Caracterización morfológica de células mediante ...

Caracterización morfológica de células mediante microscopía

holográfica digital en transmisión fuera de eje

Estefanía Mendoza Rodríguez

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento Física

Bogotá, Colombia

2017

Caracterización morfológica de células mediante microscopía

holográfica digital en transmisión fuera de eje

Estefanía Mendoza Rodríguez

Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título

De:

Magister en Ciencias Física

Director:

Ph.D. Freddy Alberto Monroy Ramírez

Departamento de Física

Línea de Investigación:

Microscopía Holografía Digital

Grupo de Investigación:

Grupo de Óptica Aplicada (GOA)

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento Física

Bogotá, Colombia

2017

(Dedicatoria)

A mi madre

Por ejemplo:

A mis padres

o

La preocupación por el hombre y su destino

siempre debe ser el interés primordial de todo

esfuerzo técnico. Nunca olvides esto entre tus

diagramas y ecuaciones.

Albert Einstein

Agradecimientos

Mi más profundo y sincero agradecimiento a todas aquellas personas que con su ayuda han

colaborado en la realización del presente trabajo, en especial al Dr. Freddy Alberto Monroy, del

Departamento de Física, director de esta investigación, por la orientación, el seguimiento y la

supervisión, pero sobre todo por brindarme un espacio de trabajo.

Quisiera hacer extensiva mi gratitud a mis compañeros del Grupo de Óptica Aplicada de la

Universidad Nacional de Colombia, su aceptación y amistad han sido de gran ayuda en mi

crecimiento personal y profesional.

A todos ellos, muchas gracias.

Resumen

La Microscopia Holográfica Digital en transmisión (MHD) es considerada una herramienta útil en

la caracterización no-invasiva de objetos biológicos translúcidos. En la presente tesis se propone

esta técnica para el estudio de macrófagos de ratón de la línea J774.A1 control o infectados por

Leishmania. La MHD inicia con el registro óptico de los hologramas utilizando un interferómetro

Mach-Zehnder modificado, y posteriormente con la reconstrucción numérica del campo óptico

complejo se calcula su amplitud, la que permite la caracterización morfométrica de las muestras y

su mapa de diferencia de fase, con el que es posible acceder al cálculo de las variaciones internas

de índice integral de refracción relativo, con esto se estima el nivel de infección de las muestras

estudiadas. Por medio de la descripción de las variaciones morfométricas y del índice integral de

refracción, se describe cuantitativamente la evolución temporal de la infección, lo que permite

proponer a la MHD como una posible herramienta de diagnóstico para estos objetos biológicos

en presencia de algún patógeno.

Palabras clave: Microscopía holográfica digital, espectro angular, índice integral de refracción,

morfometría, macrófagos, Leishmania.

Contenido IX

Abstract

The Digital Holographic Microscopy in Transmission (DHM) is considered a useful tool in the non-

invasive caracterization of translucent biological objects. In this thesis, we propose this technique

to study the macrophages of mouse line J774.A1 control or infected by Leishmania. The MHD

begins with the optical register of holograms using a modified Mach-Zender interferometer, and

subsequent rebuilding the complex numerical optical field, we calculate his amplitude, It allows

morphological characterization of the samples and his phase differences maps, with this result is

possible access to calculate of the internal variations for the relative integral refraction index,

with this process, we estimate the infection level of the samples studied. Through the description

of morphological changes and the integral refraction index is possible to describe quantitative the

temporal evolution of the infection. It procedure converts to the MHD in a viable support tool for

diagnosis for these biological objects under the presence of some pathogen.

Keywords: Digital holographic microscopy, angular spectrum algorithm, integral refraction

index, morphometry, macrophages, Leishmania.

X

Caracterización morfológica de células mediante la Microscopia Holografía Digital en transmisión Fuera de Eje

Contenido

Resumen .............................................................................................................................. VIII

Abstract .................................................................................................................................. IX

Lista de figuras ........................................................................................................................ XI

Lista de tablas ........................................................................................................................ XV

Lista de Símbolos y Abreviaturas ............................................................................................ 17

Introducción .......................................................................................................................... 19

1 Fundamentos Teóricos ........................................................................................................ 24 1.1 Microscopía Holográfica Digital .................................................................................... 24 1.1.2 Registro del campo óptico complejo ........................................................................... 25 1.1.3 Reconstrucción del campo óptico complejo ................................................................. 26 1.1.4 Información de los mapas de diferencia de fase .......................................................... 34 1.2 Relación macrófago - Leishmania ................................................................................. 35

2. Desarrollo Experimental e Implementación teórica ......................................................... 39 2.1 Procedimiento Experimental ........................................................................................ 39 2.2 Reconstrucción del campo óptico complejo: ................................................................ 41 2.2.1 Compensación de alteraciones de fase ........................................................................ 41 2.3 Calibración lateral ......................................................................................................... 44 2.4 Condiciones experimentales para el crecimiento de las muestras biológicas estudiadas: ................................................................................................................................ 48

3. Análisis de resultados: .................................................................................................... 50 3.1 Caracterización de Micro-esferas 3µm ......................................................................... 50 3.2 Caracterización de Micro-esferas 6µm ......................................................................... 53 3.3 Macrófagos sanos o control .......................................................................................... 55 3.4 Fagocitosis de Microesferas de látex ............................................................................ 60 3.5 Macrófagos después de 24 Horas de Infección de Leishmaniasis. ............................... 67 3.6 Macrófagos después de 48 Horas de Infección de Leishmaniasis. ............................... 73

4. Conclusiones y Productos................................................................................................ 79 4.1 Conclusiones .................................................................................................................... 79 4.2 Productos ...................................................................................................................... 81

5. Bibliografía ..................................................................................................................... 82

Contenido XI

Lista de figuras

Pág.

Figura 1: Interferómetro de Mach-Zehnder modificado para MHD fuera de eje: Laser de He-Ne,

Divisor de Haz (DH), Filtro Espacial(FE), Lente (L), Espejo(E), Objetivo de Microscopio(OM), Objeto

(Ob), Atenuador (A), Cubo Divisor de Haz (CDH), Cámara (CCD), HR Haz de Referencia, HO Haz

Objeto. ............................................................................................................................................. 24

Figura 2: Planos importantes en la Holografía Digital: Plano Objeto, plano Holograma y plano

Imagen.............................................................................................................................................. 25

Figura 3: Ordenes de Difracción: (1) Representa la imagen real a una distancia z en el plano

anterior al plano del sensor, (O) corresponde al orden cero de difracción, (-1) Representa la

imagen virtual en el plano posterior al plano del sensor, a una distancia z del plano holograma. . 27

Figura 4: Geometría de la fórmula de Difracción Fresnel-Kirchoff. S es la fuente puntual y L el

punto de observación (tomada y modificada de [55]). ................................................................... 29

Figura 5: Geometría para la difracción a través de una apertura 3D. (tomada y modificada de [55])

.......................................................................................................................................................... 30

Figura 6: Propagación de una Componente de onda plana en el espectro angular (tomada y

modificada de [55]). ......................................................................................................................... 31

Figura 7 Dibujo esquemático de una célula esférica, la cual presenta un cambio en el frente de

onda ∆ϕ que pasa por el objeto, donde nm es el IR del medio donde está inmersa la célula, nv el

IR del vidrio, d es el diámetro de la célula y nc el IR de la célula (Tomada y Modificada de [61]). . 35

Figura 8: Etapas de la fagocitosis de un macrófago en presencia de un patógeno (tomada y

modificada de [67]) .......................................................................................................................... 36

Figura 9: Ciclo de vida de la leishmaniasis en la etapa humana y la etapa reservorio (tomada y

modificada [69]). .............................................................................................................................. 37

Figura 10:Montaje óptico del interferómetro de MZ en configuración vertical para Microscopía

Holográfica Digital Fuera de eje: Laser, (F.E) Filtro espacial; (L.C) Lente colimadora; (D.H1, D.H2)

Divisor de Haz 50%,50% no polarizados; (P) Atenuador; (OM1) Objetivo de Microscopio del haz de

referencia 40X/AN=0,45; (OM2) Objetivo de Microscopio del haz objeto 60X/AN=0,65; (E1, E2)

espejos de primera cara; CMOS sensor de estado sólido 1280x1024 y 5,4 μm de tamaño de píxel.

.......................................................................................................................................................... 39

Figura 11: Iluminación vertical de la muestra bajo estudio ............................................................. 40

Figura 12:Esquema del proceso de reconstrucción incluyendo la compensación de curvatura ..... 43

Figura 13: Reconstrucción en amplitud y fase de barras que van en grosor desde 3.91𝜇𝑚 hasta

0.78 𝜇𝑚 y que corresponden a los Grupos 7, 8 y 9 de la Tarjeta USAF de alta resolución con

magnificación de 40X. ...................................................................................................................... 45

Figura 14: Perfil del grupo 7 elemento 0, donde la distancia en pixeles del par de líneas

corresponde 3.48µm ........................................................................................................................ 46

Figura 15 :Reconstrucción en amplitud y fase de barras de anchos desde 1,95um hasta 0,78um y

que corresponden a los Grupos 8 y 9 de la Tarjeta USAF de alta resolución con magnificación de

60X ................................................................................................................................................... 47

XII


Figura 16: A) Reconstrucción en amplitud de aglomerados de microesferas de 3𝜇𝑚 de diámetro;

B) Reconstrucción de la fase envuelta de las microesferas; C) Mapa de índice de refracción

relativo de dos microesferas de 3𝜇𝑚 con una magnificación de 40X. ............................................ 51

Figura 17: Perfil de índice integral de refracción relativo calculado para una micro esfera de 3𝜇𝑚

a lo largo de la línea diametral roja mostrada en la figura 16C. ...................................................... 52

Figura 18: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo (IRR) de una microesfera de 3𝜇𝑚

estudiada con un objetivo de 40X ................................................................................................... 52

Figura 19:A) Reconstrucción en amplitud de aglomerados de microesferas de 6𝜇𝑚 de diámetro;

B) Reconstrucción de la fase envuelta de las microesferas; C) Mapa de índice de refracción

relativo de dos microesferas de 3𝜇𝑚 con una magnificación de 60X. ............................................ 53

Figura 20: Perfil de índice integral de refracción relativo calculado para una micro esfera de 6 𝜇𝑚

a lo largo de la línea diametral azul mostrada en la figura 19C. ...................................................... 54

Figura 21:Mapa 3D de índice integral de refracción relativo una micro esfera de 6um con un

objetivo de 60X ................................................................................................................................ 54

Figura 22: Macrófagos control observados con un microscopio óptico con una magnificación de

60X. En (A) se muestra la medición del diámetro de algunos macrófagos sanos. .......................... 55

Figura 23: A) Reconstrucción en amplitud de macrófagos control con un objetivo de 60x; B)

Reconstrucción de la fase envuelta de macrófagos control; C) Fase desenvuelta del macrófago y

selección de un macrófago individual; D) Mapa de índice de refracción calculado a partir del mapa

de fase, con el valor del diámetro de un macrófago de tamaño promedio y selección del perfil a lo

largo de la línea diametral roja. ....................................................................................................... 56

Figura 24: Perfil de índice integral de refracción relativo calculado para un macrófago control a lo

largo de la línea diametral roja mostrada en la figura 23D. ............................................................ 57

Figura 25: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago control con un

objetivo de 60X. ............................................................................................................................... 57

Figura 26: A) Mapa de fase desenvuelta de macrófagos control y selección de dos de ellos B)

Mapa de índice de refracción calculado a partir del mapa de fase y utilizando el diámetro

promedio de los dos macrófagos seleccionados. ............................................................................ 58

Figura 27: Perfil de índice integral de refracción relativo calculado para dos macrófagos control a

lo largo de la línea diametral roja mostrada en la figura 26B.......................................................... 59

Figura 28: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de dos macrófagos control con un

objetivo de 60X. ............................................................................................................................... 60

Figura 29: Macrófagos que fagocitaron perlas de látex vistos en un microscopio óptico con una

magnificación de 40X. ...................................................................................................................... 60

Figura 30: A) Reconstrucción en amplitud de un macrófago que fagocitó perlas de látex de 3𝜇𝑚

con un objetivo de 60x; B) Reconstrucción de fase envuelta de un macrófago que fagocitó las

microesferas de látex; C) Mapa de diferencia de fase desenvuelta de un macrófago que fagocitó

Contenido XIII

microesferas de látex; D) Mapa de índice de refracción calculado a partir del mapa de diferencia

de fase y del tamaño medido para los macrófagos. ........................................................................ 61

Figura 31: Perfil de índice integral de refracción relativo de un macrófago que fagocitó esferas de

látex a lo largo de la línea diametral roja mostrada en la figura 30D. ............................................. 62

Figura 32: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago que fagocitó 3

esferas de látex, con un objetivo de 40X. ........................................................................................ 62

Figura 33: A) Reconstrucción en amplitud de un macrófago que fagocitó perlas de látex de 3𝜇𝑚

de diámetro; B) Reconstrucción de fase envuelta de un macrófago que fagocitó perlas de látex; C)

Mapa de diferencia de fase desenvuelta de un macrófago que fagocito microesferas de látex; D)

Mapa de índice de refracción calculado a partir del mapa de fase de un macrófago y selección de

3 microesferas. ................................................................................................................................. 63

Figura 34: Perfil de Índice integral de refracción relativo un macrófago que fagocitó esferas de

látex, el perfil diametral se realiza respecto a tres microesferas dentro de la célula como se

muestra en la figura 33D. ................................................................................................................. 64

Figura 35: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago que fagocitó 3

esferas de látex con un objetivo de 40X. ......................................................................................... 64

Figura 36: A) Reconstrucción en amplitud de un macrófago que fagocito muchas microesferas de

látex con un objetivo de 60X; B) Mapa de diferencia de fase envuelta; C) Diferencia de fase

desenvuelta de un macrófago que fagocito gran cantidad de microesferas de látex; D) Mapa de

índice de refracción relativo y señalización de un perfil. ................................................................. 65

Figura 37: Perfil diametral de Índice integral de refracción relativo en un macrófago que fagocitó

gran cantidad de microesferas de látex. .......................................................................................... 66

Figura 38: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago en estado de

fagocitosis de muchas microesferas de látex .................................................................................. 66

Figura 39: Macrófagos infectados después de 24 horas post-infección y el parásito Leishmania en

estado promastigote vistas desde un microscopio óptico con una magnificación de 60X. ............ 67

Figura 40: A) Registro holográfico de un macrófago 24 horas después de la infección por

Leishmania comparado con el registro de un macrófago sano con un objetivo de 60X; B)

Reconstrucción en amplitud de un macrófago infectado después de 24 de la infección; C) mapa de

diferencia de fase envuelta; D) mapa de diferencia de fase desenvuelta de un macrófago

infectado por Leishmaniasis, el círculo roja muestra la posible presencia de una vacuola

parasitófora; E) Mapa de índice de refracción integral relativo de un macrófago infectado y

señalización del perfil sobre la infección. ........................................................................................ 68

Figura 41: Perfil de índice integral de refracción relativo de un macrófago 24 horas después de la

infección. El círculo rojo muestra la posible presencia de una vacuola parasitófora. ..................... 69

Figura 42: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago 24 horas después

de la infección .................................................................................................................................. 70

Figura 43: Mapa de índice de refracción relativo de un conjunto de macrófagos que fueron

expuestos la bacteria 24 horas post infección, la línea azul señala el plegamiento de la membrana

plasmática en la región infectada y la línea naranja el perfil que se realiza a lo largo de dos

macrófagos con diferentes estados de infección que se observa en la figura 44. .......................... 70

Figura 44 : Perfil de un macrófago infectado y un macrófago sano ................................................ 71

XIV


Figura 45: A) Reconstrucción de Amplitud de 3 estados diferentes de infección con un objetivo de

60X; B) Mapa de índice de refracción y selección del perfil que fue realizado donde se percibe

infección. .......................................................................................................................................... 71

Figura 46: Perfil de índice de refracción en función del diámetro para 3 macrófagos donde se

evidencian diferentes niveles de infección. ..................................................................................... 72

Figura 47: Macrófagos infectados después de 48 horas post-infección, imágenes obtenidas con un

microscopio óptico con una magnificación de 60X. ........................................................................ 73

Figura 48: A) Mapa de diferencia de fase envuelta B) Mapa de diferencia de fase desenvuelta del

objeto D) Mapa de índice de refracción relativo integral y señalización del perfil. ........................ 74

Figura 49: Perfil de índice de refracción a lo largo de la línea diametral azul de la figura 47C para

un macrófago infectado. .................................................................................................................. 75

Figura 50: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago 48Horas después de

la infección ....................................................................................................................................... 75

Figura 51: A) Reconstrucción en amplitud de 3 macrófagos infectados después de 48 de infección

con un objetivo de 60X; B) Mapa de diferencia de fase envuelta de 3 macrófagos infectados; C)

Mapa de diferencia de Fase desenvuelta de 3 macrófagos infectados; D) Mapa de índice integral

de refracción relativo de macrófagos infectados y la señalización del perfil. ................................. 76

Figura 52: Perfil de índice integral de refracción relativo de un macrófagos 48 Horas después de la

infección ........................................................................................................................................... 77

Figura 53: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo para dos macrófagos infectados

después de 48 horas de infección. ................................................................................................... 77

Contenido XV

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1: Calibración para una magnificación de 40X. ...................................................................... 46

Tabla 2: Calibración para una magnificación de 60X. ...................................................................... 47

Tabla 3: Diámetro e índice de refracción relativo para diferentes macrófagos .............................. 58

Lista de Símbolos y Abreviaturas

Símbolos con letras latinas Símbolo Término Unidad SI

d Espesor m

k Número de Onda 1

m

n Índice de Refracción Relativo --

Símbolos con letras griegas Símbolo Término Unidad SI

Δφ Diferencia de Fase 𝑟𝑎𝑑

λ Longitud de Onda m

Subíndices Subíndice Término

ncontrol Índice de refracción de un macrófago control medido por MHD

n6um Índice de refracción de una perla de 6μm medido por MHD

n3um Índice de refracción de una perla de 3μm medido por MHD

npoli Índice de refracción del látex de poliestireno medido por MHD

nr-poli Índice de refracción reportado de una microesfera de látex de poliestireno

nrcontrol Índice de refracción reportado de un macrófago control

dmf Diámetro del macrófago que ha fagocitado

Dinfec Diámetro del macrófago infectado

18


Abreviaturas

Abreviatura Término

HD Holografía digital

MHD Microscopía Holográfica Digital

HO Haz Objeto

HR Haz de Referencia

IR Índice de Refracción

Caracterización morfológica de células mediante la Microscopia Holografía

Digital en transmisión Fuera de Eje

19

Introducción

La holografía digital es una técnica óptica que se utiliza para obtener información de un objeto a

partir del registro del patrón de interferencia entre un haz objeto y un haz de referencia para,

mediante la retropropagación de este patrón de difracción generado y utilizando métodos

numéricos, resolver la integral de difracción que está completamente descrita por la

aproximación de la teoría escalar de la difracción [1],como resultado, se obtiene el campo óptico

complejo transmitido por la muestra en estudio, el cual posee la información de amplitud y de

diferencia de fase que porta la información de espesor e índice integral de refracción del objeto,

respectivamente.

El primer montaje holográfico completamente digital fue realizado por U. Schnars y W. P.

Jueptner en 1994, enmarcando el inicio de la Holografía Digital (HD), esto gracias a los desarrollos

tecnológicos que dieron paso a los sensores de estado sólido. Schnars y Jueptner emplearon

dispositivos de registro de estado sólido tales como cámaras CCD (por sus siglas en inglés Charged

Couple Device) y CMOS (por sus siglas en inglés Complementary Metal Oxide Semiconductor)

para registrar hologramas de Fresnel en una configuración experimental fuera de eje. Esto

permitió el registro sin necesidad de un medio fotosensible [2].

Desde el desarrollo de la HD, esta técnica ha sido modificada, mejorada y aplicada en diversas

áreas. Dentro de los avances más relevantes se pueden mencionar algunos tales como:

1. Evolución de los montajes ópticos experimentales para el registro óptico de los hologramas y

algoritmos numéricos de reconstrucción [3-9].

2. Ensayos no destructivos para el análisis de deformación y medición de forma [10-13]

3. Reconstrucción de fase por técnicas generales de corrimiento de fase (phase-shifting) [15-

22].

4. Seguimiento de partículas para diferentes aplicaciones [22-26].

5. Medición de la distribución de índice de refracción de objetos traslúcidos [27-29].

Uno de los avances más relevantes en HD nació con la necesidad de observar objetos

microscópicos, que fue posible al insertar un objetivo de microscopio (OM) en el haz que porta la

información del objeto logrando registrar una magnificación de la onda objeto, lo que dio lugar a

un híbrido entre la HD y la microscopía óptica. Esta nueva técnica es conocida como Microscopía

Holográfica Digital (MHD), la cual ha mostrado ser eficiente para reconstruir la información de

20


topografía e índice de refracción de objetos microscópicos, particularmente muestras traslúcidas.

En 1992 Haddad et al, obtuvieron las primeras imágenes de gusanos parásitos de un diámetro de

40μm causantes de la ascariasis. Adicionalmente, propusieron un método de reconstrucción

numérico para propagar el campo transmitido por el objeto mediante la integral de difracción de

Fresnel-Kirchhoff. Con esto lograron resoluciones transversales de alrededor de 1,4μm con una

longitud de onda λ = 514,5nm [30]. Poco después Poon et al. plantearon una técnica de

microscopía holográfica basada en escaneo en profundidad para el registro a diferentes

profundidades del objeto, con lo que obtuvieron imágenes tridimensionales [31-32].

La MHD enfocada al estudio de sistemas biológicos es un campo reciente y data de hace

aproximadamente 12 años. Esta técnica es atractiva para el estudio de células, ya que es una

herramienta no invasiva que aporta nuevos parámetros en el estudio de objetos biológicos tales

como morfología, índice de refracción y densidad óptica [33,34], y para el estudio en

microestructuras [35]. Los primeros trabajos registrados en el campo de la MHD enfocados a

objetos biológicos fueron desarrollados por Haddad y Poon [36,37]. Ellos lograron incursionar en

una técnica no invasiva que proporcionó información de la amplitud y la fase, con lo cual es

posible determinar el índice integral de refracción, el espesor de la célula, su morfología y su

densidad óptica [38]. Desde entonces se han venido realizando estudios sobre células vivas, por

ejemplo: protozoos, bacterias, células vegetales, células madre, células tumorales, las

interacciones de células bacterianas, espermatozoides y células sanguíneas [39-49].

En el 2006 Kemper Et al. utilizaron la MHD como una herramienta para el estudio de cambios

morfológicos en células tumorales de páncreas para el análisis de los cambios dinámicos en el

citoesqueleto inducidos a las células por fármacos, en este trabajo observaron que los cambios

del índice de refracción están relacionados con el colapso celular, por lo tanto, demostraron que

la MHD es una técnica eficiente para el estudio de células vivas en condiciones de laboratorio

convencionales, sin ningún tipo de daño al objeto [39]. Años después el grupo de Kemper realizó

un estudio dinámico de microorganismos con una célula huésped, presentando una estación de

trabajo holográfico biofotónico que permite la manipulación de bacterias con pinzas ópticas y el

seguimiento de procesos dinámicos. De esta manera propusieron un nuevo dispositivo multiuso,

libre de marcadores para el modelado y análisis cuantitativo de infección de células individuales

[40].

Moon et al. Utilizaron la MHD con la técnica SEOL (Por sus siglas en inglés, Single-exposure

online) para el estudio de células madres y mediante algoritmos numericos realizaron la

reconstrucción tridimensional del frente de onda en el dominio de Fresnel. Entre sus conclusiones

https://es.wikipedia.org/wiki/Ascariasis



21

indican que el sistema propuesto puede ser potencialmente útil para reconocer y clasificar células

madre mediante la reconstrucción de imágenes tridimensionales [41].

La técnica de MHD para el estudio de objetos biológicos tomó fuerza a nivel internacional y

muchos grupos enfocaron sus investigaciones a este campo. Las células más estudiadas hasta

ahora por su simplicidad son los glóbulos rojos humanos, las cuales no poseen núcleo ni

organelos, solo una solución acuosa homogénea de hemoglobina. Entre los resultados con más

impacto se encuentra la investigación del grupo de Rappaz et al., quienes realizaron un estudio

comparativo entre MHD y microscopía confocal usando eritrocitos para el estudio de parámetros

como morfología, volumen, índice de refracción y contenido de hemoglobina, estos parámetros

son de gran importancia para conocer la salud de una célula; la técnica implementada por Rappaz

et al. Alcanzó una resolución a escala nanométrica permitiendo medir de forma no invasiva

algunas propiedades físicas de los glóbulos rojos [42]. El mismo año Mölder et al. realizaron el

conteo de glóbulos rojos sin marcadores mediante holografía digital; el método consistió en

utilizar un hemocitómetro, que contiene una cámara plana de vidrio reticulada en intervalos de

0.1 mm, esta retícula fue usada para contar las células de una muestra de sangre periférica. Los

resultados mostraron que la holografía digital es una técnica útil para el conteo de células con

tanta precisión como el conteo manual, además de ofrecer información cuantitativa de tamaño y

espesor [43]. Más adelante, el mismo grupo realizó un estudio sobre la velocidad de movimiento

en dos y tres dimensiones de los leucocitos, neutrófilos y fibroblastos en diferentes líneas

celulares individuales y grupales, estos fueron estimulados por agentes externos; los resultados

mostraron que el uso de la holografía digital es útil en combinación con el plugin CellTrack de

ImageJ para el seguimiento de poblaciones 2D y 3D (2010), además hizo posible caracterizar y

diferenciar las células de acuerdo a su velocidad de movimiento [44].

Otra aplicación novedosa es el estudio sobre la fertilidad en bovinos; el grupo de Memmolo et al.

logró identificar que ciertas características morfológicas de los espermatozoides pueden ser útiles

para predecir su fertilidad [45]. Un año después Crha et al. Mediante la técnica de MHD

describieron composicional y estructuralmente las cabezas de espermatozoides arrojando

resultados muy interesantes, con esto confirmaron que esta técnica es útil para el estudio de la

fertilidad en todas las especies del reino animal por la similitud morfológica de sus células [46].

La MHD también permite analizar la interacción entre células y patógenos. Algunos parásitos

causan cambios en la morfología, la bioquímica y cambios mecánicos en las células huésped. La

mayoría de estos cambios en la morfología incluyen pérdida o aumento de volumen, en algunas

células como eritrocitos, se aprecian protuberancias conocidas como “Knobs” [47]. Los cambios

bioquímicos incluyen alteraciones en la concentración de hemoglobina u otra proteína. También

es posible ver cambios de pigmentación, vacuolas y crecimiento del patógeno. Estas variaciones

se pueden visualizar y cuantificar por medio de las alteraciones que sufre el frente de onda

22


transmitido por las muestras, donde los cambios de fase son causados por los modificaciones de

densidad y de espesor del espécimen biológico debido a infección o patógenos [48]. Kemper et al.

en el año 2012, proponen una combinación de pinzas ópticas y un modulador espacial de luz

(SLM) con auto-interferencia libre de marcadores para el modelado y análisis cuantitativo de los

diferentes estados de infección en células individuales [48]. Esta aplicación de la MHD permite

obtener imágenes de células vivas en condiciones que simulan un ambiente natural y es

prerrequisito para visualizar procesos biológicos, necesarios para el análisis de las interacciones

dinámicas de microorganismos con una célula huésped, lo cual es de gran utilidad para

comprender los procesos de infección y la respuesta a fármacos [48-49].

Otro de los fenómenos en los que se puede apreciar la interacción entre células es cuando un

patógeno entre al sistema inmune, a cargo de generar respuestas de protección y en donde los

macrófagos son la primera línea de defensa. El proceso de activación del macrófago permite

responder ante un agente extraño y es muy evidente esta interacción célula-parásito en

enfermedades causadas por Leishmania o Salmonella. En el año 2012, I. V. Brito et al. utilizaron

la MHD para el estudio de una enfermedad común en Brasil debida a la infección por Leishmania

braziliensis, ellos lograron identificar diferentes variaciones de fase comparadas con el medio y

las células que los rodean. Este trabajo mostró que es posible identificar parásitos a través de los

mapas de fase con muestras directamente de la sangre [49]. El mismo año, Andrew E. Ekpenyong

et al. Realizaron un estudio de los cambios estructurales de los macrófagos en presencia de

Salmonella, donde los estudios de la distribución del índice de refracción reflejaron una

disminución en células infectadas, con lo cual afirmaron que la reducción del IR está relacionado

con la infección, este hallazgo sugiere que la DHM es útil para el monitoreo libre de marcadores,

lo que proporciona una nueva evaluación para el estudio de antibióticos contra esta bacteria [50].

La Leishmaniasis es una enfermedad olvidada en muchos países que la padecen lo cual es

preocupante ya que actualmente no existen vacunas disponibles y el desarrollo de éstas ha sido

insuficiente debido a la diversidad del parásito, además tiene mecanismos para evadir la

respuesta inmune del hospedero. En la Universidad Nacional de Colombia el grupo Biofísica y

Biología de membrana, ha dedicado varios años a investigaciones direccionadas al estudio del

parasito que genera esta enfermedad, Leishmania [54].

El Grupo de Óptica Aplicada del Departamento de Física, se ha unido al estudio de la

leishmaniasis aportando una técnica no invasiva y libre de marcadores para la cuantificación de

fase apoyada en la MHD, esta técnica alternativa es una aplicación de la interferometría y la

Microscopía Holográfica Digital para el diagnóstico de alteraciones celulares, en particular para la

descripción cualitativa y cuantitativa de los cambios morfométricos y de índice integral de



23

refracción que sufren los macrófagos sanos al ser afectados por algún tipo de infección como la

Leishmaniasis.

A continuación, se hace una descripción acerca del contenido de esta tesis, cuyo objetivo es

abordar los fundamentos teóricos de la microscopía holografía digital en transmisión y aplicarlos

al estudio de la Leishmaniasis. En el capítulo 1 se aborda el fundamento teórico de la Microscopia

Holográfica Digital (MHD) desde el registro hasta la reconstrucción del campo óptico complejo y

por último una descripción de la funcionalidad de los macrófagos y como la Leishmania afecta la

célula hospedera. En el capítulo 2 se realiza la descripción y el desarrollo experimental, la

calibración lateral del sistema óptico y las condiciones experimentales en las que fueron crecidas

las muestras biológicas bajo estudio y finalmente en el capítulo 3 se describen los resultados

obtenidos y el análisis cualitativo y cuantitativo para diferentes estados de infección de

macrófagos infectados mediante la MHD.

24


1 Fundamentos Teóricos

1.1 Microscopía Holográfica Digital

La Microscopía Holográfica Digital (MHD) es la técnica que resulta de la unión entre la

microscopía óptica y la holografía digital, esto se consigue adicionando un objetivo de

microscopio (OM) en el haz que porta la información del objeto, logrando con esto registrar el

frente de onda objeto magnificado. La configuración experimental típica de la MHD para la

observación de objetos traslúcidos, es una configuración en transmisión, fuera de eje,

implementada por medio de un interferómetro tipo Mach–Zehnder modificado, que posee un

OM en el haz que porta la información del objeto (Haz Objeto HO), este haz transmitido por la

muestra, interfiere con el otro haz que no ha interactuado con ella (Haz de Referencia HR),

produciendo un interferograma sobre el sensor de estado sólido CCD con un ángulo θ entre los

haces, como se puede ver en la figura 1.

Figura 1: Interferómetro de Mach-Zehnder modificado para MHD fuera de eje: Laser de He-Ne, (DH1)

Divisor de Haz,(FE) Filtro Espacial,(L) Lente ,(E) Espejo, (OM1) Objetivo de Microscopio 60x / AN 0.65, ,

(OM2) Objetivo de Microscopio 40x / AN 0.45, (Ob) Objeto, (A) Atenuador , (DH2) Cubo Divisor de Haz,

(CCD) Cámara, (HR) Haz de Referencia, (HO) Haz Objeto.

En esta tesis se utiliza la configuración fuera de eje debido a algunas ventajas que posee esta

técnica, tales como: (1) Tener un control del ángulo entre los haces, lo que permite manipular

adecuadamente la frecuencia de las franjas de interferencia y con esto estudiar objetos que

puedan tener diferente nivel de detalle, (2) al momento de reconstruir el holograma se utilizan

técnicas de Fourier que evidencian la aparición del orden cero e imágenes gemelas que para una

configuración en línea están superpuestas y para la configuración fuera de eje, aun estando en

HR

HO 𝜃

HO

HR



25

planos distintos están separadas; facilitando su filtrado en el espacio de Fourier, lo cual simplifica

y minimiza el ruido en la reconstrucción numérica de los hologramas [53].

1.1.2 Registro del campo óptico complejo

La MHD se basa en dos pasos principales: i) registro y ii) reconstrucción del campo óptico

complejo que porta la información de la muestras a estudiar. El registro consiste en grabar el

patrón de interferencia formado entre una onda dispersada o transmitida por el objeto (HO) y

una onda de referencia (HR). Este campo óptico registrado es una cantidad compleja ya que

preserva la información de la diferencia de fase y la amplitud del campo óptico. El segundo paso

consiste en la recuperación de la información del campo óptico a partir de su reconstrucción

numérica, siendo esta una analogía del proceso físico de reconstrucción de un holograma

convencional [54]. Para esto se “ilumina” con una onda numérica este patrón que se registra; el

cual actúa como una rejilla de difracción, así se reconstruye el campo óptico que porta

información del objeto, resolviendo numéricamente la integral de difracción planteada.

En MHD existen 3 planos importantes donde se pueden situar los procesos de registro y

reconstrucción: el primer plano, conocido como Plano-objeto (xo, yo) es donde se encuentra

ubicada la muestra a estudiar; el segundo es el Plano-holograma (xh, yh), donde se realiza el

proceso de registro, donde se graba el patrón de interferencia entre el haz proveniente del objeto

y el haz de referencia, que se corresponde con el sensor de estado sólido (CCD, por sus siglas en

inglés Charge Couple Display o CMOS, por sus siglas en inglés Complementary metal-oxide-

semiconductor), y finalmente el plano-imagen (xi, yi), que es donde se reconstruye el campo

óptico de la imagen real o virtual del frente de onda proveniente del objeto a una distancia z (ver

figura 2).

Figura 2: Planos importantes en la Holografía Digital: Plano Objeto, plano Holograma y plano Imagen

En el proceso de registro se graba la intensidad de la interferencia entre HR y HO en el plano

holograma o plano de la CCD, para escribir matemáticamente lo anterior se define la onda objeto

como:

26


O(xo, yo) = o(xo, yo)exp (iφo(xo, yo)) (1)

La ecuación (1) representa el HO y el subíndice (xo, yo) se refiere al plano objeto, esta onda posee

una amplitud o(xo, yo) y una fase φo(xo, yo). Una representación similar se realiza para el HR,

mediante la siguiente ecuación compleja, proveniente de un plano arbitrario (x, y) :

R(x, y) = r(x, y)exp (iφR(x, y)) (2)

El HO y el HR interfieren en el sensor, por lo tanto la intensidad grabada allí será proporcional al

módulo cuadrado de la superposición de los dos campos [54]:

I(xh, yh) = |O(xh, yh) + R(xh, yh)|2

I(xh, yh) = |O(xh, yh)|2 + |R(xh, yh)|

2 + R∗(xh, yh)O(xh, yh) + O∗(xh, yh)R(xh, yh) (3)

Donde el subíndice (xh, yh) se refiere al plano holograma, el término |O|2 = OO∗ es la intensidad

de HO y |R|2 = RR∗ la intensidad del HR y representa la porción de onda que no fue difractada

por el objeto; a la suma de estas dos intensidades se le da el nombre de orden cero de difracción

o término DC.

La ecuación (3) también se puede escribir como:

I(xh, yh) = |O(xh, yh)|2 + |R(xh, yh)|

2 + 2√|O(xh, yh)|2|R(xh, yh)|

2 cos[φo(xh, yh) − φR(xh, yh)]

(4)

En la anterior ecuación el tercer término de la derecha corresponde al término de interferencia y

contiene la modulación cosenoidal cos[φo(xh, yh) − φR(xh, yh)], la cual contiene la diferencia de

fase entre el HR y el HO y es el que permite distinguir entre holografía y fotografía, ya que en ésta

última solo se graban intensidades más no las diferencias de fase.

1.1.3 Reconstrucción del campo óptico complejo

Como se mencionó anteriormente, el proceso de reconstrucción consiste en multiplicar el patrón

de interferencia registrado I, por una onda similar a la onda de referencia con la que fue grabado,

por lo tanto, para reconstruir una imagen real o virtual no distorsionada de este campo óptico es

necesario multiplicar la ecuación (4) por una onda numérica R (similar a la onda de referencia con



27

que fue grabado el holograma y por simplicidad numérica típicamente se asume de amplitud

igual a uno y con fase conocida):

RI(xh, yh) = R[|O(xh, yh)|2 + |R(xh, yh)|

2 + 2R√|O(xh, yh)|2|R(xh, yh)|

2 cos[φo(xh, yh) − φR(xh, yh)]]

(5)

Por simplicidad reescribiendo esta ecuación a partir de la ecuación (3):

RI(xh, yh) = R|O(xh, yh)|2 + R|R(xh, yh)|

2 + R(R∗(xh, yh)O(xh, yh)) + R(O∗(xh, yh)R(xh, yh))

(6)

El término R|O(xh, yh)|2 es proporcional a la intensidad de la onda objeto, el siguiente término

R|R(xh, yh)|2 es proporcional a la intensidad de la onda de referencia y no posee información del

objeto, estos dos términos conforman el orden cero de difracción como se mencionó

anteriormente; el termino R(R∗(xh, yh)O(xh, yh)), posee información de la amplitud del objeto

(ya que |R|2 = RR∗ ≈ 1), lo que representa la generación de una imagen real a una distancia z en

el plano anterior al plano del sensor. El último término 𝑅(xh, yh)R(xh, yh)) es proporcional al

complejo conjugado de la amplitud de la onda objeto (ya que |R|2 = R ∙ R ≈ 1), se refiere a la

generación de una imagen virtual en el plano posterior al plano del sensor, localizado a una

distancia z del plano holograma.

Figura 3: Ordenes de Difracción: (1) Representa la imagen real a una distancia z en el plano anterior al

plano del sensor, (O) corresponde al orden cero de difracción, (-1) Representa la imagen virtual en el

plano posterior al plano del sensor, a una distancia z del plano holograma.

En el proceso de reconstrucción digital, se calcula numéricamente la distribución de amplitud y

fase que se obtendría en el plano imagen, bajo la condición de que una onda de referencia plana

y uniforme (o esférica como en el caso de esta tesis) incide sobre el holograma registrado como

28


se representa en la ecuación (5). Dicha estructura se representa en el sistema de despliegue

(pantalla de monitor) como una imagen difractada [54], este proceso es el equivalente al que

proporcionaría una apertura Ʃ cuando es iluminada por una fuente puntual esférica en una

geometría unidimensional.

Para el análisis que viene denominaremos 𝐸 al campo que resulta del producto de la intensidad

registrada 𝐼 multiplicado por la onda de referencia 𝑅, es decir: 𝐸 = 𝐼 ∙ 𝑅 y utilizando la teoría

escalar de la difracción, el campo proveniente S se describirá en algún punto en Ʃ por medio de la

ecuación (ver figura 4):

EƩ = ERei(kr′−ωt)

kr′ (7)

Donde el campo en un punto L detrás de la apertura Ʃ es

EL = −1

4πEse

−iωt ∫e[ik(r+r′)]

rr′ƩdƩ(r̂ + r ′̂). n̂ (8)

Donde n̂ representa el vector unitario direccional normal al plano de la apertura y r y r’ los

vectores posición de L y S respectivamente. La expresión (8) puede interpretarse a partir del

principio de Huygens, donde el campo para un punto en la apertura da lugar a una onda

proporcional a:

−ieikr

4πr(r̂ + r ′̂). n̂ (9)

El término 1

2(r̂ + r ′̂). n̂ llamado factor de oblicuidad (porque describe la inclinación de r’ respecto

a n̂), se convierte en r ′̂. n̂ o −r ′̂. n̂ en la teoría de Rayleigh–Sommerfeld dependiendo de las

condiciones de frontera de la pantalla. Cuando la propagación es paraxial, el factor de oblicuidad

se acerca a 1 debido a que el ángulo θ es muy pequeño, por lo tanto, el campo óptico en el punto

L es:

EL = −i

2π∫ EƩ

e(ikr)

rƩdƩ (10)



29

Figura 4: Geometría de la fórmula de

Difracción Fresnel-Kirchoff. S es la fuente

puntual y L el punto de observación

(tomada y modificada de [55]).

Considerando una geometría más aproximada (Figura 4), se puede considerar el campo óptico de

entrada como Eo(xo, yo; 0) en el plano de entrada Ʃo, es decir, en z = 0 y el campo de salida

como E(x, y; z) en el plano Ʃ a lo largo de la dirección z, reescribiendo la ecuación 10 se tiene:

E(x, y; z) = −ik

2π∬ Eo(xo, yo; 0)

eikr

r dxodyoƩ0

= −ik

2πz∬ Eo(xo, yo; 0) e

[ik√(x−xo)2+(y−yo)2+z2]

Ʃ0dxodyo (11)

Adicionalmente se realiza una aproximación de r ≈ z en el denominador, pero no en el

exponente ya que afectaría abruptamente la componente de fase, lo cual implica una

aproximación más fina como se realiza en la aproximación de Fresnel [56], reescribiendo la

ecuación (11), se puede apreciar que ésta es la integral de una convolución del campo de entrada

Eo con una apertura circular SH:

E(x, y; z) = Eo ⊗ SH (12)

Siendo el kernel de propagación SH(x, y; z) = −ik

2πze[ik√x2+y2+z2]

La ecuación (12) también se le conoce como la Función de Punto Extendido (PSF por sus siglas en

inglés Point Spread Function) o Función respuesta al impulso, más precisamente, esta es una

función de dispersión coherente, conocida como PSF de Huygens [55].

s

L

30


Figura 5: Geometría para la

difracción a través de una

apertura 3D. (tomada y

modificada de [55])

Existen varios métodos para la solución aproximada de la ecuación (11) por medio de algoritmos

de reconstrucción numérica en función de la distancia 𝑧. El tipo de aproximación varía según la

geometría y el tamaño del objeto a estudiar, es decir, de su aplicación; por ejemplo, en objetos

que se encuentran en el campo lejano, 𝑧 se considera grande si 𝑧 ≫ 𝜆 (𝜆 longitud de onda de la

iluminación), por lo que el campo difractado por el objeto se reconstruye en el regimen de

Fraunhofer por medio de ondas esféricas a distancias muy grandes comparadas con la longitud de

onda 𝜆 [3]. Para campo medio (𝑧 > 𝜆) se considera la zona de Fresnel mediante la utilización de

un frente de onda esférico [56] y por último para distancias cortas (𝑧~𝜆), normalmente se utiliza

el algoritmo denominado espectro angular, que utiliza la descomposición del frente de onda en

un conjunto de ondas planas [11]. La forma adecuada para elegir la zona de trabajo depende de

las dimensiones del objeto bajo estudio, la configuración experimental y la longitud de onda

utilizada.

En la presente tesis para la propagación del campo óptico complejo se utilizó el algoritmo del

espectro angular, ya que las distancias de reconstrucción son muy cortas (del orden de los

micrómetros o menos), debido a la introducción de los elementos formadores de imagen ales

como objetivos de microscopio en los haces objeto y referencia (llamados OM1 y OM2,

respectivamente), quienes forman la imagen en un plano muy cercano al plano holograma, así

como también afecta el hecho del tamaño microscópico de los objetos en estudio. Analíticamente

el algoritmo del espectro angular es equivalente a la convolución de Huygens con ondas planas,

por lo que permite que el algoritmo de espectro angular sea más intuitivo, pero también conduce

a cálculos robustos.



31

Para aplicar el algoritmo del espectro angular se inicia tomando un campo de entrada

Eo(xo, yo; 0) cuya Transformada de Fourier (TF) es:

Ao(kx, ky; 0) = ℑ[Eo] =1

2π∬ Eo(xo, yo; 0) e[−i(kxxo+kyyo)] dxodyo Ʃ0

(13)

La ecuación anterior describe la contribución de las ondas planas que componen el frente de

onda que se va propagar en el espacio de las frecuencias. Por lo tanto, el campo de entrada

Eo(xo, yo; 0) será la TF inversa del espectro angular en el espacio de las coordenadas.

Eo(xo, yo; 0) = ℑ−1{Ao} =1

2π∬Ao(kx, ky; 0) e[i(kxxo+kyyo)]dkxdky (14)

La exponencial compleja e[i(kxxo+kyyo)] es la proyección en el plano (xo, yo; 0) de una onda plana

propagándose a lo largo del vector �⃗� = (kx, ky, kz) donde kz = √k2 − kx2 − ky

2

Figura 6: Propagación de una Componente de

onda plana en el espectro angular (tomada y

modificada de [55]).

En consecuencia, el campo de entrada Eo(xo, yo; 0) puede verse como una proyección de muchas

ondas planas propagándose en varias direcciones �⃗� = (kx, ky, kz) con la amplitud compleja de

cada componente Ao(kx, ky; 0), después de la propagación a una distancia z cada onda adquiere

un factor de fase e[ikzz] por lo tanto el campo de salida a una distancia 𝑧 ≠ 0 es:

E(x, y; z) =1

2π∬ Ao(kx, ky; 0) e[i(kxx+kyy+kzz)] dkxdkyƩo

(15)

Por lo anterior se puede concluir que el campo de salida es

E(x, y; z) = ℑ−1 {ℑ{E0}.e(i√k2−kx

2−ky2𝑧)

} (16)

Al observar la ecuación (16) se concluye que [55]:

32


1. La ecuación (16) es una representación general de la propagación de un campo entre dos

planos arbitrarios, en particular para la MHD el plano de entrada es el plano imagen

(xi, yi) y el plano de salida (xh, yh) es el plano holograma que es donde se encuentra la

CCD como están representados en los planos importantes en la Holografía (figura (2)).

2. El factor de la raíz cuadrada debe cumplir con que kx2 + ky

2 ≤ k2 es decir que la

difracción impone un filtro pasabajo en las frecuencias espaciales del campo de entrada;

por lo tanto, solo pasarán los detalles más finos que superen la longitud de onda utilizada

y solo estas se propagan en el campo cercano.

3. El algoritmo del espectro angular está basado en las propiedades fundamentales de la

Transformada de Fourier (TF) y no involucra condiciones de frontera de las fuentes

puntuales, por lo que no son necesarias las aproximaciones en la integral de difracción.

4. El principio de Huygens y la teoría de Rayleigh –Sommerfeld están construidas desde el

comportamiento de ondas esféricas puntuales, las cuales inherentemente involucran

singularidades de la fuente puntual; pero la física de la difracción por espectro angular

está construida desde un conjunto de ondas planas las cuales por definición se

comportan muy bien en el espacio evitando singularidades espaciales.

El resultado del espectro angular como se vio anteriormente, también es el equivalente al

resultado de una convolución. Cuando se expanden los términos de la ecuación (15) y

reemplazando la ecuación (13) se puede observar que el campo de salida E(x, y; z) expandido,

toma la siguiente forma:

𝐸(x, y; z)

=1

(2π)2∬ E0(x0, y0; 0)dx0dy0 ∬ ei[kx(x−x0)+k𝑦(y−y0)]e

(i√k2−kx2−ky

2𝑧)dkxdky

Ʃo

Ʃo

Que se puede reescribir como:

𝐸(x, y; z) =1

2π∬ E0(x0, y0; 0)dx0dy0 ℑ

−1 {e(i√k2−kx

2−ky2𝑧)

} Ʃo

(17)



33

Nótese que:

ℑ {e(i√k2−kx

2−ky2𝑧)

} = SH

Donde ⊗ es la convolución de un frente de onda plano con una apertura [54,55].

𝐸(x, y; z) = E0 ⊗ SH (18)

Es decir, el campo reconstruido se puede nuevamente considerar como el resultado de una

convolución. La versión discreta de la ecuación (15) está asociada a los procesos digitales de

registro holográfico por medio de una matriz de pixeles y reconstrucción numérica del campo. El

sensor discretiza el patrón en un arreglo rectangular de Nx x Ny pixeles y el tamaño de cada pixel

(∆x, ∆y). En consecuencia, el arreglo de pixeles en el plano holograma estará determinado por

(l∆kx, k∆ky

) y los pixeles en el plano imagen estarán determinados por (m∆x, n∆y), donde

𝑚, 𝑙 = 0,1…Nx − 1 y 𝑛, 𝑘 = 0,1…Ny − 1. Con 𝑛,𝑚, 𝑙, 𝑘 contadores de las coordenadas discretas

para cada dirección. Por lo tanto, la ecuación (15) se puede escribir en la forma discreta.

E(m∆x, n∆y, z) =1

2π∑ ∑ Ao (l∆kx

, k∆ky; z)

Ny−1

k=0

Nx−1

l=0

e[i(l∆kxm∆x+k∆kyn∆y)]

(19)

Utilizando las siguientes relaciones del tamaño de pixel en el plano imagen y el tamaño del pixel

en el plano holograma [58]:

∆x=λz

Nx∆kx

; ∆y=λz

Ny∆ky

La expresión discretizada queda

E(m∆x, n∆y, z) =1

2π∑ ∑ Ao (l∆kx

, k∆ky; z)

Ny−1

k=0Nx−1 l=0 e

iλz(lm

Nx+

kn

Ny) (20)

La ecuación anterior describe la Transformada Discreta de Fourier del espectro angular que

corresponde a la amplitud compleja del campo óptico, el cual permite la reconstrucción numérica

tanto en intensidad como en fase punto a punto del objeto. La distribución de intensidad

correspondiente a la distribución compleja E(m∆x, n∆y, z) está determinada por:

I(m∆x, n∆y, z) = |E(m∆x, n∆y, z) |2

= [𝐑𝐞|E(m∆x, n∆y, z) |]2+ [𝐈𝐦|E(m∆x, n∆y, z) |]

2 (21)

34


Donde 𝐑𝐞 corresponde a la parte real y 𝐈𝐦 a la parte imaginaria. Para el cálculo numérico de la

distribución de fase se utiliza la relación:

ϕ(m∆x, n∆y, z) = 𝑎𝑟𝑐𝑡𝑎𝑛 {𝐈𝐦[E(m∆x, n∆y, z)]

𝐑𝐞[E(m∆x, n∆y, z)]} mod(2π) (22)

El término 𝑚𝑜𝑑(2𝜋) describe la discontinuidad de la función 𝑎𝑟𝑐𝑡𝑎𝑛, esto significa que la fase

presenta discontinuidades en múltiplos enteros de 2𝜋, a esta se le llama la fase envuelta. Para

obtener las variaciones continuas de la fase se hace necesario remover estas discontinuidades, a

este proceso se le llama desenvolvimiento de fase [58-60].

1.1.4 Información de los mapas de diferencia de fase

Para los fines de esta tesis, la información más relevante que brindan los mapas de diferencia de

fase ∆ϕ calculados por la técnica de MHD son: el cálculo del índice de refracción relativo 𝑛(𝑟 )

para todos los puntos 𝑟 (𝑥, 𝑦, 𝑧) de las células en estudio y, su espesor ℎ(𝑥, 𝑦) en cada punto de

ella.

La expresión general que describe los cambios de fase que sufre un haz al atravesar una muestra

biológica con índice de refracción relativo 𝑛(𝑟 ) y longitud de camino óptico ∆d⃗⃗ ⃗⃗ (𝑥, 𝑦, 𝑧) está dada

por [40]:

∆ϕ(𝑟 ) = �⃗� ∙ ∆d⃗⃗ ⃗⃗ (𝑥, 𝑦, 𝑧) (23)

Donde la diferencia de camino óptico se define como ∆𝑑(𝑟 ) = ∫ 𝑛(𝑟 )ℎ

0𝑑𝑟, ya que Las variaciones

internas de índice de refracción en un medio traslúcido, causan diferencias en la longitud de

camino óptico ∆𝑑 y |�⃗� | = 2𝜋

λ, con �⃗� el vector de onda, que indica la dirección de la misma.

En particular para el caso hipotético de un objeto esférico de diámetro 𝑑 e índice de refracción

uniforme 𝑛𝑐, inmerso en un medio de índice de refracción 𝑛𝑚, la longitud de camino óptico se

simplifica como ∆𝑑 = (𝑛𝑐 − 𝑛𝑚) ∙ 𝑑, donde el término 𝑛𝑐 − 𝑛𝑚 representa el índice relativo de

refracción local del objeto en un medio de índice de refracción 𝑛𝑚. Por lo anterior, el haz

transmitido a través de él, sufrirá un cambio de fase:

∆ϕ =2𝜋

λ∙ (𝑛𝑐 − 𝑛𝑚) ∙ 𝑑 (24)

Como se ilustra en la figura 7.



35

Figura 7 Dibujo esquemático de una célula esférica, la

cual presenta un cambio en el frente de onda ∆ϕ que

pasa por el objeto, donde nm es el IR del medio donde

está inmersa la célula, nv el IR del vidrio, d es el

diámetro de la célula y nc el IR de la célula (Tomada y

Modificada de [61]).

De la ecuación (23) y la definición de la diferencia de camino óptico, se tiene que:

∆ϕ(𝑟 ) =2𝜋

λ∙ ∫ 𝑛(𝑟 )

ℎ

0𝑑𝑟 (25)

La ecuación anterior evidencia que los valores de índice de refracción y espesor son cantidades

que están acopladas dentro de la información de la fase, es decir que ambas variables son

aportantes a la fase, pero no de forma independiente, por lo tanto, es necesario conocer una de

las dos cantidades por alguna técnica alternativa y con ella calcular la otra o implementar alguna

técnica teórico-experimental para desacoplarlas como en[62-63]; para esta tesis inicialmente, el

tamaño de las microesferas y de los macrófagos se midieron por microscopía óptica asumiendo

que las células poseen morfología con simetría esférica[64], como se observa en la figura 7.

Por lo tanto, con el mapa de fase reconstruido por MHD y el valor de 𝑑 medido por microscopía

óptica se puede calcular el índice de refracción para los diferentes objetos a estudiar.

1.2 Relación macrófago - Leishmania

Los macrófagos forman parte del sistema inmune del cuerpo de cualquier animal, estas células

son un tipo de glóbulo blanco que reside en muchos órganos y tejidos que dependiendo de su

localización reciben nombres diferentes como macrófagos alveolares en el pulmón, células de

angerhan en la piel, macrófagos peritoneales del peritoneo, etc. y se originan a partir de los

monocitos que están en la sangre, los cuales son descendientes de la médula ósea. Los monocitos

maduros en ocasiones son estimulados y pasan hacia los tejidos cambiando su tamaño

considerablemente y adquiriendo la función de fagocitosis necesaria para digerir residuos,

patógenos y antígenos antes de que causen algún efecto en el cuerpo [65]. Para que ellos tengan

nv

36


una función fagocítica es necesario que posean receptores en la membrana plasmática y puedan

detectar microorganismos mediante la quimiotaxis y además posean un sistema químico y

enzimático microbicida para exterminar el agente extraño. Cuando los macrófagos se activan

cambian drásticamente su morfología y su bioquímica, entre los cambios más relevantes están el

plegamiento de la membrana plasmática y el aumento del contenido de enzimas del macrófago.

Una vez fagocitado el microrganismo se forma el llamado fagosoma ( Compartimiento rodeado

de membrana al interior de la célula que reorganiza el macrófago luego de la fagocitosis

cambiando con respecto al control y es de esmerarse que resulte una alteración de las

propiedades físicas), que entra en contacto con los lisosomas con la finalidad de destruir los

microorganismos [66].

Figura 8: Etapas de la fagocitosis de un macrófago en presencia de un patógeno (tomada y modificada de [67])

Existen enfermedades que representan riesgos graves para quienes las padecen, más aún para

aquellas que no se conocen curas o vacunas, según la bibliografía consultada[66] esto es lo que

sucede con leishmaniasis, mayormente debido a la variedad del parásito y su sagacidad para

evadir la defensa del macrófago. Leishmania es un protozoo y en su ciclo de vida adopta dos

morfologías promastigotes y amastigotes. El promastigote posee un núcleo central y un flagelo

largo para facilitar su movilidad dentro del vector y se aloja en el intestino del insecto para luego

movilizarse hacia la boca y contagiar al momento de la picadura, ellos están presentes en la

primera etapa de infección cuando el mosquito infectado entra en contacto con la piel de una

persona. Luego es fagocitado por macrófagos y confinado en un fagosoma que madura hasta una

interfase entre endosoma tardío y lisosoma. El parásito está adaptado al ambiente ácido de este

compartimiento y tolera la actividad protelítica del mismo al punto que usa el cambio de pH y de



37

temperatura para convertirse a su estado replicativo al interior del macrófago, el amastigote

[68,69].

Los amastigotes son inmóviles y tienen forma esférica de 1,5 μm a 5 μm de diámetro, no son

flagelados y están presentes en el macrófago del hospedero mamífero (hombre o animal

reservorio) y son estructuras defáciles visualizar por microscopía óptica utilizando coloración. Los

amastigotes se dividen dentro de la vacuola parasitófora (fagosoma) por fisión binaria o

bipartición provocando su lisis y liberando otros amastigotes, los cuales son nuevamente

fagocitados por otros macrófagos haciendo que el ciclo se repita, pasando el parásito de un

hospedero a otro [69].

Se conocen al menos 20 especies diferentes de Leishmania y dos tipos de clasificación

taxonómica del nuevo mundo, en su primera clasificación se encuentran los subgéneros (L)

Leishmania y (V) Viannia. La Leishmanisis se manifiesta con formas clínicas variadas: leishmaniasis

cutánea, muco-cutánea o visceral [68]. La forma visceral de la enfermedad es causada

principalmente por la Leishmania (L) Chagasi cuyo vector es el flebótomo Lutzomia Longipalpis.

La forma cutánea y muco-cutánea es debida a Leishmania (V) brazilensis transmitida por Lutzomia

spinicrassa. Esta enfermedad se manifiesta con formas clínicas variadas, entre las patologías más

comunes están: La forma cutánea y muco-cutánea es debida a Leishmania (V) brazilensis [70].

Figura 9: Ciclo de vida de la leishmaniasis en la etapa humana y la etapa reservorio (tomada y modificada [69]).

38


La leishmaniasis afecta aproximadamente a 12 millones de personas en el mundo con 1,5 a 2

millones de nuevos casos cada año [71]. Es una enfermedad endémica en las regiones tropicales y

subtropicales de 88 países; 72 de los cuales están en vía de desarrollo. Está en 24 países de

América, extendiéndose desde el sur de Estados Unidos (Texas) hasta el norte de Argentina [69-

72]. En los últimos años el número de casos de leishmaniasis ha aumentado posiblemente debido

a los cambios climáticos, lo que convierte a esta enfermedad en un problema de salud pública. En

Colombia, se reporta como endémica en el 50% del territorio colombiano y es preocupante

debido al incremento de casos de leishmaniasis cutánea que se viene registrando desde 2003. En

nuestro país se han encontraron 2 formas nuevas de Leishmania procedentes de otros países y

esto es producto de la migración de personas o por la importación de vegetales y frutas. Por lo

tanto, en el país se reportan 7 tipos distintos de Leishmania donde cada una de ellas necesita ser

identificada para brindar un procedimiento adecuado. El método de diagnóstico más común para

detectar la Leishmania es el frotis y consiste en una muestra de sangre esparcida sobre un

portaobjetos o en el caso de la Leishmania visceral, con el tacto es posible descubrir si el bazo, el

hígado y los ganglios linfáticos están agrandados. También se pueden realizar los siguientes

exámenes clínicos: de médula ósea, biopsia del hígado, biopsia de piel y realizar el cultivo de las

respectivas biopsias para detectar el parasito o, pruebas moleculares para amplificar su material

genético. Los tratamientos disponibles son derivados del antimonio como antimoniato de

meglumina, estibogluconato de sodio y algunas sales de antimonio pentavalente, pero se ha

reportado resistencia del parasito y falla terapéutica [72].



39

2. Implementación teórico -Experimental de la Técnico de MHD

Esta sección describe la técnica teórico-experimental implementada en la presente tesis, la cual

consta básicamente de: una parte netamente experimental, la cual se inicia implementando el

montaje óptico necesario para el registro de los hologramas y una parte teórica de reconstrucción

del campo óptico registrado utilizando métodos numéricos.

2.1 Procedimiento Experimental:

Para el registro digital de los hologramas se implementó un montaje óptico tipo interferómetro

de Mach-Zehnder (MZ) modificado, en una configuración en transmisión para microscopía

holografía digital fuera de eje, para el estudio de muestras biológicas traslúcidas. Dado que estas

muestras típicamente no son sólidas y deben conservarse en medios acuosos y para su

observación in vitro no se fijan ni se secan [75], es necesario modificar la arquitectura del

montaje óptico iluminando verticalmente las muestras. Para esto, se implementó el

interferómetro de MZ en una configuración vertical, como se muestra en la figura 10. Esta

configuración vertical del MZ tiene la ventaja de facilitar la manipulación de las muestras

biológicas en estudio; sin embargo, la estabilidad mecánica decrece, por esto es necesario

diseñar el interferómetro con brazos muy cortos, lo que dificulta su alineación.

Figura 10:Montaje óptico del interferómetro de MZ en configuración vertical para Microscopía Holográfica Digital Fuera de eje: Laser, (F.E) Filtro espacial; (L.C) Lente colimadora; (D.H1, D.H2) Divisor de Haz 50%,50% no polarizados; (P) Atenuador; (OM1) Objetivo de Microscopio del haz de referencia 40X/AN=0,45; (OM2) Objetivo de Microscopio del haz objeto 60X/AN=0,65; (E1, E2) espejos de primera cara; CMOS sensor de estado sólido 1280x1024 y 5,4 μm de tamaño de píxel.

Como fuente de luz coherente se utilizó un láser de He-Ne de 632.8nm de longitud de onda y 35mW de potencia, el cual se hace pasar por un sistema de colimación que consta de un filtro

40


espacial que tiene un OM de 20X/AN=0.40 y un pinhole de 10μm con la finalidad de limpiar el haz y filtrar las frecuencias altas y, una lente colimadora, logrando con esto un frente de onda aproximadamente plano en amplitud y fase. Esta onda plana se hace pasar por un divisor de haz (DH1), el cual lo divide en dos. Una parte es transmitida y sigue horizontalmente hasta llegar al espejo (E2) quien lo direcciona verticalmente hacia arriba para iluminar el objeto, este frente de onda es modificado en fase al atravesar la muestra en estudio y posteriormente es magnificado mediante un OM de 60X/AN= 0.65; a este haz se le conoce como haz objeto HO, como se muestra en la siguiente figura.

Figura 11: Iluminación vertical de la muestra bajo estudio

La otra parte del haz, la reflejada por el divisor DH1, es direccionada verticalmente y redirigida

por un espejo (E1) hacia otro objetivo de microscopio con magnificación de 40X/AN=0.45, que lo

convierte en un frente de onda esférico, este es el haz HR. Por último, un segundo divisor de haz

DH2 recoge la información de la onda transmitida por el objeto HO y la onda que no interactuó

con el objeto HR, para dirigirlas hacia el sensor CMOS, en donde se registra el patrón de

interferencia resultante de la superposición entre estos dos haces. Al registro de este patrón de

interferencia se le da el nombre de holograma registrado.

Es de notar que en este montaje se utilizó como haz de referencia una onda esférica con la

finalidad de controlar la variación de frecuencia y curvatura de los portadores esféricos, esto

simplifica el filtrado de Fourier al momento de la reconstrucción numérica.

HO



41

2.2 Reconstrucción del campo óptico complejo:

La reconstrucción del holograma consiste en la decodificación de la información recolectada, el

cual porta toda la información del objeto en amplitud y fase. El proceso de reconstrucción es

posterior a la digitalización y almacenamiento del holograma registrado en el sensor de estado

sólido como una matriz numérica que contiene toda la información del campo óptico transmitido

por el objeto.

El primer paso para la reconstrucción consiste en la implementación de la componente teórica

mediante la plataforma Matlab® y la eliminación del ruido producida por la imagen gemela y el

orden cero de difracción. Este proceso se le denomina Filtrado de Fourier, ya que para llevarlo a

cabo más fácilmente se pasa al espacio de Fourier; donde quedan separadas las frecuencias

correspondientes a los tres órdenes de difracción. Estos tres órdenes; (0), (1) y (−1),

corresponden al orden cero y las imágenes gemelas reconstruidas, virtual y real

respectivamente, las cuales están separadas espacialmente en holografía fuera. El filtrado en el

espacio de las frecuencias se logra aplicando un filtro pasa banda, cortando las frecuencias altas

del orden cero y las frecuencias bajas de la imagen gemela aplicando una máscara de ceros y

dejando solo la información seleccionada.

Esta porción de campo filtrado es centrada y retropropagada para obtener la imagen virtual

enfocada estará localizada donde estaba el objeto en el momento de registro a una distancia z

(ver figura 3), utilizando el algoritmo del espectro angular descrito en el capítulo anterior y así

reconstruir el campo óptico complejo que porta la información de las muestras en estudio. A

partir de este, y usando las ecuaciones (21) y (22) obtener los mapas de amplitud y de fase.

2.2.1 Compensación de alteraciones de fase:

Como parte del proceso numérico de reconstrucción del campo óptico que porta la información

del objeto, se deben compensar las posibles alteraciones que éste haya sufrido durante el

proceso de registro.

Debido a que la técnica de MHD requiere de la introducción de un objetivo de microscopio (OM)

en el brazo del HO para magnificar el objeto microscópico a estudiar y que para el montaje óptico

de esta tesis se introdujo otro OM en el HR, es necesario tener en cuenta la afectación de estos al

campo óptico registrado. Estos objetivos de microscopio introducen a cada uno de los haces una

curvatura adicional, que no corresponde a información real del objeto y además, cada OM

introduce aberraciones ópticas que alteran la calidad de la imagen (lo cual se revierte en

alteraciones en la fase del campo). Por lo tanto, los valores de las diferencias de fase no serán las

correctas. Para compensar dichas alteraciones de fase se han implementado distintas técnicas

tanto teóricas como experimentales [76]. En este trabajo se realizó la compensación de estas

alteraciones de fase de manera experimental, utilizando la técnica del holograma de referencia

[77]. Para tal fin, en cada caso se hace el registro del holograma (HO+HR+O) y luego se registra un

42


holograma de referencia sin objeto (HO+HR, sin objeto). Posteriormente se realiza el proceso de

reconstrucción descrito anteriormente a los dos hologramas, para obtener sus respectivos mapas

de diferencia de fase y finalmente se realiza la resta punto a punto de los dos mapas de fase

calculados, eliminando de esta forma las curvaturas indeseadas (llamadas alteraciones de fase) y

las aberraciones introducidas por el sistema óptico al sistema.

En la figura 12 se muestra un diagrama de flujo que resume el proceso numérico de

reconstrucción del campo óptico, incluyendo la compensación de las alteraciones de fase

descritas en el apartado anterior; dicha implementación se realizó bajo la plataforma Matlab®:



43

Figura 12:Esquema del proceso de reconstrucción incluyendo la compensación de curvatura

44


Teniendo la información digitalizada de los hologramas completo (con objeto) y holograma de

referencia (sin objeto), el primer paso consiste en filtrarles la información no deseada del orden

cero de difracción y de la imagen gemela, este filtrado se realiza en el espacio de Fourier tal como

se describió anteriormente, posteriormente, para regresar al espacio de las coordenadas se

aplica la transformada inversa (IFT) de Fourier, a estos se les denomina hologramas filtrados (a

ambos: al holograma con objeto y al holograma sin objeto). Posteriormente con estos

hologramas filtrados se procede a la reconstrucción de sus respectivos campos ópticos, para esto,

dichos hologramas filtrados se propagan utilizando el algoritmo del espectro angular descrito en

la sección 1.1.3, con esto se tienen los campos ópticos complejos de los hologramas con y sin

objeto. Finalmente, utilizando la ecuación (21) se obtiene la intensidad de los campos

reconstruidos y con la ecuación (22) se obtienen sus respectivos mapas de fase envueltos. Por

último, estos dos mapas de fase obtenidos son restados punto a punto con la finalidad de

compensar la curvatura y aberraciones introducidas por los OM tal como se describió en la

sección anterior. Como resultado se obtiene un mapa de fase envuelto que porta únicamente

información propia del objeto. Este mapa de fase envuelto se somete a un algoritmo de

desenvolvimiento que consiste en remover las singularidades módulo 2π utilizando la técnica de

mínimos cuadrados, basado en la norma L0 mínima propuesto por Ghiglia [58]. Este método fue

implementado por el Grupo de Óptica del Instituto de Física de la Universidad Nacional de

Rosario (Argentina) [78] y fue el que se utilizó en esta tesis; este algoritmo tiene la posibilidad

remover todas las singularidades y además minimiza los problemas de ruido por lo que es un

algoritmo robusto que no depende de la trayectoria seguida en la remoción de las

discontinuidades.

Para todos los hologramas mencionados en esta tesis, se realizó el mismo proceso de

reconstrucción de intensidad y de fase

2.3 Calibración lateral:

Como parte del proceso experimental, es necesario realizar una calibración lateral con la finalidad

de cuantificar las características de los objetos a describir; para esto se realizó el registro y

reconstrucción de un holograma de la tarjeta de calibración lateral USAF 1951 de alta resolución

de amplitud en positivo [79], con la cual se calculó el factor de calibración de pixeles a unidades

métricas para magnificaciones de 40X y 60X.



45

Figura 13: Reconstrucción en amplitud y fase de barras que van en espesor desde 3.91𝜇𝑚 hasta 0.78 𝜇𝑚 y que

corresponden a los Grupos 7, 8 y 9 de la Tarjeta USAF de alta resolución con magnificación de 40X.

Para la magnificación de 40X se registran los hologramas y se reconstruyen los mapas de amplitud

y fase de la tarjeta de calibración lateral USAF 1951 y se calculan los anchos de los pares de líneas

en la reconstrucción de amplitud de los grupos y elementos que van desde 1,56 𝜇𝑚 hasta 1,96 𝜇𝑚

que corresponden al grupo 9 (En estas tarjetas de alta resolución, el grupo 9 contiene solo 3

elementos, mientras que los demás grupos contienen 6 elementos, los cuales van decreciendo en

tamaño hacia el centro de la tarjeta), desde 2,21 𝜇𝑚 hasta 3,90 𝜇𝑚 que corresponden al grupo 8 y

desde 4,38 𝜇𝑚 hasta 6,12 𝜇𝑚 que corresponden a los cuatro elementos más pequeños del grupo

7.

Para la construcción de la siguiente tabla se realizaron varios perfiles sobre distintos elementos

de las reconstrucciones en amplitud de la tarjeta USAF 1951. En la tercera columna se muestran

los datos obtenidos para el ancho en pixeles de un par de líneas, al calcular un perfil de intensidad

sobre el respectivo elemento, como se muestra en la siguiente figura, esta distancia se compara

con los datos en unidades métricas dados por el fabricante para el respectivo elemento [79]. La

figura 14 muestra uno de los perfiles calculados a partir del cual se obtuvo el factor de calibración

para la magnificación de 40X.

46


Grupo Elemento Ancho medido del par de línea en pixeles

Ancho del par de líneas (𝝁𝒎) según el fabricante [79]

Tamaño del pixel en

(𝝁𝒎) ∗

Número de pixeles

por(𝝁𝒎)*

3 8,37 1,56 0,18 5,36

9 2 8,63 1,74 0,20 4,95

1 7,66 1,96 0,25 3,90

6 9,54 2,21 0,23 4,31

5 11,15 2,46 0,22 4,53

8 4 11,65 2,76 0,23 4,22

3 12,31 3,1 0,25 3,97

2 14,13 3,48 0,24 4,06

1 16,69 3,90 0,23 4,27

7

6 18,31 4,38 0,23 4,18

5 21,31 4,92 0,23 4,33

4 20,73 5,52 0,26 3,75

3 26,35 6,12 0,23 4,30

Promedios 0,23 4,36

Tabla 1: Cálculo del factor de calibración lateral de pixeles a unidades métricas para una magnificación de 40X. *Valores promedio

Figura 14: Perfil del grupo 7 elemento 0, donde la distancia en pixeles del par de líneas corresponde 3.48µm

Posteriormente se promedió el valor reconstruido para cada elemento y así se encontró el valor

promedio del pixel para la magnificación de 40x de:



47

𝟏 𝒑𝒊𝒙𝒆𝒍 = (𝟎. 𝟐𝟑 ± 𝟎, 𝟎𝟑 )𝜇𝑚

Figura 15 :Reconstrucción en amplitud y fase de barras de anchos desde 1,95um hasta 0,78um y que corresponden a los Grupos 8 y 9 de la Tarjeta USAF de alta resolución con magnificación de 60X

Al realizar el mismo proceso anterior para una magnificación de 60X con varios perfiles se

obtuvo la siguiente tabla:

Grupo Elemento Ancho medido del par de línea en

pixeles

Ancho del par de líneas (𝝁𝒎) según el fabricante [79]

Tamaño del pixel en

(𝝁𝒎) ∗

Numero de pixeles

por(𝝁𝒎) ∗

3 8,30 1,56 0,18 5,32

9 2 9,52 1,74 0,18 5,47

1 10,73 1,96 0,18 5,47

6 11,82 2,21 0,18 5,34

5 12,48 2,46 0,19 5,07

8 4 13,79 2,76 0,20 4,99

3 14,27 3,11 0,22 4,60

2 15,70 3,48 0,22 4,51

1 17,87 3,91 0,21 4,57

Promedios 0,19 5,03

Tabla 2: Calibración para una magnificación de 60X. *Valores promedio.

Luego de calcular los respectivos promedios, el valor promedio del pixel reconstruido con una magnificación de 60X es de:

48


𝟏 𝒑𝒊𝒙𝒆𝒍 = (𝟎, 𝟏𝟗 ± 𝟎. 𝟎𝟐)𝜇𝑚

Utilizando los datos calculados en esta sección, en la sección de resultados se podrán reportar las

mediciones en unidades métricas.

2.4 Condiciones experimentales para el crecimiento de las muestras biológicas estudiadas:

La leishmaniasis causada por Leishmania braziliensis se caracteriza por una Lesión Cutánea (LC) o

Muco-cutánea (LMC) y en Colombia es común en el 50% del territorio colombiano y no es muy

estudiada debido a las dificultades del cultivo del parásito y el control de las condiciones

necesarias para su conservación en estado puro (condiciones axénicas). Por esta razón para la

presente tesis se trabajó en colaboración con el grupo de Biofísica y biología de membranas de la

Universidad Nacional de Colombia y Centro Internacional de Física, que proporcionó las muestras

en sus distintos estados.

Las muestras biológicas estudiadas en la presente tesis fueron macrófagos de ratón sanos de la

línea celular J774.A1 (Macrófagos control), Macrófagos que fagocitaron perlas de látex de

diferentes tamaños (con la intención de simular la infección de cualquier patógeno) y por último

macrófagos infectados en dos estados de infección diferentes 24 y 48 horas después de estar en

contacto con el parásito. Para su estudio, estas muestras fueron tratadas bajo condiciones

controladas por el grupo de biofísica y que se describen a continuación:

1. Cultivo de Macrófagos Control: Las condiciones experimentales para el crecimiento de

macrófagos peritoneales de ratón (Línea celular J774.1 ), se adecuan para mantener una

monocapa en frascos de 25 cm3 a una temperatura de 35ο C en una atmosfera de 5% de CO2,

estas células se mantienen en medio de cultivo de RPMI 1640 (GIBCO) enriquecido con suero

bovino fetal al 10% (FBS, GIBCO) [80].Los medios de cultivo ayudan a que la células se dupliquen y

se mantengan en condiciones sanas de crecimiento, pero es necesario que estén aisladas del

medio ambiente para minimizar contaminaciones por microorganismos, ya que puede alterar la

muestra y dificultar su visualización. Además cuando las células no se encuentran bajo las

condiciones adecuadas de temperatura, empiezan a mostrar signos de muerte celular después de

24 horas, lo que puede alterar la medición de las propiedades físicas. Por lo anterior, las muestras

observadas con la técnica de MHD fueron registradas con no más de 10 horas de haber perdido

sus condiciones de incubación.



49

2. Fagocitosis de perlas de Látex: cultivos de macrófagos confluentes a 80% fueron expuestos a

perlas de látex de 3 𝜇𝑚 y 6 𝜇𝑚 a una relación de 1:10, es decir, 10 perlas por cada macrófago y se

incubaron a 35°C [81].

3. Célula Parasita e Infección: Los promastigotes fueron cultivados a 25 °C en frascos de 25 cm3,

en TC-100 o Schneider (GIBCO) suplementado con FBS al 10% hasta llegar a formación de rosetas

donde la infectividad es más eficiente. Un cultivo de células J774.1 confluentes se expusieron a

promastigotes estacionarios en una relación de 1:10 respectivamente y se incubaron a 35 °C y al

5% de CO2 durante la etapa de infección (por 24 - 48 Horas) [82].

50


3. Análisis de resultados:

En esta sección se presentan los resultados obtenidos al utilizar la MHD para el estudio de

muestras biológicas: Macrófagos control, Macrófagos que fagocitaron perlas de látex

(poliestireno) y por último macrófagos en diferentes grados de infección por la Leishmania. El

primer paso consiste en una exploración y calibración de la técnica, esto se logra con registros de

micro esferas calibradas con diferentes tamaños 3 𝜇𝑚 y 6 𝜇𝑚 con magnificaciones de 40X y 60X.

Posterior a esto se realiza una descripción morfológica de los macrófagos control, los diferentes

diámetros e índice integral de refracción en el estado sano de los macrófagos. Tomando los

macrófagos sanos como un parámetro de control, se realiza un proceso descriptivo de los

cambios morfológicos y de índice de refracción para los macrófagos que fagocitaron esferas de

látex, lo que simula una infección parasitaria y los infectados por leishmaniasis brasilienses en una

variación temporal de 24 horas y 48 horas post-infección.

3.1 Caracterización de Micro-esferas 3µm:

Utilizando la calibración obtenida en el capítulo anterior, se cuantifica el diámetro de las

microesferas de poliestireno, dicho valor es comparado con el diámetro dado por el fabricante

[83] cuyo valor es 𝑑 = 3𝜇𝑚 y el índice de refracción relativo se compara con el reportado en la

bibliografía [84] que tiene un valor de nr-poli=1,57, por lo tanto, suponiendo un índice de refracción

a condiciones normales de presión y temperatura para el aire de 𝑛𝑎𝑖𝑟𝑒 = 1, el índice teórico de

refracción relativo al aire de las microesferas es de 0,57. Para realizar la cuantificación

mencionada se llevan a cabo los registros holográficos de las microesferas y se reconstruye el

campo óptico complejo según se describió anteriormente, obteniendo los mapas amplitud y de

diferencia de fase como se muestra en las figuras 16A y 16B a continuación:



51

Figura 16: A) Reconstrucción en amplitud de aglomerados de microesferas de 3𝜇𝑚 de diámetro; B) Reconstrucción de la fase envuelta de las microesferas; C) Mapa de índice de refracción relativo de dos microesferas de 3𝜇𝑚 con una magnificación de 40X.

Utilizando el valor teórico para el diámetro de las microesferas y a partir del mapa de fase

encontrado, se calcula el mapa de índice relativo de refracción utilizando la ecuación (24), el cual

se muestra en la figura 16C. A manera de ejemplo de cálculo, se realiza un perfil a lo largo de la

línea diametral roja mostrada en el mapa de índice de refracción de la figura 16C, para las dos

microesferas mostradas, se observa que estas tienen cada una un diámetro de 𝑑 = 2.94 ±

0.23 𝜇𝑚 con un error porcentual de 0.02% con respecto al valor dado por el fabricante [83]. Este

valor fue verificado por Microscopía Óptica con una magnificación de 40X. Dado que el error

calculado es tan pequeño, esto permite pensar que la técnica es confiable y por lo tanto se puede

reportar, en el mismo perfil, el valor para su índice de refracción integral relativo al índice de

refracción del aire 𝑛𝑎𝑖𝑟 = 1 de 𝑛3𝜇𝑚 = 0,59 ± 0,01. Este ejercicio se repitió al menos diez veces

y se promediaron sus resultados. El perfil se muestra en la figura 17.

52


Figura 17: Perfil de índice integral de refracción relativo calculado para una micro esfera de 3𝜇𝑚 a lo largo de la

línea diametral roja mostrada en la figura 16C.

De la anterior figura de deduce que al medir el Índice de refracción relativo, se encontró que el valor máximo del índice de refracción relativo es n3um=0,59 con error porcentual de 0,07% con respecto al índice de refracción relativo del poliestireno nr-poli = 0,57 según el fabricante [84].

Figura 18: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo (IRR) de una microesfera de 3𝜇𝑚 estudiada con un

objetivo de 40X



53

3.2 Caracterización de Micro-esferas 6µm:

Al realizar el mismo procedimiento anterior para microesferas de 6𝜇𝑚 con una magnificación de

60X, se obtienen los siguientes resultados:

Figura 19:A) Reconstrucción en amplitud de aglomerados de microesferas de 6𝜇𝑚 de diámetro; B) Reconstrucción de la fase envuelta de las microesferas; C) Mapa de índice de refracción relativo de dos microesferas de 3𝜇𝑚 con una magnificación de 60X.

Utilizando nuevamente el valor teórico para el diámetro de las microesferas y a partir del mapa

de fase encontrado, se calcula el mapa de índice relativo al aire n=1 utilizando la ecuación (24), el

cual se muestra en la figura 19C.

A manera de ejemplo de cálculo, se realiza un perfil a lo largo de la línea diametral azul mostrada

en el mapa de índice de refracción de la figura 19C, para las dos microesferas mostradas, se

observa que estas tienen cada una un diámetro de 𝑑 = 5.78 ± 0.19 𝜇𝑚 con un error porcentual

de 0,34% con respecto al valor dado por el fabricante [83]. Este valor fue verificado por

Microscopía Óptica con una magnificación de 60X. Dado que el error calculado es nuevamente

54


tan pequeño, esto permite pensar que la técnica es confiable y por lo tanto se puede reportar, en

el mismo perfil, el valor para su índice de refracción integral relativo de 𝑛6𝜇𝑚 = 0,54 ± 0,01. Este

ejercicio se repitió al menos diez veces y se promediaron sus resultados. El perfil se muestra en la

figura 20.

Figura 20: Perfil de índice integral de refracción relativo calculado para una micro esfera de 6 𝜇𝑚 a lo largo de la

línea diametral azul mostrada en la figura 19C.

La figura 21 muestra uno de los mapas 3D de índice refracción integral relativo (IRR) y tomando

un punto arbitrario en ella, se encontró que el valor del índice de refracción relativo es n6um=0,54

con error porcentual de 0,52% con respecto al índice de refracción relativo del poliestireno nr-poli =

0,57 según [84].

Figura 21:Mapa 3D de índice integral de refracción relativo una micro esfera de 6um con un objetivo de 60X



55

3.3 Macrófagos sanos o control:

El registro holográfico de macrófagos control brinda un patrón de referencia basado en el estado

sano del macrófago con respecto a las variaciones que pueden sufrir los macrófagos que han sido

afectados por algún agente externo. Los macrófagos sanos normalmente no están activos y en su

mayoría tiene simetría esférica con un diámetro que oscila entre 10𝜇𝑚 y 15𝜇𝑚 [82-83] y no

poseen plegamiento de membrana plasmática por lo que es más fácil su identificación,

observación y medida, como se observa en la figura 22. Ésta muestra dos fotografías tomadas por

microscopía óptica para un aglomerado de macrófagos control. En la figura 21A se muestra la

medición del diámetro de algunos de ellos, evidenciando el rango en el que oscilan sus diámetros.

Para el índice de refracción son muy escasos los estudios donde se ha reportado su medida, los

trabajos más recientes son los de Andrew E. Ekpenyong et al [51] quienes reportan un valor de

nrcontrol = 0,37.

Figura 22: Macrófagos control observados con un microscopio óptico con una magnificación de 60X. En (A) se muestra la medición del diámetro de algunos macrófagos sanos.

Por medio de la técnica de MHD descrita anteriormente se registran y reconstruyen los mapas de amplitud y de diferencia de fase para aglomerados de macrófagos sanos, como se muestra en la figura 22. En las reconstrucciones de amplitud de la figura 23A se puede distinguir una homogeneidad en la

superficie del macrófago, es decir que sus componentes intracelulares no son visibles sin

coloración. En el mapa de fase envuelto de la figura 23B se aprecian saltos de fase que evidencian

una simetría esférica del macrófago y al desenvolver dicha fase removiendo los saltos, se obtiene

el mapa de diferencia de fase 23C, donde es posible observar que su estructura interna no tiene

alteraciones de fase significativas propias de un macrófago en condiciones ideales. Con este mapa

de fase y con el valor del diámetro de 𝑑 = 14,8 ± 0.19 𝜇𝑚 de un macrófago de tamaño

A

B

56


promedio seleccionado en la figura 23C, se calculó el índice integral de refracción relativo, el cual

se muestra en la figura 23D.

Figura 23: A) Reconstrucción en amplitud de macrófagos control con un objetivo de 60x; B) Reconstrucción de la fase

envuelta de macrófagos control; C) Fase desenvuelta del macrófago y selección de un macrófago individual; D) Mapa

de índice de refracción calculado a partir del mapa de fase, con el valor del diámetro de un macrófago de tamaño

promedio y selección del perfil a lo largo de la línea diametral roja.

Al calcular un perfil a lo largo de la línea diametral roja en el mapa de índice de refracción (figura

23D), sobre el macrófago seleccionado, se obtuvo el perfil mostrado en la figura 24.

A B

C D

Rad

ianes

IRR



57

Figura 24: Perfil de índice integral de refracción relativo calculado para un macrófago control a lo largo de la línea

diametral roja mostrada en la figura 23D.

Esta medición se realizó al menos 20 veces y aquí se reporta el resultado del promedio de todas

las mediciones. Según el perfil anterior el valor del índice de refracción relativo para los

macrófagos control estudiados por esta técnica de MHD es 𝑛𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 = 0,32 ± 0,03.

Figura 25: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago control con un objetivo de 60X.

La figura 25 muestra un mapa 3D de índice de refracción relativo para el macrófago señalado en

la figura 23C. En él se puede observar un mayor valor de índice de refracción en su interior,

correspondiente al núcleo del macrófago.Con la finalidad de tener un valor lo más aproximado

posible para el índice de refracción, se calcularon 20 perfiles sobre los diámetros de macrófagos

control, algunos de estos se reportan en la tabla 3, donde se muestran los valores de diámetro

58


(calculado sobre los mapas de amplitud reconstruidos) e índice de refracción para los macrófagos

mostrados en la figura 23A:

Macrófago control Diámetro dmc (𝝁𝒎) ±0.19 𝝁𝒎

Índice de refracción relativo

Muestra 1 15,53 0,32

Muestra 2 15,66 0,36

Muestra 3 14,17 0,38

Muestra 4 15,73 0,42

Muestra 5 13,02 0,37

Promedio 14,82 0,37

Tabla 3: Diámetro e índice de refracción relativo para diferentes macrófagos.

De la tabla anterior se pueden resumir los siguientes valores promedio para el diámetro y el

índice de refracción de los macrófagos sanos estudiados:

𝑫𝒊𝒂𝒎𝒆𝒕𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒎𝒂𝒄𝒓ó𝒇𝒂𝒈𝒐𝒔 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 = (𝟏𝟒. 𝟖𝟐 ± 𝟎. 𝟏𝟗)𝜇𝑚

𝑰𝒏𝒅𝒊𝒄𝒆 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒇𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊𝒐𝒏 𝒓𝒆𝒍𝒂𝒕𝒊𝒗𝒐 𝒅𝒆 𝒎𝒂𝒄𝒓𝒐𝒇𝒂𝒈𝒐𝒔 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 = (𝟎. 𝟑𝟕 ± 𝟎. 𝟎𝟑)

Otro ejemplo para el mismo caso de macrófagos control es el siguiente:

Al tomar otra muestra distinta de macrófagos control de la misma línea celular y repetir el

procedimiento anterior, se obtuvieron los resultados mostrados en la figura 26:

Figura 26: A) Mapa de fase desenvuelta de macrófagos control y selección de dos de ellos B) Mapa de índice de

refracción calculado a partir del mapa de fase y utilizando el diámetro promedio de los dos macrófagos seleccionados.



59

En la figura anterior se puede observar para un nuevo conjunto de macrófagos sanos, en A) el

mapa de fase desenvuelta y en B) el mapa de índice de refracción relativo calculado a partir del

mapa anterior y con la medida teórica de su diámetro, en los cuales se puede visualizar la

uniformidad al interior de los macrófagos, revelando la ausencia de objetos o agentes extraños

ajenos al macrófago.

Al calcular un perfil de índice de refracción sobre los dos macrófagos señalados en la figura 26B,

se encuentra que tienen respectivamente índices de refracción relativo de 𝑛1 = 0,35 ± 0,03 y

𝑛2 = 0,37 ± 0,03, lo cual se puede considerar que está en el mismo rango del resultado obtenido

en el ejemplo anterior.

Figura 27: Perfil de índice integral de refracción relativo calculado para dos macrófagos control a lo largo de la línea

diametral roja mostrada en la figura 26B. La figura 28 muestra un mapa 3D de índice de refracción relativo para los macrófagos señalados en la figura 26B. En él se puede observar una mayor contribución al índice de refracción en su interior, lo cual es similar para los demás macrófagos que están incluidos en el mapa 3D.

60


Figura 28: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de dos macrófagos control con un objetivo de 60X.

3.4 Fagocitosis de Microesferas de látex

El macrófago al entrar en contacto con las microesferas, las rodea con su membrana y las

introduce en su interior (proceso de fagocitosis), luego el fagosoma entra en compartimientos

conocidos como vacuolas parasitóforas para destruir el parásito, pero las enzimas no tienen la

capacidad de eliminar el látex de poliestireno, por lo que las microesferas conservan su forma y

tamaño aun habiendo sido fagocitadas. Por esta razón este método se utiliza para simular un

patrón infeccioso y comprender el comportamiento defensivo de la célula. Con esta finalidad se

exponen macrófagos sanos en una relación de 1:10 (1 macrófago por cada 10 microesferas) de

diferentes diámetros 3𝜇𝑚 y 6𝜇𝑚. La figura 28 muestra esta situación por medio de imágenes

obtenidas por microscopía óptica.

Figura 29: Macrófagos que fagocitaron perlas de látex vistos en un microscopio óptico con una magnificación de 40X.



61

La figura 30 muestra las reconstrucciones de amplitud (30A), diferencia de fase envuelta (30B) y

de fase desenvuelta (30C), obtenidas por MHD para macrófagos que fagocitaron microesferas de

látex de 3 𝜇𝑚. Dichas reconstrucciones muestran saltos de fase adicionales a los relacionados con

la esfericidad del macrófago, además en la reconstrucción de fase desenvuelta es posible

observar que la luz que pasa a través del objeto está siendo alterada por algo que no pertenece al

macrófago, lo cual se relaciona con la presencia de las microesferas de látex en el interior de la

célula.

Figura 30: A) Reconstrucción en amplitud de un macrófago que fagocitó perlas de látex de 3𝜇𝑚 con un objetivo de 60x; B) Reconstrucción de fase envuelta de un macrófago que fagocitó las microesferas de látex; C) Mapa de diferencia de fase desenvuelta de un macrófago que fagocitó microesferas de látex; D) Mapa de índice de refracción calculado a partir del mapa de diferencia de fase y del tamaño medido para los macrófagos.

Al calcular un perfil de índice de refracción a lo largo de la línea diametral roja mostrada en la

figura 30D, se puede observar el salto en el índice de refracción debido a la contribución de fase

de la microesfera, para el caso mostrado se observa un ∆𝑛 = 0,14 ± 0.03 con respecto al valor

del índice de refracción del macrófago reportado en el apartado anterior y dentro del mismo

perfil se revela la presencia de la microesfera, tanto así que se puede medir su diámetro dentro

del macrófago, para el caso se obtuvo para la microesfera 𝑑 = 2.73 ± 0.19.

62


Figura 31: Perfil de índice integral de refracción relativo de un macrófago que fagocitó esferas de látex a lo largo de la línea diametral roja mostrada en la figura 30D.

En la Figura 31 se observa el perfil de índice de refracción integral relativo que sobrepasa el

promedio de un macrófago control, lo que se relaciona directamente con la redistribución de

masa diferencial dentro del macrófago la cual causa un aumento en el diámetro producto de la

fagocitosis.El mapa 3D de índice de refracción mostrado en la figura 32, permite observar su

incremento en toda la superficie del macrófago, esto puede ser debido a la respuesta enzimática

y aumento de proteínas dentro de la célula huésped por lo que es considerado como una sub-

activación del macrófago (llamado Sub-activación debido a la activación leve que producen las

microesferas lo cual tiene una respuesta similar con una infección temprana, similar a las de 12

horas post-infección) [82].

Figura 32: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago que fagocitó 3 esferas de látex, con un

objetivo de 40X.



63

Repitiendo el proceso anterior con otra muestra de macrófagos de la misma línea bajo condiciones experimentales similares, que también han fagocitado microesferas de látex de 3 𝜇𝑚 se obtuvieron los resultados mostrados en la figura 33. En esta figura se observa la selección de un conjunto de lo que serían 3 microesferas ya fagocitadas.

Figura 33: A) Reconstrucción en amplitud de un macrófago que fagocitó perlas de látex de 3𝜇𝑚 observadas de

diámetro; B) Reconstrucción de fase envuelta de un macrófago que fagocitó perlas de látex; C) Mapa de diferencia

de fase desenvuelta de un macrófago que fagocito microesferas de látex; D) Mapa de índice de refracción

calculado a partir del mapa de fase de un macrófago y selección de 3 microesferas.

Al calcular un perfil de índice de refracción a lo largo de las microesferas seleccionadas en la

figura 33D, se pueden observar los saltos en el índice de refracción debido a la contribución de las

tres microesferas. La figura 34 muestra el perfil calculado.

64


Figura 34: Perfil de Índice integral de refracción relativo un macrófago que fagocitó esferas de látex, el perfil diametral se realiza respecto a tres microesferas dentro de la célula como se muestra en la figura 33D.

El mapa 3D de índice de refracción también permite observar el incremento en toda la superficie

del macrófago y la contribución por cada microesferas fagocitada.

Figura 35: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago que fagocitó 3 esferas de látex con un objetivo de 40X.

El diámetro del macrófago aumenta más del 63% respecto al diámetro del macrófago control

promedio, a un valor de dmf =21.99um±0.23. Es importante resaltar que, aun habiendo fagocitado,

el macrófago no pierde su esfericidad, pero si cambia en gran medida su tamaño e índice de

refracción donde están localizadas las microesferas.



65

Extrapolando el ejercicio anterior, se estudió también el caso en que un macrófago fagocite una

gran cantidad de microesferas de látex. Repitiendo todo el proceso ya descrito por MHD se

calcularon nuevamente los mapas de amplitud, de diferencia de fase y de índice de refracción,

usando los datos ya conocidos. Los resultados se muestran en la figura 36:

Figura 36: A) Reconstrucción en amplitud de un macrófago que fagocito muchas microesferas de látex con un objetivo

de 60X; B) Mapa de diferencia de fase envuelta; C) Diferencia de fase desenvuelta de un macrófago que fagocito gran

cantidad de microesferas de látex; D) Mapa de índice de refracción relativo y señalización de un perfil.

En las reconstrucciones en amplitud es posible ver un cambio en la morfología del macrófago debido a la saturación de fagocitosis de perlas de látex.

Al realizar nuevamente un perfil a lo largo de la línea a color mostrada en la figura 36D, (ver figura 36), se puede observar claramente el aporte del conglomerado de microesferas a su valor de

66


índice de refracción. La figura 37 muestra el respectivo mapa de índice de refracción en 3D, lo cual revela la presencia del conglomerado de microesferas fagocitadas por el macrófago.

Figura 37: Perfil diametral de Índice integral de refracción relativo en un macrófago que fagocitó gran cantidad de microesferas de látex.

El mapa 3D de índice de refracción también permite observar el incremento en toda la superficie del macrófago y la contribución de todas las micro esferas fagocitadas

Figura 38: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago en estado de fagocitosis de muchas microesferas de látex

En las figuras 37 y 38, se puede observar un aumento significativo en el tamaño y en el valor del

índice de refracción del macrófago. Aunque son cantidades acopladas, se puede concluir que el

método de simulación de la infección es eficiente por que la técnica alcanza a resolver en índice

de refracción y aproximadamente en tamaño las microesferas aún después de ser fagocitadas.



67

Esto puede ser de gran utilidad para cuantificar el área de infección de un macrófago y medir el

aumento del diámetro debido a la redistribución citoplasmática producto de la fagocitosis.

3.5 Macrófagos después de 24 Horas de Infección de Leishmaniasis.

Se expusieron células sanas de la línea celular J744.A1 al parásito L. brazilensis por 24 horas, en la

literatura [82] este parásito reporta un crecimiento lento a diferencia de las demás cepas, por lo

que es posible observar diferentes estados de infección en macrófagos y en su mayoría no muy

avanzados. La figura 39 muestra imágenes obtenidas por microscopía óptica con una

magnificación de 60X, donde fue posible observar vacuolas parasitóforas pequeñas y macrófagos

con mínimas prolongaciones de la membrana plasmática, adicionalmente se observa en ellas el

parásito Leishmania en la morfología promastigote.

Figura 39: Macrófagos infectados después de 24 horas post-infección y el parásito Leishmania en estado promastigote vistas desde un microscopio óptico con una magnificación de 60X.

El parásito Leishmania afecta abruptamente a la célula hospedera debido a la formación de

vacuolas, ya que su tamaño está relacionado con el nivel de infección y la cepa de Leishmania que

se encuentre dentro del hospedero. En la figura 40A se puede observar el registro holográfico de

un macrófago infectado, donde es evidente el cambio en la curvatura de las franjas, lo que

evidencia el cambio de fase en la zona que parece estar afectada, comparado con el registro de

un macrófago sano donde las franjas conservan su curvatura. Por su parte la reconstrucción en

amplitud verifica un estado diferente al estado sano de la célula.

Leishmaniasis

Macrófago

infectado

68


Adicionalmente, los saltos de fase que se observan en la figura 40C, podrían estar relacionados

con la creación de una vacuola parasitófora. Las reconstrucciones en amplitud y en diferencia de

fase para macrófagos después de 24 horas después de infección se muestran a continuación:

Figura 40: A) Registro holográfico de un macrófago 24 horas después de la infección por Leishmania comparado con el registro de un macrófago sano observado con un objetivo de 60X; B) Reconstrucción en amplitud de un macrófago infectado después de 24 de la infección; C) mapa de diferencia de fase envuelta; D) mapa de diferencia de fase desenvuelta de un macrófago infectado por Leishmaniasis, el círculo roja muestra la posible presencia de una vacuola parasitófora; E) Mapa de índice de refracción integral relativo de un macrófago infectado y señalización del perfil sobre la infección.



69

Al calcular un perfil de índice de refracción a lo largo de la línea diametral roja mostrada en la figura 40F, se evidencia la infección, es decir donde es posible notar la presencia de una vacuola en un área muy específica del macrófago. En este caso particular de infección fue posible estimar la contribución de la infección en el índice de refracción de ∆𝑛 = 0,36 ± 0,03 con respecto al valor medido para el macrófago sano de 𝑛 = 0,37 ± 0,03, por eso en el perfil se rotula el valor de 𝑛 = 0,73 y el diámetro del círculo punteado que se observa en la figura 40E es 𝑑𝑖𝑛𝑓𝑒𝑐 = (5.79 ±

0.19)μ𝑚 que corresponde al tamaño de la vacuola parasitófora.

Figura 41: Perfil de índice integral de refracción relativo de un macrófago 24 horas después de la infección. El

círculo rojo muestra la posible presencia de una vacuola parasitófora.

Para los macrófagos existen muchos factores que pueden aportar al aumento del camino óptico

de la luz, pero si es claro que en gran medida este aumento es producto de la fagocitosis del

parásito y el cambio más evidente se muestra en la región afectada. El mapa 3D de la figura 42,

permite observar el incremento en el índice de refracción en toda la superficie del macrófago

donde su mayor contribución es en el área de la vacuola parasitófora.

70


Figura 42: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago 24 horas después de la infección

Otra característica diferencial con respecto al macrófago control, se da cuando el macrófago se

activa debido a la presencia de la bacteria, éste aumenta su membrana plasmática, pero por

observación directa de las células es más difícil de detectar.

Durante las primeras 24 horas de infección es posible observar macrófagos infectados rodeados

de membrana plasmática plegada y macrófagos sanos, como se puede apreciar en el siguiente

mapa de índice de refracción.

Figura 43: Mapa de índice de refracción relativo de un conjunto de macrófagos que fueron expuestos la bacteria 24 horas post infección, la línea azul señala el plegamiento de la membrana plasmática en la región infectada y la línea naranja el perfil que se realiza a lo largo de dos macrófagos con diferentes estados de infección que se observa en la figura 44.

En la figura 43, es posible observar un conjunto de macrófagos que podrían estar infectados

debido a que se observa una diferencia de fase entre el lado seleccionado con un recuadro azul



71

respecto al que no lo está. Para medir si existe alguna diferencia en el índice de refracción se

realiza un perfil de (línea naranja) donde se toman dos macrófagos que parecen tener diferentes

estados.

Figura 44 : Perfil de un macrófago infectado y un macrófago sano

En el perfil de la figura 44 se puede observar un cambio de índice de refracción relativo en ambos

macrófagos, se podría decir que un macrófago está infectado y el otro aún está en condiciones

relativamente sanas ya que cumple con los parámetros establecidos para el macrófago control.

En las primeras 24 horas post-infección se considera que los macrófagos infectados se

encuentran en un estado de infección establecida dentro del hospedero, la cual es posible

observar diferentes estados de infección y esto ocurre cuando fagocitan una mayor cantidad de

promastigotes que otros o cuando el macrófago ha estado en contacto por más tiempo con el

parásito logrando un estado de infección más avanzado. Por medio de esta técnica fue posible

diferenciar distintos grados de infección usando como parámetro control el índice de refracción y

se pudo diferenciar unos estados de infección más avanzados que otros, como se muestra a

continuación:

Figura 45: A) Reconstrucción de Amplitud de 3 estados diferentes de infección con un objetivo de 60X; B) Mapa de

índice de refracción y selección del perfil que fue realizado donde se percibe infección.

72


Al realizar un perfil de índice de refracción relativo a lo largo de la línea diametral verde marcada

en la figura 45B se evidencia infección, ya que muestra diferencias notorias en el índice de

refracción para cada macrófago (ver figura 46). El aumento significativo del índice de refracción

es debido la multiplicación del amastigote dentro de la Vacuola parasitóloga. Este parásito es una

célula eucariota que posee núcleo, mitocondria y aparato de Golgi, por lo que el aumento

significativo de índice de refracción estaría relacionado con la cantidad de parásitos en el interior

del macrófago, los cuales estarían contribuyendo drásticamente al retraso de la luz dentro del

macrófago y brindando un parámetro cuantitativo para establecer niveles de infección

Figura 46: Perfil de índice de refracción en función del diámetro para 3 macrófagos donde se evidencian diferentes niveles de infección.

En el perfil de la figura 46 se observa que el macrófago 1 muestra un IR de 𝑛1 = 0,43 lo cual

representa un aumento de cerca del 16% con el macrófago control; el macrófago 2 muestra un IR

de 𝑛2 = 0.52 lo cual representa un incremento de cerca de un 40% y por último el macrófago 3

con un pico en el IR de 𝑛3 = 0.66 muestra un aumento relativo del 78% con respecto al IR del

macrófago control. Respecto al diámetro, según la literatura, para macrófagos después de 24 de

infección, una vez que el parásito se estableció dentro del macrófago, la célula aumenta su

diámetro aproximadamente a d= (19,2 ± 0.19) 𝜇𝑚, significativamente mayor que el diámetro de

los macrófagos control [85]. Según el perfil de índice de refracción mostrado en la figura 46, por

medio de MHD es posible medir el incremento en el mencionado diámetro, aunque este varía de

acuerdo a las condiciones y el nivel de infección del macrófago por lo que no es adecuado

establecer un intervalo específico.



73

3.6 Macrófagos después de 48 Horas de Infección de Leishmaniasis.

La infección por L. braziliensis en macrófagos J774.A1, durante las primeras 24 horas post-

infección producen vacuolas parasitófora pequeñas, a diferencia de una etapa más madura como

lo son las 48 horas post- infección donde la mayoría de los macrófagos están infectados. Es

posible observar vacuolas parasitóforas (VP) de mayor tamaño, ya que el parásito se alimenta de

las proteínas de las vacuolas y se multiplica, por lo que es posible observar cambios más

relevantes en el interior del macrófago debido al aumento de amastigotes dentro de parásito, lo

cual aumenta la VP considerablemente hasta ocupar gran parte de la célula huésped. Esto es

posible observarlo en las figuras 47 obtenidas por microscopía óptica.

Figura 47: Macrófagos infectados después de 48 horas post-infección, imágenes obtenidas con un microscopio óptico

con una magnificación de 60X.

Al estudiar esta muestra de macrófagos infectados por medio de la técnica de MHD se obtuvieron

los siguientes resultados:

74


Figura 48: A) Mapa de diferencia de fase envuelta B) Mapa de diferencia de fase desenvuelta del objeto D) Mapa de

índice de refracción relativo integral y señalización del perfil.

En la figura 48, es posible observar un aglomerado de macrófagos que se encuentran en un

estado avanzado de la infección, debido al extenso plegamiento de membrana plasmática de los

macrófagos. Aunque por la infección de la L.brazilensis no se reportan muchos casos de

plegamiento de membrana [85] para 48 horas de infección, es más común observarla a 72 horas

post-infección.

A partir de la línea diametral azul de la figura 48C, se realiza un perfil en índice de refracción

relativo sobre un macrófago donde es posible diferenciar sus bordes, ya que en este estado, el

plegamiento de membrana limita la medida del diámetro del macrófago infectado como se

observa en la figura 49.



75

Figura 49: Perfil de índice de refracción a lo largo de la línea diametral azul de la figura 47C para un macrófago

infectado.

La diferencia de diámetro con respecto al estado de 24 horas de infección no es significativa por

lo que no se considera un parámetro relevante para afirmar estados de infección avanzados, el

aumento en el diámetro es el resultado de la adición de nueva membrana plasmática o de otros

mecanismos que no requieren el reclutamiento como la hinchazón de las células producto de la

respuesta fagocítica. Sin embargo, si se observa una variación en el índice de refracción, ya que

según el perfil el nuevo índice de refracción es 𝑛 = 0,580 ± 0,04, lo cual representa un

incremento en cerca del 56% con respecto al IRR del macrófago control. La figura 50 muestra un

mapa 3D de índice de refracción relativo para el conjunto de macrófagos estudiados, allí se

evidencian los altos valores del IR.

Figura 50: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo de un macrófago 48Horas después de la infección

76


Para otra población de 48 horas después de la infección, otro observable es un cambio

significativo en la esfericidad de los macrófagos, lo cual afecta la aproximación del diámetro en

relación al espesor de la célula, el cambio morfológico de la célula es significativo, esto se puede

observar en las reconstrucciones de amplitud y de diferencia de fase mostradas en las figuras

51A, B Y C:

Figura 51: A) Reconstrucción en amplitud de 3 macrófagos infectados después de 48 de infección observados con un

objetivo de 60X; B) Mapa de diferencia de fase envuelta de 3 macrófagos infectados; C) Mapa de diferencia de Fase

desenvuelta de 3 macrófagos infectados; D) Mapa de índice integral de refracción relativo de macrófagos infectados y

la señalización del perfil.

En la reconstrucción de amplitud es posible apreciar un cambio morfológico debido a un

alargamiento del macrófago y un hinchamiento del mismo, que se verifica en los saltos de fase

envuelta ya que son mucho más evidentes comparados con el caso del macrófago control.

El perfil diametral seleccionado en la figura 50D sobre el mapa de índice de refracción relativo y

mostrado en la figura 52, verifica la presencia de infección dentro del macrófago debido al



77

aumento considerable en el diámetro y en el índice integral de refracción relativo (más del 75%

con respecto al macrófago control), a diferencia de la infección observada en las reconstrucciones

del estado 24 horas.

Figura 52: Perfil de índice integral de refracción relativo de un macrófagos 48 Horas después de la infección

Pero en este caso el perfil muestra una tendencia de IR más homogéneo lo cual estaría

relacionado con el aumento de tamaño de la VP y la infección dentro del macrófago producto de

la multiplicación del parásito. En el mapa 3D de índice integral de refracción relativo, se puede

verificar el aumento del índice sobre todo el macrófago.

Figura 53: Mapa 3D de índice integral de refracción relativo para dos macrófagos infectados después de 48 horas de infección.

78


Por las observaciones anteriores, es posible afirmar cuando un estado de infección está más

avanzado a partir del establecimiento de dos parámetros importantes: El aumento significativo

del índice de refracción relativo y la homogeneidad de su distribución en el volumen del

macrófago, además del aumento y plegamiento la membrana plasmática que se evidencia en

algunas reconstrucciones de diferencia fase y en el mapa de índice de refracción relativo.

Con los resultados obtenidos experimentalmente en la realización de la presente tesis, se puede

afirmar que es posible el desarrollo de una herramienta eficiente para la caracterización de

muestras biológicas, particularmente macrófagos, en diferentes estados; brindando como nuevo

parámetro de caracterización en las áreas de medicina y biología el índice integral de refracción

relativo. Es importante aclarar que algunas características morfológicas para los diferentes

estados de infección ya han sido estudiadas y reportadas, pero cabe resaltar que dichas

características también son evidentes y en algunos casos con más detalle mediante esta técnica

de MHD, con la ventaja ofrecer los mapas 3D de índice de refracción, lo cual permite conocer el

valor del índice punto a punto.



79

4. Conclusiones y Productos

4.1 Conclusiones

En cuanto a la técnica implementada:

1. El interferómetro de MZ modificado para registrar en transmisión fuera de eje mostró

ventajas para el posicionamiento de las muestras biológicas estudiadas, ya que estas al

encontrarse en soluciones acuosas para su conservación requerían un posicionamiento

horizontal e iluminación vertical.

2. La resolución lateral lograda con la configuración experimental implementada se acercó a

las 3 𝜇𝑚, lo cual tiene básicamente dos ventajas: los objetos estudiados estaban dentro

de ese rango y dado que la aproximación esférica de los macrófagos es viable, esta

resolución lateral pudo ser extendida a resolución axial, salvo los posibles problemas de

orden refractivo.

3. La intervención realizada al algoritmo de reconstrucción calculando el valor del contraste

en la reconstrucción en amplitud para encontrar el plano de mejor enfoque permitió

optimizar la resolución lateral al momento de medir el tamaño y las variaciones de índice

de refracción de las muestras estudiadas.

En cuanto a las muestras estudiadas:

4. El estudio del parásito de la Leishmania, la que es considerada como una “enfermedad

olvidada” tiene un gran impacto en los países tropicales en vía de desarrollo como

Colombia, ya que, por ejemplo, es un problema de salud pública en el 50% del territorio

colombiano y quienes la padecen no tienen los recursos suficientes para tratarlas a

tiempo, por lo tanto las investigaciones que estén direccionadas hacia su diagnóstico

contribuyen a mostrar caminos de solución a problemas sociales de gran envergadura,

por esta razón el tener acceso a estas muestras y el propiciar su estudio por una técnica

óptica alternativa es una de las fortalezas de esta tesis.

5. Dado que el manejo de las muestras de macrófagos sanos e infectados no representan un

riesgo biológico debido a que no se está expuesto al ciclo infeccioso que tiene el parásito,

fue posible su manipulación segura al momento de implementar la técnica de MHD.

En cuanto a los resultados:

6. En Macrófagos control:

Mediante la reconstrucción numérica de los mapas de diferencia de fase, fue posible medir el

diámetro e índice de refracción para los macrófagos control de ratón de la línea celular

j774.A1, con la finalidad de obtener un patrón de referencia basado en el estado sano del

80


macrófago. Al comparar los datos obtenidos en la medición del índice de refracción relativo

con investigaciones previas en MHD y la medición del diámetro por microscopía óptica, se

encontró un buen acuerdo con lo reportado, por lo tanto, se puede concluir que la técnica

teórico experimental implementada en la presente tesis es eficiente en el estudio de objetos

biológicos en el caso particular de Macrófagos peritoneales de murino.

7. En fagocitosis de microesferas de látex de poliestireno calibradas:

Al exponer microesferas de diferentes tamaños a macrófagos sanos, induciendo su fagocitosis

y a partir del cálculo de las variaciones morfológicas y de índice de refracción sufridas por el

macrófago, fue posible simular un estado infeccioso en presencia de un patógeno y

compararlos con las características del macrófago control. Por lo anterior es evidente que la

técnica supera las expectativas planteadas en el objetivo general de la presente tesis y alcanza

a resolver objetos del orden de los 3um, lo que puede ser utilizado para cuantificar el área de

infección de un macrófago.

8. En Macrófagos 24 Horas Post-Infección con leishmaniasis.

En el caso de macrófagos infectados 24 horas después de la infección establecida fue posible a

partir de medidas de diferencia de fase y mapas de índice de refracción, estimar diferentes

niveles de infección y diferenciar macrófagos que aún no están infectados por el parásito, es

decir que aun poseen condiciones similares a las establecidas por los parámetros control. Lo

anterior evidencia la eficiencia de la técnica para cuantificar diferentes estados de infección

durante las primeras 24 horas post- infección.

9. En Macrófagos 48 Horas Post-Infección con leishmaniasis:

En el caso de macrófagos infectados 48 horas después de estar en contacto con el parásito, las

medidas respecto al diámetro arrojan valores no muy diferenciales a las 24 horas post

infección, por lo que no se puede establecer el diámetro como parámetro para estimar niveles

de infección avanzados. Respecto al índice de refracción relativo en la población 48 horas fue

posible observar gran cantidad de macrófagos en estados de infección altos, debido a índices

de refracción que sobrepasan en gran medida al control y una homogeneidad de la infección

es decir en el índice en la mayor parte del área proyectada sobre el sensor. Por lo anterior es

posible afirmar que existen diferencias notables en el tamaño de la vacuola parasitófora,

aunque no es posible medir con exactitud el diámetro vacuola parasitófora en este estado.



81

4.2 Productos

Los resultados parciales de esta tesis han sido presentados en los siguientes eventos científicos

internacionales:

Evento: IX Reunión Iberoamericana de Óptica y XII Reunión Iberoamericana de óptica, Láseres y

Aplicaciones (RIAO/OPTILAS)

Lugar: Pucón, Chile. Fecha: 21-25 de Noviembre 2016.

Trabajo: Caracterización de propiedades Físicas de Macrófagos Por Microscopia Holografía digital

Modalidad: Poster

Evento: European Conferences on Biomedical Optics (ECBO)

Lugar: Munich, Alemania entre el 25 y el 29 de Junio 2017

Trabajo: Phagocytosis of different agents by peritoneal macrophages of mouse observed with

digital holographic microscopy

Modalidad: Oral

Evento: Optical Metrology

Lugar: Munich, Alemania entre el 25 y el 29 de Junio 2017

Trabajo: Digital Holographic Microscopy as a technique to monitor macrophages infected by

Leishmania

Modalidad: Oral

Además el proyecto fue financiado por la Convocatoria nacional de proyectos para el

fortalecimiento de la investigación, creación e innovación de la universidad nacional de Colombia

2016-2018

Universidad: Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá

Lugar: Grupo de Óptica. Aplicada GOA

Director: Freddy Alberto Monroy.

Actividades realizadas: Tesis de Maestría en ciencias físicas – investigación

https://www.google.com.co/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjg_o_VjqfUAhXCSyYKHWvwC5MQFggkMAA&url=http%3A%2F%2Fwww.osa.org%2Fen-us%2Fmeetings%2Ftopical_meetings%2Feuropean_conferences_on_biomedical_optics%2F&usg=AFQjCNHwM399_ONYRqMXycGDG90oYL21yA

https://spie.org/conferences-and-exhibitions/optical-metrology

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Caracterización morfológica de células mediante ...

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