Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa...

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Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa ( Passiflora edulis Sims.) en la región del Sumapaz (Cundinamarca) Donald Heberth Riascos Ortíz Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ingeniería Agronómica, Escuela de Posgrados Bogotá, Colombia 2011

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Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa (Passiflora edulis Sims.) en la

región del Sumapaz (Cundinamarca)

Donald Heberth Riascos Ortíz

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería Agronómica, Escuela de Posgrados

Bogotá, Colombia

2011

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Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa (Passiflora edulis Sims.) en la

región del Sumapaz (Cundinamarca)

Donald Heberth Riascos Ortíz

Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Agrarias con énfasis en Fitopatología

Directora:

Ph.D. Lilliana María Hoyos-Carvajal

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería Agronómica, Escuela de Posgrados

Bogotá, Colombia

2011

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Dedicado a

mis padres Janeth Ortiz y Donald Riascos,

por su apoyo incondicional, a mi hijo Daniel

Eduardo por ser la principal motivación en mi

vida, a Maritza y Carolina por su apoyo .

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Contenido VI

Agradecimientos

A Lilliana Maria Hoyos Carvajal, Ph.D. y docente asociada a la Facultad de Agronomía de

la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, por sus valiosos aportes y

participación activa como directora en esta investigación.

Al proyecto “Análisis epidemiológico y valoración económica de las principales

enfermedades de la gulupa”, por financiar y llevar a feliz término este trabajo

investigativo.

A los estudiantes de Ingeniería Agronómica Ivonne Quiroga y Rafael Gómez, por su

participación activa, además de su compromiso y dedicación en el desarrollo de la

investigación.

Al Centro de Biodiversidad Fungal en Utrecht-Holanda y en especial a los Doctores Ewal

Groenewald, Pedro Crous y Ulrike Damm, por su amable colaboración en la identificación

molecular de aislamientos del género Cladosporium asociados a Roña en gulupa.

A Ricardo Mora M.Sc., por su colaboración en la colecta de material vegetal con

síntomas de Roña en los municipios de Venecia, San Bernardo, Tibacuy.

A los laboratoristas Wadith de León y Jesús León, vinculados al laboratorio de Sanidad

Vegetal de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional, sede Bogotá, por sus

asesorías en el procesamiento y análisis histológico de material vegetal de gulupa con

síntomas de Roña.

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Contenido VII

Contenido

Pág.

Resumen…………………………………………………………………………………….……..9

Lista de figuras………………………………………………………………………….……….11

Lista de tablas……………………………………………………………………………….…..13

Introducción……………………………………………………………………………….……..14

1. Capítulo 1...…………………………………………………………………………………17 Caracterización morfológica y molecular de aislamientos del género Cladosporium asociados a Roña engulupa……………………………………………………………….16 Introducción………………………………………………………………………………….16 1.1 Materiales y métodos.……………………………………….………………………….23 1.1.1Localización.…………………………………………………………………………...23 1.1.2 Aislamiento de microorganismos asociados a material vegetal enfermo..……..……………………………………………………………………..23 1.1.3 Caracterización morfológica de aislamientos de Cladosporium………………...23 1.1.4 Análisis molecular de aislamientos de Cladosporium…………………………….25 1.1.5 Análisis estadístico…………………………………………………………………...25 1.2 Resultados……………………………………………………………………………….26 1.2.1 Microorganismos asociados a material vegetal enfermo…………………………26 1.2.2 Evaluación macroscópica de aislamientos de Cladosporium……………………27 1.2.3 Evaluación microscópica de aislamientos de Cladosporium…………………….32 1.2.4 Reporte de evaluación molecular de aislamientos de Cladosporium………......35 1.3 Discusión………………………………………………………………………………...36

2. Capítulo 2…………………………………………………………………………………...39 Determinación de la patogenicidad de Cladosporium en gulupa………………….…..39 Introducción………………………………………………………………………………....39 2.1 Materiales y métodos…………………………………………………………………..43 2.1.1Localización…………………………………………………………………………...43 2.1.2 Preparación de inoculo para pruebas de patogenicidad…………………..…....43 2.1.3 Pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio……………………...43 2.1.4 Pruebas de patogenicidad en condiciones de invernadero…………………….44 2.1.5 Análisis de microscopía de Barrido Electrónico en hojas inoculadas artificialmente………………………………………………………………………………44 2.1.6 Análisis estadístico………………………………………………………………….45 2.2 Resultados……………………………………………………………………………..45

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VIII

2.2.1 Pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio……………………...45 2.2.2 Pruebas de patogenicidad en condiciones de invernadero…………………….49 2.3 Discusión……………………………………………………………………………….56

3. Capítulo 3…………………………………………………………………………………...62 Análisis de la sintomatología de la Roña en gulupa……………………………………62 3.1 Materiales y métodos..………………………………………………………………...65 3.1.1 Localización…………………………………………………………………………..65 3.1.2 Muestreo de material vegetal con síntomas de Roña…………………………...65 3.1.3 Caracterización de síntomas de Roña…………………………………………….66 3.2 Resultados……………………………………………………………………………...67 3.2.1 Caracterización de síntomas de Roña…………………………………………….67 3.3 Discusión………………………………………………………………………………..72

4. Conclusiones y Recomendaciones……………………………………………………....76 4.1 Conclusiones……………………………………………………………………………76 4.2 Recomendaciones……………………………………………………………………..77 A Anexo: Color de colonias de aislamientos de Cladosporium asociados a gulupa, de acuerdo con el manual Pantone®……………………………79

Bibliografía..…………………………………………………………………………………..….80

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Resumen

En la actualidad la gulupa, Passiflora edulis f. edulis, es una especie

económicamente importante dado el potencial de exportación de la fruta,

ocupando el cuarto puesto seguido del banano, plátano y uchuva. En el país, el

departamento con mayor producción de la fruta es Cundinamarca, con

importantes zonas productoras en los municipios de Venecia, San Bernardo,

Granada y Tibacuy. Sin embargo, en los últimos años los volúmenes de

producción se han venido disminuyendo en estas zonas por enfermedades

asociadas al cultivo, entre las que se incluye la Roña, la cual afecta la producción

exportable por daño estético de la fruta. En vista de que esta enfermedad se ha

encontrado asociada a Cladosporium, principalmente, en este estudio se

caracterizó por análisis morfológico y molecular aislamientos del hongo, también

se evaluó la patogenicidad de estos mismos aislamientos en hojas y frutos de

gulupa en laboratorio e invernadero y se caracterizó macro y microscópicamente

la sintomatología de la enfermedad. Los resultados sugieren a C. cladosporioides

sensu lato y C. lycoperdinum sensu estrito como la identidad de los aislamientos

del hongo, algunos de los cuales fueron patogénicos al reproducir los síntomas de

la enfermedad con la inoculación artificial. El desarrollo de los síntomas de Roña

esta correlacionado con degradación de células y tejidos, posiblemente por

liberación de toxinas, aunque repuestas de defensa en la planta toman lugar a

través de la formación de capas de absición en hojas y de corcho en frutos.

Palabras claves: Cladosporium, taxonomía, patogenicidad, sintomatología.

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Abstract

The gulupa, Passiflora edulis f. edulis, is an species important economically given

the potential for export of fruit, occupying the fourth position after of banana,

plantain and Physalis. In Colombia, the department with the higher of production

of the fruit is Cundinamarca, with important producing areas in the municipalities

of Venecia, San Bernardo, Granada and Tibacuy. However, in recent years the

production volumes have been declining in these areas due to diseases

associated with the cultivation, among which includes the scab, which affects the

production exportable of fruit by aesthetic damage. This disease has been found

associated with Cladosporium, mainly. In this study were characterized isolates of

the Cladosporium through morphological and molecular analysis, was also

evaluated the pathogenicity of these same isolates on leaves and fruits of gulupa

in laboratory and greenhouse and characterized the symptoms of the disease

macro and microscopically. The results suggest to C. cladosporioides sensu lato

and C. lycoperdinum sensu estrito as the causal agent of the disease, some

isolates of the fungi were pathogenic to reproduce the symptoms of the disease by

artificial inoculation. The development of scab symptoms is correlated with

degradation of cells and tissues, probably due to release of toxins, although

responses of plant defense takes place through the formation of abscission layers

in leaves and cork in fruits.

Keywords: Cladosporium, taxonomy, pathogenicity, symptomatology.

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Lista de figuras

Pág.

Figura 1: Colonias de Cladosporium crecidas en PDA, AEM y AA …………………….…28

Figura 2: Crecimiento y modelamiento de aislamientos de Cladosporium……………….31

Figura 3: Características microscópicas de aislamientos de Cladosporium

asociados a gulupa……………………………………………………………………………...33

Figura 4: Tamaño promedio de estructuras microscópicas de aislamientos

de Cladosporium asociados a gulupa…………………………………………………………35

Figura 5: Árbol filogenético construido con secuencias ITS de aislamientos de

Cladosporium…………………………………………………………………………………….36

Figura 6: Secuencia de síntomas de Roña en frutos inoculados

con herida en laboratorio……………………………………………………………………….46

Figura 7: Secuencia de síntomas de Roña en frutos inoculados

sin herida en laboratorio………………………………………………………………………...46

Figura 8: Secuencia de síntomas de Roña en hojas inoculadas

artificialmente con Cladosporium en laboratorio……………………………………………..48

Figura 9: Secuencia de síntomas de Roña en hojas inoculadas

artificialmente con Cladosporium en invernadero……………………………………………50

Figura 10: Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico de

hoja de gulupa sana…………………………………………………………………………….51

Figura 11: Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico de

hoja de gulupa con síntomas intermedios de Roña………………………………………...51

Figura 12: Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico de

ramoconidias asociadas a hoja de gulupa con síntomas de Roña………………………..52

Figura 13: Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico de

hifas de conidióforos asociadas a hoja con síntomas de Roña……………………………52

Figura 14: Secuencia de síntomas de Roña en frutos inoculadas

artificialmente con Cladosporium en invernadero…………………………………………...54

Figura 15: Periodos de incubación y de latencia promedio registrados

en condiciones de invernadero para aislamientos patogénicos en frutos y hojas……….55

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Figura 16: Síntomas iniciales e intermedios de Roña en frutos……………………….…..68

Figura 17: Síntomas avanzados de Roña en frutos…………………………………………69

Figura 18: Síntomas de Roña en hojas de gulupa…………………………………………..70

Figura 19: Síntomas de Roña en ramas de gulupa………………………………………....71

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Lista de tablas

Pág. Tabla 1: Cultivos con registros de enfermedades por Cladosporium……………………...18

Tabla 2: Parámetros para la definición de especies dentro de Cladosporium……………19

Tabla 3: Complejos de especies sensu lato y especies sensu

estricto asociadas………………………………………………………………………………..21

Tabla 4: Origen de aislamientos de Cladosporium caracterizados

morfológicamente………………………………………………………………………………..26

Tabla 5: Tamaño de estructuras microscópicas de aislamientos de

Cladosporium caracterizados morfológicamente…………………………………………….34

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Introducción

La Gulupa, Passiflora edulis f. edulis Sims., es una planta trepadora perenne, de

tallos marcadamente aristados, con flores solitarias y zarcillos que emergen de

las axilas de hojas trilobuladas, y frutos de 5-6 cm. de largo con pericarpo delgado

y duro de color púrpura. La fruta de la gulupa presenta una proyección

internacional alta, ocupando el cuarto lugar en las exportaciones de frutales

después del banano, plátano y uchuva. Su producción está dirigida en gran

medida a satisfacer las necesidades de mercados internacionales, especialmente

europeos, donde se ha incrementado la demanda de la fruta por su exquisito

sabor, pero también por sus cualidades organolépticas y nutricionales como

fuente de provitamina A, niacina, rivoflavina y ácido ascórbico, ideales en la

industria de alimentos (Wenkam, 1990; Pinzón et al., 2007).

La producción de gulupa en Colombia se concentra principalmente en los

departamentos de Cundinamarca, Antioquia y Boyacá, entre 1.800 y 2.400 msnm,

con temperatura y humedad relativa promedio diario de 17.2°C y 82.5% (Pachón

et al., 2006; Mora, 2011). Bajo estas condiciones se alcanzan producciones

adecuadas, aunque se favorece también la ocurrencia de distintos problemas

fitosanitarios, incluyendo plagas y enfermedades. Datos no oficiales reportan

pérdidas por aspectos fitosanitarios entre el 10 y el 30 % de la producción

exportable, lo cual correspondería a US$ 2.800.000 que dejarían de percibirse por

esta causa en el país.

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Con respecto a los patógenos asociados a pasifloras en Colombia, se cuenta con

un inventario de enfermedades asociadas a los cultivos del maracuyá Passiflora

edulis f. flavicarpa Degener, la granadilla Passiflora ligularis, y la curuba

Passiflora mollissima L., pero con respecto a los patógenos de gulupa P. edulis f.

edulis Sims. no se presenta informacion. En este inventario se reportan como

agentes causales de enfermedades en Pasifloras a diferentes especies de

Alternaria, Cladosporium, Colletothichum y Phoma (Buriticá, 1999; Castaño-

Zapata, 2009).

Gran interés en conocer los patógenos asociados al cultivo de gulupa ha

emergido en los últimos años, y especialmente aquellos que limitan severamente

la producción de la fruta. Recientemente, se ha definido como patógenos en

gulupa a los virus Cucumber Mosaic Virus CMV, Soybean Mosaic Virus SBMV,

Cowpea Aphid-Borne Mosaic Virus CoABMV y Potyvirus (Camelo, 2010), a la

bacteria Xanthomonas axonopodis que causa la Mancha de aceite

(Benítez, 2010), y a los hongos Fusarium oxysporum y F. solani, agentes

causantes del Marchitamiento vascular y la Pudrición del cuello de la raíz,

respectivamente (Ortíz, 2010). Sin embargo, no se ha confirmado el agente

etiológico de la Roña de la gulupa, una de las enfermedades con mayor

importancia en el cultivo por afectar todos los órganos aéreos de la planta y en

particular los frutos, en los que se reduce la calidad estética, limitándose la

exportación de la fruta a Europa, principalmente.

Debido a la demanda creciente de gulupa en el mundo, es necesario aumentar la

producción de la fruta en Colombia a través de la optimización del manejo

integrado de enfermedades en los sistemas agrícolas, por lo que es importante

avanzar en el diagnóstico de las enfermedades para las cuales no se ha

confirmado su agente causal, incluyendo la Roña. Para contribuir al conocimiento

de las enfermedades y patógenos asociados al cultivo de gulupa, se plantea en

este estudio los siguientes objetivos general y específicos: Caracterizar la

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etiología de la Roña de la gulupa P. edulis f. edulis Sims. en la región del

Sumapaz, Cundinamarca, 1) Determinar taxonómicamente el agente etiológico

asociado con la Roña de la gulupa, 2) Determinar la patogenicidad del agente

etiológico asociado con la Roña de la gulupa, y 3) Caracterizar la sintomatología

de la Roña en el cultivo de Gulupa.

El conocimiento del agente causal de la Roña en gulupa, permitirá desarrollar

métodos de evaluación de la enfermedad requeridos para la cuantificación de

pérdidas en producción y evaluación de materiales por resistencia. Igualmente, se

podrá llevar a cabo pruebas de eficacia de fungicidas y de agentes de control

biológico, como también estudios de epidemiología y de variabilidad genética de

las poblaciones del patógeno, necesarios para la formulación de programas de

manejo integrado de la enfermedad.

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1. Capítulo 1

Caracterización morfológica y molecular de aislamientos del

género Cladosporium asociados a Roña en gulupa

INTRODUCCIÓN

Cladosporium, es uno de los géneros más grandes de hyphomycetes, con más de

772 especies y teleomorfos en Davidiella (Braun et al., 2003; Dugan et al., 2004;

Schubert et al., 2007). Las especies de Cladosporium son comunes y

ampliamente distribuidas, incluyendo especies endófitas, patógenas en humanos,

patógenas en plantas y saprofitas. Las especies saprofitas ocurren en tallos y

hojas senescentes y muertas de plantas herbaceas y leñosas, como invasores

secundarios de manchas foliares necróticas, y son frecuentemente aisladas de

aire, suelo, productos alimenticios, pintura, textiles y otros materiales orgánicos

(Riesen y Sieber 1985, Brown et al., 1998, El­Morsy, 2000; Crous et al., 2007a).

Las enfermedades de plantas causadas por Cladosporium son comunes y

ampliamente distribuidas en vegetales, frutas y en algunos cultivos en campo a

través del mundo (Tabla 1). En gulupa, P. edulis f. edulis Sims., Cladosporium se

ha encontrado asociado a síntomas de Roña en la parte aérea de la planta, en

lesiones acuosas (ampollas) que posteriormente evolucionan a chancros y

finalmente a roñas cuando la enfermedad ocurre en frutos. En flores, las lesiones

aparecen en brácteas y sépalos como manchas húmedas, circulares de 5-10 mm.

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de diámetro, de color café cobrizo y esporulación gris verdoso en el centro.

Lesiones similares ocurren en hojas y ramas, observándose en este último

órgano hundimientos a manera de chancros (Mora, 2011).

Tabla 1. Cultivos con registros de enfermedades por Cladosporium.

Cultivo

Enfermedad

Especie del

patógeno

Referencia

Nuez (Carya illinoensis) Roña de la nuez C. carygenum Diehl and Graves,

1994

Lirio Alemán (Iris germánica) Mancha foliar del lirio

Alemán

C. iridis Shin y Lm, 1999

Sandía (Citrullus lanatus) Roña de la sandía C. cucumerinum Kwon et al., 1999

Frijol espada (Canavalia gladiata) Roña del frijol espada C. cucumerinum Kwon et al., 2000

Té (Thea sinensis) Roña del té C. herbarum Kwon et al., 2001a

Fresa (Fragaria ananassa) Roña de la fresa C. herbarum Kwon et al., 2001b

Tomate (Solanum lycopersicum) Moho foliar en tomate C. fulvum Agrios, 2005

Pepino (Cucumis sativus) Roña del pepino C. cucumerinum Agrios, 2005

Duraznero (Prunus persica) Roña y tizón de las ramas

del durazno

C. carpophilum Agrios, 2005

Arveja (Pisum sativum L.) Pudrición de la vaina y el

añublo de la arveja

C. cladosporioides Agrios, 2005

Bálsamo (Momordica charantia) Roña del bálsamo C. cucumerinum Kwon y Park, 2006

Espinaca (Spinacia oleraceae) Mancha foliar de

Cladosporium

C. variabile Hernandez y du

Toit, 2006.

Vid (Vitis vinifera) Pudrición de Cladosporium C. herbarum y

C. cladosporioides

Briceño y Latorre,

2008

Henbane egipcio (Hyoscyamus

muticus)

Roña del henbane egipcio C. herbarum Abdel-Motaal, 2009

Papayo (Carica papaya L.) Roña del papayo C. cladosporioides Chen et al., 2009

En los últimos años un concepto moderno de Cladosporium ha sido establecido

basado en exámenes morfológicos y análisis moleculares (Tabla 2). De esta

manera, estudios taxonómicos siguiendo una aproximación polifásica han sido

conducidos para definir distintas especies dentro de Cladosporium (Schubert y

Braun 2004; Heuchert et al., 2005; Schubert, 2005a, b; Braun et al., 2006, 2008a,

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b; Crous et al., 2006; Schubert et al., 2006; Braun y Schubert 2007; Crous et al.,

2007a,b; Arzanlou et al., 2007; Schubert et al., 2007; Zalar et al., 2007; Schubert

et al., 2009; Bensch et al., 2010).

Tabla 2. Parámetros para la definición de especies dentro de Cladosporium.

Tipo de

caracterización

Nivel de caracterización Procedimientos

Morfológica

Macroscópica

Evaluación del diámetro de colonias

crecidas en PDA (Papa dextrosa Agar),

AEM (Agar Extracto de Malta) y AA (Agar

Harina de Avena) a 25°C. al día 14.

Evaluación del color de las colonias

crecidas en los tres medios de cultivo al

día 14.

Microscópica

Determinación de los patrones de

ramificación de conidióforos.

Determinación del ancho y largo de 30

ramoconidias, conidias intercalar y

terminales a un aumento de 1.000x.

Estudios de microscopía de barrido

electrónico para definir la ornamentación

de pared de conidias y conidióforos.

Molecular

ITS

ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG Amplificación y alineamiento de

secuencias para definir el complejo de

especies sensu lato.

LR5: ATCCTGAGGGAAACTTC

Actina 512F: ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC

Amplificación y alineamiento de

secuencias para definir especies sensu

estricto dentro de los complejos de

especies sensu lato.

783R: TACGAGTCCTTCTGGCCCAT

Factor

de

elongaci

ón 1 alfa

728F: CATCGAGAAGTTCGAGAAGG

986R: TACTTGAAGGAACCCTTACC

Calmo-

dulina

228F: GAGTTCAAGGAGGCCTTCTCCC

737R: CATCTTTCTGGCCATCATGG

Histona

H3

H3-1a: ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG

H31b: GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT

Los hongos del género Cladosporium producen colonias efusas u ocasionalmente

punctiformes, a menudo de color verde oliva pero también algunas veces gris,

café o marrón oscuro, de textura aterciopelada, flocosa o vellosa y con micelio

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inmerso o superficial. Estroma algunas veces presente, setas e hifopodios

ausentes, conidióforos macronematosos o semimacronematosos y algunas veces

también micronematosos; los conidióforos macronematosos pueden ser rectos o

flexuosos, principalmente sin ramificar o con ramificaciones restringidas a la

región apical formando un estípite y cabeza, de color café o café oliva; con

ornamentación de pared lisa o verrucosa, ramoconidias a menudo presentes, con

células conidiógenas poliblásticas, usualmente integradas, algunas veces

discretas, simpodiales, más o menos cilíndricas, con cicatrices usualmente

prominentes. Las conidias son catenadas, pero algunas veces son solitarias,

especialmente en especies con muchas conidias, a menudo en cadenas

ramificadas, acropleurógenas, simple cilíndrica, doliforme, elipsoidal, fusiforme,

ovoide, esférica o subesférica, con una distinguible y protuberante cicatriz en

cada extremo o justo en la base, café oliva oscuro a pálido o café, liso,

verruculosa o equinulada, con 0-3 u ocasionalmente más septos (Ellis, 1971).

A nivel molecular distintos genes han sido amplificados y secuenciados en la

definición de especies dentro de Cladosporium (Tabla 3). Secuencias parciales de

las regiones ITS, y segmentos de los genes actina, calmodulina, factor de

elongación 1-α e histona H3 son considerados en la elucidación de especies

dentro del complejo C. herbarum, y ITS, actina y factor de elongación 1-α en C.

sphaerospermum y C. cladosporioides (Schubert et al., 2007; Dugan et al., 2008;

Bensch et al., 2010).

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Tabla 3. Complejos de especies sensu lato y especies sensu estricto asociadas.

Complejo de especies Especies sensu stricto Referencia

C. herbarum sensu lato C. antarcticum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504573

C. bruhnei Bull, 1974

C. herbaroides Schubert et al., 2007. MycoBank MB504574

C. herbarum Link, 1816

C. iridis De Vries, 1952

C. macrocarpum Preuss, 1948

C. ossifragi Braun y Schubert, 2007. MycoBank

MB504575

C. pseudiridis Schubert et al., 2007. MycoBank MB504576

C. ramotenellum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504577

C. sinuosum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504578

C. spinulosum Zalar et al., 2007

C. subinflatum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504579

C. subtilissimum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504580

C. tenellum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504581

C. varibile De Vries, 1952

C. Sphaerospermum sensu lato C. dominicanum Zalar et al., 2007. MycoBank MB510995

C. fusiforme Zalar et al., 2007. MycoBank MB510997

C. halotolerans Zalar et al., 2007. MycoBank MB492439

C. langeronii Fonseca y Nogueira, 1931.

C. sychrotolerans Zalar et al., 2007. MycoBank MB492428

C. salinae Zalar et al., 2007. MycoBank MB492438

C. sphaerospermum Penzig, 1882.

C. spinulosum Zalar et al., 2007. MycoBank MB501099

C. velox Zalar et al., 2007. MycoBank MB492435

C. cladosporioides sensu lato C. acalyphae Bensch et al., 2010. MycoBank MB517070

C. angustiporum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517071

C. asperulatum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517072

C. astraliense Bensch et al., 2010. MycoBank MB517073

C. basiinflatum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517074

C. chalastosporoides Bensch et al., 2010. MycoBank MB517075

C. chubutense Schubert et al., 2009.

C. cladosporioides De Vries, 1952.

C. colocasiae Sawada, 1916.

C. colombiae Schubert et al., 2009.

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Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz

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C. cucumerinum Ellis y Arthur, 1889.

C. delicatulum Cooke, 1876.

C. exasperatum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517076

C. exile Bensch et al., 2010. MycoBank MB517077

C. flabeliforme Bensch et al., 2010. MycoBank MB517078

C. funiculosum Yamam, 1959.

C. gamsianum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517079

C. globisporum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517080

C. hillianum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517081

C. inversicolor Bensch et al., 2010. MycoBank MB517082

C. iranicum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517083

C. licheniphilum Heuchert y Braun, 2006.

C. lycoperdinum Cooke, 1883.

C. myrtacearum Schubert , 2005a.

C. oxysporum Berk y Curtis, 1869

C. paracladosporioides Bensch et al., 2010. MycoBank MB517084

C. perangustum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517085

C. phyllactiniicola Bensch et al., 2010. MycoBank MB517086

C. phyllophilum McAlpine, 1896.

C. pini-ponderosae Schubert et al., 2009.

C. pseudocladosporioides Bensch et al., 2010. MycoBank MB517087

C. rectoides Bensch et al., 2010. MycoBank MB517088

C. scabrellum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517089

C. subuliforme Bensch et al., 2010. MycoBank MB517090

C. tenuissimum Cooke, 1878

C. uredinicola Morgan-Jones y McKemy, 1990

C. varians Braun et al., 2008b

C. verrucocladosporioides Bensch et al., 2010. MycoBank MB517091

C. vignae Gardner, 1925.

C. xylophilum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517092

En vista de que Cladosporium se ha encontrado asociado a lesiones de Roña en

gulupa, es necesario esclarecer la identidad taxonómica del hongo, no solo por

razones de manejo de la enfermedad, sino también por la condición de fruta de

exportación, pensando en que a futuro una limitante para expandir los mercados

puede ser el no tener definidos los patógenos asociados al cultivo. Este capítulo

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tiene como objetivo determinar taxonómicamente el agente etiológico asociado

con la Roña de la gulupa.

1.1 MATERIALES Y MÉTODOS

1.1.1 Localización

Esta fase del estudio se llevó a cabo en la región del Sumapaz, en los municipios

de Venecia, Tibacuy, San Bernardo y Granada, en donde se colectó material

vegetal con síntomas de Roña entre los años 2009 y 2010. Las muestras fueron

llevadas al laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Agronomía de la

Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, para su posterior

procesamiento.

1.1.2 Aislamiento de microorganismos asociados a material vegetal enfermo

Para el aislamiento de los microorganismos se esterilizó superficialmente

explantes con lesiones de la enfermedad, pasándolos por etanol al 70% e

hipoclorito de sodio al 2% por un minuto. Posteriormente, los explantes fueron

lavados tres veces con agua destilada estéril, secados con papel toalla estéril,

sembrados sobre PDA (Agar-Papa – dextrosa) e incubados por 7 días a 25ºC, de

acuerdo con el protocolo propuesto por Rivero (2000). Las colonias de hongos

crecidas en PDA fueron purificadas e identificadas hasta nivel de género, y para

algunos aislamientos fúngicos se obtuvo cultivos monospóricos, los cuales fueron

preservados en glicerina estéril al 10% a 4°C.

1.1.3 Caracterización morfológica de aislamientos de Cladosporium

Quince (15) aislamientos monospóricos, identificados como Cladosporium fueron

caracterizados taxonómicamente de acuerdo con los siguientes parámetros

propuestos por Schubert et al. (2007): (1) Características de las colonias: Los

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aislamientos se cultivaron e incubaron por 14 días en PDA, AEM (Agar extracto

de malta) y AA (Agar harina de avena) a una temperatura de 25°C. Durante este

tiempo, se registró cada 24 horas el diámetro de las colonias en tres repeticiones

por medio de cultivo. Al día 14 se evaluó el color de la superficie y el reverso de

las colonias usando el manual Pantone®, (2) Desarrollo conidial y patrones de

ramificación: Sobre colonias crecidas en SNA (Agar pobre en nutrientes) a 25ºC

durante 7 días, se realizaron improntas de conidióforos ubicados entre el margen

de la colonia y 2 Cm hacia el centro. Las improntas se montaron sobre láminas

portaobjetos con 2 gotas de ácido láctico al 85%, y seguidamente, en un

microscopio de luz a 1000x se realizó mediciones de conidias terminal, intercalar

y ramoconidias, registrando la longitud y ancho de 30 conidias por estructura.

Análisis de Microscopía de Barrido Electrónico (MEB) de los aislamientos

FABCl14 y FABCl45 fue realizado para definir el complejo de especies sensu lato

al que pertenecen, basado en la ornamentación de pared. Para tal fin, los

aislamientos fueron cultivados en SNA durante 8 días, tiempo en el cual las

conidias se desprendieron por lavado con agua destilada estéril y se dispensaron

en tubos ependorff, obteniéndose así una suspensión conidial altamente

concentrada, la cual fue posteriormente centrifugada a 2000 rpm. por 2 minutos.

El sobrenadante (agua) fue retirado y las conidias fueron fijadas por adición de

glutaraldehido al 2,5% por un periodo de 2 horas, post-fijadas con tetraoxido de

osmio por 1 hora y deshidratadas realizando diluciones seriadas por 15 minutos

en alcohol etílico al 25, 50, 70, 90 y 100%. Para el secado de punto crítico, un

volumen de la última suspensión conidial fue colocado en tubos de PCR, a los

cuales se les hizo orificios pequeños por encima del volumen de la muestra. Los

tubos de PCR con la suspensión conidial fueron centrifugados por 2 minutos a

10000 rpm a temperatura ambiente para eliminar el agua. Finalmente, las

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25

conidias fueron secadas en punto crítico por 2 horas y orificadas con aleación

oro-paladio por 30 minutos.

1.1.4 Análisis molecular de aislamientos de Cladosporium

El Ácido Desoxirribonucleico, ADN, de cinco aislamientos de Cladosporium,

evaluados por su patogenicidad en gulupa, fue extraído y enviado al Centro de

Biodiversidad Fungal en Utrech, Holanda, para su análisis e identificación

molecular. De acuerdo con la información suministrada por el servicio de

identificación del CBS, para cada aislamiento se realizó la amplificación y

secuenciación parcial de los genes ITS (Operon rDNA nuclear, abarca el extremo

3’de 18S rRNA, 5,8S rRNA, y el extremo 5’ de 28S rRNA), Actina y Factor de

elongación 1-α, como es sugerido por Bensch et al. (2010). La identidad de los

aislamientos se definió luego de que las secuencias fueran alineadas y sometidas

a comparación con secuencias de aislamientos tipo depositadas en el GenBank.

Con las secuencias ITS obtenidas para los aislamientos de Cladosporium

asociados a gulupa y de aislamientos tipo pertenecientes a los complejos de

especies C. cladosporioides y C. herbarum sensu lato, previamente depositadas

en el GENBANK, se realizó un alineamiento y construcción de un árbol

filogenético UPGMA, utilizando el programa informático MEGA, con el propósito

de establecer las especies con las cuales se agrupan los aislamientos analizados

en este estudio, y así definir el complejo de especie sensu lato al que pertenecen.

1.1.5 Análisis estadístico

Con los datos de crecimiento diario se realizó un análisis de varianza (siguiendo

un Diseño Completamente al Azar) y pruebas de comparación de medias (Tukey)

para determinar posibles diferencias estadísticas entre aislamientos y medios de

cultivo evaluados. Estos mismos datos fueron utilizados para modelar el

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26

crecimiento de los aislamientos de Cladosporium (línea de tendencia), basado en

el coeficiente de determinación (R2). Los registros de mediciones microscópicas

se usaron para establecer en cada aislamiento los rangos, promedios y

desviaciones estándar del ancho y largo de ramoconidias, conidias intercalar y

terminal.

1.2 RESULTADOS

1.2.1 Microorganismos asociados a material vegetal enfermo

De tejidos con síntomas de Roña se recuperó en PDA un total de 54 aislamientos,

identificados hasta nivel de género como Cladosporium (38), Colletotrichum (13) y

Botritys (3). Debido a que Cladosporium fue el género aislado con mayor

frecuencia, 15 aislamientos monospóricos del hongo fueron seleccionados y

caracterizados morfológicamente (Tabla 4).

Tabla 4. Origen de aislamientos de Cladosporium caracterizados morfológicamente

Código de aislamiento Localidad Órgano afectado

FABCl14 Tibacuy Hoja

FABCl 21 Tibacuy Hoja

FABCl 22 Tibacuy Hoja

FABCl 27 Tibacuy Fruto

FABCl 43 Pandi Hoja

FABCl 45 Venecia Fruto

FABCl 50 Venecia Hoja

FABCl 51 Venecia Hoja

FABCl 69 San Bernardo Fruto

FABCl71 San Bernardo Fruto

FABCl 73 San Bernardo Fruto

FABCl 74 San Bernardo Fruto

FABCl 78 Granada Fruto

FABCl 79 Granada Fruto

FABCl 80 Granada Fruto

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27

1.2.2 Evaluación macroscópica de aislamientos de Cladosporium

Basado en las características de las colonias, diferencias macroscópicas fueron

observadas entre aislamientos monospóricos para los caracteres textura y color,

registrándose en PDA aislamientos con micelio algodonoso (FABCl14, FABCl21,

FABCl22, FABCl43, FABCl51, FABCl78, FABCl79, y FABCl80) y aterciopelado

(FABCl27, FABCl45, FABCl50, FABCl69, FABCl71, FABCl73 y FABCl74). En este

mismo medio de cultivo, las colonias presentaron coloración verde oliva grisáceo

con variaciones en intensidad de un aislamiento a otro, aunque micelio de color

blanco fue observado en algunos aislamientos, especialmente en los de textura

algodonosa. Igual patrón textural fue observado cuando los aislamientos

crecieron en AEM, sin embargo, estas colonias se distinguieron por presentar un

color gris-humo y pliegues con forma elipsoidal o lineal en la parte superior. En

AA, todos los aislamientos fueron de color verde oliva con micelio blanco en la

periferia y sin pliegues (Figura 1, anexo A).

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Figura 1. Colonias de Cladosporium crecidas en PDA, AEM y AA a los 14 días. De izquierda a derecha aislamientos FABCl14, FABCl21, FABCl22, FABCl27 y FABCl43.

FABCl14 FABCl21 FABCl22 FABCl27 FABCl43

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Continuación de la figura 1. Colonias de Cladosporium crecidas en PDA, AEM y AO a los 14 días. De izquierda a derecha aislamientos FABCl45, FABCl50, FABCl51, FABCl69 y FABCl71.

FABCl45 FABCl50 FABCl51 FABCl69 FABCl71

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Continuación de la figura 1. Colonias de Cladosporium crecidas en PDA, AEM y AO a los 14 días. De

izquierda a derecha aislamientos FABCl73, FABCl74, FABCl78, FABCl79 y FABCl80.

Para todos los aislamientos, los datos de crecimiento se ajustaron a una línea de

tendencia polinómica (cuadrática) en los tres medios de cultivo evaluados, con

coeficientes de determinación (R2) entre 0.6 – 0.99 en PDA, 0.67 – 0.99 en AEM y

FABCl73 FABCl74 FABCl78 FABCl79 FABCl80

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0.89 – 0.99 en AA. De acuerdo con el análisis de varianza, diferencias

significativas entre aislamientos y medios de cultivo fueron registradas para la

variable crecimiento, con probabilidad de 0,0001 en ambos factores. Al considerar

la prueba de comparación de medias de Tukey para los dos factores, el medio de

cultivo donde mayor crecimiento se registró para todos los aislamientos fue en

AA, seguido de PDA y AEM, con valores promedio de 5.0, 4.2 y 3.4 cm. a los 14

días, respectivamente. Los aislamientos con mayor crecimiento fueron 73, 71,74,

50, 43, 27, 45, seguidos de 51, 78, 80, 69, 22, 21, 79 y 14 (Figura, 2).

Figura 2. Crecimiento y modelamiento de aislamientos de Cladosporium. A. Crecimiento de los aislamientos al día 14 en PDA (barra de color negro), AEM (barra de color blanco) y AA (barra de color gris). B-D. Modelo de crecimiento polinómico registrado en PDA, AEM y AA para todos los aislamientos evaluados.

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1.2.3 Evaluación microscópica de aislamientos de Cladosporium

Por análisis microscópico se determinó que los aislamientos de Cladosporium

asociados a Roña en gulupa presentan Micelio inmerso y superficial, septado, con

hifas primarias de pared delgada (2.5 – 4 μm de ancho) e hifas secundarias de

pared gruesa (micelio dimórfico). Conidióforos largos ó cortos, erectos, solitarios,

macro y micronematosos, algunas veces geniculados, con crecimiento simpodial,

con emergencia lateral y terminal. Ramoconidias primarias poco frecuentes de

2.5- 4.5 μm. de ancho x 21 – 28 μm. de largo. Ramoconidias secundarias de 2.5

– 5 μm. de ancho x 4.5 – 20 μm. de largo, con 2 -3 hilum conidial y 0-2 septos.

Conidias intercalar aseptadas y limoniformes, de 2 – 4 μm. de ancho x 3.5 - 8.5

μm. de largo, y Conidias terminal aseptadas y ovoides, de 2.3 – 4 μm. de ancho x

2.5 – 6 μm de largo. Por observaciones al microscopio de luz y de barrido

electrónico, se estableció que los aislamientos analizados presentan conidias y

conidióforos con ornamentación de pared lisa en comparación con un aislamiento

de Cladosporium recuperado de uchuva con ornamentación de pared equinulada,

lo que sugiere la inclusión de los aislamientos de gulupa dentro del complejo de

especies C. cladosporioides sensu lato (Figura 3).

La Tabla 5, muestra para cada aislamiento los rangos del ancho y largo de

conidias terminal, intercalar y ramoconidias secundarias; mientras que la Figura 4,

ilustra para estos mismos aislamientos los valores promedio del ancho y largo de

las conidias terminal, intercalar y ramoconidias secundarias. Al considerar los 15

aislamientos de Cladosporium evaluados, el rango promedio del ancho y largo de

conidias terminal, intercalar y ramoconidias secundarias fue de 2.7 – 3.1 x 4-5

μm, 2.9 – 3.1 x 5.2 – 6.7 μm., y 3.1 – 3.6 x 11.5 – 14.3 μm., respectivamente.

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Figura 3. Características microscópicas de aislamientos de Cladosporium asociados a gulupa. A. Micelio dimórfico, B. Conidióforos solitarios, C. Conidióforo micronematoso emergiendo lateralmente, D. Conidióforo emergiendo terminalmente, E. Conidióforo geniculado, F. Conidióforo macronematoso con crecimiento simpodial, G. Conidióforo con ramoconidias con 2 a 3 hilum conidial, H. Ramoconidias con cicatriz prominente en condióforo, I. Conidióforo de aislamiento FABCl45 con ornamentación de pared lisa (MBE), y J. Conidias de aislamiento de Cladosporium

recuperado de uchuva con ornamentación de pared equinulada.

A B C D

E F G H

I J

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Tabla 5. Ancho y largo (μm.) de estructuras microscópicas de aislamientos de Cladosporium

caracterizados morfológicamente.

Aislamiento Conidia terminal (μm) Conidia intercalar (μm) Ramoconidia secundaria (μm)

14 3-3,5 x 4-5 (DS. 0,2 x 0,3) 3-3,5 x 5-7 (DS. 0,2 x 0,7) 3-4 x 9-19 (DS. 0,3 x 3,1)

22 2,5-3 x 4-6 (DS. 0,0 x 0,7) 3-4 x 5 -7 (DS.0,3x 0,5) 2,5-4 x 6-20 (DS.0,4 x 4,3)

21 3-3,5 x 3,5-5 (DS.0,0 x 0,2) 3-3,5 x 6-8 (DS. 0,1 x 0,5) 2,5-4 x 8-20 (DS. 0,4 x 3)

27 2,5-3 x 3,5-4 (DS. 0,1 x 0,1) 2,5-3 x 5-6 (DS. 0,1 x 0,4) 2,5-4 x 7-20 (DS. 0,3 x 3,4)

43 2-3 x 2,5-5,5 (DS. 0,2 x 0,7) 2,5-3,5 x 5-6,5 (DS. 0,1 x 0,5) 2,9-4 x 6-20 (DS. 0,3 x 4,1)

45 2,5-3,0 x 3,5 – 6 (DS. 0,1 x 0,4) 2,5-3,5 x 5-7 (DS. 0,1 x 0,5) 3-4 x 10-19 (DS. 0,3 x 2,4)

50 2-3,5 x 3,3-5,5 (DS. 0,3 x 0,6) 2,4-3,8 x 3,5-7,5 (DS. 0,3 x 0,8) 2,5-4 x 4,5-18,8 (DS. 0,4 x 3,7)

51

2,5-3 x 3,5-5 (DS. 0,1 X 0,4)

3-3,5 X 4,8-6,5 (DS. 0,1 x 0,5) 3-4,5 x 8-19 (DS. 0,4 x 2,7)

69 2,5-3,5 x 4-5 (DS. 0,2 x 0,3) 2,5-3,8 x 4,5-6,5 (DS. 0,3 x 0,5) 2,8-4 x 5,5-20 (DS. 0,3 x 3,3)

71 2,5-3,5 x 4-5 (DS. 0,2 x 0,4) 2-4 x 4,5-7 (DS. 0,6x0,2) 2,5-4,5 x 6 -19,5 (DS. 0,5 x 4,3)

73 2,5-3 x 3,5-4,5 (DS. 0,2 x 0,2) 2,8-4 x 5-6,5 (DS. 0,2x0,5) 3-4 x 6,2-19 (DS. 0,4 x 3,6)

74 2,5-3,5 x 3-6 (DS. 0,3 x 0,6) 2-4 x 4,5-6,5 (DS. 0,4x0,5) 2,5-5 x 6-20 (DS. 0,6 x 4,1)

78 2,5-4 x 3,5-5,5 (DS. 0,2 x 0,4) 2,5-3,5 x 4,8-7,5 (DS. 0,2x0,7) 2,5-4,5 x 5,5-20 (DS. 0,5 x 4,5)

79 2,5-3 x 4-6 (DS. 0,2 x 0,6) 2,5-3,5 x 5-8,5 (DS. 0,2x0,8) 3-3,5 x 6,5-19 (DS. 0,2 x 3,6)

80 2,5-3 x 4-5 (DS. 0,2 x 0,3) 3-3,5 x 5-6,5 (DS. 0,2x0,5) 3-4 x 7-18,5 (DS. 0,3 x 3,2)

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35

1.2.4 Reporte de evaluación molecular de aislamientos de Cladosporium

El reporte del servicio de identificación del centro de biodiversidad fungal - CBS,

indicó que los aislamientos de Cladosporium asociados a Roña en gulupa

pertenecen al complejo de especies C. cladosporioides sesu lato, basado en

análisis de regiones ITS (Operon rDNA nuclear, abarca el extremo 3’de 18S

rRNA, 5,8S rRNA, y el extremo 5’ de 28S rRNA), lo cual se confirmó con el árbol

filogenético generado, al observar que los aislamientos de gulupa agruparon con

aislamientos tipo de especies sensu stricto pertenecientes al complejo de

especies C. cladosporioides sensu lato y no con el aislamiento tipo de la especie

C. herbarum (Figura 5). Por Actina existe una alta identidad de los aislamientos

FABCl14 y FABCl22 con C. lycoperdinum al comparar las secuencias generadas

Figura 4. Tamaño (μm) promedio de

estructuras microscópicas de aislamientos

de Cladosporium asociados a gulupa. A.

Conidias terminales, B. Conidias intercalar,

y C. Ramoconidias secundarias.

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con las previamente depositada en el GenBank para esta especie; mientras que

por Factor de elongación 1-alfa, las secuencias obtenidas para los mismos

aislamientos presentaron una identidad alta con C. acalyphae.

Figura 5. Árbol filogenético construido con secuencias ITS de aislamientos de Cladosporium asociados a Roña en gulupa y de aislamientos tipo de especies pertenecientes a los complejos de especies C. cladosporioides y C. herbarum sensu lato.

1.3 DISCUSIÓN

Los análisis morfológicos por microscopía de barrido electrónico y molecular por

ITS muestran correspondencia, al determinar por ambas vías a C.

cladosporioides sensu lato como el complejo que incluye la especie a la cual

pertenecen los aislamientos de gulupa analizados. Dentro del complejo, las

especies candidatas por actina y factor de elongación 1 – alfa son C.

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lycoperdinum y C. acalyphae, respectivamente, dada la alta identidad de las

secuencias al realizar el BLAST en GenBank. Sin embargo, las características

microscópicas registradas para los aislamientos de gulupa claramente

corresponden con las reportadas para C. lycoperdinum en el estudio de Bensch et

al. (2010). Esta especie es encontrada en Colombia asociada a Puya sp.

(Bromeliaceae), y se distingue por presentar micelio ramificado, no constreñido en

los septos, subhialino a café pálido ó olivaceo, liso ó levemente verruculoso,

pared delgada, conidióforos macro y micronematosos, solitarios, que emergen

lateral y terminalmente de hifas, erectos. Conidióforos macronematosos

cilíndricos, con proliferación simpodial, usualmente no geniculado, hifa del

conidióforo solitaria que emerge como prolongaciones cortas en forma de cuña,

con presencia de un septo justo abajo. Conidióforos micronematosos cortos,

pálidos (más que los macronematosos), no geniculados. Ramoconidas de 3-5 μm.

de ancho, con 2 - 4 loci conidial, 0 – 3 septos, 2 – 4 hilum distales, base truncada,

conidia terminal subglobosa a ovoide, aseptada, de (2-) 3,5 – 5 x (1,5-) 2-2,5 (-3)

μm., conidia intercalar limoniforme, con 0-1 septo, de 4 – 14(-16.5) x (2-) 2,5-3

(-4) μm., y ramoconidia secundaria elipsoide a cilíndrica, algunas veces doliforme,

0-1 (-3) septos, 2-5 hilum distal de 8-32(-38) x (2,5-)3-4(-5) μm..

Igual correspondencia se encontró para las características en cultivos como

textura, color y crecimiento, entre los aislamientos estudiados y lo registrado para

C. lycoperdinum en Bensch et al. (2010), debido al crecimiento de colonias

olivaceas-gris, con bordes de color blanco en PDA, gris-humo en AEM y verde

olivaceo en AA. Al considerar las evaluaciones del crecimiento, el medio de

cultivo AA favoreció el crecimiento de los aislamientos en relación a PDA y AEM,

lo que es de interés en diagnóstico fitosanitario, además por inducir la

esporulación y facilitar la adecuada identificación de Cladosporium, Acremonium,

Fusarium, Paecilomyces, Phialophor y Scopulariopsis (Rezusta et al., 2007).

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Por el contrario, las características microscópicas registradas para los

aislamientos de gulupa no concuerdan con las establecidas para C. acalyphae,

principalmente en los valores (rangos) del largo y ancho de conidias terminal,

intercalar y ramoconidias secundarias, determinados para esta especie entre 4.5

– 9 x 4.5 – 6 µm., (6-) 8-17(-21) x 3.5-5(-6) µm. y 12-25 (-29) x 3-5 µm.,

respectivamente (Bensch et al., 2010). De acuerdo con lo anterior,

C. lycoperdinum es posiblemente la identidad del hongo que causa la Roña de la

gulupa en la región del Sumapaz, y no C. cladosporioides y C. oxysporum sensu

estricto, como ha sido reportado para cultivos de maracuyá y gulupa en Brasil y

Australia, respectivamente (Barreto et al., 1996; Persley, 1993).

La discrepancia entre los genes actina y Factor de elongación 1 – alfa, basado

en la alta identidad de las secuencias con C. lycoperdinum y C. acaliphae,

respectivamente, sugiere la inclusión de diferentes marcadores en el análisis

taxonómico de aislamientos para la definición de especies dentro del género

Cladosporium, incluyendo morfológicos y biológicos (Taylor et al., 2000; Schubert

et al., 2007; Bensch et al., 2010)

Este es el primer estudio que sugiere hasta nivel de especie la identidad del

agente causal de la enfermedad en Colombia, y el cual es realizado teniendo

como base aislamientos evaluados por su patogenicidad en el cultivo,

constituyéndose en un hallazgo importante al esclarecer la etiología de la

enfermedad (usualmente atribuida a Colletotrichum), requerida para proponer y

formular estrategias de manejo, además de ser la base para futuras

investigaciones en epidemiología, selección de materiales por resistencia, análisis

de la eficacia de fungicidas, estructura genética del patógeno, entre otras.

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39

2. Capítulo 2

Determinación de la patogenicidad de Cladosporium en gulupa

INTRODUCCIÓN

Las frutas de la pasión pertenecen al género Passiflora L. (familia Passifloraceae)

el cual tiene una amplia base genética. Algunas especies silvestres permanecen

sin domesticar, otras son cultivadas como plantas ornamentales, para alimento

(Cunha, 1996; Manica, 1997) y propósitos médicos para tratar la ansiedad, el

insomnio, bronquitis, asma e hipertensión (Zibadi y Watson, 2004). La mayoría de

especies de Passiflora son originarias de las regiones tropical y subtropical de Sur

América, considerándose a Brasil como el centro de diversidad de Pasifloraceae

(Cunha, 1996; Manica, 1997). De las 400 especies conocidas de Passiflora, entre

50 y 60 son comestibles. La mayoría de estas especies son desconocidas fuera

de su centro de origen y unas pocas especies son económicamente importantes,

dentro de las cuales se incluyen Pasiflora edulis forma botanica flavicarpa, P.

edulis f. edulis Sims. y P. alata Dryand (Donadio, 1983).

La fruta de la pasión púrpura (P. edulis f. edulis) es una planta perenne y

enredadera nativa de Sur América, la cual es ahora cultivada alrededor del

mundo y usada extensivamente como ingrediente de bebidas, ensaladas,

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cocteles de frutas y postres. Aparte de Suramérica, las áreas más importantes de

producción de gulupa son Sur África, India, Malasia, Australia, Nueva Zelanda y

Hawai (Ulmer y Mac Dougal, 2004). En Colombia, la producción de gulupa se

concentra en los departamentos Cundinamarca, Antioquia, Boyacá, Quindío,

Huila y Tolima (ICA, 2006).Sin embargo, el área cultivada con esta especie ha

venido disminuyendo en los últimos años por problemas fitosanitarios,

principalmente enfermedades, como ha sido reportado en la región del Sumapaz

en los municipios de Venecia, Granada, San Bernardo y Tibacuy (Cundinamarca).

Las enfermedades reportadas en esta región y de mayor limitación en la

producción de gulupa son ocasionadas por diferentes grupos de patógenos,

entre los que se incluyen virus como Cucumber Mosaic Virus CMV, Soybean

MosaicVirus SMVA, Cowpea Aphid-Borne Mosaic Virus CoABMV, asociados a

mosaicos y deformaciones en frutos y hojas. Otras enfermedades igualmente

importantes son las denominada Mancha de aceite ocasionada por Xanthomonas

axonopodis, el Marchitamiento vascular y Pudrición del cuello de la raíz por

especies de Fusarium, y la Roña de la gulupa con etiología en estudio (Camelo,

2010; Benitez, 2010; Ortiz et al., 2010).

La Roña del maracuyá es ocasionada por C. cladosporioides y C. herbarum en

Brasil (Barreto et al., 1996) y C. oxysporum en Zimbabwe y Australia (Bates,

1954; Persley, 1993) y afecta principalmente tejidos jóvenes de hojas, ramas,

zarcillos, botones florales y frutas. Los síntomas sobre hojas son pequeñas

manchas redondas de 3-6 mm. en diámetro, translucidas pero después llegan a

ser necrótica, de color gris en el centro, lo cual corresponde a la fructificación del

hongo. Las lesiones pueden perforar las hojas (absición) ó causar deformaciones

cuando ocurren en las nervaduras. Manchas similares pueden aparecer sobre

sépalos de botones, en flores abiertas y en ramas. Como el tejido forma cicatriz,

las ramas llegan a ser débiles y se rompen por acción del viento. En frutos

pequeños, los síntomas aparecen como manchas circulares, pequeñas, oscuras y

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ligeramente hundidas de 5 mm. en diámetro. En frutos grandes, las lesiones

sobre la epidermis de la fruta crecen y llegan a ser de aspecto corchoso,

prominentes de color café, pero no alcanzan el interior de la fruta, y

consecuentemente, no afectan la calidad del jugo (Manicom et al., 2003;

Yamashiro, 1991). En Australia, la Roña de la gulupa es una enfermedad con

mayor intensidad en épocas con temperaturas bajas (20ºC) y alta humedad

relativa, especialmente en invierno (Rheinlander, 2010).

Cladosporium es un género de hongos ampliamente distribuido en el mundo, con

importantes especies fitopatógenas como Cladosporium cucumerinum

(Kwon et al., 1999), Cladosporium herbarum (Kwon et al., 2000; Kwon et al.,

2001; Abdel-Motaal et al., 2009), Cladosporium cladosporioides (Briceño y

Latorre, 2008) y Cladosporium fulvum (Agrios, 2005). El conocimiento actual

sobre la interacción planta hospedante - Cladosporium es el resultado de un

amplio número de investigaciones en el modelo de estudio C. fulvum- tomate,

especialmente en el análisis de la composición proteica del espacio apoplástico

de hojas de tomate infectadas con el hongo, con énfasis en la identificación de

proteínas de avirulencia raza-especifica (Avrs) que son secretadas por el hongo

durante la infección. Diez proteínas secretadas por C. fulvum durante la

colonización del hospedante han sido caracterizadas, cuatro proteínas efectoras

Avr2, Avr4, Avr4E, Avr9 y seis extracelulares Ecp1, Ecp2, Ecp4, Ecp5, Ecp6, y

Ecp7 (van Kan et al., 1991; van den Ackerveken et al., 1993; Joosten et al., 1994;

Laugé et al., 2000; Luderer et al., 2002; Westerink et al., 2002; Bolton et al.,

2008).

Debido a que se ha observado alta expresión de estas proteínas efectoras al

inicio de la infección, se ha sugerido que ellas juegan un rol en el establecimiento

de la enfermedad (Thomma et al., 2005; Kooman – Gersmann et al., 1997).

Durante la infección Avr2 inhibe al menos cuatro cisteinas proteasas de tomate,

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incluyendo Rcr3, Pip1, aleurain y TDI65, importantes para la defensa basal del

hospedante (Stergiopoulos y De Wit, 2009); mientras que Avr4 contribuye a una

completa virulencia, protegiendo las hifas del hongo contra la hidrólisis por

quitinasas de la planta (Van den Burg et al., 2006; Van Esse et al., 2007). Avr9 es

altamente expresado en la interacción compatible, con una máxima expresión a

los 9 días posterior a la inoculación (De Wit, 1997) y es más relacionado con el

inhibidor carboxipeptidasa aislado de plantas, aunque no tiene la actividad

inhibitoria de carboxipeptidasa (Wubben et al., 1996).

En Colombia, el manejo de enfermedades en el cultivo de gulupa, incluyendo la

Roña, ha sido limitado por el desconocimiento de los agentes causantes, y en

aproximación a la etiología, el diagnóstico ha sido basado en aislamientos en

placas de agar. Debido a que la Roña es un factor limitante en la producción

exportable de la fruta, es necesario determinar el agente causante de la

enfermedad mediante un proceso riguroso de diagnóstico, que incluya la

evaluación de la patogenicidad de aislamientos en el hospedante, siguiendo los

postulados de Koch. Basado en lo anterior, se planteó como objetivo de este

estudio determinar la patogenicidad del agente etiológico asociado con la Roña

de la gulupa.

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43

2.1 MATERIALES Y MÉTODOS

2.1.1 Localización

El presente estudio se llevó a cabo en el laboratorio de fitopatología e

invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de

Colombia, sede Bogotá. En los invernaderos, los registros de temperatura y

humedad relativa indicaron valores promedio diarios de 20.2ºC y 46.1%,

respectivamente.

2.1.2 Preparación de inóculo para pruebas de patogenicidad

Un total de 15 aislamientos monospóricos, identificados hasta género como

Cladosporium, fueron cultivados entre 8 - 14 días en SNA (Agar pobre en

nutrientes) a 25ºC. para producir el inoculo requerido en las pruebas de

patogenicidad en condiciones de laboratorio e invernadero. Trascurrido este

tiempo se colectaron las conidias y para cada hongo se preparó una suspensión

conidial ajustada a una concentración de 1 x 106 conidias/mL.

2.1.3 Pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio

En laboratorio se realizaron pruebas de patogenicidad en frutos en estado de

cuajamiento-crecimiento y hojas jóvenes desprendidos de plantas sanas (Galindo,

2009), los cuales fueron esterilizados superficialmente por inmersión consecutiva

en alcohol al 70%, hipoclorito de sodio al 1% y agua destilada estéril, de acuerdo

con el protocolo de desinfección propuesto por Cai et al., (2009). Posteriormente,

frutos y hojas fueron dispuestos sobre rejillas contenidas en recipientes plásticos

e inoculados individualmente con cinco aislamientos de Cladosporium (FABCl14,

FABCl21, FABCl22, FABCl43 y FABCl45) por los siguientes métodos de

inoculación: T1 Con herida + 6µL. de inóculo, T2 Sin herida + 6µL. de inóculo, y

como controles T3 Con herida + 6µL. de agua destilada estéril y T4: Sin herida +

6µL. de agua destilada estéril. Por cada tratamiento fueron inoculados 4 frutos y

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hojas en dos y tres puntos, respectivamente. Los órganos se incubaron en

cámara de crecimiento a 19ºC./12 h. Luz y 17ºC / 12 h. oscuridad y humedad

relativa mayor al 95%. Los ensayos fueron repetidos dos veces y las variables

evaluadas fueron periodos promedio de incubación y latencia.

2.1.4 Pruebas de patogenicidad en condiciones de invernadero

En condiciones de invernadero, 15 aislamientos de Cladosporium fueron

inoculados individualmente en frutos en estado de cuajamiento-crecimiento y en

hojas jóvenes completamente expandidas (Galindo, 2009), por los métodos de

inoculación anteriormente mencionados. Por cada aislamiento fueron inoculados

tres frutos y hojas en tres y dos puntos, respectivamente. Posterior a la

inoculación, los órganos fueron cubiertos con bolsas plásticas asperjadas

internamente con agua destilada estéril para proporcionar condiciones óptimas de

humedad relativa (95%) y favorecer la expresión de síntomas de la enfermedad.

Las variables evaluadas fueron periodos promedio de incubación y latencia.

2.1.5 Análisis de Microscopía de Barrido Electrónico de hojas inoculadas

artificialmente con Cladosporium

Hojas de gulupa inoculadas artificialmente con Cladosporium fueron analizadas

por microscopía de barrido electrónico. Para tal fin, cortes de 1 cm2 de tejido

foliar con y sin síntomas de roña fueron fijados en glutaraldehido al 2,5%,

deshidratados por pases consecutivos de 15 minutos en alcohol etílico al 25, 50,

70, 90 y 100%, secados en punto crítico por 2 horas y orificados por 30 minutos

en aleación oro/paladio. Finalmente, las imágenes de los cortes fueron

capturadas en un microscopio de barrido electrónico.

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45

2.1.6 Análisis estadístico

Con los datos de periodos de incubación y latencia registrados en condiciones de

invernadero, se realizó dos análisis de varianza (siguiendo un Diseño

Completamente al Azar) para establecer diferencias estadísticas entre

aislamientos inoculados en hojas y frutos. Igualmente, se realizó pruebas de

comparación de medias de Tukey para definir los aislamientos más virulentos.

2.2 RESULTADOS

2.2.1 Pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio

Frutos de gulupa en estado de cuajamiento-crecimiento mostraron síntomas de

Roña posterior a la inoculación con uno de cinco aislamientos de Cladosporium

(FABCl45), a los 9 y 17 dpi. (periodo de incubación) por los métodos con y sin

herida; mientras que la expresión de signos ocurrió a los 10 y 18 dpi., un día

después de la aparición de los síntomas (Figuras 6, 7). El síntoma observado en

frutos inoculados corresponde al estado intermedio de la enfermedad,

denominado chancro, a partir del cual no hubo evolución al estado de Roña

como ocurre en condiciones de campo. En frutos con expresión de síntomas se

evidenció un hundimiento progresivo del tejido afectado, resultado de la

degradación de células epidermales e hipodermales en el exocarpo y

esclerotizadas en el mesocarpo, como se sugiere en el capítulo 3.

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Figura 6. Secuencia de síntomas de Roña en frutos inoculados con herida en laboratorio. A. 3 dpi., B. 5 dpi., C. 7 dpi., D. 9 dpi., E. 10 dpi. y F. 11 dpi.

Figura 7. Secuencia de síntomas de Roña en frutos inoculados sin herida en laboratorio. A. 9 dpi, B. 10 dpi, C. 11dpi, D. Control, E. Reaislamiento del patógeno en PDA, F. Control.

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47

En hojas de gulupa se reprodujeron los síntomas de la enfermedad con dos de

cinco aislamientos de Cladosporium evaluados (FABCl14 y FABCl22). Los

síntomas de la enfermedad aparecieron a los 8 y 9 dpi. por los métodos con y sin

herida, respectivamente, lo que indica un retraso en el periodo de incubación en

hojas inoculadas por el segundo método; mientras que la expresión de signos se

presentó a los 10 y 11 dpi., dos días después de la ocurrencia de lesiones

iniciales. La enfermedad solo se presentó cuando se inoculó en el lado abaxial de

las hojas y se inició con la aparición de manchas pequeñas e irregulares de color

café en las superficies adaxial y abaxial (Figura 8A). Posteriormente, las manchas

empezaron a coalescer hacia el día 11 posterior a la inoculación, formándose una

sola mancha de color café sobre la cual se hizo visible la esporulación gris a

verde oliva del hongo a los 12 -13 dpi. Dos días después, la lesión tomó un color

verde en la periferia conforme avanzaba la senescencia de la hoja,

presentándose islas verdes (Figura 8D-F).

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Figura 8. Secuencia de síntomas de Roña en hojas de gulupa inoculadas artificialmente con Cladosporium en laboratorio. A. 9 dpi, B. 11 dpi, C. 13dpi, D. 15 dpi, E. 29dpi, F. hoja inoculada

con síntomas de la enfermedad, G. Reaislamiento deLl patógeno en PDA.

El reaislamiento de los hongos inoculados en hojas y frutos permitió corroborar su

patogenicidad, luego de recuperar en PDA a Cladosporium (Figura 7E, 8G);

mientras que en hojas y frutos control inoculados con agua destilada estéril no

hubo expresión de síntomas, ni tampoco crecimiento de microorganismos en

placas de agar como era de esperarse (Figura 7F), confirmando así los

postulados de Koch.

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49

2.2.2 Pruebas de patogenicidad en condiciones de invernadero

En hojas jóvenes completamente extendidas se inició el desarrollo de síntomas

entre 7 y 11 días posterior a la inoculación con herida, y expresión de signos del

patógeno un día después de la aparición de lesiones iniciales; mientras que sin

herida los periodos de incubación y de latencia se retrasaron entre 2 y 3 días.

En plantas completas, el avance de síntomas en hojas mostró correspondencia

con lo registrado en las pruebas de patogenicidad en laboratorio, observándose

lesiones iniciales como manchas circulares de color café oscuro a claro

(necrosis), levemente hundidas, sobre las cuales la esporulación del hongo se

hace visible en el centro. En condiciones de invernadero se evidenció el

desprendimiento de tejido afectado hacia el día 13 posterior a la inoculación,

fenómeno denominado absición ó perdigoneo y que ocurre en hojas afectadas en

condiciones de campo (Figura 9).

De acuerdo con microfotografías de barrido electrónico, en hojas de gulupa

inoculadas artificialmente con Cladosporium, la topografía de la lámina foliar es

alterada en estados intermedios de la enfermedad, observándose en el centro de

la lesión una abundante esporulación del hongo y en menor extensión en la

periferia. Sobre la lesión se observó la emergencia de conidióforos solitarios en

sitios adyacentes a estomas (Figuras 10, 11, 12, 13).

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Figura 9. Secuencia de síntomas de Roña en hojas de gulupa inoculadas artificialmente con Cladosporium en invernadero. A. 9 dpi, B. 10 dpi, C. 11 dpi, D. 12 dpi, E. 13 dpi, F. 15 dpi, G-H.

Hojas de gulupa adultas con síntomas de Roña inducidos con y sin herida.

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51

Figura 10. Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico (a un aumento de 230x) de una hoja de gulupa sana, inoculada artificialmente con agua destilada estéril.

Figura 11. Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico (a un aumento de 50x) de una hoja de gulupa con síntomas de roña posterior a la inoculación artificial de Cladosporium.

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Figura 12. Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico (a un aumento de 5.000x) de ramoconidias asociadas a síntomas de roña en una hoja de gulupa inoculada artificialmente con Cladosporium.

Figura 13. Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico (a un aumento de 500x) de hifas de conidióforos asociadas a síntomas de roña en una hoja de gulupa inoculada artificialmente con Cladosporium.

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En frutos, los síntomas de Roña se reprodujeron entre 6 y 10 días después de la

inoculación con Cladosporium por el método sin herida, e iniciaron con la

formación de manchas y ampollas acuosas de color café, sobre las cuales hubo

expresión de signos (esporulación) del patógeno entre 8 - 12 dpi (Figura 14 A-C).

Tiempo a partir del cual las lesiones empezaron a coalecer resultado del

aumento en el tamaño de las mismas y entre 9 – 12 dpi. se registró un incremento

en la esporulación del hongo, además de la formación de un halo de color verde

en el área periférica de la lesión e infecciones secundarias en otras zonas del

fruto (Figura 14D-G). Las lesiones primarias empezaron a agrietarse en la

periferia a los 13 dpi, observándose internamente una cavidad hueca hacia el día

15 posterior a la inoculación (Figura 9H-J), resultado de la degradación de células

en el mesocarpo, de acuerdo con el estudio histopatológico presentado en el

capítulo 3. Contrario a los ensayos de patogenicidad in vitro, en condiciones de

invernadero las lesiones en estado de chancro evolucionaron a Roña,

acumulándose en la superficie del fruto capas emergentes de corcho a los 23 dpi

(Figura 14K – L).

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Figura 14. Secuencia de síntomas de Roña en frutos de gulupa inoculadas artificialmente con Cladosporium en invernadero. A. 6dpi., B. 7dpi., C. 8dpi., D. 9 dpi., E. 10 dpi., F.11dpi., G. 12 dpi., H. 13 dpi., I. 14 dpi., J. 15 dpi., 18 dpi., y 23 dpi.

A B C

D E F

G H I

J K L

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55

De los 15 aislamientos evaluados por su patogenicidad en condiciones de

invernadero, ocho indujeron síntomas de la enfermedad, registrándose como

patogénicos en hojas y frutos a FABCl14, FABCl21, FABCl22, FABCl51 y

FABCl80, sólo en frutos a FABCl43, FABCl45 y FABCl71 y no patogénicos a

FABCl50, FABCl69, FABCl73, FABCl74, FABCl78, FABCl79. Diferencias

estadísticas en patogenicidad fueron registradas entre aislamientos patogénicos

con relación a los periodos de incubación y de latencia promedio, con

probabilidades de 0,0001 en frutos y 0,0002 en hojas. Los aislamientos más

virulentos fueron FABCl71 en frutos y FABCl22 y FABCl51 en hojas (Figura 15).

Figura 15. Periodos de incubación y de latencia promedio registrados en condiciones de invernadero para aislamientos patogénicos de Cladosporium en frutos (A), y hojas (B).

a

ba ba

bc bc bc

bc c

a a

a

b b

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56

Al considerar todos los aislamientos patogénicos, los periodos de incubación y de

latencia promedio en condiciones de invernadero fueron 7.7 y 9.7 días en frutos, y

9 y 10 días en hojas, respectivamente.

2.3 DISCUSIÓN

Las pruebas de patogenicidad en condiciones in vitro e invernadero establecen a

Cladosporium como el agente causante de la Roña en gulupa, luego de

reproducirse los síntomas de la enfermedad en hojas y frutos posterior a la

inoculación artificial de aislamientos del hongo, lo cual soporta los resultados del

estudio histopatológico (Capítulo 3), además de ser coherente con los reportes de

la sintomatología y etiología de la enfermedad en Brasil y Australia,

principalmente (Fischer y Rezende, 2008). Las condiciones bajo las cuales hubo

expresión de síntomas sugieren requerimientos altos de humedad relativa (95%),

temperaturas bajas (17 – 20.2°C), y tejidos receptivos al inicio de la infección,

como ha sido reportado en Australia para Cladosporium oxysporum en la fruta de

la pasión púrpura (Rheinlander, 2010). Las heridas pueden favorecer también la

expresión temprana y desarrollo de síntomas en hojas, como se registró en las

pruebas de inoculación con herida, tanto en laboratorio como en invernadero;

mientras que en frutos, la inoculación con heridas resultó en el desarrollo de

síntomas solo en condiciones de laboratorio y no en invernadero donde se

observó respuestas de cicatrización en frutos heridos e inoculados, sin progreso

alguno de la enfermedad.

El desarrollo de síntomas por el método de inoculación sin herida, demuestra que

los aislamientos patogénicos de Cladosporium tienen la habilidad para penetrar,

invadir, reproducirse y diseminarse, cumpliendo de este modo los estados de

desarrollo de la enfermedad (Agrios, 2005). El proceso de penetración es posible

que ocurra posterior a la liberación de enzimas hidrolíticas extracelulares como

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lipasas, pectinasas, celulasas y proteasas, encontradas asociadas a aislamientos

de C. herbarum recuperados de lesiones de Roña en maracuyá en Brasil

(Barbosa et al., 2001).

Lesiones necróticas en hojas y frutos de gulupa podrían estar relacionadas con

producción y liberación de fitotoxinas por parte del patógeno en los sitios de

infección (Upadhyay et al., 1990), las cuales son conocidas en algunos hongos,

incluyendo especies de Cladosporium, como factores de patogenicidad y de

virulencia que inducen necrosis requerida para la colonización, entre las que se

incluyen toxinas no específicas de hospedante como las pyrelequinonas

fotoactivadas por la luz y las toxinas específicas de hospedero (Host Specific

Toxins – HST) que funcionan como determinantes de avirulencia y que inducen

muerte celular programada luego de que son reconocidas por proteínas R de

susceptibilidad bajo un modelo gen por gen. Determinantes de avirulencia

secretados por razas de C. fulvum han sido reconocidos en el espacio apoplástico

de hojas de tomate infectadas por el hongo, e incluyen a Avr2, Avr4, Avr4E, Avr9,

Ecp1, Ecp2, Ecp4, Ecp5, Ecp6, y Ecp7 (Van Kan et al., 1991; Van den

Ackerveken et al., 1993; Joosten et al., 1994; Lauge et al., 2000; Luderer et al.,

2002; Westerink et al., 2004; Bolton et al., 2008). Sin embargo, en la interacción

Cladosporium-gulupa es posible que participen toxinas no específicas de

hospedante, como Calphostin C, cladochrome, Ent-isophleichrome y

Phleichrome, previamente documentadas en C. cucumerinum, C. cladosporioides,

C. herbarum y C. phlei, respectivamente (Yoshihara et al., 1975; Weiss et al.,

1987; Arnone et al., 1988; Robeson y Jalal, 1992); mientras que producción de

HST no ha sido reportada para especies de Cladosporium, además de que

inducen muerte celular a las 48 horas, un periodo de tiempo por debajo del

periodo de incubación de la enfermedad en gulupa, estimado entre 7 – 11 dpi. en

hojas y 6 -10 dpi. en frutos.

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58

De acuerdo con Walters et al. (2007), el fenotipo de “islas verdes” observado al

inició de la senescencia en hojas desprendidas e inoculadas en laboratorio,

estaría relacionado también con producción de toxinas por Cladosporium, como

ha sido reportado para hongos necrótrofos, incluyendo a Alternaria brassicae en

hojas de canola (Brassica napus). Aunque el concepto clásico de islas verdes ha

sido aplicado para referirse a biótrofos, estos mismos autores afirman que este

fenotipo puede ser inducido también por patógenos necrótrofos, y en este caso se

denomina fenotipo de islas verdes producido por toxinas.

Basado en imágenes de microscopía de barrido electrónico, es posible que el

proceso infectivo de Cladosporium en gulupa, ocurra en algunas etapas como ha

sido descrito para el patosistema C. fulvum – tomate, donde la infección comienza

con la germinación bipolar de la conidia, seguido del recorrido de la hifa sobre la

superficie de la hoja hasta que esta encuentra un estoma abierto, lo que explica el

requerimiento de alta humedad para la infección. Después de 1 – 4 días, la hifa

penetra el estoma y entra al espacio subestomatal, mesofilo esponjoso y se

ramifica a través del apoplasto. Después de 10 – 12 días de pos- infección, el

mesofilo es altamente colonizado y el hongo emerge del estoma. La emergencia

de conidióforos, de acuerdo con la figura 13, ocurre de manera individual en

sitios adyacentes a estomas de hojas de gulupa, lo cual difiere con lo reportado

para C. fulvum en tomate, donde el hongo emerge por estomas en un

agrupamiento coordinado de más de 20 hifas (Oliver et al., 2000)

Contrario a las pruebas de patogenicidad en laboratorio, respuestas de defensa

tardías se evidenciaron en hojas y frutos de gulupa inoculados artificialmente bajo

condiciones de invernadero, y como se menciona en el capítulo 3, formación de

capas de absición y desprendimiento de tejido afectado tomaron lugar en hojas y

formación de capas de corcho y regeneración de células en el mesocarpo y

exocarpo en frutos, lo que indica que las plantas susceptibles de gulupa

despliegan respuestas de defensa estructurales durante el proceso infectivo del

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59

patógeno. Como ha sido reportado por Mora (2011), en este estudio también se

evidenció que el progreso de lesiones iniciales y evolución de síntomas es

detenido en frutos en estados avanzados de desarrollo, lo cual puede estar

relacionado con la expresión de resistencia ontogénica conforme avanza la

formación y maduración del fruto, posiblemente en respuesta a cambios en la

porosidad de la cutícula, aumento en el contenido de cera epicutícular y a la alta

capacidad para desarrollar respuestas de defensa (Latorre et al., 2010).

Con relación a Cladosporium, los resultados sugieren distintos niveles de

virulencia en las poblaciones del patógeno, basado en los periodos de incubación

y de latencia. Sin embargo, no existe evidencia de que la virulencia diferencial

registrada en este estudio este correlacionada con razas del patógeno, como si

se ha documentado para C. fulvum en tomate (Van Kan et al., 1991; Van den

Ackerveken et al., 1993; Joosten et al., 1994; Laugé et al., 2000; Luderer et al.,

2002; Westerink et al., 2002; Bolton et al., 2008), por lo que se requiere estudios

en esa vía, incluyendo el establecimiento de variedades diferenciales.

Debido a que la enfermedad es un factor limitante en la producción exportable de

gulupa, estrategias de control pueden desplegarse considerando los diferentes

componentes del manejo integrado de enfermedades. En cuanto al control

genético, es posible que exista susceptibilidad diferencial entre materiales de

gulupa en el país, por lo que son necesarios estudios de selección de materiales

por resistencia a la enfermedad, y aunque Ortiz (2010) reportó en su estudio

reducida variabilidad genética, por análisis del ADN de 60 materiales de gulupa

procedentes de Cundinamarca, Boyacá, Huila, Tolima, Quindío y Antioquia,

mediante el empleo de marcadores AFLPs y SSRs, no se conoce si hay

correspondencia entre la baja variabilidad genética reportada y la susceptibilidad

a la enfermedad.

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60

Distintas estrategias de control cultural podrían ser consideradas para el manejo

de la enfermedad en campo, como la remoción de órganos con síntomas iniciales

de Roña antes de que esporulación del hongo ocurra, lo cual puede contribuir a

evitar la diseminación de inoculo secundario dentro del campo, el cual es

fácilmente dispersado por el viento y la lluvia (Rheinlander, 2010). Otra medida

son las podas sanitarias poco severas en cuanto a que pueden crear condiciones

desfavorables para el patógeno al incrementar la aireación dentro del cultivo,

aunque lesiones necróticas que se crean alrededor de los sitios de corte puede

proveer un sustrato para el establecimiento y colonización del hongo, como se

cree ocurre luego de la remoción foliar severa en plantaciones de uva en Chile

para los cultivares cabernet sauvignon y otros cultivares para la producción de

vino rojo, afectados por C. cladosporioides y C. herbarum (Latorre et al., 2010).

Estos mismos autores sugieren que la remoción foliar severa en uva favorece el

incremento de poblaciones epifitas de Cladosporium en diferentes vías, por daño

y necrosis asociada a lenticelas, aumento en la diseminación del inoculo por

acción del viento y por incremento de la radiación solar en el cultivo, la cual no

afecta la supervivencia del hongo dada la producción de pigmentos como

melanina en la pared celular de conidióforos y conidias, y que por el contrario

puede favorecer la activación de toxinas pyrelequinonas.

Cepas comerciales de Trichoderma podrían ser evaluadas y empleadas en el

manejo de la enfermedad en campo como ha sido reportado por Barbosa et al.

(2001). Estos autores evaluaron el efecto antagónico de T. polysporum, T.

koningii, T. viride y T. harzianum sobre el biocontrol de aislamientos de C.

herbarum asociados a Roña en maracuyá, encontrándose una efectividad

antagónica en todas las especies biocontroladoras evaluadas excepto T. koningii.

De otro lado, programas de control químico anti-resistencia pueden ser

desarrollados para el manejo de la enfermedad en campo a través del empleo de

fungicidas estándar, como oxicloruro de cobre, mancozeb, iprodione, azoxystrobin

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y acybenzolar, los cuales han resultado en un mayor nivel de control de la

enfermedad en Australia, por reducir significativamente la incidencia y severidad

de la Roña en aproximadamente un 30 y 80%, respectivamente, comparado con

fungicidas convencionales (Wilingham et al., 2002).

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62

3. Capítulo 3

Análisis de la sintomatología de la Roña en gulupa (Pasiflora

edulis f. edulis)

INTRODUCCIÓN

La fruta de la pasión pertenece a la familia Passifloraceae, la cual es

representada por 14 géneros. Passiflora, es el género representativo de la familia

y constituye cerca de 580 especies distribuidas en las regiones tropical y

subtropical (Silva y Sao José, 1994). El término fruta de la pasión se refiere

exclusivamente a la especie P. edulis Sims., la cual contiene dos formas

botánicas comercialmente importantes, la amarilla (P. edulis f. flavicarpa

Degener) y la púrpura ó gulupa (P. edulis f. edulis.). La fruta de la pasión púrpura

es relativamente pequeña en tamaño (4-9 cm. de longitud y 3,5-7 cm. de

diámetro), tiene epidermis de color púrpura y semillas negras

(Bora y Narain, 1997). El cultivo entra en producción al primer año, tiempo a partir

del cual el incremento en el rendimiento es continuo hasta el quinto y sexto año.

En este punto la producción disminuye gradualmente y las plantaciones deben

ser renovadas por razones económicas, aunque las plantas pueden vivir mucho

más tiempo (Ulmer y MacDougal, 2004).

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En Europa la fruta de P. eduis f. edulis es la más conocida, debido a su

agradable sabor para consumo como jugo fresco (Singh et al., 1991; Ulmer y

MacDougal, 2004). Sin embargo, ha sido usada ampliamente en medicina

tradicional en Sur América para tratar la ansiedad, insomnio, asma, bronquitis e

infección en el tracto urinario, debido a que extractos de diferentes partes de la

planta contienen flavonoides además de otros compuestos, los cuales son

reconocidos por desempeñar también un papel favorable en la reducción de

enfermedades cardiovasculares (Zibadi y Watson, 2004; Slayback y Watson,

2006; Zibadi et al., 2007).

.

La fruta de la pasión púrpura es la forma más tolerante al frío y crece muy bien

entre 600-2000 msnm. Sin embargo, en Kenia la fruta de la pasión púrpura es

cultivada exitosamente a una altitud de 2500 msnm. Las temperaturas frías son

favorables para iniciar la floración y fructificación (18-23ºC.), mientras que

temperaturas relativamente altas (23-33ºC) son necesarias para estimular la

producción de jugo (Wasilwa et al., 2004).

Los mayores productores de frutas de la pasión se encuentran en Sur América,

principalmente Brasil, Colombia, Perú y Ecuador (Ruggiero et al., 1996), aunque

plantaciones comerciales de frutas de la pasión son encontradas en Australia,

Hawai, E.E.U.U., India, Nueva Guinea, Kenia, Sur África, Sri Lanka y Costa Rica

(Kluge, 1998). En Colombia los departamentos productores de la fruta de la

pasión púrpura son Cundinamarca, Antioquia y Boyacá (CCI, s.f). En

Cundinamarca, la región del Sumapaz registra un área importante con cultivos de

gulupa, estimándose aproximadamente 500 ha. para el año 2005, con una

producción de 6.000 t. año (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2005). A

partir de ese año, el área sembrada aumentó paulatinamente en respuesta a la

demanda creciente de frutas de la pasión en el mundo (Akamine et al., 1954;

Pires y Sao José, 1994) y entre 2007 y 2010 la producción exportable de gulupa

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64

pasó de 523 a 2.294, 28 t., siendo los principales importadores Holanda,

Alemania, Francia, Bélgica y Luxemburgo, Reino Unido y Suecia (Agronet, 2011).

El aumento en el área sembrada con gulupa ha traído consigo un incremento de

los problemas fitosanitarios, incluyendo enfermedades, entre las que se destacan

la Mancha de aceite por Xanthomonas axonopodis (Benítez y Hoyos, 2009;

Benítez, 2010), Virosis por Cucumber Mosaic Virus CMV, Soybean Mosaic Virus

SBMV, Cowpea Aphid-Borne Mosaic Virus CoABMV y potyvirus (Camelo, 2010),

Marchitamiento vascular y Pudrición del cuello de la raíz por especies de

Fusarium (Ortiz, 2010), y la Roña de la gulupa cuya etiología se encuentra en

estudio, aunque es asociada con Cladosporium y Colletotrichum basado en

aislamientos en placas de agar. Esta última enfermedad también conocida como

Pudrición de Cladosporium ha sido reportada en Australia (Simmonds 1932),

Zimbabwe (Bates, 1954), Brasil (Bitancourt, 1935) y Venezuela (Rondón et al.,

1995), donde es limitante por causar pérdidas significantes cuando no es

controlada. En vivero puede causar muerte de plantas, mientras que en

condiciones de campo ocasiona la muerte de ramas, retraso de la floración y

producción, además de afectar la calidad del fruto, y aunque el hongo no causa

un deterioro a la pulpa, la apariencia y aceptación de la fruta en el mercado es

reducida (Goes, 1998).

En países como Kenia, la baja productividad en este cultivo es debida

principalmente a enfermedades como la Mancha café Alternaria passiflorae,

Marchitamiento vascular Fusarium oxysporum f. sp. Passiflorae (Gardner, 1989) y

virus woodiness causado por los virus Cowpea Mosaic Virus (CoMV) y Cucumber

Mosaic Virus (CMV) transmitidos por áfidos. Estas enfermedades han reducido la

vida productiva de la fruta de la pasión de cinco a dos años (Fushimi et al., 2001)

y pérdidas de producción del 40 – 100% (Wasilwa et al., 2004).

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Dada la importancia económica que tiene la Roña de la gulupa en la producción

exportable de la fruta, es necesario conocer la sintomatología y etiología como

primera medida para el manejo de la enfermedad, considerándose para tal fin

diferentes vías de diagnóstico fitopatológico. El presente capítulo tiene como

objetivo caracterizar la sintomatología de la Roña en el cultivo de Gulupa.

3.1 MATERIALES Y MÉTODOS

3.1.1 Localización

El presente estudio se realizó en la región del Sumapaz en las zonas productoras

de gulupa de los municipios de Granada, San Bernardo, Venecia y Tibacuy

(Cundinamarca), y en el laboratorio de fitopatología de la Facultad de Agronomía

de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá.

La región del Sumapaz fue considerada como área de estudio debido a que es la

zona de mayor producción de gulupa en el departamento de Cundinamarca,

dadas las condiciones óptimas para el desarrollo de la especie, con temperatura

promedio diaria de 17.2°C, humedad relativa promedio diaria de 82.5% y

precipitación promedio mensual de 74.3 mm (Mora, 2011).

3.1.2 Muestreo de material vegetal con síntomas de Roña

En los municipios antes mencionados, se colectó entre junio de 2009 y octubre de

2010 material vegetal de gulupa con síntomas de Roña. Hojas, ramas y frutos con

lesiones iniciales y avanzadas fueron tomados de plantas identificadas por

presentar la enfermedad, empacados cuidadosamente y llevados al laboratorio

de fitopatología de la Universidad Nacional para su posterior procesamiento y

análisis.

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3.1.3 Caracterización de síntomas de Roña

La sintomatología de la enfermedad se caracterizó macro y microscópicamente

en hojas, ramas y frutos. Macroscópicamente, por observación y descripción

directa de lesiones iniciales, intermedias y avanzadas. Para tal fin, se evaluó el

color, forma, elevación y aspecto de las lesiones. Microscópicamente por análisis

histopatológico de muestras con lesiones de Roña, las cuales fueron preparadas

a través del siguiente procedimiento: 1) Fijación de secciones de tejidos con y sin

síntomas de Roña en una solución de formalina- ácido acético y alcohol - FAA, 2)

Deshidratación por inmersión sucesiva de los tejidos en alcohol al 80, 90, 96 y

96%, 3) Aclarado de tejidos, mediante pases consecutivos por alcohol etílico puro

y ter-butanol, 4) Imbibición de tejidos en parafina fundida por 24 horas a 56ºC., 5)

Confección de bloques, 6) Obtención de cortes en micrótomo, con grosor de 7μm.

y 7) Montaje en láminas portaobjetos y tinción de tejidos con safranina y fast

green. Posteriormente se realizó la captura y análisis de imágenes en

microscopio de luz.

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Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz

67

3.2 RESULTADOS

3.2.1 Caracterización de síntomas de Roña

La Figura 1, ilustra los síntomas correspondientes a los estados tempranos e

intermedios de la enfermedad a nivel de frutos, en los que se observa lesiones

iniciales acuosas de color café (ampollas) que pueden o no desintegrarse (Figura

16A). Por ambos estados, se da origen a lesiones levemente hundidas que más

tarde coalescen y evolucionan a chancros, sobre los cuales se evidencia

esporulación verde oliva (Figura 16B). En frutos, donde no evoluciona la

enfermedad, se observan manchas circulares ligeramente hundidas, con bordes

definidos, de color verde en la periferia y café (necrosis) en el centro (Figura

16C).

De acuerdo con la anatomía del fruto de gulupa, en el estado de chancro la

enfermedad compromete tejidos y estructuras del exocarpo (incluyendo tricomas,

epidermis y células colenquimáticas de la hipodermis) y mesocarpo

(esclerénquima) como se observa en cortes longitudinales de frutos en el sitio de

la lesión, donde se origina una depresión del tejido (Figura 16D – E). La figura

16F-H, muestran micelio, conidióforos, ramoconidias, conidias intercalar y

terminal de Cladosporium asociadas a tejido necrótico en chancros, y en ningún

caso se encontró estructuras de Colletotrichum, como acérvulos ó conidias.

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Figura 16. Síntomas iniciales e intermedios de Roña en frutos. A. Estado inicial de la Roña en frutos de gulupa (formación de ampolla de aspecto acuoso), B. Estado intermedio de la enfermedad denominado chancro por desarrollo de lesiones hundidas, C. Fruto con lesiones de Roña que no evolucionan. D y E. Cortes longitudinales de frutos con síntomas de chancro a 10 X., F. Conidióforos de Cladosporium asociados a tejidos necróticos en chancros 40X., G. Conidióforo de Cladosporium soportando ramoconidia 100X. H. Conidias intercalar y ramoconidias asociadas a chancros.

A nivel de frutos, el estado más avanzado de la enfermedad se observa como una

lesión erupente de aspecto corchoso, resultado de la acumulación de capas de

tejido necrótico en la superficie. Las lesiones pueden presentar bordes regular e

irregular, de color café claro en el centro y verde en la periferia (Figura 17A-B).

Por análisis histopatológico de frutos con síntomas avanzados de Roña, se

evidenció la regeneración de tejidos afectados por el patógeno en etapas

tempranas e intermedias de la enfermedad, observándose en el sitio de la lesión

el restablecimiento de los tejidos en el mesocarpo (células esclerotizadas) y en el

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exocarpo (células epidermales e hipodermales en la epidermis), como se observa

en la figura 17C-D. Sobre el exocarpo regenerado se observa la acumulación de

capas de tejido necrótico que albergan estructuras del hongo, principalmente

micelio (Figura 17E-F).

Figura 17. Síntomas avanzados de Roña en frutos. A y B. Frutos de gulupa con lesiones corchosas en la superficie, C y D. Cortes longitudinales de frutos evidencia la regeneración de tejidos en el mesocarpo y exocarpo 10 y 40X (TN-C= Tejido necrótico de aspecto corchoso, EP= Epidermis, CE= Células esclereidas), E. Micelio de Cladosporium asociado a tejido corchoso en el sitio de la lesión MI, 100X. F. Tejido corchoso constituido de células muertas-CM, 100X.

En hojas de gulupa, la enfermedad se manifiesta como lesiones circulares, de

color verde en la periferia y café en el centro donde toma lugar la esporulación del

hongo (Figura 18A-B). En este órgano y en estados avanzados de la enfermedad,

el tejido afectado se desprende originando perforaciones a lo largo de la lámina

foliar (absición). La figura 18C, ilustra el arreglo anatómico de los tejidos en un

corte transversal de una hoja sana, en la que se observa epidermis

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uniestratificada en las superficies adaxial y abaxial y entre ellas parénquimas en

empalizada y esponjoso. De acuerdo con la anatomía de la hoja de gulupa, el

patógeno degrada las células epidermales y los parénquimas en empalizada y

esponjoso como se ilustra en la figura 18D-E, lo que resulta en la formación de

una capa delgada de tejido necrótico que soporta estructuras de Cladosporium, y

que posteriormente se desprende de la hoja.

Figura 18. Síntomas de Roña en hojas de gulupa. A y B. Síntomas de Roña en las superficies adaxial y abaxial de la hoja, C. Corte transversal de hoja sana de gulupa 40X. (EP=Epidermis, PE= Parenquima en empalizada, PES= Parenquima esponjoso), D. Corte transversal de hoja de gulupa con síntomas de Roña 40X. (DEP=Degradación de epidermis, DPE= Degradación de parenquima en empalizada, DPES= Degradación de parenquima esponjoso), E. Lámina foliar degradada en el sitio de la lesión 10X. (DMF= Degradación de mesofilo foliar), F. Estructuras de Cladosporium asociadas a lesiones de Roña en hojas 100x.

En ramas, los síntomas iniciales de la enfermedad se observan como manchas

circulares, levemente deprimidas y de color café, las cuales en un estado

intermedio crecen y coalescen. Posteriormente, las lesiones se tornan hundidas

con presencia de signos de Cladosporium, evidenciándose daño a nivel de

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tejidos internos (Figura 19A-B). La figura 19C, muestra un corte transversal de

una rama de gulupa e ilustra la anatomía y morfología de este órgano, constituido

por epidermis uniestratificada, cortex, cilindros vasculares, cambium y médula.

En ramas con la enfermedad, el daño causado por el patógeno puede extenderse

desde la epidermis hasta los cilindros vasculares y posiblemente a la médula

(Figura 19D-E).

Figura 19. Síntomas de Roña en ramas de gulupa. A y B. Lesiones intermedias y avanzadas de Roña en ramas, C. Corte transversal de una rama sana de gulupa, 10X., D. Corte transversal de una rama de gulupa con síntomas de Roña 40X., E. Estructuras de Cladosporium asociadas a lesiones de Roña en ramas de gulupa 100X.

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3.3 DISCUSIÓN

Los síntomas de Roña en gulupa muestran correspondencia con la

sintomatología de la enfermedad en maracuyá (Fischer y Rezende, 2008), dadas

las características de las lesiones y el progreso de las mismas en cada uno de los

órganos evaluados. La muerte de tejidos por colonización intracelular,

evidenciada por análisis histopatológicos, podría estar relacionada con la

producción y liberación de toxinas durante la patogénesis en frutos, hojas y ramas

de gulupa, como ha sido documentado para C. cucumerinum, C. cladosporioides,

C. herbarum y C. phlei, al producir toxinas del tipo perylenequinonas como

Calphostin C, cladochrome, Ent-isophleichrome y Phleichrome, respectivamente.

Estas toxinas son producidas por miembros de Ascomycota clasificados dentro de

los Phyllum Loculoascomycetes, Pyrenomycetes y Discomycetes. Estos

compuestos absorben la energía de la luz y generan especies reactivas de

oxígeno que dañan las células del hospedante, dada la sensibilidad de

macromoléculas como lípidos, proteínas y ADN a estas moléculas (Yoshihara et

al., 1975; Weiss et al., 1987; Arnone et al., 1988; Robeson y Jalal, 1992). Sin

embargo, toxinas específicas de hospedero (Host Specific Toxins) podrían

también estar jugando un papel importante en el desarrollo de la enfermedad,

como ha sido reportado en Mycosphaerellaceae, un clado hermano de

Cladosporium (Crous, 2007a, b). Las toxinas HST interfieren con la inducción de

respuestas de defensa ó inducen respuestas de defensa mediadas por muerte

celular programada en orden para generar necrosis requerida para la patogénesis

y virulencia (Friesen y Faris, 2008; Walton, 1996; Wolpert et al. 2002).

Mediante análisis histopatológico se observó colapso celular en tejidos afectados

conforme avanza el crecimiento del patógeno en los órganos evaluados. Sin

embargo, para hojas y frutos las imágenes sugieren la expresión de respuestas

de defensa por parte de la planta. En hojas el síntoma más avanzado de la

enfermedad, denominado perdigoneo, es resultado de la formación de capas de

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absición a lo largo del mesófilo foliar, que de acuerdo con Agrios (2005) ocurre en

hojas jóvenes y activas de algunas especies vegetales después de la infección

por un patógeno, y consiste en la digestión de la laminilla media entre dos capas

de células adyacentes al sitio de la lesión. De esta manera, la planta aísla el área

de infección del resto de la hoja y gradualmente el tejido donde crece el patógeno

es desprendido.

Contrario a lo que sucede en hojas, en frutos el avance del patógeno hacia el

endocarpo es restringido por la formación de capas corchosas en el mesocarpo

en el estado de chancro. De acuerdo con Vance (1980), uno de los compuestos

que podría estarse depositando en el sitio de la lesión luego del ataque del

patógeno es lignina, un biopolímero resistente a la degradación por muchos

microorganismos y que es formado comúnmente en respuesta a la penetración

microbial y a daños mecánicos, como es reportado por Geballe y Galston (1983)

en Hierba cinta (Phalaris arundinacea) y trigo (Triticum aestivum), donde papilas

con contenidos de lignina son inducidas durante la penetración de tejidos por

Helminthosporium avenae y Botrytis cinerea, respectivamente. Woo et al., 2004

investigaron aspectos ultraestructurales de la interacción planta patógeno en

frutos y hojas de mandarina (Satsuma mandarin) con síntomas de Roña por

Elsinoe fawcettii. En este estudio, la infección indujo la formación de capas de

corcho debajo de los sitios infectados, las cuales estuvieron compuestas de

células compactas del hospedante con pared celular compleja y lamelación

alterna, indicando tejido lignosuberizado en la peridermis herida. Además, el

tejido del hospedante por debajo de la capa de corcho no fue invadido por hifas,

lo que sugiere que las capas de corcho en la peridermis actúan como una barrera

protectora que restringe el crecimiento de E. fawcettii en lesiones de Roña.

El análisis histopatológico en gulupa da evidencia del restablecimiento de tejidos

en el mesocarpo posterior a la estimulación de la división celular que toma lugar

debajo de la capa corchosa emergente, siguiendo posiblemente un proceso de

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histogenia semejante al que ocurre en tubérculos de papa con síntomas de Roña

por Streptomyces scabies. Según Powell (2008) la Roña de la papa puede

iniciarse en lenticelas del tubérculo, en las cuales el meristemo es estimulado y

por división da origen a un tipo de células elongadas que son invadidas por el

parasito y posteriormente colapsadas; mientras tanto su contenido y pared toman

un color café, dando a la Roña su color característico. La destrucción de las

células elongadas produce lenticelas anchas con merístemos menos activos que

originan células hijas que cesan la elongación y llegan a ser suberizadas,

formándose así un tejido compacto (barrera de corcho) y más tarde

desprendimiento de células externas infectadas que permanecen adheridas al

tejido sano.

La fisiología de la planta aún cuando no fue objeto de estudio, posiblemente es

afectada en mayor ó menor extensión en hospedantes con síntomas de Roña. A

nivel de hojas, la enfermedad lleva a una reducción del área fotosintéticamente

activa, por muerte celular y pérdida de tejido posterior a la formación de capas de

absición (Bitancourt, 1935). A pesar de que no existen estudios sobre el efecto de

la enfermedad en la producción de gulupa, el daño por el patógeno puede ser

considerable en condiciones ambientales favorables, con alta presión de inóculo y

con presencia de hojas en estados fenológicos receptivos, aunque en hojas

puede verse de alguna manera compensado el daño dada la alta producción foliar

de esta especie vegetal, conocida por presentar un crecimiento indeterminado.

La enfermedad puede tener efectos mayores en otros órganos, como en ramas,

donde la funcionalidad de los cilindros vasculares es comprometida por

degradación de células del xilema y floema, lo cual afecta negativamente la

traslocación de agua, nutrientes y fotoasimilados, además de la estabilidad de

este órgano cuando el patógeno alcanza tejidos en la médula, lo que resulta en

su rompimiento y desprendimiento por acción del viento (Yamashiro, 1991). En

frutos, la enfermedad compromete la estabilidad de los mismos por degradación

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de células epidermales e hipodermales en el exocarpo y esclereidas en el

mesocarpo, y en esa vía la producción es reducida por pérdida de la calidad

estética (Goes, 1998), limitándose así su comercialización en el mercado de

exportación.

Como es reportado por Fischer y Rezende (2008), sobre las lesiones de Roña se

encontró asociada esporulación fungal de color verde oliva, que basado en

características microscópicas corresponde a ramoconidias, conidias intercalar y

terminal de Cladosporium, lo que sugiere a este hongo como agente causante

de la Roña de la gulupa. Lo anterior es coherente con otros reportes, debido a

que en Brasil se ha encontrado a C. cladosporioides y C. herbarum como agentes

causante de la enfermedad en maracuyá (Barreto et al., 1996) y C. oxysporum en

Zimbabwe y Australia (Bates, 1954; Persley, 1993).

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4. Conclusiones y recomendaciones

4.1 Conclusiones

Las colonias de Cladosporium asociadas a Roña en gulupa presentan

micelio algodonoso ó aterciopelado, con coloración olivacea-gris y bordes

de color blanco en PDA, gris-humo en AEM y verde olivaceo en AA, con

conidióforos macro y micronematosos, ramoconidias primarias poco

frecuentes, ramoconidias secundarias, conidias intercalar y terminal con

ornamentación de pared lisa en SNA.

Los análisis morfológico y molecular por ITS y actina mostraron

correspondencia, lo que sugiere a Cladosporium cladosporioides sensu

lato y posiblemente C. lycoperdinum sesu estricto como la identidad

taxonómica de los aislamientos evaluados.

Cladosporium, es el agente causante de la Roña en gulupa, luego de

reproducirse los síntomas de la enfermedad con la inoculación artificial de

aislamientos del hongo en hojas y frutos bajo condiciones de laboratorio e

invernadero.

La Roña de la gulupa en frutos, hojas y ramas muestra correspondencia

con la sintomatología de la enfermedad en maracuyá y esta

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correlacionada en todos los órganos evaluados con colapso celular a nivel

de los tejidos afectados, lo que sugiere la producción y liberación de

toxinas por el patógeno durante la infección.

La presencia de Cladosporium en lesiones de Roña evidencia su

responsabilidad en la enfermedad, y de acuerdo con el análisis

histopatológico, Colletotrichum no estaría involucrado en el desarrollo de la

patología, dada la ausencia de estructuras como acérvulos y conidias que

lo comprometan.

Respuestas de defensa estructurales se expresan posterior al desarrollo

de la enfermedad, como formación de capas de abscisión en hojas y de

corcho en frutos, las cuales evitan el progreso de la enfermedad al aislar el

patógeno de los tejidos sanos de la planta.

4.2 Recomendaciones

Partiendo del conocimiento actual sobre la etiología de la Roña en gulupa,

es necesario realizar estudios dirigidos a la selección de materiales con

resistencia a la enfermedad. Igualmente, es importante conocer la

variabilidad del patógeno a través de estudios de la estructura genética de

las poblaciones.

Pensando en la necesidad de manejo de la enfermedad, evaluación de

métodos de control cultural, biológico y químico son requeridos en

condiciones de laboratorio y campo, donde se evalué el efecto de

prácticas agronómicas sobre la intensidad de la enfermedad, incluyendo la

remoción de órganos afectados y el uso de agentes biocontrol y fungicidas

de síntesis química.

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El efecto de la enfermedad sobre el rendimiento y calidad de la fruta debe

ser evaluada, considerándose diferentes variables organolépticas de la

fruta, como sólidos totales solubles, color, textura, entre otros.

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A. ANEXO: Color de colonias de aislamientos de Cladosporium

asociados a gulupa, de acuerdo con el manual Pantone®.

AISLAMIENTO PDA AEM AA

FABCl14 451U-5835U/5535U 5615U/5467U 5767U-5757U/546U

FABCl21 451U- 582U/5535U 5615U-5535U-5615U /5467U 5767U-5757U/546U

FABCl22 451U-581U/5535U 5753U-5763U/5467U 5767U-5757U/546U

FABCl27 5825U/5535U 5763U/5463U 5757U/546U

FABCl43 4485U-4515U/5605U 5605U/5463U 5757U/546U

FABCl45 5815U/5535U 5753U/5467U 5767U-5757U/546U

FABCl50 5825U/5535U 5625U/5467U 5767U-5757U/546U

FABCl51 451U-5835U/5535U 5615U/5467U 5767U-5757U/546U

FABCl69 581U/5535U 5763U/5467U 5757U/546U

FABCl71 581U/5535U 5753U/5467U 5767U-5757U/546U

FABCl73 5815U/5535U 456U/5467U 5757U/546U

FABCl74 5825U/5535U 5753U/5467U 5767U-5757U/546U

FABCl78 5815U/5535U 5773U/5467U 5757U/546U

FABCl79 5815U/5535U 5753U/5467U 5757U/546U

FABCl80 5815U/5555U 5753U/5467U 5757U/546U

PDA: Papa-Dextrosa- Agar; AEM: Agar Extracto de Malta y AA: Agar harina

de Avena.

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