Caracterización Molecular y Detección de Betalactamasas de ...

Kasmera 35(2): 91 - 106, 2007ISSN 00755222 / Depósito legal 196202ZU39

Caracterización Molecular y Detección

de Betalactamasas de Espectro Extendido

en Cepas de E. coli y K. pneumoniae Aisladas

en las Unidades de Cuidados Intensivos de un

Hospital Universitario

Molecular Characterization and Extended Spectrum

Betalactamase Detection in E. coli and K. pneumoniae Strains

Isolates from Intensive Care Units in a Teaching Hospital

Perozo-Mena, Armindo1;

Castellano-González, Maribel2;

Ginestre-Pérez, Messaria2 y Harris, Belinda3

1Cátedra de Práctica Profesional de Bacteriología,Escuela de Bioanálisis, Maestría en Diagnóstico Bacteriológico,

Universidad del Zulia. Centro de Referencia Bacteriológica,Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo.

2Cátedra de Bacteriología General, Escuela de Bioanálisis,Maestría en Diagnóstico Bacteriológico, Universidad del Zulia.

3Cátedra de Bacteriología Clínica, Escuela de Bioanálisis,Maestría en Diagnóstico Bacteriológico, Universidad del Zulia.

E-mail: [email protected]; [email protected]

Resumen

La producción de Betalactamasas de Espectro Extendido por cepas de E. coli y K. pneumo-

niae, es un grave problema de salud pública ya que causa la pérdida de la eficacia terapéutica a losantibióticos ß-lactámicos. En este trabajo se investigó la presencia de betalactamasas de espectroextendido en cepas de E. coli y K. pneumoniae aisladas de pacientes de las unidades de cuidadosintensivos de un hospital universitario. Se estudiaron 41 cepas de E. coli y 59 de K. pneumoniae,aisladas de los cultivos bacteriológicos realizados en el Centro de Referencia Bacterológica del Se-vicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM). Para la detección de betalacta-

Recibido: 05-04-07 / Aceptado: 17-09-07

masas de espectro extendido se utilizaron los métodos normalizados por el Clinical and Labora-tory Standards Institute (CLSI). El 39,02% de las cepas de E. coli y el 52,54% de las de K. pneumo-

niae fueron betalactamasas de espectro extendido positivas, en estas cepas se observó resistenciaacompañante a quinolonas, aminoglicósidos, cloranfenicol, tetraciclina y trimetoprima/sulfame-toxazol. El estudio epidemiológico mediante Electroforesis de Campo Pulsado, mostró una grandiversidad genética entre los aislamientos, esta policlonalidad indica que la diseminación dentrodel ambiente hospitalario no se da por transmisión de una cepa entre pacientes, sino que se da portransferencia de plásmidos entre diferentes cepas producto de la alta presión selectiva ejercida porla mala utilización de cefalosporinas de tercera generación.

Palabras clave: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, betalactamasas de espectro ex-tendido, unidad de cuidados intensivos, electroforesis de campo pulsado.

Abstract

Extended Spectrum Betalactamases production from E. coli and K. pneumoniae strains, is a se-rious public health problem since cause loss of therapeutic effectiveness of betalactams antibiotics.In this research the presence of extended spectrum betalactamases was investigated in E. coli and K.

pneumoniae strains isolated from intensive cares unit patient’s in a teaching hospital. 41 E. coli and59 K. pneumoniae strains isolated from bacteriological cultures carried out in the BacteriologicalReference Centre at Autonomous Service Maracaibo´s University Hospital (SAHUM) were studied.For the detection of extended spectrum betalactamases the normalized methods proposed by Clini-cal and Laboratory Standards Institute were used. 39,02% of E. coli and 52,54% K. pneumoniae waspositive for extended spectrum betalactamases production, in these isolates accompanying resistan-ce to quinolones, aminoglycosides, chloramphenicol, tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxa-zole was detected. The epidemiological research by means of pulsed field gel electrophoresis showeda great genetic diversity among these strains, this polyclonal pattern, allows to determine that disse-mination inside the hospital services is not given by transmission of a single clone among patients,but rather it is given by plasmids transfer among different strains product of the selective highpressure exercised by third generation cephalosporins bad use.

Key words: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Extended-spectrum beta-lactama-ses; intensive care unit; Pulse field gel electrophoresis.

Introducción

Uno de los grupos de antibióticos másimportantes, tanto histórica como clínica-mente, es el grupo de los ß-lactámicos. Estosincluyen las penicilinas, cefalosporinas, cefa-micinas, carbapenemas y monobactámicos,entre otros antibióticos médicamente útiles(1), este grupo es el más utilizado para el tra-tamiento de las infecciones bacterianas debi-do a su baja toxicidad y a su amplio espectro(2). Los antibióticos �-lactámicos constitu-

yen una amplia familia, estos impiden la sín-tesis de la pared celular bacteriana al inhibirla síntesis del peptidoglicano, a través de lainactivación de una o varias proteínas (trans-peptidasas) de unión a penicilina (PBP) (3).La resistencia bioquímica a los antibióticos�-lactámicos se puede atribuir a cuatro meca-nismos diferentes: ya sea inactivación enzi-mática de la droga, alteración del sitio blan-co, incapacidad de la droga de alcanzar su si-tio blanco debido a modificación de las pori-nas a nivel de la pared celular y eflujo de la

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droga una vez que ingresa. El mecanismomás utilizado por los bacilos Gram negativospara adquirir resistencia a penicilinas y beta-lactámicos en general, ya sea que esto ocurrade manera natural o adquirida, es la inactiva-ción de las drogas por las enzimas�-lactamasas, que abren el anillo de las peni-cilinas y demás �-lactámicos entre los átomosde C y N para formar compuestos inacti-vos (4).

La diseminación de las �-lactamasasTEM-1, TEM-2 y SHV-1 se produjo comoconsecuencia directa de la presión selectivaejercida por la introducción de la ampicilina,carbenicilina y las primeras cefalosporinasen los años 60. En 1969 se detectaron enzi-mas TEM en Pseudomonas aeruginosa y de1973 a 1975 se encontraron en Haemophilus

influenzae, Vibrio cholerae y Neisseria go-

norrhoeae (5). En 1983 se detectaron en Ale-mania los primeros aislamientos clínicos deK. pneumoniae y E. coli resistentes a cefalos-porinas de tercera generación. Posterior a suanálisis, se demostró que la resistencia eradebida a la producción de una �-lactamasaplasmídica transferible, estas enzimas se de-nominaron �-lactamasas de espectro exten-dido (BLEE) ya que eran capaces de hidroli-zar un buen número de antibióticos �-lact-ámicos, incluyendo los que contienen el gru-po oximino, como las cefalosporinas de ter-cera y cuarta generación, así como al aztreo-nam (6). Estas enzimas derivan de mutacio-nes concretas en los genes que codifican las�-lactamasas clásicas (TEM-1, TEM-2 ySHV-1), originando cambios en su secuenciade aminoácidos. Estas mutaciones han dadolugar a una gran variedad de enzimas (deTEM-3 a TEM-29 y de SHV-2 a SHV-7) (7, 8).

La aparición de bacterias productorasde BLEE tiene importantes repercusiones clí-nicas y terapéuticas: a) la mayoría de los ais-lamientos tienen codificada la resistencia en

plásmidos que pueden ser transferidos aotros microorganismos, b) son causantes debrotes en instituciones prestadoras de salud,c) aumentan la morbimortalidad nosocomialy d) limitan las opciones terapéuticas, incre-mentándose el uso de antibióticos costososcomo el imipenem (9). Los microorganismosque más comúnmente sintetizan BLEE son:Klebsiella spp. y E. coli, pero también se handetectado en: Salmonella spp., Proteus spp.,Citrobacter spp., Morganella morganni, Se-

rratia marcescens, Shigella dysenteriae,

Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia ce-

pacia y Capnocytophaga ochracea (10). Seha descrito que la administración indiscrimi-nada de cefalosporinas de tercera genera-ción, particularmente ceftazidima es una delas principales causas de la aparición de estascepas. Cepas productoras de BLEE, han oca-sionado brotes de infección intrahospitalariacon multirresistencia a los antibióticos, espe-cialmente en las Unidades de Cuidados In-tensivos, dificultando el tratamiento y au-mentando la morbimortalidad nosocomial.Los brotes fueron controlados al reducir lautilización de ceftazidima junto con la imple-mentación de medidas de control de infeccio-nes (11).

La no detección e investigación de cepasproductoras de BLEE, por parte de algunoslaboratorios, trae como consecuencia, la ins-talación de terapias que resultan ineficaces yque además inducen a la diseminación de laresistencia. No existen datos suficientes quecorrelacionen tipos de BLEE con terapias an-timicrobianas, tipos de infección, severidadde la enfermedad de base, dosis y duración dela terapia, lo que hace difícil evaluar las op-ciones terapéuticas (2). Se requieren estudiospara conocer las características epidemioló-gicas de las cepas productoras de BLEE ennuestras Unidades de Cuidados Intensivos,sobre todo por la resistencia a betalactámicos

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de amplio espectro como cefalosporinas, asícomo la resistencia cruzada a otros grupos deantimicrobianos. La detección oportuna deestas cepas en los hospitales, permite la im-plementación de medidas de control de infec-ciones para impedir su diseminación y lo másimportante, brindar una terapia apropiada aquienes sufren infección por una bacteriaproductora de BLEE.

Las infecciones nosocomiales son aque-llas que no están presentes, ni en período deincubación en el momento de la admisión alhospital. La mayoría de las infecciones noso-comiales se reconocen mientras los pacientesestán hospitalizados. Los sitios del cuerpoafectados por infecciones nosocomiales y susfrecuencias relativas han permanecido relati-vamente constantes durante los últimos 20años. Gran parte de la información sobre in-fecciones nosocomiales endémicas se derivadel Sistema Nacional de Vigilancia de Infec-ciones Nosocomiales (NNIS) del Centro paraControl y Prevención de Enfermedades(CDC), el cual ha hecho seguimiento en ungran grupo de hospitales a través de los Esta-dos Unidos durante más de 25 años. La ternade la infección nosocomial comprende Es-

cherichia coli debido a su predominio comocausa de infecciones del tracto urinario,Staphylococcus aureus debido a su predomi-nio como causa de infecciones del torrentesanguíneo, y Pseudomonas aeruginosa debi-do a su predominio como el patógeno esen-cial adquirido en el hospital en todos los si-tios del cuerpo (12). No obstante, el orden derango de los patógenos nosocomiales ha evo-lucionado un poco durante las dos últimasdécadas, con el surgimiento de los cocosGram positivos como una causa importantede infecciones nosocomiales, aumentando laprevalencia de bacterias de baja virulencia,tales como estafilococos coagulasa-negativo;incrementando la importancia de bacterias

resistentes a múltiples antibióticos, talescomo los bacilos gram negativos que produ-cen �-lactamasas de espectro extendido ca-paces de hidrolizar las cefalosporinas másnuevas; el surgimiento de enterococos resis-tentes a vancomicina, de los cuales, numero-sas cepas son resistentes a todos los antibióti-cos comercialmente disponible y la crecienteprevalencia de infecciones micóticas nosoco-miales en pacientes inmunocomprometidos(13).

Una parte importante de la bacteriolo-gía es el estudio de la diseminación de bacte-rias patógenas, su fuente, su modo y frecuen-cia de transmisión. Los estudios epidemioló-gicos pueden comenzar a determinar las rela-ciones de los aislamientos bacterianos contécnicas basadas en el fenotipo, como seroti-pificación, biotipificación y patrones de resis-tencia a los antibióticos, pero estos métodoshan sido reemplazados por técnicas molecu-lares. Estas últimas pueden dividirse de unmodo amplio en las basadas en proteínas y enlas basadas en DNA y RNA. Las técnicas ba-sadas en ácidos nucleicos son varias. Los per-files de plásmidos fueron suplantados engran parte por técnicas que utilizan DNA cro-mosómico combinado con sondas de DNA yPCR con cebadores arbitrarios. Actualmentela técnica aceptada como el estándar de oropara la tipificación molecular de bacterias enel contexto de un brote, es la electroforesis engel con campo pulsado (ECP), esta técnica hasido una de las más útiles y desarrolladas enepidemiología molecular puesto que es detiempos recientes y ahora es consideradacomo la técnica oficial para la tipificaciónmolecular de microorganismos (1).

La confirmación fenotípica de cepasBLEE positiva es sencilla, solo se deben se-guir las recomendaciones del Clinical and La-boratory Standards Institute (CLSI) (14). Lagran diversidad de BLEE obliga a los labora-

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torios a estar preparados para detectar los di-ferentes tipos de resistencia, lo que permiti-ría que se adopten rápidamente las medidasde control. La detección oportuna por partedel laboratorio clínico de una cepa producto-ra de BLEE permitiría activar los mecanis-mos de control tendentes a evitar su disemi-nación en el ambiente hospitalario, lo quedisminuiría la estadía de los pacientes dentrodel mismo, facilitaría su tratamiento y dismi-nuiría los costos de hospitalización, lo que re-percute en la calidad de vida del paciente y sucomunidad (1).

Este estudio se realizó para conocer laincidencia de cepas de E. coli y K. pneumo-

niae productoras de BLEE, aisladas de pa-cientes internados en las Unidades de Cuida-dos Intensivos del SAHUM, así como paradeterminar cuales son las características epi-demiológicas de estos microorganismos y re-conocer si existe diseminación de estas cepasdentro del ambiente hospitalario, lo que per-mitiría diseñar medidas adecuadas para sucontrol.

Materiales y Métodos

Se determinó la producción de BLEE encepas de E. coli y K. pneumoniae aisladas decultivos bacteriológicos procesados en elCentro de Referencia Bacteriológica (CRB) apartir de pacientes internados en las Unida-des de Cuidados Intensivos (unidad de cuida-dos intensivos de adultos, pediatría y neona-tología), del SAHUM, durante el período deEnero a Diciembre de 2006. El aislamiento,identificación y conservación de estas cepasasí como las pruebas de detección de BLEE yla ECP fueron realizadas por el personal delreferido centro y el personal del Laboratoriode Bacteriología de la Escuela de Bioanálisis,Facultad de Medicina, Universidad del Zulia.Para el análisis estadístico se utilizó el paque-

te SPSS versión 11.0, como estadístico deprueba se utilizó el Chi-cuadrado (X2) con unnivel de significancia del 5%; mientras quepara el análisis de los perfiles de resistencia, ydistribución de los casos se utilizó el softwareWHONET 5.4. Para la diferenciación de lospatrones de banda electroforéticos de los di-ferentes aislados se utilizó un análisis clusterde semejanzas y diferencias con ayuda delpaquete estadístico SPSS versión 11.

Las muestras se cultivaron en medios decultivo estándar, el aislamiento e identifica-ción bacteriana se realizó siguiendo la meto-dología convencional, descrita por Fardel JJ.,2003 (15). Para realizar la selección inicial delas cepas se utilizó el método de descarte pordifusión del disco en agar y la determinaciónde la concentración inhibitoria mínima(CIM) por dilución en agar, ambos métodosrecomendados por el CLSI (14). Para el méto-do de difusión del disco en agar se utilizarondiscos comerciales de papel impregnados conlos siguientes antimicrobianos: ATM 30µg;CTX 30µg; CAZ 30µg; CPD 10µg y CRO 30µg;se utilizaron como criterios para la clasifica-ción de las cepas como posibles productorasde BLEE los siguientes puntos de corte ATM�27mm; CTX �27mm; CAZ � 22mm; CPD�17mm y CRO � 25 mm. Por otra parte, parael método de CIM por dilución en agar; serealizaron diluciones seriadas dobles desde256 µg/mL hasta 0.125 µg/mL de los antimi-crobianos CRO, CTX y CAZ respectivamente.A todas las cepas de E. coli y K. pneumoniae

se les determinó la CIM preparando una sus-pensión bacteriana con una concentración de104 UFC/mL, conjuntamente se probaron lascepas controles de E. coli ATCC 25922 BLEE(–) y K. pneumoniae ATCC 700603 BLEE(+). La CIM se interpretó de acuerdo a los cri-terios del CLSI (14). Se catalogaba a una cepacomo sospechosa de producir BLEE si la CIMera � 2 µg/mL

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Una vez identificadas las cepas comoposibles productoras de BLEE por cualquierade los métodos utilizados, el CLSI recomien-da realizar pruebas confirmatorias que per-mitan corroborar la producción de BLEE porparte de la cepa estudiada, para ello se utili-zan dos métodos, el método del disco combi-nado y el método de E-Test. El método deldisco combinado se emplea para confirmarlos resultados obtenidos por el método de di-fusión del disco en agar, para ello, se utilizandiscos de papel filtro impregnados con las di-ferentes cefalosporinas y un inhibidor suici-da de betalactamasas como es el ácido clavu-lánico; en este estudio se utilizaron tres dis-cos combinados cefpodoxima/ácido clavulá-nico [10/1µg]; ceftazidima/ácido clavulánico[30/10µg] y cefotaxima/ácido clavulánico[30/10µg]; de la casa comercial Oxoid, Ba-singstoke, UK. La confirmación de la produc-ción o no de BLEE se realiza midiendo el diá-metro del halo de inhibición producido, elcual debería ser � 5 mm por encima del halode inhibición mostrado cuando el antimicro-biano es usado individualmente (sin la com-binación del ácido clavulánico).

Por otra parte, para el método de E-test(Epsilometer-test) (AB Biodisk, Suecia); seutilizaron tiras de material no poroso quecontiene el antimicrobiano en estudio y el an-timicrobiano combinado con ácido clavuláni-co en un gradiente de concentración, lo quepermite determinar la CIM; para ello se pre-paró un inóculo estandarizado y se inoculóuna placa de agar Müeller Hinton, igual quepara la determinación de susceptibilidad porel método de difusión del disco, seguidamen-te se procedió a colocar las tiras de E-test quecontenían la combinación de CAZ y CAZ/áci-do clavulánico con rangos de CIM de 0,50 -32 µg/mL y de 0,064 - 4 µg/mL respectiva-mente; también se utilizó la tira de CTX yCTX/ ácido clavulánico con rango de CIM de

0.25 - 16 µg/mL y 0.016 - 1 µg/mL respectiva-mente. La CIM estuvo determinada en elpunto en que la elipse de inhibición intercep-ta la escala de la tira. Para confirmar la pro-ducción de BLEE, se obtiene la razón de divi-dir la CIM del antimicrobiano solo entre laCIM del antimicrobiano con ácido clavuláni-co; si esta razón es � 8, se confirma la pro-ducción de BLEE.

Adicionalmente se utilizó el método desinergia del doble disco, este se realizó si-guiendo la metodología descrita por Jarlier ycols., (16). En esta prueba se colocó un discode amoxicilina/ácido clavulánico en el centrode una placa de agar MH, y alrededor de estese colocan discos de CAZ, CRO, CTX, CPD yATM a 20mm de distancia del disco central.La presencia de BLEE se manifiesta por elefecto sinérgico del inhibidor (efecto tapónde corcho), bajo la forma de ampliación delhalo en uno o varios de los �-lactámicos (17).

Para la tipificación molecular medianteECP se utilizó el equipo GUEFAST 06 deNeuronic S.A. Para la preparación de lasmuestras se inmovilizaron las células bacte-rianas (concentración de 2x109 células/mL)en bloques de agarosa. Las células inmovili-zadas son lisadas y desproteinizadas in situpor incubación con los reactivos adecuadospara rendir moléculas de ADN intactas. Paraello se utilizaró el equipo BACKIT (NeuronicS.A). Este es un método no enzimático, me-diante el cual se provocan modificacionesquímicas en la pared celular de las bacteriasque permiten liberar el ADN mediante des-proteinización química “in situ” (18).

Posteriormente, para la obtención depulsotipos de bacterias, se digiere el ADN conla enzima de restricción Xba I, esta enzimahace corte en las cadenas de DNA cuando en-cuentra una secuencia T�CTAGA/AGATC�T. Para la digestión se siguieron lasinstrucciones del fabricante y se utilizaron 20

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U de la enzima para cada bloque de muestraen 200 µL de buffer de restricción y se incubóa 37°C durante 4 horas. Para la corrida elec-troforética se utilizó la cámara mini-CHEF,con un campo eléctrico de 10 vol/cm, a unatemperatura de 19°C, el buffer utilizado parala corrida fue Tris-Borato-EDTA (TBE) a unaconcentración de 0,5X, las muestras fueroncorridas en agarosa al 1,5%, se programaronseis rampas, la primera de 35 pulsos de 25 se-gundos cada uno, seguida de 45 pulsos de 20segundos, 60 pulsos de 15 segundos, 200 pul-sos de 10 segundos, 900 pulsos de 5 segundosy 80 pulsos de 3 segundos, para un tiempo decorrida de 5 horas y 17 minutos. Posterior a laelectroforesis se reveló el gel con bromuro deetidio y se fotografió con una cámara digitalSONY CyberShot de 5,1 megapixels y filtronaranja bajo iluminación ultravioleta.

Las imágenes digitales fueron analiza-das para determinar la migración de cadabanda utilizando como estándar un marca-dor de peso molecular lambda concatameri-zado que produce una escalera de bandas de49 Kb de diferencia, que va desde 49 Kb hasta800 Kb (Promega). Una vez determinada laposición de cada banda se realizó una matrizde semejanzas y diferencias entre los diferen-tes patrones de bandas y se realizó un análisistipo cluster utilizando el software SPSS ver-sión 11, lo que permitió clasificar los aisla-mientos en grupos o clusters de acuerdo a sussemejanzas o diferencias.

Resultados

De las 100 cepas estudiadas, 41 fueronde E. coli y 59 de K. pneumoniae. Al distri-buirlas según su procedencia, tenemos quepara E. coli 26, 11 y 4 cepas pertenecían a launidad de cuidados intensivos de adultos(UCIA), unidad de cuidados intensivos de pe-diatría (UCIP) y neonatología (NEO), respec-

tivamente; mientras que, para K. pneumo-

niae 35, 21 y 3 cepas pertenecían a la UCIA,UCIP y NEO, respectivamente.

El 39,02% de las cepas de E. coli y el52,54% de las de K. pneumoniae fueronBLEE positivas. Al discriminar la produc-ción de BLEE según la ubicación del pacien-te en cada unidad de cuidados intensivos, te-nemos que para la UCIA, el 23,08% de lascepas de E. coli fueron productoras deBLEE; mientras que para la UCIP y NEO el54,55% y el 100,00% de las cepas respectiva-mente, fueron productoras de BLEE. En elcaso de K. pneumoniae, el 42,86% de las ce-pas de la UCIA fueron productoras de BLEE,mientras que el 71,43% y el 33,33% de las ce-pas de la UCIP y NEO respectivamente, fue-ron productoras de BLEE. La Tabla 1 mues-tra la distribución de la producción de BLEEen las cepas de E. coli y K. pneumoniae, ais-ladas de pacientes de las unidades de cuida-dos intensivos.

En el caso de las cepas de E. coli aisladasde la UCIA se observaron altos niveles de re-sistencia a fluoroquinolonas (66,70%); paralos aminoglucósidos se observa un 33,30% deresistencia a TM, un 20,00% de resistencia aGM pero no se detectó resistencia a AK yNET; para C y SXT se observa un 50,00% deresistencia y para TE un 83,30%. En cuanto alos antibióticos betalactámicos se observanaltos niveles de resistencia a penicilinas y ce-falosporinas de primera y segunda genera-ción; las cefalosporinas de tercera generacióntuvieron un comportamiento divergente, porejemplo CTX y CPD presentaron 100,00% deresistencia, CRO 66,70%, ZOX 16,70% mien-tras que; para CAZ no se presentó resistencia,en cuando a FEP (cefalosporina de cuarta ge-neración) el porcentaje de resistencia fue de20,00%. No se detectó resistencia a FOX,ATM ni a los carbapenemas; en cuanto a losantibióticos combinados con inhibidores de

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betalactamasas se observa un 100,00% de re-sistencia para CFS, un 66,60% para SAM,50,00% para AMC y 16,70% para TZP.

En el caso de las cepas de E. coli aisladasde la UCIP se observó un 33,30% de resisten-cia a fluoroquinolonas; en cuanto a los ami-noglucósidos se observa un 100,00% de re-sistencia a TM, un 66,70% de resistencia aGM; un 50,00% a AK y 16,70% para NET;para TE se observó un 100,00% de resisten-cia, 80% a SXT y 16,70% para C. En cuanto alos antibióticos betalactámicos se observanaltos niveles de resistencia a penicilinas y ce-falosporinas de primera y segunda genera-ción; las cefalosporinas de tercera generacióntuvieron un comportamiento similar a losaislados de la UCIA, CTX, CPD y CRO100,00% de resistencia, CAZ 66,60% y ZOX50,00%, en cuando a FEP el porcentaje de re-sistencia fue de 33,30%. No se detectó resis-tencia a FOX ni a los carbapenemas; ATMpresentó un 50,00% de resistencia y, encuanto a los antibióticos combinados coninhibidores de betalactamasas, se observa un100,00% de resistencia a CFS, 66,70% paraSAM, 20,00% para AMC y no se observó re-sistencia a TZP.

Para las cepas de E. coli aisladas deNEO, se observó un 50,00% de resistencia afluoroquinolonas; en cuanto a los aminoglu-cósidos se observó un 100,00% de resistenciaTM y GM, y un 50,00% para AK y NET; paraTE se observó un 100,00% de resistencia ypara C y SXT un 75,00%. En cuanto a los anti-bióticos betalactámicos se observan altos ni-

veles de resistencia a penicilinas y cefalospo-rinas de primera y segunda generación aligual que los aislados de la UCIA y UCIP; lascefalosporinas de tercera generación tuvie-ron el siguiente comportamiento, CTX, CPDy CRO 100,00% de resistencia, CAZ 50,00%ZOX 66,70%, en cuando a FEP el porcentajede resistencia fue de 100,00%. No se detectóresistencia a FOX ni a los carbapenemas; elmonobactámico ATM presentó un 100,00%de resistencia y en cuanto a los antibióticoscombinados con inhibidores de betalactama-sas se observa un 100,00% de resistencia aCFS, 50,00% para SAM, 33,30% para AMC yno se observó resistencia a TZP.

En cuanto a las cepas de K. pneumoniae

aisladas de la UCIA, se observó de 81,80% a93,30% de resistencia a fluoroquinolonas; encuanto a los aminoglucósidos se observa un71,40% de resistencia TM, 46,70% para GM yNET, y 40,00% para AK; TE presentó un66,70% de resistencia, C 86,70% y SXT un93,30%. En cuanto a los antibióticos betalac-támicos se observan altos niveles de resisten-cia a penicilinas y cefalosporinas de primeray segunda generación; las cefalosporinas detercera generación tuvieron el siguiente com-portamiento, CPD 100,00% de resistencia,CAZ y CRO 80,00%, CTX 71,40% y ZOX26,70%, en cuando a FEP el porcentaje de re-sistencia fue de 16,17%, la resistencia a FOXfue de 13,30%; no se detectó resistencia a loscarbapenemas; el monobactámico ATM pre-sentó un 93,30% de resistencia y en cuanto alos antibióticos combinados con inhibidores

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Tabla 1. Distribución de la Producción de BLEE en las cepas de E. coli y Klebsiella pneumoniae,aisladas de pacientes internados en las unidades de cuidados intensivos.

Microorganismos Total de Cepas UCIA UCIP NEO

Nº BLEE+ Nº BLEE+ Nº BLEE+ Nº BLEE+

Escherichia coli 41 16(39.02%) 26 6(23,08%) 11 6(54,55%) 4 4(100,00%)

Klebsiella pneumoniae 59 31(52,54%) 35 15(42,83%) 21 15(71.43%) 3 1(33.33)

de betalactamasas se observa un 53,30% paraSAM, 42,90% para AMC, 26,70% a TZP y nose observó resistencia a CFS.

Las cepas de K. pneumoniae aisladas dela UCIP, mostraron los siguientes perfiles deresistencia, de 33,30% a 46,70% de resisten-cia a fluoroquinolonas; para los aminoglucó-sidos se observa un 86,70% de resistenciaTM, 60,00% para GM, 53,30% para AK y33,30 para NET; TE presentó un 13,30% deresistencia, C 60,00% y SXT un 88,90%. Encuanto a los antibióticos betalactámicos seobservan altos niveles de resistencia a penici-linas y cefalosporinas de primera y segundageneración; las cefalosporinas de tercera ge-neración tuvieron el siguiente comporta-miento, CAZ 80,00%, CPD 75,00%, CRO73,30%, CTX 71,40% y ZOX 33,30% de resis-tencia, en cuando a FEP el porcentaje de re-sistencia fue de 62,50%, la resistencia a FOXfue de 20,00%; no se detectó resistencia a loscarbapenemas; el monobactámico ATM pre-sentó un 93,30% de resistencia y en cuanto alos antibióticos combinados con inhibidoresde betalactamasas se observa un 85,70% paraSAM, 50,00% para AMC, 33,33% a TZP y25,00% a CFS.

En cuanto a las cepas de K. pneumoniae

aisladas de NEO, se observó 100,00% de re-sistencia a todos los antibióticos probados aexcepción de AK, GM, TM, NET, IPM. MEMy ETP que fueron los únicos que mostraronsensibilidad.

Las Figuras 1 y 2 muestran los resulta-dos de la ECP en las cepas de E. coli y K.

pneumoniae respectivamente, se puede ob-servar que cada cepa posee un patrón de ban-das totalmente diferente, por lo que los por-centajes de similitud son bajos, a excepciónde cuatro cepas de K. pneumoniae (carriles 8y 9, y carriles 12 y 13), que si presentan altosporcentajes de similitud, dos se aislaron deNEO y dos de la UCIP.

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Figura 1. Electroforesis de campo pulsado de las ce-pas de E. coli, en el carril 1 marcador de pesomolecular, carriles 2–15 muestras aisladasde pacientes, nótese el alto grado de policlo-nalidad presente entre los aislamientos.

Figura 2. Electroforesis de campo pulsado de lascepas de K. pneumoniae, en el carril 1marcador de peso molecular, carriles 2 –14 muestras aisladas de pacientes, aligual que en E. coli se observa un alto gra-do de policlonalidad, pero los aisladosubicados en los carriles 8 y 9 poseen unalto grado de similitud, al igual que losubicados en los carriles 12 y 13.

Discusión

En los últimos años se ha descrito un in-cremento en el aislamiento de enterobacte-rias productoras de betalactamasas de espec-tro extendido (BLEE) posiblemente relacio-nado con el uso generalizado de cefalospori-nas de amplio espectro (19). Desde 1983, añode aparición de la primera cepa productorade BLEE, estos microorganismos se han idodescribiendo en diferentes partes del mundo.En esta investigación es importante resaltarel hecho de que un número importante de ce-pas de E. coli (39,02%) y K. pneumoniae

(52,54%), aisladas a partir de pacientes inter-nados en unidades de cuidados intensivos,son capaces de producir BLEE; estos resulta-dos se corresponden con los descritos por di-versos autores a nivel regional y mundial(20, 21), quienes también han reportado im-portantes porcentajes en la producción deBLEE por parte de estas cepas.

Al comparar los porcentajes de produc-ción de BLEE de estos microorganismos, seevidencia que K. pneumoniae fue el principalproductor de BLEE. Esto probablemente sedebe a la capacidad de este microorganismode desarrollar competencia de manera natu-ral, lo cual le confiere cierta ventaja adaptati-va, esta competencia, favorece la adquisiciónde determinantes genéticos de resistencia(plásmidos, transposones, integrones) (22);además, las cepas de K. pneumoniae, son pa-tógenos nosocomiales por excelencia, capa-ces de permanecer durante largos períodosde tiempo en los ambientes y utensilios hos-pitalarios, adicionalmente, en la mayoría delos casos, portan plásmidos de multiresisten-cia a los antimicrobianos, que poseen genesque codifican la producción de BLEE y son al-tamente estables. Un estudio realizado porHibbert Rogers (23) demuestra que en unservicio hospitalario donde se aislaban con

frecuencia cepas de K. pneumoniae produc-toras de BLEE, se suspendió el uso de cefa-losporinas de amplio espectro por cuatroaños para el tratamiento de los pacientes, sinembargo, después de cuatro años los pacien-tes internados en ese servicio continuabanadquiriendo infecciones por cepas K. pneu-

moniae productoras de BLEE, lo que de-muestra que los plásmidos de resistencia eneste microorganismos son altamente esta-bles. Al parecer los principales factores deriesgo para la adquisición de estas cepas pro-ductoras de BLEE son el tratamiento con an-tibióticos de amplio espectro, largas estan-cias hospitalarias y la ejecución de procedi-miento invasivos (24).

A nivel nacional, El Grupo Venezolanode Vigilancia de la Resistencia Bacteriana(GVRB) refiere porcentajes de resistenciamás elevados en las cepas de K. pneumoniae

que las cepas de E. coli (25); mientras que, anivel regional, el Centro de Referencia Bacte-riológica del Servicio Autónomo HospitalUniversitario de Maracaibo (26), también re-porta mayores índices de resistencia a los an-timicrobianos en cepas de K. pneumoniae

que en E. coli.Al analizar los resultados de los perfiles

de resistencia de las cepas de E. coli BLEE po-sitivas, se puede notar que la cefalosporina detercera generación más afectada por la pre-sencia de la enzima es CTX, seguida por CRO yen último lugar se ve afectada CAZ, este pa-trón siguiere la presencia de una betalactama-sa tipo cefotaximasa, que tiene preferenciapor degradar CTX y no CAZ, esta posiblemen-te sea de la familia CTX-M, betalactamasa quese ha descrito muy asociada a cepas de E. coli

en América Latina (27). En cuanto a FOX, to-dos los aislamientos de E. coli se mostraronsensibles, pero presentaron valores de suscep-tibilidad intermedia a este antimicrobianoque van desde 16,70% hasta 25,00% (datos no

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mostrados); esto podría indicar la asociaciónde otro tipo de betalactamasa perteneciente ala clase C de la clasificación de Ambler (28),la betalactamasas plasmídica Amp-C, que adiferencia de las BLEE confiere resistencia alas cefamicinas como el FOX; otro aspectoque respalda esta suposición es la resistenciaobservada a los antibióticos con inhibidoressuicidas de betalactamasa, AMC, SAM, PTZ yCFS, las cepas productoras de BLEE general-mente son sensibles a estos inhibidores, yaque ellos actúan inhibiendo la acción de laenzima, pero en el caso de encontrarse en unmedio con una bacteria productora deAmp-C estos inhibidores actúan como induc-tores de su expresión por lo que se observaresistencia a estas combinaciones de antibió-ticos con inhibidores suicidas. Todo esto su-giere que las cepas de E. coli expresan más deun tipo de betalactamasa a la vez, lo que com-plica el panorama terapéutico dentro de unainstitución prestadora de salud ya que estasbetalactamasas son de origen plásmidico y sediseminan fácilmente en ambientes hospita-larios, por lo que ocasionan un gran problema.Por otra parte, los carbapenemas siguen cons-tituyendo el grupo de antibióticos de elecciónpara el tratamiento de cepas productoras debetalactamasas y debido, a que, no pueden serhidrolizados por estas enzimas presentan100% de susceptibilidad.

En cuanto a los aminoglucósidos, las ce-pas de E. coli mostraron niveles de resistenciamuy variados que van desde cero hasta cien,estos resultados se comprenden mejor al se-parar las cepas según su procedencia, en laUCIA los resultados de resistencia son bajos,los más afectados fueron TM (33,30%) y GM(20,00%), mientras que NET y AK fueron to-talmente sensibles, esto puede explicarse conel hecho de que AK y NET son los aminoglucó-sidos más nuevos en el mercado, mientras quelos otros dos son más antiguos, por lo que las

bacterias han permanecido en contacto conellos durante mayor tiempo y han tenido ma-yor oportunidad de desarrollar resistencia.Sin embargo, cuando se analizan los resulta-dos de resistencia a estas drogas en las cepasde E. coli aisladas de la UCIP y NEO se obser-van niveles mucho más altos de resistencia,pero se mantiene la característica de ser másefectivos NET y AK (29).

En cuanto a la resistencia a quinolonaspueden observarse altos niveles de resisten-cia principalmente en las cepas aisladas de laUCIA, esto es comparable con lo obtenidopor otros autores (19, 30), los niveles de re-sistencia en la UCIP y NEO son inferiores,probablemente esto se deba a la mala utiliza-ción de las quinolonas para el tratamiento delas infecciones urinarias de la comunidad, loque a traído como consecuencia altos nivelesde resistencia, por otra parte, las quinolonaseran hasta hace poco de uso exclusivo en eltratamiento en adultos, desde hace pocotiempo, se han comenzado a utilizar en el tra-tamiento de niños, esto podría en parte expli-car los bajos niveles de resistencia encontra-dos en la UCIP y NEO en comparación con losencontrados en la UCIA, probablemente eluso de estas drogas en niños permitirá que encierto tiempo se cambien los patrones de re-sistencia de los microorganismo general-mente presentes en el ambiente de nuestrasunidades de cuidados intensivos de pediatríay neonatología. Además, por razones pococonocidas, las cepas BLEE positivas son másfrecuentemente resistentes a quinolonas quelas cepas no productoras de BLEE (19).

Al analizar los patrones de resistenciaobtenidos en K. pneumoniae, puede obser-varse que el comportamiento de los antibióti-cos betalactámicos fue muy similar, pero, eneste caso CAZ fue la cefalosporina de tercerageneración más susceptible a la acción de labetalactamasa, a pesar de que la diferencia es

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ligera, otro factor importante es la resistenciaa ATM, que en el caso de K. pneumoniae esalta, sobre todo en la UCIA cuando se compa-ra con el valor de las cepas de E. coli, estecambio en los perfiles de resistencia indica lapresencia de una betalactamasa SHV, propiade las especies de Klebsiella, o una betalacta-masas tipo TEM la cual confiere resistencia acefalosporinas de tercera generación, espe-cialmente a CAZ (31). En el caso de K. pneu-

moniae si se observan valores de resistencia aFOX y a las combinaciones con inhibidoressuicidas, lo que al igual que en E. coli podríaindicar la presencia de una betalactamasatipo Amp-C (32). Al igual que en E. coli, loscarbapenemas se mostraron 100,00% sensi-bles a la acción de las betalactamasas.

Los aminoglicósidos en las cepas de K.

pneumoniae se comportaron de igual mane-ra que en las cepas de E. coli, TM y GM fueronlos que presentan mayores porcentajes de re-sistencia, mientras que NET y AK presenta-ron porcentajes menores, por lo que son másefectivos; a diferencia de las cepas de E. coli,en el caso de K. pneumoniae, los mayoresporcentajes de resistencia se obtuvieron delos pacientes de la UCIP, seguidos de laUCIA, mientras que en NEO no se detectó re-sistencia a ninguno de los aminoglicósidosprobados, esto probablemente se debe a quesolo se aisló una cepa de K. pneumoniae

BLEE positiva de este servicio, por lo que noes prudente realizar ningún tipo de afirma-ción al respecto ya que la población estudiadaes muy baja.

En cuanto a la resistencia a quinolonas,se presenta de la misma forma que en E. coli,con la diferencia de que las cepas de K. pneu-

moniae mostraron valores mucho más altosde resistencia que las cepas de E. coli, estosvan desde un 81,80% hasta un 93,30% en laUCIA, mientras que en la UCIP los valoresson más bajos (33,30%-46,70%), esto puede

explicarse por el mal uso de la quinolonascomo tratamiento de las infecciones urina-rias adquiridas en la comunidad, principal-mente en adultos (19, 30), y su poco o recien-te uso en pacientes pediátricos. Cabe desta-car que para el caso de NEO, donde solo sedetectó un aislado BLEE positivo, este pre-sento resistencia a las quinolonas probadas,pero no podemos elaborar conclusiones yaque la población estudiada es muy baja. Esimportante resaltar que las cepas de K. pneu-

moniae BLEE negativas aisladas de las tresunidades de cuidados intensivos fueron alta-mente sensibles a quinolonas, a diferencia delas cepas de E. coli que si mostraron valoresimportantes de resistencia (datos no mostra-dos), esto corrobora lo descrito por Paterson(30), quien describe una fuerte asociaciónentre la producción de BLEE y la resistencia aquinolonas. La resistencia a ciprofloxacina inK. pneumoniae, está estrechamente asociadacon la producción de BLEE, este asociaciónes preocupante, ya que los aislados producto-res de BLEE usualmente son resistentes a pe-nicilinas, cefalosporinas, aminoglicósidos ySXT, por lo que la resistencia a quinolonas li-mita severamente la ya limitadas opciones detratamiento para una cepa BLEE positiva. Elestudio de Paterson (30), encontró que un60,00% de las cepas de K. pneumoniae pro-ductoras de BLEE fueron resistentes a quino-lonas, y que el 78% de las cepas de K. pneu-

moniae resistentes a ciprofloxacina fueronproductoras de BLEE; todos estos datos sonsimilares a las cifras halladas en nuestro es-tudio, lo que demuestra la fuerte asociaciónentre la producción de BLEE y la resistencia aquinolonas.

Una posible explicación a este fenóme-no de coexistencia de dos mecanismos de re-sistencia es la transferencia de ambos en unmismo plásmido; sin embargo, la resistenciaa quinolonas en E. coli y K. pneumoniae se

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debe predominantemente a mutaciones cro-mosomales en los genes gyrA y parC, loscuales codifican el banco de acción de lasquinolonas (33). Sin embargo, ya se ha pu-blicado el primer estudio de resistencia aquinolonas mediada por plásmidos (34); esimportante resaltar que este plásmido tam-bién codificaba la producción de BLEE y fueaislado de una cepa de K. pneumoniae, a pe-sar de que solo proporcionaba bajos nivelesde resistencia a quinolonas, este facilitaba laadquisición altos niveles de resistenciacuando el microorganismo poseía otro fac-tor como deficiencia de porinas. La base dela resistencia a quinolonas producida poreste plásmido se basa en la producción deuna proteína “Qnr” que se encarga de prote-ger a la girasa de la acción de la quinolona,por lo que la actividad de esta no se ve afec-tada en presencia de la droga (35). Otra po-sible explicación para esta estrecha relaciónentre la resistencia quinolonas y a cefalos-porinas de tercera generación, es el eflujoactivo de antibióticos y la alteración de lasporinas de la membrana externa.

En los servicios de pediatría (UCIP yNEO), se observan porcentajes de resisten-cia mucho más elevados que en los serviciosde adultos (UCIA), esto podría explicarse enparte a factores condicionantes propios delpaciente, por lo general los niños, especial-mente los recién nacidos y los de muy cortaedad, no poseen un sistema inmunológicobien desarrollado, lo que los hace muy sus-ceptibles, otro factor importante, especial-mente en recién nacidos, es que no poseenuna flora normal establecida, por lo quecualquier patógeno presente en el ambientepuede fácilmente colonizarlos y producir unproceso infeccioso, esta misma carencia deun sistema inmunológico desarrollado es loque permitiría que una vez instalado el pató-geno este desarrolle y adquiera rápidamente

múltiples mecanismos de resistencia, esto seevidencia al observar los perfiles de resisten-cia, las cepas aisladas de UCIP y NEO sonmás resistentes y a más antibióticos a la vezque las cepas aisladas de UCIA, especialmen-te en los aislados de K. pneumoniae proce-dentes de NEO.

El análisis mediante ECP de las cepas deE. coli con XbaI mostró 14 genotipos diferen-tes, ninguno de los cluster mostró más de un80% de similaridad, se puede observar unalto grado de heterogeneidad genética entretodos los cluster identificados. Las cepas noestán genéticamente relacionadas y no se en-contró ninguna cepa epidémica. Por el con-trario, la variación en el patrón de resistenciade las cepas ESBL fue menor, esto sugiereque un incremento en el número de microor-ganismos productores de BLEE en estos ser-vicios, se debe principalmente a la disemina-ción de plásmidos de resistencia o mutacio-nes de las betalactamasas plamídicas exis-tentes, producto de la presión selectiva ejer-cida por el abuso y mal uso de cefalosporinasde tercera generación, esto resultados sonmuy parecidos a los reportados por PeterYuk-Fong Liu (36), pero diferentes a los re-portados en otras investigaciones (37, 38)que demuestran que la diseminación de ce-pas productoras de BLEE (especialmente ce-pas de K. pneumoniae productoras deSHV-5) en hospitales es debido principal-mente a diseminación clonal.

En el análisis mediante ECP para las ce-pas de K. pneumoniae con XbaI se identifica-ron 13 genotipos diferentes, al igual que en E.

coli se observa una alta heterogeneidad gené-tica entre los cluster identificados, sin varia-ción en el perfil de resistencia, lo que indicadiseminación de plásmidos producto del maluso de cefalosporinas de amplio espectro,esto concuerda con resultados presentadospor otras investigadores (36), pero para K.

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pneumoniae, se identificaron dos cluster conmás de un 80% de similaridad, lo que las cla-sifica como estrechamente relacionadas, dosfueron aisladas de NEO y dos de UCIP, esteresultado es parecido al presentado por Yu enTaiwán y otros autores (39), donde demos-traron diseminación dentro de unidades decuidados intensivos de cepas de K. pneumo-

niae productoras de BLEE.Estos resultados demuestran la impor-

tancia que poseen las cepas productoras deBLEE en nuestras unidades de cuidados in-tensivos, otro dato importante es que de-muestra que esta resistencia, se da principal-mente, por diseminación de plásmidos pro-ducto del mal uso de las cefalosporinas deamplio espectro que ejercen una presión se-lectiva que favorece la aparición de mecanis-mos de resistencia; también es importanteresaltar que en menor grado, pero sin dejarde ser importante, existe diseminación clonalde estos microorganismos producto de lamala aplicación de medidas de contenciónprimarias para el control de enfermedades enambientes hospitalarios, como son el cambiode guantes, el lavado de las manos, buena de-sinfección de equipos, etc.

Las cepas de E. coli y K. pneumoniae

productoras de BLEE aisladas en esta inves-tigación son altamente resistentes a la mayo-ría de los antimicrobianos, por el tratamientode estos pacientes se hace muy complicado,quedando únicamente como alternativa tera-péutica, el uso de los carbapenemas; sin em-bargo, se debe tener cuidado de no sobreutili-zar estos agentes antimicrobianos, ya que sumala utilización puede ejercer presión selec-tiva y conducir a la aparición de resistenciaen cepas de P. aeruginosa y A. baumanni,por lo que el uso de carbapenemas deberíarestringirse para bacteriemias severas pro-ducidas por cepas productoras de BLEE y

Amp-C, y reemplazar su uso en la medida delos posible con otros antimicrobianos o com-binaciones de estos.

La ECP demostró ser una herramientamuy útil en el control de las infecciones noso-comiales, ya que permite discriminar comose realiza la diseminación de los diferentesmicroorganismos, así como, en algunos casosidentificar las fuentes de contaminación, loque permite diseñar estrategias efectivaspara el control de las mismas.

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