Caracterización de Nuevas Xilanasas Bacterianas. Ingenieria de Enzimas con la Xilanasa XynB de...
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CARACTERIZACIÓN ARACTERIZACIÓN DE DE N NUEVAS UEVAS X X ILANASAS ILANASAS B BACTERIANAS ACTERIANAS. I NGENIERÍA NGENIERÍA DE DE E E NZIMAS NZIMAS CON CON LA LA X X ILANASA ILANASA B B DE DE P AENIBACILLUS AENIBACILLUS B BARCINONENSIS ARCINONENSIS Tesis Doctoral Óscar Gallardo Román Barcelona, 2007
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Tesis Doctoral sobre xilanasas (enzimas degradadoras de xilano) bacterianas.Óscar GallardoDepartament de MicrobiologiaUniversitat de Barcelona2007
Transcript of Caracterización de Nuevas Xilanasas Bacterianas. Ingenieria de Enzimas con la Xilanasa XynB de...
CCARACTERIZACIÓNARACTERIZACIÓN DEDE N NUEVASUEVAS X XILANASASILANASAS B BACTERIANASACTERIANAS..IINGENIERÍANGENIERÍA DEDE E ENZIMASNZIMAS CONCON LALA X XILANASAILANASA B B DEDE
PPAENIBACILLUSAENIBACILLUS B BARCINONENSISARCINONENSIS
Tesis DoctoralÓscar Gallardo RománBarcelona, 2007
UNIVERSITAT DE BARCELONA
FACULTAT DE BIOLOGIA
DEPARTAMENT DE MICROBIOLOGIA
CCARACTERIZACIÓNARACTERIZACIÓN DEDE N NUEVASUEVAS X XILANASASILANASAS B BACTERIANASACTERIANAS..
IINGENIERÍANGENIERÍA DEDE E ENZIMASNZIMAS CONCON LALA X XILANASAILANASA B B DEDE
PPAENIBACILLUSAENIBACILLUS B BARCINONENSISARCINONENSIS
Memoria presentada por Óscar Gallardo Román para optar al grado de Doctor por la
Universitat de Barcelona
Programa de doctorado: Microbiologia Ambiental i Biotecnologia (1999 – 2001)
Tesis realizada bajo la dirección del Dr. Francisco I. Javier Pastor Blasco, en el Departamento de Microbiología de la Universitat de Barcelona.
Barcelona, Octubre del 2007
VºBº del Director de Tesis
Dr. Francisco I. Javier Pastor Blasco
Memoria presentada por
Óscar Gallardo Román
AAGRADECIMIENTOSGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero dar mi más sincero
agradecimiento al Dr. Francisco I. Javier
Pastor, por haber dirigido este trabajo de tesis.
Sin su guía, su apoyo y su comprensión en los
momentos difíciles este trabajo no habría sido
posible.
Quiero darles las gracias también al resto de
los compañeros que han pasado por el grupo
de investigación a lo largo de estos años, por
su ayuda, su apoyo y su amistad, a la Dra.
Pilar Díaz, a Marga, Marta, Núria P., Pere,
Cristina, Iulia, Serena, Arnau, Noelia, Nikolia,
Eric, y en especial a Cristian, que lleva
soportándome desde que nos conocimos en el
instituto.
Mi agradecimiento también al Dr. Julio
Polaina, y a los integrantes de su grupo de
investigación durante mi estancia en València,
Txiqui, Maela, Ana-Cris y Lorena.
También quiero agradecerles su amistad y los
buenos momentos compartidos dento y fuera
del departamento a Xavi Bonjoch, Quim,
Marc, Javi del Campo, Núria F., Laura y
Sonia.
También dar las gracias a Natalia, Sandra,
Rocío, Markus, Pili, Silvia, Nestor, Ayalke,
Rosa, Tony, Cristina Garcia, Xavi Vilanova,
Salva, Núria J., Damir, Unai, Lluis, y al resto
de compañeros del Departamento de
Microbiología, por compartir tantas horas de
trabajo y tantas cenas.
Mil gracias también a toda la gente del LoKal
por su cariño, su amistad y su comprensión
durante tantos años, y en especial a Xavier
Cuartiella, alma pater del LoKal.
Y como no, darles las gracias a mis padres,
Antonio y Pilar, a mi hermana, Mª Eugenia, y
a toda mi familia por haberme apoyado
incondicionalmente desde el día en que nací.
AABREVIATURASBREVIATURAS
Abreviatura Definición
Å ångström
ADN ácido desoxiribonucleico
Amp ampicilina
AOX adsorbable organic halogens
ARN ácido ribonucleico
Bl % ISO porcentaje de blancura ISO
bp pares de bases
BSA seroalbúmina bovina
C - control negativo
C + control positivo
CBD cellulose binding domain (dominio de unión a celulosa)
CBM carbohydrate binding module (módulo de unión a carbohidratos)
Cm cloramfenicol
CMC carboximetil celulosa
Da dalton
ECF elemental chlorine free
et al. y otros / y colaboradores
FDA food and drug administration
FPLC fast protein liquid chromatography
g gramo
GRAS generally recognized as safe
h hora
HexA ácidos hexenurónicos
ICDH isocitrato deshidrogenasa
Ik índice kappa
IPTG isopropil-β-tiogalactopiranósido
ISO international organization for standardization
kb kilobases
kDa kilodalton
Km kanamicina
kPa kilopascal
l litro
M molar (mol/l)
MDH malato deshidrogenasa
mg miligramo
min minuto
ml mililitro
Abreviatura Definición
mM milimolar
MP motivo Pir
MPa megapascales
ng nanogramo
nm nanómetro
o orto
oNPX oNitrofenil-β-D-Xilopiranósido
p para
PEG polietilenglicol
pg picogramo
pI punto isoeléctrico
pNAf pNitrofenil-α-L-Arabinofuranósido
pNAp pNitrofenil-α-L-Arabinopiranósido
pNPG pNitrofenil-β-D-Glucopiranósido
pNPG2 pNitrofenil-β-Celobiósido
pNPG3 pNitrofenil-β-Celotriósido
pNPG4 pNitrofenil-β-Celotetraósido
pNPG5 pNitrofenil-β-Celopentaósido
pNPX pNitrofenil-β-D-Xilopiranósido
psi pound per square inch (libra por pulgada cuadrada)
r.p.m. revoluciones por minuto
RBB Remazol Brilliant Blue
SDS PAGE electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico
sp. especie
ssp. subespecie
TCF total chlorine free
U unidad de actividad
V voltios
W vatios
X gal 5 bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
XBD xylan binding domains (dominios de unión a xilano)
µg microgramo
µl microlitro
µm micrómetro / micra
µM micromolar
μmol micromol
IÍÍNDICENDICE
I
Introducción 11. Introducción...................................................................................... .......................3
1.1. La pared celular vegetal.........................................................................................31.1.1. Estructura y composición................................................................... ......................31.1.2. Celulosa.............................................................................................................. ......51.1.3. Hemicelulosas................................................................................... .......................51.1.4. Pectinas............................................................................................ ........................71.1.5. Lignina................................................................................................ .....................8
1.2. El xilano.................................................................................................................91.3. Enzimas degradadoras de xilano..........................................................................11
1.3.1. β-xilosidasas............................................................................................... ............121.3.2. α-L-arabinofuranosidasas.................................................................. .....................131.3.3. α-D-glucuronidasas...................................................................... ..........................131.3.4. Esterasas....................................................................................................... ..........13
1.4. Xilanasas..............................................................................................................141.4.1. Características generales........................................................................................ .141.4.2. Clasificación de las xilanasas.......................................................... .......................161.4.3. Mecanismo catalítico...................................................................................... ........181.4.4. Estructura....................................................................................... ........................201.4.5. Aplicaciones de las xilanasas................................................................................. .26
2 - Objetivos e interés del trabajo realizado............................................................ .31
2.1. Clonación e identificación de xilanasas de Bacillus sp. BP-7.............................312.2. Caracterización de la xilanasa B (XynB) de Paenibacillus barcinonensis y sobreexpresión en huéspedes homólogos...................................................................312.3. Estudio estructural e ingeniería de proteínas con XynB de Paenibacillus barcinonensis..............................................................................................................32
Materiales y Métodos 331. Microorganismos utilizados........................................................................ ..........352. Cultivo y mantenimiento de microorganismos............................................... .....35
2.1. Medios de cultivo.................................................................................................352.2. Mantenimiento de cepas......................................................................................382.3. Fraccionamiento celular.......................................................................................38
2.3.1. Sonicación............................................................................................... ...............382.3.2. French Press................................................................................ ..........................382.3.3. Lisis celular seguida de ultracentrifugación......................................................... ...39
3. Ensayos de actividad enzimática......................................................................... .39
3.1. Determinación de actividad hidrolítica sobre polisacáridos mediante el método de Nelson-Somogyi.....................................................................................................393.2. Ensayo cromogénico de actividad xilanasa.........................................................413.3. Ensayo de actividad sobre aril derivados.............................................................423.4. Determinación del pH óptimo..............................................................................433.5. Determinación de la temperatura óptima.............................................................43
II
3.6. Cuantificación de la actividad malato deshidrogenasa........................................433.7. Cuantificación de la actividad isocitrato deshidrogenasa....................................44
4. Vectores plasmídicos utilizados.............................................................. .............455. Análisis y manipulación del ADN recombinante........................ .........................46
5.1. Extracción de ADN plasmídico...........................................................................465.1.1. Minipreparación de ADN plasmídico por lisis alcalina........................ ..................465.1.2. Midipreparación de ADN plasmídico.......................................................... ...........46
5.2. Digestión con enzimas de restricción y tratamiento con RNAsa.........................475.2.1. Digestión con enzimas de restricción........................................... ..........................475.2.1. Tratamiento con RNAsa......................................................................... ................47
5.3. Ligación de moléculas de ADN...........................................................................475.4. Amplificación por PCR........................................................................................47
5.4.1. Amplificación de alta fidelidad.................................................. ............................475.4.2. PCR mutagénica........................................................................................ .............48
5.5. Gene Shuffling (recombinación in vitro por PCR)...............................................485.6. Transformación....................................................................................................51
5.6.1. Transformación de Escherichia coli....................................................... ................515.6.2. Transformación de Bacillus subtilis........................................................................ 51
6. Secuenciación y análisis de secuencia........................................................... .....53
6.1. Secuenciación......................................................................................................536.2. Análisis informático de secuencias......................................................................53
7. Dicroismo circular............................................................................................... ...548. Análisis electroforético.......................................................................................... 54
8.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes................................548.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas.......................558.3. Tinción de proteínas con azul de Coomassie.......................................................568.4. Revelado zimográfico (zimograma)....................................................................568.5. Isoelectroenfoque.................................................................................................578.6. Electroforesis y transferencia de proteínas para su secuenciación N-terminal....578.7. Electroforesis en geles de agarosa.......................................................................58
9. Purificación de proteínas........................................................... ...........................59
9.1. Preparación de las muestras.................................................................................599.2. Cromatografía en columna...................................................................................60
9.2.1. Cromatografía de gel filtración......................................................................... ......609.2.2. Cromatografía de intercambio iónico.............................................. .......................619.2.3. Tercer paso opcional de cromatografía.......................................................... .........61
9.3. Concentración de proteínas por ultrafiltración....................................................62
Capítulo I. La xilanasa XynA de Bacillus sp. BP-7 631. - Introducción y Objetivos...................................................................... ...............652. - Resultados............................................................................. ..............................65
2.1. Clonación e identificación de xilanasas de Bacillus sp. BP-7.............................652.1.1. Construcción y escrutinio de la genoteca de Bacillus sp. BP-7............................. ..65
III
2.1.2. Análisis de los clones con actividad xilanasa............................... ..........................672.1.2.1. - Análisis de los plásmidos recombinantes.............................................................672.1.2.2. - Subclonaje del inserto de pXA3............................................................................67
2.1.3. Secuenciación e identificación del gen xynA.................................. .......................68
2.2. Caracterización bioquímica de la xilanasa XynA de Bacillus sp. BP-7..............702.2.1. Determinación del peso molecular y del punto isoeléctrico.............................. ......702.2.2. Propiedades enzimáticas.................................................................................. .......71
2.2.2.1. - Especificidad de sustrato.......................................................................................712.2.2.2. - pH óptimo y Temperatura óptima.........................................................................722.2.2.3. - Termorresistencia..................................................................................................732.2.2.4. - Influencia de iones metálicos sobre la actividad..................................................73
2.3. Expresión de la xilanasa XynA en levadura........................................................742.3.1. Antecedentes................................................................................... .......................742.3.2. Análisis de actividad de los clones recombinantes......................... ........................762.3.3. - Localización celular........................................................................ .....................77
Capítulo II. Las xilanasas YnfF y XynD de Bacillus sp. BP-7 791. - Introducción y Objetivos...................................................................... ...............812. - Resultados............................................................................. ..............................81
2.1. Aislamiento de las xilanasas del clon Escherichia coli/pXA5............................812.1.1. Subclonaje del inserto del plásmido pXA5.................................................... .........812.1.2. Secuenciación e identificación de los genes de pXA5............................. ...............82
2.1.2.1.- Secuencia y homología de xynD de Bacillus sp. BP-7..........................................832.1.2.1.- Secuencia y homología de ynfF de Bacillus sp. BP-7...........................................83
2.1.2. Aislamiento de los genes xynD e ynfF de Bacillus sp. BP-7............... ...................87
2.2. Caracterización bioquímica de la enzima YnfF de Bacillus sp. BP-7.................882.2.1. Determinación del peso molecular.......................................................................... 882.2.2. Propiedades enzimáticas.................................................................................. .......89
2.2.2.1. - Especificidad de sustrato.......................................................................................892.2.2.2. - pH óptimo y Temperatura óptima........................................................................892.2.2.3. - Termorresistencia..................................................................................................902.2.2.4. - Influencia de iones metálicos sobre la actividad..................................................91
Capítulo III. Estudio de la xilanasa XynB de Paenibacillus barcinonensis 931. - Introducción y Objetivos...................................................................... ...............952. - Resultados............................................................................. ..............................95
2.1. Especificidad de sustrato de XynB de Paenibacillus barcinonensis...................952.2. Producción de XynB de Paenibacillus barcinonensis en huéspedes homólogos96
2.2.1. Clonación en vectores lanzadera E. coli-Bacillus subtilis.....................................962.2.1.1. - Amplificación de xynB para su clonación en Escherichia coli............................962.2.1.2. - Transformación en las cepas de Bacillus subtilis MB216 y MW15.....................98
2.2.2. Expresión en Bacillus subtilis............................................................................ .....99
IV
2.2.2.1. - Análisis de expresión de la xilanasa en las cepas recombinantes de Bacillus subtilis...................................................................................................................................992.2.2.2. - Expresión en diferentes medios de cultivo.........................................................100
2.3. Localización celular de XynB............................................................................1012.3.1. Localización de XynB en Bacillus subtilis MW15/pRBSPO2X20.......................1012.3.2. Localización de XynB en Paenibacillus barcinonensis.............................. ..........1022.3.3. Análisis de péptido señal................................................................... ..................106
2.4. Estudio de las homologías de XynB..................................................................1082.4.1. Homologías de XynB...................................................................... .....................108
Capítulo IV. Ingeniería de Proteínas con la xilanasa XynB de Paenibacillus barcinonensis 1111. - Introducción y Objetivos................................................................... ................1132. - Resultados.......................................................................... ...............................113
2.1. Análisis estructural y funcional de XynB de Paenibacillus barcinonensis ......1132.1.1 Análisis de la estructura primaria.................................................. ........................1132.1.2. Predicción de estructura secundaria y terciaria........................................ .............1142.1.3. Mutagénesis dirigida................................................................. ...........................116
2.2. Purificación y cristalización de XynB...............................................................1172.2.1. Obtención de clones sobreproductores de XynB.......................... ........................1172.2.2. Resultados de cristalografía........................................................................ ..........119
2.3. Aumento de la termorresistencia de XynB de Paenibacillus barcinonensis.....1212.3.1 Mutagénesis aleatoria.......................................................................... ..................1212.3.2 Selección de mutantes termorresistentes............................................................... .1222.3.3 Secuenciación de los mutantes seleccionados y aislamiento de las mutaciones.....1252.3.4 Purificación de las xilanasas mutantes............................................................. ......1272.3.5 Termoestabilidad de las xilanasas mutantes................................ ..........................1282.3.6 Obtención de dobles mutantes................................................................ ...............1292.3.7 Purificación y ensayos de termoestabilidad de las xilanasas dobles mutantes.......1312.3.8 Efectos de las mutaciones sobre la estructura de XynB............................ .............1322.3.9 Estudio de las constantes cinéticas de XynB y de las xilanasas mutantes..............133
Anexo I. Aplicación de las xilanasas estudiadas en el Blanqueo de la Pasta de Papel 1351. - Introducción y Objetivos................................................................... ................1372. - Resultados y Discusión.................................................................................. ...137
2.1. Producción en fermentador de las xilanasas a evaluar.......................................1372.2. Determinaciones de actividad enzimática..........................................................1382.3. Ensayos papeleros..............................................................................................138
2.3.1. Características de las pastas papeleras..................................................... .............1382.3.2. Secuencia de blanqueo XDP............................................................................ .....1392.3.3. Secuencia de blanqueo XDEOPD1................................................................... ....140
V
Discusión 1431. Xilanasas de Bacillus sp. BP-7............................................................................ 145
1.1.- Identificación y caracterización de XynA........................................................1451.2.- Identificación y caracterización de YnfF..........................................................1461.3.- Identificación de XynD....................................................................................1481.4.- Sistema xilanolítico de Bacillus sp. BP-7.........................................................1491.5.- Expresión de xilanasas en levaduras................................................................150
2. XynB de Paenibacillus barcinonensis ................................................... ............152
2.1. Expresión en huéspedes homólogos..................................................................1522.2. Localización celular...........................................................................................1542.3. Relación estructura-función...............................................................................1582.4. Termoestabilidad................................................................................................161
3. Aplicación de las xilanasas estudiadas en el blanqueo de la pasta de papel.165
Conclusiones 167
Bibliografía 171A........................................................................................................... .....................173B........................................................................................................... .....................173C........................................................................................................... .....................176D........................................................................................................... .....................177E..................................................................................................... ...........................178F............................................................................................................................... ..178G................................................................................................................. ...............179H........................................................................................................... .....................180I.......................................................................................................................... ........181J......................................................................................................................... ........181K........................................................................................................... .....................182L............................................................................................................................... ..183M....................................................................................................................... .........184N........................................................................................................... .....................185O................................................................................................................. ...............186P..................................................................................................... ...........................186Q................................................................................................................. ...............188R........................................................................................................... .....................188S..................................................................................................... ...........................188T............................................................................................................................... ..191U........................................................................................................... .....................192V..................................................................................................... ...........................192W................................................................................................... ............................193Y..................................................................................................... ...........................193Z............................................................................................................................... ..194
VI
Publicaciones 195
2 µm IINTRODUCCIÓNNTRODUCCIÓN
3
1. I1. INTRODUCCIÓNNTRODUCCIÓN
El trabajo de la presente tesis doctoral se
centra en el estudio de xilanasas microbianas.
Como enzimas que son, las xilanasas son
biocatalizadores (incrementan la velocidad de
las reacciones químicas al reducir la energía de
activación necesaria para la transformación de
sustratos en productos), que catalizan la
degradación del xilano, polisacárido abundante
en la pared celular vegetal.
Debido a esta propiedad y al uso frecuente de
materiales de origen vegetal en la industria, las
xilanasas presentan, además de su interés
científico, un gran interés a nivel
biotecnológico. En este sentido, la aplicación
industrial de xilanasas, al igual que la de
muchas otras enzimas (como proteasas,
amilasas y celulasas), presenta claras ventajas
respecto a los procesos industriales
convencionales, como pueden ser la elevada
eficiencia, su bajo impacto medioambiental y
su rentabilidad económica (Ahuja et al., 2004;
Schäfer et al., 2007).
1.1. La pared celular vegetal
La pared celular de las células vegetales se
localiza en la zona exterior de la célula, en
contacto íntimo con la membrana plasmática.
Proporciona rigidez, soporte estructural y
mecánico a las células, determinando la
morfología y el crecimiento celular, y por
tanto, en última instancia, la arquitectura de la
planta. Además, la pared celular previene la
excesiva expansión de la célula debida a la
entrada y circulación de agua, actúa de barrera
frente a patógenos y es el compartimento
celular que media todas las relaciones de la
célula vegetal con el entorno.
1.1.1. Estructura y composición
La pared celular vegetal es una red compleja
altamente organizada, formada por
microfibrillas de celulosa unidas entre sí por
hemicelulosas, embebidas en una matriz
gelatinosa de sustancias pécticas, y reforzada
por glicoproteínas estructurales y, en
ocasiones, por compuestos aromáticos como la
lignina.
La pared celular vegetal se estructura en tres
partes fundamentales (Figura IN.1.1):
– Lámina media: es la primera capa que se
deposita durante la división celular vegetal,
y una vez completada ésta queda
localizada entre las paredes primarias de
las células resultantes. Está formada
principalmente por sustancias pécticas, que
cementan las paredes primarias de células
adyacentes manteniendo la unión entre
éstas (Zarra y Revilla, 1993; Heredia et al.,
1995).
– Pared primaria: está presente en todas las
células vegetales y es producto de la
acumulación de microfibrillas de celulosa,
orientadas en diversas direcciones,
formando una red relativamente laxa que
permite el crecimiento celular.
4
Esta compuesta por celulosa,
hemicelulosas, pectina y en menor medida
por glicoproteínas estructurales (como
extensinas y lectinas) unidas entre ellas o
con los polisacáridos mediante enlaces
covalentes, y otras proteínas solubles
(como enzimas y proteínas
transportadoras). La pared primaria
continua creciendo en área y espesor
mientras las células crecen en tamaño
(Goodwin y Mercer, 1983; Smith, 1993).
– Pared secundaria: cuando existe, es la capa
más adyacente a la membrana plasmática.
Se forma en algunos tipos celulares
vegetales una vez se ha detenido el
crecimiento celular, y generalmente está
formada por 3 subcapas: S1 (la más
externa), S2 y S3 (la más interna).
A diferencia de la pared primaria, contiene
una mayor proporción de celulosa, una
baja cantidad de hemicelulosas y, en
algunos tipos celulares (como las fibras de
xilema y las traqueidas), lignina y/o ceras
Figura IN.1.1: Esquema de la pared celular de una célula vegetal en crecimiento, e imagen de microscopía electrónica de transmisión de la pared celular en células de tejidos rígidos.
Lámina media
Pared primaria
Membrana plasmática
Pectina
Proteína fibrilar
Proteína soluble
Microfibrilla de celulosa
Hemicelulosas
Lámina media
Pared primaria
Pared secundaria
1 μm
5
(suberina y cutina). Resulta así una
estructura más gruesa y compacta que la
pared primaria, proporcionando una mayor
rigidez y resistencia (Heredia et al., 1995;
Smith, 1993).
Los principales polímeros que componen la
pared celular vegetal son pues la celulosa, la
pectina, las hemicelulosas y la lignina, que en
conjunto constituyen la denominada
lignocelulosa (Thomson, 1993; Heredia et al.,
1995; Wong et al., 1998).
La constitución molecular y estructural precisa
de la pared celular depende del tipo de célula,
tejido y especie vegetal, siendo más variable la
composición de la pared celular secundaria
(que en algunos tipos celulares es inexistente)
que la de la pared celular primaria. De esta
manera, a pesar de las variaciones, una pared
celular primaria típica en las dicotiledóneas
estaría formada por un 25 - 30% de celulosa,
un 20 - 35% de hemicelulosa, un 35% de
pectina y un 5 - 10% de proteínas, en base al
peso seco (Kolek y Kozinka, 1992; Fry, 2001).
1.1.2. Celulosa
La celulosa es el componente más abundante
de la biomasa vegetal, y se considera el
biopolímero más abundante de la Tierra
(Saxena y Brown, 2005). Se encuentra
formando parte de la denominada fase
microfibrilar de la pared vegetal (altamente
cristalina), la cual, además de celulosa, puede
contener microfibrillas de mananos o de
xilanos β(1→3).
Es un homopolímero lineal no ramificado
formado por moléculas de β-D-glucosa unidas
entre sí por enlaces glucosídicos β(1→4), en el
que cada residuo de D-glucosa presenta una
rotación de 180º respecto al residuo anterior,
por lo que la unidad estructural básica
repetitiva de la celulosa es la celobiosa
(formada por 2 residuos de D-glucosa) y no la
D-glucosa (Delmer y Amor, 1995).
Las cadenas de celulosa se encuentran
asociadas entre sí intra e intermolecularmente
mediante puentes de hidrógeno y fuerzas de
van der Waals, dando lugar a una estructura
fibrilar rígida, insoluble y cristalina
denominada microfibrilla (Figura IN.1.2).
Cada microfibrilla de celulosa está formada
por unas 36 cadenas de celulosa, y su diámetro
es de unos 3 nm (Lerouxel et al., 2006).
1.1.3. Hemicelulosas
Las hemicelulosas son polisacáridos
heterogéneos, neutros, que presentan una
cadena principal con ramificaciones cortas.
Suponen habitualmente el 20 - 35% del peso
seco de la pared celular vegetal (De Vries y
Visser, 2001), donde, juntamente con la
pectina, la lignina y las proteínas, constituyen
la denominada matriz amorfa de la pared
celular, dentro de la cual se encuentra
embebida la fase microfibrilar cristalina.
6
Las hemicelulosas se caracterizan por requerir
para su extracción de la pared soluciones
alcalinas (como NaOH al 17,5% o KOH al
4 - 24%). Se encuentran formando uniones
entre sí, con otros polisacáridos, como las
microfibrillas de celulosa y las pectinas, y con
Figura IN.1.2: Micrografía electrónica de microfibrillas de celulosa de la pared primaria de células epiteliales de guisante (Somerville et al., 2004), y esquema de la organización de la celulosa.
Tabla IN.1.1: Hemicelulosas.
Xilano Cadenas de xilosa β(1→4) con cadenas laterales cortas de otros azúcares unidas a la cadena principal mediante el C2 y el C3 de las xilosas.
Manano puro Polímero no ramificado de manosa β(1→4). Muy compacto debido a la presencia de numerosos puentes de hidrógeno intramoleculares.
Glucomanano Cadenas de manosa β(1→4) que contienen residuos de glucosa. La relación manosa:glucosa es de 3:1.
Galactomanano Cadenas de manosa β(1→4) con cadenas laterales de residuos de galactosa simples unidos por enlaces α(1→6) a los residuos de manosa de la cadena principal.
Galactoglucomanano Como el glucomanano, pero con cadenas laterales de residuos de galactosa simples unidos por enlaces α(1→6) a los residuos de glucosa o manosa de la cadena principal.
Xiloglucano Cadenas de glucosa β(1→4) con cadenas laterales cortas de xilosa unidas por enlaces α(1→6) a los residuos de glucosa de la cadena principal.
Calosa Polímero no ramificado de glucosa β(1→3).
Man
anos
Microfibrilla
Cadenas de celulosa unidas por puentes de hidrógeno
Cadena de celulosa
Celobiosaβ-D-Glucosa
200 nm
7
la lignina, mediante enlaces tanto covalentes
como no covalentes.
La hemicelulosa más abundante en los cereales
y las maderas duras (angiospermas) es el
xilano, mientras que en las maderas blandas
(gimnospermas) es el galactoglucomanano.
Otras hemicelulosas frecuentes en vegetales
son el xiloglucano, el galactomanano, el
glucomanano, el manano puro y la calosa
(Tabla IN.1.1) (De Vries y Visser, 2001).
1.1.4. Pectinas
Las pectinas o polisacáridos pécticos son una
mezcla compleja de heteropolímeros ácidos y
neutros, que se caracterizan por su capacidad
para formar geles. Forman parte de la matriz
amorfa de la pared celular, actuando como
lubricantes y cementantes tanto en la pared
primaria como en la lámina media (donde se
encuentran en mayor concentración). A
diferencia de las hemicelulosas, pueden
extraerse de la pared celular mediante métodos
relativamente suaves, como pueden ser
tratamientos con agua caliente, con agentes
Tabla IN.1.2: Pectinas.
Galacturonanos Cadenas de ácido galacturónico α(1→4), metiladas en diferente proporción en el C6 de los grupos carboxilos.
Ramnogalacturonano I Cadenas de galacturonano interrumpidas por residuos ocasionales de L-ramnosa unidos mediante enlaces α(1→2) a los residuos de ácido galacturónico adyacentes. Al O4 de estos residuos de ramnosa pueden unirse largas cadenas de arabinanos o galactanos.También pueden encontrarse grupos acetilos unidos al O2 o al O3 de los residuos de ácido galacturónico de la cadena principal.
Ramnogalacturonano II Cadenas cortas de galacturonano (mínimo de 8 residuos) que presentan 4 cadenas laterales diferentes que contienen azúcares poco comunes como la 2-O-metil-L-fucosa, el ácido 3-deoxi-D-mano-2-octulosónico, el ácido acérico o la D-apiosa.Puede formar dímeros mediante puentes borato entre dos enlaces éster.
Galactanos Cadenas de D-galactosa β(1→4), que pueden presentar residuos de ácido ferúlico unidos al O6 de algunas galactosas.
Arabinogalactanos Como los galactanos pero con cadenas laterales de L-arabinosa unidas al C3 de residuos de galactosa de la cadena principal.
Arabinanos Cadenas de L-arabinosa α(1→5) que pueden presentar residuos laterales de L-arabinosa unidas mediante enlaces α(1→3) a la cadena principal, y/o residuos de ácido ferúlico unidos al O2 de la arabinosa terminal.
8
quelantes, como el EDTA, o con ácidos
diluidos (Zarra y Revilla, 1993).
Entre las pectinas se encuentran el
galacturonano, el ramnogalacturonano I, el
ramnogalacturonano II, el galactano, el
arabinogalactano y el arabinano (Tabla IN.1.2)
(Heredia, 1995; De Vries y Visser, 2001).
1.1.5. Lignina
La lignina es un polímero heterogéneo
formado por fenilpropanoides (alcoholes
fenólicos) unidos entre sí por enlaces éter
(C-O-C) o C-C. Los fenilpropanoides que
forman la lignina son los alcoholes
p-cumarílico (p-hidroxifenil propanol),
coniferílico (guaiaquil propanol) y sinapílico
(siringil propanol). Su proporción en la lignina
depende del tipo celular y de la especie vegetal
(Figura IN.1.3).
La lignina es la sustancia más abundante en la
matriz amorfa de la pared de plantas leñosas,
encontrándose sobre todo en la lámina media y
en la pared secundaria.
Debido a su carácter hidrofóbico desplaza el
agua de las paredes celulares secundarias,
dando lugar a una red hidrofóbica
tridimensional que interacciona con los demás
componentes de la pared y los mantiene
unidos, aumentando de esta manera la rigidez
de la pared y su resistencia frente a la
degradación química y biológica (Martínez et
al., 2005).
Figura IN.1.3: Precursores de la lignina y lignina.
Lignina
CH
CH
CH2OH
OH OH
OCH3
CH
CH
CH2OH
OH
CH3O OCH3
CH
CH
CH2OH
a b c
p-hidroxifenilpropanol
guaiaquilpropanol
siringilpropanol
Deshidrogenación ypolimerización
9
1.2. El xilano
El xilano es un polisacárido muy abundante en
la naturaleza; el más abundante después de la
celulosa (Collins et al., 2005). Forma parte de
las hemicelulosas presentes en la matriz
amorfa de la pared celular secundaria de los
tejidos lignificados de las plantas leñosas
(Timell, 1967), aunque también se puede
encontrar en la matriz de paredes primarias de
células en crecimiento y de semillas y bulbos,
donde tiene función de reserva.
Es la principal hemicelulosa de las maderas
duras (angiospermas), representando un
15 - 30% del peso seco de la pared vegetal, y
es menos abundante en el caso de las maderas
blandas (gimnospermas), donde representa un
7 - 12% del peso seco (Wong et al., 1988).
Su función parece ser básicamente estructural,
manteniendo la integridad de la pared celular
junto con otras hemicelulosas, la celulosa, las
pectinas y la lignina. Además, junto con la
lignina, ayuda a proteger las microfibrillas de
celulosa de la biodegradación.
El xilano está formado por un esqueleto de
moléculas de β-D-xilosa unidas entre sí por
enlaces β(1→4), salvo en algas marinas donde
estos enlaces son también β(1→3). Esta
cadena de β-D-xilopiranosas puede tener
diferente grado de polimerización, siendo éste
mayor en el caso de maderas duras (150 - 200
residuos de xilosa) que en el de maderas
blandas (70 - 130 residuos) (Kulkarni et al.,
1999).
Normalmente, la cadena de β-D-xilopiranosas
presenta ramificaciones laterales de diferente
naturaleza, ya que, aunque en algunas plantas
terrestres y algas se han encontrado
homoxilanos formados exclusivamente por
xilosa, lo más frecuente es que el xilano se
encuentre en forma de heteropolisacárido (Beg
et al., 2001). El número y la naturaleza de
estas ramificaciones laterales dependen de la
especie vegetal y del tipo de tejido, siendo las
más comunes aquellas formadas por
(Figura IN.1.4):
- α-L-arabinofuranosa: unida al C3 y/o al
C2 (aunque al C2 con menor frecuencia) de
residuos de β-D-xilopiranosa en xilanos de
maderas blandas (13% de la xilosas) y de
plantas herbáceas.
- Ácido α-D-glucurónico y/o ácido 4-O-
metil-α-D-glucurónico: unido al C2 de
β-D-xilopiranosas tanto en xilanos de
maderas duras (10% de las xilosas) como
en los de maderas blandas (20% de las
xilosas) y en los de plantas herbáceas
(Coughlan y Hazlewood, 1993).
- O-acetilos: unidos al C2, C3 o a ambos
carbonos de β-D-xilopiranosas en los
xilanos de maderas duras (70% de xilosas
acetiladas) y de plantas herbáceas, mientras
que los xilanos de maderas blandas no están
acetilados (Timell, 1967; Coughlan y
Hazlewood, 1993). La acetilación del
xilano aumenta su solubilidad en agua
(Biely, 1985).
10
- Ácidos ferúlico y p-cumárico: compuestos
fenólicos unidos por enlaces éster al C5 de
los residuos de arabinosa.
Además, se ha descrito la presencia de
ramnosa y galactosa en xilanos de algunas
plantas (Wong et al., 1988).
En función de las ramificaciones laterales
podemos clasificar los xilanos en 4 familias
principales (Joseleau et al., 1992):
- Arabinoxilanos: se denominan así los
xilanos de plantas herbáceas, debido a la
gran cantidad de residuos laterales de
α-L-arabinofuranosa. Además presentan
grupos laterales acetilo, de ácido
glucurónico y de ácido ferúlico y
p-cumárico.
- Glucuronoxilanos: son los xilanos de
maderas duras, que poseen cadenas laterales
de ácido α-D-glucurónico y/o ácido
4-O-metil-α-D-glucurónico, además de
grupos O-acetilo.
- Glucuronoarabinoxilanos: los xilanos de
maderas blandas; denominados así por
presentar cadenas laterales de
α-L-arabinofuranosa, ácido
α-D-glucurónico y/o ácido
4-O-metil-α-D-glucurónico y ácidos
ferúlico y cumárico.
- Homoxilanos lineales: no presentan
ramificaciones en las cadenas de
β-D-xilopiranosa. Sólo se han encontrado
en esparto (Chanda et al., 1950), en el tallo
Figura IN.1.4: Esquema de la estructura de una molécula de xilano y sus ramificaciones.
11
del tabaco (Eda et al., 1976), y en algunas
algas.
El xilano se encuentra unido a otros
componentes de la pared celular, actuando
como nexo de unión entre la lignina y el resto
de polímeros de la pared secundaria de las
plantas (Wong et al., 1988).
Puede unirse a la celulosa y a otras cadenas de
xilano y hemicelulosas mediante enlaces
covalentes y no covalentes (puentes de
hidrógeno y fuerzas de Van der Waals).
También puede unirse a la lignina mediante
enlaces covalentes (Dekker, 1989), que pueden
ser enlaces éter entre la lignina y los ácidos
cumárico y ferúlico esterificados a residuos de
arabinosa (arabinoxilanos y
glucuronoarabinoxilanos), y enlaces éster entre
la lignina y el ácido 4-O-metil glucurónico
(glucuronoxilanos y glucuronoarabinoxilanos).
Las cadenas de arabinoxilanos y
glucuronoarabinoxilanos además pueden
unirse entre ellas y con otras hemicelulosas y
lignina a través de la formación de diferulatos
(enlace covalente entre 2 residuos de ácido
ferúlico) tal como se puede apreciar en la
Figura IN.1.4 (Markwalder y Neukom, 1976).
1.3. Enzimas degradadoras de
xilano
La capacidad de degradar xilano está
ampliamente distribuida entre los
microorganismos saprófítos, tanto bacterias
como hongos, así como entre la microbiota del
rumen. Estos microorganismos poseen
complejos sistemas enzimáticos para llevar a
cabo la degradación del xilano.
La necesidad de un conjunto amplio de
diferentes enzimas, cada una con un papel
definido y determinado, para la completa
degradación del xilano, es debida a la
heterogeneidad y elevada complejidad
estructural de éste (Biely, 1985; Coughlan y
Hazlewood, 1993).
Las enzimas degradadoras del xilano se
clasifican en dos grupos principales
(Figura IN.1.5):
- Enzimas implicadas en la
despolimerización del esqueleto principal
de xilosas: Endoxilanasas (β-1,4-D-xilan-
xilanohidrolasas) y β-xilosidasas
(β-1,4-D-xilan-xilohidrolasas).
- Enzimas encargadas de la eliminación de
las cadenas laterales del xilano, llamadas
también accesorias o desramificantes:
α-L-arabinofuranosidasas,
α-D-glucuronidasas, acetilxilano esterasas,
y ferúlico y p-cumárico esterasas
(hidroxicinámico esterasas).
Entre estas enzimas existe frecuentemente
relaciones de sinergismo, de modo que,
generalmente, las enzimas desramificantes
permiten una mayor accesibilidad de las
xilanasas al esqueleto principal de xilosas, y a
su vez estas enzimas accesorias liberan los
sustituyentes laterales más fácilmente a partir
de fragmentos de xilano que no a partir del
xilano polimérico. De esta manera, se ha visto
que existe frecuentemente sinergismo entre
12
xilanasas y enzimas desramificantes, entre
xilanasas y β-xilosidasas, y entre diferentes
xilanasas (Coughlan et al., 1993; De Vries et
al., 2000).
1.3.1. β-xilosidasas
Las β-1,4-xilosidasas (EC 3.2.1.37) son
enzimas que actúan sobre xilobiosa y
xilooligosacáridos cortos no sustituidos,
hidrolizando los enlaces β(1→4) y liberando
así residuos de D-xilosa a partir del extremo
no reductor de estos sustratos (Reilly, 1981).
La afinidad de las β-xilosidasas por los
xilooligosacáridos disminuye al aumentar el
grado de polimerización de éstos, no siendo
activas sobre el xilano polimérico.
Complementan pues la acción degradadora de
las endoxilanasas al romper los xilooligómeros
que éstas generan a partir del xilano.
Dado que los oligosacáridos pueden penetrar
dentro de la célula, las β-xilosidasas suelen ser
enzimas intracelulares, aunque también las hay
extracelulares (Coughlan et al., 1993).
Muchas β-xilosidasas disponen además de
actividad transferasa o transxilosidasa (Lee y
Zeikus, 1993), por lo que pueden generar
productos de mayor tamaño que los
oligosacáridos iniciales, lo cual las hace de
interés para su utilización en biosíntesis de
oligosacáridos (De Vries y Visser, 2001).
El mecanismo catalítico utilizado por estas
enzimas puede ser de inversión o de retención
de la configuración anomérica. En este último
caso, para la hidrólisis del sustrato se produce
un doble desplazamiento, lo que permite a
algunas enzimas que usan este mecanismo de
retención catalizar reacciones de
transglicosilación (Rye y Withers, 2000).
Las β-xilosidasas suelen ser de elevado peso
molecular (hasta 360 kDa) y pueden estar
formadas por 2 o más subunidades (Coughlan
y Hazlewood, 1993).
Pertenecen a las familias 3, 39, 43 y 52 de
glicosil hidrolasas.
Figura IN.1.5: Enzimas necesarias para la degradación del xilano y lugares sobre los que actúan.
13
1.3.2. α-L-arabinofuranosidasas
Estas enzimas (EC 3.2.1.55) liberan las
moléculas de L-arabinosa unidas por enlaces
α-1,2 o α-1,3 a las cadenas de xilosa del xilano
(Kaji, 1984) o a otros polisacáridos que
contienen arabinosa (Saha, 2000). Con esta
rotura permiten la creación de zonas no
ramificadas susceptibles entonces de ser
atacadas por endoxilanasas, existiendo un
importante sinergismo entre estas enzimas.
La especificidad de sustrato y del tipo de
enlace que hidrolizan varía mucho de una
α-L-arabinofuranosidasa a otra, siendo estas
características específicas de cada enzima.
Esto propicia el hecho de que un mismo
microorganismo pueda producir múltiples
α-L-arabinofuranosidasas, cada una con
diferentes propiedades físico-químicas (Tajana
et al., 1992).
Las α-L-arabinofuranosidasas han sido
clasificadas en las familias 43, 51, 54 y 62 de
glicosil hidrolasas.
1.3.3. α-D-glucuronidasas
Las α-glucuronidasas (EC 3.2.1.131) eliminan
los residuos laterales de ácido glucurónico y
ácido 4-O-metil glucurónico, pero
generalmente sólo a partir de xilooligómeros
sustituidos, disminuyendo su actividad de
manera inversamente proporcional al grado de
polimerización de estos xilooligosacáridos
(Puls et al., 1987), por lo que suelen requerir
de la acción de endoxilanasas que
proporcionen xilooligómeros sustituidos del
tamaño adecuado a partir del xilano. Sin
embargo, hay excepciones a este hecho, como
por ejemplo una α-glucuronidasa de
Thermoascus aurantiacus, que presenta más
actividad cuanto mayor es el grado de
polimerización del xilano (Khandke et al.,
1989).
Se encuentran exclusivamente dentro de la
familia 67 de glicosil hidrolasas.
1.3.4. Esterasas
Actúan hidrolizando los enlaces éster
presentes en el polímero de xilano.
Las acetilxilano esterasas (EC 3.1.1.72)
hidrolizan los enlaces que unen grupos acetilo
a residuos de xilosa del esqueleto principal del
xilano (Tenkanen y Poutanen, 1992).
La degradación completa del xilano requiere
necesariamente de este tipo de enzimas, puesto
que su acción permite la accesibilidad de otras
enzimas a la pared celular, así como al
esqueleto de xilosa del xilano (Coughlan et al.,
1993).
Las ferúlico y p-cumárico esterasas, también
denominadas en conjunto como
hidroxicinámico esterasas, actúan sobre los
enlaces que unen residuos laterales de
arabinosa a ácido ferúlico y cumárico,
respectivamente (Mackenzie et al., 1987).
Permiten de esta manera romper uniones entre
cadenas de xilano y entre la lignina y el xilano.
14
1.4. Xilanasas
1.4.1. Características generales
Las endoxilanasas o xilanasas
(endo-β-1,4-xilanasas; EC 3.2.1.8) son las
enzimas que actúan sobre la cadena principal
del xilano hidrolizando los enlaces internos
β(1→4) entre moléculas de xilosa, dando lugar
a una mezcla de xilooligosacáridos de
diferentes tamaños (Biely, 1985). Además de
xilano pueden hidrolizar xilooligómeros de
diferente grado de polimerización (siendo más
activas cuanto mayor es el grado de
polimerización) pero no hidrolizan la
xilobiosa, lo que permite distinguirlas
claramente de las β-xilosidasas.
Las xilanasas son pues las principales enzimas
implicadas en la degradación del xilano.
En los microbios xilanolíticos hay una gran
multiplicidad de xilanasas (varios genes
distintos que además cada uno de ellos puede
dar lugar a diferentes xilanasas en función del
procesamiento post-transcripcional y
post-traduccional), que difieren en su
especificidad respecto al xilano (Wong et al.,
1988). Esta gran diversidad de xilanasas está
relacionada con el hecho de que el xilano es un
polímero muy complejo y se requieren
xilanasas distintas para degradar las diferentes
regiones del xilano y los diferentes xilanos.
Así, muchas xilanasas sólo pueden actuar
sobre regiones del xilano no sustituidas,
mientras que otras requieren un determinado
tipo de ramificación adyacente al sitio de corte
(Coughlan y Hazlewood, 1993).
Dado que el xilano es un polímero de elevado
grado de polimerización, no puede penetrar
dentro de los microorganismos para ser
degradado, de manera que las xilanasas han de
ser secretadas al medio extracelular,
normalmente mediante sistemas de secreción
de tipo II (“sec dependientes”, es decir, que
requieren del sistema de secreción Sec, el Sec
pathway) (Tjalsma et al., 2004). Sin embargo,
en algunas bacterias del rumen y en Cellvibrio
mixtus se han descrito xilanasas que no son
secretadas al espacio extracelular, quedando
localizadas en el espacio periplásmico (Fontes
et al., 2000). Probablemente, la función de
estas xilanasas periplásmicas no es la
degradación del xilano, sino la de
xilooligosacáridos de pequeño tamaño que
puedan atravesar la membrana externa,
estando protegidas al mismo tiempo de la
acción de las proteasas extracelulares.
En algunos microorganismos, principalmente
anaeróbicos, las xilanasas pueden encontrarse
también formando parte de unas estructuras
extracelulares denominadas celulosomas. Los
celulosomas son complejos multienzimáticos
anclados en la superficie celular que permiten
a los microorganismos que los poseen la unión
a sustratos lignocelulósicos y el aumento de la
eficiencia degradadora de la celulosa y las
hemicelulosas (Bayer et al., 2004).
15
Los celulosomas contienen una proteína no
catalítica de andamiaje (scaffolding protein)
que por un lado permite el anclaje a la
superficie celular a través de una proteína de
anclaje (anchoring protein), por otro contiene
dominios cohesina (cohesin modules) para unir
las diferentes enzimas hidrolíticas que forman
el celulosoma, y además puede contener
módulos de unión a carbohidratos (CBM). A
parte de esta proteína de andamiaje, los
celulosomas presentan una gran cantidad de
enzimas hidrolíticas que se unen mediante
dominios de ensamblaje o acoplamiento
(docking or dockerin domains) a los dominios
cohesina previamente mencionados (Bayer et
al., 2004). La mayoría de las enzimas que
forman parte de los celulosomas son celulasas,
pero también se encuentran xilanasas (Pason
et al., 2006), otras glicosil hidrolasas, y en
algunos casos incluso esterasas (Shoham et al.,
1999). Todas estas enzimas actúan de manera
sinérgica para degradar el sustrato
lignocelulósico, el cual resulta fácilmente
accesible gracias a las uniones que establecen
con él los CBM presentes tanto en la proteína
de andamiaje como en algunas de las
subunidades enzimáticas (Figura IN.1.6).
El termino xilanosoma ha sido propuesto para
designar aquellas agrupaciones enzimáticas
extracelulares similares a celulosomas, en que
las enzimas mayoritarias son xilanasas en
lugar de celulasas (Beg et al., 2001; Jiang et
al., 2005).
En cuanto a la regulación de la expresión de
xilanasas, generalmente no son enzimas
constitutivas, induciéndose su expresión al
crecer el microorganismo en medios que
contienen xilano o xilobiosa. La xilosa es el
principal inductor de la expresión de los genes
de xilanasas (Biely, 1985), de manera que para
que un microorganismo pueda aprovechar el
xilano del medio, son necesarios pequeños
niveles de expresión basal de xilanasas que
puedan degradar en cierta medida el xilano,
liberándose finalmente las cantidades de xilosa
suficientes para inducir la expresión de las
Figura IN.1.6: Representación esquemática de un celulosoma.
Xilanasas
Celulasas
CBMCBM
Microorganismo
Xilano
Xilano
Celulosa
Proteína de anclaje
Proteína de andamiaje
Dominios cohesina
Dominios de acoplamiento
16
xilanasas (Kulkarni et al., 1999; Stülke y
Hillen, 2000).
Además, en la mayoría de microorganismos la
expresión de xilanasas está sometida a
represión por catabolito, a través de la acción
del represor CreA (Cho y Choi, 1999; De
Vries y Visser, 2001), equivalente a CcpA en
especies del género Bacillus (Stülke y Hillen,
2000). Esto permite la utilización de fuentes de
carbono más fácilmente asimilables (como
glucosa y xilosa) cuando éstas se encuentran
disponibles en el medio.
De esta manera, la xilosa juega un doble papel
como regulador de la expresión de xilanasas,
en función de su concentración: a bajas
concentraciones de xilosa, ésta actúa como
inductor de la expresión de xilanasas, ya que
sólo ejerce una represión débil a través del
sistema CreA; pero a altas concentraciones, la
xilosa actúa reprimiendo la expresión de genes
xilanolíticos (a través del sistema CreA)
(De Vries et al., 1999).
No obstante, existen excepciones, como por
ejemplo una de las xilanasas de Bacillus
subtilis (Lindner et al., 1994) que presenta
expresión constitutiva durante el crecimiento
exponencial.
1.4.2. Clasificación de las xilanasas
Como ya se ha comentado, dada la
complejidad y heterogeneidad del xilano,
existe una gran variedad de xilanasas distintas,
que se diferencian en cuanto a su especificidad
de sustrato, su secuencia y su estructura.
En general, las xilanasas, tanto de bacterias
como de hongos, son mayoritariamente
monoméricas, y ampliamente variables en
cuanto a su peso molecular y punto
isoeléctrico (pI).
En base al peso molecular y el punto
isoeléctrico, Wong y colaboradores (1988)
dividieron las xilanasas en dos grupos:
– Un primer grupo de xilanasas de bajo peso
molecular (menos de 30 kDa) y pI alcalino.
– Un segundo grupo de xilanasas de mayor
peso molecular (más de 30 kDa) y pI
ácido.
Progresivamente, el número de xilanasas
caracterizadas fue en aumento, de manera que
empezaron a describirse enzimas con
características intermedias, y que por tanto no
encajaban en ninguno de estos dos grupos.
Gilkes y colaboradores (1991) realizaron un
estudio de las secuencias de xilanasas y
celulasas. Atendiendo principalmente a
homologías de secuencia, estas enzimas se
clasificaron en 9 familias, quedando las
xilanasas distribuidas en las familias F y G:
– La familia F incluye las xilanasas del
grupo de mayor peso molecular y bajo pI
definido por Wong y colaboradores (1988),
además de otras xilanasas y otras enzimas
como exocelulasas y endo-β-1,3-xilanasas.
– La familia G es una familia formada
exclusivamente por xilanasas, entre las que
se incluyen las xilanasas de bajo peso
17
molecular y alto pI (Wong et al., 1988),
además de otras xilanasas.
Posteriormente, las glicosil hidrolasas se
clasificaron en 35 familias en base a
comparación de secuencias (Henrissat, 1991) y
al análisis de las regiones de hidrofobicidad de
las mismas (Henrisat y Bairoch, 1993, 1996).
Estudios posteriores han corroborado que, tal
como sugerían éstos y otros autores en
estudios previos (Chothia y Lesk, 1986), existe
una correlación entre la secuencia primaria de
una proteína y su conformación
tridimensional.
Actualmente existen más de 100 familias de
glicosil hidrolasas (Carbohydrate Active
enZYmes database, http://www.cazy.org/;
Coutinho y Henrissat, 1999), las cuales se
encuentran agrupadas en diferentes clanes o
superfamilias (grupos de familias que
comparten un motivo de plegamiento terciario,
aminoácidos catalíticos conservados y similar
mecanismo catalítico; hechos que sugieren un
origen evolutivo común).
En base a esta clasificación, las xilanasas
quedan distribuidas en las familias 10 y 11,
que se corresponden con las familias F y G de
Gilkes y colaboradores (1991).
La diferencia entre estas 2 familias de
xilanasas se encuentra principalmente a nivel
de secuencia y estructura tridimensional, no
existiendo diferencias importantes a nivel de
sus características catalíticas. No obstante, las
diferencias estructurales influyen de manera
determinante en algunas características físico-
químicas de estas enzimas. Así, la estructura
tridimensional del centro activo de las
xilanasas de la familia 10 hace que estas sean
menos estrictas en cuanto al sustrato y más
activas sobre xilooligosacáridos de bajo grado
de polimerización que las xilanasas de la
familia 11 (Biely et al., 1997; Leggio et al.,
2000; Sabini et al., 2001).
Un pequeño número de xilanasas
caracterizadas más recientemente no presenta
homología de secuencia con las familias
clásicas de xilanasas 10 u 11, y en su lugar
presentan homología con otras familias de
glicosil hidrolasas, como las familias 5, 7, 8 y
43 (Collins et al., 2005).
Por último, cabe mencionar que se ha descrito
un tipo de xilanasas con un modo de acción
tipo exo, que se han denominado exoxilanasas
(Reilly, 1981; Kubata et al., 1995). En estas
enzimas, el ataque de la molécula de xilano se
produciría a partir de un extremo de la misma
(y no en el interior de la molécula como
sucede en las endoxilanasas), generándose un
único tipo de xilooligosacárido como producto
de la hidrólisis del xilano. Este modo de
acción equivaldría a la degradación procesiva
de celulosa por parte de las exocelulasas
(Sánchez et al., 2003). De todas formas, la
existencia de auténticas exoxilanasas no ha
sido admitida unánimemente debido a que un
mecanismo catalítico de este tipo requeriría
18
primero la eliminación de todos los
sustituyentes laterales de la cadena de xilosas.
Por ello, el uso del término exoxilanasas no es
aceptado formalmente.
1.4.3. Mecanismo catalítico
El mecanismo catalítico de la mayoría de
glicosil hidrolasas consiste o bien en un
desplazamiento simple (que produce la
inversión de la configuración anomérica), o
bien en un doble desplazamiento (que conlleva
la retención de la configuración anomérica)
(Rye y Withers, 2000; Yip y Withers, 2004).
En el caso de las xilanasas de las familias 10 y
11 el mecanismo utilizado en la hidrólisis del
sustrato es el de doble desplazamiento con
retención de la configuración anomérica
(β→β) (Figura IN.1.7).
En la hidrólisis del enlace glucosídico por este
mecanismo intervienen 2 residuos glutamato
conservados del centro activo de la xilanasa,
separados entre sí 5,4 - 5,5 Å, actuando uno de
ellos como catalizador ácido/base y el otro
como residuo nucleófilo (Davies y Henrissat,
1995).
Figura IN.1.7: Mecanismo catalítico de retención en xilanasas de las familias 10 y 11.
A
B
C
19
Una vez el esqueleto de xilosas ha sido
posicionado correctamente entre los dos ácidos
glutámicos catalíticos, uno de ellos (el
catalizador ácido/base) realiza un ataque ácido
sobre el enlace glucosídico, protonando el
oxígeno de dicho enlace, mientras el otro
glutamato realiza un ataque nucleofílico sobre
el carbono anomérico del enlace
(Figura IN.1.7.A). El resultado de este primer
paso es la liberación de uno de los productos
de reacción y la formación de un intermediario
α-glicosilo-enzima.
A continuación, el glutamato ácido/base pasa a
actuar como base, “robándole” un protón a una
molécula de agua, lo que permite que ésta
ataque el enlace entre el glutamato nucleófilo
y el carbono anomérico (Figura IN.1.7.B),
produciendo su hidrólisis, y dando como
resultado un producto cuyo carbono anomérico
vuelve a la misma configuración que en el
sustrato (β→β), liberándose la enzima de su
unión al sustrato para poder iniciar un nuevo
proceso de catálisis (Figura IN.1.7.C) (Davies
y Henrissat, 1995; Collins et al., 2005).
En el caso de las xilanasas pertenecientes a las
familias 5 y 7, el mecanismo catalítico es
similar al de las familias 10 y 11.
Por el contrario, las enzimas de las familias 8 y
43 de glicosil hidrolasas (entre las que se
incluyen algunas xilanasas de reciente
caracterización) utilizan el mecanismo de
desplazamiento simple, lo que comporta la
inversión de la configuración del carbono
anomérico (β→α). En este caso, los residuos
aminoacídicos implicados en la hidrólisis del
enlace glucosídico no serían dos glutamatos
sino un glutamato y un aspartato, actuando uno
como catalizador ácido y otro como
catalizador básico.
En este tipo de hidrólisis en un solo
desplazamiento, es necesaria una distancia
mayor entre los aminoácidos catalíticos
(alrededor de 9,5 - 10 Å), para que entre ellos
se pueda disponer el sustrato con el enlace
glucosídico a romper junto con una molécula
de agua que ha de posicionarse entre el
carbono anomérico de dicho enlace y el
catalizador básico (Figura IN.1.8).
Figura IN.1.8: Mecanismo catalítico de inversión en glicosil hidrolasas de las familias 8 y 43.
A B
9,5 Å
Ácido
Intermediario temporal
Base
Base
Ácido
20
1.4.4. Estructura
1.4.4.1. - Arquitectura Molecular
Atendiendo a su arquitectura molecular, al
igual que muchas otras enzimas, las xilanasas
se pueden dividir en:
– Enzimas de un sólo dominio estructural y
funcional: sólo contienen el dominio
catalítico. La xilanasa Xyn10A de Bacillus
halodurans (Hatti-Kaul et al., 2006), con
su único dominio catalítico perteneciente a
la familia 10 de glicosil hidrolasas sería un
ejemplo.
– Enzimas multidominio o modulares:
además del dominio catalítico contienen
otros dominios unidos entre sí mediante
secuencias conectoras (linkers). Estos
dominios no catalíticos independientes
pueden ser:
• Módulos de unión a carbohidratos
(carbohydrate binding modules,
CBM), que permiten la unión a
celulosa (cellulose binding domains,
CBD), a xilano (xylan binding
domains, XBD), o a otros
carbohidratos poliméricos.
• Dominios de ensamblaje o
acoplamiento (docking domains), para
mediar la unión a proteínas de
andamiaje de celulosomas o
xilanosomas.
• Dominios con funciones no totalmente
conocidas, como los dominios SLH
(surface layer homology domains) (St.
John et al., 2006a) o los dominios Fn3
(fibronectin type 3-like repeats)
(Kataeva et al., 2002).
La xilanasa XynC de Paenibacillus
barcinonensis (Blanco et al., 1999) sería
un ejemplo de xilanasa multidominio.
En las xilanasas modulares los dominios más
abundantes después de los dominios catalíticos
son los módulos de unión a carbohidratos
(CBM), que median la unión de estas enzimas
a carbohidratos. Estos CBM se encuentran
clasificados en familias en base a similitud de
secuencia de aminoácidos (Boraston et al.,
2004). En general son bastante específicos en
cuanto al tipo de carbohidrato que reconocen,
pero existen variaciones en esta afinidad.
Los primeros CBM que se caracterizaron
fueron los dominios de unión a celulosa
(CBD), que median la unión a diferentes
formas de celulosa amorfa o cristalina, y
además pueden ayudar a desorganizar las
microfibrillas de celulosa cristalina, facilitando
la acción de las celulasas (Linder y Teeri,
1997; Tomme et al., 1998). La eliminación de
los CBD puede disminuir la actividad
hidrolítica de las celulasas. Así, como ejemplo,
en el caso de los CBD de la familia IIIc
(CBM3c) asociados a dominios glicosil
hidrolasa de la familia 9, su eliminación causa
una drástica disminución de la capacidad
hidrolítica de estas celulasas sobre celulosa
cristalina, ya que la función de estos CBM3c
sería ayudar a la aproximación del sustrato al
centro activo de la enzima, y en algunos casos,
ayudarían también a que estas enzimas
21
actuaran de manera procesiva sobre el sustrato
(Irwin et al., 1998; Bayer et al., 2000).
Existen también CBM que median la unión a
xilano: dominios de unión al xilano (XBD).
Uno de los primeros XBD identificados fue el
de la xilanasa D (XylD) de Cellulomonas fimi
(Black et al., 1995). Dentro de este grupo de
CBM, se incluyen también dominios
previamente considerados como putativos
dominios de termoestabilidad (Clarke et al.,
1996; Blanco et al., 1999), que posteriormente
han sido identificados como dominios de
unión a xilano (Sunna et al., 2000),
clasificándose dentro de la familia CBM22.
Además de los CBD y los XBD
(Figura IN.1.9), se han identificado otros CBM
que median la unión a otros carbohidratos
como la quitina, el almidón, los mananos, los
galactanos y algunos glicanos de superficie
celular (Boraston et al., 2004).
1.4.4.2. - Estructura Tridimensional
Existe gran cantidad de xilanasas fúngicas y
bacterianas de las familias 10 y 11 cuya
estructura tridimensional ha sido resuelta, y
también, aunque en menor número, ha sido
determinado experimentalmente el
plegamiento de bastantes xilanasas de las
familias 5 y 8.
Las familias 5 y 10 de glicosil hidrolasas son
miembros del clan GH-A, junto a otras 15
familias más. El clan o superfamilia, es un
nivel jerárquico de clasificación superior a la
familia, que engloba a aquellas familias de
proteínas que comparten una estructura
terciaria similar, y que a su vez conservan los
aminoácidos catalíticos y el mecanismo
enzimático. Así, mientras las familias agrupan
proteínas principalmente en función de su
similitud de secuencia, los clanes o
superfamilias agrupan familias de proteínas
básicamente en función de sus similitudes
estructurales (Henrissat y Bairoch, 1996).
Los miembros del clan GH-A, a pesar de sus
diferencias en tamaño y secuencia, presentan
Figura IN.1.9: (A) Estructura en β jelly roll (típica de gran número de CBMs) de un CBD de la familia IV (CBM4) unido a celopentaosa (Boraston et al., 2002), y (B) de un XBD de la familia XIII (CBM13) con plegamiento en β trefoil de 12 hebras β (Notenboom et al., 2002).
A
B
22
un dominio catalítico de 250 a 450
aminoácidos con un plegamiento de tipo barril
(α/β)8 o TIM-barrel, consistente en 8 regiones
de conformación β dispuestas en el interior en
forma cilíndrica o de barril, rodeadas a su vez
de 8 hélices α. Asimismo, los miembros de
este clan tiene un surco catalítico altamente
conservado.
En el caso de las xilanasas de la familia 10, la
mayoría son enzimas multidominio que
presentan dominios de unión a carbohidratos
enlazados mediante linkers flexibles al
dominio catalítico. Posiblemente ha sido la
presencia de estos linkers flexibles la que ha
dificultado la cristalización y obtención de
estructuras tridimensionales de xilanasas
modulares completas de esta familia. Así,
salvo en los casos concretos de Xyn10A de
Streptomyces olivaceoviridis (Fujimoto et al.,
2000) y de Xyn10C de Cellvibrio japonicus
(Pell et al., 2004a), el resto de estructuras
resueltas para miembros de la familia 10
corresponden a dominios individuales
cristalizados por separado (Figura IN.1.10).
Respecto a la familia 5, se ha resuelto la
estructura de la xilanasa A de Erwinia
chrysanthemi, la cual contendría, además del
dominio catalítico con estructura de barril
(α/β)8, un putativo dominio de unión a xilano
en su región C-terminal (Larson et al., 2003).
Así pues, la estructura de esta xilanasa de la
familia 5 podría confundirse con la de una
xilanasa de la familia 10 (Figura IN.1.11). La familia 11 de glicosil hidrolasas pertenece
al clan GH-C, al cual pertenece también la
familia 12, formada básicamente por celulasas.
Figura IN.1.10: Estructura 3D de la xilanasa multidominio Xyn10C de Cellvibrio japonicus (Pell et al., 2004a) perteneciente a la familia 10 de glicosil hidrolasas (GH10). Se puede observar el modulo de unión a carbohidratos (CBM), a la izquierda, y el dominio catalítico con plegamiento en barril (α/β)8, a la derecha.Entre ambos dominios debería observarse el linker, pero su elevada flexibilidad dificulta su resolución estructural.
Figura IN.1.11: Estructura 3D de la xilanasa multidominio XynA de Erwinia chrysanthemi (Larson et al., 2003) perteneciente a la familia 5 de glicosil hidrolasas (GH5). Se puede observar en C-terminal, a la izquierda, un putativo modulo de unión a carbohidratos (CBM) además del dominio catalítico con plegamiento en barril (α/β)8, a la derecha.
23
Las xilanasas de la familia 11 presentan
dominios catalíticos de 180 a 200 aminoácidos
que se pliegan en una conformación de
lámina β curvada sobre sí misma, conocida
como β jelly roll (Figura IN.1.12).
Estas xilanasas suelen contener únicamente el
dominio catalítico, aunque hay excepciones,
como el caso de TfxA de Thermomonospora
fusca que posee un CBM unido al dominio
catalítico (Irwin et al., 1994).
Actualmente, sólo se conoce la estructura de 2
xilanasas de la familia 8, la xilanasa psicrófila
pXyl de Pseudoalteromonas haloplanktis y la
supuesta exoxilanasa Rex (también
denominada xilanasa Y) de Bacillus
halodurans C-125 (Van Petegem et al., 2003;
Honda y Kitaoka, 2004; respectivamente).
Esta familia de glicosil hidrolasas pertenece al
clan GH-M, conjuntamente con la familia 48
de glicosil hidrolasas. Al igual que en el resto
de proteínas de dicho clan, el dominio
catalítico de estas xilanasas presenta un
plegamiento en barril (α/α)6, consistente en 6
hélices α en el centro del barril, rodeadas por
otras 6 hélices α (Figura IN.1.13). Este
plegamiento también está presente en otras
glicosil hidrolasas que usan el mecanismo
catalítico de inversión, como las pertenecientes
al clan GH-L (familias 15 y 65) y a la
familia 9.
No se conoce la estructura de las xilanasas de
las familias 7 y 43, aunque es de esperar que la
xilanasa A de Penicillium funiculosum,
perteneciente a la familia 7, presente un
dominio catalítico con plegamiento en β jelly
roll, como las enzimas ya cristalizadas de esta
familia (Figura IN.1.14); y que igualmente las
xilanasas de la familia 43 presenten un
dominio catalítico con plegamiento muy
Figura IN.1.12: Estructura 3D de la xilanasa Xyn11X de Bacillus subtilis B230, de la familia 11 de glicosil hidrolasas (GH11) (Oakley et al., 2003). Se puede observar el plegamiento en β jelly roll del dominio catalítico.
Figura IN.1.13: Estructura 3D de la xilanasa pXyl de la bacteria antártica Pseudoalteromonas haloplanktis (Van Petegem et al., 2003), perteneciente a la familia 8 de glicosil hidrolasas (GH8). Se puede observar el plegamiento en barril (α/α)6 del dominio catalítico.
24
parecido al que presentan las proteínas ya
cristalizadas de la familia 43, denominado
5-fold β-propeller (o 5-blade β-propeller), y
consistente en un superbarril de 5 laminas β
antiparalelas formadas cada una por 4 hebras β
(Collins et al., 2005) (Figura IN.1.15).
1.4.4.3. - Estructura del centro activo
Las estructuras de diferentes xilanasas salvajes
y mutantes unidas a oligosacáridos e
inhibidores han permitido estudiar el centro
activo de estas enzimas, cómo se une el
sustrato a éste, y el mecanismo de catálisis
(Leggio et al., 2000; Sabini et al., 2001).
El centro activo de las xilanasas consiste en
una hendidura más o menos profunda,
localizada en la superficie de la proteína, y
generalmente bastante amplia. Estas
características concuerdan con el modo de
acción de tipo endo de las xilanasas.
Normalmente esta hendidura catalítica o surco
catalítico contiene entre cuatro y siete subsitios
de unión.
Los subsitios de unión se encargan de
posicionar correctamente los anillos de
xilopiranosa del sustrato de manera que el
enlace a hidrolizar quede a la distancia y en la
orientación correctas respecto a los
aminoácidos catalíticos.
Estos subsitios de unión se designan por un
número que depende de su posición respecto a
los aminoácidos del centro catalítico:
Figura IN.1.14: Estructura 3D de la endoglucanasa I (EG I) del hongo termófilo Fusarium oxysporum (Sulzenbacher et al., 1997), perteneciente a la familia 7 de glicosil hidrolasas (GH7). Se puede observar el plegamiento en β jelly roll del dominio catalítico.
Figura IN.1.15: Estructura 3D de la exoarabinanasa Arb43A de Cellvibrio japonicus (Proctor et al., 2005), perteneciente a la familia 43 de glicosil hidrolasas (GH43). Se puede observar el plegamiento en 5-fold β-propeller del dominio catalítico.
25
– Los subsitios más cercanos al centro
catalítico reciben un número más bajo,
comenzando por +1 ó -1. Los subsitios +1
y -1 flanquean el enlace a hidrolizar.
– Los situados hacia el extremo no reductor
del sustrato reciben números negativos, y
los situados hacia el extremo reductor del
sustrato (aglycone) números positivos.
De estos subsitios, son el -1 y el -2 los más
conservados en las familias 10 y 11 de
xilanasas, siendo mucho más variables los
subsitios positivos.
A parte de las similitudes, existen también
diferencias estructurales importantes en el
centro activo entre las xilanasas de la familia
10 y la familia 11. Así, en las xilanasas de la
familia 10 el lugar de unión al sustrato es una
hendidura poco profunda (shallow groove),
mientras que en las de la familia 11 el lugar de
unión al sustrato es una hendidura más
profunda (deep cleft).
Estas diferencias estructurales en la hendidura
catalítica hace que las xilanasas de la familia
10 sean menos estrictas en cuanto al sustrato,
mostrando una mayor versatilidad catalítica
que las xilanasas de la familia 11. Esta menor
especificidad de sustrato permite que algunas
xilanasas de la familia 10 muestren actividad
sobre sustratos celulósicos tales como los
aril-celobiósidos (Biely et al., 1997).
Además, las xilanasas de la familia 10 son más
activas sobre xilooligosacáridos de bajo grado
de polimerización, y liberan productos de
hidrólisis más pequeños a partir de
glucuronoxilano y xilano β-1,3-β-1,4
(rhodimenano), lo que indicaría la existencia
de un sitio de unión más pequeño en estas
xilanasas (Kolenová et al., 2005).
La estructura del centro activo también resulta
importante a la hora de discriminar
sustituyentes laterales en la cadena de xilano.
Se ha descrito que las xilanasas de la familia
11 acostumbran a hidrolizar regiones no
sustituidas de la cadena de xilosas, mientras
que las xilanasas de la familia 10 son capaces
de degradar el polisacárido en aquellas
regiones con sustituyentes laterales (Leggio et
al., 2000; Sabini et al., 2001).
Estudios recientes, en los cuales se han
cristalizado xilanasas de la familia 10
acomplejadas con sustratos que contenían
diferentes sustituyentes laterales, han
permitido comprobar como las xilanasas de
esta familia presentan subsitios de unión al
sustrato capaces de acomodar sustituyentes de
α-L-arabinofuranosa y ácido
4-O-metil-α-D-glucurónico (los más
abundantes), permitiendo además evitar la
formación de productos de punto muerto
(dead-end) y facilitando la posterior actuación
de enzimas desramificantes, como las
α-D-glucuronidasas, sobre los productos
sustituidos resultantes (Pell et al., 2004b).
Algunos autores llegan incluso a sugerir que
algunos de estos sustituyentes laterales
actuarían como determinantes de especificidad
para esta familia de xilanasas, debido a las
estrechas interacciones que se han observado
26
entre estos sustituyentes y los subsitios de
unión del centro activo que los acomodan
(Vardakou et al., 2005).
1.4.5. Aplicaciones de las xilanasas
Los sistemas enzimáticos microbianos
suponen actualmente un importante potencial
biotecnológico aplicable en numerosas
industrias en el ámbito de las denominadas
tecnologías limpias o tecnologías sostenibles.
En ellas se han introducido etapas
biotecnológicas en procesos productivos
convencionales para dar lugar a unos procesos
de producción alternativos de impacto
ambiental minimizado. Las industrias que más
se han beneficiado o se pueden beneficiar de la
aplicación de enzimas son principalmente las
papeleras, textiles, agrícolas y de alimentación,
aunque recientemente está aumentando el
interés por parte de industrias de
bioconversión y síntesis de nuevos
compuestos.
En este sentido, las hemicelulasas bacterianas,
y en especial las xilanasas, tienen importantes
aplicaciones en la industria debido a su
enorme potencial para modificar y transformar
la lignocelulosa y otros materiales de la pared
celular vegetal, muy abundantes en la biomasa
vegetal, ampliamente utilizada como materia
prima en un gran número de procesos
industriales.
Fue en la década de los 80 del pasado siglo
XX cuando comenzó la aplicación
biotecnológica de xilanasas. Sus primeros usos
en este sentido consistieron en su adición a las
formulaciones de piensos animales,
expandiéndose después su utilización a las
industrias de alimentación, textil y papelera.
Desde entonces el uso biotecnológico de estas
enzimas se ha incrementado de manera
importante, cubriendo un amplio rango de
sectores industriales. Así, en la actualidad, las
xilanasas juntamente con celulasas y
pectinasas representan el 20% del mercado
global de enzimas industriales (Polizeli et al.,
2005).
El xilano está presente en grandes cantidades
en los desechos de las industrias
agroalimentarias, por lo que las xilanasas
juegan un papel importante en la
bioconversión de estos residuos ricos en
lignocelulosa (incluyendo residuos sólidos
urbanos) en xilosa y otros azúcares
fermentables para la producción de etanol
(biofuel) (Lee, 1997; Sun y Cheng, 2002; St.
John et al., 2006a). Otro campo prometedor
para el uso de xilanasas es la bioconversión de
xilano a xilitol, un edulcorante bajo en calorías
utilizado también en salud dental y como
laxante (Parajo et al., 1998; Polizeli et al.,
2005).
Otras aplicaciones potenciales de las xilanasas,
pero menos documentadas, incluyen su uso
como aditivos de detergentes, en la producción
de oligosacáridos farmacológicamente activos
como antioxidantes, en la preparación de
protoplastos a partir de células vegetales, y en
27
la síntesis de nuevos tensioactivos gracias a la
actividad transxilosidasa que poseen algunas
xilanasas (Bhat, 2000; Collins et al., 2005). En
la industria textil también pueden utilizarse las
xilanasas conjuntamente con las pectinasas
para degradar la hemicelulosa y pectina de
materias primas vegetales como lino o
cáñamo, liberándose así las fibras de celulosa
para la fabricación del tejido. Actualmente este
proceso se realiza mediante el enriado,
consistente en sumergir las fibras textiles en
agua para que puedan actuar los
microorganismos degradadores. El problema
del enriado por microorganismos es su lentitud
y dependencia de las condiciones
climatológicas, de manera que el empleo de
enzimas supondría una alta reproducibilidad
del proceso, mejor producción y mayor
resistencia de las fibras (Hoondal et al., 2002).
Tal como se ha mencionado anteriormente, las
xilanasas se utilizan ampliamente como
aditivos de piensos para animales
monogástricos (como cerdos y gallinas), junto
a otras enzimas despolimerizantes (celulasas y
pectinasas), para aumentar el valor nutricional
de los piensos. En estos casos, la degradación
de los arabinoxilanos contenidos en este tipo
de piensos reduce la viscosidad del material,
con lo que se facilita el tránsito intestinal y la
absorción de otros nutrientes, además de
potenciar la asimilación de los oligosacáridos
resultantes de la degradación del xilano
(Polizeli et al., 2005). De esta manera, se ha
observado que la incorporación de xilanasas en
piensos para pollos basados en trigo y centeno
aumenta la eficiencia de conversión de la
comida suministrada, y por tanto el peso de los
pollos (Bedford y Classen, 1992). Beneficios
similares pueden obtenerse en la alimentación
de cerdos gracias a dietas basadas en trigo
suplementadas con xilanasas y fosfolipasas
(Diebold et al., 2005).
En la industria vinícola y de zumos la
aplicación de xilanasas junto con pectinasas
facilita la extracción y clarificación del
producto final (Bhat, 2000). Además, estas
enzimas pueden incrementar la estabilidad de
la pulpa y la liberación de precursores
aromáticos. En este sentido, se ha comprobado
que el uso de levaduras recombinantes que
expresan la xilanasa XlnA de Aspergillus
nidulans permite obtener un vino con mayor
aroma afrutado (Ganga et al., 1999).
También pueden utilizarse xilanasas en la
elaboración de cervezas para reducir la
viscosidad y turbidez de éstas, y mejorar a la
vez el filtrado de la malta (Polizeli et al.,
2005).
Como aditivos en panificación, las xilanasas
degradan las hemicelulosas de la harina, lo que
resulta en una redistribución del agua de los
pentosanos al gluten, hecho que acaba
comportando un aumento del volumen y de la
calidad de la miga, además de un aumento en
la durabilidad del pan (Linko et al., 1997).
Estos efectos pueden incrementarse aún más si
se usan amilasas en combinación con las
xilanasas (Monfort et al., 1996).
28
Actualmente, la principal aplicación industrial
de las xilanasas se da en la industria papelera.
En ella, el tratamiento con xilanasas de la
pasta de papel, previo al blanqueo químico,
comporta importantes beneficios económicos y
ventajas medioambientales (Viikari et al.,
1994, 2001; Bajpai, 2004).
Un elevado porcentaje de las pastas papeleras
son obtenidas por el proceso de cocción kraft
(altas temperaturas y condiciones alcalinas),
que tiene por objetivo liberar las fibras de
celulosa mediante la solubilización de la
lignina. Pero la lignina residual, que queda en
la pasta de papel tras la cocción kraft, produce
un color oscuro, por lo que la pasta de papel ha
de someterse a un tratamiento de blanqueo
para poder fabricar papel de calidad. El
proceso de blanqueo se realiza
tradicionalmente con cloro y derivados
clorados (hipoclorito y dióxido de cloro), que
reaccionan con la lignina y la solubilizan,
dando lugar a la formación de compuestos
organoclorados (AOX: adsorbable organic
halogens), los cuales resultan altamente
tóxicos.
Las xilanasas no eliminan directamente los
cromóforos de lignina residual, pero facilitan
su extracción de la pasta de papel al degradar
el xilano, presente en los complejos
xilano-lignina o reprecipitado sobre las fibras
tras la cocción kraft. De esta manera, la
aplicación de xilanasas potencia el blanqueo
químico posterior, por lo que su utilización
permite reducir un 20 - 25% el empleo de
cloro para obtener el mismo grado de blancura
y calidad en la pasta de papel, reduciéndose de
esta forma la generación de residuos
organoclorados (AOX) un 15 - 20% (Viikari et
al., 2001; Bajpai, 2004). Además, la reducción
en la cantidad de agentes químicos requeridos
para el blanqueo ha contribuido a la
sustitución del cloro elemental (Cl2) por el
dióxido de cloro (ClO2), mucho menos
contaminante, dando lugar a las secuencias de
blanqueo ECF (elemental chlorine free), o
incluso a la eliminación total de compuestos
clorados y su reemplazo por otros agentes
blanqueantes como el peróxido de hidrógeno
(H2O2) y el ozono (O3), en las denominadas
secuencias de blanqueo TCF (total chlorine
free).
Se ha evaluado la actividad como
potenciadoras del blanqueo de diferentes
xilanasas fúngicas y bacterianas, observándose
que a pesar de la elevada eficiencia de muchas
de las enzimas ensayadas, existen notables
diferencias entre ellas, en función de la familia
a que pertenecen y de las características
particulares de cada xilanasa (factores
endógenos de la enzima) (Elegir et al., 1995;
Clarke et al., 1997). Asimismo, se ha
constatado que el tipo de madera utilizada, el
método de pasteado y la secuencia de
blanqueo elegida (factores exógenos) también
influyen de manera significativa en la
eficiencia de las xilanasas (Suurnäkki et al.,
1996; Christov et al., 2000). En la actualidad
existen diversas xilanasas microbianas
29
disponibles en el mercado que se utilizan de
manera regular para el blanqueo en empresas
papeleras (Beg et al., 2001).
La aplicación de xilanasas en el blanqueo de
pastas papeleras puede modificar las
propiedades del refino de éstas, observándose
en algunos casos que las pastas tratadas
enzimáticamente requieren un mayor número
de revoluciones en el proceso de refinado para
alcanzar las mismas propiedades que las pastas
no tratadas (Vicuña et al., 1995). También se
ha observado que la hidrólisis del xilano ayuda
al desgote posterior de las pastas, durante la
elaboración del papel, ya que se reduce la
retención de agua por las hemicelulosas. En
cualquier caso, las propiedades físicas de
resistencia del papel obtenido no se ven
afectadas de manera significativa por la
aplicación de xilanasas (Roncero et al., 2003).
En relación con el efecto de las xilanasas sobre
la blancura del papel, se ha visto que su
utilización puede reducir además el
envejecimiento o el amarilleamiento (la
reversión del grado de blancura) del papel
procedente de pastas kraft. La reversión del
grado de blancura en pastas blanqueadas se
debe en gran medida a la temperatura de
conservación del papel y a la presencia en éste
de ácidos hexenurónicos (HexA). Estos HexA
se pueden originar a partir de los grupos de
ácido 4-O-metil-α-D-glucurónico, presentes en
los xilanos, durante el proceso de cocción kraft
(Figura IN.1.16); de manera que al reducir el
xilano de estas pastas mediante el uso de
xilanasas se reduce también el contenido de
HexA y por tanto puede aumentar la
estabilidad del papel frente al envejecimiento
(Buchert et al., 1997).
A parte de las xilanasas, se han ensayado otras
hemicelulasas en el blanqueo de pastas
papeleras, obteniéndose diversos resultados.
Se ha observado así que las β-mananasas
también facilitan el blanqueo al ayudar a
eliminar la lignina residual y aumentar el
grado de blancura del papel. Sin embargo,
generalmente el efecto de las β-mananasas
sobre la blancura no es tan pronunciado como
el de las xilanasas (Bhat, 2000; Montiel et al.,
2002).
Otra estrategia más reciente para el blanqueo
enzimático de pastas papeleras consiste en
eliminar directamente la lignina residual
utilizando para ello enzimas degradadoras de
lignina (lacasas y peroxidasas). Los avances en
el conocimiento del modo de actuación de
Figura IN.1.16: Formación de ácido hexenurónico (derecha) a partir de ácido 4-O-metil-α-D-glucurónico (izquierda) presente en el xilano (Petit-Breuilh et al., 2004).
30
estas enzimas ha permitido ensayar con éxito
lacasas fúngicas y de Streptomyces para el
blanqueo (Burbonnais et al., 1997; Arias et al.,
2003; Sigoillot et al., 2005; González Arzola
et al., 2006), aunque en estos casos, es
necesaria la presencia de un mediador para
obtener buenos resultados.
Volviendo a las xilanasas y sus aplicaciones en
la industria papelera, es preciso comentar que
éstas no se restringen al blanqueo. Los buenos
resultados obtenidos en esta etapa del proceso
de elaboración del papel han propiciado su
ensayo en otras etapas, como pueden ser el
pasteado mecánico, el drenaje o desgote de la
pasta, o el destintado de las fibras de papel
reciclado. Los prometedores resultados
obtenidos están determinando una expansión
del uso de xilanasas en la industria, con el
consiguiente aumento de la importancia de
éstas en el mercado mundial de enzimas.
31
2 - O2 - OBJETIVOSBJETIVOS EE INTERÉSINTERÉS DELDEL
TRABAJOTRABAJO REALIZADOREALIZADO
Dado el interés de la aplicación de enzimas
como las xilanasas en la industria, en las
denominadas tecnologías limpias, así como el
interés por ampliar el conocimiento de los
aspectos básicos de biología molecular de
estas enzimas, el presente trabajo se enmarca
dentro de un proyecto más amplio que tiene
por objeto la búsqueda y caracterización de
enzimas microbianas con actividades
degradadoras sobre diferentes polímeros
vegetales y el estudio de su aplicación en
procesos industriales.
Por ello, nos planteamos dos objetivos
principales:
– Por un lado, la identificación y
caracterización de nuevas enzimas
xilanolíticas.
– Y por otro lado la sobreexpresión de
xilanasas y el estudio y mejora de sus
características, con el fin de posibilitar su
aplicación industrial.
Estos objetivos principales se concretaron en
los apartados que se describen a continuación.
2.1. Clonación e identificación de
xilanasas de Bacillus sp. BP-7
Con el fin de encontrar y caracterizar nuevas
xilanasas, los objetivos de este apartado
fueron:
- La construcción de una genoteca en
Escherichia coli de la cepa Bacillus sp.
BP-7, previamente aislada y caracterizada
en el grupo de investigación (López et al.,
1998), y la selección de los clones
recombinantes portadores de genes
codificantes de xilanasas.
- La identificación y caracterización genética
y bioquímica de las enzimas codificadas en
estos genes.
Los capítulos I y II del presente trabajo
abarcan estos objetivos.
2.2. Caracterización de la
xilanasa B (XynB) de
Paenibacillus barcinonensis y
sobreexpresión en huéspedes
homólogos
Uno de los factores necesarios para facilitar la
aplicación y el estudio de enzimas es que éstas
puedan obtenerse de manera económica y en
alta cantidad. Por ello son importantes los
ensayos de sobreexpresión de enzimas. Así
pues, los objetivos de este apartado fueron:
- El análisis detallado de la especificidad de
sustrato de la xilanasa B (XynB) de
Paenibacillus barcinonensis. Esta xilanasa
había sido previamente caracterizada en el
grupo de investigación y presentaba una
actividad sobre aril-xilósidos inusualmente
alta (Blanco et al., 1996).
32
- La clonación de XynB de Paenibacillus
barcinonensis en vectores lanzadera
E. coli - Bacillus subtilis para su
transformación en cepas huéspedes de
Bacillus subtilis y el estudio de su
expresión en las cepas recombinantes
obtenidas.
Estos objetivos quedan cubiertos por los
resultados que se presentan en el capítulo III.
2.3. Estudio estructural e
ingeniería de proteínas con XynB
de Paenibacillus barcinonensis
Para profundizar en el conocimiento de esta
enzima, así como para mejorar sus cualidades
para una posible aplicación en la industria, se
decidió realizar estudios de estructura-función
y experimentos de ingeniería de proteínas.
En base a esto, los objetivos generales de este
apartado fueron:
- El análisis estructural y el estudio de la
relación estructura-función en la xilanasa B
de Paenibacillus barcinonensis.
- Ensayos de mutagénesis dirigida y
mutagénesis aleatoria (PCR mutagénica y
gene shuffling) para aumentar la
termoestabilidad de la xilanasa B.
Los resultados presentados en el capítulo IV
del presente trabajo comprenden estos últimos
objetivos.
MMATERIALESATERIALES YY M MÉTODOSÉTODOS
35
1. M1. MICROORGANISMOSICROORGANISMOS UTILIZADOSUTILIZADOS
Las enzimas estudiadas en el presente trabajo
provienen de las cepas bacterianas
Paenibacillus barcinonensis BP-23 (Blanco
et al., 1993; Sánchez et al., 2005) y
Bacillus sp. BP-7 (López et al., 1998). Estas
cepas fueron aisladas a partir de suelo de
arrozal del Delta de L'Ebre (lugar rico en
materia vegetal en descomposición y por tanto
adecuado para aislar degradadores de celulosa
y xilano), mediante cultivos de
enriquecimiento en paja de arroz. Estas cepas
presentaban elevada actividad degradadora de
xilano, celulosa, pectina, tributirina y aceite de
oliva.
En los experimentos de clonación se usaron las
siguientes cepas huéspedes:
- Bacillus subtilis MW15 (Wolf et al.,
1995): es una cepa deficiente en las
proteasas neutra y alcalina, en una celulasa,
una lichenasa y una xilanasa. his nprR2
nprE18 ΔaprA3 ΔeglS102 ΔbglT-bglSRV
ΔxynA CmR.
- Bacillus subtilis MB216 (Lampen et al.,
1986): Stp leuA8 arg-15 thrA recE4 hsrR
hsrM.
- Escherichia coli 5K (Godessart et al.,
1988): F- rk- mk
- rpsL thr thi leu lacZ.
- Escherichia coli HB101 (Bolivar y
Backman, 1979): supE44 hsd20 rb- mb
-
recA56 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20
xyl-5 mtl-1.
- Escherichia coli XL1-Blue (Bullock et al.,
1987): recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17
supE44 relA1 lac [F′proAB lacIqZ∆M15
Tn10 (Tetr)].
- Escherichia coli DH5α (Hanahan, 1983):
F- φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169
deoR recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk
+) phoA
supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1.
- Escherichia coli BL21(DE3) (Studier y
Moffatt, 1986): contiene el lisógeno λDE3
en su cromosoma, por lo que es capaz de
expresar la ARN polimerasa de T7 al
añadirse al medio de cultivo IPTG. hsdS
gal (λcIts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7).
- Saccharomyces cerevisiae BY4741
(Andrés, 2003): MATa ura3Δ0 leu2Δ0
met15Δ0 his3Δ1.
- Saccharomyces cerevisiae mnn9
(Hernández et al., 1989): cepa deficiente en
glicosilación. MATa ura3Δ0 leu2Δ0
met15Δ0 his3Δ1 ypl050c::kanMX4.
2. C2. CULTIVOULTIVO YY MANTENIMIENTOMANTENIMIENTO DEDE
MICROORGANISMOSMICROORGANISMOS
2.1. Medios de cultivo
Los medios de cultivo más comúnmente
utilizados se describen en las Tablas MM.2.1 y
MM.2.2.
En el caso de medios sólidos, al medio líquido
correspondiente se añadía agar al 1,5%.
36
Tabla MM.2.1: Preparación de los medios de cultivo bacterianos comúnmente utilizados.
Composición por litro PreparaciónLB (Luria Broth) Bactotriptona 10 g
Extracto de levadura 5 gNaCl 10 gAgua destilada
Tras disolver se llevaba a pH 7 y se esterilizaba en autoclave.
Caldo nutritivo Extracto de carne 1 gExtracto de levadura 2 gPeptona 5 gNaCl 5 gAgua destilada
Tras disolver se llevaba a pH 7 y se esterilizaba en autoclave.
BREC1(Overbeeke et al., 1990)
NH4Cl 8 gKH2PO4 4 gMgSO4·7H2O 1 gSacarosa 40 gNaCl 2 gExtracto de levadura 10 gAgua bidestiladaSolución traza 1 mlSolución de vitaminas 1 ml
Se disolvían los 5 primeros componentes en agua y se autoclavaba. Se autoclavaba el extracto de levadura aparte, y se mezclaba todo antes de usar.
Solución traza para medio BREC1
Tritriplex III (EDTA) 45 gCaCl2 95% 4,37 gFeSO4·7H2O 3,75 gMnSO4·H2O 1,4 gZnSO4·7H2O 2,2 gCuSO4·5H2O 0,4 gCoCl2·6H2O 0,45 gNa2MoO4·2H2O 0,26 gH3BO3 0,4 gKI 0,26 gAgua destilada
Se disolvía el tritriplex llevando la solución a pH 8. Se añadían el resto de componentes previamente diluidos y se esterilizaba en autoclave.
Solución de vitaminas para medio BREC1
Biotina 0,05 gTiamina 5 gMeso-inositol 4,7 gClorhidrato de piridoxina 1,46 gÁcido D-pantoténico 23 gAgua destilada
Se disolvía y se esterilizaba por filtración.
MG (NH4)2SO4 2 gK2HPO4 14 gKH2PO4 6 gCitrato de sodio 1 gMgSO4·7H2O 0,2 gGlucosa 50% 10 mlHistidina al 0.5% 10 mlCasaminoácidos al 5% 4 ml
Se disolvían las sales de manera secuencial en agua destilada. Para medios sólidos se disolvía el agar en agua destilada aparte. Se autoclavaban por separado, se mezclaba a 50 ºC y se añadía la glucosa, la histidina y los casaminoácidos, previamente esterilizados.
MG2 (NH4)2SO4 2 gK2HPO4 14 gKH2PO4 6 gCitrato de sodio 1 gMgSO4·7H2O 0,2 gSacarosa 5 gHistidina al 0,5% 10 mlCasaminoácidos al 5% 4 ml
Se disolvían las sales de manera secuencial en agua destilada. En el caso de preparar medios sólidos se disolvía el agar en agua destilada aparte.Se autoclavaban por separado, se mezclaban a 50 ºC y se añadía la histidina y los casaminoácidos, previamente esterilizados.
37
Cuando el experimento lo requería los medios
se suplementaban con diferentes sustratos, a
las concentraciones finales indicadas: xilano
de madera de abedul (0,2 - 0,4%), xilano de
espelta de avena (1%), xilano-RBB (0,1%),
paja de arroz (1%), ácido poligalacturónico
(0,4%), CMC (Carboximetil Celulosa; 0,5%),
tributirina o aceite de oliva (1%).
Cuando era necesario se añadían antibióticos a
los medios de cultivo:
- Ampicilina: se preparó una solución
concentrada de ampicilina 100 mg/ml en
agua bidestilada a la que se añadió NaOH
hasta la completa solubilización de la
ampicilina, y se esterilizó por filtración. La
concentración final de uso en el medio era
de 50 ó 100 µg/ml.
- Tetraciclina: se preparó una solución
concentrada de tetraciclina 12,5 mg/ml en
etanol al 50%, y se esterilizó por filtración.
La concentración final en los medios era de
15 µg/ml.
- Cloramfenicol: se preparó una solución
concentrada de cloramfenicol 100 mg/ml en
etanol absoluto. La concentración final de
uso era de 5 - 50 µg/ml.
En ocasiones, para la selección de cepas
recombinantes de E. coli XL1-Blue y E. coli
DH5α, se usaron medios de cultivo
suplementados con IPTG (isopropil-β-
tiogalactopiranósido) y X-gal (5-bromo-4-
cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido):
- IPTG: se utilizaba como inductor de ls
expresión génica. Se preparó una solución
concentrada de IPTG 20 mg/ml en agua
bidestilada y se esterilizó por filtración. La
concentración final de uso era de
100 µg/ml.
- X-gal: sustrato cromogénico de la
β-galactosidasa. Se preparó una solución
concentrada de X-gal 200 mg/ml en
dimetilformamida. La concentración final
los medios era de 40 µg/ml.
Cuando se cultivaban en medio mínimo SD las
cepas S. cerevisiae BY4741 y S. cerevisiae
mnn9 sin haber sido transformadas con
plásmidos recombinantes que compensasen
Tabla MM.2.2: Preparación de los medios de cultivo de levaduras utilizados.
Composición por litro PreparaciónYPD Bactotriptona 20 g
Extracto de levadura 10 gGlucosa 20 gAgua destilada
Tras disolver se llevaba a pH 7 y se esterilizaba en autoclave.
SD (medio mínimo sintético para levaduras)
Base nitrogenada para levaduras (sin aminoácidos) 7 gGlucosa 20 gSulfato amónico 5 gAgua bidestilada
Tras disolver se llevaba a pH 6 y se esterilizaba en autoclave.Antes de utilizar se añadían los aminoácidos y nucleótidos necesarios (a concentraciones finales entre 0,002% y 0,008%).
38
sus auxotrofías, se suplementaba el medio con
los siguientes aminoácidos y nucleótidos:
– Histidina 0,0080%.
– Leucina 0,0020%.
– Uracilo 0,0035%.
– Adenina 0,0020%.
2.2. Mantenimiento de cepas
Las cepas de Bacillus y Paenibacillus se
mantenían a 4 ºC resembrándolas cada 15 días
en placas de Agar Nutritivo (suplementado con
los antibióticos necesarios), las cuales se
incubaban a 30 ºC durante unas 16 - 24 h.
Las cepas de E. coli se mantenían también a
4 ºC resembrándolas cada 30 días en placas de
Agar LB (suplementado con los antibióticos
necesarios), las cuales se incubaban a 37 ºC
durante unas 16 - 24 h.
Asimismo, todas las cepas se mantenían
también congeladas a -80 ºC en glicerol al
15 %.
2.3. Fraccionamiento celular
2.3.1. Sonicación
Fue el método habitual para pequeños
volúmenes de cultivo.
Las muestras de cultivos líquidos (5 - 10 ml)
de toda la noche de las cepas a estudiar, tras
medir su D.O.600nm, se centrifugaban para
sedimentar las células, usando para ello una
centrífuga de sobremesa, a 3000 r.p.m. durante
15 min a 4 ºC.
Se recuperaba los sobrenadantes (medio de
cultivo) en tubos aparte. Los pellets de células
se resuspendían en 1 ml de Ringer 1/4 para
lavar las células, se transferían a tubos
eppendorf, y se centrifugaban en una
centrífuga eppendorf a 14000 r.p.m. durante
10 min a 4 ºC para sedimentar nuevamente las
células, descartando el sobrenadante.
Para obtener los extractos celulares, las células
se resuspendían en 1/10 del volumen original
de tampón Tris-HCl 100 mM pH 7 y se lisaban
por sonicación mediante 2 pulsos de 2 min a
50 W. Después de sonicar no se centrifugaba,
de manera que los extractos obtenidos
contenían tanto el citoplasma celular como los
restos de membrana y pared bacterianas.
2.3.2. French Press
Fue el método habitual para grandes
volúmenes de cultivo.
Se repartían los cultivos líquidos (1 - 2 l) de
toda la noche de las cepas a estudiar en tubos
Beckman de 450 ml, y tras medir la D.O.600nm
se centrifugaba para sedimentar las células,
usando para ello una centrífuga Beckman
high-speed, a 7000 r.p.m. durante 15 min a
4 ºC.
Se recuperaban los sobrenadantes (medio de
cultivo) en tubos aparte. Para lavar las células,
los pellets se resuspendían en 50 ml de
Ringer 1/4 o tampón a pH 7, se transferían a
tubos Beckman de 35 ml, y se centrifugaba en
39
una centrífuga Beckman high-speed a
7000 r.p.m. durante 15 min a 4 ºC para
sedimentar las células, descartando el
sobrenadante.
Para obtener los extractos celulares, las células
se resuspendían en 50 ml de tampón a pH 7 y
se lisaban por presión, utilizando un aparato de
French Press, en el que se sometían las células
bacterianas a presiones de 1000 psi
(6894,76 kPa).
Después de lisar las células, se centrifugaba en
una centrífuga Beckman high-speed a
10000 r.p.m. durante 30 min a 4 ºC para
sedimentar las células no lisadas y la mayor
parte de restos celulares particulados, que se
descartaban. Los sobrenadantes resultantes
eran extractos celulares que contenían
básicamente la fracción citoplasmática.
2.3.3. Lisis celular seguida de
ultracentrifugación
Fue el método utilizado para la obtención de
fracciones celulares solubles desprovistas de
membranas.
Partiendo de extractos celulares obtenidos por
cualquiera de los métodos anteriores, se
repartían en tubos Beckman de 8 ml, y se
centrifugaban usando una ultracentrífuga
Beckman a 38000xg durante 1 h a 4 ºC.
3. E3. ENSAYOSNSAYOS DEDE ACTIVIDADACTIVIDAD ENZIMÁTICAENZIMÁTICA
3.1. Determinación de actividad
hidrolítica sobre polisacáridos
mediante el método de
Nelson-Somogyi
Este método permite cuantificar azúcares
reductores (extremos reductores), con lo que
permite valorar la actividad de enzimas
hidrolíticas que rompen polisacáridos
generando nuevos extremos reductores, como
es el caso de xilanasas, celulasas, pectinasas,
amilasas, liquenasas (Spiro, 1966).
Fue el método principalmente utilizado para
determinar las actividades enzimáticas que se
indican en la Tabla MM.3.3.
Para valorar la actividad hidrolítica sobre un
determinado polisacárido, las muestras
Tabla MM.3.3: Actividades enzimáticas ensayadas mediante el método de Nelso-Somogyi.
Actividad enzimática
Polisacáridos utilizados como sustrato en el ensayo
Xilanasa Principalmente xilano de madera de abedul, aunque también otros, como el xilano de espelta de avena y arabinoxilanos.
Celulasa Carboximetil Celulosa y Avicel
Pectinasa Pectina y ácido poligalacturónico
Amilasa Almidón
Liquenasa Liquenano
Laminarinasa Laminarina
40
(5 - 25 µl) se incubaban con una solución de
dicho polisacárido a una concentración final
del 0,5% en el tampón apropiado para obtener
el pH deseado, y a la temperatura adecuada
para cada enzima. El volumen final de
reacción era de 100 μl.
Por cada muestra se incubaban 3 tubos
eppendorf: 2 réplicas y un blanco (al cual la
muestra se añadía tras el reactivo de cobre).
Después de la incubación a una temperatura
adecuada para las enzimas a ensayar, durante
el tiempo necesario, se enfriaban los tubos en
hielo durante 5 min y se añadía agua
bidestilada hasta 250 µl.
A continuación se añadían 250 µl de reactivo
de cobre (el cual se preparaba inmediatamente
antes de usar mezclando Solución I y
Solución II en una proporción 4:1 en
volumen). Se mezclaba mediante vortex y se
calentaba al baño maría (a 100 ºC) durante
10 min. Esto permitía que se diera la reducción
del Cu2+ en función de las sustancias
reductoras del medio.
Tras enfriar en agua, se añadían 250 µl de
reactivo de arsenomolibdato (preparado
previamente a partir de una solución de
arsenomolibdato y una de H2SO4 1,5 N en una
proporción 1:2 en volumen). Se mezclaba
usando vortex y se añadían 750 μl de agua
bidestilada (volumen final de 1,5 ml).
Por último, se centrifugaba durante 5 min a
4 ºC para precipitar sólidos y evitar así
interferencias en la lectura espectrofotométrica
de la absorbancia de los sobrenadantes a
520 nm.
La valoración de la actividad se hacía frente a
una recta patrón del monosacárido que
constituía el polisacárido sobre el que se
evaluaba la actividad hidrolítica, preparado en
las mismas condiciones que en el ensayo de
actividad. Una unidad de actividad enzimática
se define como la cantidad de enzima que
libera 1 μmol de azúcar reductor por minuto en
las condiciones de ensayo.
Soluciones:
- Reactivo alcalino de cobre:
Solución I:(1 litro)
Tartrato sódico potásico 15 gNa2CO3 30 gNaHCO3 20 gNa2SO4 180 g
Para preparar la Solución I se disolvían
primero el tartrato sódico potásico y el Na2CO3
en agua bidestilada; y después se añadían el
NaHCO3 y el Na2SO4 ya disuelto en agua
bidestilada.
Solución II:(250 ml)
CuSO4·5H2O 5 gNa2SO4 45 g
Para preparar la Solución II se disolvían los
dos reactivos en agua bidestilada.
- Reactivo de arsenomolibdato:
Solución de arsenomolibdato:(500 ml)
(NH4)6Mo7O24·4H2O 25 gH2SO4 96% 21 mlNa2HAsO4·7H2O 3 gNaHCO3 20 g
Para preparar esta solución, se disolvía el
(NH4)6Mo7O24·4H2O en agua bidestilada, se
añadía el H2SO4 al 96%, se agitaba y se añadía
41
a continuación el Na2HAsO4·7H2O
previamente disuelto en agua bidestilada. Por
último, se incubaba a 37 ºC durante 24 - 48 h y
se guardaba en una botella opaca para
protegerla de la luz.
3.2. Ensayo cromogénico de
actividad xilanasa
El método utilizado es una modificación del
método descrito por Biely et al. (1998).
En este método se utiliza como sustrato de la
reacción el xilano-RBB (xilano-Remazol
Brilliant Blue), un xilano marcado con el
cromógeno Remazol Brilliant Blue R. Cuando
este sustrato es degradado por endoxilanasas y
se añade etanol precipitan los fragmentos de
alto peso molecular, mientras los fragmentos
de menor peso molecular liberados por el
enzima quedan en solución, pudiéndose medir
fotométricamente el color solubilizado.
Las ventajas respecto a los métodos basados
en la liberación de azúcares reductores son:
- No se ve interferido por sustancias
reductoras del medio.
- Es específico para endoxilanasas: las
enzimas de tipo exo no interfieren ni
producen falsos positivos.
Y las desventajas son:
- Es aproximadamente seis veces menos
sensible que el método de Nelson-Somogyi.
- El marcaje del xilano no puede ser
controlado de manera precisa, de manera
que cada lote de xilano-RBB ha de ser
estandarizado antes de utililizarse.
Para valorar la actividad xilanasa se incubaban
las muestras (50 - 125 µl) con xilano-RBB
(Sigma, 16% de marcaje) a una concentración
final del 5,92 mg/ml (equivalente a 0,5% de
xilano no marcado), en el tampón apropiado
para obtener el pH deseado, a la temperatura
adecuada y durante el tiempo necesario, en un
volumen final de 0,5 ml.
Por cada muestra se incubaban 3 tubos
eppendorf: 2 réplicas y un blanco.
Después de la incubación se añadía 1 ml
(2 volúmenes) de etanol absoluto y se
mezclaba. El etanol detenía la reacción y hacía
precipitar el sustrato no hidrolizado y los
fragmentos de alto peso molecular.
En este punto se añadía también la muestra al
blanco.
A continuación se mantenía 30 min a
temperatura ambiente (equilibración térmica
de las muestras), tras los cuales se centrifugaba
a 2000xg durante 3 min, y se recuperaba el
sobrenadante, sobre el cual se hacía la medida
de absorbancia a 595 nm (D.O.595).
La valoración de la actividad se hacía frente a
una recta patrón elaborada midiendo la D.O.595
de ensayos con concentraciones crecientes del
enzima en las mismas condiciones y
correlacionando los valores obtenidos con
cuantificaciones obtenidas mediante el método
Nelson-Somogyi de las mismas
concentraciones de enzima.
42
3.3. Ensayo de actividad sobre
aril derivados
Se utilizó un método fotométrico basado en el
uso de aril derivados como sustratos. Los aril
derivados utilizados en los ensayos del
presente trabajo, adquiridos a Sigma-Aldrich,
se recogen en la Tabla MM.3.4.
Estos aril derivados eran prácticamente
incoloros y estaban formados por un
sustituyente carbohidratado (por ejemplo
xilosa o glucosa) unido a un grupo arilo
(paranitrofenol, pNP, u ortonitrofenol, oNP),
simulando ser sustratos diméricos u
oligómeros cortos. La ruptura enzimática del
enlace entre el sustituyente y el grupo arilo,
permite la liberación de este este último en
forma soluble, la cual presenta coloración
amarilla que puede ser cuantificada
fotométricamente.
Para valorar la actividad de las enzimas sobre
estos sustratos, se incubaban las muestras
(5 - 50 µl) con el aril derivado a una
concentración final de 5 mg/ml (para los
ensayos de especificidad de sustrato), 5 mM
(para los ensayos de actividad rutinarios) o
variable (para los ensayos de cinética
enzimática), en el tampón apropiado para
obtener el pH deseado, en un volumen final de
0,25 ml, y a una temperatura adecuada para
cada enzima.
Por cada muestra se incubaban 3 tubos
eppendorf: 2 réplicas y un blanco (al cual la
muestra se añadía tras parar la reacción).
Después de incubar, los tubos se mantenían en
hielo durante 5 min, y a continuación se añadía
1 ml de Na2CO3 1 M a cada tubo para parar la
reacción.
Por último, se medía la absorbancia a 400 nm
(D.O.400nm) en un espectrofotómetro.
La valoración de la actividad se hacía frente a
una recta patrón de paranitrofenol u
ortonitrofenol (dependiendo del grupo arilo
presente en el aril derivado utilizado)
preparada en las mismas condiciones.
En los experimentos de cinética enzimática y
de termoestabilidad, se sustituyó el ensayo en
tubo eppendorf por un ensayo en placas de
microtiter de 96 pocillos, que permiten realizar
un mayor número de ensayos simultáneos. En
estos casos, el volumen final por pocillo era de
0,2 ml, y no se paraba la reacción con Na2CO3,
realizándose la lectura de absorbancia en el
lector de placas inmediatamente tras la
incubación.
Tabla MM.3.4: Aril derivados y su abreviatura.
Aril derivado Abreviatura
pNitrofenil-β-D-Xilopiranósido pNPXoNitrofenil-β-D-Xilopiranósido oNPXpNitrofenil-β-D-Glucopiranósido pNPGpNitrofenil-β-Celobiósido pNPG2pNitrofenil-β-Celotriósido pNPG3pNitrofenil-β-Celotetraósido pNPG4pNitrofenil-β-Celopentaósido pNPG5pNitrofenil-α-L-Arabinopiranósido pNAppNitrofenil-α-L-Arabinofuranósido pNAf
43
3.4. Determinación del pH óptimo
Para determinar el pH óptimo (pH al que una
enzima tiene máxima actividad), se hicieron
los ensayos de actividad enzimática, sobre los
sustratos adecuados, a diferentes pH en
intrrvalos de 0,5 puntos de pH, usando para
ello soluciones tampón distintas en función del
rango de pH a cubrir:
TampónRango de pH
cubiertoCitrato sódico 50 mM 3,0 - 4,0Acetato sódico 50 mM 4,0 - 6,0Fosfato sódico 50 mM 6,0 - 7,5Tris-HCl 50 mM 7,0 - 9,0Glicina sódica 50 mM 9,0 - 12,0
3.5. Determinación de la
temperatura óptima
Para determinar la temperatura óptima
(temperatura a la que una enzima muestra
máxima actividad), se hicieron los ensayos de
actividad enzimática, sobre los sustratos
adecuados, en amplio rango de temperaturas
en intervalos de 5 ó 10 ºC.
3.6. Cuantificación de la actividad
malato deshidrogenasa
La malato deshidrogenasa (MDH) es una
enzima intracelular del ciclo de Krebs, que por
tanto sólo se detecta en sobrenadantes de
cultivos bacterianos si existe lisis celular, de
manera que puede utilizarse como marcador
para cuantificar el porcentaje de lisis celular en
Bacillus subtilis.
La MDH cataliza la siguiente reacción
enzimática:
Oxalacetato + NADH + H+ ↔ Malato + NAD+
En nuestros experimentos, se cuantificó la
conversión de NADH + H+ a NAD+ midiendo
la absorbancia a 334 nm (midiendo pues el
decremento de NADH + H+).
A partir de cultivos líquidos se obtenían las
muestras a analizar: sobrenadantes de cultivo y
extractos celulares libres de restos celulares y
membranas.
La reacción enzimática se realizaba en una
cubeta espectrofotométrica de cuarzo, en la
que se mezclaban 1 ml de tampón fosfato
potásico 200 mM pH 7,8, la muestra (máximo
1,2 ml), agua bidestilada esterilizada hasta
2,2 ml y 100 μl de NADH 6 mM.
A continuación se hacía el blanco de
absorbancia a 334 nm, se añadían 100 μl de
oxalacetato potásico 14 mM, se mezclaba por
inversión y se hacía un seguimiento del
decremento de absorbancia a 334 nm durante
6 min a temperatura ambiente.
Además se hacía un control de oxidación del
NADH, sin muestra.
Las unidades de actividad MDH (mol/min) se
calculaban a partir de la pendiente de la recta
resultante y en función del coeficiente de
extinción molar del NADH a 334 nm
(6,11·103 M-1cm-1) según la siguiente fórmula:
U= D.O.334nm Muestra−D.O.334nmControl ×Volumen
Coeficienteextinciónmolar×1cm tiempo
44
El grado de lisis se expresó como el porcentaje
de actividad malato deshidrogenasa
extracelular (en sobrenadantes) respecto a la
actividad malato deshidrogenasa total (en
extractos celulares más sobrenadantes).
Soluciones:
Tampón fosfato potásico 200 mMpH 7,8:
K2HPO4 200 mM + KH2PO4
200 mM hasta pH 7,8
Oxalacetato potásico 14 mM:(50 ml)
Oxalacético 28 mM 25 mlKOH 28 mM 25 ml
NADH 6 mM
3.7. Cuantificación de la actividad
isocitrato deshidrogenasa
La isocitrato deshidrogenasa (ICDH) es una
enzima intracelular del ciclo de Krebs,
relativamente resistente a los exoenzimas de
Bacillus subtilis. Sólo se detecta en
sobrenadantes de cultivos bacterianos si existe
lisis celular, de manera que puede utilizarse
como marcador para cuantificar el porcentaje
de lisis celular (Harwood et al., 1990).
La ICDH, en presencia de Mn2+ o Mg2+,
cataliza la siguiente reacción enzimática:
threo-Ds isocitrato + NADP+ ↔ 2-oxoglutarato
+ NADPH + H+ + CO2
En nuestros experimentos, se cuantificó la
conversión de NADP a NADPH + H+
midiendo la absorbancia a 340 nm (midiendo
pues el incremento de NADPH + H+).
A partir de cultivos líquidos se obtenían los
sobrenadantes de cultivo y los extractos
celulares libres de restos celulares y
membranas.
La reacción enzimática se realizaba en una
cubeta espectrofotométrica de cuarzo, en la
que se mezclaban 500 μl de tampón fosfato
potásico 100 mM pH 8, 20 μl de MgCl2
250 mM, 50 μl de NADP 8 mM, la muestra
(máximo 420 μl) y agua bidestilada
esterilizada hasta 990 μl.
A continuación se hacía el blanco de
absorbancia a 340 nm, se añadían 10 μl de
isocitrato 100 mM, se mezclaba por inversión
y se hacía un seguimiento del incremento de
absorbancia a 340 nm durante 6 min a
temperatura ambiente.
Además se hacía un control de reducción del
NADP, sin muestra.
Las unidades de actividad ICDH (mol/min) se
calculaban a partir de la pendiente de la recta
resultante y en función del coeficiente de
extinción molar del NADPH a 340 nm
(6,22·102 M-1cm-1) según la siguiente fórmula:
U= D.O.340nm Muestra−D.O.340nmControl ×Volumen
Coeficienteextinciónmolar×1cm tiempo
El grado de lisis se expresó como el porcentaje
de actividad isocitrato deshidrogenasa
extracelular (en sobrenadantes) respecto a la
actividad malato deshidrogenasa total (en
extractos celulares más sobrenadantes).
45
Soluciones:
Tampón fosfato potásico 100 mMpH 8:
K2HPO4 100 mM + KH2PO4 100 mM hasta pH 8
Isocitrato 100 mM
NADP 8 mM
4. V4. VECTORESECTORES PLASMÍDICOSPLASMÍDICOS UTILIZADOSUTILIZADOS
pUC19: el plásmido pUC19 (Yanisch-Perron
et al., 1985) es un vector de clonación en
E. coli de alto número de copia, que permite la
selección blanco-azul de recombinantes
gracias a que el polylinker (sitio de clonación
múltiple) se encuentra interrumpiendo el gen
5'-lacZ. Las colonias transformantes pueden
seleccionarse por su resistencia a ampicilina
(gracias al gen bla del plásmido, que codifica
para una β-lactamasa).
pGEM®-T y pGEM®-T easy: vectores
comerciales de la empresa Promega
Corporation (Robles y Doers, 1994) basados
en el plásmido pGEM®-5Zf(+) de clonación
en E. coli (Yanisch-Perron et al., 1985),
digerido con EcoRV (en posición 51 en el caso
de pGEM®-T, y 60 en el caso de
pGEM®-T easy), al que se ha añadido una
timina (T) en cada extremo 3' libre, para
aumentar la eficacia de clonación de
fragmentos de ADN provenientes de
amplificación con polimerasas que añaden una
adenina en 3', como la Taq polimerasa.
Permiten la selección de transformantes por
resistencia a ampicilina.
pET3b: este plásmido forma parte de la serie
de vectores pET (Studier y Moffatt, 1986;
Novagen) para la expresión inducible por
IPTG en cepas de E. coli que contengan el
lisógeno λDE3. El plásmido pET3b permite
clonar genes bajo el control del promotor
fuerte e inducible del fago T7, entre las dianas
NdeI y BamHI. Además posee un gen
marcador para la selección de transformantes
en ampicilina.
pN5: el plásmido pN5 (Pastor et al., 1999) es
un vector lanzadera E. coli - Bacillus subtilis,
resultado de la ligación de pUC19 con pC194
(vector de clonación en Bacillus subtilis)
(Alonso y Tailor, 1987). Permite la selección
de transformantes por resistencia a ampicilina
(E. coli) y cloramfenicol (B. subtilis).
pRB473: el plásmido pRB473 (Obst et al.,
1995) es un vector lanzadera
E. coli - Bacillus subtilis derivado de pBR322
(vector de clonación en E. coli de bajo número
de copia) (Bolivar et al., 1977) y pUB110
(vector de clonación en B. subtilis) (Maciag et
al., 1988). Permite la selección de
transformantes por resistencia a ampicilina
(E. coli) y cloramfenicol (B. subtilis).
pRBSPO2: el vector pRBSPO2 contiene el
promotor SPO2, promotor fuerte en B. subtilis
(Williams et al., 1981b; Bolhius et al., 1999),
insertado en el polylinker de pRB473.
pMSR8: el plásmido pMSR8 (Soriano, 2004)
es un vector lanzadera
E. coli - Bacillus subtilis derivado de pUC19 y
pUB110. Permite la selección de
46
transformantes por resistencia a ampicilina
(E. coli) y kanamicina (B. subtilis).
pMSR8amy y pMSR8SPO2: son vectores
derivados del vector pMSR8, que contienen
los promotores de la α-amilasa (Palva et al.,
1981) y SPO2, respectivamente, promotores
fuertes en B. subtilis.
YEplac195: vector lanzadera
E. coli-S. cerevisiae (Gietz y Sugino, 1988).
5. A5. ANÁLISISNÁLISIS YY MANIPULACIÓNMANIPULACIÓN DELDEL
ADN ADN RECOMBINANTERECOMBINANTE
5.1. Extracción de ADN
plasmídico
5.1.1. Minipreparación de ADN
plasmídico por lisis alcalina
A partir de 5 - 10 ml de cultivos en fase
estacionaria, las células se recogían por
centrifugación y se resuspendían en 200 µl de
solución I agitando vigorosamente. En caso de
extraer ADN plasmídico de Bacillus subtilis,
se añadían también 20 µl de lisozima
20 mg/ml (concentración final de 2 mg/ml),
para degradar su gruesa pared celular de
peptidoglicano. Se incubaba con la solución I
durante 5 min en hielo.
Se añadían a continuación 400 µl de
solución II y se mantenía 5 min en hielo.
Después se añadían 300 µl de solución III y se
mantenía otros 5 min en hielo.
El sobrenadante se recuperaba tras centrifugar
en una microcentrífuga eppendorf durante
15 min, se le añadían 500 µl de isopropanol, y
se dejaba 5 min a temperatura ambiente. Tras
este tiempo, se centrifugaba 5 min y se
decantaba el isopropanol. El pellet (que
contenía el ADN) se secaba al vacío y se
resuspendía en 200 µl de TE.
A continuación se añadían 200 µl de LiCl 5 M
y se mantenía la preparación 5 min a -20 ºC.
Se centrifugaba 5 min, y se recuperaba el
sobrenadante.
Para precipitar el ADN, se añadían 40 µl de
solución III y 2 volúmenes de etanol absoluto
frío, y se dejaba 1 h a -20 ºC. Después el ADN
se recogía por centrifugación (15 min), se
lavaba 2 veces con etanol al 70% frío
(1 volumen de etanol), se secaba al vacío y se
resuspendía en el volumen adecuado de agua
bidestilada esterilizada.
Soluciones:
Solución I: Glucosa 50 mM.Tris-HCl 25 mM pH 8.EDTA 10 mM.
Solución II: NaOH 0,2 N.SDS 1%.
Solución III: Acetato sódico 3 M.Ajustada a pH 4,8 con ácido acético glacial.
TE: Tris-HCl 10 mM pH 8.EDTA 1 mM.
5.1.2. Midipreparación de ADN
plasmídico
Se utilizó el kit comercial QIAGEN-tip 100
MidiPrep.
47
En este kit, el ADN plasmídico se aislaba
mediante cromatografía de intercambio
aniónico en columna, partiendo de 25 ml de
cultivo para plásmidos de alto número de
copia (como pUC19), y de 100 ml de cultivo
para plásmidos de bajo número de copia
(como pRB473).
5.2. Digestión con enzimas de
restricción y tratamiento con
RNAsa
5.2.1. Digestión con enzimas de
restricción
Las digestiones con enzimas de restricción se
hicieron siguiendo las instrucciones del
suministrador (Boehringer Mannheim,
Promega o Biolabs).
Los tampones utilizados fueron los
suministrados con cada enzima (los óptimos
según la casa comercial). En las digestiones
dobles se escogió el tampón más adecuado
para la actividad de ambas enzimas.
5.2.1. Tratamiento con RNAsa
La eliminación de ARN de las preparaciones
de ADN se realizó justo antes de cargar las
muestras en geles de agarosa mediante la
adición de RNAsa A (Biolabs) en una
concentración final de 10 µg/ml (a partir de un
stock de 5 mg/ml) e incubando a temperatura
ambiente durante 5 - 10 min.
Este tratamiento solo se aplicó a las muestras
de ADN plasmídico cuando el ARN podía
enmascarar la presencia de algunos fragmentos
de ADN en los geles. Por el contrario, no se
aplicó a las muestras obtenidas usando el kit
comercial QIAGEN-tip 100 MidiPrep, ya que
en su protocolo se incluye un tratamiento con
RNAsa A.
5.3. Ligación de moléculas de
ADN
Las ligaciones entre insertos y vectores de
ADN se realizaron usando la ligasa del
bacteriófago T4 (Biolabs) siguiendo las
instrucciones de la casa comercial.
Generalmente, las proporciones molares entre
ADN vector y ADN inserto fueron 1:3 cuando
se trabajaba con plásmidos de clonación en
E. coli y 1:6 cuando se trabajaba con vectores
lanzadera E. coli - Bacillus subtilis.
5.4. Amplificación por PCR
5.4.1. Amplificación de alta fidelidad
Las amplificaciones preparativas, en las que
interesaba que no se introdujeran cambios
aleatorios en la secuencia de nucleótidos, se
llevaron a cabo utilizando una ADN
polimerasa de alta fidelidad (Stratagene cloned
Pfu ADN Polymerase) para la reacción de
amplificación, siguiendo las instrucciones de
la casa comercial:
48
Tampón 10X: 1XDeoxinucleótidos trifosfato (dNTPs):
200 μM cada dNTP
ADN molde: 50 - 200 ng/100 μlCebadores: 0,2 μM cada unoPolimerasa Pfu: 5,0 U/100 μl
Generalmente los volúmenes de reacción eran
de 50 μl, aunque en algunas ocasiones se
usaron volúmenes de 100 μl para obtener
mayor cantidad de ADN amplificado.
El termociclador utilizado fue un Perkin Elmer
GeneAmp PCR System 2400.
El ADN amplificado se purificó usando el kit
Wizard® de Promega para la eliminación de
sales, cebadores, dNTPs y otros
contaminantes.
5.4.2. PCR mutagénica
Permite realizar mutagénesis aleatoria
aprovechando la falta de actividad correctora
de polimerasas como la Taq.
Además, para aumentar la tasa de error de esta
ADN polimerasa (2x10-5 mutaciones por
nucleótido por ciclo), se realizaron 4 PCRs de
amplificación diferentes del mismo gen, en
cada una de las cuales uno de los cuatro
dNTPs estaba en exceso.
Para la reacción de PCR se siguieron las
instrucciones de la casa comercial
suministradora de la Taq polimerasa:
Tampón 10X: 1XDeoxinucleótidos trifosfato (dNTPs):
200 μM cada dNTP
Dideoxinucleótido trifosfato en exceso:
200 μM extra
ADN molde: 50 - 200 ng/100 μlCebadores: 0,4 μM cada unoPolimerasa Taq: 2,5 U/100 μl
Generalmente los volúmenes de reacción eran
de 50 μl; y tras la amplificación se mezclaba el
contenido de los 4 tubos utilizados.
El termociclador utilizado fue un Perkin Elmer
GeneAmp PCR System 2400.
5.5. Gene Shuffling
(recombinación in vitro por PCR)
Se utilizó un método muy similar al de
Stemmer (1994), consistente básicamente en
fragmentar las diferentes copias de un gen o
fragmento de ADN de manera aleatoria con
DNAsa I, para después volver a recomponer el
gen mediante una primera PCR sin cebadores
(PCR I), que permite la mezcla aleatoria pero
ordenada de los diferentes fragmentos (con o
sin mutaciones), y una segunda PCR de
amplificación utilizando 2 cebadores (PCR II),
que permite obtener la gran variedad de copias
del gen generadas durante el proceso.
Se partía de amplificados obtenidos bien
mediante una PCR mutagénica bien mediante
una PCR no mutagénica, pero utilizando en
ambos casos una ADN polimerasa sin
actividad correctora. Los amplificados eran
49
analizados en geles de agarosa de bajo punto
de fusión (0,7% de agarosa en TAE), y la
banda correspondiente al gen de interés se
eluía utilizando el kit Wizard® de Promega.
A continuación las muestras de ADN se
sometían a una digestión parcial con DNAsa I
en presencia de Mg2+, para obtener fragmentos
cohesivos de tamaño aleatorio. La mezcla de
reacción contenía:
ADN muestra: 80 μlTampón Tris-HCl 1 M pH 7,4: 5 μlMgCl2 2,5 M: 4 μlDNAsa I 1 U/μl: 1 μlAgua destilada: Hasta 100 μl
Se incubaba a 25 ºC hasta obtener fragmentos
de ADN entre 150 y 500 bp. Para comprobar
el tamaño de los fragmentos de digestión, cada
3 min se analizaban 3 μl de la mezcla de
reacción mediante electroforesis en geles de
agarosa.
Una vez los fragmentos de ADN alcanzaban el
rango de tamaño deseado, se paraba la
reacción añadiendo 10 μl de EDTA 0,5 M y
calentando a 80 ºC durante 10 min para
inactivar la DNAsa I.
A continuación, las muestra de ADN digerido
eran separadas en geles de agarosa de bajo
punto de fusión (1,5% de agarosa en TAE), de
los que se recortaba por un lado la zona del gel
que contenía fragmentos de ADN de 200 a
400 bp (fragmentos de tipo A) y por otro la
que contenía fragmentos de 80 a 200 bp
(fragmentos de tipo B). Estos fragmentos de
ADN se eluían utilizando el kit QIAquick de
QIAGEN, y se comprobaba su tamaño por
electroforesis en geles de agarosa 0,7% en
TBE.
Una vez comprobado el tamaño de los
fragmentos A y B de ADN, se realizaba con
ellos una PCR sin cebadores (PCR I), en la que
los mismos fragmentos de ADN actuaban
simultáneamente como molde y como
cebadores, de manera que por
complementariedad de bases y amplificación,
el gen se iba reensamblando de nuevo.
Para encontrar las condiciones adecuadas de
PCR I para cada experimento de gene
shuffling, se realizaban varias PCR de prueba
en 25 μl de reacción conteniendo diferentes
cantidades (entre 10 y 17 μl) de fragmentos de
ADN de tipo A, de tipo B o una mezcla de
ambos:
Tampón 10X: 1XDeoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): 200 μM cada dNTP
ADN molde: 10 - 17 μlCebadores: -Polimerasa Taq: 2,5 U/100 μl
El programa de PCR utilizado se dividía en 2
secciones para favorecer el aumento de tamaño
de los fragmentos de ADN y permitir tomar
muestra a medio programa (tras los 20
primeros ciclos) y monitorizar el aumento de
tamaño:
50
Hold Incial: 94 ºC 5 minDesnaturalización: 94 ºC 30 sHibridación: 50 ºC 30 sSíntesis: 72 ºC 40 s
x20 ciclos
Hold Intermedio: 94 ºC 5 minDesnaturalización: 94 ºC 30 sHibridación: 60 ºC 25 sSíntesis: 72 ºC 1 min
x25 ciclos
Hold de síntesis: 72 ºC 10 minParada: 4 ºC -
Una vez concluido el programa de
amplificación, los productos de cada PCR I
eran analizados electroforéticamente para
comprobar si había habido aumento de tamaño
de los fragmentos de ADN.
Si era así, se usaban éstos como molde para la
PCR II.
En la PCR II se amplificaba el resultado de
PCR I utilizando cebadores externos (los
mismos que se utilizaban en la amplificación
previa al gene shuffling), con el objetivo de
obtener múltiples copias de las diferentes
variantes mutagenizadas del gen original que
se hubieran generado durante el proceso:
Tampón 10X: 1XDeoxinucleótidos trifosfato (dNTPs):
200 μM cada dNTP
Producto de PCR I: 1 μlCebadores: 0,4 μM cada unoPolimerasa Taq: 2,5 U/100 μl
El volumen utilizado era de 25 μl, y el
programa presentaba un número reducido de
ciclos para evitar la aparición de amplificados
inespecíficos:
Hold Inicial: 94 ºC 5 minDesnaturalización: 94 ºC 30 sHibridación: 55 ºC 25 sSíntesis: 72 ºC 2 min
x10-15 ciclos
Hold de síntesis: 72 ºC 10 minParada: 4 ºC -
Una vez concluido el programa de
amplificación, los productos de PCR II se
analizaban electroforéticamente para
comprobar el tamaño de los fragmentos
amplificados y la obtención de un amplificado
con el tamaño del fragmento original,
indicativo de que se había reconstruido dicho
fragmento.
Si era así, se repetía la PCR II tantas veces
como fuera necesario, y usando mayores
volúmenes de reacción, para obtener suficiente
cantidad de ADN mutagenizado.
La banda de ADN correspondiente al tamaño
del gen mutagenizado se eluía utilizando el kit
Wizard® de Promega tras su separación en
geles de agarosa de bajo punto de fusión (0,7%
de agarosa en TAE).
Tampones:
TAE (10X): Tris 0,9 M Ácido acético 0,9 MEDTA 0,02 M pH 8,3
51
5.6. Transformación
5.6.1. Transformación de Escherichia
coli
Se utilizó un método basado en el descrito por
Cohen et al. (1972).
A partir de un cultivo nocturno de la cepa de
E. coli a transformar, se inoculaban 20 ml de
LB fresco (con los antibióticos necesarios) y
se incubaba a 37 ºC en agitación hasta una
D.O.600nm de 0,3 - 0,5 (correspondiente a la fase
exponencial de crecimiento).
Una vez alcanzada esta densidad óptica, se
separaban 10 ml del cultivo (volumen inicial)
y se mantenían a 0 ºC durante 10 min. A
continuación, se recogían las células por
centrifugación en una centrífuga de sobremesa
(5 min a 4 ºC), se resuspendían en 5 ml (1/2
del volumen inicial) de CaCl2 50 mM enfriado
en hielo, y se mantenían durante 20 min en
hielo.
Transcurrido este tiempo se recogían las
células por centrifugación (3 min a 4 ºC), se
resuspendían en 665 µl (1/15 del volumen
inicial) de CaCl2 50 mM enfriado en hielo y se
mantenían en hielo durante 1 - 1,5 h, para
obtener así células competentes.
A continuación, 100 µl de células competentes
se mezclaban con el ADN a introducir por
transformación y se mantenían en hielo
durante 1 h. Tras este tiempo las células eran
sometidas a un choque térmico de 42 ºC
durante 2 min, y se volvían a poner en hielo.
Después se añadía 1 ml de medio LB (sin
antibióticos) y se incubaba a 37 ºC durante 1 h
en agitación, para permitir la expresión de los
genes marcadores de resistencia a antibióticos
presentes en el ADN introducido.
Por último, las células transformadas se
sembraban en placas de Agar LB
suplementado con los antibióticos necesarios
para la selección de transformantes y se
incubaban a 37 ºC durante 16 - 24 h.
5.6.2. Transformación de Bacillus
subtilis
Se utilizó el método descrito por Cohen y
Chang (1979).
A partir de un cultivo nocturno en caldo
Penassay de la cepa de B. subtilis a
transformar, se inoculaban 65 ml de caldo
Penassay fresco (con los antibióticos
necesarios) y se incubaba a 37 ºC en agitación
hasta una D.O.600nm de 0,5 - 0,6
(correspondiente a la fase exponencial de
crecimiento).
Se separaban entonces 50 ml de cultivo
(volumen inicial) y se centrifugaban para
recoger las células, que eran después
resuspendidas en 5 ml (1/10 del volumen
inicial) de SMMP con lisozima 2 mg/ml. Esta
suspensión se incubaba a 37 ºC durante 3 h, en
agitación muy suave, hasta que al microscopio
se observaba la formación de protoplastos.
52
A continuación, se recogían los protoplastos
por centrifugación (2600xg 15 min) y se
resuspendían en 5 ml de SMMP para
recogerlos de nuevo por centrifugación
(2600xg 15 min).
Después de este lavado, los protoplastos se
resuspendían suavemente en 5 ml (1/10 del
volumen original) de SMMP.
Tabla MM.5.5: Medios y tampones para la transformación de protoplastos de Bacillus subtilis.
Composición PreparaciónCaldo Penassay 1X(1 l):
Extracto de levadura 1,5 gExtracto de carne 1,5 gPeptona 5 gGlucosa 1 gNaCl 3,5 gK2HPO4 3,68 gKH2PO4 1,32 gAgua destilada
Tras disolver se esterilizaba en autoclave.
Caldo Penassay 4X(250 ml):
Extracto de levadura 1,5 gExtracto de carne 1,5 gPeptona 5 gGlucosa 1 gNaCl 3,5 gK2HPO4 3,68 gKH2PO4 1,32 gAgua destilada
Tras diolver se esterilizaba en autoclave.
SMM 2X(500 ml):
Sacarosa 171,15 gMaleato 2,32 gMgCl2 4,06 gAgua bidestilada
Tras disolución de sus componentes, se ajustaba a pH 6,5 con NaOH, se enrasaba a 500 ml con agua bidestilada y se autoclavaba.
SMMP: Volúmenes iguales de caldo Penassay 4Xy SMM 2X.
Se hacía la mezcla en condiciones estériles.
PEG6000 al 40%en SMM:
PEG6000 (Polietilenglicol 6000) 50 ml Se disolvía el PEG en SMM 2X caliente. Tras autoclavar, se enrasaba a 100 ml con agua destilada estéril.
Agar DM3(1 l):
Agar 8 gExtracto de levadura 10% 5 gK2HPO4 3,5 gKH2PO4 1,5 gGlucosa 5 gAgua destilada 375 ml
Succinato sódico 1 M pH 7,3 500 mlMgCl2 1 M 20 mlCasaminoácidos 5% 100 mlSeroalbúmina bovina (BSA) 2% 5 ml
Se esterilizaban por filtración la BSA y los casaminoácidos. El MgCl2 y el succinato sódico se autoclavaban por separado. El resto de productos se autoclavaban juntos.Antes de plaquear, se calentaban las diferentes soluciones; se mezclaban el succinato sódico, el cloruro de magnesio, los casaminoácidos y la BSA, y se añadían a la botella que contenía el resto de productos con el agar.
Stock de lisozima: 20 mg/ml de lisozima en agua bidestilada Se esterilizaba por filtración.
53
Se mezclaban 0,5 ml de protoplastos en
SMMP con 1,5 ml de Polietilenglicol 6000
(PEG6000) al 40% en SMM, 50 µl de TE,
50 µl de SMM 2X y el ADN a introducir por
transformación (de 1 pg a 5 μg). Esta mezcla
se incubaba 5 min a temperatura ambiente, y a
continuación se añadían 5 ml de SMMP y se
centrifugaba para recuperar los protoplastos
(2600xg 10 min).
Una vez recuperados los protoplastos, se
resuspendían en 1 ml de SMMP y se
incubaban a 30 ºC durante 1,5 h en agitación
suave, para permitir la expresión de los genes
marcadores de resistencia a antibióticos
presentes en el ADN introducido.
Por último, los protoplastos transformados se
sembraban en placas de Agar DM3
suplementado con los antibióticos necesarios
para la selección de transformantes, y se
incubaba a 30 ºC durante 2 - 3 días para
permitir que los protoplastos regeneraran la
pared y así como el crecimiento de los clones
transformantes correspondientes.
Los medios de cultivo y los tampones
utilizados para esta técnica de transformación
se describen en la Tabla MM.5.5.
6. S6. SECUENCIACIÓNECUENCIACIÓN YY ANÁLISISANÁLISIS DEDE
SECUENCIASECUENCIA
6.1. Secuenciación
Se utilizó la secuenciación automática
fluorescente por PCR, empleando para ello los
kits de secuenciación comerciales de
Amershan y Perkin Elmer y los secuenciadores
ABI PRISM 377 ADN Sequencer y ABI
PRISM 3700 ADN Analyzer (Perkin Elmer)
de los Serveis Cientificotècnics de la
Universitat de Barcelona (UB).
6.2. Análisis informático de
secuencias
Se realizaron búsquedas de homología tanto de
secuencias de nucleótidos como de
aminoácidos usando los programas Blast del
NCBI (Altschul et al., 1997), Fasta3 del EBI
(Pearson, 1990) y Blast del SubtiList Web
Server (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ ;
Moszer et al., 1995). Se utilizaron los servicios
Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/ ; Finn et al.,
2006) y ProDom (http://prodom.prabi.fr/ ; Bru
et al., 2005) para la búsqueda de homologías
de secuencia con dominios de proteínas ya
conocidas.
Asimismo se realizaron alineamientos
múltiples de secuencias de proteínas usando
los programas ClustalX (Thompson et al.,
1997) y ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ ;
54
Thompson et al., 1994) en su versión 1.8. Los
árboles filogenéticos a partir de estos
alineamientos se generaron usando el
programa ClustalX y se visualizaron con el
programa TreeView (Page, 1996).
En la predicción de péptido señal se utilizaron
los programas SignalP v1.1
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ;
Nielsen et al., 1997, 1999) y PSort v6.4
(http://psort.nibb.ac.jp/ ; Nakai y Kanehisa,
1991, 1992).
Para la predicción de estructura secundaria se
utilizaron los servicios on-line Jpred
(http://www.compbio.dundee.ac.uk/~www-
jpred/ ; Cuff y Barton, 2000) y SCRATCH
(http://www.igb.uci.edu/tools/scratch/ ; Cheng
et al., 2005), ambos basados en el
procesamiento de alineamientos múltiples
mediante redes neuronales.
Para la predicción de modelos de estructura
terciaria por homología se utilizó el servicio
automatizado on-line SWISS-MODEL
(http://swissmodel.expasy.org/ ; Schwede et
al., 2003)
También se usaron las herramientas del
ExPASy Molecular Biology Server
(http://expasy.org/ ; Gasteiger et al., 2003)
para la predicción de diferentes parámetros
físico-químicos de las proteínas secuenciadas.
7. D7. DICROISMOICROISMO CIRCULARCIRCULAR
El dicroismo circular (CD) es una técnica
espectrofotométrica basada en la absorción
diferencial de la luz polarizada circularmente a
la derecha y a la izquierda. Todas las
macromoléculas presentan esta característica,
que puede ser utilizada para la caracterización
estructural de proteínas (Beychok, 1966;
Bulheller et al., 2007).
Para medir el CD de las proteínas purificadas,
se utilizó un espectropolarímetro Jasco J-810
(JASCO Inc.) de los Serveis Cientificotècnics
de la Universitat de Barcelona (UB).
8. A8. ANÁLISISNÁLISIS ELECTROFORÉTICOELECTROFORÉTICO
8.1. Electroforesis en geles de
poliacrilamida desnaturalizantes
Generalmente, las muestras proteicas se
analizaron mediante electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida con
dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) según
Laemmli (1970), lo que permite separar las
proteínas en función de su peso molecular.
El montaje y la electroforesis se realizaron
usando un aparato Mini-Protean-II (Bio-Rad).
Los geles utilizados fueron geles de 2 fases, un
gel de empaquetamiento al 5% de
poliacrilamida y un gel separador al 10% o al
12%, preparados de la siguiente manera:
55
Separador Empaquetador
10% 12% 5%
Solución de acrilamida
2 ml 2,4 ml 0,42 ml
Tampón 1,56 ml 1,56 ml 0,625 ml
Agua bidestilada
2,4 ml 2 ml 1,4 ml
Persulfato amónico 10%
30 μl 30 μl 17,5 μl
TEMED 5 μl 5 μl 5 μl
Cuando se preparaban geles para la detección
de actividades mediante zimograma, se
sustituía parte del agua por una solución en
agua del sustrato cuya degradación se quería
estudiar, en nuestro caso xilano de madera de
abedul al 0,2% final.
Las muestras, antes de ser cargadas en los
geles, se mezclaban con tampón de muestra
3X y se trataban a 100 ºC durante 5 min para
desnaturalizarlas. Además de las muestras, en
uno de los carriles se cargaba también un
marcador comercial de pesos moleculares.
Las electroforesis se desarrollaban
generalmente a 75 V a través del gel de
empaquetamiento y a 100 V a través del gel
separador.
Una vez desarrollada la electroforesis, los
geles podían revelarse para la detección de
proteínas (tinción de Coomassie) o de actividad
enzimática (revelado zimográfico).
Tampones y soluciones:
Solución de acrilamida:
Acrilamida 30%Bisacrilamida 0,8%
Tampón de separación:
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8SDS 0,4%
Tampón de empaquetamiento:
Tris-HCl 0,5 M pH 6,8SDS 0,4%
Tampón de electroforesis (10X):
Tris-HCl 0,25 M pH 8,3Glicina 1,92 MSDS 1%
Tampón de muestra 3X:
Glicerol 10%β-mercaptoetanol 5%SDS 2,3%Tris-HCl 0,0625 M pH 6,8Azul de bromofenol 0,02%
8.2. Electroforesis en geles de
poliacrilamida en condiciones
nativas
Cuando había que analizar la actividad en gel
de enzimas que se desnaturalizaban
irreversiblemente (como es el caso de XynB
de Paenibacillus barcinonensis), se recurrió a
la utilización de geles de poliacrilamida
nativos (no desnaturalizantes) según Hames y
Rickwood (1981).
Estos geles son similares a los de SDS-PAGE,
pero los reactivos utilizados no contienen
elementos desnaturalizantes, de manera que las
proteínas migran en función de su carga
eléctrica y de su volumen molecular.
Como en el caso del SDS-PAGE, los geles
utilizados fueron geles de 2 fases, un gel de
empaquetamiento al 5% de poliacrilamida y un
gel separador generalmente al 8% o al 10%,
preparados del siguiente modo:
56
Separador Empaquetador
8% 10% 5%
Solución de acrilamida
1,33 ml 1,66 ml 0,5 ml
Tampón 0,62 ml 0,62 ml 1 ml
Agua bidestilada
2,79 ml 2,46 ml 2 ml
Persulfato amónico 1,5%
250 μl 250 μl 300 μl
TEMED 8 μl 8 μl 5 μl
Para la detección de actividades mediante
zimograma, se sustituía parte del agua por una
solución en agua del sustrato cuya degradación
se quería estudiar, en nuestro caso xilano de
madera de abedul al 0,2% final.
Las muestras, antes de ser cargadas en los
geles, se mezclaban con tampón de muestra
nativo 3X y no se trataban térmicamente.
Tampoco se utilizaba ningún tipo de marcador
de pesos moleculares, ya que las proteínas en
estos geles no se separan en base a su peso
molecular.
Las electroforesis se desarrollaban
generalmente a 75 V a través del gel de
empaquetamiento y a 125 V a través del gel
separador.
Una vez desarrollada la electroforesis, los
geles podían revelarse para la detección de
proteínas (tinción de Coomassie) o de actividad
enzimática (revelado zimográfico).
Tampones y soluciones:
Solución de acrilamida:
Acrilamida 30%Bisacrilamida 0,8%
Tampón de separación:
Tris-HCl 3 M pH 8,8
Tampón de empaquetamiento:
Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
Tampón de electroforesis (10X):
Tris-HCl 0,25 M pH 8,3Glicina 1,92 M
Tampón de muestra 3X:
Glicerol 30%β-mercaptoetanol 5%Tris-HCl 0,19 M pH 6,8Azul de bromofenol 0,08%
8.3. Tinción de proteínas con azul
de Coomassie
Una vez desarrollada una electroforesis de
proteínas en geles de poliacrilamida, para
visualizar las bandas de proteínas se teñían los
geles durante 1 h con una solución de azul
brillante de Coomassie, y después se desteñían
con ácido acético al 10% hasta observar la
aparición de bandas.
Solución para la tinción de Coomassie:
Azul de Coomassie R-250 0,05%Ácido acético 10%Isopropanol 25%
8.4. Revelado zimográfico
(zimograma)
Se utilizaba para revelar la actividad
enzimática de las bandas de proteínas en geles
de poliacrilamida suplementados con el
sustrato de la enzima a detectar (xilano en
nuestro caso).
57
Si los geles de poliacrilamina eran
desnaturalizantes (SDS-PAGE), primero se
lavaban con Tritón X-100 2,5% durante
30 min, para eliminar el SDS y que las
proteínas pudieran renaturalizarse.
Se lavaban varias veces durante 30 min con el
tampón adecuado para la actividad enzimática,
y a continuación se incubaban los geles en el
mismo tampón a la temperatura adecuada
durante el tiempo necesario para que se
pudiera dar la hidrólisis del sustrato incluido
en dichos geles.
Los geles se teñían durante 15 min con Rojo
Congo 0,1%, el cual se une a los sustratos
polisacarídicos. A continuación, se desteñían
con NaCl 1 M hasta que aparecían bandas de
degradación del sustrato. Por último, se
sumergían en ácido acético al 5% para bajar el
pH y hacer virar el rojo claro de las zonas de
sustrato no degradado a azul oscuro,
aumentando así el contraste con las bandas
claras de degradación.
8.5. Isoelectroenfoque
Se utilizaba para la determinación del punto
isoeléctrico (pI) de las proteínas. Consiste en
la aplicación de una diferencia de potencial
para hacer migra las proteínas nativas a través
de un gel en el que se ha formado un gradiente
de pH, de manera que estas dejaran de migrar
cuando lleguen al pH correspondiente a su pI.
Se utilizaban geles de isoelectroenfoque
comerciales (PhastGel® de Pharmacia) con un
rango de pH de 3,0 a 9,0. Las electroforesis se
desarrollaban en un PhastSystem (Amersham
Pharmacia Biotech) según las instrucciones de
la casa comercial.
El marcador de pI utilizado era el Broad pI Kit
Marker (Amersham Pharmacia Biotech), cuyo
rango de pI era de 3,5 a 9,3.
Una vez desarrollada la electroforesis, para
detectar la actividad xilanasa de las enzimas,
los geles se lavaban con agua destilada
(30 min), para después aplicarles una
sobrecapa (overlay) de agarosa 1% con xilano
de madera de abedul al 0,5%, e incubarlos a
37 ºC durante 30 - 45 min.
Las sobrecapas se revelaban con Rojo Congo
para la detección de actividad enzimática
(zimograma). Mientras los geles de
isoelectroenfoque se revelaban para la
detección de proteínas (tinción de Coomassie).
8.6. Electroforesis y transferencia
de proteínas para su
secuenciación N-terminal
El método utilizado para la secuenciación del
extremo N-terminal de proteínas por
degradación de Edman fue el descrito por
Packman (1993).
Se realizaba una electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida
(SDS-PAGE), para los que la poliacrilamida
58
había sido previamente desionizada durante
2 h con un 5% de Analytical Grade Mixed Bed
Resin (Bio-Rad) y después filtrada. Además, el
tampón de electroforesis contenía 2 mM de
ácido tioglicólico, y, antes de cargar las
muestras, se eliminaban los iones
contaminantes que contuviera el gel aplicando
130 V durante 20 min.
Una vez desarrollada la electroforesis, los
geles se trataban con metanol (5 min) y se
incubaban en tampón de transferencia (5 min)
antes de realizar la transferencia de las
proteínas a una membrana de PVDF (Roche)
utilizando un Trans-Blot Semi-Dry (Bio-Rad)
a 15 V durante 1 h.
A continuación, las membranas se lavaban 3
veces con agua bidestilada, se teñían las
proteínas transferidas con Azul de Coomassie,
se desteñían las membranas con una solución
de ácido acético, y se dejaban secar.
Finalmente se recortaban las bandas de las
proteínas de interés y se congelaba a -20 ºC.
La secuenciación automática de Edman (Niall,
1973) era realizada a partir de la banda
proteica por el Servei de Seqüenciació de
Proteïnes de l'Institut de Biologia Fonamental
de la Universitat Autònoma de Barcelona
(UAB) utilizando un secuenciador Procise 492
(Applied Biosystems).
Tampones y soluciones:
Tampón de transferencia:
Tris 48 mMGlicina 39 mMMetanol 20%SDS 0,02%pH 8,3
Solución para la tinción con Coomassie:
Azul de Coomassie R-250 0,01%Metanol 50%
Solución de desteñido:
Ácido acético 10%Metanol 50%
8.7. Electroforesis en geles de
agarosa
Las preparaciones de ADN se analizaron
mediante electroforesis en geles de agarosa de
baja electroendósmosis (EEO) al 0,8 - 1,3%
(en función del tamaño de los fragmentos de
ADN a analizar) en TBE.
El montaje y la electroforesis se realizaron en
cubetas horizontales Bio-Rad.
Las muestras se mezclaban con tampón de
carga 5X antes de ser cargadas en los geles.
Las electroforesis se desarrollaron
generalmente a 100 - 125 V.
Una vez desarrollada la electroforesis, los
geles se teñían sumergiéndolos en una solución
de bromuro de etidio en agua destilada
(0,75 μg/ml) durante 15 min.
59
Tampones:
TBE (10X): Tris 0,9 M Ácido bórico 0,9 MEDTA 0,02 M pH 8,3
Tampón de carga 5X:
Azul de bromofenol 0,25%Xilencianol 0,25%Glicerol 60%
9. P9. PURIFICACIÓNURIFICACIÓN DEDE PROTEÍNASPROTEÍNAS
9.1. Preparación de las muestras
Se partía de 2 l de cultivos en fase estacionaria
de la cepa que expresaba la proteína a
purificar.
A partir de estos cultivos se obtenían extractos
celulares en 50 ml utilizando el método de
fraccionamiento por French Press descrito
anteriormente, empleando tampón fosfato
50 mM pH 7 para lavar y resuspender.
Antes de continuar con la preparación de las
muestras, se comprobaba que efectivamente
contenían la proteína de interés. En nuestro
caso, para comprobar la presencia de XynB o
alguna de sus variantes mutagenizadas, se
realizaban ensayos de actividad enzimática
sobre pNPX.
A continuación, se procedía a la eliminación
de los ácidos nucleicos de las muestras. Para
ello, se añadía a los extractos celulares, en
agitación suave y poco a poco, 2,5 mg de
sulfato de estreptomicina por cada ml de
extracto, y se dejaba reposar a 0 ºC varias h.
Después, se centrifugaba a 40000 r.p.m. en
una ultracentrífuga Beckman durante 50 min a
6 ºC para recuperar los sobrenadantes, libres
de ácidos nucleicos.
Para limpiar los extractos celulares
concentrados del mayor número posible de
proteínas no deseadas, se procedía a una doble
precipitación con sulfato amónico (salting
out).
Primero se hacía un pequeño ensayo en que se
añadían concentraciones crecientes de sulfato
amónico a pequeños volúmenes (0,5 ml) de
extractos concentrados y se ensayaba la
actividad sobre pNPX de los sobrenadantes
resultantes tras centrifugar para separar las
proteínas precipitadas de las solubles. Este
ensayo permitía determinar la concentración
máxima de sulfato amónico a que la proteína
de interés se mantenía mayoritariamente
soluble, y la concentración mínima a utilizar
para hacerla precipitar.
A continuación, a los extractos celulares
concentrados se añadía poco a poco el sulfato
amónico necesario para llegar a la
concentración máxima a que la proteína de
interés se mantenía aún soluble, de manera que
tras centrifugar a 10000 r.p.m. durante 1 h a
4 ºC en una centrífuga Beckman high-speed
sólo se recuperaba el sobrenadante.
A este sobrenadante se le continuaba
añadiendo poco a poco el sulfato amónico
necesario para llegar a la concentración
mínima que hacía precipitar nuestra proteína
de interés. Así, en este segundo paso del
salting out, tras centrifugar a 10000 r.p.m. 1 h
60
a 4 ºC en una centrífuga Beckman high-speed,
se recuperaba el pellet.
Por último se resuspendía este pellet en 5 ml
de tampón fosfato 50 mM pH 7 (concentración
final 400X), y se ensayaba la actividad
enzimática sobre pNPX para evaluar la
proteína a purificar.
9.2. Cromatografía en columna
Se utilizó un purificador ÄKTATM FPLCTM
(Fast Protein Liquid Chromatography) de
Amersham Biosciences para llevar a cabo las
cromatografías en columna con el fin de
purificar la proteína XynB y sus variantes
mutagenizadas.
Las columnas utilizadas, todas ellas de
Amersham Biosciences, fueron:
– Columnas de gel filtración (exclusión
molecular): permiten la separación de
proteínas en función de su tamaño. Se
utilizaron 2 columnas diferentes:
– HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 75 prep
grade: permite volúmenes de carga
relativamente elevados, manteniendo
una alta resolución. Se utilizó en el
primer paso de purificación para
eliminar la mayoría de proteínas
diferentes a la proteína de interés,
especialmente aquellas de peso
molecular muy elevado o muy bajo.
– Tricorn™ SuperdexTM 200 10/300 GL:
de mayor resolución que la anterior y
menor capacidad de carga. Esta
columna se utilizó en algunas
purificaciones como un tercer paso
extra (o de polishing) después del paso
de intercambio iónico, con el fin de
eliminar totalmente algunas proteínas
de bajo peso molecular que coeluían
con XynB.
– TricornTM Mono QTM 5/50 GL: es una
columna de intercambio aniónico de alta
resolución que permite la separación de
proteínas en función de su carga eléctrica.
Esta columna se utilizó en el segundo paso
de purificación para obtener las proteínas
con un alto grado de pureza.
9.2.1. Cromatografía de gel filtración
El primer paso de purificación era pues un
paso de gel filtración, en el cual se cargaban
2 ml de los extractos concentrados con sulfato
amónico en la columna HiLoadTM 16/60
SuperdexTM 75 pg. Como eluyente se utilizaba
tampón fosfato 50 mM pH 7 con un 0,02% de
azida sódica (para evitar el crecimiento de
microorganismos), que se hacía pasar por la
columna a un flujo de 1 ml/min con una
presión máxima de 0,5 MPa.
Las fracciones se recogían de forma continua a
razón de 2 ml por fracción.
A continuación se seleccionaban aquellas
fracciones en que se encontraba de forma
mayoritaria la proteína a purificar. Para ello se
observaban los picos de absorbancia a 280 nm
en el cromatograma resultante, y se analizaban
61
las fracciones que contenían dichos picos
mediante ensayos de actividad sobre pNPX y
SDS-PAGE.
Este primer paso además de permitir separar la
proteína de interés de la mayoría de proteínas
del extracto, también permitía la eliminación
del sulfato amónico (el cual eluía hacia el
final), ya que podría interferir en el siguiente
paso de purificación.
Las fracciones seleccionadas (normalmente 3
ó 4 fracciones) se mezclaban y se
concentraban en 1 ml por ultrafiltración con
unidades de filtración Centricon Ultracel
YM-10.
9.2.2. Cromatografía de intercambio
iónico
Constituía el segundo paso de purificación. En
este paso las muestras concentradas obtenidas
en el proceso anterior se cargaban en una
columna de intercambio aniónico TricornTM
Mono QTM 5/50 GL. Como eluyentes se
utilizaban dos tampones con diferente
concentración de NaCl: tampón fosfato 50 mM
pH 7, 0,02% azida sódica, sin NaCl; y tampón
fosfato 50 mM pH 7, 0,02% azida sódica, con
1 M NaCl. Estos tampones eran mezclados de
manera automática por el ÄKTATM FPLCTM
para generar un gradiente creciente de fuerza
iónica dentro de la columna a lo largo del
tiempo. La mezcla de tampones se hacía pasar
por la columna a un flujo de 2 ml/min con una
presión máxima de 4 MPa.
Las fracciones se recogían de forma continua a
razón de 0,5 ml por fracción, pero cuando el
FPLCTM detectaba un pico de absorbancia a
280 nm, las fracciones se reducían a 0,3 ml por
fracción, con el objetivo de obtener una mayor
resolución.
A continuación se volvían a seleccionar
aquellas fracciones en que se encontraba
solamente (o en una proporción especialmente
elevada) la proteína a purificar. Para ello se
observaban los picos de absorbancia a 280 nm
en el cromatograma resultante, y se analizaban
las fracciones que recogían dichos picos
mediante ensayos de actividad sobre pNPX y
en especial mediante SDS-PAGE.
Las fracciones seleccionadas (normalmente 3
ó 4 fracciones) se mezclaban en un sólo tubo.
9.2.3. Tercer paso opcional de
cromatografía
En algunas purificaciones, tras el paso de
intercambio iónico, aún se observaron
proteínas de bajo peso molecular que coeluían
con XynB. En estos casos, se procedió a un
tercer paso extra de purificación (polishing),
en el cual las muestras resultantes del
intercambio aniónico se cargaban en una
columna de gel filtración TricornTM
SuperdexTM 200 10/300 GL. Como eluyente se
utilizaba también tampón fosfato 50 mM pH 7
con un 0,02% de azida sódica, que se hacía
62
pasar por la columna a un flujo de 1 ml/min
con una presión máxima de 1,5 MPa.
Las fracciones se recogían de forma continua a
razón de 0,5 ml por fracción, pero cuando el
FPLCTM detectaba un pico de absorbancia a
280 nm, las fracciones pasaban a ser de 0,3 ml
por fracción, para obtener una mayor
resolución.
Por último se seleccionaban de nuevo aquellas
fracciones en las que se encontraba solamente
la proteína a purificar mediante ensayos de
actividad enzimática sobre pNPX y mediante
SDS-PAGE.
Las fracciones seleccionadas se mezclaban en
un solo tubo.
9.3. Concentración de proteínas
por ultrafiltración
Se utilizaban unidades de filtración Centricon
de Millipore, que contenían filtros de celulosa
regenerada de baja adherencia y con exclusión
de pesos moleculares de 10 ó 30 kDa (modelos
Ultracel YM-10 y YM-30, respectivamente).
Se centrifugaba a 3000 r.p.m. en una
centrifuga Beckman high-speed hasta que
pasaba por el filtro la mayor parte del volumen
de la muestra a concentrar y sólo quedaba sin
filtrar el volumen deseado.
Por último se recuperaban las proteínas
concentradas invirtiendo la unidad de
filtración y volviendo a centrifugar a
3000 r.p.m. durante 15 min, de manera que se
recogía en un tubo el volumen no filtrado
concentrado.
CCAPÍTULOAPÍTULO I. I.
LLAA XILANASAXILANASA X XYNYNA A DEDE BBACILLUSACILLUS SPSP. BP-7. BP-7
65
1. - I1. - INTRODUCCIÓNNTRODUCCIÓN YY O OBJETIVOSBJETIVOS
La biodegradación del xilano es un proceso
complejo que requiere la acción coordinada de
diferentes enzimas, entre las cuales las
xilanasas juegan un papel fundamental al
degradar los enlaces β(1→4) del esqueleto de
xilosas del xilano.
La cepa Bacillus sp. BP-7 (López et al. 1998)
había sido previamente aislada por el grupo de
investigación a partir de suelo de arrozal del
Delta de L'Ebre (lugar rico en materia vegetal
en descomposición y por tanto adecuado para
aislar degradadores de celulosa y xilano),
mediante cultivos de enriquecimiento en paja
de arroz. Esta cepa fue seleccionada por su
elevada actividad degradadora de xilano,
además de presentar actividad hidrolítica sobre
celulosa, pectina y lípidos.
Con el fin de encontrar y caracterizar nuevas
xilanasas para su análisis, tanto molecular
como de aplicación industrial, los objetivos de
este capítulo fueron:
- Construcción de una genoteca en
Escherichia coli de la cepa Bacillus sp.
BP-7, selección de los clones
recombinantes portadores de genes de
xilanasas, e identificación y caracterización
genética de los mismos.
- Caracterización bioquímica de la xilanasa
mayoritaria de la cepa Bacillus sp. BP-7.
- Expresión de las enzimas caracterizadas en
forma de proteínas de fusión en estudios de
secreción fúngica.
2. - R2. - RESULTADOSESULTADOS
2.1. Clonación e identificación de
xilanasas de Bacillus sp. BP-7
2.1.1. Construcción y escrutinio de la
genoteca de Bacillus sp. BP-7
Con el objetivo de clonar e identificar los
genes codificantes de enzimas degradadores de
polisacáridos y lípidos (xilanasas, celulasas,
lipasas, esterasas y pectinasas) de la cepa
Bacillus sp. BP-7, se construyó una genoteca
de la misma en colaboración con el resto de
miembros del grupo de investigación.
Para la construcción de la genoteca, el ADN
total de Bacillus sp. BP-7 fue digerido a
tiempo parcial con el enzima de restricción
Sau3A. El ADN resultante fue sometido a
electroforesis en geles preparativos, a partir de
los cuales se aislaron fragmentos de tamaño
medio aproximado entre 6 y 8 kb. Estos
fragmentos fueron ligados al plásmido pUC19
linearizado con BamHI, y el resultado de la
ligación fue introducido por transformación en
E. coli XL1-Blue. Se sembró a continuación
en placas de agar LB suplementado con
tetraciclina, ampicilina, IPTG y X-gal, que se
incubaron 24 h a 37 ºC. A partir de las
colonias que crecieron en estas placas se
66
seleccionaron alrededor de 4500 clones
recombinantes (colonias blancas y AmpR) para
su posterior análisis.
Para el escrutinio de la genoteca, los clones
recombinantes seleccionados se sembraron en
placas de agar LB suplementado con distintos
sustratos para revelar la producción de las
enzimas de interés. Estos sustratos fueron:
CMC para identificar clones productores de
celulasas, ácido poligalacturónico para
detectar clones con actividad pectinasa,
tributirina para detectar clones positivos para
esterasas, y aceite de oliva para detectar clones
con actividad lipasa. Para identificar clones
positivos para actividad xilanasa, se usaron
placas de agar LB suplementadas con xilano
de espelta de avena (0,4%). Estas placas eran
turbias debido al xilano, de manera que las
colonias con actividad xilanasa presentaban a
su alrededor un halo claro resultante de la
degradación del xilano. Sin embargo, la
sensibilidad de estas placas para identificar
clones con actividad xilanasa es relativamente
baja. Por ello en ocasiones se usaron también
placas de agar LB suplementadas con
xilano-RBB (0,1%), con mayor sensibilidad, y
que por tanto permiten detectar clones con
niveles bajos de actividad xilanasa. En las
placas de agar LB xilano-RBB las colonias
productoras de xilanasas se detectan por la
formación de halos claros que destacan sobre
el fondo azul oscuro del medio (Figura I.2.1).
Tras el escrutinio de más de 4500 clones
recombinantes se identificaron 3 clones
productores de lipasa, 1 clon productor de
pectinasa y 6 clones productores de xilanasa.
Vector (pUC19)
Extracción de DNA
DNA digerido
DNA (tamaños deseados)
Vector digerido
Transformación en E. coli XL1Blue
Selección de clones
recombinantes(colonias blancas
AmpR)
Digestión
parcial con Sau3A
DNA Cromosómico
Ligación
Selección de clones con actividad xilanasa
(con halo de degradación del
xilano del medio)
pXA1 pXA2 pXA3 pXA7
pXA5 pXA6
Bacillus sp. BP7
Digestión con BamH1
Figura I.2.1: Construcción y escrutinio de la genoteca de Bacillus sp. BP-7.
67
Los 6 clones recombinantes con actividad
xilanasa se clasificaron en 2 grupos:
- Clones XA1, XA2, XA3, y XA7.
Presentaban actividad en placas de agar LB
suplementadas con xilano de espelta de
avena o con xilano-RBB.
- Clones XA5 y XA6. Mostraban actividad
detectable únicamente en placas de agar
LB con xilano-RBB.
Los clones fueron congelados en glicerol a
-80 ºC para su conservación.
2.1.2. Análisis de los clones con
actividad xilanasa
2.1.2.1. - Análisis de los plásmidos
recombinantes
El ADN plasmídico (obtenido por
minipreparación) de los clones productores de
xilanasa fue analizado mediante digestiones
simples y dobles con enzimas de restricción.
A partir de estos análisis de restricción se
obtuvo el tamaño de los insertos de los
diferentes clones, tal como aparece en la Tabla
I.2.1.
Se observó que los plásmidos recombinantes
pXA1, pXA2, pXA3 y pXA7 presentaban
muchas bandas de restricción comunes, lo cual
indicaba que una gran parte del inserto que
contenían era común a todos ellos.
Por otra parte, se constató que los plásmidos
pXA5 y pXA6 presentaban un patrón de
restricción idéntico, hecho que indicaba que
los clones XA5 y XA6 contenían el mismo
plásmido. Dicho patrón de restricción era
además totalmente distinto al de los otros
plásmidos recombinantes.
Así pues, los 6 clones productores de xilanasa
correspondían únicamente a 2 fragmentos
distintos del ADN de Bacillus sp. BP-7.
Sobre la base de estos resultados, para
posteriores estudios se seleccionaron 2 clones.
Del grupo de clones XA1, XA2, XA3 y XA7
se escogió al XA3 por ser el que presentaba un
inserto de menor tamaño; y del grupo de
clones XA5 y XA6 (ambos idénticos) se
escogió XA5.
2.1.2.2. - Subclonaje del inserto de pXA3
Para delimitar el gen de xilanasa y eliminar el
ADN no necesario para la expresión del
enzima, se procedió a subclonar el inserto de
pXA3, contenido en el clon recombinante
XA3.
Para ello se digirió el inserto del plásmido
pXA3 con diferentes enzimas de restricción, se
clonaron los fragmentos digeridos en pUC19 y
se transformó en células competentes de
E. coli XL1 Blue.
Tabla I.2.1: Tamaño del inserto de los plásmidos recombinantes.
ClonPlásmido
RecombinanteTamaño
del inserto (kb)XA1 pXA1 7,2XA2 pXA2 8,9XA3 pXA3 6,0XA5 pXA5 8,7XA6 pXA6 8,7XA7 pXA7 6,8
68
A partir del clon XA3 se obtuvo el subclón
XA30, que presentaba actividad xilanasa y
contenía el plásmido pXA30, el cual consistía
en el fragmento HindIII de 1,4 kb del inserto
de pXA3 clonado en pUC19 (Figura I.2.2).
La cuantificación de actividad xilanasa en
extractos celulares del subclón obtenido, en
comparación con la del clon original y del
control negativo, se muestra en la Tabla I.2.2.
2.1.3. Secuenciación e identificación
del gen xynA
Se secuenció el inserto de pXA30, usando para
ello cebadores que flanqueaban el sitio de
clonación múltiple de pUC19. La secuencia
obtenida (Figura I.2.3) mostró una pauta
abierta de lectura de 639 bp, que codificaba
una proteína de 213 aminoácidos, con un peso
molecular teórico de 23474,7 Da y un pI
teórico de 9,28, a la que se denominó XynA
(xilanasa A de Bacillus sp. BP-7).
La secuencia deducida de aminoácidos se
comparó con secuencias de glicosil hidrolasas
conocidas contenidas en las bases de datos
(Swissprot, NCBI, EMBL y SubtiList). Se
encontró una elevada homología (92% de
identidad) con la xilanasa A de Bacillus
subtilis (Paice et al., 1986), la xilanasa A de
Bacillus circulans (Yang et al., 1988) y la
xilanasa S de Bacillus sp. YA-14 (Yu et al.,
1993); y una menor homología con XynA de
B. stearothermophilus (78% de identidad)
(Cho y Choi, 1995), XynN de B. halodurans
(75% de identidad) (EMBL accession number
AY170624), XynA de B. pumilus (46% de
identidad) (Fukusaki et al., 1984) y con XynA
de B. agaradhaerens (45% de identidad)
(EMBL accession number A68006), todas
ellas xilanasas de la familia 11 (G) de glicosil
hidrolasas (Gilkes et al., 1991; Henrissat y
Bairoch, 1996).
Tabla I.2.2: Actividad xilanasa en placa y en ensayos de actividad de los clones y subclones obtenidos.
Clonesrecombinantes
Actividaden placa
U/ml de cultivo
E. coli/pXA3(XA3)
+ 0,03
E. coli/pXA30(XA30)
+ 0,03
E. coli/pXA5(XA5) + 0,01
E. coli/pUC19(C –)
- 0,00
Figura I.2.2: Plásmido pXA30.
AmpR
ORI LacI
LacZ
xynAxynA
HindIII
HindIII
pXA304,09 kb
Inserto(1,4 kb)
69
Tal como se observa en el alineamiento
múltiple (Figura I.2.4), la homología con las
xilanasas mencionadas en primer lugar es muy
elevada, conservándose en todas ellas los dos
residuos catalíticos del centro activo del
enzima, correspondientes a los ácidos
glutámicos en posiciones 106 y 200.
Según se observó en estos análisis de
secuencia, la xilanasa XynA de Bacillus sp.
BP-7 es una enzima de dominio único, de la
familia 11 (G) de glicosil hidrolasas, y dentro
47 GCT ACC TCA TGT CAA AGT CAG AAA AAA TAT TAT AGG AGG TAA CAT 91
92 ATG TTT AAG TTT ACA AAG AAA TTC TTA GTT GGG TTA ACG GCA GCT 1361 Met Phe Lys Phe Thr Lys Lys Phe Leu Val Gly Leu Thr Ala Ala 15
137 TTG ATG AGT ATT AGC TTG TTT TCG GCA AAC GCC TCT GCA GCT AAC 18116 Leu Met Ser Ile Ser Leu Phe Ser Ala Asn Ala Ser Ala Ala Asn 30
182 ACA GAC TAC TGG CAA AAT TGG ACT GAT GGG GGC GGA ACA GTA AAC 22631 Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn 45
227 GCT GTC AAT GGG TCT GGC GGG AAT TAC AGT GTG AAT TGG TCT AAT 27146 Ala Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn 60
272 ACC GGG AAT TTC GTT GTT GGT AAA GGT TGG ACT ACA GGT TCG CCA 31661 Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro 75
317 TTT AGG ACG ATA AAC TAT AAT GCC GGA GTT TGG GCG CCG AAT GGC 36176 Phe Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly 90
362 AAT GCA TAT TTG ACT TTA TAT GGT TGG ACG CGA TCA CCT CTC ATA 40691 Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile 105
407 GAA TAT TAT GTA GTG GAT TCA TGG GGT ACT TAT AGA CCT ACT GGA 451106 Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly 120
452 ACG TAT AAA GGT ACG GTT TAC AGT GAT GGG GGT ACA TAT GAC GTG 496121 Thr Tyr Lys Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Val 135
497 TAC ACA ACT ACA CGT TAT GAT GCA CCT TCC ATT GAT GGC GAT AAA 541136 Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr Asp Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asp Lys 150
542 ACT ACT TTT ACG CAG TAC TGG AGT GTT CGC CAG TCG AAG AGA CCA 586151 Thr Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro 165
587 ACT GGA AGC AAC GCT ACA ATC ACT TTC AGC AAT CAC GTT AAC GCA 631166 Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala 180
632 TGG AAG AGA TAT GGG ATG AAT CTG GGT AGT AAT TGG TCT TAC CAA 676181 Trp Lys Arg Tyr Gly Met Asn Leu Gly Ser Asn Trp Ser Tyr Gln 195
677 GTC TTA GCG ACA GAG GGA TAT CAA AGT AGT GGA AGT TCT AAC GTC 721196 Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Val 210
722 ACA GTG TGG TAA CAG ATT ATC TTT AAT CAG GGG TAG CTA ACG GGC 766211 Thr Val Trp Stop
767 TGC TGA TCG TTC CTT GAG AAA TTT TAT AAT CGT TGT TAT TGT GAG 811
Figura I.2.3: Secuencia de nucleótidos y secuencia deducida de aminoácidos del gen xynA de Bacillus sp. BP-7.
70
de ella pertenece al subgrupo de xilanasas
alcalinas de bajo peso molecular, el cual
parece ser ubicuo entre las especies del género
Bacillus y ha sido propuesto como el principal
subgrupo de la familia 11 de glicosil
hidrolasas.
2.2. Caracterización bioquímica
de la xilanasa XynA de
Bacillus sp. BP-7
2.2.1. Determinación del peso
molecular y del punto isoeléctrico
Para analizar el producto génico de xynA
expresado en la cepa recombinante
E. coli/pXA30 se obtuvieron extractos
celulares concentrados de dicha cepa
recombinante y se analizaron mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida con
SDS (SDS-PAGE), junto a los extractos
celulares concentrados de un control negativo
(E. coli/pUC19). Los geles de electroforesis
resultantes fueron revelados para proteínas por
tinción con azul de Coomassie y para actividad
xilanasa mediante técnicas zimográficas
(Figura I.2.5).
En los geles teñidos con azul de Coomassie no
se observaron diferencias significativas en el
patrón de bandas proteicas del extracto celular
de E. coli/pXA30 respecto al del control
negativo. Sin embargo, en los geles
desarrollados zimográficamente se observó
una banda intensa de actividad xilanasa en el
extracto celular de E. coli/pXA30, que no se
observó en el control negativo. Esta banda de
actividad xilanasa presentaba un peso
molecular aparente de unos 23 - 24 kDa, que
concuerda con el peso molecular teórico
deducido a partir de su secuencia aminoacídica
(23474,7 Da).
Figura I.2.4: Alineamiento múltiple de XynA de Bacillus sp. BP-7 (XynA_BP-7), XynA de Bacillus subtilis (XynA_B.sub), XynA de Bacillus circulans (XynA_B.cir) y XynS de Bacillus sp. YA-14 (XynS_B.sp.) (Yu et al., 1993).
71
Los extractos celulares de E. coli/pXA30,
fueron también analizados en geles de
isoelectroenfoque que se revelaron
zimográficamente para actividad xilanasa.
Se observó una única banda de actividad en el
límite de pH superior de los geles, lo que
indica que XynA posee un pI de 9 o superior
(Figura I.2.6), tal como era de esperar en
función de su pI teórico (9,28).
2.2.2. Propiedades enzimáticas
2.2.2.1. - Especificidad de sustrato
Se hicieron estudios de especificidad de
sustrato ensayando la actividad de extractos
crudos del subclón E. coli/pXA30 sobre
diferentes xilanos (xilanos de maderas duras y
xilanos de cereales), celulosas (Avicel y
carboximetil celulosa), otros polisacáridos
(laminarina, liquenano, poligalacturonato,
pectina y almidón), además de sobre
aril-xilósidos (pNPX y oNPX) y otros
aril-glicósidos (pNAp, pNAf y pNPG)
(Tabla I.2.3).
La xilanasa A presentó elevada actividad sobre
los distintos xilanos de maderas duras y
cereales ensayados, obteniéndose los valores
más altos sobre xilano de madera de haya
(0,207 U/mg de proteína). Por el contrario, la
actividad sobre celulosas, otros polisacáridos,
aril-xilósidos y aril-glicósidos evaluados, fue
muy baja o indetectable.
Figura I.2.5: Análisis electroforético mediante SDS-PAGE de la xilanasa A.(A) Tinción con azul de Coomassie.(B) Zimograma para actividad xilanasa.(1) Extractos de E. coli/pUC19 (C−).(2) Extractos de E. coli/pXA30.
Figura I.2.6: Análisis zimográfico a partir de geles de isoelectroenfoque de la xilanasa A (extractos de E. coli/pXA30).
72
La especificidad de sustrato mostrada por
XynA indica que se trata de una endoxilanasa
(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.8).
2.2.2.2. - pH óptimo y Temperatura óptima
A continuación se determinaron el pH óptimo
(pH al que el enzima tiene máxima actividad)
y la temperatura óptima (temperatura a la que
el enzima presenta máxima actividad) de la
enzima, con el fin de determinar las
condiciones de aplicación de la misma en
posibles usos industriales.
Se ensayó la actividad de extractos crudos de
E. coli/pXA30 sobre xilano de madera de
abedul en el rango de pH de 3 a 12 en
intervalos de 0,5 unidades de pH, a una
temperatura de 60 ºC (Figura I.2.7).
A partir de estos ensayos se observó que el pH
óptimo de XynA en extractos crudos es de 6,0,
manteniendo más de un 50% de actividad en el
rango de pH entre 4,5 y 8,5.
Para determinar la temperatura óptima, se
analizó la actividad de los extractos crudos de
E. coli/pXA30 sobre xilano de madera de
Tabla I.2.3: Especificidad de sustrato de la xilanasa A de Bacillus sp. BP-7.
Sustrato
Actividad específica(U/mg) a
% respecto a la actividad máxima
Xilano de madera de abedul 0,182 87,92Xilano de madera de haya 0,207 100,00Metil glucuronoxilano 0,139 67,15Xilano de espelta de avena 0,145 70,05Arabinoxilano de trigo 0,164 79,23Arabinoxilano de centeno 0,054 26,09Carboximetil celulosa ND 0Avicel ND 0Laminarina ND 0Liquenano 0,003 1,45Poligalacturonato ND 0Pectina 0,003 1,45Almidón 0,003 1,45pNPX 0,001 0,48oNPX 0,001 0,48pNPG 0,001 0,48pNPAp 0,001 0,48pNPAf 0,002 0,97
a ND: No Detectable
73
abedul, a pH 6, en el rango de temperaturas de
50 a 70 ºC, en intervalos de 5 ºC (Figura I.2.8).
Los resultados mostraron que la temperatura
óptima de XynA en extractos crudos es de
60 ºC, presentando más de un 50% de
actividad a temperaturas entre 50 y 70 ºC.
2.2.2.3. - Termorresistencia
Para analizar la termorresistencia (o
termoestabilidad) de la enzima, muestras de
extractos crudos de E. coli/pXA30 se
incubaron a 50, 55 ó 60 ºC durante diferentes
intervalos de tiempo (hasta un máximo de 3 h)
a pH 7, y posteriormente se ensayó la
actividad xilanasa residual sobre xilano de
madera de abedul (Figura I.2.9).
La xilanasa cruda se mostró altamente estable
a 50 ºC, manteniendo el 100% de su actividad
tras las 3 h de incubación ensayadas.
Por el contrario, tras 3 h de incubación a 55 ºC
la actividad disminuyó hasta el 50%; mientras
que a 60 ºC la enzima se inactivó rápidamente,
no mostrando actividad significativa tras 1 h
de incubación en estas condiciones.
2.2.2.4. - Influencia de iones metálicos sobre
la actividad
Por último, se comprobó la influencia de
diferentes cationes metálicos sobre la actividad
de la xilanasa A cruda.
Para ello, se realizó el ensayo de actividad
xilanasa en presencia de diferentes cationes
Figura I.2.8: Efecto de la temperatura sobre la actividad de XynA.
Figura I.2.7: Efecto del pH sobre la actividad de XynA.
Figura I.2.9: Termorresistencia de XynA a pH 7.
0
20
40
60
80
100
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Act
ivid
ad r
elat
iva
(%)
pH
0
20
40
60
80
100
Act
ivid
ad r
elat
iva
(%)
60 120 18030 90 150
Tiempo de preincubación (min.)
55 ºC
50 ºC
60 ºC
50 55 60 65 70
50
60
70
80
90
100
Temperatura (ºC)
Act
ivid
ad R
elat
iva
(%)
74
metálicos a una concentración final de 1 mM o
10 mM. Con el fin de observar el efecto de la
falta de iones sobre la actividad, también se
realizaron ensayos añadiendo EDTA (1 o
10 mM).
Tal como se observa en la Figura I.2.10, la
xilanasa A fue inhibida en mayor o menor
grado por casi todos los cationes ensayados a
concentraciones de 10 mM.
Es de destacar el efecto inhibidor de los iones
Mn2+, Fe3+, Pb2+ y Hg2+, que a concentraciones
de 10 mM redujeron la actividad por debajo
del 25 % respecto al control + (sin iones). De
estos 4 iones, sólo el Hg2+ no mostraba efecto
inhibidor a concentraciones de 1 mM. Por el
contrario, el Ba2+ presentaba un ligero efecto
activador sobre la xilanasa tanto a 1 mM como
a 10 mM, aumentando la actividad hasta un
112% y un 110% de la actividad del control +.
2.3. Expresión de la xilanasa
XynA en levadura
2.3.1. Antecedentes
El bajo peso molecular (24 kDa), la alta
actividad sobre arabinoxilanos de trigo (79%
de la actividad máxima), el amplio rango de
pH (4,5 - 8,5) y la termoestabilidad (3 h a
50 ºC) son características bioquímicas de la
xilanasa A de Bacillus sp. BP-7 que la
convierten en una buena candidata para su uso
en la industria panadera, con el fin de mejorar
las propiedades reológicas del pan. Es por ello
que se decidió ensayar su expresión en
Saccharomyces cerevisiae.
Act
ivid
ad R
elat
iva
(%
)
1 mM 10 mM
0
102030
405060
708090
100110120
Ni2+
NH
4+
Mn2+
Mg2+
Fe3+
Cu2+
Co2+
Ba2+
Pb2+
Zn2+
Ca2+
Ag2+
Hg2+
ED
TA C+
Figura I.2.10: Influencia de diferentes iones y EDTA a 1 y 10 mM sobre la actividad de XynA.
75
Como estrategia para conseguir la secreción de
la xilanasa A en esta levadura se decidió su
fusión génica a proteínas de pared celular, que
trasportaran la xilanasa al exterior de la
superficie celular de la levadura.
En colaboración con el grupo del Dr. Jesús
Zueco de la Universitat de València, se
construyeron 5 proteínas de fusión diferentes.
En ellas, la pauta abierta de lectura de XynA,
sin la región que codifica el péptido señal, se
fusionó en distintos puntos con el gen
codificante de la proteína Pir4 (proteína de
pared de S. cerevisiae, que además es
secretada parcialmente al medio de cultivo;
Moukadiri et al., 1999), tal como se describe
en la Figura I.2.11.
Las 5 construcciones realizadas (C1 - C5),
basadas en el plásmido de expresión en
levaduras YEplac112, fueron transformadas en
las cepas de S. cerevisiae BY4741 (cepa
salvaje) y S. cerevisiae mnn9 (cepa deficiente
en glicosilación; Hernández et al., 1989).
NcoI BglII SalI
PS S I MP S IIPir4 XynA
PS Xilanasa
NcoI NcoI
BglII BglII
SalI
NcoI BglII SalI
NcoI SalI
SalI
C1
C2
C3
C4
C5
Digestión con enzimas de restricciónAmplificación de la región codificante, sin
incluir el PS, usando cebadores que incorporan dianas de restricción
Figura I.2.11: Construcciones XynA-Pir4. PS: región codificante para el péptido señal; S I: región codificante para la subunidad I de Pir4 (pro-péptido procesado en el aparato de Golgi); MP: región codificante para el motivo Pir (repeticiones internas); S II: región codificante para la subunidad II de Pir4 (la región C-terminal de esta subunidad posiblemente permite el anclaje a la pared).
76
2.3.2. Análisis de actividad de los
clones recombinantes
Para proceder al estudio de la actividad
xilanasa de los 10 clones obtenidos (5 en
S. cerevisiae BY4741 y 5 en S. cerevisiae
mnn9), éstos fueron sembrados en placas de
Agar SD (his, leu, met) suplementado con
Xilano-RBB al 0,1%. También se sembró la
cepa E. coli/pXA30 como control +, y las
cepas parentales S. cerevisiae BY4741 y
S. cerevisiae mnn9 como controles –.
Las placas se incubaron a 30 ºC durante 48 h,
al cabo de las cuales se analizó la aparición de
halos de degradación del xilano alrededor de
las estrías de crecimiento microbiano.
Tal como se observa en la Figura I.2.12, los
clones con las construcciones C2, C3 y C4
presentaron halos de degradación del xilano
alrededor de las estrías de crecimiento, tanto
los derivados de la cepa S. cerevisiae mnn9
como los derivados de la cepa salvaje
S. cerevisiae BY4741, siendo especialmente
notables los halos de los clones que contenían
la construcción C4, cuyos halos resultaron más
intensos que los del control +. En el caso de la
construcción C1 también se observaron halos
de degradación del xilano en ambas cepas
huéspedes, sin embargo estos eran muy tenues
en comparación con los de las otras
construcciones.
Por el contrario, la construcción C5 no mostró
halos de degradación en ninguna de las 2 cepas
huéspedes.
Con este ensayo en placa comprobamos que
las proteínas de fusión expresadas por algunos
de los clones recombinantes eran funcionales,
quedando pues por determinar la localización
celular de estas proteínas de fusión en los
diferentes clones.
Figura I.2.12: Ensayo de actividad en placa de las 5 construcciones obtenidas (clones del 1 al 5) en S. cerevisiae mnn9 (placa A) y S. cerevisiae BY4741 (placa B).
C1C2
C3C4C5
C+ C- C+ C-
A B
C1C2
C3C4C5
77
2.3.3. - Localización celular
Aquellos clones positivos para actividad
xilanasa que resultaban más activos
(construcciones C2, C3 y C4), fueron
cultivados en medio líquido SD (his, leu, met)
para poder obtener sobrenadantes de cultivo y
fracciones de pared celular sobre los que
realizar análisis cuantitativos de actividad
xilanasa. Las cepas huéspedes también fueron
cultivadas en medio YPD para utilizarlas como
controles −.
Los sobrenadantes de cultivo fueron dializados
y concentrados antes de realizar los ensayos de
actividad. La diálisis se realizó frente a tampón
Tris-HCl 200 mM pH 7, para eliminar los
azúcares presentes en los medios de cultivo
utilizados (ya que ambos contenían, entre
otros, un 2% de glucosa) y evitar así la
interferencia de estos azúcares reductores con
el método de detección de actividad xilanasa
(Nelson-Somogyi). Una vez dializados, los
sobrenadantes fueron concentrados 40 veces
(40X) mediante varios pasos de ultrafiltración.
A continuación se ensayó la actividad xilanasa
de los sobrenadantes concentrados en las
condiciones óptimas de pH y temperatura
previamente establecidas.
Las paredes celulares fueron procesadas y
analizadas paralelamente por Isabel Andrés,
del grupo del Dr. Jesús Zueco.
Tal como se observa en la Tabla I.2.4, todos
los clones analizados presentaron actividad
xilanasa significativa asociada a pared celular,
aunque en el caso de la construcción C4, ésta
fue muy inferior a la mostrada por las
construcciones C2 y C3 en las mismas cepas.
En cuanto a la actividad liberada a los
sobrenadantes de cultivo, en el caso de los
clones en la cepa S. cerevisiae BY4741 sólo la
construcción C4 presentaó valores
significativos de actividad xilanasa; mientras
que en los clones derivados de la cepa
S. cerevisiae mnn9 todos los sobrenadantes de
Tabla I.2.4: Actividad xilanasa asociada a pared y en sobrenadantes de cultivo de las construcciones C2, C3 y C4 en las cepas S. cerevisiae BY4741 y S. cerevisiae mnn9.
Actividad asociada a pared celular Actividad en sobrenadantes de cultivo
Cepa U/g pared U/l cultivo % U/l cultivo %
BY4741 0,00 0,00 0 0,00 0
C2-BY4741 1,80 5,76 100 0,00 0
C3-BY4741 1,50 4,80 96 0,19 4
C4-BY4741 0,45 1,10 11 8,43 89
mnn9 0,00 0,00 0 0,00 0
C2-mnn9 0,93 5,95 76 1,83 24
C3-mnn9 1,17 7,50 43 9,85 57
C4-mnn9 0,35 2,20 13 14,33 87
78
los clones recombinantes analizados, aunque
especialmente los del que contenía la
construcción C4, presentaron actividad
xilanasa significativa.
Así pues, destacaba especialmente la elevada
actividad xilanasa presente en los
sobrenadantes de los dos clones que contenían
la construcción C4, en los que el 87 - 89% de
la actividad xilanasa total fue secretada al
medio de cultivo.
CCAPÍTULOAPÍTULO II. II.
LLASAS XILANASASXILANASAS Y YNFNFF F YY X XYNYND D DEDE
BBACILLUSACILLUS SPSP. BP-7. BP-7
81
1. - I1. - INTRODUCCIÓNNTRODUCCIÓN YY O OBJETIVOSBJETIVOS
Tal como se ha descrito en el capítulo anterior,
el escrutinio de la genoteca de la cepa
Bacillus sp. BP-7 en Escherichia coli dio lugar
al aislamiento de 2 tipos de clones productores
de xilanasa: los clones del primer tipo (XA1,
XA2, XA3, y XA7) contenían todos ellos el
gen xynA, caracterizado en el capítulo anterior,
mientras que el segundo tipo de clones,
formado por XA5 y XA6, sólo mostraba
actividad detectable en placas de agar LB con
xilano-RBB, lo que indicaba la presencia de,
como mínimo, una xilanasa con características
diferentes a XynA.
El objetivo del presente capítulo fue la
caracterización genética y bioquímica de las
xilanasas de la cepa Bacillus sp. BP-7 clonadas
en XA5 y XA6.
2. - R2. - RESULTADOSESULTADOS
2.1. Aislamiento de las xilanasas
del clon Escherichia coli/pXA5
Tras analizar el ADN plasmídico de los clones
XA5 y XA6, se observó que los plásmidos
pXA5 y pXA6 presentaban el mismo tamaño
(8,7 kb) y un patrón de restricción idéntico, y a
su vez distinto al de los plásmidos
recombinantes que codificaban para la
xilanasa A, descrita en el capítulo anterior.
Sobre la base de estos resultados, se seleccionó
el clon XA5 (E. coli/pXA5) para continuar con
su estudio.
2.1.1. Subclonaje del inserto del
plásmido pXA5
Con el objetivo de delimitar los posibles genes
de xilanasa y eliminar el ADN no necesario
para la expresión de las mismas, se procedió a
subclonar el inserto de pXA5. Para ello se
digirió el inserto del plásmido pXA5 con
diferentes enzimas de restricción, se clonaron
los fragmentos digeridos en pUC19 y se
transformó en células competentes de E. coli
XL1-Blue.
La poca cantidad de dianas de restricción
útiles en el inserto dificultó la subclonación.
Finalmente, tras varios intentos, se obtuvieron
2 subclones, conteniendo los plásmidos
pXA50 y pXA51, consistentes
respectivamente en los fragmentos EcoRI de
82
1,9 kb y 2,2 kb del inserto de pXA5 clonados
en pUC19. Pero ninguno de estos 2 subclones
presentó actividad xilanasa (Tabla II.2.1).
2.1.2. Secuenciación e identificación de
los genes de pXA5
Puesto que no se obtuvieron subclones activos,
se secuenciaron los extremos de los insertos de
pXA5 y de pXA50 y pXA51 (contenidos en
los subclones), usando para ello cebadores que
flanqueaban el sitio de clonación múltiple de
pUC19. La secuenciación reveló que el inserto
de pXA5 era homólogo a la región del genoma
de Bacillus subtilis entre 1940 kb y 1949 kb
(Kunst et al., 1997). Esta región de Bacillus
subtilis (Figura II.2.1) contenía, entre otros, los
genes bglC (anotado como endoglucanasa),
ynfF (gen de función desconocida homólogo a
genes de xilanasas) y xynD (anotado como
xilanasa).
La nueva información permitió diseñar
cebadores para avanzar en la secuenciación de
zonas concretas del inserto de pXA5,
comprobándose que el plásmido contenía 2
Figura II.2.1: Región del genoma de Bacillus subtilis con homología al inserto de pXA5, conteniendo los genes bglC, ynfF y xynD.
ynfFynfF xynDxynD
pXA50 pXA51
Subclonación
Secuenciación y Búsquedas de homología
pXA5
Tabla II.2.1: Actividad xilanasa de los clones y subclones obtenidos.
Clones recombinantes
Actividad en placa
U/ml de cultivo
E. coli/pXA5 (XA5) + 0,01E. coli/pXA50 (XA50) - 0,00E. coli/pXA51 (XA51) - 0,00E. coli/pUC19 (C -) - 0,00
83
pautas abiertas de lectura homólogas a los
genes ynfF y xynD de Bacillus subtilis.
2.1.2.1.- Secuencia y homología de xynD de
Bacillus sp. BP-7
La pauta abierta de lectura contenida en pXA5
que presentaba muy alta homología con el gen
xynD de Bacillus subtilis, pasó a denominarse
xynD de Bacillus sp. BP-7 (Figura II.2.2).
La proteína deducida de esta pauta abierta de
lectura, XynD de BP-7, contiene 512
aminoácidos, y muestra un peso molecular
teórico de 54243,9 Da y un pI teórico de 8,17.
Las búsquedas de homología en bases de datos
(NCBI y SubtiList) mostraron que la proteína
XynD de Bacillus sp. BP-7 presentaba alta
homología con XynD de Bacillus subtilis 168
(84% de identidad) (Kunst et al., 1997), tal
como se esperaba, con XynD de Paenibacillus
polymyxa (64% de identidad) (Gosalbes et al.,
1991), XynA de Caldicellulosiruptor sp.
Tok7B.1 (49% de identidad) (Gibbs et al.,
2000), una xilanasa de Caldicellulosiruptor sp.
Rt69B.1 (48% de identidad) (NCBI
AAB95326) y XynF de Caldicellulosiruptor
saccharolyticus (48% de identidad) (Luthi et
al., 1990).
Muchas de estas enzimas pertenecen a la
familia 43 de glicosil hidrolasas en lugar de a
las familias 10 y 11, típicas de xilanasas.
Resulta de interés señalar en este punto que la
familia 43 contiene mayoritariamente enzimas
con actividad arabinofuranosidasa, y que
algunas de las proteínas homólogas a la
nuestra (entre ellas XynD de Paenibacillus
polymyxa) han sido caracterizadas
bioquímicamente presentando actividad
arabinofuranosidasa, además de actividad
xilanasa.
2.1.2.1.- Secuencia y homología de ynfF de
Bacillus sp. BP-7
Por otro lado, la pauta abierta de lectura del
inserto de pXA5 que presentaba homología
con el gen ynfF de Bacillus subtilis, pasó a
denominarse ynfF de Bacillus sp. BP-7
(Figura II.2.3).
Esta pauta abierta de lectura codifica una
proteína de 423 aminoácidos, con un peso
molecular teórico de 47608,6 Da y un pI
teórico de 8,80, a la que se denominó YnfF.
Los estudios de homología de secuencia que se
realizaron (NCBI y SubtiList) mostraron alta
homología entre YnfF de Bacillus sp. BP-7 e
YnfF de Bacillus subtilis 168 (92% de
identidad) (Kunst et al., 1997). Asimismo, se
halló alta homología con una endoxilanasa de
Aeromonas punctata W-61 (79% de identidad)
(NCBI BAA13641), la xilanasa D de
Aeromonas caviae ME-1 (77% de identidad)
(Suzuki et al., 1997) y la xilanasa A de
Pectobacterium chrysanthemi D1 (39% de
identidad) (Keen et al., 1996).
Todas estas enzimas presentan homología a
glicosil hidrolasas de la familia 5, en lugar de a
xilanasas de las familias 10 u 11.
84
496 CCC CAT TTT TAG AAA AAA GGA GGA TGT TAA GTC ATG AGT AAA AAG 540 Met Ser Lys Lys 4
541 TGT AGC GTA TGT TTA TGG GTT CTT GCT TTA TTA TTG AGT TGC TTA 5855 Cys Ser Val Cys Leu Trp Val Leu Ala Leu Leu Leu Ser Cys Leu 19
586 TTT GGG GAG TCT GCG TAT GCA GCC AGT ACT ACA ATT GCA AAA CAT 63020 Phe Gly Glu Ser Ala Tyr Ala Ala Ser Thr Thr Ile Ala Lys His 34
631 GCA GGG AAT TCA AAC CCC CTT ATA GAC CAT CAT TTG GGA GCA GAT 67535 Ala Gly Asn Ser Asn Pro Leu Ile Asp His His Leu Gly Ala Asp 49
676 CCG TTT GCG CTG ACC TAT AAC GGA AGA GTC TAC ATC TAT ATG TCA 72050 Pro Phe Ala Leu Thr Tyr Asn Gly Arg Val Tyr Ile Tyr Met Ser 64
721 AGT GAT GAC TAT GAA TAT AAT AGC AAC GGA ACG ATT AAG GAT AAC 76565 Ser Asp Asp Tyr Glu Tyr Asn Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Asn 79
766 TCA TTT GCC AAT TTG AAT AGA GTA TTC GTC ATC TCT TCA GCG GAT 81080 Ser Phe Ala Asn Leu Asn Arg Val Phe Val Ile Ser Ser Ala Asp 94
811 ATG GTG AAC TGG ACA GAC CAC GGA GCC ATT CCG GTA GCA GGT GCC 85595 Met Val Asn Trp Thr Asp His Gly Ala Ile Pro Val Ala Gly Ala 109
856 AAC GGG GCT AAT GGC GGC CGG GGG ATT GCG AAA TGG GCA GGT GCG 900110 Asn Gly Ala Asn Gly Gly Arg Gly Ile Ala Lys Trp Ala Gly Ala 124
901 TCC TGG GCC CCG TCA GTC GCA GTT AAA AAG ATA AAT GGT AAG GAT 945125 Ser Trp Ala Pro Ser Val Ala Val Lys Lys Ile Asn Gly Lys Asp 139
946 AAA TTC TTC CTT TAT TTC GCA AAC AGC GGC GGA GGT ATC GGG GTT 990140 Lys Phe Phe Leu Tyr Phe Ala Asn Ser Gly Gly Gly Ile Gly Val 154
991 CTC ACC GCA GAC AGC CCG ATT GGC CCA TGG ACC GAC CCA ATC GGA 1035155 Leu Thr Ala Asp Ser Pro Ile Gly Pro Trp Thr Asp Pro Ile Gly 169
1036 AAA GCG CTC GTA ACG CCA AGT ACG CCA GGA ATG TCC GGT GTT GTA 1080170 Lys Ala Leu Val Thr Pro Ser Thr Pro Gly Met Ser Gly Val Val 184
1081 TGG CTT TTT GAT CCG GCA GTA TTT GTA GAT GAT GAC GGC ACC GGT 1125185 Trp Leu Phe Asp Pro Ala Val Phe Val Asp Asp Asp Gly Thr Gly 199
1126 TAC CTG TAT GCC GGG GGA GGC GTT CCT GGC GGT TCA AAT CCA ACG 1170200 Tyr Leu Tyr Ala Gly Gly Gly Val Pro Gly Gly Ser Asn Pro Thr 214
1171 CAG GGA CAA TGG GCC AAT CCT AAA ACA GCA AGA GTC ATG AAA TTG 1215215 Gln Gly Gln Trp Ala Asn Pro Lys Thr Ala Arg Val Met Lys Leu 229
1216 GGG CCT GAT ATG ACC AGT GTT GTT GGA AGT GCA GCT ACA ATT GAT 1260230 Gly Pro Asp Met Thr Ser Val Val Gly Ser Ala Ala Thr Ile Asp 244
1261 GCG CCT TTT ATG TTT GAA GAT TCG GGA ATG CAT AAG CAT AAC GGA 1305245 Ala Pro Phe Met Phe Glu Asp Ser Gly Met His Lys His Asn Gly 259
1306 AAA TAT TAC TAT TCC TAT TGC ATC AAT TTC GGG GGC ACG CAC CCG 1350260 Lys Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Cys Ile Asn Phe Gly Gly Thr His Pro 274
1351 GCC GAT AAA CCC CCA GGT GAG ATC GGC TAT ATG ACC AGC TCA AGT 1395275 Ala Asp Lys Pro Pro Gly Glu Ile Gly Tyr Met Thr Ser Ser Ser 289
1396 CCC ATG GGT CCC TTT ACA TAT AGA GGG CAC TTC CTG AAA AAT CCG 1440290 Pro Met Gly Pro Phe Thr Tyr Arg Gly His Phe Leu Lys Asn Pro 304
1441 GGA GCA TTT TTC GGA GGT GGC GGA AAC AAC CAC CAT GCT GTT TTC 1485305 Gly Ala Phe Phe Gly Gly Gly Gly Asn Asn His His Ala Val Phe 319
1486 AAT TTA AAA AAT GAG TGG TAT GTG GTG TAC CAT GCT CAA ACT GTC 1530320 Asn Leu Lys Asn Glu Trp Tyr Val Val Tyr His Ala Gln Thr Val 334
85
1531 AGT TCC GCT CTG TTC GGA GCC GGC AAA GGA TAC CGT TCT CCC CAT 1575335 Ser Ser Ala Leu Phe Gly Ala Gly Lys Gly Tyr Arg Ser Pro His 349
1576 ATT AAT AAG CTG GTG CAT AAT GCA GAT GGA TCC ATT CAA GAG GTT 1620350 Ile Asn Lys Leu Val His Asn Ala Asp Gly Ser Ile Gln Glu Val 364
1621 GCG GCA AAT TAT GCA GGC GTA ACA CAG CTT TCC AAT TTG AAT CCA 1665365 Ala Ala Asn Tyr Ala Gly Val Thr Gln Leu Ser Asn Leu Asn Pro 379
1666 TTT AAC CGG GTA GAA GCT GAA ACG TTT GCC TGG AAT GGA CGC ATA 1710380 Phe Asn Arg Val Glu Ala Glu Thr Phe Ala Trp Asn Gly Arg Ile 394
1711 TTG ACC GAG AAA TCT TCA GCA ACC GGC GGG CCG GTA AAT AAT CAA 1755395 Leu Thr Glu Lys Ser Ser Ala Thr Gly Gly Pro Val Asn Asn Gln 409
1756 AAT GTA ACA AGC ATT CAT AAC GGA GAC TGG ATT GCT GTA GGA AAT 1800410 Asn Val Thr Ser Ile His Asn Gly Asp Trp Ile Ala Val Gly Asn 424
1801 GCA GAC TTC GGG GCG GGC GGT GCC AGA ACG TTT AAA GCA AAT GTA 1845425 Ala Asp Phe Gly Ala Gly Gly Ala Arg Thr Phe Lys Ala Asn Val 439
1846 GCA TCC ACT ATA GGC GGG AAA ATA GAA GTG CGT CTA GAC AGT GCA 1890440 Ala Ser Thr Ile Gly Gly Lys Ile Glu Val Arg Leu Asp Ser Ala 454
1891 AAC GGT AAG CTT GCA GGA ACC CTG AAT GTA CCT TCC ACA GGC GGA 1935455 Asn Gly Lys Leu Ala Gly Thr Leu Asn Val Pro Ser Thr Gly Gly 469
1936 GCG CAA ACC TGG AGA GAA ATA GAA ACT GCG GTA AGC GGT GCA ACC 1980470 Ala Gln Thr Trp Arg Glu Ile Glu Thr Ala Val Ser Gly Ala Thr 484
1981 GGT GTA CAC AAA GTT TTC TTT GTA TTT ACC GGA ACA GGT ACA GGA 2025485 Gly Val His Lys Val Phe Phe Val Phe Thr Gly Thr Gly Thr Gly 499
2026 AAC TTG TTT AAT TTT GAT TAC TGG CAG TTT ACG CAA AGA TAG CAG 2070500 Asn Leu Phe Asn Phe Asp Tyr Trp Gln Phe Thr Gln Arg Stop
2071 ATG AGA AAA CCT TTT GTT TGC AAT ATA AAA GGA GAC AGA TCA GAT 2115
Figura II.2.2: Secuencia de nucleótidos y secuencia deducida de aminoácidos del gen xynD de Bacillus sp. BP-7.
93 AAA AGA CAA GGA GAG GAA AAA ATG ATT TCA AGC GTA AAA AAA CCA 137 Met Ile Ser Ser Val Lys Lys Pro 7
138 ATT TGT GTA TTA TTG GTA TGT TTC ACT ATG CTG TCA GTC ATG TTA 1828 Ile Cys Val Leu Leu Val Cys Phe Thr Met Leu Ser Val Met Leu 22
183 GCC GGG CCA GGT GCT ACT GAA GTT TTA GCA GCA AGT GAT GTA ACA 22723 Ala Gly Pro Gly Ala Thr Glu Val Leu Ala Ala Ser Asp Val Thr 37
228 ATT AAT TTA TCT GCA GAA AAA CAA GTG ATC CGC GGT TTT GGA GGC 27238 Ile Asn Leu Ser Ala Glu Lys Gln Val Ile Arg Gly Phe Gly Gly 52
273 ATG AAC CAC CCG GCT TGG ATT GGA GAT TTG ACA GCA GCT CAA AGA 31753 Met Asn His Pro Ala Trp Ile Gly Asp Leu Thr Ala Ala Gln Arg 67
318 GAA ACC GCT TTT GGC AAT GGA CAG AAT CAG TTA GGT TTT TCA ATC 36268 Glu Thr Ala Phe Gly Asn Gly Gln Asn Gln Leu Gly Phe Ser Ile 82
363 TTA AGA ATT CAT GTG GAT GAA AAT AGA AAT AAT TGG TAT AGA GAA 40783 Leu Arg Ile His Val Asp Glu Asn Arg Asn Asn Trp Tyr Arg Glu 97
408 GTG GAG ACT GCA AAG AAT GCG ATC AAA CAT GGA GCA ATC GTT TTT 45298 Val Glu Thr Ala Lys Asn Ala Ile Lys His Gly Ala Ile Val Phe 112
86
453 GCT TCT CCC TGG AAT CCT CCA AGC GAT ATG GTT GAG ACC TTC AAT 497113 Ala Ser Pro Trp Asn Pro Pro Ser Asp Met Val Glu Thr Phe Asn 127
498 CGT AAT GGT GAC ACA TCA GCT AAA CGG CTA AGA TAC GAT AAG TAC 542128 Arg Asn Gly Asp Thr Ser Ala Lys Arg Leu Arg Tyr Asp Lys Tyr 142
543 GCC GCA TAC GCG CAG CAT CTT AAC GAT TTT GTT ACC TAC ATG AAG 587143 Ala Ala Tyr Ala Gln His Leu Asn Asp Phe Val Thr Tyr Met Lys 157
588 AAT AAT GGC GTG AAT CTT TAT GCG ATT TCT GTT CAA AAC GAG CCT 632158 Asn Asn Gly Val Asn Leu Tyr Ala Ile Ser Val Gln Asn Glu Pro 172
633 GAT TAT GCA CAC GAA TGG ACG TGG TGG ACT CCG CAA GAA ATA CTT 677173 Asp Tyr Ala His Glu Trp Thr Trp Trp Thr Pro Gln Glu Ile Leu 187
678 CGT TTC ATG AGA GAA AAT GCC GGT TCC ATT AAT GCA CGT GTC ATT 722188 Arg Phe Met Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ile Asn Ala Arg Val Ile 202
723 GCA CCA GAA TCT TTT CAG TAC TTT AAA AAT ATA TCG GAC CCC ATT 767203 Ala Pro Glu Ser Phe Gln Tyr Phe Lys Asn Ile Ser Asp Pro Ile 217
768 TTG AAC GAT CCA CAG GCG CTT AGG AAT ATG GAT ATT CTC GGA ACT 812218 Leu Asn Asp Pro Gln Ala Leu Arg Asn Met Asp Ile Leu Gly Thr 232
813 CAC CTG TAC GGT ACT CAG GTC AGT CAG TTT CCT TAT CCT CTA TTC 857233 His Leu Tyr Gly Thr Gln Val Ser Gln Phe Pro Tyr Pro Leu Phe 247
858 AAA CAA AAA GGA GCA GGG AAA GAG CTA TGG ATG ACG GAA GTA TAC 902248 Lys Gln Lys Gly Ala Gly Lys Glu Leu Trp Met Thr Glu Val Tyr 262
903 TAT CCA AAC AGT GAC AAC AAT TCA GCG GAT CGC TGG CCC GAG GCA 947263 Tyr Pro Asn Ser Asp Asn Asn Ser Ala Asp Arg Trp Pro Glu Ala 277
948 TTA GGC GTT TCA GAG CAT ATT CAC CAT TCA ATG GTG GAG GGA GAT 992278 Leu Gly Val Ser Glu His Ile His His Ser Met Val Glu Gly Asp 292
993 TTT CAA TCT TAT GTT TGG TGG TAC ATC CGC AGA TCT TAC GGT CCT 1037293 Phe Gln Ser Tyr Val Trp Trp Tyr Ile Arg Arg Ser Tyr Gly Pro 307
1038 ATG AAA GAA GAC GGT ACG ATC AGC AAA CGC GGT TAC AAT ATG GCT 1082308 Met Lys Glu Asp Gly Thr Ile Ser Lys Arg Gly Tyr Asn Met Ala 322
1083 CAT TTC TCG AAG TTT GTG CGT CCC GGC TAT GTA AGG GTT GAT GCA 1127323 His Phe Ser Lys Phe Val Arg Pro Gly Tyr Val Arg Val Asp Ala 337
1128 ACG AAA AAT CCT AAT GCG AAC GTT TAC GTG TCA GCC TAT AAA GGT 1172338 Thr Lys Asn Pro Asn Ala Asn Val Tyr Val Ser Ala Tyr Lys Gly 352
1173 GAC AAC AAG GTC GTT ATT GTT GCC ATT AAC AAA AGC AAT ACA GGG 1217353 Asp Asn Lys Val Val Ile Val Ala Ile Asn Lys Ser Asn Thr Gly 367
1218 GTC AAC CAA AAC TTT GTG TTG CAG AAT GGA TCT GCT TCT CAG GTA 1262368 Val Asn Gln Asn Phe Val Leu Gln Asn Gly Ser Ala Ser Gln Val 382
1263 TCT AGG TGG ATA ACA AGC GGA AGC AGC AAT CTT CAA CCT GGA ACG 1307383 Ser Arg Trp Ile Thr Ser Gly Ser Ser Asn Leu Gln Pro Gly Thr 397
1308 AAT CTC AAT GTA ACG GGC AAT CAT TTT TGG GCC CAT CTT CCA GCT 1352398 Asn Leu Asn Val Thr Gly Asn His Phe Trp Ala His Leu Pro Ala 412
1353 CAA AGC GTG ACA ACA TTT GTC GCA AAT CGT TAA GGG GAC CTC AGG 1397413 Gln Ser Val Thr Thr Phe Val Ala Asn Arg Stop
1398 CAA GCG GGC CCG CGG ACA TGT TTT GCC AAA AAT CCA TAT AGC AAA 1442
Figura II.2.3: Secuencia de nucleótidos y secuencia deducida de aminoácidos del gen ynfF de Bacillus sp. BP-7.
87
También se encontró homología entre YnfF
(posiciones 103 a 365) y el dominio
conservado de las glicosil hidrolasas de la
familia 30 (GH 30) (65% de identidad), y con
módulos de unión a carbohidratos de la familia
6 (CBM6) de Clostridium (70% de identidad).
2.1.2. Aislamiento de los genes xynD e
ynfF de Bacillus sp. BP-7
Con el fin de estudiar independientemente
estos dos genes y caracterizar las enzimas
correspondientes, se procedió a amplificarlos y
clonarlos por separado.
Se diseñaron para ello cebadores que
contenían las dianas SmaI y SacI, necesarias
para clonar cada uno de los genes en la
dirección adecuada dentro del polylinker de los
vectores lanzadera E. coli - Bacillus subtilis
pMSR8amy y pMSR8SPO2 (Figura II.2.4).
Estos vectores lanzadera se eligieron con el fin
de poder sobreexpresar estas xilanasas en
cepas huéspedes de Bacillus subtilis, de
manera que se facilitara su obtención en alta
cantidad para su purificación así como para
ensayos papeleros.
En primer lugar, los resultados de
amplificación de ambos genes se clonaron de
manera independiente en pUC19 usando la
diana EcoRV (extremos romos), y se
transformaron en E. coli 5K.
Tras la selección de transformantes
recombinantes (colonias blancas ampicilina
resistentes), el análisis por restricción de los
plásmidos contenidos en ellos permitió la
selección de los plásmidos pUC19-xynD y
pUC19-ynfF, que contenían los genes xynD e
ynfF respectivamente.
A continuación los plásmidos obtenidos se
digirieron con SmaI y SacI para clonar de
manera direccional los genes xynD e ynfF en
los vectores pMSR8amy y pMSR8SPO2,
bajo el control de los promotores contenidos
en ellos.
Los nuevos plásmidos construidos se
transformaron en varias cepas huéspedes de
Escherichia coli (5K, HB101 y DH5α).
En el caso de ynfF, entre los clones
recombinantes obtenidos, se seleccionaron los
siguientes para poder realizar los estudios
bioquímicos:
Cebador Secuencia Región de hibridación
FWXYND Sma I TGACCCGGGTGATCACCCCCC
Cadena - antes de la región de unión al ribosoma de xynD.
BKXYND Sac I TTGAGCTCTCTGATCTGTCTCC
Cadena + después del codón stop de xynD.
FWYNFF Sma I TACCCGGGAAGACAAGGAGAGG
Cadena - antes de la región de unión al ribosoma de ynfF.
BKYNFF Sac I CTGAGCTCCCCTTAACGATTTG
Cadena + después del codón stop de ynfF.
Figura II.2.4: Cebadores diseñados para la amplificación de la región estructural de los genes xynD (FWXYND + BKYND) e ynfF (FWYNFF + BKYNFF).
88
– E. coli HB101/pMSR8amy-ynfF 9.
– E. coli 5K/pMSR8SPO2-ynfF 1A.
– E. coli DH5α/pMSR8amy-ynfF 4.
– E. coli DH5α/pMSR8SPO2-ynfF 50.
Todos estos clones presentaron niveles
similares de actividad sobre xilano de madera
de abedul (unas 0,004 U/ml de cultivo).
También se escogieron varios clones que
contenían el gen xynD, aunque ninguno de los
clones analizados mostró actividad xilanasa
sobre xilano de madera de abedul. Este hecho
sugería que, tal como mostraban los estudios
de homología, el gen xynD codificaba una
arabinofuranosidasa en lugar de una xilanasa.
2.2. Caracterización bioquímica
de la enzima YnfF de Bacillus sp.
BP-7
2.2.1. Determinación del peso
molecular.
Para confirmar de manera experimental el peso
molecular teórico de 47608,6 Da de YnfF, se
obtuvieron extractos celulares concentrados de
la cepa recombinante E. coli
DH5α/pMSR8amy-ynfF 4 y se analizaron
mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), junto a
los extractos celulares de un control negativo
(E. coli DH5α/pMSR8amy). Los geles de
electroforesis resultantes fueron revelados con
azul de Coomassie y mediante técnicas
zimográficas (Figura II.2.5).
Los geles revelados con tinción de Coomassie
no mostraron diferencias significativas en el
patrón de bandas proteicas del extracto celular
del clon recombinante respecto al del control
negativo. Mientras que en los geles paralelos
desarrollados como zimograma se observó una
banda intensa de actividad xilanasa
únicamente en el carril del extracto celular de
E. coli DH5α/pMSR8amy-ynfF 4. Esta banda
de actividad xilanasa mostró un peso
molecular aparente de unos 47 - 48 kDa, en
concordancia con el peso molecular teórico
deducido previamente a partir de la secuencia.
Figura II.2.5: Análisis electroforético de la xilanasa YnfF mediante SDS-PAGE.(A) Gel revelado con azul de Coomassie.(B) Zimograma de actividad xilanasa.(1) Control –.(2) Extractos concentrados de E. coli DH5α/pMSR8amy-ynfF 4.
37 -
25 -
15 -
50 -
75 -
kDa
100 -150 -
A B
1 2 1 2
89
2.2.2. Propiedades enzimáticas
2.2.2.1. - Especificidad de sustrato
Se hicieron estudios de especificidad de
sustrato ensayando la actividad de extractos
crudos de los clones recombinantes de E. coli
conteniendo el gen ynfF sobre diferentes
xilanos, celulosas y otros polisacáridos,
además de sobre aril-xilósidos y otros
aril-glicósidos.
Los resultados obtenidos (Tabla II.2.2)
mostraron que la xilanasa YnfF tenía actividad
sobre xilanos de maderas duras (tales como
xilano de madera de abedul, de haya y metil
glucuronoxilano), obteniéndose los valores
más altos sobre xilano de madera de abedul
(0,581 U/g). Por el contrario, la enzima no
presentó actividad detectable sobre xilanos de
gramíneas (arabinoxilanos), y su actividad
tampoco fue detectable o significativa sobre
los aril-glicósidos ensayados.
2.2.2.2. - pH óptimo y Temperatura óptima
Se determinaron las condiciones óptimas en
cuanto a pH y temperatura para la actividad de
YnfF sobre xilano de madera de abedul.
Para ello se ensayó la actividad xilanasa de
extractos crudos de los clones recombinantes
Tabla II.2.2: Especificidad de sustrato de la xilanasa YnfF.
Sustrato
Actividad específica
(U/g) a
% respecto a la actividad específica
máximaXilano de madera de abedul 0,581 100,0Xilano de madera de haya 0,464 79,9Metil glucuronoxilano 0,573 98,7Xilano de espelta de avena ND 0Arabinoxilano de trigo ND 0Arabinoxilano de centeno ND 0Carboximetil celulosa ND 0Avicel ND 0Laminarina ND 0Liquenano ND 0Poligalacturonato ND 0Pectina ND 0Almidón ND 0pNPX 0,001 0,2oNPX ND 0pNPG ND 0pNPAp ND 0pNPAf ND 0
a ND: No Detectable
90
de E. coli conteniendo el gen ynfF sobre xilano
de madera de abedul en el rango de pH de 3 a
12 en intervalos de 0,5 unidades de pH, a una
temperatura de 65 ºC.
A partir de estos ensayos se observó que el pH
óptimo de XynA en extractos crudos es de 6,5,
presentando más de un 50% de actividad en el
rango de pH entre 4,5 y 10 (Figura II.2.6).
Se midió también la actividad de estos
extractos, a pH 7 y 6,5, en el rango de
temperaturas de 30 a 75 ºC, en intervalos de
5 ºC.
Los ensayos permitieron determinar que la
temperatura óptima de YnfF en extractos
crudos es de 65 ºC, presentando más de un
60% de actividad en el rango de temperaturas
comprendido entre 30 y 70 ºC (Figura II.2.7).
2.2.2.3. - Termorresistencia
Para analizar la termoestabilidad de la enzima
YnfF, factor importante para una posible
aplicación en procesos industriales, los
extractos crudos de de los clones
recombinantes de E. coli conteniendo el gen
ynfF se incubaron a 50, 55 ó 60 ºC durante
diferentes intervalos de tiempo hasta un
máximo de 3 h, a pH 7. A continuación se
ensayó la actividad xilanasa residual sobre
xilano de madera de abedul (Figura II.2.8).
Figura II.2.6: Efecto del pH sobre la actividad de YnfF.
0
20
40
60
80
100
Act
ivid
ad r
elat
iva
(%)
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH
Figura II.2.7: Efecto de la temperatura sobre la actividad de YnfF.
30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Temperatura (ºC)
20
40
60
80
100
Act
ivid
ad r
elat
iva
(%)
Figura II.2.8: Termorresistencia de YnfF a pH 7.
30 60 90 120 150 1800
25
50
75
100
125
150
Tiempo de preincubación (min.)
Act
ivid
ad r
elat
iva
(%)
55 ºC
50 ºC
60 ºC
91
La xilanasa cruda se mostró altamente estable
a las 3 temperaturas ensayadas, alcanzando
incluso valores superiores al 100% de su
actividad tras las 3 h de incubación ensayadas,
lo que hace suponer un proceso de activación
por temperatura.
Los valores de actividad relativa fueron
significativamente superiores en el caso de las
incubaciones a 50 ºC.
2.2.2.4. - Influencia de iones metálicos sobre
la actividad
Por último, se comprobó la influencia de
diferentes cationes metálicos sobre la actividad
de la xilanasa YnfF.
Para ello, se realizaron ensayos de actividad
xilanasa en presencia de diferentes cationes
metálicos a concentraciones finales de 1 mM y
10 mM.
Se realizaron también ensayos de actividad
xilanasa añadiendo EDTA (1 y 10 mM), y una
muestra sin adicionar ningún catión
(Control +).
Tal como se observa en la Figura II.2.9, en
general la xilanasa YnfF mostró únicamente
una ligera inhibición por casi todos los
cationes a concentraciones de 1 mM.
Sin embargo, a concentraciones de 10 mM, el
grado de inhibición por algunos cationes tales
como Fe3+, Hg2+, Cu2+, Zn2+ y Mn2+ fue
importante (7 - 29% de la actividad residual);
mientras que para el resto de cationes la
actividad residual se mantuvo superior al 80%.
Por otro lado, la adición de EDTA no modificó
de forma significativa la actividad de la
enzima.
Act
ivid
ad R
elat
iva
(%)
1 mM 10 mM
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ni2+
NH
4+
Mn2+
Mg2+
Fe3+
Cu2+
Co2+
Ba2+
Pb2+
Zn2+
Ca2+
Ag2+
Hg2+
ED
TA C+
Figura II.2.9: Influencia de diferentes iones y EDTA a 1 y 10 mM sobre la actividad de YnfF.
CCAPÍTULOAPÍTULO III. III.
EESTUDIOSTUDIO DEDE LALA XILANASAXILANASA X XYNYNB B DEDE
PPAENIBACILLUSAENIBACILLUS BARCINONENSISBARCINONENSIS
95
1. - I1. - INTRODUCCIÓNNTRODUCCIÓN YY O OBJETIVOSBJETIVOS
La xilanasa B (también denominada X20 o
XynB) de Paenibacillus barcinonensis
(previamente descrito como Bacillus sp.
BP-23) había sido clonada en Escherichia coli
y caracterizada previamente por el grupo de
investigación. Esta xilanasa presenta una
inusual actividad sobre aril-xilósidos, así como
actividad transxilosidasa (Blanco et al., 1996),
lo cual la convierte en una enzima de interés
tanto a nivel de ciencia básica como a nivel
biotecnológico.
Un factor importante a la hora de facilitar la
aplicación de enzimas es la obtención de cepas
productoras que expresen y secreten las
enzimas en cantidades elevadas. Estas cepas
también resultan de interés para obtener
cantidades suficientes de enzimas para su
adecuado estudio bioquímico y estructural.
De esta manera, los objetivos de este capítulo
fueron:
- El análisis detallado de la especificidad de
sustrato de la xilanasa B de Paenibacillus
barcinonensis.
- La clonación de la xilanasa B de
Paenibacillus barcinonensis en vectores
lanzadera E. coli - Bacillus subtilis para su
posterior transformación en cepas
huéspedes de Bacillus subtilis.
- El estudio de la sobreexpresión en los
clones recombinantes de Bacillus subtilis
obtenidos.
2. - R2. - RESULTADOSESULTADOS
2.1. Especificidad de sustrato de
XynB de Paenibacillus
barcinonensis
Tal como se ha comentado, la xilanasa XynB
de Paenibacillus barcinonensis, además de
actividad xilanasa, presenta una elevada
actividad sobre aril-xilósidos.
Con el fin de dilucidar mejor la especificidad
de sustrato de esta enzima, se obtuvieron
extractos celulares concentrados del clon
E. coli 5K/pX60, derivado del clon original
E. coli 5K/pX20 (Blanco et al., 1996), y se
ensayó su actividad enzimática sobre
diferentes xilanos, otros polisacáridos,
aril-xilósidos y otros aril-glicósidos, todos
ellos al 0,5%, a excepción de los
aril-glicósidos, que se ensayaron al 0,1%.
Los resultados (Tabla III.2.1) mostraron que
XynB presenta similar actividad específica
sobre los diferentes xilanos ensayados,
independientemente de su grado y tipo de
sustituciones. De entre éstos, la máxima
actividad se obtuvo sobre arabinoxilano de
trigo (265,4 U/g). La enzima también presentó
actividad sobre todos los aril-glicósidos
ensayados, resultando destacable su actividad
sobre aril-xilósidos, siendo ésta igual o incluso
superior a su actividad sobre xilanos. En
concreto, la actividad específica sobre oNPX
(550,3 U/g) fue aproximadamente el doble que
la obtenida sobre arabinoxilano de trigo.
96
Los resultados obtenidos corroboran los
previamente publicados (Blanco et al., 1996) y
podrían indicar que XynB es una β-xilosidasa
(β-1,4-xylosidases, EC 3.2.1.37) en lugar de
una xilanasa. Sin embargo, su incapacidad
para hidrolizar la xilobiosa tal como se había
demostrado en trabajos previos (Blanco et al.,
1996) descartan esta interpretación.
2.2. Producción de XynB de
Paenibacillus barcinonensis en
huéspedes homólogos
2.2.1. Clonación en vectores lanzadera
E. coli-Bacillus subtilis
2.2.1.1. - Amplificación de xynB para su
clonación en Escherichia coli
La xilanasa B es una enzima de dominio único
de 332 aminoácidos, con un peso molecular
teórico de 38561 Da. Está codificada por una
pauta abierta de lectura (ORF) de 999 bp
Tabla III.2.1: Especificidad de sustrato de XynB en extractos crudos de E. coli 5K/pX60.
Sustrato
Actividad específica
(U/g) a
% respecto a la actividad específica
máximaXilano de madera de abedul 215,0 39,07Xilano de madera de haya 248,7 45,18Meti glucuronoxilano 169,6 30,82Xilano de espelta de avena 213,1 38,72Arabinoxilano de trigo 265,4 48,23Arabinoxilano de centeno 224,4 40,77Carboximetil celulosa 3,1 0,56Avicel 3,5 0,63Laminarina ND 0Liquenano ND 0Almidón ND 0pNPX 286,1 51,98oNPX 550,3 100,00pNPG 0,6 0,11pNPG2 41,5 7,53pNPG3 42,5 7,72pNPG4 42,1 7,66pNPG5 31,4 5,70pNAp 26,4 4,80pNAf 0,8 0,14
a ND: No Detectable
97
contenida en la secuencia depositada en el
EMBL-Bank con número de acceso
AJ006646.
Para clonar el gen xynB de Paenibacillus
barcinonensis en E. coli, en primer lugar se
amplificó el gen xynB a partir del ADN
plasmídico de pX60. Se diseñaron para ello
cebadores que contenían las dianas SacI y
SmaI, necesarias para clonar el gen en la
dirección adecuada dentro del polylinker de los
plásmidos pN5 y pRBSPO2; vectores
lanzadera E. coli - Bacillus subtilis
previamente construidos en el grupo de
investigación.
Además, puesto que se quería evaluar la
expresión de xynB tanto bajo el control de su
propio promotor como bajo el control del
promotor fuerte SPO2, contenido en el vector
pRBSPO2, se amplificó el gen
alternativamente con y sin su promotor.
Los 3 cebadores que se diseñaron a tal efecto
pueden verse en la Figura III.2.1.
El resultado de amplificación con los
cebadores FWX20A y BKX20 fue, tal como se
esperaba, un fragmento de 1,3 kb
correspondiente a la hipotética región
promotora (de 121 bp) más la región
estructural de xynB. Este fragmento se clonó
en el vector lanzadera pN5, entre las dianas
SacI y SmaI, dando lugar al vector pN5X20.
De la amplificación con los cebadores
FWX20B y BKX20 resultó un fragmento de
1,1 kb (tamaño esperado) correspondiente a la
región de unión al ribosoma más la región
estructural de xynB. Este fragmento se clonó
en el vector lanzadera pRBSPO2, entre las
dianas SacI y SmaI, bajo el control del
promotor SPO2, dando lugar al plásmido
pBRSPO2X20.
EcoRI (100)
EcoRI (314)
PstI (303) PstI (1020)
FWX20A FWX20B BKX20
ORF
pX60
Cebador Secuencia Región de hibridación
BKX20 Sac I ACGAGCTCTCCCTTAATCAAGGGC
Cadena - después de la pauta abierta de lectura de xynB.
FWX20A Sma I CGCCCGGGTTTTCCCAGTCAC
Cadena + antes de la hipotética región promotora de xynB.
FWX20B Sma I AACCCGGGAGGAGGAACCAGG
Cadena + después de la hipotética región promotora de xynB.
Figura III.2.1: Cebadores diseñados para la amplificación de xynB con su posible promotor (FWX20A + BKX20) y sin él (FWX20B + BKX20).
98
Los plásmidos construidos fueron
transformados en diferentes cepas de E. coli y
de entre todos los clones obtenidos se
escogieron aquellos que presentaban actividad
xilanasa en placas de agar LB suplementado
con xilano-RBB.
Se obtuvo ADN plasmídico de los clones
seleccionados y se realizaron análisis de
restricción y secuenciación para verificar las
construcciones genéticas que contenían.
A partir de estos análisis se escogió un clon de
E. coli HB101/pRBSPO2X20 y un clon de
E. coli XL1-Blue/pN5X20, por presentar el
primero de ellos xynB sin promotor propio en
pRBSPO2 (pRBSPO2X20), y xynB con su
promotor en pN5 (pN5X20) el segundo de
ellos.
Se hizo a continuación una cuantificación de
actividad xilanasa en los extractos celulares de
los clones elegidos. Los resultados se muestran
en la Tabla III.2.2.
2.2.1.2. - Transformación en las cepas de
Bacillus subtilis MB216 y MW15
Las cepas huéspedes Bacillus subtilis MB216
y Bacillus subtilis MW15, esta última
deficiente en xilanasas, celulasas y proteasas,
se transformaron con los plásmidos
pRBSPO2X20 y pN5X20.
Los transformantes obtenidos se seleccionaron
en placas de agar DM3 suplementadas con
cloramfenicol 20 µg/ml, para los
transformantes de la cepa MB216, o
cloramfenicol 50 µg/ml, para los de la cepa
MW15.
De entre todos los clones obtenidos se
seleccionaron aquellos que presentaban
actividad xilanasa en placas de agar LB con
xilano-RBB. El análisis de restricción del
ADN plasmídico de los clones seleccionados
reveló que contenían las construcciones
correctas (pN5X20 y pRBSPO2X20).
Como resultado de la transformación de las 2
construcciones en cada una de las 2 cepas de
Bacillus subtilis se obtuvieron 4 cepas
recombinantes:
– B. subtilis MW15/pN5X20
– B. subtilis MW15/pRBSPO2X20
– B. subtilis MB216/pN5X20
– B. subtilis MB216/pRBSPO2X20
Tabla III.2.2: Actividad xilanasa de los clones recombinantes elegidos.
Clones
Actividad xilanasa en placa
Actividad xilanasa
(U/ml cultivo)
E. coli HB101/pRBSPO2X20 + 0,04
E. coli XL1-Blue/pN5X20 + 0,08
E. coli 5K/pX60 (C +) + 0,08
E.coli/pUC19 (C -)
- 0,00
99
2.2.2. Expresión en Bacillus subtilis
2.2.2.1. - Análisis de expresión de la xilanasa
en las cepas recombinantes de Bacillus
subtilis
Las cepas recombinantes de B. subtilis se
cultivaron en caldo nutritivo a 30 ºC durante
varios días, se tomaron muestras a distintos
días de cultivo, y se determinó la actividad
xilanasa en los sobrenadantes de los cultivos.
Los resultados se resumen en la Tabla III.2.3 y
en la Figura III.2.2.
En vista de estos resultados se decidió
proseguir los estudios de producción con la
cepa B. subtilis MW15/pRBSPO2X20, por ser
la que presentaba los valores más elevados de
actividad xilanasa.
Para comprobar la correcta expresión de XynB
en la cepa seleccionada, se hicieron análisis
electroforéticos en geles de poliacrilamida con
SDS de las proteínas de sobrenadantes de
cultivo de dicha cepa.
Tabla III.2.3: Actividad xilanasa en los sobrenadantes de cultivos de los clones recombinantes de Bacillus subtilis.
Actividad (U/ml de sobrenadante)Cepa 1 día 2 días 3 días 4 días 8 días
MB216/pN5X20 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01MB216/pRBSPO2X20 0,01 0,03 0,03 0,02 0,02MB216 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01MW15/pN5X20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00MW15/pRBSPO2X20 0,00 0,02 0,05 0,05 0,04MW15 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Figura III.2.2: Actividad xilanasa en los sobrenadantes de cultivos de los clones recombinantes de Bacillus subtilis.
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Días
Act
ivid
ad
xila
na
sa (
U/m
l)
MB216/pN5X20MB216/pRBSPO2X20MB216MW15/pN5X20
MW15MW15/pRBSPO2X20
100
En estos sobrenadantes de B. subtilis
MW15/pRBSPO2X20 se observó una banda
de proteína que no aparecía en el sobrenadante
del control – (B. subtilis MW15/pRBSPO2) y
que mostraba la misma movilidad
electroforética que una banda proteica de los
extractos del clon original E. coli 5K/pX20
utilizado como control + (Figura III.2.3). Esta
banda mostraba un tamaño de unos 38 kDa,
que concuerda con el tamaño descrito para la
xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis
(Blanco et al., 1996), correspondiendo por
tanto a la misma.
Es de destacar también que la xilanasa B
constituía la proteína mayoritaria de los
sobrenadantes de la nueva cepa B. subtilis
MW15/pRBSPO2X20, hecho que evidencia la
eficacia en producción y secreción de la
misma.
2.2.2.2. - Expresión en diferentes medios de
cultivo
Para ensayar la influencia de la composición
del medio de cultivo sobre la producción de
xilanasa por parte de B. subtilis
MW15/pRBSPO2X20, se realizaron cultivos
de dicha cepa durante 8 días a 30 ºC en 4
medios distintos (caldo nutritivo, MG, MG2 y
BREC1), sin suplementar o suplementados con
diferentes sustancias, y se determinó la
actividad xilanasa en los sobrenadantes de
dichos cultivos a diferentes tiempos durante el
periodo de incubación.
Debido a la gran cantidad de sustancias
reductoras del medio, la actividad xilanasa de
los sobrenadantes de los medios MG y BREC1
y de algunas muestras en medios MG2 no
pudo cuantificarse por el método de
Nelson-Somogyi, y hubo que evaluarla por el
método cromogénico basado en xilano-RBB.
Esto hace que los resultados obtenidos no sean
del todo comparables, ya que los valores de
actividad obtenidos por dicho método
presentan mayor variabilidad y acostumbran a
ser algo mayores que los obtenidos por el
método de Nelson-Somogyi.
Los resultados más significativos obtenidos
con los medios utilizados se resumen en la
Tabla III.2.4.
Figura III.2.3: Análisis por SDS-PAGE en geles del 12%.(1) Extracto de E. coli 5K/pBR322 (C -).(2) Extracto de E. coli 5K/pX20.(3) Sobrenadante de cultivos de 4 días en caldo nutritivo de B. subtilis MW15/pRBSPO2X20.(4) Sobrenadante de cultivos de 4 días en caldo nutritivo de B. subtilis MW15/pRBSPO2 (C -).
45 -31 -
21 -
66 -
97 -116 -
1 2 3 4
kDa
101
Se observó que la máxima producción tuvo
lugar en caldo nutritivo suplementado con
xilano de madera de abedul a los 3 días de
cultivo.
Se hicieron también análisis de proteínas de
los sobrenadantes de los cultivos anteriores
mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida con SDS, observándose en
todos los casos la banda proteica de 38 kDa
correspondiente a XynB, muy intensa y
ausente en los controles negativos (datos no
mostrados).
2.3. Localización celular de XynB
2.3.1. Localización de XynB en Bacillus
subtilis MW15/pRBSPO2X20
Se obtuvieron los extractos celulares de las
muestras de Bacillus subtilis
MW15/pRBSPO2X20 correspondientes a los
sobrenadantes de los cultivos en los diferentes
medios ensayados, y se hicieron
determinaciones de actividad xilanasa para
medir la proporción de xilanasa existente
dentro de la célula.
Al comparar la actividad en los extractos
celulares (intracelular) con la actividad en los
sobrenadantes de cultivo (extracelular) se
observó que sorprendentemente la actividad
intracelular suponía más del 35% del total,
valor muy superior a lo esperado inicialmente
(Tabla III.2.5).
A continuación, se hicieron análisis
electroforéticos de las proteínas de los
extractos celulares y sobrenadantes de cultivos
de 3 y 4 días de B. subtilis
MW15/pRBSPO2X20 en caldo nutritivo.
Tanto en los extractos celulares como en los
sobrenadantes se observó la banda proteica de
Tabla III.2.4: Producción de xilanasa por B. subtilis MW15/pRBSPO2X20 en distintos medios de cultivo.
Medio base Sustancia añadidaDía de máxima
actividadMáxima actividad
(U/ml sobrenadante)
Caldo nutritivo
- 4 0,06Xilano de espelta de avena 1% 3 0,09Paja de arroz 1% 4 0,20Xilano de madera de abedul 0,2% 3 0,23
MG- 8 0,12 (a)
Xilano de espelta de avena 1% 8 0,16 (a)
Paja de arroz 1% 8 0,16 (a)
MG2- 0,00Xilano de espelta de avena 1% 3 0,09 (a)
Paja de arroz 1% 8 0,13 (a)
BREC1- 0,00 (a)
Xilano de espelta de avena 1% 8 0,15 (a)
Paja de arroz 1% 4 0,07 (a)
(a) : Valores obtenidos por el método cromogénico basado en xilano-RBB.
102
38 kDa correspondiente a XynB
(Figura III.2.4). Además, la intensidad de
dicha banda proteica era aproximadamente la
misma tanto en extractos celulares como en
muestras de sobrenadantes.
La proporción tan elevada de xilanasa B
intracelular, cuando la enzima se expresaba en
cepas secretoras de Bacillus subtilis, fue un
resultado inesperado que hizo que nos
planteáramos como nuevo objetivo el estudio
de la localización celular de XynB en la cepa
original Paenibacillus barcinonensis.
2.3.2. Localización de XynB en
Paenibacillus barcinonensis
Para determinar la localización celular de la
xilanasa B en la cepa original Paenibacillus
barcinonensis, se hicieron nuevos cultivos en
caldo nutritivo suplementado con xilano de
Figura III.2.4: Análisis mediante SDS-PAGE en geles del 12% de los sobrenadantes y extractos celulares de cultivos de (1) B. subtilis MW15/pRBSPO2 (C-) y (2) B. subtilis MW15/pRBSPO2X20.
4º día de cultivo
ExtractosSobrenadantes
3er día de cultivo
Extractos
45 -
31 -
21 -
66 -
97 -116 -
1 2 1 2 1 2 1 2
Sobrenadantes
kDa
Tabla III.2.5: Actividad xilanasa en sobrenadantes y extractos celulares de cultivos de Bacillus subtilis MW15/pRBSPO2X20.
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20(4º día de incubación)
Actividad (U/ml de cultivo)
Proporción(%)
Caldo nutritivoExtracto celular 0,03 37,5Sobrenadante 0,05 62,5
Caldo nutritivo con paja de arroz 1%
Extracto celular 0,11 35,5Sobrenadante 0,20 64,5
103
madera de abedul 0,2%, de Paenibacillus
barcinonensis y de la cepa recombinante
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20. En los
extractos celulares y sobrenadantes de estos
cultivos se determinaron tanto la actividad
xilanasa (sobre xilano) como la actividad
xilosidasa (sobre pNPX), por ser XynB activa
sobre ambos sustratos (Blanco et al., 1996).
En el caso de B. subtilis MW15/pRBSPO2X20
no se detectaron valores significativos de
actividad xilanasa ni xilosidasa en los
sobrenadantes hasta las 24 h de cultivo,
mientras que en los extractos celulares se
detectaron ambas actividades a las 17 h de
cultivo. Las actividades enzimáticas en los
extractos celulares fueron muy superiores a las
encontradas en los sobrenadantes hasta las
48 h de cultivo, momento en que
aproximadamente ambas actividades se
igualaron. Únicamente en cultivos de 72 h las
actividades extracelulares xilanasa y xilosidasa
superaron ligeramente a las intracelulares
(Tabla III.2.6 y Figura III.2.5).
En el caso de Paenibacillus barcinonensis,
cepa que posee un sistema xilanolítico
complejo con varios enzimas con actividad
xilanasa y xilosidasa, se observó que los
valores de actividad xilanasa fueron siempre
mucho mayores en los sobrenadantes. Sin
embargo, la actividad xilosidasa, asociada
principalmente a XynB, era mayoritariamente
intracelular en cultivos jóvenes (14 h), y sólo a
las 48 h pasaba a localizarse de forma
mayoritaria en los sobrenadantes (Tabla III.2.6
y Figura III.2.5).
Los resultados obtenidos hasta este punto
parecían indicar que la xilanasa B era una
enzima de localización preferentemente
intracelular. Para determinar si la existencia de
lisis celular en los cultivos realizados daba
lugar a la liberación inespecífica de XynB a
los sobrenadantes de cultivo, y por tanto era
responsable de la actividad xilanasa detectada
extracelularmente, se realizaron ensayos que
evaluaban el grado de lisis celular en los
cultivos y su relación con los niveles de XynB
en los sobrenadantes.
Una de las enzimas usada comúnmente como
marcador intracelular en Bacillus subtilis es la
isocitrato deshidrogenasa (ICDH). Sin
embargo en los ensayos realizados únicamente
se pudo detectar actividad ICDH, aunque a
unos niveles muy bajos, en algunas muestras
de los extractos celulares de B. subtilis
MW15/pRBSPO2X20, pero no en los
sobrenadantes de cultivo.
Se realizaron entonces ensayos para
determinar la presencia de otro marcador
intracelular, la malato deshidrogenasa (MDH),
que a pesar de no estar descrito como tal en
Bacillus subtilis es muy usado como marcador
intracelular en E. coli.
En estos ensayos, se detecto actividad MDH
tanto en extractos como en sobrenadantes de
cultivos de 1 a 3 días de B. subtilis
MW15/pRBSPO2X20. Los valores de
104
Tabla III.2.6: Actividad xilanasa y xilosidasa total en sobrenadantes y extractos celulares de cultivos de Paenibacillus barcinonensis y Bacillus subtilis MW15/pRBSPO2X20.
Actividad xilanasa Actividad (U/ml cultivo) Porcentajes (% actividad)
14 17 24 48 72 14 17 24 48 72
Paenibacillusbarcinonensis
Extracto 0,040 - 0,035 0,051 0,052 26,2 - 6,3 5,7 6,0
Sobrenadante 0,113 - 0,514 0,850 0,821 73,8 - 93,7 94,3 94,0
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20
Extracto - 0,005 0,084 0,172 0,215 - 100,0 93,9 55,3 48,4
Sobrenadante - 0,000 0,005 0,139 0,229 - 0,0 6,1 44,7 51,6
Actividad xilosidasa Actividad (U/ml cultivo) Porcentajes (% actividad)
14 17 24 48 72 14 17 24 48 72
Paenibacillusbarcinonensis
Extracto 0,017 - 0,013 0,011 0,010 100,0 - 48,3 28,5 31,8
Sobrenadante 0,000 - 0,013 0,027 0,021 0,0 - 51,7 71,5 68,2
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20
Extracto - 0,005 0,058 0,353 0,283 - 100,0 69,9 56,7 43,6
Sobrenadante - 0,000 0,025 0,270 0,366 - 0,0 30,1 43,3 56,4
Actividad Xilanasa:
Paenibacillus sp. BP23
0,00
0,10
0,200,30
0,40
0,50
0,600,70
0,80
0,90
0 24 48 72Horas
U/m
l cul
tivo
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
D.O
.600
nm
Extractos Sobrenadantes D.O.600nm
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 24 48 72Horas
U/m
l cul
tivo
0,000,100,200,300,400,500,600,700,800,901,00
D.O
.60
0n
mExtractos Sobrenadantes D.O.600nm
Paenibacillus barcinonensis
Actividad Xilosidasa:
Paenibacillus sp. BP23
0,00
0,01
0,01
0,02
0,02
0,03
0,03
0 24 48 72Horas
U/m
l cul
tivo
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
D.O
.60
0nm
Extractos Sobrenadantes D.O.600nm
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0 24 48 72Horas
U/m
l cul
tivo
0,000,100,200,300,400,500,600,700,800,901,00
D.O
.60
0n
m
Extractos Sobrenadantes D.O.600nm
Paenibacillus barcinonensis
Figura III.2.5: Actividad xilanasa y xilosidasa en extractos celulares y sobrenadantes de cultivos de Paenibacillus barcinonensis y Bacillus subtilis MW15/pRBSPO2X20.
105
actividad de este marcador de lisis celular
obtenidos presentaron bastante correlación con
los valores de actividad xilanasa detectados en
los compartimentos intracelular y extracelular
de la cepa recombinante (Tabla III.2.7).
Por el contrario, no pudo detectarse actividad
MDH ni en extractos ni en sobrenadantes de
cultivos de Paenibacillus barcinonensis.
Ante la falta de resultados concluyentes
utilizando los marcadores intracelulares para
Paenibacillus barcinonensis, con el fin de
comprobar la localización intracelular de
XynB en dicha cepa, se realizaron análisis
zimográficos de extractos y sobrenadantes
concentrados tanto de cultivos jóvenes (17 h)
como de cultivos en fase estacionaria (72 h).
Puesto que la xilanasa B de Paenibacillus
barcinonensis se inactiva de manera
irreversible en geles desnaturalizantes
(SDS-PAGE), se tuvieron que usar geles
nativos para su posterior revelado zimográfico.
Además, se usaron 2 controles para identificar
tanto la xilanasa B, en estudio, como la
xilanasa C de Paenibacillus barcinonensis,
xilanasa de secreción previamente clonada y
caracterizada (Blanco et al., 1999): extractos
de E. coli 5K/pX20 como control + de XynB,
y extractos de E. coli 5K/pX31 como
control + de XynC. (Figura III.2.6).
Tabla III.2.7: Actividad MDH y xilanasa en fracciones celulares de B. subtilis MW15/pRBSPO2X20.
Actividad MDH(U/ml cultivo)
Actividad MDHextracelular (%)
Actividad xilanasaextracelular (%)
1 día de cultivo
Extractos 0,039
Sobrenadantes 0,0024,88 30,1
2 días de cultivo
Extractos 0,084
Sobrenadantes 0,21872,10 43,3
3 días de cultivo
Extractos 0,013
Sobrenadantes 0,06583,33 56,4
Control - 0,000
Figura III.2.6: Análisis zimográfico de sobrenadantes y extractos celulares de cultivos de Paenibacillus barcinonensis en caldo nutritivo.(1) Sobrenadante de cultivos de 17 h.(2) Extractos celulares de cultivos de 17 h.(3) Sobrenadante de cultivos de 72 h.(4) Extractos celulares de cultivos de 72 h.(5) Extractos celulares de E. coli 5K/pX20 (C + de XynB).(6) Extractos celulares de E. coli 5K/pX31 (C + de XynC).
1 2 3 4 5 6
106
En los carriles correspondientes a los
sobrenadantes concentrados de Paenibacillus
barcinonensis, tanto a 17 como a 72 h, se
observó una banda de actividad muy
prominente correspondiente a la xilanasa C,
juntamente con otras bandas difusas y menos
intensas. Todas estas bandas correspondían al
complejo de xilanasas secretadas de
Paenibacillus barcinonensis, previamente
descrito (Blanco et al. 1993, 1995). Sin
embargo, en estos sobrenadantes, no se
observó ninguna banda de actividad con la
movilidad electroforética de la xilanasa B.
Por el contrario, en los carriles
correspondientes a los extractos celulares se
observaba claramente una banda de actividad
correspondiente a la la xilanasa B, tanto en los
cultivos jóvenes de 17 h como en los de fase
estacionaria de 72 h.
En zimogramas de otras muestras de cultivos
de Paenibacillus barcinonensis
correspondientes a 17 y 72 h, se observaron
ocasionalmente bandas de actividad
correspondientes a XynB en algunos
sobrenadantes, aunque siempre mucho más
tenues que las correspondientes bandas de
actividad de XynB observadas en todos los
extractos celulares.
Para evaluar la posibilidad de que XynB fuera
una enzima de secreción pero asociada a la
pared bacteriana, se realizó un fraccionamiento
fino de extractos celulares de cultivos de 14 h
de Paenibacillus barcinonensis para separar el
citoplasma de los restos de pared y
membranas. Los extractos celulares se
centrifugaron a 38000xg durante 1 h a 4 ºC y
se recuperaron los sobrenadantes (citoplasma),
mientras que los sedimentos (pellet, restos de
pared y membranas celulares) se lavaron con
tampón acetato y se resuspendieron en 1
volumen del mismo tampón.
Tras este fraccionamiento, se ensayó la
actividad xilanasa tanto en la fracción soluble
como en la fracción particulada del extracto
celular de Paenibacillus barcinonensis.
Tal como puede observarse en los resultados
de la Tabla III.2.8, sólo se detectó actividad
xilanasa en el citoplasma (sobrenadante),
mientras que no se detecto actividad en la
fracción particulada.
2.3.3. Análisis de péptido señal
Los resultados observados indicaban que
XynB de Paenibacillus barcinonensis era una
xilanasa intracelular en lugar de una enzima de
secreción. Por ello, se realizó un análisis del
gen codificante para determinar la existencia o
no de señales de secreción en él.
El estudio de la secuencia de la región
N-terminal de XynB no reveló la presencia de
secuencias de aminoácidos compatibles con la
Tabla III.2.8: Actividad xilanasa en fracciones celulares de Paenibacillus barcinonensis.
FracciónActividad xilanasa
(U/ml cultivo) a
Citoplasma 0,080Pared y membranas celulares ND
a ND: No Detectable
107
estructura típica de un péptido señal que
pudiera ser reconocido por los sistemas de
secreción de Bacillus subtilis y otros Gram +.
La ausencia de péptido señal en XynB fue
confirmada por los análisis realizados con los
programas SignalP y PSort, en contraposición
con los de la xilanasa A de Bacillus sp. BP-7,
utilizada como control + por contener un
péptido señal típico (Figura III.2.7).
Para confirmar la ausencia de péptido señal, se
secuenció el extremo N-terminal de la
xilanasa B aislada a partir de geles de
poliacrilamida de muestras tanto de extractos
celulares como de sobrenadantes de cultivo de
B. subtilis MW15/pRBSPOX20. También se
secuenció el extremo N-terminal de la proteína
aislada a partir de extractos celulares del clon
original E. coli/pX20.
En los 3 casos, la secuencia N-terminal que se
obtuvo fue la misma, STEIPSLSAS, y
coincidía con la secuencia N-terminal
deducida a partir de la secuencia de
nucleótidos. Este resultado confirma la
ausencia de péptido señal en XynB y
corrobora que la presencia de XynB en el
medio de cultivo sería debida a una liberación
inespecífica, posiblemente por lisis celular.
MFKFTKKFLVGLTAALMSI SLFSANASAANTDYWQNWT
DGGGTVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFVVGKGWTTGSPF
RTI N
MSTEI PSLSASYANSFKI GAAVHTRMLQTEGEFI AKHY
NSVTAENQMKFEEVHPREHEYTFEAADEI VDFAVARGI
GVRG
XynA de Bacillus sp. BP-7 (C+) XynB de Paenibacillus barcinonensis
Análisis con SignalP
Figura III.2.7: Análisis de la región N-terminal de XynB de Paenibacillus barcinonensis en comparación con la región N-terminal de XynA de Bacillus sp. BP-7 (control +).En el análisis informático con SignalP, los valores de S score elevados indican secuencias de péptido señal, los valores de C score superiores a 0,5 indentifican posibles lugares de corte para peptidasas señal, y el Y score combina en un único estadístico el S score y el C score para una mejor predicción del lugar de corte de las peptidasas señal.
108
2.4. Estudio de las homologías de
XynB
2.4.1. Homologías de XynB
La secuencia de aminoácidos de XynB fue
comparada con secuencias de proteínas
conocidas contenidas en las bases de datos
(NCBI y EMBL).
La máxima homología se encontró con XynX
de Aeromonas punctata (85% de identidad)
(Usui et al., 1999), XynA2 de Bacillus
stearothermophilus T-6 (57% de identidad)
(Shulami et al., 1999), XyaA de Bacillus sp.
N137 (55% de identidad) (Tabernero et al.,
1995), Xyn2 de Bacillus stearothermophilus
21 (55% de identidad) (Baba et al., 1994),
XynA de Thermobacillus xylanilyticus (54%
de identidad) (Debeche et al., 2000) y XynA
de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (52%
de identidad) (Luthi et al., 1990). Estas 6
xilanasas pertenecen a la familia 10 de glicosil
hidrolasas (familia F de xilanasas).
El análisis de potenciales secuencias de
péptido señal en estas 6 proteínas homólogas a
XynB, usando para ello los programas SignalP
y PSort, no halló evidencia de que estas
proteínas presentaran péptidos señal, tal como
ya había sucedido con XynB de Paenibacillus
barcinonensis. Por el contrario, se
Figura III.2.8: Regiones A y B sobre el alineamiento múltiple de las secuencias de proteínas XynA de Caldicellulosiruptor sp. Tok7B.1 (XynA_C.sp.) (Gibbs et al., 2000), XynA de Dictyoglomus thermophilum (XynA_D.the) (Gibbs et al., 1995), XynC de Caldicellulosiruptor sp. (XynC_C.sp.) (Morris et al., 1999), XynE de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (XynE_C.sac) (PIR T30910), XynA de Anaerocellum thermophilum (XynA_A.the) (NCBI CAA93627), XynA de Caldibacillus cellulovorans (XynA_C.cel) (Sunna et al., 2000), XynB de Caldicellulosiruptor sp. (XynB_C.sp.) (Morris et al., 1999), XynA de Aeromonas punctata (XynX_A.pun), XynB de Paenibacillus barcinonensis (XynB_BP23), XynA2 de Bacillus stearothermophilus T-6 (XynA2_B.ste), Xyn2 de Bacillus stearothermophilus 21 (Xyn2_B.ste), XynA de Thermobacillus xylanilyticus (XynA_T.xyl), XyaA de Bacillus sp. N137 (XyaA_B.sp.) y XynA de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (XynA_C.sac). Se muestrtan también las regiones V y VI, conservadas en las xilanasas de la familia 10.
V LHV M VFLID I L G IA MVAG M Y S DV LH V D EM II
10 20 30 40 50 60 70....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....
XynA_C.sp. KSLKEKGVPIHGIGLQSHINLDWP-SISEIENTIRLFSSIPGLEIHITELDMS-FYQWGSSTSYSTPPRDLLIKXynA_D.the KKLKDKGVPIHGIGIQGHWTLAWP-TPKMLEDSIKRFAEL-GVEVQVTEFDISIYYDRNENNNFKVPPEDRLERXynC_C.sp. KSLKEKGVPIHGIGLQCHINLDWP-SISEIENTIKLFSSIPGLEIHITELDMS-FYQWGSSTSYSTPPRDLLIKXynE_C.sac KNMKSKGIPIHGVGLQCHINVDSP-SVEEIEETIKLFSTIPGLEIQITELDMS-FYQWGSSVYYVEPSREMLLRXynA_A.the KSLREKGIPIHGVGLQCHISVSWP-SVEEVEKTIKLFSSIPGIKIHVTEIDISVAKEYGEDIDEET-KRYLLIQXynA_C.cel QRLKSKGIPVHGVGHQTHINITWP-SISEIENSLVKFSNL-GVVQEITELDMSIYNNSSQKYDTLP--SDLAQQXynB_C.sp. KALHDRGL-IDGVGLQGHINVDSP-AVKEIEDTINLFSTIPGLQIQITELDISVYTSSTQQYDTLP--QDIMIKXynX_A.pun RSLL KGAPVHG G Q HWN HGP-S EEIRMAIERYAS -D Q TELD S RHEDRRTDLTAPTSEMAELXynB_BP23 RSLLDQGAPVHG G Q HWN HGP-S DEIRQ IER L- Q TELDLS FRHE QRTDLTEPTA AELXynA2_B.ste KSLRDKGIPIHGIGMQAHWSLTRP-SLDEIRAAIERYASL-GVVLHITELDVSMFEFHDRRTDLAAPTSEMIERXyn2_B.ste KSLRDKGIPIHGIGMQAHWSLNRP-TLDEIRAAIERYASL-GVILHITELDISMFEFDDHRKDLAAPTNEMVERXynA_T.xyl KWLKEQGAPIHGIGMQGHYNLASP-SIAEVREAIEKYAEL-GLVIHVTELDMSVYAWDDRRTDLLEPTAEMVERXyaA_B.sp. KSLLDKDVPIHGVGLQAHWNVHDP-SLDDIRAAIERYASL-GIQLQITEMDVSMFSWDNRRADLTQPTEKMLNLXynA_C.sac KELLERGTPIDGIGIQAHWNIWDKNLVSNLKKAIEVYASL-GLEIHITELDISVFEFEDKRTDLFEPTPEMLEL
Región A Región B
680 690 700 710 720 730 740
Región V Región VI
109
identificaron secuencias típicas de péptido
señal en las otras xilanasas de la familia F
analizadas, todas ellas con un menor nivel de
homología a XynB de Paenibacillus
barcinonensis.
Se realizaron alineamientos múltiples de las
secuencias proteicas de las 6 xilanasas más
homólogas a XynB de Paenibacillus
barcinonensis ya mencionadas, juntamente
con otras xilanasas de la familia F
(Figura III.2.8).
Se observó que tanto XynB como las 6
xilanasas más homólogas a ella, todas sin
péptido señal, presentaban 2 regiones
Figura III.2.9: Dendrograma de XynB de Paenibacillus barcinonensis con 28 xilanasas de la familia F (Gilkes et al., 1991; Henrissat y Bairoch 1996). Está señalada la rama a la que pertenecen XynB de Paenibacillus barcinonensis y las 6 xilanasas más homólogas a esta.
Xyn Cryptococcus albidus
Cex Cellulomonas fimi
XynZ Clostridium thermocellum
XlnA Streptomyces lividans
Xyn Thermoascus aurantiacus
XynA Aspergillus awamori var. kawachii
XynA Pseudomonas fluorescens
XynB Pseudomonas fluorescens
ORF4 Caldocellum saccharolyticum
XynB Butyrivibrio fibrisolvens
XynA Ruminococcus flavefaciens
XynA Butyrivibrio fibrisolvens
XynA Caldibacillus cellulovorans
XynA Bacillus sp. C125
XynB Clostridium stercorarium F-9
XynA Dictyoglomus thermophilum
CelB Caldocellum saccharolyticum
XynE Caldicellulosiruptor saccharolyticus
XynA Caldicellulosiruptor sp. Tok7B.1
XynC Caldicellulosiruptor sp.
XynA Caldicellulosiruptor saccharolyticus
XynX Aeromonas punctata
XynB Paenibacillus barcinonensis BP-23
Xyn Bacillus sp. N137
XynA Thermobacillus xylanilyticus
XynA2 Bacillus stearothermophilus T-6
Xyn2 Bacillus stearothermophilus 21
XynA Anaerocellum thermophilum
XynB Caldicellulosiruptor sp.
110
altamente conservadas no presentes en el resto
de xilanasas de la familia F. Estas regiones
estaban situadas alrededor de la región VI,
conservada en las xilanasas de la familia F
(Baba et al., 1994; Fukumura et al., 1995); y
se denominaron provisionalmente como región
A, cuya secuencia conservada es AIE_YASL,
y región B, cuya secuencia conservada es
RTDL__PT.
A partir de nuevos alineamientos múltiples
conteniendo más secuencias de xilanasas de la
familia F (Gilkes et al., 1991; Henrissat y
Bairoch 1996) se obtuvo el árbol filogenético
para estas xilanasas que se muestra en la
Figura III.2.9.
En este árbol, XynB de Paenibacillus
barcinonensis junto con las 6 xilanasas
homólogas que no contienen péptido señal
quedaron segregadas, formando un cluster o
agrupamiento separado del resto de xilanasas
de la familia 10.
CCAPÍTULOAPÍTULO IV. IV.
IINGENIERÍANGENIERÍA DEDE P PROTEÍNASROTEÍNAS CONCON LALA XILANASAXILANASA
XXYNYNB B DEDE PPAENIBACILLUSAENIBACILLUS BARCINONENSISBARCINONENSIS
113
1. - I1. - INTRODUCCIÓNNTRODUCCIÓN YY O OBJETIVOSBJETIVOS
Las peculiares características de la xilanasa B
(XynB) de Paenibacillus barcinonensis la
convierten en una enzima de interés tanto
desde el punto de vista básico como aplicado.
Para profundizar en el conocimiento de esta
enzima así como para mejorar sus cualidades
para una posible aplicación en la industria, se
decidió realizar estudios de estructura-función
y experimentos de ingeniería de proteínas.
En base a esto, los objetivos de este capítulo
fueron:
- El análisis estructural de la xilanasa B de
Paenibacillus barcinonensis.
- Estudio de la relación estructura-función en
la xilanasa B mediante mutagénesis
dirigida.
- La purificación y la cristalización de la
xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis.
- Ensayos de mutagénesis aleatoria (PCR
mutagénica y shuffling) para aumentar la
termoestabilidad de la xilanasa B.
- Estudio de la relación estructura-función en
la xilanasa B a partir del análisis de las
enzimas mutantes obtenidas.
2. - R2. - RESULTADOSESULTADOS
2.1. Análisis estructural y
funcional de XynB de
Paenibacillus barcinonensis
2.1.1 Análisis de la estructura primaria
Para averiguar los posibles dominios
funcionales y estructurales de XynB, se usaron
los servicios on-line Pfam y ProDom, que se
basan en la búsqueda de homologías de
secuencia con dominios de proteínas ya
conocidas.
La búsqueda en Pfam dio como resultado la
identificación, entre los aminoácidos 44 y 244
de XynB, de una región altamente homóloga a
un dominio típico de glicosil hidrolasas de la
familia 10 (número de acceso PF0033). Este
dominio, anteriormente denominado
glycosyl_hydro3 y cuya denominación actual
en Pfam es Glyco_hydro_10, engloba el centro
activo de esta familia de enzimas, así como el
núcleo de la estructura en forma de
TIM-barrel o barril (α/β)8 de dichas enzimas.
Las diferentes familias de glicosil hidrolasas
con este plegamiento terciario se agrupan
dentro de un clan o superfamilia, denominado
Tim barrel glycosyl hydrolase superfamily
(denominación en Pfam) o clan GH-A. Las
familias de este clan presentarían un origen
evolutivo común.
114
Por su parte, los resultados obtenidos de la
búsqueda en ProDom (Figura IV.2.1)
indicaban que la proteína XynB contenía
regiones homólogas a 3 dominios presentes en
su base de datos (versión 2001.3):
– Al dominio 809, hacia la región N-terminal
y central de XynB. Este dominio es típico
de glicosil hidrolasas de la familia 10 y
engloba las regiones conservadas I a VI de
dicha familia (Baba et al., 1994; Fukumura
et al., 1995).
– Al dominio 5864, hacia la región
C-terminal de XynB. Este dominio
también es típico de glicosil hidrolasas de
la familia 10 y engloba las regiones
conservadas VII a VIII típicas de esta
familia (Fukumura et al., 1995).
– A un dominio localizado entre los 2
dominios anteriores, que recibía el número
de identificación 277407 y que solamente
se encontraba presente en XynB y las otras
6 xilanasas sin péptido señal homólogas a
ella, mencionadas en el capítulo anterior.
El hecho de que tanto en XynB de
Paenibacillus barcinonensis como en las otras
6 xilanasas homólogas a ella y sin péptido
señal, aparecía un dominio no presente en
otras xilanasas y que contenía además la
región B (RTDL__PT) identificada
previamente en este grupo de xilanasas
(Figura III.2.8 del capítulo III) confería un
interés adicional al estudio de XynB.
Actualmente, según la versión 2005.1 de la
base de datos de ProDom, la enzima XynB
presenta regiones homologas a 5 dominios,
dos de los cuales, PD000809 y PD005864,
corresponden a los anteriores 809 y 5864, y los
otros tres, situados a N-terminal, son dominios
típicos de glicosil hidrolasas de la familia 10;
desapareciendo cualquier referencia al antiguo
dominio 277407.
2.1.2. Predicción de estructura
secundaria y terciaria
Se realizó un análisis informático de la
estructura secundaria de la proteína utilizando
para ello los servicios on-line Jpred y
SCRATCH. Ambos servicios usan programas
de predicción 2D basados en alineamientos
múltiples (generados con PSI-BLAST) de la
secuencia introducida y en el posterior
procesamiento de estos alineamientos
mediante redes neuronales.
Los resultados obtenidos sugerían que XynB
presentaba 8 regiones de hélice α y 8 regiones
de conformación β, intercaladas por varias
regiones no estructuradas (Figura IV.2.2).
Tal como hemos indicado anteriormente, en
las enzimas de la familia 10 de glicosil
hidrolasas estas estructuras secundarias
1000 200 300 400
809 277407 5864 XynB
Prodom Release 2001.3
Figura IV.2.1: Predicción de dominios para la xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis según ProDom (2001.3).
115
conforman un plegamiento tridimensional
conocido como TIM-barrel o barril (α/β)8.
Para comprobar esta hipotética estructura
secundaria, y continuar con el estudio de
XynB, se obtuvo un modelo por homología de
XynB : jalign :jfreq :jhmm :jnet :jpssm :jpred :
1---------11--------21--------31--------41--------51--------61--------71--------81--------91-------100MSTEIPSLSASYANSFKIGAAVHTRMLQTEGEFIAKHYNSVTAENQMKFEEVHPREHEYTFEAADEIVDFAVARGIGVRGHTLVWHNQTPAWMFEDASGGTA-----HHHHHHH-------EE--------HHHHHHH---------------------------HHHHHHHHHH---EE--EEEEEE------EEE---------HHHHHHHHHH--------EE-HHHHHHHHHHHHHH-------------------------HHHHHHHHHHH---EEE-EEEEEE-----EEEE----------HHHHHHHHH-----EEEEE-------HHHHHHHH---EE------------------HH-HHHHHHHHHH----EE-EEEE--------------------HHHHHHHHHH-----EEEEE---HHHHHHHHHHHH---EEE-------------------HHHHHHHHHHH---EEEEEEEEEE-----EEEE------------HHHHHHH-----EEEE------H--HHHHHH----EEE-------------------HHHHHHHHHHH---EEE-EEEEE------EEEE----------HHHHHHHHH-----EEEEE-------HHHHHHHH---EE--------------------HHHHHHHHHHH---EEE-EEEEEE-----EEEE-------
XynB : jalign :jfreq :jhmm :jnet :jpssm :jpred :
101-----111-------121-------131-------141-------151-------161-------171-------181-------191--------202SREMMLSRLKQHIDTVVGRYKDQIYAWDVVNEAIEDKTDLIMRDTKWLRLLGEDYLVQAFNMAHEADPNALLFYNDYNETDPVKREKIYNLVRSLLDQGAPVHHHHHHHHHHH-HHHHEEE----EEEEEEEEEE------------EEEE----HHHHHHHHHHHH-----EEEE---------HHHHHHHHHHHHH-------HHHHHHHHHH-EEEEEEE---EEEEEEEE-EEE-----------EEE-----HHHHHHHHHHHH-----HHHH---------HHHHHHHHHHHHHH------HHHHHHHHHHHHHHHHHH----EEEEEEEEEE-------------HHE---HHHHHHHHHHHHHH----EEEE---------HHHHHHHHHHHHHH------HHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEEEEE-------------EE---HHHHHHHHHHHHHH----EEEE---------HHHHHHHHHHHHHH------HHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEEEEEE-------------E----HHHHHHHHHHHHHH----EEEEE--------HHHHHHHHHHHHH-------HHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEEEEE-------------EE---HHHHHHHHHHHHHH----EEEE---------HHHHHHHHHHHHHH-----
XynB : jalign :jfreq :jhmm :jnet :jpssm :jpred :
203---211-------221-------231-------241-------251-------261-------271-------281-------291----------304HGIGMQGHWNIHGPSMDEIRQAIERYASLDVQLHVTELDLSVFRHEDQRTDLTEPTAEMAELQQKRYEDIFGLFREYRSNITSVTFWGVADNYTWLDNFPVR---------------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEE------------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE------------------EEE--------HHHHHHHHHHHH----EEEEEEE----------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE---------------EEEEEE-------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEE------------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE---------------EEEEEE-------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEEE----------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE---------------EEEE----------HHHHHHHHHHHH----EEEEEEE-----------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE---------------EEEEEE-------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEEE-----------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE-------------
XynB : jalign :jfreq :jhmm :jnet :jpssm :jpred :
305-311-------321------330 GRKNWPFVFDTELQPKDSFWRIIGQD --------------------EE---- ------------------EEEE---- ----------------HHHHHH---- -----------------HHHHH---- ------------------HH------ ------------------HHHH----
Figura IV.2.2: Predicción de la estructura secundaria de XynB de Paenibacillus barcinonensis usando el servicio Jpred. Las H en rojo indican la predicción de regiones de hélice α y las E en naranja indican la predicción de regiones de hebras β. En azul se indican los glutámicos catalíticos, y en violeta la región B.
jalign - Predicción de Jnet según el alineamiento múltiplejfreq - Predicción de Jnet según la frecuencia de perfiles de PSI-BLASTjhmm - Predicción de Jnet basada en “hidden Markov models” (HMM)jnet - Predicción de Jnet con parámetros estándarjpssm - Predicción de Jnet según la “position-specific scoring matrix” (PSSM)
de PSI-BLASTjpred - Predicción consenso
Figura IV.2.3: Imágenes del modelo de la estructura terciaria de XynB de Paenibacillus barcinonensis, generado por el servicio SWISS-MODEL. Las hélices α están coloreadas en rojo, las hebras β en amarillo y los bucles o loops en verde claro. Los 2 aminoácidos catalíticos están coloreados en azul. Puede observarse tanto la representación de lazos (A y B), como de la superficie (C).
A
B
C
116
la estructura terciaria de la enzima, usando
para ello el servicio SWISS-MODEL
(Figura IV.2.3).
Tal como se puede observar en el modelo, la
estructura de la xilanasa B sería la típica de
barril (α/β)8 con elementos adicionales de
estructura secundaria (Figura IV.2.3.A). Los
aminoácidos catalíticos de esta enzima
quedarían muy próximos hacia el interior del
barril en una hendidura de la superficie de la
proteína (Figura IV.2.3.C). La región B
(RTDL__PT), previamente identificada en el
grupo de xilanasas sin péptido señal, aparecía
localizada en uno de los bucles (loops)
exteriores de la estructura terciaria de la
proteína.
2.1.3. Mutagénesis dirigida
Para estudiar la posible funcionalidad de la
región B presente en XynB, se decidió obtener
proteínas mutantes derivadas de XynB en las
que dicha región estuviera deleccionada total o
parcialmente. La región B, como ya hemos
visto, formaría parte del dominio 277407
según ProDom versión 2001.3.
Se realizaron 3 delecciones distintas
(Figura IV.2.4):
– Una delección que englobaba sólo los
aminoácidos 253 a 256 de XynB
(Δ253-256), y que correspondía a la
secuencia RTDL de la región B.
– Una segunda delección más amplia
correspondiente a los aminoácidos 253 a
260 (Δ253-260), y que incluía toda la
región B de XynB.
– La delección de todo el dominio 277407,
comprendiendo los aminoácidos 249 a 261
(Δ249-261).
Estas delecciones se introdujeron en el gen
xynB contenido en el plásmido pX60
(pUC19-X20) mediante amplificación por
PCR divergente en un sólo paso con la pareja
de cebadores adecuada (Figura IV.2.4) y
posterior religación de los amplificados.
250240 260 270
277407TELDLSVFRHEDQRTDLTEPTAEMAELQQKRTELDLSVFRHEDQ----TEPTAEMAELQQKRTELDLSVFRHEDQ--------AEMAELQQKRTELDLSVFR-------------EMAELQQKR
XynB Δ253-256XynB Δ253-260XynB Δ249-261
XynB
BKDEL_ABFWDEL_A
FWDEL_B
BKDEL_C FWDEL_C
250240 260 270
Cebador Secuencia Delección
BKDEL_AB CTGATCCTCGTGACGAAAC Δ253-256Δ253-260
FWDEL_A ACCGAGCCAACGGCAGAG Δ253-256
FWDEL_B GCAGAGATGGCAGAGCTG Δ253-260
BKDEL_C ACGAAACACAGACAGATCC Δ249-261
FWDEL_C GAGATGGCAGAGCTGCAGC Δ249-261
Figura IV.2.4: Delecciones de XynB y cebadores diseñados para la amplificación de xynB sin los fragmentos a deleccionar.
117
Los plásmidos obtenidos fueron clonados en
E. coli DH5α, se seleccionaron los clones
recombinantes, y se comprobó por
secuenciación la correcta introducción de las
delecciones en el gen xynB.
Para analizar la actividad de las xilanasas
deleccionadas construidas, se obtuvieron
extractos celulares de los clones
recombinantes correspondientes y se ensayó su
actividad enzimática sobre xilano de madera
de abedul y pNPX, a temperatura ambiente y
pH 5,5 y 7.
En ninguno de los ensayos se obtuvieron
valores detectables de actividad, hecho que
indicaba que estas xilanasas deleccionadas
construidas no eran funcionales.
2.2. Purificación y cristalización
de XynB
Para aumentar los conocimientos estructurales
sobre XynB se decidió llevar a cabo la
resolución de su estructura terciaria mediante
cristalografía y difracción de rayos X.
2.2.1. Obtención de clones
sobreproductores de XynB
Con el fin de obtener elevada cantidad de
XynB, que facilitara su purificación y
posterior cristalización, se decidió su
clonación en vectores de expresión bajo el
control de un promotor inducible.
Se eligió para ello el sistema pET, en concreto
el plásmido pET3b, que permite clonar genes
bajo el control del promotor fuerte e inducible
del fago T7.
Para ello, se amplificó el gen xynB a partir de
ADN plasmídico de pX60 mediante cebadores
que contenían las dianas NdeI y BamHI,
necesarias para clonar el gen en la dirección
adecuada (Figura IV.2.5).
A continuación el fragmento amplificado se
clonó en el vector pET3b, entre las dianas de
restricción para las mencionadas enzimas,
obteniéndose así el plásmido pET3b-X20
(Figura IV.2.6).
Este plásmido se transformó en la cepa E. coli
BL21(DE3), que al contener el lisógeno λDE3
en su cromosoma es capaz de expresar la ARN
polimerasa de T7 al añadir IPTG al medio de
cultivo.
Cebador Secuencia Región de hibridación
FWX20pET1 Nde I ACCCATATGTCTACCGAAATTCCG
Cadena + después del RBS de xynB.
BKX20pET1 BamH I CTTATAGGATCCTAGTCTTGCCCG
Cadena - después de la pauta abierta de lectura de xynB.
Figura IV.2.5: Cebadores diseñados para la amplificación de xynB y posterior clonación en pET3b.
118
Los clones recombinantes obtenidos se
seleccionaron por su actividad enzimática en
placas de agar LB suplementado con
xilano-RBB e IPTG.
Al ensayar la actividad sobre pNPX de
extractos de cultivos inducidos con IPTG de
los diferentes clones seleccionados, todos ellos
conteniendo el plásmido pET3b-X20, se
observaron importantes diferencias entre ellos,
aunque en todos los casos la actividad fue
superior a la del clon original E. coli 5K/pX60
(Tabla IV.2.1).
Asimismo, se observó una reducción de la
actividad a lo largo de diferentes resiembras de
los clones, lo que, juntamente con los
resultados anteriores, parece indicar problemas
de estabilidad de la construcción pET3b-X20
en la cepa E. coli BL21(DE3).
A pesar de estos problemas, el clon E. coli
BL21(DE3)/pET3b-X20 2b fue utilizado con
éxito para la purificación de la xilanasa B
mediante cromatografía de alta resolución
(FPLC). Dicha purificación fue realizada por
el grupo de Estructura y Función de Enzimas
del Dr. Julio Polaina, del Departamento de
Biotecnología de los Alimentos, en el Instituto
de Agroquímica y Tecnología de Alimentos
(IATA-CSIC, Valencia).
La proteína purificada fue cristalizada a
continuación por Pablo Isorna del grupo de
Cristalografía Macromolecular y Biología
Estructural de la Dra. Julia Sanz-Aparicio, en
el Instituto de Química-Física Rocasolano
(CSIC, Madrid).
Tabla IV.2.1: Actividad sobre pNPX de los clones recombinantes con pET3b-X20 seleccionados.
Clones
Actividad sobre pNPX
(U/mg de proteína)
% Actividad respecto al clon con
pX60
E. coli BL21(DE3)/pET3b-X20 2b
0,504 4367,8
E. coli BL21(DE3)/pET3b-X20 3b
0,078 679,6
E. coli BL21(DE3)/pET3b-X20 5b
0,026 225,6
E. coli 5K/pX60
0,012 100,0
E. coli BL21(DE3)/pET3b (C -)
0,000 0,0
Figura IV.2.6: Plásmido pET3b-X20, resultante de clonar el gen xynB en pET3b.
AmpR
ORI
T7Ter
xynBxynB(1 kb)
BamHI
NdeIpET3b-X205,6 kb T7
Pro
119
2.2.2. Resultados de cristalografía
Tras la obtención de cristales de la proteína
XynB, se recogió el espectro de difracción de
rayos X y se resolvió la estructura
tridimensional de la enzima a una resolución
de 2 Å (Figura IV.2.7).
Esta estructura tridimensional resultó ser la
típica de xilanasas de la familia 10, el barril
(α/β)8, tal como se había observado
previamente en el modelo teórico obtenido por
homología (Figura IV.2.3). Las principales
diferencias entre dicho modelo teórico y la
estructura real de XynB se encontraban en los
bucles que conectan los extremos N-terminal
de las láminas β con las hélices α
(Figura IV.2.8), cosa coherente con el hecho
de que estas regiones son las más difíciles de
modelar por homología, ya que son las que
presentan mayor variabilidad secuencial. Las
máximas diferencias se observan en el bucle
L7 (Figura IV.2.8), que une la lámina β7 con
la hélice α7 del barril (aminoácidos S245-
T260). Este bucle es esencial en la
Figura IV.2.7: Imágenes de la estructura terciaria de XynB de Paenibacillus barcinonensis, obtenidas a partir del análisis de difracción de rayos X de sus cristales (esquina superior izquierda). Las hélices α están coloreadas en rojo, las hebras β en amarillo y los bucles en verde. Los 2 aminoácidos catalíticos están coloreados en azul. Puede observarse tanto la representación de lazos (A y B), como la de superficie (C).
A
B C
Figura IV.2.8: Comparación entre la estructura tridimensional de XynB obtenida mediante modelado por homología (en azul) y la obtenida a partir de los análisis de difracción de rayos X (en amarillo). El bucle L7, que une β7 con α7 del barril, está representado en negro en la estructura experimental.
120
conformación del centro activo, siendo el
máximo responsable de la forma y
especificidad del centro activo en los subsitios
de la parte positiva.
Según la estructura tridimensional obtenida,
los dos aminoácidos catalíticos de la enzima
quedarían muy próximos entre ellos hacia el
interior del barril (α/β)8 (Figura IV.2.7.B) en
una hendidura de la superficie de la enzima
(Figura IV.2.7.C).
Al observar con más detalle este surco o
hendidura catalítica, se distinguen claramente
los subsitios -2, -1, +1 y +2 de unión a las
xilosas del sustrato, aunque también es
probable la existencia de los subsitios -3, +3 y
+4 (Figura IV.2.9).
Destaca la presencia a nivel del subsitio -1 de
los 2 residuos de ácido glutámico implicados
en la hidrólisis del sustrato (E241 y E134), así
como la de otros residuos aromáticos (W299,
Y179 y F303) que ayudarían a posicionar
correctamente los anillos de xilosa del sustrato
en los diferentes subsitios para permitir la
hidrólisis del enlace glicosídico.
También es importante señalar la presencia de
una cavidad a nivel del subsitio +2, que
permitiría acomodar sustituyentes laterales en
la cadena de xilosas del sustrato (como por
ejemplo metil glucurónico).
Esta cavidad viene determinada
estructuralmente por el bucle L7, que contiene
la secuencia consenso RTDL__PT presente en
el grupo de xilanasas sin péptido señal
homólogas a XynB. Los residuos R248, H249
y E250 de este bucle son además los
principales responsables de la especificidad de
los subsitios +2 y +3.
Figura IV.2.9: Surco catalítico de XynB de Paenibacillus barcinonensis, en el que se ha modelado una cadena de xilosas, hidrolizada a nivel del subsitio -1, y un posible anillo de metil glucurónico en el O2 de la xilosa del subsitio +2. También se han representado los residuos R248, H249 y E250 del bucle L7, altamente variables y máximos responsables de la especificidad de los subsitios +2 y +3 (A).Ampliación de los subsitios -2, -1 y +1, y aminoácidos implicados en el posicionamiento de las xilosas del sustrato para que los residuos catalíticos E241 y E134 del subsitio -1 puedan llevar a cabo la hidrólisis (abajo).
A
Subsitio -2 Subsitio -1 Subsitio +1
121
2.3. Aumento de la
termorresistencia de XynB de
Paenibacillus barcinonensis
Con el fin de mejorar las características de la
enzima XynB para facilitar su utilización en
procesos biotecnológicos, y asimismo
aumentar el conocimiento sobre la relación
entre estructura y función de esta xilanasa, nos
planteamos aumentar su termorresistencia.
2.3.1 Mutagénesis aleatoria
Dados los problemas para obtener resultados
mediante mutagénesis dirigida, descritos en el
apartado 2.1.3 y los pocos conocimientos que
disponíamos sobre la relación estructura-
función para XynB, se decidió recurrir a la
mutagénesis aleatoria para generar una gran
variabilidad de copias mutantes del gen xynB
entre las que poder seleccionar después
aquellas que diesen lugar a enzimas con una
mayor termoestabilidad (estrategia conocida
como evolución dirigida) (Kaur y Sharma,
2006).
Primeramente, a partir del plásmido pX60 y
utilizando los cebadores CL1 y CL3
(Figura IV.2.10), se realizó una PCR
mutagénica que permitió obtener diferentes
variantes mutantes de dicho gen.
A continuación, se mezclaron los diferentes
amplificados mutagenizados y se sometieron a
un proceso de DNA shuffling (recombinación
in vitro por PCR).
Este proceso consiste en fragmentar las
diferentes copias mutagenizadas de forma
aleatoria con DNAsa I y después volver a
recomponer el gen mediante una primera PCR
sin cebadores (PCR I), que permite la mezcla
aleatoria pero ordenada de los diferentes
fragmentos (con o sin mutaciones), y una
segunda PCR (PCR II) utilizando los mismos
cebadores utilizados en la PCR mutagénica
inicial, que permite obtener la gran variedad de
copias mutantes del gen generadas durante el
proceso.
El ADN amplificado resultante se ligó al
vector pGEM-T (Promega), consistente en el
plásmido pGEM digerido con EcoRV
(extremos romos) al que se ha añadido una
timina (T) en cada extremo 3' libre para
aumentar la eficacia de clonación de
fragmentos de ADN provenientes de
amplificación con polimerasas que añaden una
adenina en 3', como es el caso de la Taq
polimerasa que se utilizó en estos
experimentos.
El resultado de ligación se transformó en
E. coli DH5α, y de entre los transformantes
obtenidos se seleccionaron aquellos que
expresaban una xilanasa funcional (aquellos
Cebador Secuencia
CL1 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
CL3 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
Figura IV.2.10: Cebadores que flanquean el polylinker de pUC19, utilizados en la PCR para amplificar xynB y en la PCR II del DNA shuffling.
122
donde las mutaciones introducidas durante el
proceso mutagénico no habían inactivado la
enzima).
Para ello se hicieron réplicas de las placas que
contenían los transformantes y, tras el
crecimiento de las colonias y la lisis mediante
cloroformo, se les aplicó una sobrecapa
(overlay) de agarosa sólida que contenía
pNPX, seleccionándose aquellas colonias que
daban lugar a un halo amarillo al cabo de
pocos minutos, hecho que implicaba la
degradación del pNPX por la xilanasa
expresada. La actividad sobre pNPX de los
clones positivos era reevaluada nuevamente
mediante la técnica del overlay, comparando
con un control + (E. coli DH5α/pX60) y un
control – (E. coli DH5α).
Al final del proceso, se obtuvieron muy pocos
clones que expresaran una xilanasa funcional,
lo que obligó a realizar múltiples ciclos de
shuffling y selección a partir de los
amplificados de la PCR mutagénica.
De esta manera se obtuvieron un total de 35
clones que contenían una xilanasa B funcional,
y posiblemente mutada.
Para aumentar la cantidad de mutantes activos,
se repitió el proceso mutagénico, pero esta vez
se optó por sustituir la PCR mutagénica inicial
por una PCR de amplificación estándar
utilizando una polimerasa Taq, hecho que
reducía la tasa de mutación en este paso a la
tasa de error típica de la polimerasa Taq
(2x10-5 mutaciones por nucleótido y ciclo). A
continuación se realizó el proceso de
shuffling, clonación, transformación y
selección tal como se ha descrito previamente.
De esta manera, tras 3 ciclos de shuffling y
selección, se obtuvieron un total de 48 nuevos
clones que contenían una xilanasa B funcional
potencialmente mutada.
Entre las dos aproximaciones de mutagénesis
aleatoria utilizadas se obtuvo un total de 83
posibles mutantes para xynB. Los clones
provenientes de la primera aproximación
mutagénica fueron numerados del 1 al 35, y
del 36 al 83 los clones provenientes de la
segunda aproximación.
2.3.2 Selección de mutantes
termorresistentes
Para seleccionar aquellos clones que poseían
variantes mutagenizadas del gen xynB que
dieran lugar a una xilanasa más
termorresistente que la salvaje, se realizó en
primer lugar un escrutinio cualitativo.
En este primer paso de selección, varias
réplicas de las placas que contenían los 83
clones obtenidos fueron sometidas a choques
térmicos de 45, 50, 60, 70 y 80 ºC, durante 15
y 30 min.
Tras cada choque térmico, utilizando la técnica
del overlay con pNPX se comparaba la
intensidad de color amarillo que se apreciaba
para cada clon (relacionada con el grado de
actividad residual de la xilanasa expresada)
123
Tabla IV.2.2: Intensidad relativa de coloración amarilla de los clones obtenidos por mutagénesis aleatoria, tras choque térmico a diferentes temperaturas y revelado de la actividad usando overlays con pNPX.
45 ºC 50 ºC 60 ºC 70 ºC 80 ºC
Clon 15' 30' 15' 30' 15' 30' 15' 30' 15' 30' Media
C+ 100 100 100 100 100 13 13 0 0 0 53
1 100 100 0 50 0 0 0 0 0 28
2 100 100 0 50 0 0 0 0 0 28
3 200 200 200 200 100 50 0 0 0 106
4 200 100 100 50 0 0 0 0 0 50
5 100 100 50 75 0 0 0 0 0 36
6 100 100 50 100 0 0 0 0 0 39
7 100 100 100 100 50 50 0 0 0 56
8 100 100 100 75 25 25 0 0 0 47
9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 100 200 200 50 100 25 0 0 0 75
11 100 100 100 75 100 0 0 0 0 53
12 100 100 0 25 0 0 0 0 0 25
13 100 100 200 100 50 50 0 0 0 67
14 0 0 0 0 0 0
15 100 200 200 100 50 0 0 0 0 72
16 100 100 100 100 0 50 0 0 0 50
17 100 100 50 100 0 0 0 0 0 39
18 100 100 100 75 25 0 0 0 0 44
19 100 100 100 50 0 0 0 0 0 39
20 100 100 100 100 50 50 0 0 0 56
21 100 100 100 100 50 50 0 0 0 56
22 50 100 100 125 0 0 0 0 0 42
23 100 100 0 0 0 0 0 0 0 22
24 75 0 0 0 0 0 13
25 100 100 0 100 0 0 0 0 0 33
26 100 100 50 100 0 0 0 0 0 39
27 100 100 0 150 0 0 0 0 0 39
28 100 100 100 100 50 25 0 0 0 53
29 100 100 100 100 50 25 0 0 0 53
30 200 200 100 150 0 0 0 0 0 72
31 100 50 0 0 0 0 0 0 0 17
32 100 100 100 75 0 0 0 0 0 42
33 100 100 50 75 25 0 0 0 0 39
34 50 50 100 125 0 0 0 0 0 36
35 100 100 100 200 50 0 0 0 0 61
45 ºC 50 ºC 60 ºC 70 ºC 80 ºC
Clon 15' 30' 15' 30' 15' 30' 15' 30' 15' 30' Media
36 100 50 0 50 0 0 0 0 0 22
37 100 50 0 25 0 0 0 0 0 19
38 100 100 100 150 0 0 0 0 0 50
39 100 100 100 150 0 0 0 0 0 50
40 50 100 100 50 0 0 0 0 0 33
41 100 100 100 100 50 0 25 0 0 0 48
42 100 200 100 100 150 0 25 0 0 0 68
43 100 100 100 100 75 0 25 0 0 0 50
44 100 0 100 100 75 0 25 0 0 0 40
45 50 100 50 100 100 0 0 0 0 0 40
46 100 100 100 0 25 0 25 0 0 0 35
47 100 100 100 100 100 0 25 0 0 0 53
48 100 100 100 100 50 0 25 0 0 0 48
49 100 100 100 100 75 0 25 0 0 0 50
50 100 100 100 100 150 0 25 0 0 0 58
51 100 100 100 100 100 0 25 0 0 0 53
52 100 100 100 100 150 0 25 0 0 0 58
53 100 100 100 200 100 0 50 0 25 0 68
54 100 100 100 100 150 0 0 0 0 0 55
55 100 100 100 100 100 0 50 0 50 0 60
56 100 100 100 100 100 25 100 0 50 0 68
57 100 50 100 50 50 0 25 0 0 0 38
58 50 100 50 100 50 0 0 0 0 0 35
59 100 200 100 200 75 0 100 0 25 0 80
60 200 100 200 100 125 0 25 0 0 0 75
61 100 100 100 200 150 0 50 0 25 0 73
62 100 100 100 100 100 25 50 0 50 0 63
63 100 100 100 100 100 100 100 0 50 0 75
64 100 100 100 100 150 100 100 0 50 0 80
65 100 50 100 50 100 0 0 0 0 0 40
66 100 50 100 50 50 0 0 0 0 0 35
67 100 100 100 100 100 0 25 0 0 0 53
68 0 0 0 0 50 0 0 0 0 0 5
69 100 100 100 100 100 0 50 0 50 0 60
70 100 0 100 0 0 0 0 0 0 0 20
71 100 100 100 100 100 0 50 0 0 0 55
72 100 100 100 50 75 0 0 0 0 0 43
73 200 100 200 200 150 0 50 0 0 0 90
74 100 100 100 100 100 0 25 0 0 0 53
75 100 100 100 100 100 0 25 0 0 0 53
76 100 0 25 0 0 0 21
77 100 200 100 100 100 0 50 0 50 0 70
78 100 100 100 50 150 0 25 0 0 0 53
79 100 200 100 50 75 0 25 0 0 0 55
80 100 100 100 100 150 50 50 0 50 0 70
81 100 100 100 50 75 0 0 0 0 0 43
82 100 100 100 0 100 0 0 0 0 0 40
83 100 100 100 0 100 0 0 0 0 0 40
124
con la intensidad que se apreciaba en un
control + (E. coli DH5α/pX60) que no había
sido sometido a ningún choque térmico.
En función de la relación de intensidades de
coloración amarilla de cada clon, a cada
temperatura y a los 2 tiempos de incubación
ensayados (Tabla IV.2.2), se seleccionaron los
siguientes clones para proseguir con su
estudio:
– Por elevada termorresistencia: clones 53,
55, 56, 59, 61, 62, 63, 64, 69, 77 y 80.
– Por elevada actividad y termorresistencia:
clones 3, 60 y 73.
– Por elevada actividad y moderada
termorresistencia: clon 30.
– Por elevada actividad, aunque baja
termorresistencia: clones 4 y 15.
Tal como se puede observar, la mayoría de los
clones preseleccionados (13 de 17) provenían
del proceso de mutagénesis en el que no se
incluyó una PCR mutagénica inicial
(Tabla IV.2.2).
Una vez realizado el escrutinio cualitativo, se
procedió a verificar de manera cuantitativa la
termorresistencia de los clones seleccionados,
mediante ensayos de la actividad residual
sobre pNPX de los extractos celulares crudos
de estos clones y de un control + (E. coli
DH5α/pX60), tras preincubaciones de dichos
extractos a 45 ºC durante 0, 10, 20 y 30 min.
Las gráficas obtenidas al representar el
logaritmo neperiano del porcentaje de
actividad residual en relación al tiempo de
preincubación (Figura IV.2.11) permitieron
calcular las pendientes de las rectas de
inactivación o termorresistencia, las cuales se
utilizaron para seleccionar los clones mutantes
que presentaban una variante de la xilanasa B
más termoestable que la xilanasa salvaje
(control +).
Mutante 80
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30
Tiempo de incubación a 45ºC (min)
%A
ctiv
idad
máx
ima
Control +
y = -0,0852x + 4,4968
y = -0,0552x + 4,4345
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0 10 20 30
Tiempo de incubación a 45ºC (min)
Ln
(%A
ctiv
idad
máx
ima)
Figura IV.2.11: Ejemplo de la comparación entre la termoestabilidad de la xilanasa B de extractos crudos de uno de los mutantes seleccionados (el 80) respecto a la del control +. Se muestran las rectas de regresión obtenidas en cada gráfica para calcular la pendiente.
125
En estas gráficas, cuanto más cercano a 0 es el
valor de la pendiente mayor es la
termoestabilidad de la enzima (Tabla IV.2.3).
Para comprobar también la elevada actividad
aparente de algunos de los clones
seleccionados, se determinó la actividad
específica sobre pNPX de los extractos
celulares crudos de todos ellos (Tabla IV.2.3).
En base a los resultados obtenidos respecto al
control +, se seleccionaron los siguientes 9
clones mutantes:
– Por su elevada actividad específica: clones
30, 53, 61 y 73.
– Por su elevada termorresistencia: clones
55, 62, 63 y 64.
– Por su elevada termorresistencia y
actividad específica: clon 80.
2.3.3 Secuenciación de los mutantes
seleccionados y aislamiento de las
mutaciones
Con el fin de localizar aquellas mutaciones
que producían cambios en la secuencia
aminoacídica de XynB que pudieran ser
responsables del aumento de la
termoestabilidad o de la actividad específica
de la enzima, se secuenció el gen xynB
contenido en los plásmidos recombinantes de
los diferentes clones mutantes.
Para ello se diseñó una serie de 5 nuevos
cebadores solapantes que permitieran cubrir
toda la pauta abierta de lectura de xynB así
como la parte de la región 5' no codificante
(upstream) clonada en los plásmidos
(Figura IV.2.12).
Tabla IV.2.3: Pendientes de las rectas de termorresistencia y actividad específica sobre pNPX de los clones seleccionados.
Clones PendienteActividad específica
(U/mg)3 -0,12 0,084 - -15 -0,07 0,1330 -0,08 0,3453 -0,09 0,6455 -0,06 0,0356 -0,09 0,1559 -0,10 0,2760 -0,15 0,0261 -0,08 0,8662 -0,04 0,0963 -0,04 0,0564 -0,06 0,1069 -0,11 0,0273 -0,10 1,7377 -0,08 0,0480 -0,06 1,38Control + -0,09 0,13
Cebador Secuencia
CL3 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
OG376 (FWXB1) CACACTCTGGTATGGC
OG377 (FWXB2) CACGGTCCTTCTATGG
OG378 (BKXB1) TCAAGGGCTGCATGC
OG379 (BKXB2) CATGAAGCTGTACATCC
OG380 (BKXB3) TCTCTCTGGAAGCCG
1 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200
OG376 (FWXB1)
OG380 (BKXB3)
OG377 (FWXB2)
OG379 (BKXB2) OG378 (BKXB1)
CL3
xynB ORF
Figura IV.2.12: Cebadores utilizados en la secuenciación de xynB y sus variantes mutantes.
126
Una vez obtenidas las secuencias completas de
los genes xynB de los mutantes 30, 55, 61, 62,
63, 64 y 80 (los correspondientes a los
mutantes 53 y 73 no se pudieron secuenciar),
éstas fueron comparadas con la secuencia del
gen xynB salvaje en busca de mutaciones en la
región codificante del gen. Los resultados se
resumen en la Tabla IV.2.4.
Tal como se puede observar, el conjunto de
mutantes secuenciados contenía únicamente 4
mutaciones que producían sustituciones
aminoacídicas, que fueron seleccionadas para
su estudio: E137D y D323N presentes en el
mutante 30, de elevada actividad; S15L
presente en los mutantes termoestables 63 y 64
(que resultaron ser idénticos a nivel de
secuencia de xynB); y M93V presente en el
mutante 80, termoestable y de elevada
actividad.
El siguiente paso fue el aislamiento de estas
mutaciones de otras posibles mutaciones
presentes en regiones reguladoras o en el
vector de los mutantes obtenidos, para poder
así estudiar el efecto independiente de cada
una de ellas sobre la termoestabilidad de la
xilanasa B.
Primero, a partir del plásmido pX60 se
amplificó el gen xynB salvaje usando los
cebadores CL1 y CL3 (Figura IV.2.10) y la
polimerasa Pfu, para evitar introducir nuevas
mutaciones.
A continuación, el resultado de amplificación
fue purificado y adenilado en sus extremos 3'
para simular una amplificación con Taq
polimerasa y así poder clonarlo en el plásmido
pGEM-T easy (pGEM-Te), obteniéndose, tras
su transformación en E. coli, la cepa
recombinante E. coli DH5α/pGEM-Te-X20.
Esta cepa fue verificada en cuanto a su
actividad, mediante ensayos enzimáticos, y el
gen xynB fue secuenciado, para asegurar que
no existía ninguna diferencia respecto a la
xilanasa B original.
Las 4 mutaciones seleccionadas fueron
introducidas en el plásmido pGEM-Te-X20
mediante mutagénesis dirigida, utilizando la
técnica de amplificación por PCR divergente
en un solo paso y 4 parejas de cebadores que
Tabla IV.2.4: Mutaciones en la secuencia de xynB de los clones mutantes seleccionados.
MutanteCambio
nucleotídicoCambio
aminoacídico30 2 mutaciones no codificantes
A411T E137DC618T G206C681A I227C909T F303G967A D323N
53 -55 T592C L19861 1 mutación no codificante62 T36C Y1263 2 mutaciones no codificantes
C44T S15L64 2 mutaciones no codificantes
C44T S15L73 -80 A277G M93V
127
permitían la introducción de las mutaciones
(Figura IV.2.13).
Los plásmidos mutagenizados obtenidos tras
amplificación y religación (pGEM-Te-
X20E137D, pGEM-Te-X20D323N,
pGEM-Te-X20S15L y pGEM-Te-X20M93V)
fueron transformados en E. coli DH5α,
obteniéndose así 4 clones que presentaban,
cada uno, una de las 4 mutaciones
anteriormente seleccionadas. La introducción
correcta de dichas mutaciones fue comprobada
por secuenciación.
2.3.4 Purificación de las xilanasas
mutantes
A partir de los cuatro clones con las
mutaciones simples introducidas en xynB y del
clon con el gen xynB salvaje (E. coli
DH5α/pGEM-Te-X20), se hicieron cultivos en
2 litros de medio LB con ampicilina
Cebador Secuencia Mut.
FWE137D ATCTGATTATGCGTGATACAAAATG -
BKE137D CCGTCTTGTCATCAATCGCC T → A
FWD323N CTTCTGGCGTATTATCGGGC -
BKD323N GAATTCTTGGGCTGAAGCTCTG C → T
FWS15L AAAATAGGTGCGGCAGTGC -
BKS15L GAACAAATTGGCATAAGATGCAG G → A
FWM93V AAGATGCTTCCGGGGGAACG -
BKM93V CAAACACCCAAGCCGGCGTC T → C
Figura IV.2.13: Cebadores utilizados para la mutagénesis dirigida de xynB.
Figura IV.2.14: Cromatogramas (izquierda) y SDS-PAGE (derecha) de los resultados de purificación de la xilanasa XynB salvaje mediante gel filtración (1) e intercambio iónico (2), a partir de extractos celulares concentrados precipitados con sulfato amónico (0). En los cromatogramas, se muestra la absorbancia a 280 nm en azul y la conductividad en marrón.
(2) Intercambio Iónico
(1) Gel Filtración
0
500
1000
1500
2000
2500
mAU
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
mS/cm
0 50 100 150 ml
0
500
1000
1500
2000
mAU
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
mS/cm
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 ml
0 1
116 -
66 -
97 -
31 -
45 -
21 -
kDa
2
200 -
SDS-PAGE
128
100 μg/ml, de los que se obtuvieron los
extractos celulares correspondientes por
French Press.
Los extractos celulares fueron clarificados,
precipitados con sulfato amónico y
concentrados para someterlos a continuación a
un proceso de purificación mediante
cromatografía en columna de 2 etapas
(Figura IV.2.14):
– Una primera etapa de gel filtración que
permitía eliminar la mayoría de proteínas
diferentes a XynB, especialmente aquellas
de peso molecular elevado.
– Una segunda etapa de intercambio
aniónico que permitía obtener la proteína
XynB con un alto grado de pureza.
En algunos casos, para eliminar totalmente
algunas proteínas de bajo peso molecular que
coeluían con XynB en el segundo paso de
intercambio aniónico, fue necesario recurrir a
una última etapa de purificación, en la que se
utilizaba una segunda columna de gel
filtración de menor diámetro de poro y mayor
resolución que la usada en la primera etapa.
Durante todos las etapas de purificación se
determinó la actividad específica
(Tabla IV.2.5) y se analizaron las distintas
fracciones mediante SDS-PAGE
(Figura IV.2.15) para comprobar el grado de
purificación obtenido para las diferentes
enzimas.
2.3.5 Termoestabilidad de las xilanasas
mutantes
Para analizar la termoestabilidad de las
xilanasas purificadas, se ensayó la actividad
enzimática residual sobre pNPX tanto de las
variantes mutantes de XynB como de la
xilanasa salvaje, tras diferentes tiempos de
preincubación a 45 ºC y a 50 ºC.
Tabla IV.2.5: Actividad específica (U/mg de proteína) de XynB salvaje y las variantes mutantes a lo largo de las diferentes etapas del proceso de purificación.
XynB salvaje XynB E137D XynB D323N XynB S15L XynB M93V
Extracto precipitado 0,089 0,002 0,142 0,134 0,298Gel filtración 1 0,660 0,101 2,007 0,520 1,204Intercambio aniónico 0,687 0,292 2,395 1,090 1,476Gel filtración 2 2,776 1,314
116 -
66 -
97 -
31 -
45 -
21 -
kDa
0 1 2 3 4 5
Figura IV.2.15: Análisis por SDS-PAGE de las xilanasas purificadas: (1) XynB salvaje, (2) XynB E137D, (3) XynB D323N, (4) XynB S15L, (5) XynB M93V. (0) Extractos celulares precipitados con sulfato amónico de E. coli DH5α/pGEM-Te-X20.
129
En los ensayos a 45 ºC, la gráfica obtenida al
representar el logaritmo neperiano del
porcentaje de actividad residual en relación al
tiempo de preincubación, mostró como las
xilanasas mutantes presentaban una mayor
termorresistencia que la enzima salvaje,
destacando especialmente las variantes que
presentaban las mutaciones M93V y S15L
(Figura IV.2.16).
Al repetir el ensayo de termoestabilidad con
estas dos últimas xilanasas, esta vez
preincubando a 50 ºC, se observó como las
diferencias de termoestabilidad respecto a la
enzima salvaje se hacían aún más apreciables
(Figura IV.2.17).
Estos resultados se observan mejor al calcular
la vida media, en minutos, de estas enzimas
(Tabla IV.2.6).
Se observó así que a 45 ºC todas las xilanasas
mutantes presentaban una vida media superior
a la xilanasa salvaje, hecho que se hizo más
patente a 50 ºC. En concreto, la vida media a
50 ºC de la enzima con la mutación M93V fue
más de 3 veces superior a la de la xilanasa
salvaje, mientras que la xilanasa mutante S15L
presentó a 50 ºC una vida media 5 veces
superior a la de la enzima salvaje.
2.3.6 Obtención de dobles mutantes
Tras los resultados obtenidos, se propuso
incrementar la termorresistencia de la
xilanasa B combinando las diferentes
mutaciones entre sí. Para ello se crearon 2
xilanasas dobles mutantes:
– Una que contenía simultáneamente las
mutaciones E137D y D323N, provenientes
Tabla IV.2.6: Vida media, en minutos, de XynB y las xilanasas mutantes.
45 ºC 50 ºCXynB (wt) 9,1 1,8
XynB E137D 14,1 -
XynB D323N 11,2 -
XynB S15L 17,6 9,1
XynB M93V 35,8 7,1
XynB (wt)M93VS15L
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0 4 8 12 16
ln (
% A
cti
vid
ad
)
Tiempo de incubación a 50 ºC (min)
Figura IV.2.17: Gráfica de termoestabilidad a 50 ºC de la xilanasa B salvaje y las xilanasas mutantes XynB M93V y XynB S15L.
ln (
% A
ctiv
idad
)
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo de incubación a 45 ºC (min)
XynB (wt)M93VS15LE137DD323N
Figura IV.2.16: Gráfica de termoestabilidad a 45 ºC de la xilanasa B salvaje y 4 de sus variantes mutantes.
130
las dos del mismo clon mutante original
(clon 30).
– Una segunda xilanasa doble mutante con
las 2 mutaciones que conferían
individualmente mayor termorresistencia,
M93V y S15L.
Para obtener la doble mutante E137D/D323N,
se partió del plásmido pGEM-Te-X20D323N,
sobre el cual se introdujo la mutación E137D
mediante mutagénesis dirigida, utilizando la
técnica de amplificación por PCR divergente
en un sólo paso y los cebadores FWE137D y
BKE137D ya utilizados previamente para
introducir las mutaciones simples
(Figura IV.2.13).
Para obtener la doble mutante S15L/M93V se
aplicó la metodología anterior (mutagénesis
dirigida por PCR divergente en un sólo paso),
tanto para introducir la mutación S15L en el
plásmido pGEM-Te-X20M93V, como a la
inversa, para introducir la mutación M93V en
pGEM-Te-X20S15L; pero no se obtuvieron
resultados positivos.
La alternativa que se utilizó finalmente fue
dividir en dos fragmentos tanto el plásmido
pGEM-Te-X20S15L como el pGEM-Te-
X20M93V utilizando la enzima de restricción
NaeI, que posee una diana en el gen xynB
localizada entre las mutaciones S15L y M93V,
y otra diana en el vector pGEM-Te. En el caso
de pGEM-Te-X20S15L se generó un
fragmento de 3082 bp, con la mutación S15L,
y otro de 1723 bp sin mutaciones; mientras
que a partir de pGEM-Te-X20M93V el
fragmento resultante de 3082 bp no contenía
mutaciones y era el fragmento de 1723 bp el
que contenía la mutación M93V.
La ligación de los 2 fragmentos que contenían
las mutaciones (el de 3082 bp con la mutación
S15L y el de 1723 bp con la mutación M93V),
dio lugar al plásmido pGEM-Te-
X20S15L+M93V (Figura IV.2.18).
Los dos nuevos plásmidos construidos,
pGEM-Te-X20E137D+D323N y pGEM-Te-
X20S15L+M93V, fueron transformados en
E. coli, dando lugar a los clones E. coli
AmpR
f1 ORI
lacZ
xynBS15L
NaeI
SpeI
pGEM-Te-X20S15L
4,8 Kb NaeI
S15LAmpR
f1 ORI
lacZ
xynBM93V
NaeI
SpeI
pGEM-Te-X20M93V
4,8 Kb NaeI
M93V
AmpR
f1 ORI
NaeI
SpeI
3,1 KbNaeI
S15L
lacZNaeI
1,7 Kb NaeI
M93V
AmpR
f1 ORI
lacZ
xynBS15L+M93V
NaeI
SpeI
pGEM-Te-X20S15L+M93VpGEM-Te-X20S15L+M93V
4,8 KbNaeI
M93V
S15L
Figura IV.2.18: Obtención del plásmido pGEM-Te-X20S15L+M93V por restricción y ligación.
131
DH5α/pGEM-Te-X20E137D+D323N y
E. coli DH5α/pGEM-Te-X20S15L+M93V.
La correcta introducción de las 2 mutaciones
en cada uno de los clones construidos fue
comprobada mediante secuenciación.
2.3.7 Purificación y ensayos de
termoestabilidad de las xilanasas
dobles mutantes
A partir de los clones E. coli DH5α/pGEM-Te-
X20E137D+D323N y E. coli
DH5α/pGEM-Te-X20S15L+M93V se
procedió a purificar las xilanasas dobles
mutantes utilizando la misma metodología
descrita en el apartado 2.3.4.
La determinación de la actividad específica a
lo largo de las etapas de purificación y el
análisis por SDS-PAGE (Figura IV.2.19),
evidenciaron el grado de pureza de las enzimas
obtenidas.
Para determinar la termoestabilidad de estas
nuevas xilanasas purificadas, se ensayó su
actividad enzimática residual sobre pNPX tras
diferentes tiempos de preincubación a 50 ºC.
Los resultados de termoestabilidad obtenidos
mostraron claramente como la xilanasa doble
mutante S15L/M93V presentaba una
termorresistencia muy superior a la de la
enzima salvaje, mientras que la doble mutante
E137D/D323N no mostró grandes diferencias
respecto a la termoestabilidad de la xilanasa
salvaje (Figura IV.2.20).
La comparación de la termoestabilidad de la
doble mutante S15L/M93V con la de las
xilanasas mutantes simples de las que deriva,
mostró que la doble mutante presentaba una
termorresistencia notablemente aumentada
(Figura IV.2.20).
116 -
66 -
97 -
31 -
45 -
21 -
kDa
0 1 2 3
Figura IV.2.19: Análisis por SDS-PAGE de las xilanasas dobles mutantes purificadas. (1) XynB salvaje, (2) XynB E137D+ D323N, (3) XynB S15L+M93V, (0) extractos celulares precipitados con sulfato amónico de E. coli DH5α/pGEM-Te-X20.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0 4 8 12 16
ln (
% A
ctiv
idad
)
Tiempo de incubación a 50 ºC (min)
XynB (wt)M93VS15L
S15L/M93V
E137D/D323N
Figura IV.2.20: Gráfica de termoestabilidad a 50 ºC de la xilanasa B salvaje, las dobles mutantes S15L/M93V y E137D/D323N, y las mutantes simples M93V y S15L.
132
La vida media de la doble mutante
S15L/M93V resultó muy superior a la vida
media de las mutantes simples S15L y M93V
originales (Tabla IV.2.7), observándose un
efecto sinérgico de estas dos mutaciones, lo
cual confería a la doble mutante S15L/M93V
una vida media a 50 ºC aproximadamente 20
veces superior a la de la xilanasa salvaje.
2.3.8 Efectos de las mutaciones sobre
la estructura de XynB
Con el fin de averiguar si las diferentes
mutaciones encontradas podían producir
cambios en la estructura tridimensional de la
enzima, se localizó la situación dichas
mutaciones en la estructura tridimensional de
la xilanasa salvaje.
Tal como se puede observar en la
Figura IV.2.21, todas las mutaciones se
encontraban en regiones superficiales del
plegamiento, relativamente alejadas del centro
activo. Esta localización periférica hacía
suponer la ausencia de cambios importantes en
la estructura tridimensional y en la función.
Para comprobar si estas mutaciones producían
o no cambios significativos en la estructura
secundaria de la enzima que permitieran
Tabla IV.2.7: Vida media en minutos de XynB y las mutantes simples y dobles analizadas.
50 ºCXynB (wt) 1,8XynB E137D/D323N 2,2XynB S15L 9,1XynB M93V 7,1XynB S15L/M93V 37,7
Figura IV.2.21: Localización de las mutaciones (en azul) y los residuos catalíticos (en rojo) en la estructura tridimensional de la xilanasa B.
MM 9393VV
EE137137DD
DD323323NN
SS1515LL
EE241241
EE134134
133
explicar el aumento de termorresistencia, se
hicieron análisis por dicroísmo circular a
diferentes temperaturas de la xilanasa B
salvaje y de la doble mutante S15L/M93V, por
ser esta la más termoestable de entre las
mutantes.
Los resultados obtenidos (Figura IV.2.22), no
mostraron variaciones significativas alrededor
de los 220 nm que permitieran inferir posibles
diferencias en la estructura secundaria. Se
observaron, sin embargo, ligeras diferencias en
la desviación de la luz entre los 228 y los
240 nm.
2.3.9 Estudio de las constantes
cinéticas de XynB y de las xilanasas
mutantes
Se determinaron a continuación los valores de
las constantes cinéticas VMáx y KM sobre
pNPX, evaluando para ello la actividad de la
xilanasa B salvaje, de las dos mutantes simples
más termoestables (mutaciones S15L y M93V)
y de las dos dobles mutantes, sobre
concentraciones crecientes de pNPX
(Figura IV.2.23).
-8
3
-5
0
200 260220 240
CD
(m
grad
os)
Longitud de onda (nm)
XynB (wt) 30 ºC
XynB (wt) 40 ºC
XynB (wt) 50 ºC
XynB (wt) 60 ºC
XynB S15L/M93V 30 ºC
XynB S15L/M93V 40 ºC
XynB S15L/M93V 50 ºC
XynB S15L/M93V 60 ºC
Figura IV.2.22: Gráfica de dicroísmo circular de XynB salvaje y la doble mutante S15L/M93V a 30, 40, 50 y 60 ºC de temperatura.
0 2 4 6 8 100,2
0,8
1,4
2,0
2,6
3,2
Ve
loc
ida
d (
U/m
l)
Concentración pNPX (mM)
XynB (wt)M93VS15L
E137D/D323N
M93V/S15L
Figura IV.2.23: Gráfica de las cinéticas enzimáticas de la xilanasa B salvaje y las xilanasas mutantes.
134
El cálculo de las constantes cinéticas a partir
de las gráficas (Tabla IV.2.8), no mostró
grandes diferencias respecto a la xilanasa
salvaje en cuanto a la afinidad (1/KM) aunque
sí que se apreciaba un ligero aumento de ésta
en el caso de las mutantes más
termorresistentes.
Por el contrario los valores de velocidad
máxima (VMáx) mostraban una alta
variabilidad, pero al corregir por la
concentración total de enzima ([E]Total), la
constante catalítica (KCAT) resultante fue muy
similar entre todas las xilanasas mutantes, que
presentaron valores muy superiores a los de la
xilanasa B salvaje.
Resultados similares se obtuvieron al calcular
la eficacia catalítica (KCAT/KM). Todas las
xilanasas mutantes presentaron valores
similares de eficiencia catalítica, que fueron a
su vez muy superiores a la eficiencia catalítica
de la xilanasa B salvaje.
Tabla IV.2.8: Parámetros cinéticos de XynB y las xilanasas mutantes.
VMáx
(U/ml)KM
(mM)[E]Total
(μmol/ml)KCAT
(ms-1)KCAT/KM
(ms-1mM-1)
XynB (wt) 1,451 2,384 186,193 0,130 0,054XynB S15L 0,877 1,820 12,652 1,155 0,635XynB M93V 3,395 1,712 48,077 1,177 0,688XynB E137D/D323N 2,938 2,495 30,491 1,606 0,644XynB S15L/M93V 3,260 1,497 59,464 0,914 0,610
AANEXONEXO I. I.
AAPLICACIÓNPLICACIÓN DEDE LASLAS XILANASASXILANASAS ESTUDIADASESTUDIADAS
ENEN ELEL B BLANQUEOLANQUEO DEDE LALA P PASTAASTA DEDE P PAPELAPEL
137
1. - I1. - INTRODUCCIÓNNTRODUCCIÓN YY O OBJETIVOSBJETIVOS
Tal como se ha comentado con anterioridad en
este trabajo, una de las principales
aplicaciones industriales de las xilanasas hoy
día se da en la industria papelera. El
tratamiento con xilanasas de la pasta de papel,
previo al blanqueo químico, hace mucho más
eficiente el proceso de blanqueo, lo que reduce
las necesidades de blanqueantes clorados para
obtener el mismo grado de blancura y calidad
en la pasta de papel, generándose como
consecuencia una menor cantidad de residuos
organoclorados, de elevada toxicidad
ambiental (Bajpai, 2004).
Por este motivo se decidió probar la idoneidad
o no de los enzimas estudiados en este trabajo
para potenciar el blanqueo de la pasta de
papel.
Los ensayos papeleros fueron realizados por
Cristina Valls, del grupo de Ingeniería
Papelera de la Universitat Politècnica de
Catalunya (UPC), bajo la dirección de la
Doctora Mª Blanca Roncero.
En base a esto, los objetivos de este apartado
fueron:
- La producción de las xilanasas XynA
(familia 11) e YnfF (familia 5) de
Bacillus sp. BP-7, y XynB (familia 10) de
Paenibacillus barcinonensis, en cantidad
suficiente para su ensayo en laboratorio
papelero.
- La cuantificación de la actividad xilanasa
producida, en las condiciones de los
ensayos papeleros posteriores, y su
suministro al grupo de Ingeniería Papelera
de la UPC para su evaluación en el
blanqueo de pastas kraft de Eucalyptus
globulus.
2. - R2. - RESULTADOSESULTADOS YY D DISCUSIÓNISCUSIÓN
2.1. Producción en fermentador
de las xilanasas a evaluar
A partir de las cepas E. coli/pXA30 (ver
capítulo I de Resultados), E. coli DH5α/
pMSR8SPO2-ynfF (ver capítulo II de
Resultados) y E. coli 5K/pX20 (Blanco et al.,
1996) se prepararon cultivos de 500 ml, en
medio LB suplementado con ampicilina
100 μg/ml, que se incubaron a 37 ºC toda la
noche.
10 ml de cada uno de estos cultivos fue
utilizado para verificar la actividad xilanasa,
mediante el ensayo enzimático sobre xilano de
madera de abedul. Una vez comprobada esta
actividad, el resto de los cultivos iniciales
(490 ml) se utilizó como inóculo de cultivos en
50 l de medio LB preparado y esterilizado en
el fermentador B. Braun Biotech - Sartorius
del servicio de fermentación de la Universitat
de Barcelona; medio que se suplementó con
ampicilina 100 μg/ml esterilizada por filtración
antes de ser inoculado.
Tras incubaciones de 15 h a 37 ºC, se
recogieron las células por centrifugación en
una centrífuga clarificadora Westfalia CSA
1-06-475 (con tambor de platos y esterilizable
138
por vapor) del servicio de fermentación. Las
células obtenidas fueron concentradas
adicionalmente por centrifugación en una
centrífuga Beckman high-speed, se
resuspendieron en 100 ml de tampón Tris-HCl
100 mM pH 7, se sometieron a lisis mediante
French Press, y a continuación se
centrifugaron los lisados obtenidos para
recuperar los sobrenadantes, que contenían las
enzimas.
2.2. Determinaciones de actividad
enzimática
Una vez obtenidos los extractos celulares
concentrados, se ensayó la actividad xilanasa
de los mismos mediante ensayo enzimático
sobre xilano de madera de abedul en las
condiciones de pH y temperatura adecuadas en
cada caso para su aplicación en las pastas
papeleras.
Generalmente estas condiciones no eran las
óptimas para las xilanasas, pero sí eran
aquellas que permitían que las enzimas
mantuvieran un alto porcentaje de actividad
durante las 2 h de duración de los tratamientos
enzimáticos de las pastas, manteniendo bajos
los niveles de inactivación.
La actividad xilanasa obtenida para cada
enzima, junto a las condiciones de ensayo, se
detallan en la Tabla AN1.2.1.
Las muestras de xilanasas fueron alicuotadas
en tubos de 10 ml, se congelaron a -20 ºC y se
enviaron en frío al grupo de Ingeniería
Papelera de la UPC, donde se realizaron los
ensayos papeleros.
2.3. Ensayos papeleros
2.3.1. Características de las pastas
papeleras
La materia prima que se utilizó para los
ensayos fue pasta kraft de Eucalyptus globulus
(pasta de maderas duras, ricas en xilano),
previamente deslignificada con oxígeno.
Se emplearon dos tipos de pastas de eucalipto,
ambas de procedencia industrial y producidas
por la empresa Torraspapel S.A.:
– Pasta 1: pasta tal cual era proporcionada
por Torraspapel S.A., sin lavar
posteriormente en el laboratorio. Esta pasta
contenía gran cantidad de xilooligómeros,
hecho que suele dificultar el análisis del
efecto de las xilanasas sobre ellas.
Tabla AN1.2.1: Condiciones de ensayo y actividad de las xilanasas obtenidas por fermentación.
Xilanasa Clon Temperatura pHActividad
(U/ml extracto)
XynA de Bacillus sp. BP-7 E. coli/PXA30 50 ºC 7 46,5
YnfF de Bacillus sp. BP-7E. coli DH5α/ pMSR8SPO2-ynfF 60 ºC 7 91,8
XynB de Paenibacillus barcinonensis E. coli 5K/pX20 40 ºC 8 30,2
139
– Pasta 2: pasta lavada en el laboratorio con
tampón Tris-HCl pH 7 durante 30 min a
temperatura ambiente. Este lavado
permitía eliminar los xilooligómeros.
Las características iniciales de estas pastas se
resumen en la Tabla AN1.2.2:
El índice kappa es una medida de la cantidad
de lignina, responsable del color marrón de la
pasta de papel. Se determinó según la norma
ISO 302.
El porcentaje de blancura ISO es una medida
del grado de blanco de un papel, expresado
como porcentaje respecto a un blanco
normalizado (el del óxido de magnesio =
100%). Se determinó según la norma
ISO 5351/1.
2.3.2. Secuencia de blanqueo XDP
Para la evaluación del efecto de las xilanasas
sobre las pastas papeleras se utilizó en primer
lugar una secuencia parcial de blanqueo ECF
(elemental chlorine free).
En concreto se utilizó una secuencia XDP, que
consta de 3 etapas:
– Fase X: pretratamiento enzimático con
xilanasa (Tabla AN1.2.3).
– Fase D: blanqueo con dióxido de cloro
(equivalente a 3% de Cl2 activo).
– Fase P: blanqueo con peróxido de
hidrógeno (1,5% de NaOH, 3% de H2O2).
Las xilanasas XynA e YnfF de Bacillus sp.
BP-7 se evaluaron sobre pasta 1, y la xilanasa
XynB de Paenibacillus barcinonensis sobre
pasta 2.
Los resultados obtenidos en el índice kappa
(Ik) y el porcentaje de blancura ISO
(Bl % ISO), determinados al final de la
secuencia de blanqueo, se resumen en la
Tabla AN1.2.4:
Tal como se puede observar los tratamientos
con XynA e YnfF permitieron obtener un
aumento de 1 - 1,4% en la blancura final
Tabla AN1.2.2: Características iniciales de las pastas papeleras utilizadas.
Pasta 1 Pasta 2Índice kappa 9,2 8,0Blancura (%ISO) 50,2 51,1Viscosidad (ml/g) 958±24 972±20
Tabla AN1.2.3: Condiciones de aplicación de las xilanasas en la fase X de la secuencia XDP.
EnzimaDosis
(U/gps)Temp.
(ºC) pH TampónTiempo
(h)
C - 0 40 - 60YnfFXynAXynB
2605040
7
8
Tris-HCl50 mM 2
Tabla AN1.2.4: Resultados finales de la secuencia de blanqueo XDP.
Pasta Ik Bl (% ISO)
C -YnfFXynA
12,6 89,22,2 90,62,0 90,2
C -XynB
22,5 89,42,4 89,4
140
respecto al control –, y una reducción de
0,4 - 0,6 puntos en el índice kappa
(relacionado con la cantidad de lignina
residual). Por el contrario, la aplicación de la
xilanasa XynB no produjo mejoras apreciables
en las propiedades del papel.
2.3.3. Secuencia de blanqueo XDEOPD1
A partir de los resultados con la secuencia
XDP se seleccionaron las xilanasas XynA e
YnfF de Bacillus sp. BP-7 para proceder a la
realización de una secuencia completa de
blanqueo ECF. Se utilizó la secuencia
XDEOPD1, que consta de 4 etapas:
– Fase X: pretratamiento enzimático con
xilanasa (Tabla AN1.2.5). Se aumentaron
las dosis de enzimas respecto a la
secuencia XDP para acentuar los efectos
de éstas.
– Fase D: blanqueo con dióxido de cloro
(equivalente a 3% de Cl2 activo).
– Fase EOP: extracción alcalina con oxígeno
y peróxido de hidrógeno (1,1% de NaOH,
0,3% de H2O2).
– Fase D1: nueva fase de blanqueo con
dióxido de cloro, pero en menor cantidad
(equivalente a 1,25% de Cl2 activo).
Las dos enzimas seleccionadas y el control se
evaluaron sobre pasta 2.
Los resultados que se obtuvieron para el índice
kappa y el porcentaje de blancura ISO tras el
tratamiento enzimático y al final de la
secuencia de blanqueo se resumen en la
Tabla AN1.2.6:
Se observó que, por un lado, a pesar de que el
índice kappa es inferior al del control en
ambos tratamientos enzimáticos, las
diferencias son en general pequeñas (menores
o iguales a 0,3 puntos).
En cuanto a la blancura final de las pastas,
mientras la xilanasa A causó un incremento de
ésta en 1,1%, YnfF causó un aumento de
blancura del 0,1%, muy discreto respecto al
control sin enzima.
Sin embargo, la determinación de la blancura
tras las distintas etapas de blanqueo mostraba
que a medida que se avanzaba en la secuencia
de blanqueo, las diferencias de blancura
respecto al control se reducían (datos no
mostrados). Esto podía ser debido a que las
elevadas dosis de blanqueantes químicos
empleadas permiten por sí solas que se
Tabla AN1.2.5: Condiciones de aplicación de las xilanasas en la fase X de la secuencia XDEOPD1.
EnzimaDosis
(U/gps)Temp.
(ºC) pH TampónTiempo
(h)
C - 0YnfFXynA
350 7 Tris-HCl
50 mM 2
Tabla AN1.2.6: Resultados tras el tratamiento enzimático (fase X) y al final de la secuencia completa de blanqueo XDEOPD1.
XIk Bl(% ISO)
XDEOPD1
Ik Bl(% ISO)
C -YnfFXynA
7,9 51,87,8 52,37,9 54,5
0,8 89,30,7 89,40,5 90,4
141
alcancen valores de blancura muy elevados, y
por tanto muy difíciles de mejorar.
Estos resultados indican que la aplicación de
estas enzimas, al menos en el caso de la
xilanasa A, permitirían reducir los niveles de
blanqueantes químicos a utilizar
(especialmente el dióxido de cloro) para
obtener una blancura determinada;
consiguiéndose así una reducción de los
residuos tóxicos generados durante el proceso.
También se hicieron ensayos de la cantidad de
ácidos hexenurónicos (HexA) presentes en las
pastas tratadas con xilanasas. Estos HexA se
generan durante el proceso de cocción kraft a
partir de los grupos de ácido
4-O-metil-α-D-glucurónico presentes en los
xilanos y son responsables en gran medida del
envejecimiento o amarilleamiento del papel
(Buchert et al., 1997).
Los resultados obtenidos hasta el momento
indican que la aplicación tanto de YnfF como
de XynA de Bacillus sp. BP-7 reducen las
cantidades de HexA en las pastas.
El conjunto de resultados papeleros obtenidos
muestran, por una parte la diferente
efectividad de las xilanasas bacterianas para su
aplicación en el blanqueo de pastas de papel, y
por otra parte han permitido identificar dos
nuevas xilanasas potenciadoras del blanqueo
de pastas kraft de eucalipto.
En el momento actual se están llevando a cabo
nuevos ensayos para cuantificar la efectividad
potenciadora del blanqueo de las enzimas
estudiadas en nuevas secuencias ECF y en
secuencias TCF (total chlorine free), así como
su contribución a la disminución de la dosis de
blanqueantes (especialmente derivados
clorados) y la consecuente reducción en la
generación de AOX (Compuestos Orgánicos
Halogenados), altamente contaminantes.
DDISCUSIÓNISCUSIÓN
145
1. X1. XILANASASILANASAS DEDE BBACILLUSACILLUS SPSP..
BPBP--77
Con el objetivo de clonar e identificar nuevos
genes de xilanasas se construyó una genoteca
de Bacillus sp. BP-7. Esta cepa había sido
aislada y caracterizada bioquímicamente en el
grupo de investigación (López et al., 1998), y
fue escogida por presentar una elevada
actividad xilanasa.
A partir de la genoteca construida se aislaron
seis clones capaces de degradar xilano. Cuatro
de estos clones poseían alta actividad y
codificaban la misma xilanasa, que se
denominó xilanasa A (XynA). Los otros dos
clones eran idénticos y poseían menor
actividad. El inserto de los mismos incluía 2
pautas abiertas de lectura que codificaban
proteínas homólogas a xilanasas, las cuales se
denominaron XynD e YnfF, respectivamente.
Las 3 xilanasas de Bacillus sp. BP-7 fueron
clonadas de manera independiente, fueron
secuenciadas, y dos de ellas, XynA e YnfF,
fueron caracterizadas bioquímicamente
(capítulos I y II de Resultados).
1.1.- Identificación y
caracterización de XynA
Los resultados de especificidad de sustrato
obtenidos para XynA (Tabla I.2.3) indican
claramente que esta enzima es una
endoxilanasa (1,4-β-D-xylan
xylanohydrolase; EC 3.2.1.8) que presenta
máxima actividad sobre xilano de madera de
haya, además de presentar actividad sobre
otros glucuronoxilanos y arabinoxilanos,
observándose una actividad decreciente a
medida que aumenta el grado de sustitución de
los xilanos. No se detectó actividad de XynA
sobre celulosas (CMC o Avicel), y su
actividad sobre polisacáridos diferentes del
xilano y sobre los aril-glicósidos ensayados
fue muy baja.
El peso molecular teórico de la xilanasa A de
Bacillus sp. BP-7 es de 23,5 kDa, lo cual
concuerda con el peso molecular aparente en
los zimogramas de extractos de la cepa
recombinante E. coli/pXA30 (23-24 kDa).
Esta enzima debe corresponder a la xilanasa
mayoritaria de Bacillus sp. BP-7, previamente
identificada en los análisis electroforéticos de
sobrenadantes de esta cepa (López et al.,
1998). Dichos análisis, sin embargo, indicaban
un peso molecular de 22 kDa para esta enzima.
La diferencia en cuanto al peso molecular se
debería a que la proteína deducida a partir de
xynA presenta un péptido señal de 28
aminoácidos (comprobado mediante los
programas SignalP y PSort), el cual no sería
procesado en el clon recombinante
Escherichia coli/pXA30, mientras que en la
enzima detectada en sobrenadantes de la cepa
parental Bacillus sp. BP-7 este péptido señal
sería eliminado durante la secreción al medio.
El punto isoeléctrico (pI) teórico de 9,28
deducido para esta xilanasa se vio corroborado
146
también por los resultados experimentales en
geles de isoelectroenfoque (pI de 9 o superior).
Las condiciones óptimas de actuación de
XynA fueron determinadas, siendo estas 60 ºC
de temperatura y pH 6, aunque mantiene un
porcentaje elevado de actividad en márgenes
amplios alrededor de estos valores (de 40 a
70 ºC y pH de 4,5 a 8,5).
En cuanto a la termoestabilidad de la enzima, a
50 ºC es de como mínimo 3 h, inactivándose
rápidamente a 60 ºC. En base a ésto, la enzima
no plantearía problemas a la hora de su
mantenimiento y almacenamiento, sin
embargo no soportaría las altas temperaturas
de algunos procesos industriales, de manera
que para su utilización en este tipo de procesos
biotecnológicos podría ser interesante
someterla a ensayos de evolución dirigida para
incrementar su termoestabilidad.
Los análisis de secuencia revelaron que XynA
de Bacillus sp. BP-7 es una enzima de dominio
único con una alta homología con el subgrupo
de xilanasas, dentro de la familia 11 de
glicosil hidrolasas, de pI alcalino y bajo peso
molecular (92% de identidad con la xilanasa A
de Bacillus subtilis y con la xilanasa A de
Bacillus circulans; Figura I.2.4). Este tipo de
xilanasas parece ser ubicuo entre las especies
del género Bacillus y ha sido propuesto como
el principal subgrupo de enzimas de la familia
11 de glicosil hidrolasas (Wong et al., 1988).
De esta manera, tal como era de esperar, las
características bioquímicas (pH y temperaturas
óptimos, especificidad de sustrato, etc.) de
XynA de Bacillus sp. BP-7 son similares a las
de las xilanasas mencionadas, las cuales están
exhaustivamente caracterizadas (Paice et al.,
1986; Yang et al., 1989; Wakarchuk et al.,
1994; Wolf et al., 1995).
También se ha observado que la composición
G+C en la primera y segunda posición de
codón de xynA de Bacillus sp. BP-7 es del
38,2% y del 52,1% respectivamente.
Porcentajes similares se obtienen para xynA de
B. circulans y para xynA de B. subtilis (38,3%
en G+C para la primera posición y 52,8% para
la segunda), mientras que los porcentajes
promedio para estas posiciones de codón en
los genes de glicosil hidrolasas de B. subtilis
son de 51,7% y 37,7%. Este hecho, sugiere
que la xilanasa A de Bacillus sp. BP-7
corresponde a una enzima altamente
conservada en este género y adquirida por
transferencia horizontal de genes, mediada
en este caso por el profago 6, tal como
sugieren García-Vallvé y colaboradores
(1999).
1.2.- Identificación y
caracterización de YnfF
YnfF de Bacillus sp. BP-7 presenta alta
homología con la proteína deducida del gen
ynfF de Bacillus subtilis ssp. subtilis cepa 168,
identificada en el Proyecto Genoma de
Bacillus subtilis (Kunst et al., 1997) y anotada
originalmente como una proteína de función
desconocida homóloga a endoxilanasas; pero
que recientemente ha sido caracterizada y
147
renombrada como XynC (St. John et al.,
2006b).
En cuanto a la función de ynfF de Bacillus sp.
BP-7, hemos comprobado que codifica una
endoxilanasa. Sin embargo, YnfF es una
xilanasa atípica en el sentido de que no
pertenece ni a la familia 10 ni a la familia 11, a
las que pertenecen la mayoría de
endoxilanasas, ya que no presenta homología
con estas familias. YnfF presenta homología
con enzimas con actividad xilanasa que a su
vez son homólogas a enzimas de la familia 5
de glicosil hidrolasas (Keen et al., 1996;
Suzuki et al., 1997). Asimismo, YnfF presenta
homología a nivel de secuencia con un
dominio conservado de glicosil hidrolasas de
la familia 30, hecho descrito también para
otras enzimas de la familia 5 (Collins et al.,
2005). A pesar de que su estructura
tridimensional es el típico barril (α/β)8 de las
enzimas de la familia 5, las xilanasas de esta
familia son muy similares en secuencia de
aminoácidos a glicosil hidrolasas de la
familia 30, cuya estructura, inferida a partir de
la β-glucosidasa ácida 1 de Homo sapiens,
sería también de barril (α/β)8 (Lieberman et
al., 2007).
YnfF de Bacillus sp. BP-7 es por tanto una de
las pocas xilanasas descritas dentro de la
familia 5 de glicosil hidrolasas.
Tal como se ha comentado, los resultados de
especificidad de sustrato obtenidos para YnfF
(Tabla II.2.2) indican que esta enzima es una
endoxilanasa (1,4-β-D-xylan xylanohydrolase;
EC 3.2.1.8) que hidroliza xilanos de maderas
duras (tales como xilano de madera de abedul,
de haya y metil glucuronoxilano),
obteniéndose los valores más altos de
actividad sobre xilano de madera de abedul.
Por el contrario, la enzima no presenta
actividad detectable sobre xilanos de
gramíneas (xilano de espelta de avena,
arabinoxilano de trigo, arabinoxilano de
centeno), y su actividad tampoco es detectable
o significativa sobre los aril-glicósidos
ensayados.
Estos resultados indican que la xilanasa YnfF
tiene actividad sobre xilanos con
ramificaciones de ácido metil glucurónico
(glucuronoxilanos) pero es inactiva sobre
xilanos con ramificaciones de arabinosa
(arabinoxilanos); lo cual es coherente con el
modo de acción descrito para xilanasas de la
familia 5 de glicosil hidrolasas.
Recientes estudios han demostrado que estas
xilanasas de la familia 5 sólo cortan la cadena
de xilosas del xilano en aquellos puntos
cercanos a una ramificación lateral de ácido
4-O-metil-α-D-glucurónico, la cual quedaría
acomodada en el subsitio -2 del centro activo.
Los productos resultantes de este modo de
acción son fragmentos de xilano que,
independientemente de su longitud, contienen
esta ramificación lateral de ácido
metil glucurónico en el segundo residuo de
xilopiranosa contando desde el extremo
reductor (St. John et al., 2006b; Vršanská et
al., 2007) (Figura D.1.1).
148
La falta de actividad de estas xilanasas sobre
arabinoxilanos sugeriría la imposibilidad
estérica de acomodar residuos de
α-L-arabinofuranosa en los subsitios del centro
activo de la enzima.
La xilanasa YnfF de Bacillus sp. BP-7 tiene un
peso molecular teórico de 47,6 kDa, que
concuerda con el peso molecular determinado
zimográficamente, 47 - 48 kDa, a partir de
extractos obtenidos de cepas recombinantes de
E. coli. Se ha comprobado además, mediante
los programas SignalP y PSort, que la
secuencia proteica deducida de ynfF presenta
péptido señal, hecho que indica que se trata
de una enzima de secreción en la cepa original
de Bacillus sp. BP-7.
Las condiciones óptimas de actuación de YnfF
son 65 ºC de temperatura y pH 6,5,
presentando un porcentaje elevado de
actividad (>50%) en margenes amplios
alrededor de estos valores (de 30 a 70 ºC y pH
de 4,5 a 10).
Estos valores además son muy similares a los
de XynC de Bacillus subtilis 168 (St. John et
al., 2006b), lo cual era de esperar dado el alto
grado de identidad entre ambas proteínas (92%
de identidad a nivel de secuencia
aminoacídica).
La termoestabilidad de YnfF fue muy elevada
(>3 h) a las temperaturas ensayadas de 60 y
50 ºC. Así, esta enzima no plantearía
problemas a la hora de su mantenimiento y
almacenamiento.
1.3.- Identificación de XynD
Hasta el momento, XynD de Bacillus sp. BP-7
sólo ha sido clonada y secuenciada, no
habiéndose caracterizado aún su actividad
enzimática.
A nivel de secuencia de aminoácidos, presenta
alta homología con la xilanasa D (XynD) de
Bacillus subtilis (Kunst et al., 1997), la cual a
pesar de haber sido secuenciada durante el
Proyecto Genoma de Bacillus subtilis no ha
sido caracterizada bioquímicamente. También
presenta homología elevada con XynD de
Paenibacillus polymyxa (Gosalbes et al.,
1991) y otras enzimas que, además de
actividad xilanasa, muestran actividad
arabinofuranosidasa, y que se encuentran
clasificadas en la familia 43 de glicosil
hidrolasas, la cual engloba enzimas con
diferentes actividades hidrolíticas.
Figura D.1.1: Esquema del modo de actuación de las xilanasas de la familia 5.
149
Así, en este caso sería necesario caracterizar la
actividad enzimática de XynD de Bacillus sp.
BP-7, comprobando si realmente la proteína
clonada tiene actividad xilanasa, o si por el
contrario presenta alguna otra de las
actividades hidrolíticas relacionadas con la
degradación del xilano, xilosidasa o
arabinofuranosidasa, exhibidas por enzimas de
la familia 43.
1.4.- Sistema xilanolítico de
Bacillus sp. BP-7
Se han clonado e identificado entre 2 y 3
xilanasas de la cepa Bacillus sp. BP-7,
dependiendo de si consideramos sólo los genes
xynA e ynfF, o si finalmente se confirma XynD
como una auténtica xilanasa (Tabla D.1.1).
Sin embargo, en los zimogramas realizados a
partir de sobrenadantes de la cepa analizada
aparecen una gran variedad de bandas con
actividad xilanasa (López et al., 1998). Así,
podría ser que Bacillus sp. BP-7 presentara
más genes de xilanasas, aunque también
podría suceder que las bandas de actividad
detectadas en los zimogramas fueran
agregados de la xilanasa mayoritaria (XynA) o
de las otras xilanasas caracterizadas en este
trabajo, así como productos de procesamiento
de las mismas. Dado que taxonómicamente
Bacillus sp. BP-7 se encuentra muy cercano a
Bacillus subtilis (López, 2000) y que la
homología de los genes de ambos hasta ahora
comparados es bastante elevada, cabría esperar
que Bacillus sp. BP-7 tuviera un número de
xilanasas similar al de Bacillus subtilis.
A partir de consultas en la base de datos del
genoma de Bacillus subtilis (SubtiList) se
deduce que éste posee sólo 2 genes conocidos
que codifiquen para xilanasas, xynA e ynfF
(recientemente renombrado como xynC),
cuyos homólogos en Bacillus sp. BP-7 se han
identificado en este trabajo. Bacillus subtilis
posee también otros 2 genes clasificados como
homólogos a endoxilanasas, pero aún no
confirmados experimentalmente, xynD e yheN,
de los cuales en Bacillus sp. BP-7 se ha
identificado y subclonado el homólogo a
xynD.
De esta manera, a parte de la caracterización
bioquímica de este último enzima, que se está
realizando actualmente en el grupo de
investigación, quedaría por analizar la
existencia en Bacillus sp. BP-7 del gen
homólogo a yheN de Bacillus subtilis y por
Tabla D.1.1: Xilanasas de Bacillus sp. BP-7.
Gen FamiliaPeso
molecular pITemperatura
óptimapH
óptimoVida media a
50 ºC
xynA 11 23 - 24 kDa 9,28* 60 ºC 6,0 > 3 hynfF 5 47 - 48 kDa 8,80* 65 ºC 6,5 > 3 hxynD 43 54,3 kDa* 7,73* - - -* Valores teóricos
150
caracterizar la presunta proteína codificada por
él.
1.5.- Expresión de xilanasas en
levaduras
En colaboración con el grupo del Dr. Jesús
Zueco de la Universitat de València, se ha
conseguido ensayar con éxito la expresión y
secreción de la xilanasa XynA de Bacillus sp.
BP-7 en Saccharomyces cerevisiae, como
primer paso para su posible utilización
biotecnológica en la industria alimentaria.
S. cerevisiae es un buen candidato para estos
ensayos ya que de forma natural no produce
xilanasas autóctonas (Jeffries, 1983), es un
organismo considerado seguro por la FDA
americana (GRAS: Generally Recognized as
Safe), y se posee una amplia experiencia en su
cultivo a escala industrial en fermentadores.
En los experimentos realizados, se
construyeron cinco fusiones génicas entre el
gen de la xilanasa A de Bacillus sp. BP-7 y el
gen de la proteína de pared Pir4 de
S. cerevisiae.
Pir4 es una proteína formada por dos
subunidades, S I hacia N-terminal y S II en
C-terminal, unidas entre sí a través del motivo
Pir (MP). Pir4 posee además en N-terminal un
péptido señal para su secreción en
S. cerevisiae.
Tras su síntesis en el retículo endoplasmático
de la levadura, la proteína Pir4 es procesada, a
nivel del aparato de Golgi, por la proteasa
Kex2 (Moukadiri et al., 1999), quedando
separada la subunidad I (con el péptido señal)
del resto de la proteína. A continuación, la
subunidad I es secretada al medio de cultivo;
mientras que el resto de Pir4 (MP + S II)
queda anclado a la pared celular gracias a que
contiene 4 cisteínas (1 a nivel del MP y 3 a
nivel de la S II) que permiten la formación de
puentes disulfuro para la unión a la pared
celular de la levadura.
Las distintas construcciones re1alizadas
(C1 - C5) contenían la secuencia codificante
de XynA desprovista de péptido señal
(aa 28 - aa 245) fusionada a posiciones
distintas de la secuencia codificante de Pir4
(Figura I.2.11):
– En la construcción C1 la secuencia
codificante de XynA fue insertada en la
región N-terminal de la subunidad I.
– En C2, XynA se insertó en la región
N-terminal de la subunidad II.
– En C3, XynA se insertó en la región
C-terminal de la subunidad II.
– En C4, la secuencia codificante de XynA
sustituyó gran parte de la secuencia
codificante de la subunidad II.
– En C5, la secuencia codificante de XynA
sustituyó prácticamente toda la secuencia
codificante de Pir4, excepto el péptido
señal.
Estas construcciones fueron expresadas con
éxito en S. cerevisiae BY4741 (cepa salvaje) y
S. cerevisiae mnn9 (cepa deficiente en
glicosilación); y se analizó su localización
151
celular mediante ensayos de actividad
xilanasa.
De las 5 construcciones (C1 - C5), cuatro de
ellas mostraron actividad xilanasa en placas
suplementadas con xilano-RBB, C1 - C4, lo
que indica el correcto plegamiento de la
xilanasa bacteriana en el huésped eucariota.
En el caso de la construcción C5, la falta de
actividad podría deberse a un incorrecto
plegamiento de la proteína a nivel del retículo
endoplasmático, tal como sucede con otras
proteínas de fusión con proteínas de pared de
la familia Pir en las que no se incluye la
subunidad II de la proteína Pir (Simonen et al.,
1994).
En el caso de la construcción C1, ésta dio
lugar a tenues halos de degradación en placas
suplementadas con xilano-RBB. Este hecho
podría deberse a que el procesamiento de la
proteína de fusión en el aparato de Golgi
separaría la subunidad I, con la actividad
xilanasa, de la subunidad II; lo cual podría
afectar al correcto plegamiento de la enzima,
tal como se ha mencionado anteriormente. El
fragmento procesado conteniendo la enzima
XynA y la subunidad I muy probablemente
sería secretado al medio de cultivo, en lugar de
quedar retenido en la pared celular.
Los productos génicos de las construcciones
C2 y C3, se detectaron mediante ensayos de
actividad xilanasa a nivel de la pared celular
de S. cerevisiae. Esto sería debido a que ambas
construcciones conservaban las 4 cisteínas
típicas de la familia Pir que permitirían la
formación de puentes disulfuro para la unión a
la pared celular.
En los clones de la cepa S. cerevisiae BY4741
con estas construcciones, C2 y C3, la mayoría
de la actividad xilanasa (100% y 96%
respectivamente) se detectó a nivel de pared;
mientras que en el caso de la cepa
S. cerevisiae mnn9, los clones con estas
construcciones, presentaron actividad xilanasa
tanto a nivel de pared celular como en los
sobrenadantes de cultivo, debido a que las
deficiencias en glicosilación de esta cepa
(Hernández et al., 1989) afectarían la unión de
Pir4 a la pared celular (Moukadiri et al.,
1999), y por tanto parte de la proteína de
fusión Pir4-XynA sufriría cierta secreción al
sobrenadante en lugar de quedar retenida en la
pared celular. Esta secreción parcial de
Pir4-XynA al medio de cultivo también
explicaría porque la actividad a nivel de pared
en la cepa mnn9 era menor que en la cepa
BY4741.
Por último, se observó que la proteína de
fusión Pir4-XynA resultante de la construcción
C4 era secretada de manera mayoritaria al
medio de cultivo (87 - 89% de la actividad
xilanasa total), tanto en los clones de la cepa
BY4741 como en los de la cepa mnn9. Esto
sería debido a que en esta construcción se
había eliminado la región de la subunidad II de
Pir4 que contiene 3 de las 4 cisteínas
conservadas, y por tanto la proteína resultante
no podría ser retenida en la pared celular. El
hecho de que esta proteína fuera secretada
también explicaría que los clones que
152
contenían la construcción C4 dieran mayores
halos de degradación del xilano-RBB en los
ensayos de actividad en placa, al poder
difundirse por el medio sólido.
Los resultados de actividad y localización de
las proteínas de fusión se vieron respaldadas
por los resultados de western blot con
anticuerpos anti-Pir4 obtenidos por el grupo
del Dr. Jesús Zueco en Valencia (Andrés et al.,
2005).
Se ha conseguido un sistema basado en la
proteína Pir4 que permite direccionar xilanasas
hacia la pared celular de levaduras o hacia el
medio de cultivo, para obtener enzimas
activas, bien inmovilizadas en la pared celular
o bien secretadas.
Estos ensayos con S. cerevisiae facilitan el uso
de XynA y otras xilanasas en la industria
panadera para obtener los efectos beneficiosos
que se derivan de la aplicación de estas
enzimas en panificación (aumento del
volumen y de la calidad de la miga, además de
un efecto de antienranciamiento) (Linko et al.,
1997); con la ventaja añadida que conlleva el
hecho que sea la propia levadura utilizada para
el esponjado de la masa panaria la que
produzca xilanasas que queden expuestas al
medio y, por tanto, en contacto con las
hemicelulosas sobre las que han de actuar.
2. X2. XYNYNB B DEDE PPAENIBACILLUSAENIBACILLUS
BARCINONENSISBARCINONENSIS
2.1. Expresión en huéspedes
homólogos
La xilanasa B (XynB) de Paenibacillus
barcinonensis presenta unas propiedades, entre
las que se encuentra su actividad
transxilosidasa (Blanco et al., 1996; Gallardo
et al., 2003), que confieren a esta enzima
especial interés por su potencial aplicación en
la síntesis de nuevos xilósidos, de utilidad en
la industria alimentaria o farmacéutica (Jiang
et al., 2004). Con el fin de producir xilanasa B
en elevadas cantidades, se decidió clonarla y
sobreexpresarla en huéspedes homólogos. Se
eligió para ello Bacillus subtilis, debido a que
es un sistema de expresión homólogo a
Paenibacillus barcinonensis (del antiguo
género Bacillus). Bacillus subtilis es además
un microorganismo GRAS, bien conocido,
fácilmente cultivable, y previamente utilizado
con éxito para la producción industrial de
enzimas y otras proteínas (Harwood, 1992;
Ferrari et al., 1993; Tremblay y Archibald,
1993; Wong, 1995). Además, presenta la
ventaja añadida de tener la capacidad de
secretar un gran número de proteínas al medio
extracelular, con lo que era de esperar que la
xilanasa podría ser secretada al medio de
cultivo en lugar de permanecer dentro de las
células (como sucede en E. coli),
153
simplificándose así su purificación a escala
industrial (downstream-processing).
Concretamente, se eligieron las cepas Bacillus
subtilis MB216, por ser fácilmente
transformable (Lampen et al., 1986), y
Bacillus subtilis MW15, por ser una cepa
deficiente en proteasas, celulasas, lichenasas y
xilanasas (Wolf et al., 1995).
Se realizaron construcciones que contenían el
gen xynB en los vectores lanzadera
E. coli-Bacillus subtilis pBRSPO2 y pN5. Los
clones con la construcción pBRSPO2X20
(donde xynB está bajo el control del promotor
fuerte SPO2) mostraron una elevada
producción de actividad xilanasa; mientras que
los clones con la construcción pN5X20 (xynB
con su propio promotor) no presentaron
diferencias de actividad xilanasa con las
correspondientes cepas huésped.
La falta de expresión apreciable de XynB en
los clones con la construcción pN5X20 podría
deberse a que la potencial región promotora
del gen xynB (121 bp) clonada en pN5X20 no
era funcional en las cepas huéspedes
utilizadas, a pesar de su similitud con
secuencias reconocidas por la subunidad σA de
la ARN polimerasa de Bacillus subtilis y a
pesar también de que, por regla general, los
promotores de Bacillus y géneros afines dan
lugar a altos niveles de expresión en B. subtilis
(Sumitomo et al., 1995). Este hecho parece
indicar que dicha región de 121 bp en posición
5' del gen estructural xynB no es tampoco una
región promotora funcional en Paenibacillus
barcinonensis, y que falta alguna secuencia
importante en posición 5' necesaria para la
transcripción del gen xynB.
Por otra parte, los buenos niveles de expresión
obtenidos con el plásmido pRBSPO2X20 se
deberían al buen funcionamiento del promotor
SPO2 utilizado, tal como era de esperar en
base a publicaciones de otros autores (Schoner
et al., 1983; Overbeeke et al., 1990; Bolhuis et
al., 1999). Es probable que se puedan
conseguir niveles de expresión iguales e
incluso superiores a los obtenidos con el
promotor SPO2 utilizando otros promotores
fuertes en Bacillus subtilis, como por ejemplo
el promotor de la α−amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens (Palva et al., 1981;
Yamamoto et al., 2005) o el promotor SPO1
(Osburne y Craig, 1986).
De entre los clones con la misma construcción
pBRSPO2X20, el clon en la cepa B. subtilis
MW15 mostró más actividad que el clon
correspondiente en B. subtilis MB216, debido
seguramente a que la cepa B. subtilis MW15
es deficiente en 2 proteasas (la proteasa neutra
y la proteasa alcalina), mientras que la cepa
B. subtilis MB216 no lo es, de manera que en
el clon B. subtilis MW15/pRBSPO2X20 debe
haber menor proteólisis de la enzima
producida. La actividad xilanasa de este clon
proviene además exclusivamente de la
xilanasa recombinante, ya que la cepa huésped
Bacillus subtilis MW15 no presenta actividad
xilanasa basal detectable al tener
disrupcionado el gen xynA, que codifica la
154
xilanasa mayoritaria de la cepa. Por el
contrario, en el clon B. subtilis
MB216/pRBSPO2X20 parte de la actividad
xilanasa producida es actividad basal debida a
las xilanasas propias de la cepa huésped.
Continuando con el estudio de la expresión en
Bacillus subtilis MW15/pRBSPO2X20, se
observó que los niveles máximos de actividad
xilanasa se obtenían en fase estacionaria
avanzada, a los 3 - 4 días de cultivo, lo cual
concuerda con datos de producción de otras
enzimas en cepas de Bacillus (Blanco y Pastor,
1993; Kim y Pack, 1996). Estudios por
SDS-PAGE de los sobrenadantes de estos
cultivos mostraron que la xilanasa B
representaba la banda proteica mayoritaria de
los mismos, hecho que confirma la
sobreproducción de XynB en la cepa
recombinante construida.
Los medios de cultivo que dieron lugar a
mayor producción de xilanasa fueron el caldo
nutritivo suplementado con paja de arroz o con
xilano de madera de abedul. En este último
medio se obtuvieron niveles de actividad en
los sobrenadantes unas 3 veces superiores a los
niveles de actividad intracelular del clon
original E. coli 5K/pX60.
El resto de medios de cultivo ensayados no
dieron lugar a estos niveles de producción,
siendo sorprendente la baja producción en los
medios MG, MG2 y, sobre todo, en el medio
BREC1, si se tiene en cuenta que contienen
altas concentraciones de amonio para
minimizar la expresión de proteasas, y que
concretamente el medio BREC1 ha sido
descrito como un medio muy adecuado para la
sobreexpresión en Bacillus subtilis DB104,
cepa de la cual deriva la cepa MW15
(Overbeeke et al., 1990).
2.2. Localización celular
Cuando se comparó la actividad xilanasa en
los extractos celulares (intracelular) con la
actividad en los sobrenadantes (extracelular)
de cultivos de Bacillus subtilis
MW15/pRBSPO2X20 en fase estacionaria, se
observó que sorprendentemente la actividad
intracelular era más elevada de lo que se
esperaría si la xilanasa B fuera secretada al
medio. Asimismo, estudios por SDS-PAGE
confirmaron que la xilanasa B recombinante se
encontraba en alta proporción tanto en los
sobrenadantes como en los extractos celulares
de cultivos en fase estacionaria.
Se comprobó que en cultivos jóvenes (hasta
24 h) la actividad xilanasa era
mayoritariamente intracelular, a medida que
los cultivos progresaban en la fase estacionaria
(1 - 2 días) la actividad empezaba a detectarse
en el medio extracelular; y sólo en cultivos en
fase estacionaria muy avanzada (3 - 4 días) los
niveles extracelulares de actividad xilanasa
superaban ligeramente a los intracelulares.
Puesto que la mayoría de enzimas
extracelulares de Bacillus son secretadas al
medio desde las primeras etapas de los
cultivos (Jeong et al., 1998; Leloup et al.,
1999; Qureshy et al., 2000; Schallmey et al.,
155
2004); los resultados indicaban que la
xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis era
una enzima intracelular, que no se secretaba al
medio, y que, posiblemente, debido a lisis
celular se encontraría también en el
sobrenadante de cultivos viejos.
En base a estos datos, planteamos la hipótesis
según la cual la xilanasa B sería una enzima
intracelular cuya liberación al medio de cultivo
se podría producir de manera inespecífica por
lisis celular en determinadas condiciones. Ésto
se pudo constatar en la cepa recombinante
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20, en la cual
los valores de lisis, medidos en función de la
actividad malato deshidrogenasa extracelular
respecto a la intracelular, presentaron
correlación con los valores de actividad de la
xilanasa B detectados en el compartimento
extracelular (Tabla III.2.7).
La realización de estudios de localización
celular en la cepa original Paenibacillus
barcinonensis resultó más compleja debido a
que dicha cepa, a diferencia del clon
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20, posee un
sistema xilanolítico complejo con varias
enzimas con actividad xilanasa y xilosidasa
(Blanco y Pastor, 1993), de manera que no se
puede asociar directamente la actividad
xilanasa o xilosidasa de una fracción celular a
XynB.
Sin embargo, los análisis zimográficos en
geles nativos de los extractos celulares y los
sobrenadantes de cultivo permitieron obtener
una prueba empírica sólida del carácter
intracelular de XynB de Paenibacillus
barcinonensis. En este tipo de geles la banda
de actividad correspondiente a XynB se puede
diferenciar fácilmente del resto de xilanasas de
la cepa debido a su diferente movilidad
electroforética (Blanco et al., 1996). Esta
banda aparecía claramente en todas las
muestras analizadas de extractos celulares de
Paenibacillus barcinonensis, mientras que
sólo ocasionalmente se observaron bandas de
actividad correspondientes a XynB en algunos
sobrenadantes de Paenibacillus barcinonensis,
y siempre varios ordenes de magnitud más
tenues que las bandas de XynB observadas en
los correspondientes extractos celulares.
La posibilidad de que XynB fuera una enzima
secretada pero asociada a la pared bacteriana
fue descartada al comprobarse que sólo se
detectaba actividad xilanasa en el citoplasma,
no detectándose ésta en los restos de pared y
membranas celulares, tras analizar las
fracciones soluble y particulada de extractos
celulares de Paenibacillus barcinonensis.
El análisis de la secuencia de aminoácidos
deducida del gen xynB de Paenibacillus
barcinonensis mostró la ausencia en la región
N-terminal de un péptido señal típico para
secreción en Bacillus y otros Gram + mediante
el sistema Sec (Sec pathway) o por el sistema
Tat (twin-arginine pathway). Un péptido señal
de este tipo debería de consistir en varios
aminoácidos con cargas positivas en el
extremo más N-terminal (dominio N), con la
156
presencia o no de secuencias KR o RR
(twin-arginine motif), seguidos de una zona de
aminoácidos hidrófobos (dominio H), y de
aminoácidos polares o cargados a continuación
y antes del lugar de corte por la peptidasa
señal (dominio C). Tampoco se identificó en
XynB la presencia de otros péptidos señales
menos frecuentes, como los utilizados por los
sistemas de secreción Com (dominio N +
dominio C + dominio H) o ABC (dominio N +
dominio C) (Tjalsma et al., 2004)
(Figura D.2.2).
La ausencia de péptido señal fue evidenciada
mediante análisis informáticos de la secuencia
proteica deducida mediante los programas
SignalP y PSort. También se verificó
empíricamente mediante secuenciación del
extremo N-terminal de la xilanasa B presente
tanto en citoplasma como en sobrenadantes de
cultivo. En todos los casos se observó una
secuencia aminoacídica idéntica a la
N-terminal deducida a partir del gen xynB. Si
la xilanasa B fuera una proteína que se
secretara por cualquiera de los 4 sistemas de
secreción descritos en Bacillus y otros Gram +
(sistema Sec, sistema Tat, sistema Com y
sistema de transportadores ABC; Tjalsma et
al., 2004), deberían haberse observado
diferencias, debidas al procesamiento por parte
de cualquiera de los tipos de peptidasa señal
involucrados en secreción en este tipo de
bacterias.
Figura D.2.2: Péptidos señal válidos en Bacillus y otros Gram +. Se representan los dominios N (con cargas positivas, en rojo), C (con aminoácidos polares o cargados, en azul) y H (con aminoácidos hidrófobos, en amarillo). (Tjalsma et al., 2004).
Tat
Sec
Com
ABC
Péptido señal de tipo Tw in-arginine
Péptido señal de tipo Sec
Péptido señal de lipoproteínas
Péptido señal de Pseudopilinas
Péptido señal de Bacteriocinas y Feromonas
++ K/RR ## AXAN H C
+1
++ CLXXN H C
+1
+++N H C
+1AXAPG
KG EFN HC
+1
N C
+1
Tipo I(SipS, SipT, SipU,
SipV o SipW)
Tipo II(LspA)
Peptidasas de Pseudopilinas
(ComC)
Transportadores ABC
(SunT, AlbE/F)
Sistema de secreción
Peptidasas señal
157
La ausencia de péptido señal impediría la
secreción de la xilanasa B al medio, ya que
todas las enzimas de Bacillus y géneros afines
(como Paenibacillus) descritas hasta la fecha
necesitan péptido señal para ser secretadas
(Nagarajan, 1993; Fu et al., 2007).
Estos hechos indicarían, en concordancia con
el resto de experimentos de localización, que
la xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis
es una enzima intracelular.
La localización intracelular de la xilanasa B
resulta sorprendente ya que las xilanasas,
como enzimas degradadoras de polímeros,
deben ser secretadas al medio para que puedan
actuar sobre el xilano (de elevado tamaño),
liberando xilooligómeros más pequeños que sí
pueden ser transportados al interior de la
célula para su completa degradación. Dado
que, tal como hemos demostrado, XynB no es
secretada al medio, su función natural no
puede ser la degradación del xilano, ya que en
condiciones normales no entraría en contacto
con él. Su función podría ser pues la
degradación de xilooligómeros cortos, de 3 o
más residuos de xilosa, resultantes de la
degradación extracelular del xilano por otras
xilanasas, una vez transportados al interior de
la célula. Esta posibilidad se vería respaldada
tanto por estudios previos que indican que
XynB presenta elevada actividad sobre estos
xilooligosacáridos (Blanco et al., 1996), como
por los datos de especificidad de sustrato
mostrados en el presente trabajo.
Cabe mencionar en este punto que, tal como se
comentó en la introducción, han sido descritas
xilanasas localizadas en el espacio
periplásmico de bacterias Gram negativas,
como es el caso de la bacteria del rumen
Prevotella bryantii, en la que
aproximadamente un 80% de la actividad
xilanasa se localiza en el periplasma (Miyazaki
et al., 1997); o de Cellvibrio mixtus, en la que
la xilanasa XylC presenta un péptido señal que
dirige su secreción al periplasma (Fontes et al.,
2000). Tal como sugieren estos autores, la
función de estas xilanasas periplásmicas no
sería tampoco la degradación del xilano, sino
que, muy posiblemente, sería la degradación
de aquellos xilooligosacáridos de menor
tamaño que pudieran atravesar la membrana
externa, al mismo tiempo que quedarían
protegidas en el periplasma de la acción de las
proteasas extracelulares.
Por último, los estudios de homología de
XynB mostraron que pertenecía a la familia 10
de glicosil hidrolasas, observándose un
elevado grado de homología con otras 6
xilanasas de esta familia. Nuestros estudios
han revelado que estas 6 xilanasas tienen una
serie de características comunes entre ellas y
con XynB, que las diferencian respecto al resto
de xilanasas de la familia. En concreto, estas
xilanasas no presentan evidencias de poseer
péptido señal (comprobado mediante análisis
informáticos de secuencia), y todas ellas
poseen 2 regiones de aminoácidos conservadas
no presentes en el resto de xilanasas de la
158
familia 10 (regiones A, AIE_YASL, y B,
RTDL__PT, flanqueando la región VI
conservada en las xilanasas de esta familia).
Además, XynB y estas 6 xilanasas homólogas
sin péptido señal son xilanasas de dominio
único, sin dominios extra de unión a sustratos
insolubles; y, en algunos casos, sus autores las
clasifican como xilanasas intracelulares o
como exoxilanasas (Usui et al., 1999; Shulami
et al., 1999), aunque en ningún caso se ha
mostrado evidencia experimental de la
localización intracelular de las mismas.
Al realizar estudios de agrupamiento en
dendrogramas, XynB y las 6 xilanasas
homólogas quedan agrupadas juntas, formando
un cluster, separadas del resto de miembros de
la familia 10 (Figura III.2.9).
Así, estaríamos ante un nuevo tipo de
xilanasas, dentro de la familia 10, con función
intracelular, posiblemente la degradación de
xilooligómeros pequeños, pero con actividad
claramente distinta a la de las xilosidasas al no
ser activas sobre xilobiosa. Este grupo de
enzimas constituirían pues un tipo intermedio
entre las xilanasas auténticas y las xilosidasas,
cuya función biológica en la degradación del
xilano todavía está por dilucidar
experimentalmente.
Para confirmar que realmente estas enzimas
forman un grupo aparte dentro de las xilanasas
de la familia 10, sería necesario un estudio
más amplio y detenido de las características
bioquímicas y estructurales de las xilanasas
homólogas a XynB, que agrupan junto a ella
en los árboles filogenéticos.
Sería necesaria también una caracterización
bioquímica exhaustiva de XynB, evaluando su
actividad sobre un amplio rango de
xilooligómeros y sustancias afines, con el fin
de dilucidar cuál es el sustrato natural de esta
enzima e identificar su función biológica.
Asimismo, el estudio detallado de la actividad
transglicosidasa de la xilanasa B, evidenciada
por la aparición de productos de mayor grado
de polimerización que los sustratos (Blanco et
al., 1996), podría ser de utilidad para
identificar la función biológica de XynB, ya
que muy posiblemente sea éste el mecanismo
responsable de que esta xilanasa presente la
inusualmente elevada actividad sobre
aril-xilósidos que se ha descrito en el trabajo.
La existencia de xilanasas intracelulares tanto
citosólicas como periplásmicas permitirían a
las bacterias que las poseen un rápido y eficaz
aprovechamiento de los productos resultantes
de la degradación del xilano extracelular,
llevada a cabo por xilanasas extracelulares
propias o de otras bacterias.
2.3. Relación estructura-función
Para profundizar en el conocimiento de la
xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis, se
decidió realizar estudios de estructura-función.
159
A partir de los modelos de estructura
secundaria y terciaria de XynB, y
posteriormente de la estructura tridimensional
determinada por cristalografía, se comprobó
que la estructura de la xilanasa era la típica
estructura de barril (α/β)8 o TIM-barrel de las
xilanasa de la familia 10. En esta estructura,
los aminoácidos catalíticos de la enzima (E241
y E134) quedarían muy próximos y hacia el
interior del barril en una hendidura de la
superficie de la proteína. Cabe recordar aquí
que en las xilanasas de la familia 10 el lugar de
unión al sustrato está en una hendidura poco
profunda (mientras que en las de la familia 11
el lugar de unión al sustrato está en un surco
más profundo), hecho que permite a las
xilanasas de esta familia ser menos estrictas en
cuanto al sustrato, mostrando una mayor
versatilidad catalítica que las xilanasas de la
familia 11 (Biely et al., 1997). En el caso de
XynB esta mayor laxitud respecto al sustrato
puede observarse en el análisis de su
especificidad de sustrato del capítulo III de
Resultados (Tabla III.2.1), ya que además de
actividad sobre diferentes xilanos (tanto de
maderas duras como de gramíneas) y la
elevada actividad sobre aril-xilósidos, la
xilanasa B presenta actividad significativa
sobre aril-glucósidos (pNPCel2 - pNPCel5),
característica particular de las xilanasas de la
familia 10 que sirve para diferenciarlas de las
de la familia 11 (Biely et al., 1997).
La estructura obtenida por cristalografía reveló
con detalle la hendidura catalítica, en la que se
distinguen 4 subsitios de unión al sustrato
claramente definidos (subsitios -2, -1, +1 y
+2), y sugiere la existencia de 3 subsitios
adicionales (-3, +3 y +4) (Figura IV.2.9). La
presencia del elevado número de subsitios de
unión al sustrato es coherente con la capacidad
de la xilanasa B de hidrolizar oligosacáridos
de 3, 4 o más residuos de xilosa, y con su
ausencia de actividad frente a xilobiosa.
Además de los dos residuos de glutámico
catalíticos a nivel del subsitio -1, es importante
la presencia de otros residuos aromáticos
(W299, Y179 y F303) que ayudarían a
posicionar correctamente el sustrato en la
orientación correcta para la hidrólisis del
enlace glucosídico (Leggio et al., 2000);
asimismo estos residuos aromáticos, y en
especial el triptófano 299 en el subsitio -1,
actuarían como impedimento estérico para el
correcto posicionamiento de un anillo de
glucosa (con un CH2OH en lugar de un H
respecto a la xilosa) a nivel del subsitio -1, lo
cual explicaría la baja actividad (<1% de la
actividad máxima) de esta enzima sobre las
celulosas ensayadas (carboximetil celulosa y
Avicel).
También es importante resaltar la presencia de
una cavidad a nivel del subsitio +2, la cual
permitiría acomodar sustituyentes laterales en
el O2 de la xilosa posicionada en este subsitio,
como por ejemplo metil glucurónico (Pell et
al., 2004), lo que se ve corroborado por la
actividad de la xilanasa B sobre sustratos
como el glucuronoxilano.
160
Con el fin de profundizar en los estudios de la
relación estructura-función, se decidió recurrir
a la ingeniería de proteínas, ya que se ha
demostrado como una tecnología útil para
resolver cuestiones relativas a la estructura y la
función de las proteínas, además de para
obtener nuevas estructuras proteicas que estén
mejor preparadas para una utilización
industrial específica (Arrizubieta y Polaina,
2000).
En concreto, para estudiar la posible
funcionalidad de la región conservada B
(RTDL__PT), distintiva del grupo de xilanasas
sin péptido señal y situada en uno de los
bucles (o loops) exteriores de la estructura de
XynB, se decidió recurrir a una estrategia de
mutagénesis dirigida para obtener proteínas
mutantes derivadas de ésta en las que dicha
región estuviera deleccionada total o
parcialmente.
A pesar de que se consiguieron diferentes
clones con delecciones de 4, 8 y 13
aminoácidos en esta región, ninguno de ellos
mostró actividad xilanasa o sobre pNPX,
hecho que indica que estas xilanasas truncadas
no son funcionales.
En un principio se creyó que ésto
probablemente era debido a que se había
alterado la estructura básica de la enzima, al
reducirse la distancia entre la séptima hebra β
y la séptima hélice α del barril (α/β)8. Este tipo
de resultado negativo es bastante frecuente a la
hora de intentar rediseñar enzimas, ya que, por
ejemplo, es muy fácil desbaratar con las
modificaciones introducidas la intrincada red
de puentes de hidrógeno que mantienen la
estructura necesaria para que las enzimas
realicen su función concreta, obteniéndose
como resultado enzimas inactivas (Hwang y
Warshel, 1988; Yano et al., 1998).
Sin embargo, cuando se obtuvieron
posteriormente los resultados de cristalografía,
se observó que el bucle L7 (aminoácidos
S245 - T260), que contiene la región
conservada B y está afectado por las
delecciones introducidas mediante
mutagénesis dirigida, es esencial para
determinar la conformación del centro activo
de la xilanasa B, ya que los residuos R248,
H249 y E250 situados en dicho bucle son los
principales responsables de la especificidad de
los subsitios +2 y +3 (Figura IV.2.9). Así, las
alteraciones debidas a las delecciones
introducidas no sólo podían afectar a la
estructura básica de la enzima, como se creyó
en un primer momento, sino que además
alteraban de manera importante el centro
activo de la enzima al acortar y desestructurar
el bucle L7.
En cualquier caso, la falta de mutantes
funcionales no permite dilucidar si la región B
juega alguna función o no, más allá de su
aparente papel en el mantenimiento de la
estructura del bucle L7, para el correcto
plegamiento del centro activo de la enzima.
161
2.4. Termoestabilidad
Para conocer mejor la xilanasa B de
Paenibacillus barcinonensis así como para
mejorar sus cualidades para una posible
aplicación en la industria, se realizaron
experimentos de ingeniería de proteínas
enfocados a modificar su termorresistencia.
Debido a los problemas encontrados en la
obtención de resultados mediante mutagénesis
dirigida y a los pocos conocimientos que
disponíamos sobre la relación entre la
estructura y la función de XynB, se decidió
recurrir a la denominada “evolución dirigida”
(Hancock et al., 2006). Esta tecnología se basa
en la generación aleatoria de una gran
variabilidad de copias mutantes del gen entre
las que seleccionar a continuación aquellas que
dan lugar a enzimas con las características
deseadas (López-Camacho y Polaina, 1993;
Yano et al., 1998); en nuestro caso xilanasas
con una mayor termorresistencia.
Un paso crítico en la estrategia de evolución
dirigida es el procedimiento para generar las
copias mutagenizadas. Se decidió utilizar la
técnica de DNA shuffling, con o sin una etapa
previa de PCR mutagénica, ya que es una
técnica que ha dado muy buenos resultados en
aproximaciones de este tipo (Stemmer, 1994;
López-Camacho et al., 1996; Sanz-Aparicio et
al., 1998; Arrizubieta y Polaina, 2000).
Mediante esta metodología se consiguió
obtener 3 clones mutantes termoestables, que
contenían un total de 4 mutaciones en la
secuencia aminoacídica de XynB. Las 4
mutaciones identificadas, E137D, D323N,
S15L y M93V, fueron aisladas mediante PCR
divergente en un sólo paso y expresadas de
manera individual, obteniéndose de esta
manera 4 xilanasas mutantes que fueron
purificadas y caracterizadas en cuanto a
termoestabilidad. Todas las xilanasas mutantes
presentaron una termoestabilidad superior a la
xilanasa salvaje, tanto a 45 como a 50 ºC;
destacando entre ellas las mutantes M93V y
S15L, que presentaron a 50 ºC una vida media
entre 3 y 4 veces superior a la de la enzima
salvaje.
Con el fin de mejorar el incremento de
termoestabilidad que producían las mutaciones
de manera individual, se decidió combinarlas
creando 2 xilanasas dobles mutantes: una que
contenía las 2 mejores mutaciones, M93V y
S15L, y otra que contenía las mutaciones
E137D y D323N.
La xilanasa doble mutante E137D/D323N no
mostró grandes diferencias de termoestabilidad
respecto a la enzima salvaje; mientras que la
xilanasa doble mutante S15L/M93V presentó
un incremento notable en la termoestabilidad,
siendo su vida media a 50 ºC 20 veces superior
a la de la xilanasa B salvaje y 2 veces superior
a la suma de las vidas medias de las mutantes
simples S15L y M93V. Se constató pues un
efecto sinérgico de estas 2 mutaciones sobre la
termoestabilidad de la xilanasa B. Diferentes
estudios previos muestran también como la
combinación de mutaciones puntuales que
afectan positivamente la misma propiedad de
una proteína produce una enorme mejora de
162
dicha propiedad, bien debido a un efecto
aditivo o a un efecto sinérgico (cooperativo,
como es nuestro caso) de las mutaciones
(Zhang et al., 1995; Kawamura et al., 1998;
Akanuma et al., 1999; Arrizubieta y Polaina,
2000).
Para inferir las posibles modificaciones
estructurales que determinaban los residuos
mutagenizados y como éstas podrían afectar
positivamente a la termoestabilidad de la
enzima XynB, se localizó la posición de las
mutaciones estudiadas sobre la estructura
tridimensional obtenida por cristalografía de la
xilanasa B.
Se observó que todas las mutaciones
caracterizadas quedaban en regiones de
plegamiento superficial, bastante alejadas del
centro activo (Figura IV.2.21). La única de las
mutaciones que presentaba cierta proximidad
al centro activo era la mutación E137D,
cercana a nivel de estructura primaria al
aminoácido catalítico E134. Sin embargo, en
la representación de la superficie de la
proteína, se puede constatar como el
aminoácido en esta posición no interviene en
el surco catalítico de la enzima (Figura D.2.3);
además del hecho de que se trata de un cambio
conservativo (glutámico por aspártico, ambos
aminoácidos ácidos) y por tanto suponemos
que no son de esperar grandes alteraciones de
cargas o en los enlaces salinos de esta región
cercana al centro activo.
También cabe remarcar que todas las
mutaciones se sitúan en bucles (S15L y
E137D) o en la frontera entre estructuras en
hélice α y bucles (M93V y D323N), lo cual es
consistente con el hecho de que los bucles son
las regiones de los barriles (α/β)8 con una
mayor variabilidad en secuencia y donde más
cambios aminoacídicos pueden darse sin que
se produzca un cambio deletéreo en la enzima
(Sanz-Aparicio et al., 1998).
Al estudiar con más detalle las regiones (el
entorno) en que se encuentran las dos mejores
mutaciones, S15L y M93V, se observa como,
en el caso de la mutación S15L, la serina en
posición 15 de la proteína salvaje está
estabilizada por 3 puentes de hidrógeno con
otros residuos polares de su entorno (Y12, N14
y R282). Su sustitución por leucina en las
mutantes imposibilita dos de estos puentes de
hidrógeno: los que se establecían con Y12 y
con R282 (Figura D.2.4).
Sin embargo, la leucina en las xilanasas
mutantes puede establecer interacciones
hidrofóbicas con los anillos aromáticos de
Figura D.2.3: Localización sobre la superficie tridimensional de XynB de los aminoácidos catalíticos E241 y E134 (azul) en el surco catalítico, y del glutámico mutagenizado E137D (púrpura). Se aprecia claramente como este aminoácido no forma parte del surco catalítico.
163
aminoácidos de su entorno, Y12 y F16,
permitiendo un plegamiento más compacto en
esta zona (Akanuma et al., 1999).
En el caso de la mutación M93V, la situación
es diferente. Aquí no se pierden puentes de
hidrógeno al cambiar la metionina en posición
93 por valina (Figura D.2.5).
Sin embargo, se ha descrito para otras enzimas
que la metionina es químicamente lábil y
propensa a la oxidación o desaminación a altas
temperaturas cuando está situada en regiones
superficiales, hecho que llevaría a la
inactivación irreversible de la enzima (Estell
et al., 1985; Glazer y Nikaido, 1995;
Arrizubieta y Polaina, 2000; Koc y Gladyshev
2007). Por el contrario estas modificaciones
químicas no podrían darse sobre la valina de
las mutantes M93V, de manera que la
W92
P90
F94V93V93
M93M93
W92
P90
F94
MM9393VV
Figura D.2.5: Entorno de la metionina en posición 93 en la proteína salvaje (arriba, modelo obtenido por cristalografía), y entorno resultante al sustituir dicha metionina por valina (abajo, modelo obtenido por manipulación informática). En ambos casos se muestra el único puente de hidrógeno de la región en línea discontinua de color verde.
R282
Y12
F16
N14
L15L15
S15S15
R282
Y12
F16
N14
SS1515LL
Figura D.2.4: Entorno del residuo en posición 15 de XynB. Se muestra tanto la enzima original donde es una serina la que ocupa esta posición (arriba, modelo obtenido por cristalografía), como el resultado de sustituir dicha serina por leucina (abajo, modelo obtenido por manipulación informática). En ambos casos se marcan los puentes de hidrógeno en línea discontinua de color verde.
164
sustitución de metionina por valina permitiría
una mayor estabilidad de la xilanasa frente a la
temperatura. Además, esta sustitución podría
mejorar el empaquetamiento de esta región
debido a las mejores interacciones
hidrofóbicas con los aminoácidos del entorno,
W92 y F99, que puede establecer la valina al
presentar ésta una cadena lateral ramificada
(Arrizubieta y Polaina, 2000; Wu et al., 2007).
Para comprobar si estas modificaciones
aminoacídicas producían algún tipo de cambio
en la estructura secundaria respecto a la de la
xilanasa B salvaje, se hicieron análisis de
dicroísmo circular.
En los resultados obtenidos no se observaron
variaciones significativas alrededor de los
220 nm que permitieran inferir posibles
diferencias en la estructura secundaria (en el
grado de α-helipticidad o de contenido en
conformación hélice α) (Hurlbert y Preston,
2001). Asimismo, las ligeras diferencias en la
desviación de la luz encontradas en la zona de
230 nm entre la xilanasa B salvaje y la doble
mutante (Figura IV.2.22), serían debidas a
cambios puntuales causados por la
reorganización de los residuos aromáticos en
el entorno de los aminoácidos mutados.
En cualquier caso, tal como ha sido descrito
previamente (Akanuma et al., 1999), son
posibles aumentos en la termorresistencia
mediante pequeños cambios aminoacídicos sin
que ello conlleve cambios aparentes en la
estructura básica de las proteínas.
A partir de los resultados de los estudios
cinéticos que se realizaron con las xilanasas
mutantes, se observa que a pesar de las
importantes diferencias en cuanto a
termoestabilidad de estas proteínas, la
constante de Michaelis (KM) de éstas no
presenta grandes diferencias respecto a la KM
de la xilanasa B salvaje; aunque sí que se
aprecia una ligera reducción de esta constante
en el caso de las enzimas mutantes más
termorresistentes, especialmente en la doble
mutante S15L/M93V, lo que indicaría un
pequeño aumento de la afinidad (1/KM) de
estas mutantes por el sustrato.
Sin embargo, la constante catalítica (KCAT) aun
siendo muy similar entre todas las xilanasas
mutantes, resulta ser muy superior (alrededor
de un orden de magnitud) a la KCAT de la
xilanasa B salvaje. Esto significa que a pesar
de que no se ha modificado de manera
apreciable la afinidad en las mutantes, sí que
ha aumentado la cantidad de moléculas de
sustrato que una molécula de enzima mutante
puede convertir en producto por unidad de
tiempo.
Cabe destacar el caso de la doble mutante
XynB E137D/D323N, cuya termoestabilidad
es muy similar a la de la xilanasa B salvaje,
pero que, a pesar de tener la KM más parecida a
la de la enzima salvaje, presenta los valores de
KCAT más elevados. Esto es debido a su alta
VMáx en relación a la baja concentración de
enzima utilizada.
Resultados en el mismo sentido que para la
KCAT se obtuvieron al calcular la eficacia
165
catalítica (KCAT/KM): todas las xilanasas
mutantes presentan valores similares de
eficiencia catalítica, que son a su vez muy
superiores a la eficiencia catalítica de la
xilanasa B salvaje.
Se han conseguido pues no sólo aumentos en
la termoestabilidad de algunas de las xilanasas
mutantes, sino también aumentos en la
eficiencia catalítica.
Cambios aminoacídicos similares, que no
afectan a residuos de la hendidura catalítica
pero que sin embargo producen cambios en la
capacidad catalítica de una enzima, han sido
previamente descritos (Oue et al., 1999;
Shimotohno et al., 2001); y pueden resultar de
gran utilidad para el diseño de estrategias de
mutagénesis dirigida orientadas a modificar la
funcionalidad de la enzimas, debido a la
demostrada importancia funcional que tienen
también los residuos que no forman parte del
centro activo.
Actualmente se está llevando a cabo la
cristalización de la doble mutante S15L/M93V
para comprobar las hipótesis de mejora de
plegamiento propuestas. Asimismo, con la
estructura de la doble mutante obtendremos un
mayor conocimiento de XynB, que podría ser
utilizado para mejorar su potencial
biotecnológico.
3. A3. APLICACIÓNPLICACIÓN DEDE LASLAS XILANASASXILANASAS
ESTUDIADASESTUDIADAS ENEN ELEL BLANQUEOBLANQUEO DEDE LALA
PASTAPASTA DEDE PAPELPAPEL
En el anexo I del presente trabajo se recogen
los resultados obtenidos de la aplicación de las
xilanasas YnfF y XynA de Bacillus sp. BP-7, y
XynB de Paenibacillus barcinonensis, en
estudios de blanqueo de pasta de papel.
Los resultados papeleros mostrados ponen de
manifiesto la diferente efectividad de las
xilanasas microbianas en el blanqueo de pastas
de papel (Elegir et al., 1995; Vicuña et al.,
1995; Clarke et al., 1997). Así, mientras XynB
no produjo mejoras apreciables, la aplicación
de YnfF y sobre todo de XynA permitieron
obtener mejoras notables en la blancura del
papel.
Es de destacar que la xilanasa más eficiente,
XynA, pertenece a la familia 11, a la cual
también pertenecen la mayoría de las xilanasas
utilizadas a nivel industrial para el blanqueo
del papel.
Es también importante mencionar los buenos
resultados de la xilanasa YnfF en la
potenciación del blanqueo. Esta enzima
pertenece a la familia 5 de glicosil hidrolasas,
de la que no se han descrito ensayos papeleros
hasta el momento. Sin embargo, tal como se ha
descrito en este trabajo, se trata de una
xilanasa que únicamente presenta actividad
sobre xilanos desprovistos de arabinosa, lo que
puede resultar de importancia para el blanqueo
de pastas de maderas duras, como la de
166
eucalipto, que es la materia prima más
importante en la industria papelera española.
Actualmente se están llevando a cabo nuevos
ensayos para cuantificar la efectividad
potenciadora del blanqueo de XynA e YnfF en
nuevas secuencias ECF (elemental chlorine
free) y en secuencias TCF (total chlorine free).
Estos ensayos también pretenden determinar la
contribución de estas enzimas a la disminución
de la dosis de blanqueantes químicos
necesarios (especialmente derivados clorados)
y evaluar así la reducción en la generación de
AOX, altamente contaminantes.
En este sentido, sería también de interés la
utilización de la xilanasa doble mutante
XynB S15L/M93V en ensayos papeleros, para
comprobar si su aplicación a las pastas
papeleras a temperaturas más altas y durante
más tiempo, gracias a su aumentada
termoestabilidad, permite mejorar los
resultados obtenidos hasta el momento con la
xilanasa B salvaje.
CCONCLUSIONESONCLUSIONES
169
1.- Se han clonado e identificado 3 enzimas
degradadoras de xilano de la cepa
Bacillus sp. BP-7: XynA, YnfF y XynD.
2.- La xilanasa XynA de Bacillus sp. BP-7
presenta máxima actividad sobre xilano de
madera de haya. Es una enzima homóloga
a las xilanasas del subgrupo de pI alcalino
y bajo peso molecular de la familia 11.
3.- Los resultados del análisis de uso de
codón en XynA de Bacillus sp. BP-7
sugieren que la enzima, altamente
conservada en especies del género
Bacillus, posiblemente ha sido adquirida
por transferencia horizontal de genes entre
especies relacionadas de dicho género.
4.- Se ha conseguido diseñar un sistema
basado en la proteína Pir4 de
Saccharomyces cerevisiae para la
expresión y direccionamiento de la
xilanasa XynA de Bacillus sp. BP-7 a la
pared celular de levaduras o al medio de
extracelular, como primer paso hacia su
posible utilización biotecnológica en la
industria alimentaria.
5.- La xilanasa YnfF de Bacillus sp. BP-7 es
una de las pocas xilanasas descritas hasta
el momento en la familia 5 de glicosil
hidrolasas. YnfF presenta actividad sobre
xilanos con ramificaciones de ácido
metil glucurónico pero es inactiva sobre
xilanos con ramificaciones de arabinosa.
6.- La enzima XynD de Bacillus sp. BP-7
presenta alta homología con enzimas con
actividad xilanasa y arabinofuranosidasa
que se encuentran clasificadas en la
familia 43 de glicosil hidrolasas.
7.- La enzima XynB de Paenibacillus
barcinonensis es una xilanasa de la
familia 10 con elevada actividad sobre
xilanos y sobre aril-xilósidos.
8.- Se ha clonado y expresado la xilanasa
XynB de Paenibacillus barcinonensis en
cepas de Bacillus subtilis. La máxima
producción se ha obtenido con la cepa
recombinante B. subtilis
MW15/pRBSPO2X20, que contiene el
gen xynB bajo el control del promotor
SPO2.
9.- Los estudios de localización celular
indican que XynB de Paenibacillus
barcinonensis es un xilanasa intracelular.
Su detección en sobrenadantes de cultivos
viejos es debida a lisis celular y no a
auténtica secreción.
10.- La xilanasa XynB de Paenibacillus
barcinonensis junto con otras 6 xilanasas
altamente homólogas de la familia 10
forman un nuevo subgrupo de xilanasas
dentro de dicha familia. Las características
comunes de estas xilanasas son la
ausencia de péptido señal, y la presencia
de 2 secuencias conservadas, regiones A y
B, no presentes en el resto de xilanasas de
la familia 10.
11.- La estructura tridimensional de la
xilanasa B de Paenibacillus
barcinonensis, determinada por métodos
cristalográficos, es un barril (α/β)8, como
170
en el resto de las xilanasas de la familia
10. La hendidura catalítica muestra 4
subsitios de unión al sustrato claramente
definidos, y sugiere la existencia de 3
subsitios adicionales. Es importante la
presencia de una cavidad a nivel del
subsitio +2, que permitiría acomodar
sustituyentes laterales como ácido
metil glucurónico. También es de gran
importancia el bucle L7, que contiene la
región conservada B, para determinar la
conformación del centro activo de la
xilanasa.
12.- Mediante evolución dirigida se han
obtenido 4 mutantes termoestables de
XynB de Paenibacillus barcinonensis,
cada una de ellas con una de las siguientes
sustituciones: E137D, D323N, S15L y
M93V. Las variantes con las mutaciones
S15L y M93V presentan una vida media
claramente superior a la xilanasa salvaje.
13.- La combinación de las 2 mutaciones más
efectivas (S15L y M93V) en un doble
mutante S15L/M93V origina una xilanasa
con una vida media a 50 ºC incrementada
más de 20 veces respecto a la enzima
salvaje; hacho que se debería a un efecto
sinérgico de las mutaciones introducidas.
14.- Además de los aumentos en la
termoestabilidad de las xilanasas mutantes
se han conseguido también aumentos en la
eficiencia catalítica (KCAT/KM) de estas
enzimas.
15.- La aplicación en el blanqueo de pastas de
papel de las xilanasas YnfF y XynA de
Bacillus sp. BP-7 permite obtener mejoras
notables en la blancura del papel.
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PPUBLICACIONESUBLICACIONES
Los artículos publicados derivados del presente trabajo de investigación son:
Gallardo, O., Diaz, P. y Pastor, F.I. (2003) Characterization of a Paenibacillus
cell-associated xylanase with high activity on aryl-xylosides: a new subclass of family
10 xylanases. Applied Microbiology and Biotechnology 61 (3): 226-233.
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Appl Microbiol Biotechnol (2003) 61:226–233DOI 10.1007/s00253-003-1239-1
O R I G I N A L P A P E R
O. Gallardo · P. Diaz · F. I. J. Pastor
Characterization of a Paenibacillus cell-associated xylanasewith high activity on aryl-xylosides: a new subclassof family 10 xylanases
Received: 8 October 2002 / Revised: 13 December 2002 / Accepted: 16 December 2002 / Published online: 27 February 2003� Springer-Verlag 2003
Abstract The sequence of gene xynB encoding xylanaseB from Paenibacillus sp. BP-23 was determined. Itrevealed an open reading frame of 999 nucleotidesencoding a protein of 38,561 Da. The deduced aminoacid sequence of xylanase B shows that the N-terminalregion of the enzyme lacks the features of a signalpeptide. When the xylan-degrading system of Paenibacil-lus sp. BP-23 was analysed in zymograms, it revealed thatxylanase B was not secreted to the extracellular mediumbut instead remained cell-associated, even in late station-ary-phase cultures. When xynB was expressed in aBacillus subtilis secreting host, it also remained associ-ated with the cells. Sequence homology analysis showedthat xylanase B from Paenibacillus sp. BP-23 belongs tofamily 10 glycosyl hydrolases, exhibiting a distinctivehigh homology to six xylanases of this family. Thehomologous enzymes were also found to be devoid of asignal peptide and seem to constitute, together withxylanase B, a separate group of enzymes. They all havetwo conserved amino acid regions not found in the otherfamily 10 xylanases, and cluster in a separate group afterdendrogram analysis. We propose that these enzymesconstitute a new subclass of family 10 xylanases, that arecell-associated, and that hydrolyse the xylooligosaccha-rides resulting from extracellular xylan hydrolysis.Xylanase B shows similar specific activity on aryl-xylosides and xylans. This can be correlated to some, notyet identified, trait of catalytic activity of the enzyme onplant xylan.
Introduction
Biodegradation of xylan, an abundant plant polysaccha-ride, is a complex process that requires the coordinatedaction of several enzymes, among which xylanases (1,4-b-d-xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), cleaving internallinkages on the b-1,4-xylose backbone, play a key role.The complex chemical nature and heterogeneity of xylancan account for the multiplicity of xylanases produced bymicrooorganisms (Kulkarni et al. 1999). The activity ofdifferent xylanases with subtle differences in substratespecificity and mode of action should improve degrada-tion of plant xylan in natural habitats. Based on aminoacid sequence homologies and hydrophobic cluster anal-ysis, xylanases have been classified in two groups, family10 and family 11 (Gilkes et al. 1991; Henrissat andBairoch 1996). However, xylanases homologous to family5 b-glycanases have also been found (Keen et al. 1996).Although xylanases show remarkable differences insequence, only minor differences in catalytic activitybetween xylanases of the different families have beenreported (Biely et al. 1997). These differences have beenproposed to result from differences in the three-dimen-sional structure of their catalytic domains, which showgreater conformational flexibility in family 10 enzymes(Davies and Henrissat 1995). Several xylanases aresingle-domain enzymes, while other xylanases have amodular structure that, in addition to a catalytic domain,contains one or more cellulose-binding domains (Tommeet al. 1998). Recent identification of domains thatpromote specific binding to xylan or other carbohydrateshas prompted the term "carbohydrate-binding module" togroup domains that mediate substrate binding (Charnocket al. 2000).
Xylanases are secreted enzymes, released to theextracellular medium to enable contact with and cleavageof highly polymerized xylans. However, an intracellularxylanase has recently been described in Cellvibrio mixtus(Fontes et al. 2000). The enzyme is located in theperiplasm, where it is probably involved in the breakdownof large xylooligosaccharides and protected from extra-
O. Gallardo · P. Diaz · F. I. J. Pastor ())Department of Microbiology, Faculty of Biology,University of Barcelona,Avinguda Diagonal 645, 08028 Barcelona, Spaine-mail: [email protected].: +34-93-4034626Fax: +34-93-4034629
cellular proteases. A similar location of xylanase activityhas been reported in the rumen bacterium Prevotellaruminicola (Miyazaki et al. 1997).
The strain Paenibacillus sp. BP-23, previously termedBacillus sp. BP-23, secretes into the extracellular media aset of xylanases, several of which have been characterized(Blanco and Pastor 1993; Blanco et al. 1995, 1999). Inthis article we describe the characterization of xylanase Bfrom this strain, which has been cloned in Escherichiacoli (Blanco et al. 1996). Xylanase B does not exhibit asignal peptide for its secretion outside the cytoplasm andshows activity on both xylans and aryl-xylosides. The roleof the enzyme in plant xylan biodegradation is discussed.
Materials and methods
Bacterial strains and plasmids
Paenibacillus sp. strain BP-23 was grown as described previously(Blanco and Pastor 1993). E. coli-pX20 and E. coli-pX60,described previously (Blanco et al. 1996), are recombinant strainscontaining xynB. Bacillus subtilis MW15 has been describedelsewhere (Wolf et al. 1995). Plasmid pRB473 is a shuttle vectorfor E. coli and B. subtilis (Br�ckner 1992). The SPO2 promoter wasamplified by PCR from plasmid pPL608 (Schoner et al. 1983) andinserted between XbaI and BamHI sites of plasmid pRB473polylinker. The resultant plasmid was named pRBSPO. Thestructural part of xynB was amplified by PCR from pX60, andinserted between SacI and SmaI sites of pRBSPO, downstream ofthe SPO2 promoter. The resultant plasmid was named pRB-SPOX20.
Nucleic acid manipulations
Plasmid DNA was purified by the alkaline lysis procedure(Sambrook et al. 1989) or by chromatography (QIAGEN-tip 100MidiPrep, Promega). PCR amplification was performed with PfuDNA polymerase (Stratagene). Restriction nucleases and ligasewere purchased from Boehringer Mannheim. E. coli was trans-formed as described by Sambrook et al. (1989). Protoplasts from B.subtilis were transformed as described by Cohen and Chang (1979).The sequence of both strands of xynB and SPO2 promoter wasdetermined by automated fluorescence sequencing with an ABIPRISM dye terminator cycle sequencing ready reaction mix (PerkinElmer) in a 377 Perkin Elmer DNA sequencer.
Enzyme assays
Cultures from Paenibacillus sp. BP-23, B. subtilis MW15/pRB-SPOX20, E. coli-pX20 or E. coli-pX60 were centrifuged andsupernatants and pellets separated. Cells were disrupted bysonication and enzyme activity of cell extracts and supernatantswas evaluated. To isolate the cytoplasmic fraction, cell extractswere centrifuged at 8,000 g for 10 min and supernatants werecollected and centrifuged at 38,000 g for 60 min. Supernatants fromthe last centrifugation were kept as cytoplasmic fraction whilepellets were resuspended in buffer and kept as membrane fraction.Xylanase activity was assayed by measuring the amount ofreducing sugars released from xylans using the method of Nelsonand Somogyi (Spiro 1966). The xylans tested as substrates werebirchwood, oat spelt and beechwood xylan, methylglucuronoxylan(Sigma Chemical), and rye or wheat arabinoxylan (Megazyme).The assay mixture contained 0.5% xylan in a final volume of 0.1 mlof 50 mM acetate buffer pH 5.5. The mixture was incubated at40�C for 15 min. Colour development was measured at 520 nm. To
study the activity on aryl-glycosides, the enzyme was incubatedwith substrate for 5 min at 40�C in a final volume of 0.25 ml of100 mM acetate buffer pH 5.5. Substrate concentration was 0.5%for p-nitrophenyl-b-d-xylopyranoside or o-nitrophenyl-b-d-xylopy-ranoside; and 0.1% for p-nitrophenyl-b-d-glucopyranoside, p-nitrophenyl-b-cellobioside, p-nitrophenyl-b-cellotrioside, p-nitro-phenyl-b-cellotetraoside, p-nitrophenyl-b-cellopentaoside, p-nitro-phenyl-a-l-arabinofuranoside or p-nitrophenyl-a-l-arabinopy-ranoside (Sigma Chemical). The reaction was stopped by theaddition of 1 ml of 1 M Na2CO3 and colour development wasmeasured at 400 nm. One unit of enzymatic activity was defined asthe amount of enzyme that released 1 �mol of reducing sugarequivalent, p-nitrophenol or o-nitrophenol per minute under theassay conditions described.
Gel electrophoresis and zymograms
Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed in 12% gels, essentially as described byLaemmli (1970). Native gel electrophoresis was performed in 8%polyacrylamide gels according to Hames and Rickwood (1981). Forthe detection of xylanase activity, 0.2% birchwood xylan wasincluded in native gels before polymerization. Samples were heatedfor 10 min at 50�C in sample buffer before being applied to gels.After electrophoresis, gels were washed in 50 mM phosphatebuffer, pH 7.0, for 30 min, and incubated at 37�C for 30 min in thesame buffer. Gels were then stained with 0.1% Congo Red for15 min and washed with 1 M NaCl until xylanase bands becamevisible. Gels were then immersed in 5% (v/v) acetic acid andphotographed.
N-terminal sequencing of xylanase B
Xylanase protein bands were separated in SDS-PAGE gels andtransferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes asdescribed (Packman 1993). N-terminal sequencing was determinedby automated Sanger degradation in a Beckman LF3000 sequencer.
Nucleotide sequence accession number
The DNA sequence of the xynB gene was deposited at the EMBLdatabase under accession number AJ006646.
Results
Substrate specificity of xylanase Bfrom Paenibacillus sp. BP-23
Recombinant E. coli-pX60, harbouring the xylanase Bencoding gene, was isolated previously from a genelibrary made from Paenibacillus sp. BP-23 (Blanco et al.1996). The enzymatic activity of cell extracts from E.coli-pX60 on xylans having a different extent of arabinoseand methylglucuronic substitution, and on nitrophenolderivatives of xylose, arabinose, glucose and cel-looligosaccharides, was evaluated (Table 1). Xylanase Bshowed similar specific activity on all tested xylans,irrespective of the extent of substitution. The enzyme alsoshowed activity on most aryl-glycosides tested. Interest-ingly, the specific activity on pNP-b-xyloside and oNP-b-xyloside was similar to that found on xylans. The highactivity on aryl-xylosides could indicate that the enzymewas a b-xylosidase. However, previous results had shown
227
that although the enzyme was active on xylotetraose andxylotriose, it did not hydrolyse xylobiose (Blanco et al.1996), clearly indicating that XynB is a xylanase. Thehigh activity found on aryl xylosides could be the result oftransferase activity of xylanase B, as shown from theanalysis of XynB hydrolysis products from xylotetraose(Blanco et al. 1996).
Genetic characterization of xynB
The sequence of the 1,219-bp DNA fragment fromPaenibacillus sp. BP-23 contained in pX60 was deter-mined and submitted to the EMBL nucleotide sequencedatabase under accession number AJ006646. It containsan open reading frame of 999 nucleotides that encodes aprotein of 332 amino acids with a predicted molecularmass of 38,561 Da. This size is in agreement with that ofrecombinant xylanase B produced in E. coli (40 kDa), asdetermined from SDS-PAGE gels (Fig. 1). Seven nucle-otides upstream of the ATG start codon there is anAGGAGG sequence, resembling that of a ribosome-binding site (Shine-Dalgarno).
Analysis of the deduced amino acid sequence of XynBshows that the enzyme has an N-terminal region that lacksthe features of a signal peptide (Nagarajan 1993) (Fig. 2).A stretch of 25–30 amino acids, containing a hydrophobiccore preceded by a few positively charged residues andfollowed by a sequence recognized by bacterial signalpeptidases (Tjalsma et al. 1997) is not found in Paeni-bacillus sp. BP-23 XynB. The absence of a signal peptidein XynB was confirmed by SignalP and PSORT computeranalysis programs for the identification of signal peptides(Nakai and Kanehisa 1992; Nielsen et al. 1999).
Cellular location of XynB from Paenibacillus sp. BP-23
Paenibacillus sp. BP-23 was cultured in nutrient brothsupplemented with birchwood xylan. High xylanase
activity was detected in culture supernatants from thebeginning of the stationary phase, reaching a maximumafter 2 days of culture. This activity corresponds to the setof secreted xylanases previously described in the strain(Blanco and Pastor 1993; Blanco et al. 1995, 1999).Activity was also found in cell extracts, although itrepresented only a small percentage of total activity (6%in samples from late stationary-phase cultures).
To analyse the location of xylanase B, cell extracts andextracellular fractions from early or late stationary-phasecultures from Paenibacillus sp. BP-23 were analysed bygel electrophoresis and zymograms. As XynB wasirreversibly inactivated by SDS, native gels were usedfor the zymographic analysis. Paenibacillus sp. BP-23culture supernatants showed several xylanase activitybands: a well defined prominent band, corresponding tothe previously characterized xylanase C (Blanco et al.1999), and a broad and diffuse band that extended up tothe upper limit of the gel, probably the result of
Fig. 1 SDS-PAGE analysis of cell-associated and extracellularfractions from Bacillus subtilis MW15/pRBSPOX20. Bacillussubtilis MW15/pRBSPOX20, carrying xynB, and control B. subtilisMW15/pRBSPO were grown on nutrient broth supplemented with0.2% birchwood xylan. Samples were taken after 3 days ofincubation, fractionated into cell extracts and supernatants andanalysed by SDS-PAGE. Lane 1, cell extracts from Escherichiacoli-pBR322. Lane 2, cell extracts from E. coli-pX20, carryingxynB. Lane 3, concentrated supernatants from B. subtilis MW15/pRBSPOX20. Lane 4, concentrated supernatants from B. subtilisMW15/pRBSPO. Lane 5, cell extracts from B. subtilis MW15/pRBSPOX20. Lane 6, cell extracts from B. subtilis MW15/pRBSPO. The positions of molecular weight markers are indicated
Fig. 2 N-Terminal sequence of xylanase B. The sequence of the 50amino acids from the N-terminus of xylanase B, and thecorresponding DNA encoding sequence is shown. The nucleotidesequence resembling a ribosome binding site is underlined
Table 1 Substrate specificity of xylanase B
Substrate Specific activity(U/mg)·10�3
Birchwood xylan 232.8Oat spelt xylan 213.1Beechwood xylan 248.7Methylglucuronoxylan 192.8Rye arabinoxylan 224.4Wheat arabinoxylan 265.4p-Nitrophenyl b-xylopyranoside 286.1o-Nitrophenyl b-xylopyranoside 550.3p-Nitrophenyl b-glucopyranoside 0.6p-Nitrophenyl b-cellobioside 41.5p-Nitrophenyl b-cellotrioside 42.5p-Nitrophenyl b-cellotetraoside 42.1p-Nitrophenyl b-cellopentaoside 31.4p-Nitrophenyl a-arabinopyranoside 26.4p-Nitrophenyl a-arabinofuranoside 0.8
228
coalescence of less well defined bands (Fig. 3). Theactivity bands detected showed different mobility to thatof xylanase B from recombinant E. coli-pX20 cells, usedas a control. The extracellular xylanase profile wascompletely different from the zymographic pattern found
for the cell-associated xylanases. Cell extracts fromPaenibacillus sp. BP-23 showed a single xylanase bandwith identical mobility to that of recombinant xylanase B,while no other significant activity bands were detected.The results indicate that xylanase B is not secreted to themedium, but instead, remains cell-associated, even in latestationary-phase cultures. Cell extracts were centrifugedto separate membranes from the soluble fraction andxylanase activity was evaluated. The soluble fractionshowed 97% of the activity associated to cells, indicatingthat xylanase B is located in the cytoplasm of Paeni-bacillus sp. BP-23.
Cloning of xylanase B in B. subtilis
Xylanase B was cloned and expressed in B. subtilisMW15 (Wolf et al. 1995), which is devoid of backgroundxylanase activity. Cultures of recombinant B. subtilisMW15/pRBSPOX20, harbouring xynB, produced xy-lanase that initially remained cell-associated. However,in late stationary-phase cultures (3 days), around 40% oftotal activity was found at the supernatants, probably as aresult of cell lysis.
The cellular location of xylanase B in B. subtilisMW15/pRBSPOX20 was also examined by SDS-PAGE.Cell extracts and supernatants from 3-day-old culturesshowed a 40 kDa protein band, corresponding to xylanaseB, not found in control B. subtilis MW15/pRBSPOcultures (Fig. 1). It is noteworthy that the enzymedetected in the two locations showed identical mobility,
Fig. 3 Zymographic analysis of cell-associated and secreted xy-lanases from Paenibacillus sp. BP-23. Paenibacillus sp. BP-23 wascultivated on 0.2% birchwood xylan-supplemented nutrient broth.Samples were taken after 17 h of incubation (early stationary phase)or after 72 h (late stationary phase), fractionated in cell extracts andsupernatants, and analysed by native gel electrophoresis andzymograms. Lanes: 1, concentrated supernatants from 17 hcultures; 2, cell extracts from 17 h cultures; 3, concentratedsupernatants from 72 h cultures; 4, cell extracts from 72 h cultures.Lane 5, control cell extracts from E coli-pX20 carrying xynB. Lane6, control cell extracts from E- coli-pX31 carrying xynC. Arrowsindicate the activity bands corresponding to XynB and XynC
Fig. 4 Amino acid alignment of family 10 xylanases. Alignment ofthe amino acid sequences flanking the conserved regions V and VIof family 10 xylanases was performed using the ClustalW program.The xylanases aligned are the 14 enzymes having the highesthomology to xylanase B from Paenibacillus sp. BP-23, accordingto Blast analysis of sequences from the Swissprot and EMBLdatabases. The sequences shown are: Caldicellulosiruptor sp.Tok7B.1 XynA (CspXynA), Dictyoglomus thermophilum XynA(DthXynA), Caldicellulosiruptor sp XynC (CspXynC), Caldicel-lulosiruptor saccharolyticus XynE (CsaXynE), Anaerocellum ther-mophilum XynA (AthXynA), Caldibacillus cellulovorans XynA(CceXynA), Caldicellulosiruptor sp. XynB (CspXynB), Aeromo-nas punctata XynA (ApuXynX), Paenibacillus sp. BP-23 XynB
(PspXynB), Bacillus stearothermophilus T-6 XynA2 (BstXynA),Bacillus stearothermophilus 21 Xyn2 (BstXyn2), Thermobacillusxylanilyticus XynA (TxyXynA), Bacillus sp. N137 XyaA(BspXyaA) and Caldicellulosiruptor saccharolyticus XynA(CsaXynA); accession numbers: AF078737, Q12603, T31085,T30910, Z69782, AF200304, T31082, AB015980, AJ006646,AF098273, P45703, Y16849, I40356 and P23556, respectively.Numbering of the amino acids starts at the N-termini of theproteins. Gaps are indicated by dashes. Amino acids identical in atleast seven of the sequences aligned are shown in shadowed boxes.Regions a and b, of conserved amino acids in xylanases from thesignal peptide-less group, are underlined
229
suggesting the lack of processing of the xylanase found inextracellular media. To confirm this, the N-terminalsequence of xylanase B from supernatants and cellextracts from B. subtilis MW15/pRBSPOX20, and alsofrom cell extracts from E coli-pX20, was determined.Each of the three samples had the N-terminal sequenceSTEIPSLSAS, deduced from xynB (Fig. 2).
Homology of xylanase B to enzymes from family 10
The deduced amino acid sequence of XynB was com-pared to enzyme sequences contained in the Swissprotand EMBL databases. Alignment by BLASTP (Altschulet al. 1997) showed that xylanase B is a single-domainenzyme with homology to xylanases of family 10glycosyl hydrolases. The highest homology was foundto six of these enzymes: XynX from Aeromonas punctata(Usui et al. 1999), XynA2 from Bacillus stearother-mophilus T-6 (Shulami et al. 1999), XyaA from Bacillussp. N137 (Tabernero et al. 1995), Xyn2 from B.
stearothermophilus 21 (Baba et al. 1994), XynA fromThermobacillus xylanilyticus (Connerton et al. 1999), andXynA from Caldicellulosiruptor saccharolyticus (L�thi etal. 1990), which showed 85, 57, 55, 55, 54 and 52%identity to XynB from Paenibacillus sp. BP-23, respec-tively (Fig. 4). Analysis of the deduced amino acidsequences of these enzymes showed that, like xylanase B,they do not show an N-terminal region with the featuresof a signal peptide. This was verified by SignalP andPSORT programs analysis for the identification of leaderpeptides. Xylanases of family 10 show eight conservedregions (Baba et al. 1994; Fukumura et al. 1995),including the conserved sequences WDVVNE (regionIII) and TELD (region VI) containing the two Gluresidues, Glu-134 and Glu-241 in the case of XynB,proposed to be the catalytic acid-base and nucleophileresidues in family 10 xylanases (Harris et al. 1994;Dominguez et al. 1995). Alignment of XynB fromPaenibacillus sp. BP-23 with the six signal peptide-lessxylanases allowed the identification of two additionalconserved regions, flanking region VI. The regions show
Fig. 5 Dendrogram of xylanases of family 10 based on amino acidsequence homology. The dendrogram was generated with ClustalX.The xylanases compared are the 14 enzymes with the highesthomology to XynB from Paenibacillus sp. BP-23, according to
Blast analysis, and those enzymes quoted by Baba et al. (1994) andFukumura et al. (1995) in the identification of conserved regions infamily 10 xylanases. The arrow indicates the group of sevenxylanases from the signal peptide-less group
230
the amino acid sequences AIE_YASL (region a) andRTDL__PT_EM (region b), and are not found in otherxylanases from family 10. Our results indicate that XynBfrom Paenibacillus sp. BP-23 and six family 10 xylanasesconstitute a distinctive group of highly homologousenzymes that do not exhibit a signal peptide sequence.A dendrogram of 28 xylanases of family 10 was generatedwith the ClustalX program (Thompson et al. 1997)(Fig. 5). This showed that xylanase B, together with thexylanases from the signal peptide-less group, clusterseparately from the rest of the enzymes of family 10. Theidentified group probably constitutes a new type ofxylanase with some specific action in the degradation ofplant xylan.
Discussion
Paenibacillus sp. BP-23 has a complex xylanolyticsystem with multiple xylanases (Blanco and Pastor1993), three of which (xylanases A, B and C) have beencharacterized (see Blanco et al. 1995, 1999; this article).This multiplicity of xylanases is similar to that found inother microorganisms (Wong and Saddler 1992; Kulkarniet al. 1999), where the cooperation of different xylanaseswith distinctive action on xylan is assumed to favourdegradation of the polymer. Xylanase B from Paeni-bacillus sp. BP-23 shows similar activity on xylans ofdifferent rate of arabinose or methylglucuronic substitu-tion. Similarly to other xylanases from family 10 (Biely etal. 1997), the characterized enzyme does not require along stretch of unsubstituted xylose residues for thecleavage of xylan.
Xylanase B from Paenibacillus sp. BP-23 seems to bean intracellular enzyme. Several pieces of evidencesupport this assumption. First, the enzyme does not showa signal peptide. In accord with this, xylanase B was notsecreted to the extracellular media by Paenibacillus sp.BP-23, but remained cell-associated, in the solublefraction. Additionally, when xynB was overexpressed inB. subtilis, the enzyme was mainly cell-associated.
Xylanases are usually secreted to the extracellularmedium and accordingly, have a signal peptide. However,XynB from Paenibacillus sp. BP-23 is a cell-associatedenzyme without a signal peptide. To our knowledge this isthe first example of a xylanase with these traits. Threeother xylanases without signal peptide have been reportedup to date, although no experimental evidence of theirlocation has been provided. These enzymes are: XynXfrom Aeromonas punctata, XynA2 from Bacillusstearothermophilus T6 and XyaA from Bacillus sp. strainN137 (Usui et al. 1999; Shulami et al. 1999; Tabernero etal. 1995). These enzymes have been proposed to beintracellular or, alternatively, secreted to the extracellularmedium by a signal peptide-independent mechanism,similar to ABC exporter systems described in Gram-negative bacteria (Binet et al. 1997). A region of the B.subtilis chromosome has been found to contain sequenceshomologous to ABC transporter genes (Yamamoto et al.
1996). However, the significance of this region forsecretion of proteins in B. subtilis remains to beestablished.
Analysis of sequence homology shows that xylanase Bfrom Paenibacillus sp. BP-23 belongs to family 10glycosyl hydrolases and exhibits a distinctive higherhomology to six xylanases of this family: the threexylanases without a signal peptide mentioned above andXyn2 from Bacillus stearothermophilus 21 (Baba et al.1994), XynA from Thermobacillus xylanilyticus (Con-nerton et al. 1999), and XynA from Caldicellulosiruptorsaccharolyticus (L�thi et al. 1990). These three latterenzymes have also been shown after computer analysis tobe devoid of signal peptides. Xylanase B from Paeni-bacillus sp. BP-23 and the six signal peptide-lessxylanases cluster separately from the rest of the family10 xylanases and seem to constitute a separate group ofenzymes. Additionally, they show as a distinctive featurethe conserved amino acid stretches AIE_YASL andRTDL__PT_EM, flanking region VI of family 10xylanases. The 3-D structure of xylanase B, predictedby the Swiss pdbViewer program (Guex and Peitsch1997), is an (a/b)8 barrel, similar to family 10 enzymes.Interestingly, the conserved stretch RTDL__PT_EM foldsas a random loop located in close proximity to thesubstrate-binding cleft. This suggests that the residues inthis region can play a role in the catalytic properties ofxylanase B. Analysis of domains by the ProDom program(Corpet et al. 2000) showed that xylanase B contains adomain of 41 amino acids (ID: 277407) found exclusivelyin the seven xylanases of the signal peptide-less group.This domain contains the conserved stretchRTDL__PT_EM and is located between regions VI andVII of family 10 xylanases. This makes the spacingbetween these conserved regions in xylanase B unusuallylong.
Our data suggest that xylanase B, together with the sixsignal peptide-less xylanases, form a new subclass offamily 10 xylanases of intracellular location. A cytoplas-mic location would be in agreement with the fact that allthese xylanases are single-domain enzymes withoutmodules that mediate binding to insoluble substrates.These xylanases probably hydrolyse short xylooligosac-charides, resulting from extracellular xylan hydrolysis,once they have been transported inside cells. Recently, aperiplasmic xylanase (XylC) has been characterized inCellvibrio mixtus (Fontes et al. 2000). The xylanaseshows a typical signal peptide (Fontes et al. 2000) anddoes not show homology or clustering with the group ofsignal peptide-less xylanases described in this paper.
The group of xylanases proposed here may differ fromextracellular xylanases in substrate specificity by somesubtle, not yet identified, traits. One of these could behigh activity on pNP-b-xyloside, which can suggest anexo-type of catalytic activity. Although the occurrence oftrue exoxylanases remains to be elucidated, this type ofmechanism has been proposed for xylanases fromPrevotella ruminicola and Aeromonas caviae (Gasparicet al. 1995; Kubata et al. 1994). Our results indicate that
231
xylanase B belongs to a new group of xylanases, bearingunusual features probably related to some specific, not yetidentified, function in degradation of plant xylan. Thebiotechnological applications of this new subclass ofxylanases have not yet been evaluated, but their distinc-tive properties make them good candidates for thespecific modification of xylan-containing substrates.
Acknowledgements We thank Monika Wolf for her gift ofbacterial strain Bacillus subtilis MW15 and Gaspar P�rez-Gonz�lezfor his gift of plasmid pRB473. We also thank Serveis Cient�fico-Tcnics of the University of Barcelona for their support innucleotide sequencing, Servei de Protemica i Bioinform�tica ofUniversitat Autnoma de Barcelona for the N-terminal sequencingof XynB and Margarita Soriano for technical aid in the constructionof pRBSPO. This work was partially supported by the SpanishMinistry of Science and Technology (CICYT), project ref.PPQ2000-0091-P4-04, and the Generalitat de Catalunya (III Plade Recerca, project. ref. 2001SGR 00143) and Centre de Refernciaen Biotecnologia (CerBa). Oscar Gallardo held a FI grant fromGeneralitat de Catalunya.
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Cloning and Characterization of Xylanase A from the StrainBacillussp. BP-7: Comparison with Alkaline pI-Low Molecular WeightXylanases of Family 11
Oscar Gallardo, Pilar Diaz, F.I. Javier Pastor
Departament de Microbiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Avinguda Diagonal 645, 08028 Barcelona, Spain
Received: 16 July 2003 / Accepted: 15 August 2003
Abstract. ThexynA gene encoding a xylanase from the recently isolatedBacillus sp. strain BP-7 has beencloned and expressed inEscherichia coli. Recombinant xylanase A showed high activity on xylans fromhardwoods and cereals, and exhibited maximum activity at pH 6 and 60°C. The enzyme remained stableafter incubation at 50°C and pH 7 for 3 h, and it was strongly inhibited by Mn2�, Fe3�, Pb2�, and Hg2�.Analysis of xylanase A in zymograms showed an apparent molecular size of 24 kDa and a pI of above9. The amino acid sequence of xylanase A, as deduced fromxynA gene, shows homology to alkalinepI-low molecular weight xylanases of family 11 such as XynA fromBacillus subtilis. Analysis of codonusage inxynA from Bacillus sp. BP-7 shows that the G�C content at the first and second codon positionsis notably different from the mean values found for glycosyl hydrolase genes fromBacillus subtilis.
Biodegradation of xylan, a major component of plant cellwalls, is a complex process that requires the coordinateaction of several enzymes, among which xylanases (1,4-�-D-xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), cleaving inter-nal linkages on the�-1,4-xylose backbone, play a keyrole. Based on amino acid sequence homologies andhydrophobic cluster analysis, xylanases have been clas-sified in two groups, family 10 and family 11 [7, 9].However, xylanases homologous to family 5�-gly-canases have also been found [10]. The complex chem-ical nature and heterogeneity of xylan can account for themultiplicity of xylanases produced by microorganisms[11]. Members of the genusBacillus produce many dif-ferent xylanases, several of which have been cloned andcharacterized [2, 8, 14]. The activity of different xyla-nases with subtle differences in substrate specificity andmode of action should improve degradation of plantxylan in natural habitats.
The alkali-tolerant strainBacillus sp. BP-7 secreteshigh xylanase activity in media supplemented with xy-lose and shows a complex xylanolytic system [13]. Inthis article we describe the cloning and sequencing of the
gene encoding xylanase A fromBacillus sp. BP-7, andthe characterization of the enzyme.
Materials and Methods
Nucleic acids manipulation. Plasmid DNA was purified by the alka-line lysis procedure [16] or by chromatography (QIAGEN-tip 100MidiPrep, Promega). Restriction nucleases and ligase were purchasedfrom Boehringer Mannheim.Escherichia coli XL1-Blue was trans-formed as described [16]. The sequences of both strands ofxynA,contained in plasmid pXA30, were determined by automated fluores-cence sequencing with an ABI PRISM dye terminator cycle sequencingready reaction mix (Perkin Elmer) in a 377 Perkin Elmer DNA se-quencer. Sequence homology was analyzed through BLAST [1].
Enzyme assays. Escherichia coli/pXA30 was grown on ampicillinsupplemented LB broth at 37°C for 16 h, and cells were collected anddisrupted by sonication. Xylanase activity on cell extracts was assayedas described [5]. The assay mixture contained 0.5% (wt/vol) xylan,pNP-�-xyloside,oNP-�-xyloside,pNP-�-glucopyranoside,pNP-�-ar-abinofuranoside orpNP-�-arabinopyranoside (Sigma Chemical Co.) ina final volume of 0.1–0.25 mL of 50 mM Tris-HCl buffer pH 6. Themixture was incubated at 60°C for 15 min. Color development wasmeasured at 520 nm for xylans and 400 nm foroNP andpNP deriva-tives. One unit of enzymatic activity was defined as the amount ofenzyme that releases 1�mol of reducing sugar equivalent,p-nitrophe-nol or o-nitrophenol per minute under the assay conditions described.
Gel electrophoresis and zymograms. Sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed in 12%gels essentially as described by Laemmli [12]. For detection of xyla-Correspondence to: F.I.J. Pastor;email: [email protected]
CURRENT MICROBIOLOGY Vol. 48 (2004), pp. 276–279DOI: 10.1007/s00284-003-4196-0 Current
MicrobiologyAn International Journal© Springer-Verlag New York LLC 2004
nase activity, 0.2% (wt/vol) birchwood xylan was included in the gelsbefore polymerization. Samples were heated for 10 min at 45°C insample buffer before being applied to gels. After electrophoresis, gelswere soaked in 2.5% (wt/vol) Triton X-100 for 30 min, washed in 50mM phosphate buffer pH 7 for 30 min, and incubated at 37°C for 15min in the same buffer. Gels were stained with 0.1% (wt/vol) Congored for 15 min and washed with 1 M NaCl until xylanase bands becamevisible. Gels were then immersed in 5% (wt/vol) acetic acid, in whichthe background turned dark blue, and photographed.
Isoelectric focusing (IEF) was performed with a Pharmacia Phast-System unit. Gels with a pH range from 3.0 to 9.0 (Amersham Phar-macia Biotech AB) were used. After electrophoresis, gels were overlaidwith 1% agarose gels containing 0.5% (wt/vol) birchwood xylan,incubated for 45 min at 37°C, stained with Congo red, and washed withNaCl.
Nucleotide sequence accession number. The DNA sequence of xynAgene was submitted to the EMBL database under accession numberAJ536759.
Results and Discussion
Cloning of xylanase A encoding gene. A gene libraryfrom Bacillus sp. BP-7, previously constructed in Es-cherichia coli [15], was screened for xylanase activity onagar LB plates containing 0.1% (wt/vol) Remazol Bril-liant Blue R-D-Xylan. Six clones out of the 4500 testedshowed clear halos around the bacterial growth and wereselected. Four of these clones carried recombinant plas-mids with different inserts that contained a commonDNA segment of 3.8 kb. The smallest of these plasmidswas digested with HindIII, and fragments were insertedin pUC19. After transformation in Escherichia coli, aclone harboring plasmid pXA30, containing a 1.6 kbDNA insert and expressing xylanase activity, was chosenfor further experiments.
Properties of the enzyme. The activity of the enzymeproduced by the recombinant clone was tested on severalpolysaccharides. Cells from E. coli/pXA30 cultures weredisrupted by sonication, and the lysates obtained wereassayed for activity. High hydrolytic activity was foundon most xylans tested, showing the maximum value onbeechwood xylan, while activity on highly arabinose-substituted xylan from rye was considerably lower (Ta-ble 1). Cloned enzyme showed very low activity onpNP-xyloside and other aryl-glycosides tested. Activitywas not detected on carboxymethyl cellulose or Avicel,and no significant activity was found on other polysac-charides. The results obtained indicate the cloned en-zyme is an endoxylanase. We call the enzyme XynA.
The effects of pH and temperature on the activity ofxylanase A were determined. Optimum conditions foractivity were 60°C and pH 6. The enzyme was highlyactive in a wide range of pH, showing more than 50% ofmaximum xylanase activity in the pH range from 4.5 to8.5 (Fig. 1). Thermostability assays indicated that the
enzyme remained stable at 50°C and pH 7 for at least 3 h(Fig. 1). However, at 60°C, the enzyme lost 78% of itsactivity after 15 min incubation. The effect of differentmetal ions at a concentration of 10 mM on xylanase Aactivity was also determined. The enzyme was com-pletely inhibited by Mn2�, while strong inhibition wascaused by Fe3�, Pb2�, and Hg2� (3.0, 12.9, and 22.4%residual activity, respectively). Little inhibition wascaused by Cu2�, Zn2�, Ni2�, Ag2�, Co2�, and Ca2�.Mg2� did not affect enzyme activity, while Ba2� pro-duced a small stimulating effect.
The gene product contained in pXA30 was charac-terized by SDS-PAGE and zymographic analysis. Anintense and well-defined xylanase activity band, showingan apparent molecular weight of 24 kDa, was found inzymograms from E. coli/pXA30 (Fig. 2). The xylanaseband was not detected in extracts from control cells fromE. coli/pUC19. Analysis of the recombinant enzyme inisoelectric focusing gels and zymograms showed aunique and prominent activity band in the upper pH limitof the gel, indicating xylanase A has a pI of 9.0 or higher(Fig. 2).
Analysis of xylanase coding sequence. The nucleotidesequence of the 1394 bp DNA insert of pXA30 wasdetermined. It contained an open reading frame of 639 bpencoding a protein of 213 amino acids with deducedmolecular weight and isoelectric point of 23,475 Da and9.28, respectively, in agreement with results from zymo-graphic analysis. Alignment of the deduced amino acidsequence of xynA to �-glycanase sequences contained in
Table 1. Substrate specificity of crude xylanase A
SubstrateSpecific activity
(U/mg)a
Birchwood xylan 0.182Beechwood xylan 0.207Methylglucuronoxylan 0.139Oat spelt xylan 0.145Wheat arabinoxylan 0.164Rye arabinoxylan 0.054Carboxymethyl cellulose NDAvicel NDLaminarin NDLichenan 0.003Polygalacturonate NDPectin 0.003Starch 0.003pNPX 0.001oNPX 0.001pNPG 0.001pNPAp 0.001pNPAf 0.002
a ND, not detected.
O. Gallardo et al.: Xylanase A from Bacillus sp. BP-7 277
Swissprot and EMBL databases showed that xylanase Afrom Bacillus sp. BP-7 is a single domain enzyme withhomology to xylanases of family 11. The cloned enzymeseems to belong to the type of “alkaline pI-low molecularweight xylanases” , that was proposed to constitute thecore group of family 11 glycanases, and that seems to beubiquitous among Bacillus species [17]. However, thistype of xylanase is differently conserved among thedifferent isolates and species of the genus. In this way,xylanase A from Bacillus sp. BP-7 shows 92% identitywith the low-molecular-weight xylanases from B. subtilis[14], B. circulans [18], and Bacillus sp. YA-14 [19],while the identity found with XynA from B. stearother-mophilus [3], XynN from B. halodurans [EMBL acces-sion number AY170624], XynA from B. pumilus [4], and
XynA from B. agaradhaerens [EMBL accession numberA68006] was only 78, 75, 46, and 45%, respectively.
A recent report on codon usage in glycosyl hydro-lases shows that the G�C content at the first and secondcodon positions of xynA from B. subtilis (38.3 and52.8%, respectively) differs widely from the averageG�C content at the same codon positions of glycosylhydrolase genes of this microorganism (51.7 and 37.7%,respectively) [6]. Similar results have been found forxynA from B. circulans, suggesting that these genes havebeen acquired by horizontal gene transfer, through trans-duction mediated by prophage 6, probably from an ac-tynomycetes-related organism. Interestingly, the G�Ccontent values at the first and second codon positions ofxynA from Bacillus BP-7 (38.2 and 52.1%, respectively),are similar to those found in B. subtilis xynA. The resultsfound suggest that the cloned xylanase corresponds to ahighly conserved enzyme that has probably been ac-quired by Bacillus sp. BP-7 by horizontal gene transferfrom a related Bacillus strain.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Serveis Cientıfico-Tecnics of the University of Barcelona fortheir support in nucleotide sequencing. This work was partially sup-ported by the Spanish Ministery of Science and Technology (CICYT),project ref. PPQ2000-0091-P4-04; the Generalitat de Catalunya (III Plade Recerca, project. ref. 2001SGR 00143); and Centre de Referencia enBiotecnologia (CeRBa). Oscar Gallardo held an FI grant from theGeneralitat de Catalunya.
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Fig. 1. Effect of pH and temperature on xylanase Aactivity. (A) Effect of pH on activity of XynA. (B)Thermal stability of XynA at pH 7 and 50°C (F),55°C (E), or 60°C (}).
Fig. 2. Electrophoretic analysis of xylanase A. (A) Coomassie Blue-stained SDS polyacrylamide gel. (B) Zymogram of an SDS polyacryl-amide gel. (C) Zymogram of an isoelectric focusing gel. Lanes 1:Control cell extracts from Escherichia coli/pUC19; lanes 2: cell ex-tracts from Escherichia coli/pXA30. The positions of molecular weightstandards and of pI markers are indicated.
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O. Gallardo et al.: Xylanase A from Bacillus sp. BP-7 279
Use of the Cell Wall Protein Pir4as a Fusion Partner for the Expressionof Bacillus sp. BP-7 Xylanase A inSaccharomyces cerevisiae
Isabel Andres,1 Oscar Gallardo,2 Palma Parascandola,3
F.I. Javier Pastor,2 Jesus Zueco1
1Unidad de Microbiologıa, Facultad de Farmacia, Univ. De Valencia,Avda. Vicente Andres Estelles s/n. 46100-Burjassot (Valencia), Spain;telephone: 34-963543605; fax: 34-963544299;e-mail: [email protected]. Microbiologia, Fac. Biologıa, Univ. Barcelona, Avinguda Diagonal 645,08028-Barcelona, Spain3Dip. di Ingegneria Chimica e Alimentare, Universita degli Studi di Salerno,Via Ponte Don Melillo 1, I-84084 Fisciano, SA, Italy
Received 7 July 2004; accepted 14 October 2004
Published online 31 January 2005 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/bit.20375
Abstract: Xylanase A from Bacillus sp. BP7, an enzymewith potential applications in biotechnology, was used totest Pir4, a disulfide bound cell wall protein, as a fusionpartner for the expression of recombinant proteins instandard or glycosylation-deficient mnn9 strains of Sac-charomyces cerevisiae. Five different constructions werecarried out, inserting in-frame the coding sequence ofxynA gene in that of PIR4, with or without the loss ofspecific regions of PIR4. Targeting of the xylanase fusionprotein to the cell wall was achieved in two of the fiveconstructions, while secretion to the growth medium wasthe fate of the gene product of one of the constructions. Inall three cases localization of the xylanase fusion proteinswas confirmed both by Western blot and detection withPir-specific antibodies and by xylanase activity determi-nation. The cell wall-targeted fusion proteins could beextracted by reducing agents, showing that the inclusionof a recombinant protein of moderate size does not af-fect the way Pir4 is attached to the cell wall. Also, theconstruction that leads to the secretion of the fusionprotein permitted us to identify a region of Pir4 responsiblefor cell wall retention. In summary, we have developed aPir4-based system that allows selective targeting of anactive recombinant enzyme to the cell wall or the growthmedium. This system may be of general application for theexpression of heterologous proteins in S. cerevisiae forsurface display and secretion. B 2005 Wiley Periodicals, Inc.
Keywords: Saccharomyces cerevisiae; Pir cell wall pro-teins; recombinant protein expression; cell wall targeting;secretion; xylanase
INTRODUCTION
The cell wall of the yeast Saccharomyces cerevisiae is
made of three main components: h-1,6 and h-1,3-glucans,
chitin, and mannoproteins. Glucans and chitin are localized
to the inner part of the cell wall and are responsible for the
structural strength and the shape of the cell wall, while
mannoproteins are localized to the surface of the cells and
their main role seems to be structural and that of mediating
with the environment (Klis, 1994; Klis et al., 2002). A
biotechnologically interesting feature of S. cerevisiae, first
demonstrated by Schreuder et al. (1993), is the possibility
to immobilize heterologous enzymes on the cell surface by
fusing them to a cell wall protein, creating in this way an
easy-to-separate reusable biocatalyst (Schreuder et al.,
1996). Different groups of cell wall mannoproteins (CWPs)
have been used as partners for the targeting of recombinant
fusion proteins to the yeast cell wall: that of the glucanase-
extractable GPI-CWPs, which are linked to h-1,6-glucan
through the remnant of a glycosylphosphatidylinositol
group, the Pir-CWP group, supposedly linked to h-1,3-
glucan through alkali-sensitive linkages, and that of the
disulphide-bound cell wall proteins. GPI-CWPs have been
used as fusion partners for the targeting of a reporter
enzyme to the cell wall (Schreuder et al., 1993; Van der
Vaart et al., 1997), for the immobilization of glucolytic
enzymes on the cell surface to create a starch-utilizing yeast
(Murai et al., 1997a,b, 1998, 1999; Sato et al., 2002), for
the expression of lipases (Schreuder et al., 1996; Washida
et al., 2001; Matsumoto et al., 2002), or for the surface
display of the staphylococcal protein A (Andres et al.,
2003), while Pir1 and Pir2, two Pir-CWPs, have been used
for the cell wall targeting of different glycosyltransferases
B 2005 Wiley Periodicals, Inc.
Correspondence to: Jesus Zueco
Contract grant sponsors: Ministerio de Ciencia y Tecnologıa (Spain);
Generalitat Valenciana
Contract grant numbers: BMC2001-2761; Grupos 03/106, and a
predoctoral grant (to I.A.)
so as to create single-cell biocatalysts (Abe et al., 2003,
2004). Finally, Aga2p, a disulphide-bound CWP, has been
used as a carrier to present a library of antibody fragments
on the cell surface (Boder and Wittrup, 1997; Kieke at al.,
1997, Wittrup, 2001).
Pir4 belongs to the so-called Pir (proteins with internal
repeats) family of S. cerevisiae cell wall proteins (Toh-e
et al., 1993; Mrsa et al., 1997; Klis et al., 2002), which
are supposed to be directly attached to h-1,3-glucan.
However, two of the four PIR-CWPs described, Pir4 and
Pir2/Hsp150, are secreted to the medium to a variable
degree (Russo et al., 1992; Moukadiri and Zueco, 2001)
and can be specifically extracted from isolated cell walls
by reducing agents (Moukadiri et al., 1999; Moukadiri and
Zueco, 2001) and, accordingly, they can be included
among the disulphide-bound cell wall proteins. In this
work, we describe the use of Pir4 for the targeting of
xylanase A from Bacillus sp. BP-7 to the yeast cell wall
or to the culture medium. Xylan is a complex polymer
of plant cell walls that is second only to cellulose in
abundance in nature. The xylanases, which are the en-
zymes responsible for the depolymerization of the xylan
backbone, have attracted interest because of their poten-
tial biotechnological application in pulp bleaching and
in the food and animal feed industries (Maat et al.,
1992; Beauchemin et al., 1995; Luonteri et al., 1996).
S. cerevisiae does not naturally secrete xylanases and
cannot degrade xylan (Jeffries, 1983); however, it is an
attractive host for the expression and production of
recombinant xylanases (Li and Ljungdahl, 1996; Perez-
Gonzalez et al., 1996; Ganga et al., 1999; La Grange
et al., 2001). It provides for posttranslational processing
such as proteolytic cleavage and glycosylation and, since
it normally secretes few proteins and in low abundance,
a secreted heterologous protein is easily separated from
most other yeast proteins. Furthermore, it is a GRAS
(generally regarded as safe) organism, which allows
for its use in the food and pharmaceutical industries,
and there is ample experience in its growth in indus-
trial fermentors.
MATERIALS AND METHODS
Strains and Media
Escherichia coli DH5a was used for the propagation of
plasmids; it was grown in Luria broth supplemented with
100 Ag of ampicillin per ml when necessary. The
S. cerevisiae strains BY4741 (MATa, ura3�0, leu2�0,
met15�0, his3�1) and mnn9 (MATa, ura3�0, leu2�0,
met15�0, his3�1, ypl050c::kanMX4) used in this study
were obtained from the EUROSCARF collection (Heidel-
berg, Germany). Yeast strains were grown in YPD (1%
yeast extract, 2% bacto peptone, 2% glucose) or synthetic
minimal medium SD (0.7% yeast nitrogen base without
amino acids, 2% glucose, and amino acids as required).
Reagents
Agar, yeast extract, peptone, and yeast nitrogen base were
purchased from Difco Laboratories (Detroit, MI); phenyl-
methylsulphonylfluoride (PMSF) was from Roche (Nutley,
NJ); DNA restriction and modification enzymes were from
Roche, New England Biolabs (Beverly, MA), and Amer-
sham-Pharmacia (Amersham, UK). Tris-base, HCl, and
other buffer reagents were purchased from Sigma Chemical
(St. Louis MO) and from Panreac (Barcelona, Spain).
Electrophoresis reagents were from Bio-Rad Laboratories
(Hercules, CA). Nitrocellulose membranes and the chemi-
luminescence ECL reagents for developing Western
immunoblots were from Amersham. Goat antirabbit IgG-
peroxidase was from Bio-Rad.
Transformation of Strains, DNA Isolation,and Sequencing
Basic DNA manipulation and transformation in E. coli was
performed as described by Sambrook et al. (1989). Yeast
transformation was carried out by the lithium acetate
method (Ito et al., 1983; Gietz and Sugino, 1988). Plasmid
DNA from E. coli was prepared using the Flexi-Prep kit
(Amersham-Pharmacia) and DNA fragments were purified
from agarose gels using the Sephaglass Band-Prep kit, also
from Amersham-Pharmacia. Sequencing was performed
using Amplytaq polymerase with a Dye Terminator kit
(Perkin Elmer, Norwalk, CT) in an Applied Biosystems
(Foster City, CA) 373A automatic sequencer.
Construction of the Different Gene FusionsBetween PIR4 and XYNA
The first step consisted of subcloning the complete
sequence of the PIR4 gene into vector YEplac195 (Gietz
and Sugino, 1988), whose SalI restriction site had been
previously destroyed. For this, YEplac195 was digested
with PstI and XbaI and the resulting protruding ends were
filled in with Klenow and ligated with the loss of the PstI,
HincII, SalI, and XbaI sites from the polylinker of
YEplac195. The complete sequence of PIR4, including
its regulatory sequences, was amplified by PCR using
oligonucleotides PIR5V and PIR3V (Table I) and Expand High
Fidelity Polymerase from Roche. The resulting 1.2-Kbp
fragment was subcloned in the SmaI site of YEplac195,
previously modified as described above, to give construc-
tion pIA1.
Constructions C1 to C3 consisted of the insertion of the
coding sequence of Bacillus sp. BP7 xynA gene (Gallardo
et al., 2004), minus the 5V region coding the leader peptide,
in the NcoI, BglII, and SalI sites of PIR4. For this, a 569-bp
fragment of xynA was amplified using the oligonucleo-
tides XNCO5-XNCO3, XBGL5-XBGL3, XSAL5-XSAL3
(Table I), and plasmid pXA3V1 (Gallardo et al., 2004)
as template. The oligonucleotides included the restriction
ANDRES ET AL.: PIR-4 BASED EXPRESSION OF A XYLANASE 691
sites for the enzymes NcoI, BamHI, which leaves overhangs
compatible with those left by BglII, and XhoI, which leaves
overhangs compatible with the overhangs left by SalI, and
had been designed so that the xynA fragment was inserted
in-frame in PIR4 in construction pIA1. The PCR fragments
amplified using Expand High Fidelity DNA polymerase
(Roche) were subcloned in the HincII site of pUC19;
digested out with NcoI, BamHI, or XhoI, and inserted in
pIA1 previously digested by NcoI, BglII, or SalI. The
correct orientation of the inserts was monitored by PCR
performed directly on the colonies of transformants using
oligonucleotides PIR5V and the corresponding 3V oligonu-
cleotides used in the amplification of xynA (Table I).
Constructions C4 and C5 involved the substitution of
fragments of PIR4 by the coding sequence of xynA. In C4,
the 567-bp fragment of xynA was amplified using
oligonucleotides XBGL5 and XSAL3 (Table I) and
plasmid pXA3V1 as template, subcloned in the HincII site
of pUC19; digested out with BamHI and XhoI and
subcloned in pIA1 previously digested with enzymes BglII
and SalI with the loss of 365 bp of the 5V region of the
PIR4 ORF. Finally, to create construction C5, the 567-bp
fragment of xynA was amplified using oligonucleotides
XNCO5 and XSAL3 (Table I) and plasmid pXA3V1 as tem-
plate, subcloned in the HincII site of pUC19; digested out
with NcoI and XhoI and subcloned in pIA1 previously
digested with enzymes NcoI and SalI with the loss of 588 bp
of the PIR4 ORF. Constructions C4 and C5 were moni-
tored by PCR using oligonucleotides PIR3V and either
XBGL5 or XNCO5 (Table I).
Isolation of Cell Wall Mannoproteins
Cell walls were purified and extracted with h-mercaptoeth-
anol as follows: cells in the early logarithmic phase were
harvested and washed twice in Tris-HCl 10 mM, pH 7.4,
1 mM in PMSF (buffer A). The harvested biomass was
resuspended in buffer A in a proportion of 2 ml per gram
(wet weight), glass beads (0.45 mm in diameter) were added
up to 50% of the final volume, and the cells were broken by
shaking four times for 30 sec, with 1-min intervals, in a CO2
refrigerated MSK homogenizer (Braun Melsungen, Ger-
many). Breakage was confirmed by phase contrast micro-
scopy and the walls were washed six to eight times in buffer
A. Removal of noncovalently bound proteins was achieved
by boiling the walls in buffer A containing 2% SDS (10 ml
per gram of walls, wet weight) for 10 min, followed by six
to eight washes in buffer A. The purified cell walls were
finally resuspended in 10 mM ammonium acetate buffer,
pH 6.3, containing 2% (v/v) h-mercaptoethanol (5 ml per
gram of walls, wet weight) and incubated for 3 h at 30jC in
an orbital incubator at 200 rpm. The extract was separated
from the cell walls by centrifugation and concentrated by
lyophilization. Cell walls to be used in the xylanase activity
determinations were washed six to eight times in buffer A
and used directly.
SDS-Polyacrylamide Gels and Western Blot Analysis
Proteins were separated by SDS-polyacrylamide gel elec-
trophoresis (SDS-PAGE) according to the method of
Laemmli (1970) in 10% polyacrylamide gels. The proteins
separated by SDS-PAGE were transferred onto Hybond-C
nitrocellulose membranes as described by Towbin et al.
(1979) and Burnette (1981). Membranes were blocked
overnight in Tris-buffered saline containing 0.05% Tween-
20 (TBST) and 5% nonfat milk. The blocked membranes
were washed three times in TBST and incubated for 1 h
in TBST containing an antibody that reacts with Pir cell
wall proteins (Moukadiri et al., 1999) at a dilution of
1:5,000. After three washes in TBST, the membranes were
incubated for 20 min in TBST containing goat antirabbit
IgG-peroxidase at a dilution of 1:12,000 and washed in
TBST. Finally, antibody binding was visualized on X-ray
film by using the ECL method (Amersham).
Determination of Xylanase Activity
Plates for the xylanase plate assay contained 0.1% of xylan
Remazol Brilliant Blue (Sigma) in SD minimal medium to
which the required amino acids had been added. Strains
containing the different constructions were inoculated on
the plates, grown for 48 h at 28jC, and the xylanase activity
was detected by the presence of a transparent halo around
the growth. The quantification of the xylanase activity was
done by measuring the amount of reducing sugars, xylose
equivalents, released from birch wood xylan (Sigma), by the
method of Somogyi-Nelson (Spiro, 1966). Samples of
growth medium or cell walls were incubated for 10 min at
50jC in 50 mM Tris-HCl buffer pH 7containing 0.5% of
birch wood xylan. The reaction was stopped by cooling on
ice for 5 min and the determination of reducing sugars was
carried out by the method of Somogyi-Nelson, measuring
the resulting color at 520 nm. One unit of xylanase activity
is defined as the amount of enzyme that releases 1 Amol of
reducing sugar equivalent in 1 min under the assay
conditions described.
Table I. Oligonucleotides used to amplify the coding sequence of the
xynA gene minus the region coding for the leader peptide.
Oligonucleotide Sequence
PIR5V TGCATTCCATACGATTTCCACGGG
PIR3V GTGTATATTAAAGGCTGCATGTGG
XNCO5 AATTAACCATGGGCTAACACAGACTACTGGC
XNCO3 AAAAATCCATGGCCACACTGTGACGTTAGAAC
XSAL5 AATTAACTCGAGGCTAACACAGACTACTGGC
XSAL3 TATATACTCGAGCCACACTGTGACGTTAGAAC
XBGL5 AATTAAGGATCCTAGCTAACACAGACTACTGGC
XBGL3 TATATAGGATCCACACTGTGACGTTAGAAC
692 BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 89, NO. 6, MARCH 20, 2005
RESULTS
PIR4/xynA Gene Fusion Strategies and Expressionin S. cerevisiae
A total of five different gene fusion strategies were at-
tempted with the aim of testing the viability of using Pir4
as a fusion partner for the targeting of xylanase A to the
cell wall, and also to determine the different regions in
Pir4 that are important for its linkage to the cell wall
structure. All four PIR-CWPs share the presence of a sig-
nal peptide and that of a propeptide (Subunit I) that is
processed at the Golgi by the Kex2p protease. The mature
protein (Subunit II) includes a 19 amino acid repetitive do-
main and a very conserved carboxy-terminus that contains
four cysteine residues at fixed positions, which, considering
the extractability of some PIR-CWPs by reducing agents,
should be responsible for cell wall retention.
The structure of the PIR4, as outlined above, and that of
the xynA genes is shown in Figure 1, together with a
schematic representation of the five different fusion
strategies used. The first three (C1–C3) consisted of
inserting all the coding sequence of the xynA gene, minus
the 5V fragment coding the leader peptide, in different
naturally occurring restriction sites of the coding sequence
of PIR4. For this, the xynA sequence was amplified using
plasmid pXA3V1 (Gallardo et al., 2004) as template and
oligonucleotides which included in their 5V ends restriction
sites compatible with the NcoI, BglII, or SalI sites in PIR4,
and which had been designed to fit in-frame in the
corresponding sites in the ORF of PIR4.
Constructions C4 and C5 (Fig. 1) involved the substi-
tution of fragments of PIR4 by the coding sequence of the
xynA gene. In the case of the C4 construction, the xynA
coding sequence was subcloned in the BglII–SalI sites of
PIR4, with the loss of the carboxy-terminal fragment of
Subunit II of PIR4 that contains three of the four very
conserved cysteine residues that are expected to be
responsible for cell wall retention. Finally, in C5 the xynA
coding sequence was inserted between the NcoI–SalI
restriction sites of PIR4, to give a construction consisting
in the signal peptide of PIR4 followed by the xynA coding
sequence, with the loss of almost the complete coding
sequence of Subunits I and II of PIR4 (Fig. 1).
The five different constructions, based in YEplac112,
were then transformed in the wildtype BY4741 and the
glycosylation-deficient strain mnn9 (Hernandez et al.,
1989) of S. cerevisiae and the resulting recombinant strains
were tested for xylanase activity in plate assays using
Remazol Brilliant Blue xylan as substrate. The results of
this assay are shown in Figure 2. As can be deduced from
the halos around the different strains, constructions C1–C4
confer xylanase activity to the strains harboring them, in
some cases (C4), as intense as that of the positive control,
consisting of a recombinant E. coli strain harboring pXA3V1(Gallardo et al., 2004).
Study of the Localization of the RecombinantPir4-XynA Fusion Proteins by Western Immunoblot
To find out if the Pir4-XynA fusion proteins were being
correctly targeted to the cell wall, and if, as is the case with
Pir4, they could be extracted by reducing agents, h-
mercaptoethanol extracts from purified cell walls of the
different strains and concentrated samples of growth me-
dium were probed by Western immunoblot using an anti-
body that reacts with Pir-CWPs of S. cerevisiae (Moukadiri
et al., 1999). The results (Fig. 3A) show that, at least in
the h-mercaptoethanol extracts from purified cell walls of
the strains transformed with constructions C2 and C3, it
was possible to detect specific bands reactive with the anti-
body and with sizes compatible with those of the ex-
pected fusion proteins. In the case of the wildtype BY4741
strain harboring the C3 construction, the size of the spe-
cific reactive polypeptide is of 58 kDa, which matches the
expected size of 36 kDa for Pir4 plus f20 kDa of the
xylanase portion. In the same strain transformed with C2,
two main polypeptides of 52 and f100 kDa could be de-
tected. A possible interpretation of this 100 kDa polypep-
tide would be that it corresponds to a dimer of the 52 kDa
one, still attached through disulfide bridges despite the
SDS-PAGE procedure. No specific polypeptides could
be detected in the extracts of strains transformed with C1,
C4, and C5. In C1 and C5 this could be explained by the fact
that the resulting fusions may not be recognized by the
antibody, C5 because there is almost nothing of Pir4 itself
left, and C1 because it involves subunit I, which is not rec-
ognized by the antibody. Moreover, in C4 and C5 the four
cysteine region of Pir4, probably responsible for cell wall
retention, is not present and, accordingly, the fusions
resulting from these constructions were not expected to be
targeted to the cell wall.
Figure 1. Schematic representation of the xynA and PIR4 genes together
with the different PIR4-xynA gene fusions. SP, signal peptide; SI, subunit I;
PM, Pir motive; SII, subunit II; LP, leader peptide.
ANDRES ET AL.: PIR-4 BASED EXPRESSION OF A XYLANASE 693
To complete the above results, the presence of Pir4-
XynA fusions was also probed in the growth medium of the
strains harboring the different constructions. Only in the
case of the strain transformed with C4 was it possible to
detect the presence of a series of polypeptides that were
specific to this strain using the Pir antibody. A total of three
bands were detected, of 50, 45, and 40 kDa, the 50 kDa one
probably representing the full size fusion protein, and the
other two, partial degradation products (Fig. 3B). As
mentioned before, the presence of the fusion protein
derived from C4 in the growth medium correlates with
the absence from the resulting fusion protein of the region
of Pir4 that is responsible for cell wall retention. Finally,
no trace of the fusion protein derived from C5 could be
detected. This could be explained by the fact that, as is
the case in C1, the region of Pir4 that is recognized by the
antibody is not included in the resulting fusion protein;
however, it is also important to note that the strain
harboring C5 was the only one that did not exhibit
xylanase activity in the plate assay.
The results obtained with the mnn9-based strains
(Fig. 4A,B) were basically similar to those of the
BY4741-based strains. Specific Pir4-xynA bands of the
expected size were detected in the h-mercaptoethanol
extracts of the mnn9 strains transformed with constructions
C2 and C3 (Fig. 4A). Two Pir4-XynA bands were detected
in each of these strains, probably corresponding to the
Kex2-processed and unprocessed forms of the fusion
protein, as is the case with the native Pir4 in the mnn9
strain (Moukadiri et al., 1999). Finally, the results obtained
with the growth medium showed the presence of specific
Pir4-XynA bands in the mnn9 strain transformed with
Figure 2. Xylanase plate assay of the different strains harboring constructions C1–C5; halos around the streaks represent degradation of the substrate
(Remazol Brilliant Blue Xylan). Strains based on BY4741 (A), and mnn9 (B). Numbers 1–5 represent the strains harboring constructions C1–C5. Number 6
corresponds to a positive control consisting in an E. coli strain harboring plasmid pXA3V1. Number 7 corresponds to the parental strains BY4741 (A) or
mnn9 (B).
Figure 3. Immunoblot localization of the different recombinant fusion-proteins derived from constructions C1–C5 (lanes 2–6) in the wildtype strain
BY4741 of S. cerevisiae using an antibody that reacts with the Pir4 protein. A: h-Mercaptoethanol extracts from purified cell walls. B: Growth medium.
Lane 1 corresponds to the untransformed BY4741 strain of S. cerevisiae.
694 BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 89, NO. 6, MARCH 20, 2005
construction C4 only (Fig. 4B), with sizes very similar to
those found in the wildtype BY4741 strain transformed
with the same construction.
Detection of Xylanase Activity Associated With CellWall or Secreted to the Growth Medium
To confirm the above results and, at the same time, to test
and quantify functionality of the fusion proteins expressed
in the strains transformed with constructions C2, C3, and
C4, xylanase activity was determined in purified cell walls
and cell-free spent culture medium of 24-h cultures of these
strains. The results are shown in Table II. Xylanase activity
associated with the cell walls was detected for both the
wildtype BY4741 and mnn9 strains transformed with
constructions C2, C3, and C4, but not in the cell walls of
the untransformed strains. The detection of xylanase
activity associated with the cell walls in the strains
transformed with construction C4 shows that some fusion
protein was retained at the cell wall, although it could not
be detected by Western blot. However, the level of cell
wall-associated xylanase activity was lower than in the
strains harboring constructions C2 and C3, and most of the
total xylanase activity was detected in the growth medium
(88% of the culture’s total), while no xylanase activity
could be detected in the growth medium of strain BY4741
transformed with either construction C2 or C3. The results
for the transformed strains based on mnn9 confirm that
most of the activity expressed by the strain harboring
construction C4 is secreted to the growth medium;
however, unlike the strains based on BY4741, the mnn9
strains harboring constructions C2 and C3 leak xylanase
activity to the growth medium (Table II). This could be
accounted for by the fact that Pir4 is partly secreted to the
growth medium in the mnn9 strain (Moukadiri and Zueco,
2001), a fate that could presumably be followed by the
Pir4-xylanase fusion proteins derived from constructions
C2 and C4. As a whole, the distribution of the enzymatic
activities matches that of the fusion proteins as determined
by Western blot and specific antibody detection; however,
in some cases no fusion protein could be detected in
samples containing detectable enzymatic activity levels.
Figure 4. Immunoblot localization of the different recombinant fusion-proteins derived from constructions C1–C5 (lanes 2–6) in the mnn9 glycosylation-
deficient strain of S. cerevisiae using an antibody that reacts with the Pir4 protein. A: h-Mercaptoethanol extracts from purified cell walls. B: Growth
medium. Lane 1 corresponds to the untransformed mnn9 strain of S. cerevisiae.
Table II. Xylanase activity as determined in cell walls and growth medium of strains BY4741 and
mnn9 of S. cerevisiae, untransformed or harboring constructions C2, C3, or C4.
Strain
Cell wall associated activity Activity in growth medium
(Units/g
cell walls)
(Units/l
of culture
in cell walls)
% of culture
activity
in cell walls
(Units/l
of culture in
growth medium)
% of culture
acitivity in growth
medium
BY4741 0 0 0 0 0
C2-BY4741 1.8 5.76 100 0 0
C3-BY4741 1.5 4.8 100 0 0
C4-BY4741 0.45 1.1 12 8 88
mnn9 0 0 0 0 0
C2-mnn9 0.93 5.95 75 2 25
C3-mnn9 1.17 7.5 45 10 55
C4-mnn9 0.35 2.2 14 14 86
The mean of three experiments is presented.
ANDRES ET AL.: PIR-4 BASED EXPRESSION OF A XYLANASE 695
DISCUSSION
In a previous report (Moukadiri et al., 1999), we have
shown the use of Pir4, a disulphide bound cell wall protein
of S. cerevisiae, for the targeting of the IgG binding domain
of staphylococcal protein A to the cell wall. Our aim in the
present work was to explore the viability of using Pir4 as a
partner for the targeting of functional enzymes to the yeast
cell wall. For this, xylanase A of Bacillus sp. BP-7 was
used (Gallardo et al., 2004). Of the five different PIR4/
xynA gene fusion constructions tested (C1–C5), four
exhibited xylanase activity in plate assays, and in three of
these the fusion protein could be detected using an antibody
that recognizes the Pir4 moiety. C2 involves the insertion
of the xynA fragment in the region of PIR4 that codes
subunit II, between the 19 amino acids repetitive domain
and the carboxy-terminal region that contains the four
conserved cysteine residues, while in C3, the insertion of
xynA is made just two amino acids before the carboxy-
terminal end of Pir4. In both cases the resulting fusion
proteins are correctly targeted to the cell wall, from where
they can be extracted by reducing agents, and confer
xylanase activity to the cells. However, the sizes of the
respective fusion proteins, as detected by immunoblot
analysis, are slightly different. In the case of C3, the band
detected is relatively well defined and has a size close to
the expected, while in C2, two bands are detected, not very
well defined, and with average sizes of 50 and 100 kDa. A
possible interpretation for this difference could be that in
C3 the insertion would not affect the disulphide formation
in the folding of Pir4, while in C2, because of the insertion
being in the central part of Pir4, it would affect it and even
induce stronger dimer formation, the 100 kDa form being
representative of this. Accordingly, insertions in the SalI
restriction site of PIR4 (C3), which are equivalent to a
carboxy-terminal fusion, are most likely to be correctly
folded and to retain activity, besides being correctly
targeted to the cell wall.
In the case of the mnn9 strain transformed with
construction C2, no dimer form was detected; however,
both in C2 and C3 a double band of the approximate
expected size was detected. Since Pir4 also appears as a
double band in the mnn9 strain, corresponding to the
unprocessed and Kex2-processed forms (Moukadiri et al.,
1999), it is reasonable to assume that the double bands
derived from the C2 and C3 constructions in this strain
correspond also to the unprocessed and Kex2-processed
forms of the fusion proteins.
Different from C2 and C3, the fusion protein derived
from C4 could only be detected in the growth medium, both
in the BY4741 and mnn9 strains, in the form of three
polypeptides of 50, 45, and 40 kDa, probably correspond-
ing to the full-size fusion protein and partial degradation
products. In this case, the construction involved the
substitution of the region containing three of the four
conserved cysteine residues of Pir4 by XynA and, as could
be expected, the fusion protein is no longer retained in the
cell wall. Also, the fact that the fusion protein is secreted
would explain the larger halo around the strains harboring
construction C4 in the xylanase activity plate assay. Two
conclusions can be drawn from this result: first, that Pir4
can be used as a carrier for the secretion of heterologous
proteins, in a similar fashion to the a-factor leader
(Romanos et al., 1992) or to Pir2/Hsp150 (Simonen et al.,
1994; Simonen et al., 1996), just by removing the cell wall
retention domain; and second, that the very conserved
carboxy-terminal domain in Pir4, including four cysteine
residues, is indeed responsible for the disulphide cell wall
attachment of Pir4, notwithstanding the fact that Pir4 may
also, to some extent, be linked to the h-1,3-glucan of the
cell wall through an alkali-sensitive linkage that involves
the Pir repetitive domain. Furthermore, Simonen et al.
(1996) suggested that the repetitive domain in Pir2/Hsp150
may allow productive folding of the heterologous protein
fused after it. Since this 19 amino acids domain is present
11 times in Pir2/Hsp150, and only once in Pir4, we can
conclude that the single copy of this domain is enough to
perform this role, at least for the case studied.
The results from the quantification of the xylanase
activity associated with cell walls or secreted to the growth
medium shows that activity is mainly associated with the
cell walls in the strains harboring constructions C2 and C3,
and that xylanase activity of BY4741-based strains is
higher than that of those based in the mnn9 strain, probably
because, in this strain, part of Pir4 is released to the growth
medium (Moukadiri and Zueco, 2001). This is confirmed
by the presence of xylanase activity in the growth medium
of the mnn9 strain harboring constructions C2 and C3.
Finally, no fusion protein derived from C5 could be
detected. This could be easily explained by the fact that the
fusion protein does not include subunit II of Pir4, and it is
not recognized by the antibody used, as is the case with the
fusion protein derived from C1. However, contrary to the
case of C1, no xylanase activity was detected in the plate
assay of the strain harboring C5. This result matches that of
Simonen et al. (1994) in Pir2/Hsp150, which found that a
Pir2/h-lactamase fusion protein was retained at the
endoplasmic reticulum and lacked activity when Subunit
II of Pir2/Hsp150 was not part of the fusion.
In summary, we have developed a Pir4-based system that
allows selective targeting of heterologous proteins to the
cell wall or the growth medium. This system may be of
general application and, at least in the example studied,
leads to cell wall immobilization or to secretion to the
growth medium of an active enzyme.
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ORIGINAL ARTICLE
Cloning and production of Xylanase B from Paenibacillus
barcinonensis in Bacillus subtilis hosts
OSCAR GALLARDO, PILAR DIAZ, & F. I. JAVIER PASTOR
Department of Microbiology, Faculty of Biology, University of Barcelona, Spain
AbstractXylanase B from Paenibacillus barcinonensis was cloned in shuttle vectors for Escherichia coli and Bacillus subtilis ,and expressed in Bacillus hosts. Several recombinant strains were constructed, among which B. subtilis MW15/pRBSPOX20showed the highest production. This recombinant strain consists of a protease double mutant host containingP. barcinonensis xynB gene under the control of a phage SPO2 strong promoter. Maximum production was foundwhen the strain was cultured in nutrient broth supplemented with xylans. Analysis of xylanase B location in B. subtilisMW15/pRBSPOX20 showed that the enzyme remained cell-associated in young cultures, consistent with its intracellularlocation in its original host, P. barcinonensis, and the lack of a signal peptide. However, when cultures reached the stationaryphase, xylanase B was released to the external medium as a result of cell lysis. The amount of enzyme located in thesupernatants of old cultures could account for 50% of total xylanase activity. Analysis by SDS�PAGE showed that xylanaseB is an abundant protein found in the culture medium in late stationary phase cultures.
Keywords: Xylanase, production, expression, Bacillus
Introduction
Xylan is a major structural component of plant cell
walls and, after cellulose, is the second most abun-
dant renewable polysaccharide in nature (Collins
et al. 2005). Biodegradation of xylan is a complex
process that requires the co-ordinate action of several
enzymes, among which xylanases (1,4-b-D-xylan
xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), cleaving internal lin-
kages on the b-1,4-xylose backbone, play a key role
(Gilkes et al. 1991; Henrissat & Bairoch 1996). The
complex chemical nature and heterogeneity of xylan
can account for the multiplicity of xylanases pro-
duced by micro-organisms (Kulkarni et al. 1999).
Xylanases have important applications in industry
due to their enormous potential to modify and
transform plant-derived biomass, which is used in
a wide variety of industrial processes. One of the
most successful biotechnological applications of
these enzymes is in pulp bleaching, where xylanase
pretreatment results in important economic and
environmental advantages over the non-enzymatic
process (Viikari et al. 1994; Bajpai 2004). Xylanases
have also important applications in food and animal
feed industries (Bedford & Classen 1992; Monfort
et al. 1996). The synthesis of new xylosides is a
promising application, where xylanases with trans-
glycosidase activity can be of special interest (Jiang
et al. 2004).
Paenibacillus barcinonensis is a recently identified
new species that produces a complex set of enzymes
for xylan degradation (Blanco et al. 1995, 1999;
Sanchez et al. 2005). One of these enzymes, xylanase
B, has previously been cloned and characterized
(Blanco et al. 1996). In contrast with known
xylanases, which are secreted to the extracellular
medium to allow contact and cleavage of highly
polymerized xylans, xylanase B is a cytoplasmic
enzyme that may represent a new type of enzyme
involved in xylan degradation (Gallardo et al. 2003).
Xylanase B shows transglycosidase activity on oligo-
saccharides, suggesting that it has a potential for the
synthesis of new compounds (Blanco et al. 1996). In
this article, we describe the expression of xylanase B
in different microbial hosts as a first step in
constructing recombinant strains able to produce
high amounts of enzyme to be evaluated in biotech-
nological applications.
Correspondence: F. I. J. Pastor, Department de Microbiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Avinguda Diagonal 645,
08028 Barcelona, Spain. Tel: 34 93 4034626. Fax: 34 93 4034629. E-mail: [email protected]
Biocatalysis and Biotransformation, March�August 2007; 25(2�4): 157�162
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Materials and methods
Bacterial strains and plasmids
Escherichia coli /pX60 is a recombinant strain con-
taining xynB described previously (Blanco et al.
1996). Bacillus subtilis MB216 (trpC2 thr-5) and
B. subtilis MW15 (his nprR2 nprE18 DaprA3
DeglS102 DbglT bglSRV DxynA CmR) have been
described elsewhere (Lampen et al. 1986; Wolf et al.
1995). Plasmid pN5 is a shuttle vector for E. coli and
B. subtilis that was constructed in this work by
ligation of partially Sau3A-digested pUC19 and
pC194 plasmids (Horinouchi & Weisblum 1982).
A 1.3 Kb DNA segment of P. barcinonensis, contain-
ing xynB preceded by a region with partial homology
to Bacillus spp promoters, was amplified by PCR
from pX60 and inserted at the SmaI site of pN5.
The resulting plasmid was named pN5X20. Plasmid
pRBSPOX20 contains the xynB structural gene
cloned downstream of the SPO2 promoter of vector
pRBSPO (Gallardo et al. 2003). Strains were
cultured at 308C in nutrient broth, BREC1 (Over-
beeke et al. 1990), MG and MG2 (Hoch 1991).
When necessary, media were supplemented with 1%
oat spelt xylan (Sigma Chemical Co.), 0.2% birch-
wood xylan (Sigma Chemical Co.), or 1% rice straw.
Nucleic acid manipulations
Plasmid DNA was purified by the alkaline lysis
procedure (Sambrook et al. 1989) or through chro-
matography (QIAGen-tip 100 MidiPrep, QIAGen).
PCR amplification was performed using Pfu DNA
Polymerase (Stratagene). Restriction nucleases and
ligase were purchased from Boehringer Mannheim
and used according to the manufacturer’s instruc-
tions. E. coli was transformed as described (Sam-
brook et al. 1989). Protoplasts from B. subtilis were
obtained by lysozyme treatment of cells from mid-log
phase cultures and transformed as described (Chang
& Cohen 1979). The sequence of both strands of
xynB was determined by automated fluorescence
sequencing with an ABI PRISMTM
dye terminator
cycle sequencing ready reaction mix (Perkin-Elmer)
in a 377 Perkin-Elmer DNA sequencer.
Enzyme assays
Cultures from B. subtilis MB216/pN5X20, B. subtilis
MW15/pN5X20, B. subtilis MB216/pRBSPOX20
and B. subtilis MW15/pRBSPOX20 were centri-
fuged and supernatants and pellets separated. To
obtain cell extracts, pelleted cells were washed in
water, resuspended in 100 mM Tris/HCl and dis-
rupted by sonication (four pulses of 2 min). Enz-
yme activity of cell extracts and supernatants was
evaluated. Xylanase activity was assayed by measur-
ing the amount of reducing sugars released from
birchwood xylan using the method of Nelson and
Somogyi (Spiro 1966). The assay mixture contained
0.5% xylan in a final volume of 0.1 mL of 50 mM
acetate buffer pH 5.5. After 15 min incubation at
408C, color development was measured at 520 nm.
One unit of enzymatic activity was defined as the
amount of enzyme that released 1 mmol of reducing
sugar equivalent per minute under the assay condi-
tions described. Xylanase activity in supernatants
from cultures containing glucose or other substances
that could interfere in the determination of reducing
sugars was determined by evaluating the release of
soluble color from Remazol Brilliant Blue xylan
(Sigma Chemical Co.). The assay mixture contained
6 mg mL�1 of Remazol Brilliant Blue xylan in a final
volume of 0.5 mL of 50 mM acetate buffer pH 5.5.
The mixture was incubated at 408C for 15 min and 1
mL of absolute ethanol was added. After further
incubation for 30 min at room temperature, samples
were centrifuged at 2 000 g for 3 min and the color
released to the supernatant measured at 595 nm. To
quantify the activity assayed by the Remazol Brilliant
Blue xylan system, xylanase activity of control
samples was determined by the two assay methods
described and a standard plot was obtained.
Gel electrophoresis
Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel elec-
trophoresis (SDS�PAGE) was performed in 12%
gels essentially as described by Laemmli (1970).
Results
Cloning of xylanase B in selected strains of Bacillus
subtilis
Xylanase B from P. barcinonensis was previously
identified and characterized from E. coli /pX60, a
recombinant clone containing xynB (Blanco et al.
1996). The enzyme shows high specific activity on
aryl-xylosides, probably as a result of transglycosi-
dase activity, as revealed from the study of its mode
of action on xylooligosaccharides (Blanco et al.
1996). This makes the enzyme a good candidate
for biotechnological applications.
The choice of an appropriate host is usually an
important factor in obtaining high levels of expres-
sion and production of recombinant enzymes.
B. subtilis can be successfully used for the production
of heterologous proteins of other endosporulating
Gram-positive bacteria. To obtain a high level of
production of xylanase B, we cloned xynB in shuttle
vectors for E. coli and B. subtilis . The two shuttle
vectors used, pN5 and pRBSPO, were derived from
158 O. Gallardo et al.
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E. coli plasmids pUC19 or pBR322, respectively, and
from plasmids pC194 or pUB110, respectively, for
cloning in B. subtilis (see Materials and methods). In
the case of pN5, xynB was placed under the control
of its own putative promoter, while in the case of
pRBSPO, the xynB structural gene was cloned
downstream of the SPO2 phage promoter contained
in this vector.
The plasmids constructed, pN5X20 and
pRBSPOX20, were selected from E. coli transfor-
mants that showed xylanase activity on plate assays.
These plasmids were subsequently isolated and
introduced in B. subtilis by protoplast transforma-
tion. Two different strains were used as recipient
host: B. subtilis MB216 (with background xylanase
activity) and B. subtilis MW15 (devoid of xylanase
activity). The recombinant strains obtained were
grown in nutrient broth supplemented with the
corresponding antibiotics and xylanase activity in
the culture supernatants was determined (Figure 1).
Recombinant strains containing plasmid pN5X20
did not show a significant increase of xylanase
activity over the non-recombinant parental strains.
However, recombinant strains carrying plasmid
pRBSPOX20 showed notable xylanase activity.
Maximum production was obtained with B. subtilis
MW15/pRBSPOX20, which was selected for further
studies.
Influence of culture media on xylanase production
B. subtilis MW15/pRBSPOX20 was grown in differ-
ent culture media that were supplemented with
birchwood xylan, oat spelt xylan or rice straw.
Samples were taken at different intervals and xyla-
nase activity in culture supernatants was deter-
mined. All cultures showed maximum xylanase
activity after 3 to 8 days of incubation, and in all
cases xylanase production was increased in media
with xylans or rice straw (Table I). Cultures supple-
mented with these substrates showed a notable
increase in xylanase production when compared to
the non-supplemented cultures, which in some cases
(MG2 and BREC) did not show detectable xylanase
activity. In most cultures, birchwood xylan and rice
straw showed a similar stimulating effect in the
production of xylanase, while cultures supplemented
with oat spelt usually displayed lower xylanase
activity. Maximum xylanase production was ob-
tained when strain B. subtilis MW15/pRBSPOX20
was grown on birchwood xylan supplemented nu-
trient broth. In this medium, 0.23 xylanase activity
units mL�1 were detected in supernatants of 3-day-
old cultures.
Cellular location of xylanase B in Bacillus subtilis
Previous analysis of xylanase B showed that it does
not have a signal peptide for secretion outside the
cells, and, accordingly, it is a cytoplasmic enzyme in
its original host, P. barcinonensis (Gallardo et al.
2003). The physiological role of intracellular xylanase
B in xylan degradation is unclear, but it is probably in
the hydrolysis of the oligosaccharides resulting
from xylan degradation by extracellular xylanases,
once they have been transported inside the cells.
In the results shown up to this point, xylanase
activity determinations were performed in culture
supernatants of the recombinant strains constructed.
Detection of activity in these samples indicated that at
least a percentage of the xylanase produced by the
recombinant strains was released to the extracellular
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Days
)lm/
U(ytivitca
esanalyX
Figure 1. Production of xylanase activity by recombinant strains
of Bacillus subtilis carrying xynB . B. subtilis MB216 ('), B. subtilis
MW15 (^), B. subtilis MB216/pRBSPOX20 (m), and B. subtilis
MW15/pRBSPOX20 (k) were grown at 308C in nutrient broth.
Samples were collected at different intervals and xylanase activity
in supernatants of cultures was determined.
Table I. Production of xylanase by Bacillus subtilis MW15/
pRBSPOX20 cultured in media supplemented with different
polysaccharides.
Culture media
Polysaccharide
added
Days of
culture
Activity
(U mL�1)
Nutrient brotha � 4 0.06
Oat spelt xylan 3 0.09
Rice straw 4 0.20
Birchwood xylan 3 0.23
MGb � 8 0.02
Oat spelt xylan 8 0.16
Rice straw 8 0.16
MG2b � 0.00
Oat spelt xylan 3 0.09
Rice straw 8 0.13
BREC1b � 0.00
Oat spelt xylan 8 0.15
Rice straw 4 0.07
aXylanase activity was determined by the method of Nelson and
Somogyi.bActivity was determined by the Remazol Brilliant Blue Xylan
assay.
Cloning and production of Xylanase B 159
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medium. To analyze the location of xylanase B in
B. subtilis MW15/pRBSPOX20, the strain was cul-
tured in nutrient broth supplemented with birchwood
xylan, samples were taken at different intervals, and
xylanase activity determined in both cell extracts and
culture supernatants (Figure 2). Xylanase activity
remained cell associated in young cultures, through
the exponential phase of growth. However, when
cultures reached the stationary phase, a significant
amount of xylanase activity was released to the
external medium, and in 3-day-old cultures around
50% of total activity was found in the supernatants.
The cellular location of xylanase B in B. subtilis
MW15/pRBSPOX20 was also examined by SDS-
PAGE. Supernatants from 3-day cultures showed a
prominent 40 kDa protein band, corresponding to
xylanase B, not found in supernatants from control
B. subtilis cultures (Figure 3). Cell extracts from
B. subtilis MW15/pRBSPOX20 also showed a pro-
minent band (not shown) with identical mobility to
that found in the supernatants of old cultures,
suggesting the lack of processing of the enzyme found
extracellularly, which was probably released as a
result of cell lysis.
Discussion
Xylanase B from P. barcinonensis has several proper-
ties that make it an unusual enzyme among xylanases
(Blanco et al. 1996; Gallardo et al. 2003). One of the
properties is transglycosidase activity, which makes
the enzyme a good candidate for biotechnological
application in the synthesis of new xylosides
with potential use in food, pharmaceutical and
detergency industries (Jiang et al. 2004). Biotechno-
logical evaluation of enzymes usually requires the
availability of high amounts of purified or enriched
samples. As a first stage in the production of
xylanase B, we constructed several recombinant
strains in which xynB was cloned in different
plasmid vectors and expressed under the control of
different promoters in several host strains. B. subtilis
is a well known micro-organism successfully used
for industrial production of enzymes and proteins
(Harwood 1992; Ferrari et al. 1993; Wong 1995).
We selected it as a host for the heterologous
production of xylanase B from P. barcinonensis . One
of the strains used, B. subtilis MB216, was selected
because of its efficiency in producing heterologous
proteins from other bacilli (Lampen et al. 1986),
whereas the second strain, B. subtilis MW15, is a
double mutant deficient in neutral and alkaline
protease activity, which additionally is devoid of
background xylanase activity (Wolf et al. 1995). In
the experiments performed in this work, the strain
B. subtilis MW15 showed the highest production of
recombinant xylanase B, in agreement with previous
results showing the effectiveness of protease-
deficient mutants of B. subtilis for the expression of
enzymes and proteins (Wu et al. 1991).
Hours
.D.
Omn006
)lm/
U(ytivitca
esanalyX
0 24 48 72
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Figure 2. Cellular location of xylanase activity in Bacillus subtilis
MW15/pRBSPOX20. B. subtilis MW15/pRBSPOX20 was grown
at 308C in nutrient broth supplemented with birchwood xylan,
samples were taken at different intervals of incubation, fraction-
ated into cell extracts and supernatants, and xylanase activity
determined. Culture O.D.600nm ('), xylanase activity in cell
extracts (m), xylanase activity in supernatants (I).
97 -116 -
45 -
31 -
21 -
66 -
1 2
kDa
Figure 3. SDS�PAGE analysis of extracellular fractions from
Bacillus subtilis MW15/pRBSPOX20. B. subtilis MW15/
pRBSPOX20 and control B. subtilis MW15/pRBSPO were
cultured at 308C. Samples were taken after 3 days of incubation,
centrifuged and supernatants were analyzed by SDS�PAGE.
Lane 1, concentrated supernatants from B. subtilis MW15/
pRBSPOX20. Lane 2, concentrated supernatants from B. subtilis
MW15/pRBSPO. The positions of molecular weight markers are
indicated.
160 O. Gallardo et al.
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Regarding the plasmids constructed, plasmid
pN5X20 did not give rise to the production of
detectable xylanase activity by the B. subtilis strains
that contained it. This may be due to the absence of
Bacillus promoters in the shuttle vector used, pN5.
However, the DNA insert of pN5X20 contained
both the structural gene xynB plus a 121 bp DNA
upstream fragment that included a region with
partial sequence similar to those recognized by the
sA factor of Bacillus RNA polymerase. This putative
promoter sequence included in pN5X20 seems not
to be functional in the B. subtilis hosts used in this
work, although promoters from Bacillus and related
genera are usually active in B. subtilis hosts, and can
give rise to high levels of production (Sumitomo
et al. 1995). The results obtained here suggest that
the 121 bp region upstream xynB structural gene
may not be a functional promoter in its natural host
P. barcinonensis . Plasmid pRBSPOX20, however,
expressed high xylanase activity in the two host
strains assayed, probably as a result of the good
performance of the SPO2 promoter located up-
stream of xynB. Several studies have shown that
the SPO2 promoter can give rise to high expression
of heterologous enzymes (Schoner et al. 1983;
Bolhius et al. 1999). High levels of production of
recombinant proteins in B. subtilis have also been
reported using promoters, such as SPO1 phage
(Osbourne & Craig 1986) and the a-amylase pro-
moter from B. amyloliquefaciens (Palva et al. 1981;
Inoue et al. 2002, Yamamoto et al. 2005).
Among the several culture media assayed, max-
imum xylanase production was found when B.
subtilis MW15/pRBSPOX20 was grown in nutrient
broth. The reported increase of production in media
with high ammonium concentration (MG, MG2 and
BRECI), that suppress expression of residual pro-
tease in protease deficient strains (Overbeeke et al.
1990) seems not to apply in our experiments. In all
media tested, xylan supplementation enhanced xyla-
nase production, probably as a result of a higher
growth of the strains in these media, as confirmed by
the determination of cell protein contents of samples.
Xylanase B was mostly located in the cytoplasm of
B. subtilis hosts in accordance with the intracellular
location of the enzyme in its original host
P. barcinonensis , and the lack of a signal peptide
(Gallardo et al. 2003). This is in agreement with the
need for a signal peptide for enzyme export to the
extracellular medium in B. subtilis (Nagarajan
1993). Although alternative, signal peptide-indepen-
dent, secretion pathways have been described in
Gram-negative bacteria (Binet et al. 1997), similar
pathways for protein secretion in B. subtilis have not
been reported to date. Our results show that when
cultures of B. subtilis MW15/pRBSPOX20 pro-
gressed into the stationary phase, a significant
amount of xylanase B was released to the media.
Most probably this is non-specific release, resulting
from cell lysis of old cultures, as the activity of the
cytoplasmic enzyme malate dehydrogenase, assayed
in parallel, was also released to the medium in these
cultures (data not shown). We have obtained a high
level of expression and production of recombinant
xylanase B in B. subtilis . At present, new construc-
tions using alternative promoters and Bacillus host
strains are being prepared to obtain higher levels of
production of the enzyme. This should facilitate
biotechnological evaluation of xylanase B, an en-
zyme of unique and distinctive properties among
xylanases.
Acknowledgements
We thank Monika Wolf for her gift of bacterial strain
Bacillus subtilis MW15. We also thank the Serveis
Cientıfico-Tecnics of the University of Barcelona for
their support in nucleotide sequencing, and Margar-
ita Soriano for technical aid in the construction of
pRBSPOX20. This work was partially supported by
the Spanish Ministry of Education and Science,
project ref. CTQ2004-07560-CO2-02.
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Tesis DoctoralÓscar Gallardo Román
Barcelona, 2007
