNA expression

• Several groups develop or modify existing gene expression microarrays for profiling miRNAs• Babak et al. 2004 [article], Barad et al. 2004 [article], Liu et al. 2004 [article], Nelson et al. [abstract], 2004, Thomson et al. 2004 

[article][article].

2005 – Next‐Gen Sequencing is used for small RNA discovery and analysis• Green Lab ‐ uses Solexa (now Illumina) sequencing to identify novel small RNAs in Arabidopsis plants• Lu C et al. 2005 Elucidation of the small RNA component of the transcriptome. Science, 309: 1567–1569. [abstract] 

2006 iRB li t S I tit t2006 – miRBase goes online at Sanger Institute• Depository for experimentally verified microRNAs: http://www.mirbase.org/• Griffiths‐Jones S et al. 2006 miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. NAR 34(Database Issue):D140‐D144. 

[article] 

2008 – Circulating miRNAs detected in body fluids• miRNA signatures in serum and plasma provide cancer diagnosis / prognosis• Serum ‐ Chen X et al.(2008) Characterization of microRNAs in serum: A novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other ( ) g

diseases. Cell Res 18:997–1006. [article]• Plasma ‐Mitchell PS et al.(2008) Circulating microRNAs as stable blood‐based markers for cancer detection. PNAS USA 105:10513–

10518. [article]

Milestones ‐ Cardiovascular

2005 ‐miRNA is essential for proper muscle development in Drosophila• miR 1 exerts post transcriptional control during myogenesis in Drosophila• miR‐1 exerts post‐transcriptional control during myogenesis in Drosophila • Sokol NS, Ambros V (2005) Mesodermally expressed Drosophila microRNA‐1 is regulated by Twist and is required in muscles during 

larval growth. Genes Dev 19(19): 2343–2354.[article]• Kwon C, Han Z, Olson EN, Srivastava D. (2005) MicroRNA1 influences cardiac differentiation in Drosophila and regulates Notch 

signaling. Proc Natl Acad Sci USA 102(52): 18986–18991. .[article]

2006 ‐Muscle microRNAs regulate myoblast proliferation and differentiation in skeletal muscle

• Chen JF et al. (2006) The role of microRNA‐1 and microRNA‐133 in skeletal muscle proliferation and differentiation. Nat Genet 38(2): 228–233. [article]

• KIM HK et al. (2006) Muscle‐specific microRNA miR‐206 promotes muscle differentiation. J Cell Biol 174(5): 677–687. [article]

2006 ‐ The expression of several miRNAs was identified as being regulated in response to cardiac muscle hypertrophy

• van Rooij E et al (2006) A signature pattern of stress responsive micro RNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure• van Rooij E et al. (2006). A signature pattern of stress‐responsive micro‐ RNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure. Proc Natl Acad Sci USA 103(48): 18255–18260. [article]

Milestones ‐ Cardiovascular

2008/2009 miRNAs are involved in Cardiomyocyte Apoptosis and2008/2009 ‐miRNAs are involved in Cardiomyocyte Apoptosis and Regeneration, Cardiac Conduction, Fibrosis

• Rane S – (2009) Circ Res 104: 879–886. [article], • Terentyev D (2009) Circ Res 104 514 521 [article]• Terentyev D – (2009) Circ Res 104: 514–521. [article],  • van Rooij E – (2008) PNAS 105: 13027–13032. [article] 

2010 ‐MicroRNAs regulate cardiac stem cell fateSl ij l (20 0) i d 99 l diff i i d lif i i h d i d di i• Sluijter JP et al. (2010) MicroRNA‐1 and ‐499 regulate differentiation and proliferation in human‐derived cardiomyocyte progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 30(4):859‐68 [article]

2010/2011 ‐ Circulating miRNAs may be novel biomarkers for coronary artery disease (CAD) and acute myocardial infarction (AMI) 

• M. Hoekstra et al. (2010) The peripheral blood mononuclear cell microRNA signature of coronary artery disease. Biochem BiophysRes Commun, 394, 792–797. [article]

• V. Di Stefano et al. (2011) microRNAs as peripheral blood biomarkers of cardiovascular disease. Vascul Pharmacol, 55, 111–118. [article]

miRNA Processing

pri‐miRNA = primary microRNA transcript

pre‐miRNA = precursor microRNA

miRNA* = antisense microRNA(now ‐3p or ‐5p)

miRISC = microRNA‐induced silencingmiRISC = microRNA‐induced silencing complex

F l i f i di iRNAFor latest information regarding miRNA nomenclature see the miRBase.org blog.

25000

miRNAs in miRBase20000

21,264 miRBase Entries ‐ 193 plant, animal, and virus species

miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.Griffiths Jones S et al NAR 2006 34(Database Issue):D140 D144

15000

Griffiths‐Jones S et al. NAR 2006 34(Database Issue):D140‐D144 [article]

10000

Illumina Releases first small RNA Sample Prep Kit

50005000

0V6.1 V7.1 V8.0 V8.1 V8.2 V9.0 V9.1 V9.2 V10.0 V10.1 V11.0 V12.0 V13.0 V14.0 V15.0 V16 V17 V18 V19

Apr‐05 Oct‐05 Feb‐06 May‐06 Jul‐06 Oct‐06 Feb‐07 May‐07 Aug‐07 Dec‐07 Apr‐08 Sep‐08 Mar‐09 Sep‐09 Apr‐10 Sep‐10 Apr‐11 Nov‐11 Aug‐12

miRNAs in PubMed

6000

7000

* Projected

5000

6000

3000

4000

2000

3000

1000

02001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

Why Study miRNAs in the di l ?Cardiovascular System? 

1. Several miRNA genes are specifically expressed or highly enriched in skeletal and/or cardiac muscle, the so‐called muscle miRNAs. 

2. miRNAs are essential for proper muscle development and exert post‐transcriptional control during myogenesistranscriptional control during myogenesis.

3. Muscle miRNAs regulate myoblast proliferation and differentiation in skeletal muscle.

4. Circulating miRNAs may be novel biomarkers for coronary artery disease (CAD) and acute myocardial infarction (AMI).

5. Dysregulation of miRNAs can contribute to cardiovascular related diseases and disorders: CAD, AMI, arrhythmia, hypertrophy and fibrosis.

6. miRNAs are likely associated with other muscle‐related diseases and are potential therapeutic targets.

miRNAs in the Cardiovascular System: Clinical PotentialM l l Di i / Bi kMolecular Diagnostics / Biomarkers – Identification of specific miRNAs or miRNA expression based signatures that can act as biomarkers for various diseases/pathologies. /p g

1. Biomarkers in body fluids: serum, plasma, exosomes, & HDL particles

2 M k t d d t il d li i l di i2. Make accurate and detailed clinical diagnosis

3. Potential to determine prognosis and predict treatment efficacy

Rosetta Genomics' miRview Lung Assay:Rosetta Genomics  miRview Lung Assay:Assay Shown to Accurately Differentiate Between the Four Main Types of Lung Cancer

miRNAs in the Cardiovascular System: Clinical Potential

Drug Discovery / Therapeutics – Identification of miRNAs that play essential roles in disease to act as drugs or possible p y g ptherapeutic targets. 

1. miRNAs as vascular regulating drugs

2. miRNAs as drug targets

3 St d f iRNA t d t d t i f ti t th ti li3. Study of miRNAs to understand response to infections, stress, other stimuli

2010 Review: MicroRNAs in Cardiovascular Disease and disordersCardiovascular Disease and disorders

Review ‐ Small EM, Frost RJ, Olson EN. (2010)MicroRNAs add a new dimension to cardiovascular disease. Circulation. 2010 

( ) [ l ]

15

121(8):1022‐32. [article]

2012 Review: Extracellular/circulating gmicroRNAs and their potential role in cardiovascular disease

Cellular releases (A) and uptake (B) of miRNAs. (A) Extracellular miRNAs may be contained within vesicles, including microvesicles, exosomes, and apoptotic bodies, as well as within proteins such as

16

Zhu H, Fan GC. (2012) Extracellular/circulating microRNAs and their potential role in cardiovascular disease. Am J Cardiovasc Dis 1(2):138‐149. [article]

exosomes, and apoptotic bodies, as well as within proteins such as Ago2, HDL, and other RNA‐binding proteins. (B) Extracellular miRNAs may potentially interact with recipient cells via direct fusion, internalization, receptor‐mediated interactions and other possible mechanisms.

2012 Review: Circulating microRNAs as gnovel and sensitive biomarkers 

Li C, Pei F, Zhu X, Duan DD, Zeng C. (2012) Circulating microRNAs as novel and sensitive biomarkers of acute myocardial Infarction Clin Biochem45(10‐11):727‐32myocardial Infarction. Clin Biochem45(10‐11):727‐32. [abstract]

MicroRNA therapeutics for cardiovascular 

17

disease: opportunities and obstacles.van Rooij E, Olson EN.Nat Rev Drug Discov. 2012 Nov;11(11):860‐72.

MicroRNA Profiling Review:

MicroRNA profiling:approaches and considerations

Colin C. Pritchard, Heather H. Cheng & Muneesh TewariColin C. Pritchard, Heather H. Cheng & Muneesh TewariNature Reviews Genetics 13, 358‐369 (May 2012) .[abstract]

microRNA Research ToolsSeq‐Array

SM

Target  Determination

Bi i f ti T tS Pi T

miRNA Identification

ACGT101‐miR

• Bioinformatics – TargetScan, PicTar,PITA

• Gene / proteome expression analysis• Pull‐down assays• 5′ RACE analyses

• Genetic screening • Direct cloning, sequencing• Computational strategy –

MIRCheck, findMiRNA, MIRscan, MiRAlign

Stem‐Loop Specific 

f

y• Degradome Sequencing

MiRAlign• Tiling Microarrays• Next‐gen Sequencing

Pathway AnalysisDetection & Profiling

• Northern Blotting• In situ hybridization • Real‐time PCR

Degradsome Seq

• Bioinformatics – miRFocus, mirPath, MMIA

• Microarray analysis• Next‐gen Sequencing

Functional Analysis

• Lucifierase Assays• Gene knockout/overexpression  models• miRNA inhibition ‐ antagomirs Digital Gene Expressiong• miRNA mimicry

Pathway Network

3 M j St & T h l i3 Major Steps & Technologies

Discovery Profiling QuantitationValidation

miRNA qRT PCRcustom miRNA

Next Gen microarray qRT-PCRmiRNAmicroarray

Sequencing

Seq Array SMSeq‐Array

SamplePreparation

Cell LineFFPE Block

Fatty Tissue(Viscous Samples)

Norgen Biotek

Tissue PlantM t i l

(Viscous Samples)

Total RNA( )

Total RNA

BloodSerum Algea

Material(1‐4 µg)Qiagen

Total RNA Extraction Kit

Plasma

Ambion

miRNeasy KitUrine

• Select a kit designed to retain small RNA 

• Select kit based on your sample type

• Use the same kit for entire experimentmiRVana Kit

Customer Sample Quality Control

You can check the UV spectrum of your sample with a spectrophotometer. 

↑ 1 0 ↑ 1 8260nm 260nm

Customer Sample Quality Control

↑ 1.0  ↑ 1.8 230nm 280nm

Bioanalyzer or 1‐1.5% agarose gelBioanalyzer or 1 1.5% agarose gel 

• 28S rRNA band at 4.5kb  ‐ ~2X intensity

• 18S rRNA band at 1.9kb.

• For Average Cell Line or Tissue sample – RIN number must be  ↑ 7

• For other sample types such as Blood orFor other sample types such as Blood or Plant – RIN number does not apply

• Excessive smearing on the gel indicates degraded RNAdegraded RNA.

Customer Sample Quality Control

microRNA Microarray Expression ProfilingCustomer Sample Quality Control

Good              Poor Good              Poor Good              Poor

1 5% F ld h d A G l1.5% Formaldehyde Agarose Gel

Agilent BioAnalyzer Gel Image

Urea‐PAGE Gel

Failure in recovery of RNA <200 nt (including microRNA)

Agilent BioAnalyzer Gel Image

Images ©Norgen Biotek

Key Advantages of RNA Seq

Microarray vs RNA Sequencing

Key Advantages of Microarray Key Advantages of RNA‐Seq

• Provides a comprehensive view of the transcriptome. All transcripts can be 

l d ( RNA RNA RNA

Key Advantages of Microarray

• Robust, reliable method, proven over decades of use

analyzed (mRNA, ncRNA, snoRNA, lncRNA, miRNA, ...).

• Not necessarily dependent on any prior k l d

• High through‐put method – 100s of samples analyzed per month

• Streamlined handling – can be easily   sequence knowledge. 

• Increased dynamic range and tunable sensitivity. 

g yautomated

• Straightforward data analysis

Sh d i 5 d • Can detect structural variations such as gene fusions and alternative splicing events.

• Short turn‐around time – 5 days 

• Lower cost

• A truly digital solution (absolute abundance vs relative abundance).

microRNA Microarray Expression Profiling

Comprehensive Microarray Experiment

• Sample QC

Customer Total RNACustomer Total RNA

CustomerSequencesCustomerSequences

Sample QCSample QCmiRBasemiRBase

• Sample preparation

• Hybridization reactionsSmall RNA Isolation Small RNA Isolation

LabelingLabeling

Chip DesignChip Design

Chip SynthesisChip Synthesis

• Advanced data analysis

• High level customer supportChip QCChip QC HybridizationHybridization

Signal AmplificationSignal Amplification

Image AcquisitionImage Acquisition

Data ExtractionData Extraction

Data AnalysisData Analysis

CustomerAnalysis Report

CustomerAnalysis Report

Differentiated miRNAs of Biological & Statistical Significance ‐Multiple Chips

microRNA Microarray Expression Profiling

Control / TreatedBiological repeats Control       Treated

g g p p

p < 0.05

t‐Test

Array assay

p < 0.01

Multi‐array normalization and clustering analysis

Key Advantages of RNA Seq

Microarray vs RNA Sequencing

Key Advantages of Microarray Key Advantages of RNA‐Seq

• Provides a comprehensive view of the transcriptome. All transcripts can be 

l d ( RNA RNA RNA

Key Advantages of Microarray

• Robust, reliable method, proven over decades of use

analyzed (mRNA, ncRNA, snoRNA, lncRNA, miRNA, ...).

• Not necessarily dependent on any prior k l d

• High through‐put method – 100s of samples analyzed per month

• Streamlined handling – can be easily   sequence knowledge. 

• Increased dynamic range and tunable sensitivity. 

g yautomated

• Straightforward data analysis

Sh d i 5 d • Can detect structural variations such as gene fusions and alternative splicing events.

• Short turn‐around time – 5 days 

• Lower cost

• A truly digital solution (absolute abundance vs relative abundance).

Small RNA Sequencing and Data AnalysisComprehensive RNA Sequencing ExperimentComprehensive RNA Sequencing Experiment

• Sample QC

• Sample preparationp p p

• Library preparation

• High‐throughput sequencing 

• Advanced bioinformatics analysis

• High level customer support

Sequencing Run

Small RNA Sequencing and Data Analysisq g

Instrument: Illumina Genome Analyzer GAIIx

Length of Reads: 35 bases

Number of Reads: ~20‐30 Million

Data Output: ~0.7‐1.0 Gb

d ( d ) lBar‐coding (Indexing) Samples:

• We recommend 3 per lane, Max 4 per lane

• The total number of reads does not change with bar‐coding

• Sacrifice sequencing depth for lower cost

Total Reads / LaneNumber of 

Samples / LaneReads/ Sample

Samples / Lane30 M 1 30 M30 M 2 15 M30 M 3 10 M30 M 4 7 5 M30 M 4 7.5 M30 M 5 6 M30 M 6 5 M

Reg. Experimental Design

Sample Replicates for Expression Studies

Biological Replicates – Still Very Important

Sample Replicates for Expression Studies

o og ca ep cates St e y po ta t

• For experiments performed with a small number of biological replicates, significant results may be due to biological diversity between individuals and may not be reproducible it is impossible to know whether expressionmay not be reproducible ‐ it is impossible to know whether expression patterns are specific to the individuals in the study or are a characteristic of the test condition.

f f ff• There is no statistical significance for a difference observed between 2 samples.

• There is no magic to RNA‐Seq. These ideas are widely accepted for DNA g q y pmicroarray experiments, where a large number of biological replicates are now required to justify scientific conclusions.

Hansen KD, Wu Z, Irizarry RA, Leek JT. 2011 Sequencing technology does not eliminate biological variability. Nat Biotechnol 29:572–573. [abstract] 

Data Flow

Small RNA Sequencing and Data Analysis

Mappable readsRaw reads

Reads mapped to Reads un-mappedReads mapped to mammalian mirs in miRBase

Reads un-mapped to mammalian mirsin miRBaseACGT101‐miR 

v3.5 Software 

mirs mapped to species genome

mirs un-mapped to species genome

Reads un-mapped to mRNA, Rfam, and repbase

Reads mapped to mRNA, Rfam, and repbase

othersGroup 1 othersKnown species miRNAs

Reads mapped to species genome

Reads un-mapped to species genome

Reads mapped to species genome

Reads un-mapped to species genome

Group 4 no hitGroup 2 Group 3 G oup o tG oup G oup 3

Known miRNAscandidate species

miRNAs

Candidate species miRNAs genome

inconsistent with miRBase

Potentially novel miRNAs

IsomiRs

Small RNA Sequencing and Data Analysis

IsomiRs

Can explain discrepancies array data vs qRT‐PCR validation

Basic Research / Discovery

Characterization and discovery of novel miRNAs and moRNAs in JAK2V617FCharacterization and discovery of novel miRNAs and moRNAs in JAK2V617F mutated SET2 cells

To gain insights into a possible role of microRNAs in myeloproliferative neoplasms, they performedin myeloproliferative neoplasms, they performed short RNA massive sequencing and extensive bioinformatic analysis in the JAK2V617F‐mutated SET2 cell line. 

O ll 652 k t iRNAOverall, 652 known mature miRNAs were detected, of which 21 were highly expressed, thus being responsible of most of miRNA‐mediated gene repression. microRNA putative targets were enriched in specific signaling g p g gpathways, providing information about cell activities under massive posttranscriptional regulation. The majority of miRNAs were mixtures of sequence variants, called isomiRs, mainly because of alternative noncanonicalmainly because of alternative, noncanonical processing of hairpin precursors. 

Overall, this study shed light on the complexity of microRNA‐mediated gene regulation in SET2 

Relative isomiR contribution to the total read count of 21 most expressed miRNAs in SET2 cells. The total read count belonging to sequences not passing the stringent threshold for being considered as isomiRs is indicated in the white rectangle.

Bortoluzzi S, Bisognin A, Biasolo M, Guglielmelli P, Biamonte F, Norfo R, Manfredini R, Vannucchi AM. (2012) Characterization and discovery of novel miRNAs and moRNAs in JAK2V617F mutated SET2 cells. Blood 119(13), e120‐e130.[article] 

cells and represents the basis for future studies in JAK2V617F‐mutated cellular models.

Basic Research / Discovery

miR‐29 acts as a regulator of cardiac fibrosisg

Acute myocardial infarction (MI) due to coronary artery occlusion is accompanied by a pathological remodeling response that includes hypertrophic cardiac growth and fibrosis, which impair cardiac contractility. 

Show by miRNA microarray that MI inShow by miRNA microarray that MI in mice and humans results in the dysregulation of specific miRNAs, which are similar to but distinct from those involved in hypertrophy and heart failure. A th MI l t d iRNAAmong the MI‐regulated miRNAs are members of the miR‐29 family, which are down‐regulated in the region of the heart adjacent to the infarct. 

Down‐regulation of miR‐29 with anti‐miRs in vitro and in vivo induces the expression of collagens, whereas over‐expression of miR‐29 in fibroblasts reduces collagen expression Conclude that miR 29 acts as

MiRNA profiling in response to MI. (A) Masson Trichrome staining of mouse heart sections (B) Microarray analysis (C) Real‐time PCR analysis of specific miRNAs in response to MI in sham operated animals (D) Real‐time PCR analysis of miRNAs in human heart samples (E) Northern blot analysis

van Rooij E, Sutherland LB, Thatcher JE, DiMaio JM, Naseem RH, Marshall WS, Hill JA, Olson EN. (2008) Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR‐29 in cardiac fibrosis. Proc Natl Acad Sci USA 105(35), 13027‐32.[article] 

expression. Conclude that miR‐29 acts as a regulator of cardiac fibrosis and represents a potential therapeutic target for tissue fibrosis in general.

samples (E) Northern blot analysis 

Biomarkers – Molecular Diagnostics – Diagnosis

Identification of a miRNA signature of renal ischemia reperfusion injury

Renal ischemia reperfusion injury (IRI) is associated with significant morbidity and mortality

Identification of a miRNA signature of renal ischemia reperfusion injury

morbidity and mortality. 

miRNA microarray expression profiling conducted on RNA prepared from IRI, sham, and naive kidneys of mice revealed nine miRNAs that are differentially expressed following IRI when compared with sham controls.controls. 

The differentially expressed miRNAs could be placed into four groups based on their expression tt Th fi di d fi

G d i JG G X St h K J i h A T lli SG

patterns. These findings define a molecular fingerprint of renal injury.

Identification of a miRNA signature following renal IRI. (A) Heat map of miRNAs differentially expressed in the kidneys of mice after IRI or sham operation. (B) Plots of above microarray 

Godwin JG, Ge X, Stephan K, Jurisch A, Tullius SG, Iacomini J. (2010) Identification of a microRNA signature of renal ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci USA 107(32), 14339‐44. [abstract]

data expressed as the mean signal intensity ± SE. 

The differentially expressed miRNAs could be placed into four groups based on their expression patterns following IRI: group 1 was rapidly up‐regulated, group 2 also up‐regulated, group 3 was rapidly down‐regulated, group 4 was also down‐regulated.

Molecular Diagnostics / Biomarkersin Body Fluids – BloodPeripheral blood microRNA signatures can be utilized to identify patients exhibiting atherosclerotic CAD

Used real‐time PCR‐based profiling toUsed real time PCR based profiling to determined the microRNA signature of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from stable and unstable CAD patients and unaffected controls. 

The presence of CAD in general coincided with a marked 5‐fold increase in the relative expression level of miR‐135a, and a 4‐fold decrease in the expression of miR‐147 in pPBMCs from CAD patients as compared to controls.

Unstable angina pectoris patients could be discriminated from stable patients based

(A) The relative expression level of several “housekeeping” microRNAs was determined in PBMCs from coronary artery disease patients (CAD; black bars) and unaffected controls (Control; white bars). Data are expressed as fold change compared to control and represent means + SEM of three (control) or six (CAD) different RNA pools derived from a respective total of 20 and 50 

discriminated from stable patients based upon their relatively high expression level of a cluster of three microRNAs including miR‐134, miR‐198, and miR‐370, suggesting that the microRNA signatures can be used to identify 

subjects. (B) The relative expression level of microRNAs that were differentially expressed between PBMCs from coronary artery disease patients (CAD; black bars) and unaffected controls (Control; white bars). P < 0.01,  P < 0.001 (two‐way ANOVA) (C) The calculated ratio of 

microRNA‐135a and microRNA‐147 expression levels in PBMCs from CAD patients (black bar) and controls (white bar) P < 0 01 (t test)

Hoekstra M et al. (2010) The peripheral blood mononuclear cell microRNA signature of coronary artery disease. BiochemBiophys Res Commun 394(3), 792‐97. [abstract]

patients at risk for acute coronary syndromes. patients (black bar) and controls (white bar).  P < 0.01 (t‐test).

Drug Discovery / Therapeutics miRNAs as Novel Treatments

Mi RNA 210 i i i i hibi i d i di f i

Using microRNA microarrays, showed that microRNA‐210 was highly expressed in live mouse HL 1

MicroRNA‐210 can improve angiogenesis, inhibit apoptosis, and improve cardiac function in a murine model of myocardial infarction

210 was highly expressed in live mouse HL‐1 cardiomyocytes compared with apoptotic cells after 48 hours of hypoxia exposure. Gain‐of‐function and loss‐of‐function approaches were used to investigate microRNA‐210 therapeutic potential in vitro. 

Adult FVB mice underwent intramyocardial injections with minicircle vector carrying microRNA‐210 precursor, minicircle carrying microRNA‐scramble, or sham surgery At 8 weeks echocardiography showedsham surgery. At 8 weeks, echocardiography showed a significant improvement of left ventricular fractional shortening in the minicircle vector carrying microRNA‐210 precursor group compared with the minicircle carrying microRNA‐scramble control. 

MicroRNA‐210 represents a potential novel therapeutic approach for treatment of ischemic heart disease.

Evaluation of cardiac function after MI after miR‐210 treatment. A, Representative echocardiogram of mice with LAD ligation after injection of MC‐210, MC‐Scr, or sham group at Week 8. B, Quantitative analysis of left ventricular FS among the 3 groups. C, Representative Masson trichrome staining of explanted heart at Week 8 showed increased wall thickness for the MC‐210 group, confirming the positive functional imaging data seen in echocardiography D TUNEL staining of an explanted

Hu S, Huang M, Li Z, Jia F, Ghosh Z, Lijkwan MA, Fasanaro P, Sun N, Wang X, Martelli F, Robbins RC, Wu JC. (2010) MicroRNA‐210 as a novel therapy for treatment of ischemic heart disease. Circulation122(11 Suppl), S124‐31. [article]

imaging data seen in echocardiography. D, TUNEL staining of an explanted heart demonstrated significantly reduced apoptotic cells in MC‐210 group compared with the MC‐Scr control group. E, Immunofluorescence staining of CD31 endothelial marker (green) demonstrated increased neovascularization in the myocardium after MC‐210 delivery compared with the MC‐Scr control. 

Drug Discovery / Therapeutics miRNAs as Drug Targets

l l f d l fMicroRNA‐24 regulates vascularity after myocardial infarction

Myocardial infarction leads to cardiac remodeling and development of heart failureremodeling and development of heart failure. Insufficient myocardial capillary density after myocardial infarction has been identified as a critical event in this process.

Showed that microRNA‐24 (miR‐24) is enriched in cardiac endothelial cells and considerably upregulated after cardiac ischemia. MiR‐24 induces endothelial cell apoptosis & abolishes endothelial capillary network formation

Low‐dose antagomir‐24 treatment preferably leads to miR‐24 silencing in endothelial cells in vitro and in vivo. A, Uptake of Cy3‐labeled antagomirs in human umbilical vein endothelial cells (10 μg/mL, 24 hours). B, Primary deposition of Cy3‐labeled t i (C 3 A t ) t l t l t d d th li l ll dh i l l 1

endothelial capillary network formation.

Blocking of endothelial miR‐24 limited myocardial infarct size of mice via prevention of endothelial apoptosis and enhancement of 

l i hi h l d d di antagomirs (Cy3‐Ant.) to platelet and endothelial cell adhesion molecule‐1 (Pecam1)–positive endothelial capillaries after injection of a low dose (5 mg/kg) or homogenous cardiac uptake after treatment with 80 mg/kg (high dose). C, MiR‐24 expression in fractionated cardiomyocytes and cardiac endothelial cells 14 days after myocardial infarction (MI). Animals were treated at day 0 and day 2 with either 5 mg/kg scrambled antagomir (Scr) or antagomir against miR‐24 (Ant24). n=3 to 6 experiments/animals per group. Data are mean and SEM; ***P<0.005.

vascularity, which led to preserved cardiac function and survival. 

The findings indicate that miR‐24 acts as a critical regulator of endothelial cell apoptosis 

Fiedler J, Jazbutyte V, Kirchmaier BC, Gupta SK, Lorenzen J, Hartmann D et al. (2011) MicroRNA‐24 regulates vascularity after myocardial infarction. Circulation 124, 720–730. [article]

p / p g p ;g p pand angiogenesis and is suitable for therapeutic intervention in the setting of ischemic heart disease. 

Drug Discovery / Therapeutics miRNAs as Drug Targets

l f b h bDownregulation of miRNA‐29 by antisense inhibitors protects against myocardial ischaemia‐reperfusion injury

Pioglitazone (PIO), a peroxisome proliferator‐ti t d t (PPAR) i t t tactivated receptor (PPAR)‐γ agonist, protects 

against myocardial ischaemia–reperfusion (IR) injury. 

Evaluated the expression changes of miRNAs in the rat heart after PIO administration using miRNA arrays and found that miR‐29a and c levels decreased remarkably after 7‐day treatment with PIO. 

Antagomirs against miR‐29a or ‐29c significantly reduced myocardial infarct size and apoptosis in hearts subjected to IR injury. 

These finding show that modulation of miRNAs can be achieved by pharmacological intervention and provide a rationale for the development of miRNA‐based strategies for the attenuation of IR injury.  Fig 1 ‐ (A) Relative expression of miR‐29a 16 h after the third injection of 

antagomir (anta‐29a) or missense antagomir (misanta‐29). (B) Relative expression of miR 29c 16 h after the third injection (C) Effect of anta 29aexpression of miR‐29c 16 h after the third injection. (C) Effect of anta‐29a, anta‐29c, and misanta‐29 on myocardial IS. (D) % of TUNEL‐positive‐stained cardiomyocytes in the ischaemic area of antagomir‐pre‐treated mice hearts subjected to IR. (E) Representative staining pattern. Arrows indicate TUNEL‐positive nuclei which are stained blue. 

Ye Y, Hu Z, Lin Y, Zhang C, Perez‐Polo JR. (2010) Downregulation of microRNA‐29 by antisense inhibitors and a PPAR‐{gamma} agonist protects against myocardial ischaemia‐reperfusion injury. Cardiovasc Res 87(3), 535‐44.

CompanyOverview• Global ‐ Genomics & Proteomics Services Provider 

• Headquarters in Houston, Texas ‐ USA

• Offices in USA & ChinaOffices in USA & China 

• Representatives in Japan, Korea, & India

• Extensive Experience

• Providing services since 2005

• Processed > 12,000 samples

• Primary Technological Advantage

• μParaflo® Microfluidics Technology ‐ customizable

Results• Results

• Diverse customer base (> 1400 institutions, > 40 countries)

• ~600 customer publications 

• Excellent reputation in marketplace

• Worldwide sales40

Global Reach – Distribution Channels

United StatesLC Sciences, LLCHouston, TXinfo@lcsciences.comwww.lcsciences.com

ChinaLC BioHangzhou

JapanALLIANCE Technology, Inc.Kyoto City

KoreaYeBTSeoul

IndiaGenetix Biotech Asia (P) Ltdg

info@lc‐bio.comwww.lc‐bio.com

Kyoto Cityinfo@alliance‐technology.jpwww.alliance‐technology.jp

bdhan@yebt.netwww.yebt.net

tdNew Delhi www.genetixbiotech.com

49

Thank You!For Questions or Feedback: service@lcsciences.com

50