Caratterizzazione strutturale delle proteine

1. X-ray2. NMR

1)Cristallografia a raggi X

2) NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

1864 Viene cristallizzata l’ emoglobina.1895 Röngten osserva che quando i raggi catodici (elettroni) colpiscono un bersaglio metallico si

origina una nuova forma di radiazione penetrante, che egli chiamò raggi X.1912 Facendo attraversare dai raggi X un cristallo di solfuro di zinco Von Laue ottiene i primi

diffrattogrammi. W.L. Bragg e W.H. Bragg propongono una correlazione semplice tra la figura di diffrazione ottenuta con i raggi X e la disposizione degli atomi nel cristallo che ha generato la figura (legge di Bragg).

Anni ‘30 Bernal, Crowfoot, Bragg, ottengono i primi diffrattogrammi da cristalli di proteine (insulina, emoglobina, mioglobina).

1941 Atsbury ottiene il primo diffrattogramma ai raggi X del DNA.1951 Pauling e Corey propongono i concetti di struttura a-elica e foglietto b in base a considerazioni

teoriche.1953 Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica del DNA sulla base delle analisi

diffrattometriche ai raggi X di Franklin e Wilkins.1954 Perutz e coll. elaborano i metodi basati sull’ impiego dei metalli pesanti per risolvere il

problema delle fasi nella cristallografia ai raggi X.1960 Kendrew descrive la struttura della mioglobina a una risoluzione di 2 Å. Perutz propone la

struttura della emoglobina, piu’ grande, ad una risoluzione inferiore.Anni ‘80 Hartmut Michel risolve la struttura (3 Å) della prima proteina di membrana (centro di reazione

fotosintetico).

LA STORIA

The paper

The model

Maurice Wilkins

M.H.F. Wilkins, A.R. Stokes, H.R. Wilson:Molecular Structure of Deoxypentose NucleicAcids. Nature 171, 738 (1953)

Rosalind Franklin

R.E. Franklin and R.G. GoslingMolecular Configuration in Sodium Thymonucleate, Nature 171, 740 (1953)

Nobel laureates 1962

Wilkins, Perutz, Crick, Steinbeck, Watson, Kendrew

• Attualmente tecnica di elezione per la determinazione di strutture 3D a risoluzione atomica

• Tecnica indiretta: l’immagine va ricostruita

• Non ci sono limitazioni nelle dimensioni delle macromolecole

• Svantaggi:– cristalli singoli– altamente ordinati– ragionevolmente grandi (80-100 μM)

Cristallografia a raggi X

Cristallografia a raggi X

Cristalli della proteina– 0.3-1.0 mm– Le singole molecole sono ordinate in modo periodico, ripetitivo

Salting out non è sufficiente

Precisa determinazione della posizione atomica

La solubilità della proteina è determinata dalle interazioni soluto solvente dovute alle cariche superficiali della proteina

Lys, Arg, Asp, Glu

L’aumento della forza ionica della soluzione favorisce la interazione tra le cariche superficiali della proteina

ed il solvente polare

Un eccesso di forza ionica della soluzione favorisce le solvatazione

degli ioni stessi a scapito della solvatazione della proteina. Il sale

compete con la proteina e la solvatazione diminuisce

all’aumentare della forza ionica

Polietilenglicole: proteina precipita, ma rimane in contatto con l’acqua.

Struttura ordinata con indice di rifrazione diversorispetto a quello del mezzo in cui si trova

Per poter visualizzare due oggetti come entità separate, la lunghezza d’onda della radiazione elettromagnetica deve essere dello stesso ordine di grandezza della distanza tra gli oggetti:

distanza interatomica ≈1Å (10 nm)

λraggiX= 0.1 ÷ 2 Å

con i raggi X “vedo” gli atomi

Perchè i raggi X?

Visione d’insieme del processo

FFTRX

Risoluzione della struttura e affinamento

Cristallizzazione Diffrazione

…perché un cristallo?

MA: - è troppo debole

- impossibile separarla dalla radiazione di fondo (soluzione) Impossibile ricostruire la molecola

L’immagine di diffrazione da una singola molecola si forma per interazione dei raggi X con gli elettroni degli atomi della molecola

In un cristallo, miliardi di molecole sono disposte

in modo ripetuto e ordinato

nelle tre dimensioni

Cristallo è amplificatore del segnale

buone immagini di diffrazione

si può ricostruire la molecola

100 mg!!

Schmid, M. Trends in Microbiology, 10:s27-s31.

Instrumentation

or synchrotron X-rays

Instrumentation ESRF - Grenoble

InstrumentationElettra - Trieste

The Bragg law

l = 2 d sinq

sinq/l = 1/(2 d)d = l / (2 sinq)

Facendo incidere un'opportuna onda elettromagnetica su di un cristallo si osservano fenomeni di interferenza, causate dalla riflessione di onde riflesse da piani cristallinidiversi, ma paralleli.

Dove:- θ è l'angolo che il fascio incidente forma con il piano cristallino- λ è la lunghezza d’onda della radiazione- d è la distanza tra due piani adiacenti.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/38/Dinamica_della_cristallizzazione.jpg

Soluzione cristallizzante

Agen

te p

reci

pita

nte

Acqu

a

acqua/acetone cloroformio o cloruro di metilene/etere di petrolio o esano

Crystal growth

Crystal growth

Abbiamo ottenuto le MAPPE … e poi?

+ =

Densità iniziale Interpretazione Struttura 3D

• La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione.

• La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.

Risoluzione

Esempio: la proteasi del virus HIV

La cavità centrale è ampia epuò legare un polipeptide in conformazione estesa

• La tasca è stata “riempita” con analoghi non idrolizzabili del substrato: inibitori competitivi altamente specifici e selettivi

KNI577

• Nuova generazione di farmaci “intelligenti” con pochi effetti collaterali inibitori non competitivi altamente specifici e selettivi

Superimposition of myristate and abacavir (panel A), nevirapine (panel B), and atazanavir (panel C) in binding site FA6. Ligands are colored as follows:myristate: green; abacavir: blue; nevirapine: orange; atazanavir: cyan. Atomic coordinates were taken from the PDB entry 1O9X (Zunszain et al., 2003).

MODULATION OF HEME AND MYRISTATE BINDING TO HUMAN SERUM ALBUMIN BY ANTI-HIV DRUGS. AN OPTICAL AND NMR SPECTROSCOPIC STUDY (FEBS J. 274 (2007) 4491-4502)

Heme Binding to Albuminoid Proteins is the Result of Recent Evolution, IUBMB Life 59, 436-440 (2007).

• Tecnica spettroscopica per lo studio della struttura di macromolecole a risoluzione atomica

• È basata sull’interazione dei singoli nuclei atomici magneticamente attivi - 1H, 15N, 13C e 31P - con il campo magnetico esterno e con i campi magnetici dei nuclei adiacenti

2) NMR

Informazioni di:– dinamica– conformazione– folding– interazioni intermolecolari

Campo magnetico

NOE (Nuclear Overhauser Effect)

Il campo magnetico

Magnete a 400 MHzMagnete a 900 MHz

Costo commerciale di uno spettrometro a 900 MHz: ca. 5 M €

n. di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10

Magnetic Resonance Center - Firenze

The Magnet

A “cutted” magnet

History

First magnets were built using ferromagnetic material=permanent magnet

Then Electromagnets: i.e. field was generated by wiring of conducting material

Now: cyomagnets: i.e. electromagnets made of superconducting wire.

La rotazione dei nuclei atomici su sé stessi è capace di procurare un momento magnetico μ se i nuclei sono carichi.

Solo nuclei con numero atomico dispari mostrano proprietà magnetiche: si dice che il loro numero quantico di spin è ±1/2.

Solo particelle dotate di spin sono in grado di disporsi in diversi livelli energetici se immerse in un campo magnetico.

Orbita di precessioneB0

Dipolo magnetico

Nucleo

μN

Frequenza di Larmor

Momento magnetico

L’energia della transizione NMR

B0

E

m=+1/2

m=-1/2

DE=h0

Larmor Frequency

DE=g(h/2p)B0

E= -m•B0

Il campo magnetico B0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli

Si applica un campo magnetico B0:il momento magnetico del protone tenderà ad allinearsi con il campo esterno. Si creano due livelli energetici: uno, ad energia più alta, in cui il suo momentomagnetico si oppone al campo esterno; uno, ad energia più bassa, in cui è allineato.

L’energia della transizione NMR

B0

E

m=+1/2

m=-1/2

DE=h0

Larmor Frequency

DE=g(h/2p)B0

E= -m•B0

Devo applicare una radiofrequenza = alla frequenza DE=h0

Per stimolare la transizione!

Il campo di radiofrequenza utilizzato per eccitare la transizionesi chiama anche B1

B1 deve emettere una radiofrequenza in corrispondenza della frequenza di Larmor

Some paradigmatic examples

Why?NMR is a unique method to obtain information in solution

AT THE ATOMIC LEVEL.

Each individual atom has a peculiar resonance frequency.

Because the resonance frequency depends on the environment of the atom, EACH atom has a different resonance frequency and

can, therefore be identified

CH3-CH2-OH

equivalent

NMR Spectrum to 3D Structure

Spectrum

H

H

H

H

H

H

H

H H

H

H

Interactions

Structure

Challenges For Determining Protein Structures Using NMR• Proteins have thousands of signals

• Assign the specific signal for each atom

• Thousands of interactions between atoms- also need to be assigned

• Need to transform from NMR spectrum through interpretation of scalar and dipolar interactions to generate 3D coordinates

Resonance Assignment

CH3-CH2-OH

Which signal from which H atoms?

OH CH2 CH3

The key attribute: use the scalar and dipolar couplings to match the set of signals with the molecular structure

Proteins Have Many Signals

1H NMR Spectrum of Ubiquitin~500 resonances

A large number of signals are overlapped

A Critical Feature of Protein NMR Spectra

• Only some nuclei are coupled

Each amino acid gives rise to an independent NMR sub-spectrum, which is much simpler than the

complete protein spectrum

Methods have been developed to extract each sub-spectrum from the whole

Critical Features of Protein NMR Spectra

• The nuclei are not all mutually coupled

• Regions of the spectrum correspond to different parts of the amino acid

• Tertiary structure leads to increased dispersion of resonances

Regions of the 1H NMR Spectrumare Further Dispersed by the 3D Fold

What would the unfolded protein look like?

Proteins Have Overlapped Signals

Resolve resonances by multi-dimensional experiments

1H NMR Spectrum of Ubiquitin

Spettri monodimensionali presentano differenze di c.s. < potere risolutore

Resolve Peaks By Multi-D NMR

A BONUSregions in 2D spectra provide protein fingerprints

If 2D cross peaks overlap go to 3D or 4D …..

Solution to the Protein Challenge

1. Increase dimensionality of spectra to better resolve signals: 1234

2. Detect signals from heteronuclei (13C,15N)

t2

t1

t3

NMR Structure Calculations• Objective is to determine all conformations consistent

with the experimental observables

• NMR data is not perfect: noise, incomplete

Multiple solutions: caused by uncertaintiesin the experimental constraints

Conformational Ensemble Representing an NMR Structure

C

N

Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)

• Proteine in soluzione• Limite di dimensione ~ 40 kDa• Proteine stabili a lungo• Marcatura con 15N, 13C, 2H.• Strumentazione molto costosa• Tempo per assegnare le risonanze

Pro e contro

X-ray

• Richiede cristalli, problematico

• Non ha limiti (teorici) di grandezza

• Piú preciso

• Risoluzione

• Struttura può essere deformata dai cristalli, rigida

• Una “soluzione“

NMR

• Possibile in soluzione, più semplice

• Limitato a proteine fino a circa 300 residui

• Meno preciso

• Numero di vincoli

• Struttura nativa in soluzione, flessibile

• Molti modelli

X-ray NMR