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Caracterización Molecular y Análisis De Estabilidad Temporal de la Cepa Dominante De Enterococos obtenida de Heces Fecales Humanas Christian Del Rio Ramos y Dr. Luis A. Ríos Hernández Departamento de Biología Recinto Universitario de Mayagüez Resultados Referencias Objetivos Metodología El género Enterococcus, es utilizado como indicador de contaminación fecal en cuerpos de agua gracias a su presencia casi universal en las heces fecales. Las dos especies dominantes en humanos son E. faecalis y E. faecium, los cuales están vinculados con infecciones nosocomiales dada su resistencia a antibióticos y la presencia de factores de virulencia. El poder detectar algunas cepas que sean exclusivas o pertenecientes al intestino humano, nos podría ayudar a determinar la contaminación fecal humana en cuerpos de agua. Para poder determinar la estabilidad temporal de la cepa de Enterococcus dominante en un sujeto, se propuso una serie de muestreos fecales y caracterización de estos organismos. Para poder estudiar la población intestinal de enterococos en las muestras de heces fecales se utilizaron distintos procedimientos moleculares, entre los cuales están, el Tuf PCR que determina el género; Jackson PCR que es usado para identificar entre especies de enterococos; Box PCR para distinguir entre cepas; y VF para determinar factores de virulencia. Estas técnicas nos ayudaran a determinar la diversidad de cepas presentes en un momento definido y como la población cambia en un periodo de siete días. Preámbulo Introducción Cuantificar la población de enterococos. Analizar la cepa dominante de enterococos obtenida de heces fecales humanas en un tiempo definido. Comparar factores de virulencia, resistencia a antibióticos y Box PCR Determinar la cantidad de cepas distintas presentes en las heces fecales en un tiempo definido. El propósito principal de este estudio es caracterizar la cepa de enterococos dominante presente en heces fecales de un sujeto durante un periodo de muestreo de 7 días. Esto nos permitirá determinar si la población es constante o transitoria, donde podremos identificar el número máximo de cepas presentes y caracterizar las mismas. Nuestra hipótesis consiste en que la población de enterococos es transitoria y cepa dominante cambia frecuentemente, entiéndase a diario. Crecimiento y colonias rojas en agar mEnterococcus Prueba de Catalasa Negativa Crecimiento en BHI a 45C y 6.5% de NaCl Positivo en Agar Enterococcosel Extracción de ADN Para Pruebas Moleculares Resistancia a Antibioticos Prueba de Motilidad Pigmentación Pruebas Moleculares Tuf, atpA, VF Jackson PCR Box PCR Comparar Composición de Población y Cepas Sistema de filtración basado en el método de la EPA 1600 para calidad de agua utilizando una membrana de 0.45μm para filtrar las diluciones de material fecal. Se colocará la membrana en un plato con Agar mEnterococcus y se incubará a 41ºC por 48 hrs. Un total de 20 aislados se seleccionaran de la dilución más apropiada. Fisher, K., & Phillips, C. (2009). The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. Microbiology (Reading, England), 155(Pt 6), 1749–57. doi:10.1099/mic.0.026385-0 McCormick, J. K., Hirt, H., Dunny, G. M., & Schlievert, P. M. (2000). Pathogenic mechanisms of enterococcal endocarditis. Current Infectious Disease Reports, 2, 315-321. Klein, G. (2003). Taxonomy, ecology and antibiotic resistance of enterococci from food and the gastro-intestinal tract. International Journal of Food Microbiology, 88(2-3), 123–131. doi:10.1016/S0168-1605(03)00175-2 Fig.1 Box PCR del Dia 1 de muestreo. Cepas similares en carriles 8, 20 y 22. Otro grupo parecido es 9, 11, 12, 13, 23 y 24. Fig.2 Box PCR del Día 2 de muestreo. Cepas similares en carriles 2-4, 9, 11 y de 16-23. Fig.3 Box PCR del Día 3 de muestreo. Cepas similares a las recuperadas en el día 2, misma cepa observada en todas las muestras. Resultado de Jackson PCR: Día 1 – 100% E. faecalis Día 2 – 80% E. faecium y 20% E. faecalis Día 3 – 100% E. faecium Día 4 – 100% E. faecium Resultado de Box PCR: Existe una variedad limitada de Cepas entre los enterococos aislados. Utilizando la data presentada, podemos concluir: • Ocurre un cambio en la población de enterococos a nivel de especie en un periodo de 24 horas. • Se puede ver una cepa dominante entre día 2 y día 3, pero ninguna se comparte con día 1. • Transición entre el día 2 y el día 3, tanto en especie como cepa. Jackson PCR Día 1 Jackson PCR Día 2 Jackson PCR Día 3 Jackson PCR Día 4 Día 4 E. faecalis E. faecium E. faecalis E. faecium E. faecalis E. faecium E. faecalis E. faecium Conclusiones
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Caracterización Molecular y Análisis De Estabilidad Temporal de la Cepa Dominante De Enterococos obtenida de Heces Fecales Humanas
Christian Del Rio Ramos y Dr. Luis A. Ríos Hernández Departamento de Biología
Recinto Universitario de Mayagüez
Resultados
Referencias
Objetivos
Metodología
El género Enterococcus, es utilizado como indicador de contaminación fecal en cuerpos de agua gracias a su presencia casi universal en las heces fecales. Las dos especies dominantes en humanos son E. faecalis y E. faecium, los cuales están vinculados con infecciones nosocomiales dada su resistencia a antibióticos y la presencia de factores de virulencia. El poder detectar algunas cepas que sean exclusivas o pertenecientes al intestino humano, nos podría ayudar a determinar la contaminación fecal humana en cuerpos de agua. Para poder determinar la estabilidad temporal de la cepa de Enterococcus dominante en un sujeto, se propuso una serie de muestreos fecales y caracterización de estos organismos. Para poder estudiar la población intestinal de enterococos en las muestras de heces fecales se utilizaron distintos procedimientos moleculares, entre los cuales están, el Tuf PCR que determina el género; Jackson PCR que es usado para identificar entre especies de enterococos; Box PCR para distinguir entre cepas; y VF para determinar factores de virulencia. Estas técnicas nos ayudaran a determinar la diversidad de cepas presentes en un momento definido y como la población cambia en un periodo de siete días.
Preámbulo
Introducción
Cuantificar la población de enterococos.
Analizar la cepa dominante de enterococos obtenida de heces fecales humanas en un tiempo definido.
Comparar factores de virulencia, resistencia a antibióticos y Box PCR
Determinar la cantidad de cepas distintas presentes en las heces fecales en un tiempo definido.
El propósito principal de este estudio es caracterizar la cepa de enterococos dominante presente en heces fecales de un sujeto durante un periodo de muestreo de 7 días. Esto nos permitirá determinar si la población es constante o transitoria, donde podremos identificar el número máximo de cepas presentes y caracterizar las mismas. Nuestra hipótesis consiste en que la población de enterococos es transitoria y cepa dominante cambia frecuentemente, entiéndase a diario.
Crecimiento y colonias rojas en agar
mEnterococcus
Prueba de Catalasa
Negativa
Crecimiento en BHI a 45C y 6.5% de NaCl
Positivo en Agar Enterococcosel
Extracción de ADN
Para Pruebas
Moleculares
Resistancia a Antibioticos
Prueba de Motilidad
Pigmentación
Pruebas Moleculares
Tuf, atpA, VF
Jackson PCR
Box PCR
Comparar
Composición de Población y Cepas
Sistema de filtración basado en el método de la EPA 1600 para calidad de agua utilizando una membrana de 0.45µm para filtrar las diluciones de material fecal. Se colocará la membrana en un plato con Agar mEnterococcus y se incubará a 41ºC por 48 hrs. Un total de 20 aislados se seleccionaran de la dilución más apropiada.
Fisher, K., & Phillips, C. (2009). The ecology, epidemiology and
virulence of Enterococcus. Microbiology (Reading, England),
155(Pt 6), 1749–57. doi:10.1099/mic.0.026385-0
McCormick, J. K., Hirt, H., Dunny, G. M., & Schlievert, P. M.
(2000). Pathogenic mechanisms of enterococcal endocarditis.
Current Infectious Disease Reports, 2, 315-321.
Klein, G. (2003). Taxonomy, ecology and antibiotic resistance of
enterococci from food and the gastro-intestinal tract. International
Journal of Food Microbiology, 88(2-3), 123–131.
doi:10.1016/S0168-1605(03)00175-2
Fig.1 Box PCR del Dia 1 de muestreo. Cepas similares en carriles 8, 20 y 22. Otro grupo parecido es 9, 11, 12, 13, 23 y 24.
Fig.2 Box PCR del Día 2 de muestreo. Cepas similares en carriles 2-4, 9, 11 y de 16-23.
Fig.3 Box PCR del Día 3 de muestreo. Cepas similares a las recuperadas en el día 2, misma cepa observada en todas las muestras.
Resultado de Jackson PCR: Día 1 – 100% E. faecalis Día 2 – 80% E. faecium y 20% E. faecalis Día 3 – 100% E. faecium
Día 4 – 100% E. faecium
Resultado de Box PCR: Existe una variedad limitada de Cepas entre los enterococos aislados. Utilizando la data presentada, podemos concluir: • Ocurre un cambio en la población de
enterococos a nivel de especie en un periodo de 24 horas.
• Se puede ver una cepa dominante entre día 2 y día 3, pero ninguna se comparte con día 1.
• Transición entre el día 2 y el día 3, tanto en especie como cepa.
Jackson PCR Día 1
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