CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA À LIMITAÇÃO DE …...Aos meus amigos do Laboratório de Física...
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IBMR - LAUREATE INTERNATIONAL UNIVERSITIES Maria Carolina Aguiar Marques Da Silva CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA À LIMITAÇÃO DE FÓSFORO EM LINHAGENS DE Cylindrospermopsis raciborskii (CYANOBACTERIA) Rio de Janeiro 2016
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IBMR - LAUREATE INTERNATIONAL UNIVERSITIES
Maria Carolina Aguiar Marques Da Silva
CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA À LIMITAÇÃO DE
FÓSFORO EM LINHAGENS DE Cylindrospermopsis raciborskii
(CYANOBACTERIA)
Rio de Janeiro
2016
MARIA CAROLINA AGUIAR MARQUES DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA À LIMITAÇÃO DE
FÓSFORO EM LINHAGENS DE Cylindrospermopsis raciborskii
(CYANOBACTERIA)
Monografia apresentada ao IBMR - Laureate
International Universities como requisito
parcial para a obtenção do grau de Bacharel em
Biomedicina.
ORIENTADOR: Ana Beatriz Furlanetto Pacheco
Rio de Janeiro
2016
MARIA CAROLINA AGUIAR MARQUES DA SILVA
“CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA À LIMITAÇÃO DE
FÓSFORO EM LINHAGENS DE Cylindrospermopsis raciborskii
(CYANOBACTERIA).”
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado como requisito para obtenção do
grau de Bacharel em Biomedicina do Instituto
Brasileiro de Medicina de Reabilitação – Uni-
IBMR.
Aprovada em 06 de Dezembro de 2016
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
JORGENILCE DE SOUZA SALES
__________________________________________
JOSE CLAUDIO CARVALHO CORDEIRO
_________________________________________
LUCIANA MACHADO RANGEL
Ao meu pai, por estar sempre comigo em
pensamento e a minha mãe, pelo apoio e
carinho.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Ana Beatriz por ter me proporcionado esse projeto e por sempre
estar à disposição para me ajudar e ensinar. Sendo principalmente uma inspiração para mim.
Aos meus amigos do Laboratório de Física Biológica, em especial ao Leandro e Thamires
por sempre estar à disposição para esclarecer qualquer dúvida e pela imensa ajuda durante a
elaboração desse trabalho e a Anna Carolina por participar junto comigo nessa jornada dupla
de Catete-UFRJ diariamente me ajudando no estágio e na faculdade.
Aos amigos do Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias, em especial
a Iamê por esclarecer diversas dúvidas que eu tive ao longo dos experimentos e ao Daniel por
ter me ajudado muito com o cultivo de Cianobactéria e com a sua fisiologia.
À Camilla, obrigada por ajudar a tornar mais leves dias difíceis.
Aos meus amigos da faculdade, em especial a Renata e a Anna por terem ajudado esse
período de 4 anos ser o melhor da minha vida.
Aos meus Professores, por exercerem o dom de ensinar de uma maneira inesquecível.
À banca pelo carinho de poder passar os seus conhecimentos.
Às agências de fomento (PIBIC/CNPq).
À minha família, namorado e amigos pelo apoio incondicional durante a graduação e
principalmente por entenderem muitas vezes a minha ausência.
A ciência não é uma ilusão, mas seria uma ilusão
acreditar que poderemos encontrar noutro lugar
o que ela não nos pode dar.
(Sigmund Freud)
RESUMO
Cylindrospermopsis raciborskii é uma espécie de cianobactéria de distribuição global e
crescente em ambientes de água doce e está entre as principais formadoras de florações tóxicas
no Brasil e no mundo. Esta ampla plasticidade adaptativa está relacionada com sua capacidade
de estabelecer respostas fisiológicas adequadas a condições ambientais variáveis. A
eutrofização dos ambientes aquáticos é o fator mais associado às florações de cianobactérias.
O fósforo tem sido considerado o principal elemento limitante ao crescimento de cianobactérias
e o aumento nas concentrações deste elemento é relacionado à ocorrência de florações. Apesar
disso, elevadas biomassas de C.raciborskii já foram observadas em ambientes com baixa
concentração de fósforo total e dissolvido. O fósforo também parece regular a produção de
toxinas em algumas espécies de cianobactérias, como saxitoxinas e clindrospermopsinas. O
objetivo deste estudo foi estudar a resposta fisiológica em termos de crescimento e expressão
de proteínas de C.raciborskii à disponibilidade de fósforo. Duas linhagens isoladas de
ambientes brasileiros foram estudadas: CyRF, produtora de saxitoxina e CyLP não produtora.
Foram cultivadas em meio ASM-1 completo ou sem fósforo por 21 dias. O crescimento foi
acompanhado por contagem de células e por biovolume. Padrões de proteínas de membrana e
de lisados totais foram analisados por SDSPAGE, bandas diferenciais foram recuperadas e as
proteínas identificadas por espectrometria de massas. O crescimento de ambas as linhagens foi
reduzido na ausência de fósforo, porém em graus diferentes. A síntese total de proteínas também
se reduziu nessa condição. Em limitação de fosfato identificamos transportadores de fosfato e
outros transportadores, além de uma proteína de resposta a estresse, já a partir do 6º dia de
cultivo. Na fração de membrana identificamos porinas. Na linhagem CyRF foi detectada
saxitoxina ao final do cultivo em presença de fósforo mas não na sua ausência. Esses resultados
apontam para diversas respostas fisiológicas envolvidas com a adaptação à limitação de fósforo
nessa espécie.
Palavras-chave: 1. CIANOBACTÉRIA; 2. Cylindrospermopsis raciborskii; 3.
PORINAS; 4. FÓSFORO; 5. TOXINA
SUMMARY
Cylindrospermopsis raciborskii is a cyanobacteria species of global and growing
distribution in freshwater environments and is among the most common species in toxic blooms
in Brazil and worldwide. This broad adaptive plasticity is related to its ability to establish
adequate physiological responses to variable environmental conditions. Eutrophication of
aquatic environments is highy associated with cyanobacteria blooms. Phosphorus has been
considered a limiting element to the growth of cyanobacteria and the increase in the
concentrations of this element are related to the occurrence of blooms. Despite this, high
biomasses of C.raciborskii have already been observed in environments with low concentration
of total and dissolved phosphorus. Phosphorus also appears to regulate the production of toxins
in some species of cyanobacteria, such as saxitoxins and clindrospermopsins. The objective of
this study was to study the physiological response of C.raciborskii to the availability of
phosphorus. Two strains isolated from Brazilian environments were studied: CyRF, producer
of saxitoxin and CyLP, which does not produce it. They were grown in ASM-1 medium,
complete or without phosphorus, for 21 days. Growth was accompanied by cell counting and
biovolume. Protein profiles obtained from membranes or from total lysates were analyzed by
SDSPAGE, differential bands were recovered and the proteins identified by mass spectrometry.
The growth of both strains was reduced in the absence of phosphorus, but in different degrees.
Total protein synthesis also decreased in this condition. In phosphate limitation we identified
phosphate transporters and other transporters, as well as a general stress response protein,
starting from the 6th day of culture. In the membrane fraction we identified porins. In the CyRF
strain, saxitoxin was detected at the end of the cultivation in the presence of phosphorus but not
in its absence. These results point to several physiological responses involved in the adaptation
to phosphorus limitation in this species.
Keywords: 1. CYANOBACTERIA; 2. Cylindrospermopsis raciborskii; 3. PORINAS; 4.
PHOSPHORUS; 5. TOXIN
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: MORFOLOGIA DA CIANOBACTÉRIA .................................................. -14-
FIGURA 2: FLORAÇÃO DE CIANOBACTÉRIA................................................. ........... -16-
FIGURA 3: MEMBRANA DE CIANOBACTÉRIA......................................................... -17-
FIGURA 4: PROTEÍNA DE MEMBRANA......................................................... .............. -18-
FIGURA 5: ESTRUTURA QUÍMICA DAS TOXINAS.............................................. -21-
FIGURA 6: LINHAGENS CYRF E CYLP ....................................................................... -23-
FIGURA 7: CURVA DE CRESCIMENTO POR CÉLULA – CYRF............................. -31-
FIGURA 8: CURVA DE CRESCIMENTO POR CÉLULA - CYLP............................ -32-
FIGURA 9: VOLUME CELULAR DAS LINHAGENS ............................................ -33-
FIGURA 10: BIOVOLUME – CYRF........................................................................... -34-
FIGURA 11: BIOVOLUME – CYLP ........................................................................... -35-
FIGURA 12: DOSAGEM DE PROTEÍNA - CYRF .................................................. -36-
FIGURA 13: DOSAGEM DE PROTEÍNA - CYLP.............................. ...................... -37-
FIGURA 14: PADRÕES DAS FRAÇÕES DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA...............-38-
FIGURA 15: DOMÍNIOS CONSERVADOS................................................................ -39-
FIGURA 16:ALINHAMENTO DAS DUAS PROTEÍNAS IDENTIFICADAS................ -40-
FIGURA 17: PADRÕES DAS FRAÇÕES DE PROTEÍNAS DO LISADO – CYRF......... -42-
FIGURA 18: PADRÕES DAS FRAÇÕES DE PROTEÍNAS DO LISADO – CYLP......... -43-
FIGURA 19: PADRÕES REPRESENTATIVOS DAS FRAÇÕES DE PROTEÍNAS - CYLP E
CYRF................................................................................................................................. -46-
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: CLASSIFIAÇÃO POR MORFOLOGIA....................................................... -15-
TABELA 2: CLASSIFICAÇÃO POR TOXINA................................................................. -20-
TABELA 3: COMPOSIÇÃO DO MEIO ASM-1................................................................ -25-
TABELA 4: PROTEÍNAS IDENTIFICADAS – FRAÇÃO DE MEMBRANA................ -39-
TABELA 5: PROTEÍNAS IDENTIFICADAS- FRAÇÃO DO LISADO.......................... -45-
LISTA DE ABREVIATURAS
HPLC- “High Performance Liquid Chromatography” - cromatografia líquida de alta eficiência
P- Fósforo
STX- Saxitoxina
MS- “mass espectrometry”- espectrometria de massas
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................................... VII
SUMMARY .......................................................................................................................... VIII
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. IX
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. XI
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................................... XII
1.INTRODUÇÃO ................................................................................................................ - 14 -
1.1 CIANOBACTÉRIAS ............................................................................................... - 14 -
1.1.1 Estrutura celular de Cianobactérias ..................................................................... - 17 -
1.2 TOXINAS ................................................................................................................. - 19 -
1.3 FLORAÇÕES DE CIANOBACTÉRIAS E FÓSFORO ...................................... - 22 -
1.4 Cylindrospermopsis Raciborskii ............................................................................... - 22 -
2. OBJETIVOS .................................................................................................................... - 24 -
2.1 OBJETIVOS GERAL: ............................................................................................ - 24 -
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ................................................................................ - 24 -
3. METODOLOGIA............................................................................................................ - 25 -
3.1 LINHAGENS DE ESTUDO E CONDIÇÕES PADRÃO DE CULTIVO .......... - 25 -
3.2 CULTIVOS DAS LINHAGENS COM E SEM FÓSFORO ................................ - 25 -
3.3 CONTAGEM DE CÉLULAS ................................................................................. - 26 -
3.4 BIOVOLUME .......................................................................................................... - 27 -
3.5 DOSAGENS DE PROTEÍNA ................................................................................. - 27 -
3.6 EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA .............................................. - 28 -
3.7 ANÁLISES DE PROTEÍNAS EM SDS-PAGE .................................................... - 28 -
3.8 IDENTIFICAÇÕES DE PROTEÍNAS .................................................................. - 29 -
3.9 EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE SAXITOXINAS ................................................... - 29 -
4. RESULTADOS ............................................................................................................... - 31 -
4.1- CRESCIMENTO .................................................................................................... - 31 -
4.1.1- Contagem de Células ......................................................................................... - 31 -
4.1.2- Biovolume .......................................................................................................... - 32 -
4.1.3- Dosagem de proteína.......................................................................................... - 35 -
4.2 ANÁLISE DE SAXITOXINA TOTAL .................................................................. - 37 -
4.3 EXTRAÇÕES DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA ............................................ - 37 -
4.4- EXPRESSÕES DE PROTEÍNAS NA PRESENÇA E AUSÊNCIA DE FOSFATO -
41 -
5. DISCUSSÃO ................................................................................................................... - 48 -
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... - 56 -
7 REFERÊNCIAS ............................................................................................................... - 57 -
- 14 -
1.INTRODUÇÃO
1.1 CIANOBACTÉRIAS
As cianobactérias são organismos procariotos fotossintetizantes, aeróbios. As
cianobactérias são consideradas atualmente um filo dentro do domínio Bacteria
(CASTENHOLZ, 2001). Estima-se que as cianobactérias surgiram na Terra há cerca de 3,5
bilhões de anos, tendo sido responsáveis pela liberação de oxigênio na atmosfera (SCHOPF,
2000). Atualmente são amplamente distribuídas em diversos tipos de ambientes tanto terrestres
quanto aquáticos, como fontes termais, desertos, e regiões polares. Podem ocorrer em simbiose
com plantas ou fungos ou terem vida livre. Algumas espécies são capazes de fixar nitrogênio,
portanto esse grupo tem um papel importante nos ciclos do carbono, oxigênio e nitrogênio.
Além disso, é estabelecido que os cloroplastos das plantas tiveram origem em cianobactérias
simbiontes (OLIVER, et al., 2000.)
Quanto à morfologia, cianobactérias podem ser unicelulares, filamentosas ou coloniais
(Figura 1). Com base nessas características e no tipo de divisão celular esse grupo é classificado
em Seções (Tabela 1).
FIGURA 1: Morfologias identificadas em cianobactérias. (a) filamentosa- Cylindrospermum sp., (b)
unicelular- Aphanothece sp.: (c) colonial - Microcystis sp. (Adaptado: Keweenaw Algae-
www.keweenawalgae.mtu.edu)
- 15 -
TABELA 1- Classificação taxonômica do filo Cyanobacteria de acordo com o Manual de Bergey de
Sistemática Bacteriológica. Fonte: MARQUES, 2006
Cianobactérias podem habitar diversos ambientes, mas são encontradas em abundância
em ambientes aquáticos, tanto marinhos como de água doce. Quando acontece um aumento na
concentração de nutrientes em um ambiente aquático, geralmente ocorre um aumento da
população desses microrganismos, gerando florações, as quais são prejudiciais ao ecossistema
local ocasionando perda da transparência da água, decomposição de matéria orgânica que gera
hipóxia, afetando negativamente macroalgas, vertebrados, peixes e outros organismos locais
(Figura 2) (CHORUS AND BARTRAM, 1999; HUISMAN et al., 2005; PAERL, 2008).
- 16 -
FIGURA 2- Florações de cianobactérias tóxicas em diversos ambientes aquáticos. (a) Lago Taihu, China
(Microcystis spp.) (cedida pela NASA MODIS), (b) Lago Erie, EUA-Canadá (Microcystis) (cedida pela NASA
MODIS), (c) Lago Atitlan, Guatamala (Lyngbya) (cortesia NASA MODIS), (d) Mar Báltico -Golfo da Finlândia
(Nodularia, Anabaena, Microcystis) (cortesia NASA MODIS). (e) Lago Dianchi, China (Aphanizomenon sp.)
(cortesia Chinese Academy of Sciences). (f e g) Lago Tahiu, China (Microcystis spp.) (Fotos por H. Paerl). (h)
Baia Taivallahti, Mar Báltico, Finlândia (Instituto-SYKE). (i) Estuário do Rio Neuse, Carolina do Norte, EUA
(Microcystis sp.) (Foto H. Paerl). (j) St. John’s River, FL (foto J. Burns). (k) Mar Báltico, Golfo da Finlândia
(Nodularia). (l) Sanibel Inlet, Golfo do litoral do México, Florida USA (Trichodesmium sp.) Cedida: PAERL, 2011
Particularmente em ambientes de água doce, o crescimento de cianobactérias é favorecido
em temperaturas de 18ºC a 30ºC, pH neutro alcalino e alta concentração de nutrientes
(principalmente nitrogênio e fósforo). O seu crescimento abundante em corpos d’água cria
diversos problemas relacionados ao uso da água, pois algumas linhagens produzem e liberam
toxinas prejudiciais à saúde de animais e humana (CHORUS AND BARTRAM, 1999;
MINISTÉRIO DA SAÚDE: FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 2003).
- 17 -
1.1.1 Estrutura celular de Cianobactérias
O tamanho das células pode variar entre 2 a 40 μm. No caso de espécies coloniais e
algumas filamentosas um agregado de células envolto por uma matriz de polissacarídeos.
Naquelas capazes de fixar nitrogênio existe um tipo celular diferenciado chamado heterocito
com paredes espessas que impedem a difusão do oxigênio garantindo o funcionamento da
enzima nitrogenase. Alguns gêneros de filamentosoas podem formar acinetos, células de
resitência diferenciadas que são geradas em condições ambientais desfavoráveis. O acineto
tende a sedimentar e atua como um esporo de resistência (FLORES AND HERRERO 2010).
As cianobactérias possuem uma parede celular do tipo Gram-negativa. O envoltório
básico das cianobactérias é formado por: membrana externa, peptídeoglicano e membrana
plasmática (Figura 3). A sua parede de peptideoglicano é mais espessa que da maioria das
bactérias Gram-negativas, sendo um exemplo a espessura do envoltório de Synechoccus, que
pode chegar até cerca de 10nm (Figura 3) (GOLECKI, 1977).
FIGURA 3- Comparação de parede celular de células gram negativas utilizando microscopia eletrônica.
Cianobactéria P. uncinatum (A) e E. coli (B)OM: Membrana externa; P: Periplasma; CM: Membrana
Citoplasmática; EL: Camada externa . Fonte: Adaptado de Hoiczyk & Hansel, 2000. (C) Esquema do envoltório
celular de cianobactérias. Adaptado de Fagan&Fairweather, Nat Rev.Microbiol. 2014
C
- 18 -
Sua membrana externa contém vários tipos de proteínas, sendo as porinas (outer
membrane proteins, OMPs) as mais abundantes (HOICZYK AND HANSEL, 2000). Porinas
são canais proteicos que permitem o fluxo de compostos hidrofílicos através da membrana
externa e promovem a difusão de íons e pequenas moléculas (Figura 4) (NIKAIDO, 2003).
OMPs podem se organizar em trímeros ou monômeros. Cada monômero possui uma estrutura
de barril β, com folhas β transmembranares formando uma estrutura circular. Folhas β são
conectadas por pequenas voltas no lado periplasmático e longas alças para o exterior da célula.
Em Gram-negativas, cada monômero de porina possui 30-40 kDa, mas em cianobactérias
podem alcançar 70kDa, pois possuem um domínio extra, SLH (surface layer homology)
conservado em cianobactérias e relacionado à sua ligação ao peptidoglicano (NIKAIDO,2003;
ZETH, 2010). A expressão de porinas é regulada por variações ambientais tais como alterações
de pH, osmolaridade ou limitação nutricional, sendo essas mudanças sentidas em primeira
instância pelo envoltório celular.
FIGURA 4 – (A) Sequência de aminoácidos de uma porina prevista no genoma de C.raciborskii e estrutura
secundária predita. Imagem cedida por Carolina Goulart. (B) Estrutura predita de uma proteína de membrana
externa de Synechococcus sp. (Barnett, et al., 2014).
A B
- 19 -
As cianobactérias apresentam no citoplasma estruturas para acúmulo de reservas. Assim
podem estocar nutrientes na forma de grânulos de cianoficina como estoque de nitrogênio,
grânulos de polifosfato como estoque de fósforo e carboxissomos como estoque de carbono
(VAN DE MEENE, et al. 2006).
Um sistema de membranas chamado tilacóide se organiza no citoplasma arranjado em
camadas e é onde se encontram os ficobilissomos, que são estruturas formadas por proteínas e
pigmentos fotossintéticos (VAN DE MEENE, et al. 2006).
Cianobactérias podem se adaptar a diferentes intensidades luminosas, inclusive
regulando sua posição na coluna d’água devido à presença de vesículas de gás no interior das
células, favorecendo assim a fotossíntese (DAMERVAL, et al. 1989).
Todos estes fatores conferem vantagens adaptativas às cianobactérias em relação a outros
grupos do fitoplâncton no ambiente aquático.
1.2 TOXINAS
Muitas espécies de cianobactérias incluem linhagens capazes de produzir toxinas. Os
gêneros em que é mais comum ocorrerem linhagens produtoras de toxinas são: Anabaena,
Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Lyngbya, Nodularia, Oscillatoria, Trichodesmium,
Microcystis e Planktothrix, sendo encontrados principalmente em água doce (Tabela 2).
Cianotoxinas são metabólitos produzidos por cianobactérias com efeitos tóxicos para animais.
Elas são divididas em três grandes grupos de acordo com sua estrutura química: peptídeos
cíclicos, alcaloides e lipopolissacarídeo (LPS) (CHORUS AND BARTRAM, 1999) (Tabela 2,
Figura 5).
- 20 -
TABELA 2- Tipos de toxinas produzidas por determinados gêneros de Cianobactérias de acordo com efeitos em
mamíferos (Adaptado de Chorus e Bartram, 1999)
Quanto ao seu efeito em mamíferos, as cianotoxinas podem ser classificadas como
hepatotoxinas, citotoxinas, dermatoxinas e neurotoxinas (Figura 5) (CHORUS AND
BARTRAM, 1999; VAN APELDOORN et al., 2007). Os peptídeos cíclicos (nodularina e
microcistinas) são hepatotoxinas que geram um grande risco em reservatórios de água potável.
Em mamíferos a maior parte da absorção destas toxinas ocorre através de transportadores de
membranas, principalmente em hepatócitos, sendo o órgão mais afetado o fígado, causando
hemorragias em casos de intoxicação aguda com alta concentração da toxina (CHORUS E
BARTRAM, 1999).
As neurotoxinas são alcalóides responsáveis por casos de intoxicação e morte por parada
respiratória, pois a substância pode imitar o efeito da acetilcolina, inibir a colinesterase e
bloquear os canais de sódio das células nervosas. A saxitoxina é um alcalóide responsável por
- 21 -
intoxicações por ingestão de frutos do mar (SHUMWAY, 1995), porém nestes casos a toxina
é produzida por um dinoflagelado marinho. O grupo das saxitoxinas apresenta variantes de
acordo com a substituição de alguns grupamentos químicos na molécula (indicados por R na
figura 5). A toxina se liga a canais de sódio e potássio em membranas de axônios e impede a
passagem destes íons através da membrana celular bloqueando a transmissão do impulso
nervoso, o que afeta a função muscular. Dependendo da dose da toxina pode causar tontura,
náusea, adormecimento, paralisia muscular ou morte. Ela é estável em diversas condições (seca
por liofilização, em meio ácido e em temperaturas de -80ºC, - 20ºC e 4ºC) (ALFONSO et al.,
1994), sendo também difícil sua retirada da água quando utilizadas técnicas de remoção de
cianobactérias, como floculação concomitante com a filtração das células que retira apenas uma
porcentagem da toxina em questão (HOEGER et al., 2004).
FIGURA 5: Estrutura química das cianotoxinas. FONTE: BORTOLI & PINTO, 2015.
- 22 -
1.3 FLORAÇÕES DE CIANOBACTÉRIAS E FÓSFORO
Florações de cianobactérias têm se tornado cada vez mais frequentes e intensas em todo
o mundo nas últimas décadas (PAERL AND OTTEN, 2013; HEISLER et al., 2008; PAERL
AND HUISMAN, 2008) Várias condições ambientais são relacionadas à formação de
florações: enriquecimento de nutrientes, temperaturas elevadas, estratificação da coluna d’água
e pH elevado com baixo teor de CO2 (REYNOLDS, 2006; PAERL AND HUISMAN, 2008;
PAERL AND OTTEN, 2013).
Não é possível apontar um único fator ambiental como responsável por esse crescimento
exagerado. Mas um dos fatores considerados mais importantes é o aporte de nutrientes em
ambientes aquáticos resultante de atividades humanas como aquacultura, descarga de esgoto e
de fertilizantes na água (Heisler et al., 2008; Paerl and Otten, 2013). Quando corpos d’água são
enriquecidos em nutrientes ocorre uma mudança na comunidade fitoplanctônica com
predominância de cianobactérias. Os principais nutrientes envolvidos são nitrogênio e fósforo
(Heisler et al., 2008). Como algumas espécies de cianobactérias que formam florações são
capazes de fixar nitrogênio, nestes casos um dos fatores limitante seria o P. Por isso, inclusive,
normas públicas de qualidade de água recomendam reduzir P em corpos d’água como uma
forma de controlar o crescimento de cianobactérias (Ministério da Saúde: Fundação Nacional
de Saúde, 2003).
1.4 Cylindrospermopsis Raciborskii
Cylindrospermopsis foi isolada pela primeira vez em 1912 em Java, uma ilha tropical. Na
última década tem sido reportado um aumento na sua distribuição geográfica para zonas
temperadas e hoje já foi isolada de todos os continentes exceto a Antártica (ANTUNES et al.,
2015).
Cylindrospermopsis raciborskii é uma espécie de cianobactéria filamentosa, diazotrófica,
globalmente distribuída em ambientes de água doce (Figura 6) (PADISÁK, 1997). Sua
crescente predominância nestes locais tem sido relacionada à sua capacidade invasora
(BRIAND, 2004; SUKENIK et al, 2012, ANTUNES et al. 2015). Isto vem sendo atribuído a
sua plasticidade ecofisológica, à existência de diversos ecotipos e aumento da temperatura da
água devido a alterações climáticas globais (PICCINI et al., 2011; BONILLA et al., 2012).
Portanto, este organismo tolera bem mudanças no ambiente aquático, como temperatura, pH,
- 23 -
luminosidade, condutividade e limitação de nutrientes (SUKENIK et al., 2012). O sucesso de
C.raciborskii é relacionado a aspectos fisiológicos como capacidade de fixar nitrogênio, alta
afinidade por amônio e formação de acinetos (PADISÁK, 1997; Sinha et al., 2012, SUKENIK
et al., 2012).
FIGURA 6: Imagem microscópica na objetiva de 100x de duas linhagens de C.raciborskii, CyRF (A) e CyLP
(B).
A concentração de P no ambiente é um fator importante para a dominância de
C.raciborskii. Florações desta espécie ocorrem em ambientes com baixa concentração de P
(PADISAK AND ISTVANOVICS, 1997; BURFORD AND O’DONOHUE, 2006). Segundo
Istvanovics et al. (2000) esta espécie é capaz de captar P com alta afinidade e depois estocar
este P intracelular.
O primeiro relato de Cylindrospermopsis como um gênero tóxico ocorreu em 1979 a
parir da intoxicação de 150 pessoas com sintomas de gastrenterite e dano renal em Palm Island,
na Austrália (CARMICHAEL, 2001). Mais tarde a toxina foi caracterizada como
cilindrospermopsina, (OHTANI et al., 1992). No entanto não são todas as linhagens de
C.raciborskii que produzem esta toxina. Em 1999 Lagos et al. descreveram
linhagens brasileiras capazes de produzir a neurotoxina saxitoxina. Até hoje todas as linhagens
tóxicas desta espécie isoladas no Brasil foram caracterizadas como produtoras de neurotoxinas
do tipo saxitoxina (LAGOS et al.,1999; SU et al., 2004). Isso se torna um problema de saúde
pública uma vez que Cylindorspermopsis está entre os principais gêneros formadores de
florações no Brasil e no mundo (PADISÁK, 1997; BRIAND et al., 2004; SUKENIK et al, 2012;
SOARES et al., 2015, ANTUNES et al. 2015).
A B
- 24 -
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAL:
- Estudar a resposta fisiológica de duas linhagens de Cylindrospermopsis raciborskii à
alteração na disponibilidade de fósforo.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
- Comparar o crescimento de duas linhagens de C.raciborskii em resposta à
disponibilidade de fosfato.
- Identificar as proteínas expressas por algumas linhagens de C.raciborskii em diferentes
condições de cultivo, na presença ou ausência de fosfato.
- Desenvolver um protocolo de extração de proteínas de membrana externa adequado para
a C.raciborskii.
- Avaliar se a produção de toxina é afetada pela disponibilidade de fosfato.
- 25 -
3. METODOLOGIA
3.1 LINHAGENS DE ESTUDO E CONDIÇÕES PADRÃO DE CULTIVO
Inicialmente foram utilizadas seis linhagens de C.raciborskii para testar o protocolo de
extração de proteínas de membrana: NPCS1, CyDB, T3, CyAF, CyRF e CyLP (Banco de
Linhagens do Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias, IBCCF, UFRJ).
Foram usadas duas linhagens para análise de crescimento e expressão diferencial de proteínas:
CyRF (isolada no Reservatório do Funil, Rio de Janeiro) e CyLP (isolada do Lago Paranoá,
Brasília). As cepas foram mantidas em meio de cultura ASM-1 (Tabela 3) pH8,0, sob condições
controladas de luminosidade (50 – 60 µM de fluxo de fótons mˉ²sˉ¹) e temperatura (25±2°C),
sem aeração e com foto período de 12 horas. O pH do meio de crescimento foi determinado
com auxílio de um pHametro.
TABELA 3: Composição do meio de cultivo ASM-1 (concentrações em micromolar)
NaNO3 2000 FeCl3 4
MgSO4 200 H3BO3 40
MgCl2 200 MnCl2 7
CaCl2 200 ZnCl2 3,2
K2HPO4 100 CoCl2 0.08
Na2HPO4 100 CuCl2 0,0008
Na2EDTA 20
3.2 CULTIVOS DAS LINHAGENS COM E SEM FÓSFORO
Antes do início do cultivo, as vidrarias utilizadas foram embebidas com 0,1 M de HCl
durante 24 h e em seguida enxaguadas com água MilliQ para evitar qualquer contaminação com
fósforo externo. As condições de cultivo utilizadas para verificar a expressão diferencial de
proteínas foram meio ASM-1 ou ASM-1 sem fósforo.
- 26 -
Para se obter o inoculo da cultura, partimos de cultivos de estoque das linhagens CyLP e
CyRF mantidos nas condições padrão descritas acima, e um volume foi repicado na proporção
de 1:5 em meio ASM-1. Este cultivo foi mantido até que a densidade celular atingisse um valor
adequado para realizar o inoculo de cultivos com ou sem P como descrito a seguir. Neste
momento, as células foram centrifugadas a 5000 RPM em centrífuga Sorvall rotor GSA a 4oC
por 15 min, o precipitado de células foi lavado com meio ASM-1 estéril sem P e repetiu-se a
centrifugação. Em seguida as células foram ressuspensas em um pequeno volume de meio
ASM-1 estéril sem P e a densidade celular foi calculada como descrito no item no item 3.3.
Então foi feita a diluição apropriada para se iniciar os cultivos com e sem P a partir de um
inoculo contendo aproximadamente 5 x 105 células/mL.
As culturas foram mantidas durante 15 dias, nas condições descritas acima (item 3.1)
em erlenmeyers de 1 L com 500 mL de meio para a linhagem CyRF e erlenmeyers de 500 mL
com 300 mL de meio para a linhagem CyLP. A cada 3 dias foram retiradas amostras da cultura
para a contagem de células por microscopia (1mL), como descrito por Carneiro, 2009 e
resumido abaixo no item 3.3. Neste caso as células foram fixadas com Lugol.
Além disso, foram retiradas amostras para dosagem de saxitoxina da linhagem
produtora de toxina CyRF (300 mL), para a dosagem de proteínas (2 mL) e análise de proteínas
expressas por SDS-PAGE ( 2-10 mL), como descrito a seguir.
3.3 CONTAGEM DE CÉLULAS
A contagem de células foi utilizada para acompanhar o crescimento celular das duas
linhagens com amostragens a cada três dias, estimando-se o número de células/mL. Utilizou-se
as células fixadas em Lugol, microscópio óptico e lâmina de Fuchs-Rosenthal e de acordo com
a necessidade foram feitas diluições das amostras. Inicialmente foi calculada a média do
comprimento das células de cada linhagem a partir da medição de trinta células. Os
comprimentos dos tricomas foram medidos e a soma total do comprimento dos tricomas
mensurados foi dividida pelo comprimento médio de uma célula, resultando no número de
células contadas (CARNEIRO, 2009). Como à medida que a densidade celular aumentava
durante o cultivo os filamentos iam se agregando, o que impossibilitava a contagem correta, foi
- 27 -
preciso desagregá-los. Para isso, foi utilizado um intervalo de cerca de 3 minutos no banho de
ultrassom e alguns instantes no vortex para que os filamentos agrupados fossem soltos.
Para cada condição foi calculada a razão de crescimento, subtraindo-se o valor da
densidade celular no tempo final de cultivo pelo valor da densidade celular do inóculo.
3.4 BIOVOLUME
O cálculo do biovolume foi realizado em amostras do cultivo retiradas a cada 3 dias para
analisar a concentração em mm3. L-1 durante 15 dias de cultivo. A metodologia realizada foi
descrita por H.HILLEBRAND, et al (1999), a qual consiste no seguinte:
(Cálculo do volume do cilindro/célula (fator) Χ o número de célula do cultivo) / 1000.
3.5 DOSAGENS DE PROTEÍNA
Para a dosagem de proteínas foram coletadas amostras do cultivo a cada 3 dias durante
15 dias do cultivo. A partir de 2 mL de cultura as células foram precipitadas por centrifugação
(10000 g por 10 min) o sobrenadante foi descartado e as células foram congeladas a -20oC. Para
dosagem de proteínas as células foram ressupensas em 100 uL de água MilliQ e lisadas por 5
ciclos de congelamento em N2 líquido e descongelamento a 37oC. A concentração de proteínas
nas amostras de lisado total foi obtida segundo a técnica de BRADFORD (1976), adaptada para
microvolumes. Amostras contendo até 4 µg de proteínas, em 20 µg de volume, foram diluídas
em 0,2 mL de reagente Bradford (azul brilhante de Comassie G-250 [Sigma] 0,01%, etanol
4,75%, ácido fosfórico 8,5%). Após um período de 2 a 30 min, as amostras eram analisadas por
espetrometria a 595 nm [Microplate Reader, modelo 450, Bio-Rad], em microplacas de fundo
chato (Nunc, Inter Med, Alemanha).
- 28 -
3.6 EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
As células mantidas em um precipitado congelado foram descongeladas e adicionadas
de em tampão Tris-HCl 10 mM pH 8, MgCl2 10mM. As células foram lisadas com adição de
pérolas de vidro 100µm (SIGMA) e 4 ciclos de 45 segundos cada com intensidade 4,0 no
aparelho FastPrep (MPBio). Em seguida foram eliminados as pérolas de vidro e os restos
celulares por decantação 10 min a temperatura ambiente e se recuperou o sobrenadante.
Para extração de proteínas de membrana o protocolo se baseou em Schnaitman (1971).
Foram feitas etapas de centrifugação de proteínas (50000g, 30 min, 4° C) e lavagens sucessivas
do precipitado em tampão Tris-HCl 10 mM pH 8, MgCl2 10mM com adição de detergentes
(sarcosil 1%; SDS 1%, SDS 2%), e recuperação de proteínas de membrana no último
sobrenadante. A recuperação de proteínas em cada fração foi acompanhada por análise em
SDS-PAGE.Chegou-se ao protocolo descrito a seguir:
As células foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em 1-2 mL de Tris HCl 50
mM, MgCl2 10 mM, lisadas com o auxílio de esferas de vidro em sistema FastPrep (MPBio),
5 ciclos de 45 segundos a 5M/s, com intervalos de 5 minutos no gelo. Após esse processo as
esferas foram decantadas e o sobrenadante recuperado. Este foi centrifugado a 50000 g por 30
minutos a 4º C e o sobrenadante removido. O pellet de proteínas foi ressuspendido em Tris-HCl
50mM, MgCl2 10mM e centrifugado a 50000 g por 30 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi
removido e o pellet de proteína foi ressuspendido em uma solução de SDS 2%. A amostra foi
novamente centrifugada e o sobrenadante recuperado.
3.7 ANÁLISES DE PROTEÍNAS EM SDS-PAGE
Amostras de proteínas foram adicionadas de tampão de aplicação SDS-PAGE, fervidas
10 min, centrifugadas a 10000 g por 10 min e o sobrenadante aplicado em SDS-PAGE 12,5%
com tampão Tris-Glicna-SDS e os géis foram corados com Coomassie Blue G250 (Sambrook,
2001).
- 29 -
3.8 IDENTIFICAÇÕES DE PROTEÍNAS
Depois de corados os géis, as bandas de interesse foram excisadas e seguiu-se protocolo
para tripsinização de proteínas em gel (GOULART, 2005). Os peptídeos gerados foram
analisados por espectrometria de massas no equipamento QTOF Ultima (Waters) da Unidade
de Espectrometria de Massas de Proteínas, Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ. Os
resultados (arquivos .pkl) foram usados para busca em banco de dados NCBI geral com a
ferramenta Mascot (Matrix Science, http://www.matrixscience.com, MS/MS Ions Search)
Nesta ferramenta foram usados os seguintes parâmetros para busca: banco de dados NCBIProt,
taxonomia Bacteria, permitindo 1 falha na digestão por tripsina, oxidação de metionina como
modificação variável, erro de massa de peptídeos de 1,0 Da, erro de massa do íon fragmento de
MS/MS de 1,0 Da, carga do peptídeo precursor +1 +2 +3, valores de massa monoisotópicos.
Para validação dos hits de proteínas recuperados foram usados os seguintes critérios:
proteína identificada em C.raciborskii ou Raphidiopsis borskii (espécie evolutivamente mais
próxima), massa molecular compatível com a banda retirada do gel, função compatível com a
condição de cultivo (+ ou – P), presença de peptídeos únicos.
3.9 EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE SAXITOXINAS
Um volume de 300 mL das culturas amostradas no 21º dias foi mantido a -20 ºC até que
fossem usados para a extração de toxinas. O material foi liofilizado para a análise da fração
extracelular e intracelular. A extração de saxitoxinas foi feita no máximo 24 h antes das análises
das toxinas por HPLC (“Hight Perfomace Liquid Chromatography” - Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência).
Para a extração de saxitoxinas, foram adicionados 3 mL de ácido acético 500 mM sobre
o material liofilizado. Essas amostras ficaram sob agitação por 2 h, em agitador de bancada.
Posteriormente, foram centrifugadas durante 30 min a 1000 g. O sobrenadante foi filtrado em
filtros de nylon (0,45 µm- 13 mm diâmetro- Millipore). As amostras foram analisadas para a
quantificação de saxitoxina de acordo com metodologia de Oshima (1995). As toxinas foram
quantificadas pela comparação com o tempo de retenção e área integrada geradas por padrões.
Os padrões foram adquiridos do “Institute of Marine Bioscience, National Research Council of
Canada” (Halifax, Canadá).
- 30 -
3.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os resultados do crescimento celular, dosagem de proteína e biovolume foram expressas
como médias ± desvio padrão. Para testar a normalidade de distribuição dos dados, foi utilizado
o programa Sigmaplot 12,5. Quando os dados eram caracterizados como normais, foi realizada
a análise pelo teste One Way Repeated Measures (ANOVA) para comparar as condições
controle x tratamento.
- 31 -
4. RESULTADOS
4.1- CRESCIMENTO
4.1.1- Contagem de Células
No caso da linhagem CyRF (Figura 7) foi observado que até o 12o dia de cultivo o
crescimento foi semelhante nas duas condições e após este período a linhagem apresentou
menor crescimento em ausência de P. Após 15 dias de cultivo foi calculada uma razão de
crescimento de 13,6 na condição controle (+P) e de 9,4 na condição de tratamento (-P). Isso
mostra que na condição de limitação de fosfato a linhagem continuou crescendo, porém com
uma queda na taxa de divisão celular se comparado ao controle. Houve uma diferença
estatisticamente significativa (P <0, 001) entre o crescimento nas duas condições durante o
período analisado.
FIGURA 7: Curva de crescimento da linhagem CyRF e ao longo de 15 dias, em condição controle (+P) e
tratamento (-P). As barras de erro indicam o desvio padrão das réplicas analisadas.
0.00E+00
5.00E+05
1.00E+06
1.50E+06
2.00E+06
2.50E+06
3.00E+06
3.50E+06
4.00E+06
4.50E+06
0 3 6 9 12 15
Dias
Nú
mero
de c
élu
las (
cels
.mL
-1)
CyRF +P
CyRF -P
- 32 -
Para a linhagem CyLP foi observado que o crescimento nas duas condições foi diferente
a pós o 6o dia. Praticamente não houve crescimento na condição -P ao longo de 15 dias (Figura
8). Após esse período de cultivo, a razão de crescimento calculada foi de 8,9 na condição
controle (+P) e de 1,4 na condição de tratamento (-P). Houve uma diferença estatisticamente
significativa (P <0, 001) entre o crescimento nas duas condições durante o período analisado.
FIGURA 8: Curva de crescimento da linhagem CyLP ao longo de 15 dias, em condição controle (+P) e tratamento
(-P). As barras de erro indicam o desvio padrão das triplicatas analisadas.
A ausência de P pode alterar não só a taxa de divisão celular como também outros
aspectos fisiológicos e morfológicos. Por exemplo, poderia afetar as dimensões das células e
seu volume. Para investigar isso decidiu-se avaliar se as células estariam mudando em termos
de volume nas condições testadas.
4.1.2- Biovolume
A medida do biovolume dá uma ideia de alterações nas dimensões das células, que
poderiam ser um tipo de resposta a presença ou ausência de P. Como anteriormente só
avaliamos o crescimento pelo número de células, esse dado não informava se, por exemplo,
haveria um número maior de células, porém menores. Para uma análise mais específica de
crescimento das linhagens estudadas foi realizado o cálculo do biovolume (mm3. L-1).
0.00E+00
5.00E+06
1.00E+07
1.50E+07
2.00E+07
2.50E+07
3.00E+07
3.50E+07
4.00E+07
0 3 6 9 12 15
Dias
Nú
mero
de C
élu
las (
cels
.mL
-1)
CyLP +P
CyLP -P
- 33 -
Os valores médios do volume das células em cada tempo são mostrados na figura 9.
Pode-se notar já a partir dos valores dos inóculos que os volumes celulares das duas linhagens
são bem diferentes. No caso da linhagem CyRF, o volume celular mudou entre o início e o
final do cultivo e isso ocorreu de forma diferente na presença ou ausência de P. Na presença
de P o volume aumentou enquanto na ausência de P diminuiu. Já no caso da linhagem CyLP,
embora os volumes também tenham mudado ao longo do cultivo, não foi visto um padrão de
menor ou maior volume de acordo com a condição de cultivo.
FIGURA 9: Valores médios do volume das células das linhagens CyRF e CyLP cultivadas por 15 dias em meio
ASM-1 completo ou sem fosfato.
Esses valores de volume celular foram usados para gerar gráficos de biovolume ao
longo do período de cultivo. No caso da linhagem CyRF (Figura 10) foi possível observar um
crescimento semelhante nas duas condições testadas até o nono dia porém a partir do tempo
12 ocorreu um aumento do biovolume na condição controle (+P) quando comparada com a de
tratamento (-P). Com isso a razão de crescimento calculada a partir do biovolume (mm3. L-1)
na condição controle (+P) foi de 15 enquanto na condição de tratamento (-P) foi de 7,3. Houve
uma diferença estatisticamente significativa (P <0, 001) entre o crescimento do biovolume nas
duas condições durante o período analisado. Comparando o crescimento por biovolume com o
0
10
20
30
40
50
60
0 3 6 9 12 15
Vo
lum
e d
a c
élu
la (
µm
3)
Dias
CyRF +P
CyRF -P
CyLP +P
CyLP -P
- 34 -
crescimento por densidade celular (Figura 7), percebemos uma resposta de adaptação à
limitação de fosfato semelhante nos dois casos, mas com a medida do biovolume a diferença
entre controle e tratamento fica mais evidente.
FIGURA 10: Crescimento por biovolume da linhagem CyRF ao longo de 15 dias, em condição controle (+P) e
tratamento (-P). As barras de erro indicam o desvio padrão das réplicas analisadas.
No caso da linhagem CyLP, foi observado o mesmo padrão das curvas de crescimento a
partir de densidade celular e biovolume (Figuras 8 E 11). Sendo a razão de crescimento
calculada a partir do biovolume (mm3. L-1) na condição controle (+P) foi de 9,3 enquanto na
condição de tratamento (-P) foi de 3,8. Isso era esperado já que não houve tanta mudança nos
valores de volume celular nesta linhagem, diferente da CyRF (Figura 9). Houve uma diferença
estatisticamente significativa (P <0, 001) entre o crescimento por biovolume nas duas
condições durante o período analisado.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 3 6 9 12 15
Bio
vo
lum
e (
mm
³/L
)
Dias
CyRF +P
CyRF -P
- 35 -
FIGURA 11: Crescimento por biovolume da linhagem CyLP ao longo de 15 dias, em condição controle (+P) e
tratamento (-P). As barras de erro indicam o desvio padrão das réplicas analisadas.
4.1.3- Dosagem de proteína
Para a linhagem CyRF houve um aumento no conteúdo de proteínas até o 9o dia de
cultivo na condição +P. Este resultado mostra que houve síntese protéica e está de acordo com
os dados de crescimento que mostraram que condição controle (+P) a linhagem continuou
crescendo continuamente (Figuras 7 e 10). Já no tratamento -P não houve acúmulo de proteínas
até o 15o dia o que indica que o metabolismo das células estava reduzido nesta condição de
acordo com seu crescimento mais limitado. Houve uma diferença estatisticamente significativa
(P <0, 001) entre a síntese proteica nas duas condições durante o período analisado.
0
100
200
300
400
500
600
700
0 3 6 9 12 15
Dias
Bio
vo
lum
e (
mm
³/L
)
CyLP +P
CyLP -P
- 36 -
FIGURA 12: Dosagem de proteína da linhagem CyRF ao longo de 15 dias, em condição controle (+P) e
tratamento (-P). As barras de erro indicam o desvio padrão das réplicas analisadas.
Os resultados de dosagem de proteínas totais da linhagem CyLP (Figura 13) mostram
que na condição de presença de P, houve acúmulo de proteínas até o 12o dia de cultivo. As
curvas de crescimento mostraram que a divisão celular foi mais intensa até o dia 15, o que
indica que a intensa síntese proteica sustentou este crescimento. Na limitação de fósforo, não
houve acúmulo de proteínas, indicando que ocorreu uma queda no metabolismo na linhagem
quando comparada com a condição controle do cultivo ao longo do período analisado e de
acordo com seu reduzido crescimento. Houve uma diferença estatisticamente significativa (P
<0, 001) entre a síntese proteica nas duas condições durante o período analisado.
- 37 -
FIGURA 13: Dosagem de proteína da linhagem CyLP ao longo de 15 dias, em condição controle (+P) e
tratamento (-P). As barras de erro indicam o desvio padrão das réplicas analisadas.
4.2 ANÁLISE DE SAXITOXINA TOTAL
Para a linhagem tóxica CyRF foi quantificada a concentração de saxitoxina total (intra e
extracelular). Foi calculada uma concentração de toxina de 1,27 ng/106 células na condição
controle (+P) e 0,01 ng/106 células na condição de tratamento (-P).
4.3 EXTRAÇÕES DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
Como descrito na metodologia, foram testadas diversos detergentes e várias etapas
de centrifugação para eluição das proteínas de membrana. Afinal, foi estabelecido um
protocolo de extração de proteínas de membrana
Através da realização desse protocolo, extratos de proteínas de membrana de 6 linhagens
de C.raciborskii cultivadas por 15 dias em condições controle foram analisadas em SDS-PAGE
12,5 % (Figura 14). Nestes géis pode-se ver que o protocolo resultou em frações com poucas
bandas de proteína, majoritariamente entre 49 e 85 kDa.
- 38 -
FIGURA 14 - Padrões representativos das frações de proteínas obtidas com o protocolo de extração
de proteínas de membrana e analisadas em SDS-PAGE 12,5%. Nesta análise foram incluídas 6
linhagens de C.raciborskii: 1,2 CyRF; 3 CyLP; 4 NPCS1; 5,6 CyDB; 7,8 T3; 9 CyAF. Numeração das
bandas de acordo com a tabela 4. À esquerda padrão de peso molecular.
A estrutura do envoltório de cianobactérias é do tipo Gram negativa com duas
membranas, a citoplasmática e a externa. Na fração de membrana externa, cerca de 50% da
massa consiste de proteínas, dentre as quais as porinas que são expressas em altos níveis.
Porinas formam poros que permitem a passagem por difusão de pequenos solutos ou contém
sítios de ligação específicos para certos solutos, Assim possibilitam o transporte de solutos do
meio externo para o periplasma. (KOEBNIK et al., 2000). Portanto era de se esperar que nestas
frações de membrana obtidas encontrássemos porinas, devido à sua abundância e sua faixa de
massa molecular.
Duas bandas dos géis de fração de membrana foram extraídas e processadas para
identificação por MS. Uma delas foi identificada como uma proteína hipotética
[WP_061546537.1 GI:1004659499] de C.raciborskii. A proteína identificada tem massa
estimada de 57781 Da, o que é compatível com a banda marcada no gel (FIGURA 14). Para
obter mais informações sobre esta proteína foi realizada um busca por proteínas similares
usando a ferramenta blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) no banco de dados geral.
Recuperamos cerca de 80 proteínas com alto grau de identidade (identidade > 52%, e value=0)
descritas como proteínas de membarna, porina de carboidratos, proteína S-layer, cianoporina
etc, em divresas espécies de cianobactérias. Também buscamos por domínios conservados no
banco PFAM (http://pfam.xfam.org) e encontramos dois domínios conservados: S-layer e OprB
(Figura 15).
*1 *2
- 39 -
FIGURA 15 – Domínios conservados encontrados na proteína hipotética de C.raciborskii WP_061546537. 1 de
acordo com o banco de dados PFAM.
A outra banda identificada a partir do gel da figura 14 também foi uma proteína hipotética
de C.raciborskii [WP_061546280.1 GI:1004659242]. A proteína identificada tem massa
estimada de 55752 Da, o que é compatível com a banda marcada no gel. Para obter mais
informações sobre esta proteína foi realizada um busca por proteínas similares usando a
ferramenta blastP no banco de dados geral. Da mesma forma que no caso anterior, recuperamos
dezenas de proteínas descritas como proteínas de membrana, porina de carboidratos,
cianoporina etc, com alto grau de identidade em diversas espécies de cianobactérias. A própria
busca se similaridade revelou domínios conservados assim como no caso anterior: S-layer e
OprB. Detalhes da identificação destas proteínas estão mostrados na tabela 4.
TABELA 4: Lista de proteínas identificadas a partir de frações de membrana nas linhagens de
C.raciborskii CyLP e CyRF
ACESSO DESCRIÇÃO ORGANISMO
Nº
PEPTÍDEOS
IDENT.
(ÚNICOS)
MASSA
MOL.
KDA
LINHAGEM
EXPRESSA
NUM.
BANDA
GEL
WP_061546537.
1
GI: 1004659499
HIPOTÉTICA C.
RACIBORSKI
3 (3) 57781 CyRF
1
WP_061546280.
1
GI: 1004659242
HIPOTÉTICA C.
RACIBORSKI
3 (3) 55752 CyLP
2
- 40 -
Uma possibilidade é que as duas proteínas identificadas se tratassem da mesma proteína
anotada com códigos diferentes. Para verificar isso fizemos um alinhamento entre essas duas
proteínas (Figura 16). Podemos notar que as proteínas compartilham uma parte de suas
sequências, o que está de acordo com a identificação dos mesmos domínios e possíveis funções
para elas, embora sejam diferentes.
FIGURA 16 – Alinhamento das duas proteínas identificadas a partir de frações de membrana nas
linhagens de C.raciborskii CyLP e CyRF.
- 41 -
Portanto, as duas proteínas identificadas foram de fato de membrana,
especificamente de membrana externa, o que está de acordo com o protocolo usado que
visava recuperar proteínas desta fração celular. A descrição de sua função pode ser
encontrada item abaixo.
4.4- EXPRESSÕES DE PROTEÍNAS NA PRESENÇA E AUSÊNCIA DE FOSFATO
A partir dessa etapa passamos a trabalhar com 2 linhagens, testando diferentes
condições de cultivo. Durante 15 dias as linhagens CyRF e CyLP foram cultivadas em
presença ou ausência de fosfato e em alguns tempos amostras selecionados e as amostras do
seu lisado total (Figura 17 E Figura 18) e da sua fração de proteínas de membrana (Figura 14)
analisadas através de SDS- PAGE 12,5 %. Como mostrado nos géis a seguir foram
identificadas proteínas diferencialmente expressas.
Na figura 17 estão representadas proteínas de lisados totais da linhagem CyRF obtidas
nos dias 3, 6 e 15 de cultivo com e sem fosfato. Foi identificada uma proteína (número 3 no
gel) mais expressa na presença de fosfato, visivelmente a partir do dia 6. Também foram
observadas duas proteínas (números 4 e 5 no gel) mais expressas na ausência de fosfato. Uma
delas (número 4) já visivelmente mais expressa a partir do dia 6 e a outra (número 5)
visivelmente mais expressa a partir do dia 15. Em geral, todas essas diferenças de expressão
ficaram mais evidentes no tempo de 15 dias.
- 42 -
FIGURA 17- Padrões representativos das frações de proteínas de lisados totais obtidos a partir do cultivo da
linhagem CyRF em condição de alto e baixo fosfato: PM, padrão de peso molecular em kDa; 1- CyRF +P,
TEMPO 6; 2 – CyRF –P, TEMPO 6; 3- CyRF +P, TEMPO 13; 4- CyRF -P, TEMPO 13; 5- CyRF +P, TEMPO
15; 6- CyRF -P, TEMPO 15 dias. Foram marcadas as proteínas diferencialmente expressas. Numeração
das bandas de acordo com a tabela 4.
Na figura 18 estão representadas proteínas de lisados totais da linhagem CyLP obtidas
nos dias 3, 6 e 15 de cultivo com e sem fosfato. Foi identificada uma proteína (número 6 no
gel) mais expressa na presença de fosfato, visivelmente a partir do dia 13, além de uma proteína
(número 7 no gel) mais expressas na ausência de fosfato, a partir do dia 13. De acordo com a
massa molecular destas proteínas, suas condições de expressão (presença ou ausência de
fosfato) e tempo de aparecimento (13 dias) elas poderiam corresponder às mesmas proteínas
identificadas na linhagem CyRF.
DIAS 6 13 15
+P -P +P -P +P -P
PM 1 2 3 4 5 6
225
150
100
75
50
35
25
- 43 -
FIGURA 18- Padrões representativos das frações de proteínas de lisados totais obtidos a partir do cultivo da
linhagem CyLP em condição de alto e baixo fosfato: 1- PM, padrão de peso molecular em KDa; 2- CyLP
+P, TEMPO 6; 3 – CyLP –P, TEMPO 6; 4- CyLP +P, TEMPO 13; 5- CyLP -P, TEMPO 13; 6- CyLP +P, TEMPO
15;7- CyLP -P, TEMPO 15 dias Foram marcadas as proteínas que foram diferencialmente expressas.
Numeração das bandas de acordo com a tabela 4.
As bandas que tiveram alguma variação na expressão entre as condições +P e -P foram
retiradas e processadas para digestão e análise de peptídeos por espectrometria de massas (MS).
As identificações estão listadas na tabela 5. Foram identificadas proteínas de C.raciborskii em
todos os casos, exceto em um em que a proteína recuperada foi da espécie evolutivamente mais
próxima, Raphidiopsis borkii.
A proteína hipotética WP_061546280. 1 é a mesma já identificada a partir das frações de
membrana (tabela 4, figura 14). Possui um domínio S layer e um domínio OprB conservado de
porina transportadora de carboidratos.
Diversas proteínas foram identificadas como mais expressas na ausência de fosfato sendo
elas descritas a seguir:
DIAS 6 13 15
+P -P +P -P +P -P
PM 1 2 3 4 5 6
225
150
100
75
50
35
25
- 44 -
O transportador de fosfato do tipo ABC PstS (WP_061546391.1). PstS é um
componente de um complexo protéico composto pelas proteínas pstSACB que funciona
como um transportador do tipo ABC. Transportadores ABC pertencem a uma grande
superfamília de proteínas presentes em todos os tipos de organismos. Em bactérias, têm
como função translocar (importar e exportar) entre o periplasma e o citoplasma solutos
como ions ou peptídeos. São formados por proteínas transmembrana (neste caso PstA e
PstC) e uma ou mais proteínas ligam e hidrolisam ATP, o que fornece energia para o
transporte através da membrana (neste caso PstB). PstS é o componente que se liga ao
substrato e está envolvido na importação de fosfato e acumula-se em condições de
limitação de P (DAVIDSON et al, 2008).
A proteína SphX (WP_006276651. Esta proteína pertence a uma família de proteínas
ligadoras de fosfato que contém um domínio de ligação periplasmático e são induzidas
em resposta à limitação de P (MANN et al., 2012).
O transportador de biopolimero ExbB (WP_061544865). Pertence a uma família de
proteínas de membrana envolvidas com o transporte dependente de TonB.
Transportadores dependentes de TonB são proteínas de membrana externa que
transportam sideróforos (quelantes de ferro) vitaminas, carboidratos etc. O transporte
requer energia que é gerada a partir do gradiente de prótons da membrana
citoplasmática. Uma vez que o transportador está situado na membrana externa e a fonte
de energia está na membrana citoplasmática, existe um conjunto de proteínas que
transfere a energia para o transporte, TonB-ExbB-ExbD (NOINAJ et al., 2010) .
Transportador de bacitracina (WP_006275870). Bacitracina é um termo que se refere a
um conjunto de polipeptídeos com ação antibiótica. A resistência a esses compostos é
mediada por um sistema de transporte de bacitracina que é do tipo ABC. Neste sistema
a bacitracina seria eliminada da célula por efluxo através deste transporte (MANSON
et al., 2004). Na proteína identificada foi apontado um domínio de ligação a ATP comum
à proteína NrtD, esta última envolvida no transporte de nitrato. Transportadores ABC
são uma grande família de proteínas envolvida com o transporte de diversos compostos
como açúcares, íons, peptídeos e moléculas orgânicas mais complexas, como já descrito
acima.
- 45 -
A proteína de estresse universal UspA (WP_061546917), é uma pequena proteína
citoplasmática que é expressa quando a célula se encontra em uma situação de estresse.
Usp aumenta a taxa de sobrevivência durante exposição prolongada a condições de
estresse em geral é induzida em condições em que o crescimento é reduzido (LIU et al.,
2007)
A proteína de vesículas de gás GvpC (WP_061547067). Esta proteína é um componente
das vesículas de gás. Estas vesículas são tubos ocos e cilíndricos cobertos por
extremidades cônicas. Estão presentes no citoplasma e permitem o posicionamento da
bactéria na profundidade apropriada para crescimento e fotossíntese. Dois tipos de
proteína compõem esta estrutura, GvpA e GvpC. GvpC é minoritária e se localiza
externamente na superfície (OLIVER, 1994).
Outras proteínas foram menos expressas na ausência de fosfato sendo elas as seguintes:
Proteína hipotética (WP_061546280.1). Possui um domínio S-Layer e um domínio
OprB. A família OprB de porinas de carboidratos possui canais seletivos para diferentes
açúcares. Essas proteínas possibilitam o transporte e aquisição de monossacarídeos
como por exemplo a glicose através da membrana externa (VAN DEN BERG, B, 2012).
Em Gram- negativas, cada monômero de porina possui 30-40 kDa, mas em
cianobactérias podem alcançar 70k Da, pois possuem um domínio extra, SLH (surface
layer homodomain) (NIKAIDO, 2003). S-layer é uma camada de superfície da bactéria
formada por conjuntos de glicoproteínas. Muitas proteínas desta camada ou de outras
do envoltório celular contém uma ou mais cópias de um domínio de 50 a 60 resíduos de
aminoácidos, o domínio SLH que ancora a proteína a polímeros da parede celular
(SÁRA AND SLEYTR, 2000).
Proteína hipotética (WP_061546537.1), possui os mesmos domínios Slayer e OprB da
proteína descrita acima (WP_061546280.1), porém com 40 % de identidade segundo o
programa blastp.
- 46 -
Proteína small mechanosensitive channel, MscS (WP_009343507). Esta proteína faz
parte de um sistema de efluxo de solutos regulado pelo turgor da célula que protege a
bactéria da lise por choque osmótico. Se localiza na membrana citoplasmática e é
considerada uma válvula de segurança que regula a osmolaridade da célula em relação
ao meio. A proteína MscS é suficiente para formar um canal funcional que responde a
tensão da camada lipídica. (BOOTH et al., 2007).
TABELA 5: Lista de proteínas identificadas a partir de lisados nas linhagens de C.raciborskii CyLP e
CyRF.
ACESSO DESCRIÇÃO ORGANISMO
Nº
PEPTÍDEOS
IDENT.
(ÚNICOS)
MASSA
MOL.
KDA
CONDIÇÃO
EXPRESSA
NUM.
BAND
A GEL
WP_061546280.1
GI:1004659242
HIPOTÉTICA
C. raciborski
55752
11 (3) CyRF
↑+P↓-P
3 (=6)
18(18) CyLP
↑+P↓-P
6 (=3)
WP_061547067.1
GI:1004660244
GAS VESICLE
PROTEIN GVPC
C. raciborski 24953 10 (10) CyLP
↑-P↓+P
5
WP_006276651.1
GI:493319315
PROTEIN sphX
C. raciborski
38533
2(0) CyLP
↑-P ↓+P
7
2(0) CyRF
↑-P ↓+P
4 (=7)
WP_061544865.1
GI: 1004657337
BIOPOLYMER
TRANSPORTER
EXBB
C. raciborski 26726 3(1) CyLP
↑-P ↓+P
8
WP_006275870.1
GI|493318519
BACITRACIN
ABC
TRANSPORTER
ATP-BINDING
PROTEIN
C. raciborski 30675 1(1)
CyLP
↑-P ↓+P
8
WP_061546917.1
GI|1004659974
UNIVERSAL
STRESS
PROTEIN USPA
C. raciborski 30317 2(0)
CyLP
↑-P ↓+P
8
WP_061546537.1 HIPOTÉTICA
C. raciborski 57876 3(1)
CyLP
↑+P ↓ -P
6
WP_009343507.1
MECHANOSENS
ITIVE ION
CHANNEL
PROTEIN
Raphidiopsis
brookii
57805
6(1) CyLP
↑+P ↓ -P
6 (=3)
6(1) CyRF
↑+P ↓ -P
3 (=6)
WP_061546391.1
PHOSPHATE
ABC
TRANSPORTER
SUBSTRATE-
BINDING
PROTEIN PSTS
C. raciborski
37175
4(1)
CyLP
↑-P ↓+P
7 (=4)
4(1)
CyRF
↑-P ↓+P
4 (=7)
- 47 -
Também buscamos por proteínas diferencialmente expressas na presença ou ausência de
fosfato em frações de proteínas de membrana, como mostrado na figura 19. Neste caso as
proteínas identificadas (números 9 e 10 no gel) foram às mesmas identificadas a partir do gel
da figura14, já listadas na tabela 4. Isso faz sentido, pois em ambos os casos as proteínas
selecionadas foram mais expressas na presença de fosfato, o que corresponde à condição
controle de cultivo, a que está na fração de membrana da figura 19.
FIGURA 19- Padrões representativos das frações de proteínas de membrana obtidas de duas
linhagens CyLP e CyRF cultivadas em e analisadas em SDS-PAGE 12,5%. Foram marcadas as
proteínas que foram diferencialmente expressas. Numeração das bandas de acordo com a tabela 6.
9 10
- 48 -
5. DISCUSSÃO
Entre os fatores considerados como responsáveis pela dominância de C.raciborskii sua
ampla distribuição em diversos ambientes estão à capacidade de estocar fósforo e de captá-lo
com alta afinidade (ISVÁNOVICS et al., 2000). Também se considera a diversidade fisiológica
entre linhagens de uma população como uma estratégia ecológica importante nesta espécie
(BRIAND et al., 2004; CHONUDOMKUL et al., 2004; PICCINI et al., 2011).
Considerando estes fatos o objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta à limitação de
fosfato em duas linhagens de C.raciborskii, examinando diversos parâmetros de crescimento e
fisiológicos.
Quanto ao crescimento, foi observado que as duas linhagens cresceram menos em
ausência de P, mas com respostas diferentes. A linhagem CyRF sofreu menor redução de
crescimento do que a linhagem CyLP. No caso de CyRF até o dia 12o dia de cultivo o
crescimento foi semelhante nas duas condições, já no caso de CyLP esta diferença já apareceu
no 9o dia e praticamente o número de células não mudou ao longo do tempo em meio sem P.
Esses dados indicam que CyRF poderia resistir melhor do que CyLP à limitação de P. Porém
esta diferença entre as linhagens não se refletiu no conteúdo de proteínas que não aumentou em
meio sem P para nenhuma delas, indicando a diminuição do metabolismo geral em ausência de
P.
Piccini et al., (2011) analisaram duas linhagens de C.raciborskii produtoras de saxitoxinas
isoladas de corpos d'água do Uruguai sob vários aspectos, morfológicos genéticos e
fisiológicos. Em ensaios em que as linhagens foram cultivadas em limitação de P, se mostraram
bem diferentes quanto às taxas de crescimento. Foram testadas as concentrações de 1, 2 e 5 µM
de fosfato, mas não foi testado o crescimento na ausência de P. De forma similar aos nossos
resultados as linhagens tiveram respostas diferentes à limitação de P. Uma das linhagens
mostrou uma clara dependência da concentração de P, aumentando a taxa de crescimento com
o aumento de P. Já para a outra linhagem isso não ocorreu e embora sua taxa de crescimento
fosse menor em 5µM de P, passou a ser maior em 1µM de P. Foi sugerido que esta diferença
fisiológica entre as duas linhagens poderia refletir o ambiente do qual cada uma foi isolada que
apresentavam diferentes concentrações de P. Em conjunto com suas características genéticas e
- 49 -
morfológicas os resultados indicaram que as duas linhagens seriam diferentes ecotipos.
Diferentes adaptações a níveis maiores ou menores de P entre vários ecotipos poderiam permitir
a C.raciborskii ocupar ambientes com estados tróficos diversos. No nosso caso seria
interessante expandir o estudo para um número maior de linhagens, se possível registrando as
concentrações de P dos seus ambientes de isolamento.
No estudo de Wu et al., 2012, foi avaliada a aclimatação de uma linhagem não tóxica de
C.raciborskii a diversas concentrações de P inorgânico. O experimento foi feito de forma
diferente. As células foram inicialmente incubadas em meio sem P por 8 a 10 dias para remover
os estoques intracelulares de P. Em seguida foram inoculadas em meio contendo as seguintes
concentrações de P inorgânico: 0, 0,02, 0,05, 0, 50 e 1.00 mg/L e cultivadas por 16 dias. As
taxas de crescimento foram reduzidas de acordo com o decréscimo da concentração de P no
meio, assim como a atividade fotossintética. A partir do 2o dia houve ativação da fosfatase
alcalina nas concentrações de P menores que 0,50 mg/L. Também nessas concentrações mais
baixas de P houve ativação da enzima antioxidante catalase e aumento dos níveis de
malodialdeído, um produto da peroxidação de lipídeos, revelando uma resposta de estresse
quando a cultura é mantida em limitação de P. Estas respostas indicam que C.raciborskii é capaz
de regular seu metabolismo para aclimatar-se a ambientes com baixa concentração de P.
A resposta fisiológica de C.raciborskii a diferentes compostos orgânicos como fonte de
fósforo foi investigada por Bai et al., 2014. Diversas fontes de fósforo foram adicionadas a
diferentes cultivos, incluindo K2HPO4, assim como no nosso caso. Como controle as células
foram mantidas em meio sem fósforo. Os cultivos foram mantidos por 16 dias. A partir do 12º
dia de cultivo o crescimento das células em K2HPO4 se diferenciou do sem P. A taxa de
crescimento de células com esta fonte de P foi 3 vezes maior do que sem P. A atividade de
fosfatase alcalina extracelular aumentou no meio livre de P ao longo do cultivo e está ativação
já foi medida a partir do 2º dia sem P. No cultivo com K2HPO4 na atividade desta enzima só foi
ativada em tempos bem tardios. Em paralelo foi medida a expressão do gene phoA, que codifica
a fosfatase alcalina e também se observou já a partir do 2º dia de cultivo sem P a sua expressão
induzida. Os resultados mostraram que C.raciborskii é capaz de usar diferentes fontes de fosfato
orgânico quando em limitação de P. Isso reforça a flexibilidade adaptativa da resposta a este
nutriente.
- 50 -
O único estudo que mostrou um resultado diferente quanto ao crescimento sob limitação
de P foi o de Willis et al., 2015. Este grupo comparou 3 linhagens de C.raciborskii, sendo 2
delas produtoras de cilindrospermopsina. Foram investigados diversos aspectos como
morfologia, produção de heterocitos em crescimento em diferentes concentrações de N e P.
Curiosamente a taxa de crescimento exponencial foi reduzida à medida que a concentração de
P aumentava (de 0 a 200 µM). Isso foi interpretado como uma estratégia de favorecer mais a
estocagem de P e menos o crescimento, o que seria importante para a adaptação a ambientes
com flutuações na concentração de P. Ainda assim, ao longo de 30 dias as linhagens mantiveram
algum crescimento mesmo nas menores concentrações de P.
Assim como nos estudos citados, seria interessante aprofundar a caracterização da
resposta de linhagens à limitação de P incluindo a atividade de fosfatase alcalina.
De acordo com nossos resultados, a produção de saxitoxina parece ter sido abolida após
21 dias de cultivo da linhagem CyRF na ausência de P. Analisando os resultados de dosagem
de proteínas totais da linhagem (FIGURA 12), é possível sugerir que a parada na produção de
saxitoxina pode estar relacionada com a tendência de queda da síntese de proteica na condição
controle (- P), já que a produção de toxina não é um fator de sobrevivência para linhagem
estudada.
A influência de fatores ambientais como nitrogênio, temperatura e fósforo sobre a síntese
da toxina já foi testada (BOOPATHI et al, 2014). No estudo que caracterizou os genes que
codificam as enzimas de produção de saxitoxina em cianobactéria, foram identificados genes
com possíveis funções regulatórias (KELLMANN et al., 2008). Foram eles stxY e stxZ,
relacionados a PhoU e OmpR. PhoU é um regulador da aquisição de fosfato e o fator
transcricional OmpR está envolvido na regulação em resposta a nitrogênio e osmolaridade. Por
isso foi sugerido que a produção de saxitoxina em C.raciborskii pudesse ser regulada no nível
da transcrição em resposta à concentração de fosfato.
Diversos fatores foram testados quanto a seu efeito sobre a produção de saxitoxina em
Aphanizomenon sp. (DIAS et al., 2002). Foi relatado que as concentrações de toxina e sua
composição foram afetadas por densidade celular, fase de crescimento, temperatura,
disponibilidade de nitrogênio e fósforo. A cota celular da toxina aumentou no final da fase
- 51 -
exponencial de crescimento. Uma concentração alta de toxina foi dosada na fração extracelular
e aumentou conforme o tempo de cultivo. Sob limitação de nitrogênio e aumento de temperatura
houve aumento da cota celular de STX. Já sob limitação de fosfato, a cota celular de toxina
diminuiu na fase estacionária e também houve mudança na proporção das variantes. Em meio
rico em P, GTX5 e neo GTX foram mais abundantes e sob limitação de P, STX e dcSTX
aumentaram em fases tardias do crescimento.
No nosso caso também será necessário repetir a dosagem de saxitoxina partindo de um
número de células maior, pois a quantificação ficou abaixo do nível de detecção e um dos
motivos pode ter sido o número de células insuficiente. Outra possibilidade é que de fato a
linhagem tenha diminuído o conteúdo de saxitoxina no meio sem P. Teria sido interessante testar
a concentração de toxina em tempos anteriores (6 ou 10 dias) para perceber o possível
decréscimo gradual na concentração da toxina. Também seria interessante dosar a toxina
separadamente no meio extracelular e na fração celular. Ainda seria importante aprofundar se
há alteração nos níveis das diversas variantes da toxina produzida pelas células nas condições
testadas.
Neste trabalho visamos caracterizar também em termos de proteínas expressas as
diferenças entre o cultivo na presença ou ausência de P. O objetivo era identificar proteínas e
assim funções do metabolismo envolvidas coma resposta adaptativa a baixos níveis de P.
Inicialmente, planejamos analisar as frações de membrana. Isso porque a célula bacteriana
responde em grande medida a alterações ambientais mudando o padrão de proteínas de
superfície, que estão em contato mais direto com o ambiente. Outra razão foi que ao separar
proteínas de membrana ficariam mais evidentes as envolvidas com transporte, por exemplo
porinas, que são muito abundantes na membrana externa. Além disso, nas frações de membrana
a complexidade de proteínas é bem menor do que nos lisados celulares totais e assim seria mais
fácil comparar os padrões de proteínas em gel a partir das frações de membrana.
Para obter estas frações, nós adaptamos um protocolo descrito para Escherichia coli, que
inclui tratamento com detergente para eluição de proteínas do envoltório (Schnaitman et al.,
1971). No caso de cianobactérias, existem protocolos bem mais elaborados na literatura para
obtenção de frações purificadas de cada tipo de membrana: externa, citoplasmática e tilacóides.
Porém, estes protocolos se baseiam na ultracentrifugação em gradientes de densidade seguida
de etapas de separação de fases e controles para verificar se não há mistura das frações de
- 52 -
membrana recuperadas (OMATA et al., 2004). Este tipo de procedimento não está estabelecido
no nosso laboratório e por limitação de tempo optamos por um mais simples que enriquecesse
a fração em proteínas de membrana. De fato, recuperamos proteínas de membrana dos géis
obtidos com estas preparações. No entanto, os padrões de proteínas nos géis continham uma
diversidade muito pequena de bandas. E, comparando com os padrões de lisados totais
percebemos que nos lisados seria possível identificar maior variedade de proteínas.
A partir dos lisados celulares, análise da expressão de proteínas diferencialmente
expressas em alto e baixo P revelou algumas proteínas menos expressas sob limitação do
nutriente e outras mais expressas. Essas mudanças foram observadas nos géis de proteínas a
partir do 6º dia de cultivo, e foram ficando mais evidentes com o passar do tempo até o 15º dia
de cultivo. Isso indicou que já a partir do sexto dia as linhagens foram capazes de responder à
limitação de fosfato e possivelmente essa resposta foi que possibilitou o seu crescimento,
mesmo que reduzido, até o final do cultivo. Muitas proteínas estavam presentes nas duas
linhagens estudadas, indicando uma resposta comum à limitação e P.
Neste trabalho, retiramos bandas de um gel unidimensional para identificação por MS,
com base em diferenças visuais. Embora se retire uma banda por vez, nesta banda é possível
haver mais de uma proteína com massas moleculares similares. Por isso, a partir dos resultados
de identificação por MS, foram recuperadas várias proteínas para cada banda e levamos em
consideração várias identificações em que os resultados correspondiam a proteínas com funções
relacionadas ao metabolismo de P, com massa molecular compatível com o observado no gel e
de origem de C.raciborskii.
A maior parte das proteínas mais expressas sob limitação de fosfato corresponderam a
funções de transporte e aquisição de nutrientes. Especificamente as proteínas PstS e SphX estão
envolvidas com o transporte e a aquisição de P com alta afinidade. Sua expressão é controlada
pelo regulon Pho e, juntamente com a fosfatase alcalina (phoX), são mais expressas quando
este nutriente é limitante (HARKE et al., 2012). No sistema Pst compostos fosfatados
atravessam a membrana externa através da porina PhoE e, uma vez no periplasma, são
degradados por fosfatases. O fosfato inorgânico é então transferido através da membrana
citoplasmática pelo sistema PstSABC. O gene sphX tem esse nome derivado de sua descrição
em Synechococcus onde é regulado pelo sistema de dois componentes sphS (quinase) e sphR
(ativador transcricional). Em Microcystis aeruginosa há um operon contendo os genes sphX,
- 53 -
pstS-C-A-B, porém no genoma de C.raciborskii sphX não faz parte deste operon. Em diversas
cianobactérias a regulação de sphX e pstS ocorre em paralelo em resposta à limitação de fosfato
(HARKE et al., 2012).
Também apareceram os transportadores de bacitracina e de polímeros ExbB. No primeiro
caso foi identificada uma proteína com domínio similar a este transportador, que pertence a
ampla família de transportadores do tipo ABC. A proteína presente no gel, portanto,
provavelmente tem função de transportador, não necessariamente de bacitracina, ou peptídeos,
já que este tipo de transporte serve a diversas moléculas. Também poderia estar envolvida com
o efluxo de compostos (MANSON et al., 2004). A proteína ExbB também participa de um
sistema de transporte, neste caso ligado a TonB e uma proteína de membrana externa. Este tipo
de transporte atua na aquisição de ferro mas também de outros tipos de moléculas (NOINAJ et
al., 2010). Não podemos determinar que tipo de transporte seria realizado para estas proteínas,
mas a ativação de sistemas de aquisição de nutrientes é uma resposta à limitação nutricional.
A proteína UspA é chamada proteína de estresse universal. Este grupo de proteínas é
encontrado em bactérias, Archea, fungos, insetos e plantas. Em Escherichia coli UspA é
produzida em resposta a muitos tipos de desafios ambientais e se torna muito abundante
(KVINTET et al., 2003). Em cianobactérias, já foi descrito em Anabaena um gene (alr0882)
que quando clonado em E. coli é mais expresso sob limitação de fósforo, assim como de
carbono, nitrogênio e sob estresses como exposição a H2O2, UV-B, NaCl, calor etc.,
aumentando o crescimento celular nestas condições. Isso reforça o seu papel na tolerância aos
mais diversos tipos de estresse (SHRIVASTAVA et al., 2012).
Quanto à identificação da proteína GvpC, constituinte de vesículas de gás, este resultado
foi mais surpreendente. As vesículas de gás conferem a capacidade de flutuação às células e
podem ocupar de 1 a 16% do volume celular. São compostas por proteínas chamadas Gvp. Até
14 genes foram relacionados com a produção de vesículas de gás, mas apenas os produtos de
dois deles estão presentes nestas estruturas, GvpA (90% da massa) forma filamentos que
compõem a estrutura e GvpC que se liga na parte externa desses filamentos e impede o seu
colapso (WALSBY, 1994). A regulação da síntese destas proteínas e formação das vesículas não
é muito clara. Em algumas espécies se observou que sua síntese depende da taxa de crescimento
e em outras não. A formação das vesículas não depende inteiramente da síntese proteica pois
proteínas de vesículas que colapsam podem ser reaproveitadas. Em limitação de luz, culturas
- 54 -
de Microcystis aeruginosa mantiveram o mesmo nível de vesículas de gás em todas as fases de
crescimento, mas para Aphanizomenon flos-aquae a taxa de vesículas foi dependente da taxa de
crescimento. Quanto à limitação de fosfato, quando culturas de Microcystis aeruginosa
limitadas por fosfato foram transferidas para meio com fosfato, com ou sem luz, foi observado
que a síntese de proteínas e de vesículas foi dependente de luz. Após transferência para luz +
fosfato, a formação de vesículas de gás foi mais intensa do que a síntese proteica total, o que
resultou em um aumento do número de vesículas por célula. Porém não se sabe se isso foi uma
resposta específica aos níveis de fosfato ou seria geral para limitação de outros nutrientes, como
por exemplo nitrogênio (KROMKAMP et al., 1989). Já no caso de A. flos-aquae, culturas sob
limitação, seja por intensidade luminosa ou limitação de fosfato, diminuíram o conteúdo de
vesículas de gás. Porém, sob limitação de P, o conteúdo de vesículas foi 43% menos do que o
das culturas limitadas por luz. Também foi visto que nas culturas limitadas por P, a pressão de
turgor na célula era bem maior do que nas limitas por luz e isso pode inclusive ter causado o
colapso de vesículas explicando sua maior redução (KONOPKA et al., 1987).
Outras proteínas foram menos expressas sob limitação de fosfato. Foram duas proteínas
de membrana, uma hipotética e outra de um canal mecanosensível.
A proteína de membrana designada como hipotética possui um domínio S layer e um
domínio do tipo porina de carboidrato. Porinas são proteínas que formam canais na membrana
externa de bactérias Gram-negativas e permitem a difusão de nutrientes, metabólitos e
compostos tóxicos através da membrana (NIKAIDO, 2003). Porinas podem ser inespecíficas,
permitindo a difusão com base na massa, carga e polaridade da molécula. Outras são específcas
e realizam transporte por canais com alta afinidade pelo substrato, podendo ter sítios de ligação
para o substrato no canal. A porina OprB específica para glicose se encaixa nesta última classe
(NIKAIDO, 2003). Já foi demonstrado em Pseudomonas putida que a porina OprB é induzida
durante cultivo em glicose e reprimida em cultivo com compostos aromáticos e ácidos
orgânicos (SHRIVASTAVA et al., 2100). A porina do tipo OprB está entre as três porinas
globalmente conservadas em cianobactérias (SIMM et al. 2014). Isso sugere que esta proteína
garante um mecanismo geral de interação com o ambiente nesse grupo.
Porém não foi encontrada nenhuma referência na literatura da regulação de sua expressão em
cianobactéria, o que dificulta formular uma possível razão para sua baixa expressão na ausência
de P, como observamos.
- 55 -
Os canais mecanosensíveis trocam osmólitos em bactérias e protegem a célula da lise por
choque osmótico. A proteína MscS forma um canal heptamérico de baixa condutância na
membrana citoplasmática que responde a tensão da membrana e se abre quando a célula incha
devido à entrada de água (BOOTH et al., 2007). Quando a tensão alivia, o canal volta a fechar.
As porções citoplasmáticas das proteínas MscS formam uma câmara que altera sua
conformação quando o canal abre e fecha. Porém foi mostrado que uma porção citoplasmática
de MscS de E. coli interage com a proteína FtsZ. FtsZ atua na formação do anel de septação na
divisão celular e a expressão aumentada de MscS rompeu a formação desse anel e gerou células
compridas, filamentosas. Esses dados levaram a hipótese de que a parte citoplasmática de MscS,
exposta quando o canal abre, interage co FtsZ e influencia na síntese da parede celular
(KOPROWSKI et al., 2015). De acordo com os nossos dados não podemos afirmar por que a
proteína MscS esteve mais expressa em presença do que em ausência de P. Uma possibilidade
é que as alterações de biovolume das células apresentadas durante o cultivo levem à necessidade
de regular o balanço osmótico e também estejam envolvidas alterações na síntese de parede
celular e respondam a taxa de divisão celular.
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6. CONCLUSÕES
Podemos concluir a partir da comparação do cultivo de duas linhagens de
Cylindrospermopsis raciborskii na presença e ausência de fósforo que houve uma diminuição
do crescimento na condição de tratamento (-P) nas duas linhagens estudadas. Também foi
observada alteração do biovolume das células na condição de tratamento (-P) se comparado ao
controle principalmente no caso da linhagem CyRF. Além disso, houve queda na síntese
proteica na ausência de P.
Ainda assim, mesmo após 21 dias na ausência de P as células tiveram um pequeno
crescimento sugerindo então nessas condições a presença de um estoque fósforo nas células.
Através da análise da concentração de saxitoxina total no último dia de cultivo na linhagem
CyRF, foi possível observar a presença da toxina no controle e ausência de saxitoxina na
condição de limitação de fósforo, o que pode estar relacionado com a queda do metabolismo
devido à baixa da síntese proteica.
Durante o trabalho também foi estabelecido um método apropriado para a extração de
proteínas de membrana de C.raciborskii, sendo esse método usado para a identificação de
porinas através de gel SDS-PAGE 12,5 %.
Foram identificadas proteínas diferencialmente expressas em condições de presença e
ausência de fosfato no meio, sendo essas proteínas identificadas a partir de lisados totais e da
fração de membrana. Dentre as proteínas identificadas estão porinas com domínio S-layer. . A
maior parte das proteínas mais expressas sob limitação de fosfato corresponderam a funções de
transporte e aquisição de nutrientes.
- 57 -
7 REFERÊNCIAS
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dinoflagellatesAlexandrium spp. Marine Biology, v. 104, n. 3, p. 511-524, 1990.
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of the distribution, phylogeography, and ecophysiology of a global invasive
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