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Tesis Doctoral

Caracterización Caracterización de los mecanismosde los mecanismoscelulares involucrados en lacelulares involucrados en laregresión tumoral según laregresión tumoral según la

dependencia hormonal de losdependencia hormonal de lostumores mamariostumores mamarios

Polo, María Laura

2014

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Polo, María Laura. (2014). Caracterización de los mecanismos celulares involucrados en laregresión tumoral según la dependencia hormonal de los tumores mamarios. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

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Polo, María Laura. "Caracterización de los mecanismos celulares involucrados en la regresióntumoral según la dependencia hormonal de los tumores mamarios". Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2014.

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Caracterización de los mecanismos celulares involucrados en la regresión tumoral según la dependencia hormonal de los

tumores mamarios

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área CIENCIAS BIOLÓGICAS

María Laura Polo

Director de tesis: Virginia Novaro

Consejero de Estudios: Eduardo Arzt

Lugar de trabajo: Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME)

Buenos Aires, 2014

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AGRADECIMIENTOS

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Quisiera agradecer muy especialmente a Virginia, mi directora de Tesis, por permitirme realizar este trabajo, por su comprensión y paciencia a lo largo de estos años.

A Claudia, por su excelente predisposición y consejo, y por discutir y corregir los resultados de esta Tesis.

A todos mis compañeros del laboratorio, por hacer que el trabajo diario sea tan divertido, por la ayuda que me brindaron y todo lo que me enseñaron.

A Bruno por su ayuda en el bioterio.

A la Universidad de Buenos Aires y a su Facultad de Ciencias Exactas y Naturales por la formación que he recibido y por la oportunidad de realizar este Doctorado en Ciencias Biológicas.

A CONICET, por su apoyo económico con las becas de Posgrado Tipo I y II.

Al Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME), donde realicé este trabajo de investigación.

A la Fundación Sales por su apoyo económico con subsidios para el desarrollo de esta investigación.

A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, por los subsidios provistos al laboratorio durante estos años.

A la Fundación Avon por las becas otorgadas para participar de los congresos de la AACR 2011 y 2013.

A la Fundación Fullbright y a la Fundación Bunge y Born por la beca otorgada para poder llevar a cabo la pasantía de investigación en el laboratorio del doctor Derek Radisky en la Clínica Mayo, Florida, Estados Unidos.

Por último, quisiera agradecer a mi familia, que me acompañó desde el primer día de facultad y siempre me apoyó incondicionalmente.

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RESUMEN-ABSTRACT

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Caracterización de los mecanismos celulares involucrados en la regresión tumoral según la dependencia hormonal de los tumores mamarios

Las similitudes morfológicas y fenotípicas entre los carcinomas mamarios más frecuentes

en mujeres (carcinomas ductales, positivos para los receptores de estrógenos (ER) y progesterona (PR)), y el modelo de carcinomas mamarios murinos inducidos con acetato de medroxiprogesterona (MPA), hacen de este modelo una herramienta útil para estudiar los mecanismos celulares asociados al tratamiento antitumoral con agentes endocrinos (antagonistas del ER y PR), e inhibidores de quinasas, entre otros.

En este trabajo de Tesis hemos evaluado en el modelo de carcinomas mamarios inducidos con MPA, mecanismos tempranos de regresión tumoral asociados al tratamiento endocrino con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) y el inhibidor de PI3K wortmanin (WORT). En vista de la evidencia clínica actual, que demuestra que la combinación de agentes endocrinos e inhibidores de la vía PI3K/Akt resulta beneficiosa para el tratamiento adyuvante de pacientes con tumores ER y PR positivos, y de los estudios que señalan a los antiprogestágenos como una terapia válida para el tratamiento del cáncer de mama, creemos que este trabajo resulta valioso ya que constituye el primer estudio realizado en un modelo experimental de cáncer de mama en donde se evalúan los efectos de la terapia combinada de antiprogestágenos e inhibidores de PI3K.

Analizando variantes tumorales que representan distintos estadios dentro de la progresión del cáncer de mama (desde la hormono-dependencia a la resistencia endocrina), comprobamos que los agentes MFP y WORT poseen mecanismos diferenciales de acción, tanto en el parénquima como en el estroma tumoral. Dichos mecanismos posibilitan en ciertas variantes que la combinación de ambos sea más efectiva que el tratamiento con cada droga por separado, y que en otras variantes, en cambio, la combinación no sea beneficiosa. De acuerdo a la creciente importancia que ha adquirido el microambiente tumoral tanto en la regulación del crecimiento de los tumores como en la respuesta a las terapias, demostramos que en algunas de las variantes analizadas el estroma tumoral juega un papel activo durante la regresión inducida por el tratamiento endocrino y por la inhibición de PI3K. Los resultados obtenidos en el modelo experimental plantean la posibilidad de que la expansión del compartimiento estromal que se asocia tempranamente con la regresión de los tumores (fenómeno definido como reacción estromal), actúe como un indicador de la eficacia de la terapia antitumoral utilizada.

Hemos demostrado también que el modelo de cultivo tridimensional en Matrigel es una herramienta eficaz para evaluar in vitro la sensibilidad diferencial de las células epiteliales derivadas de las variantes tumorales a los distintos agentes ensayados, lo que apoya el uso de

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este sistema para predecir el comportamiento de las células neoplásicas frente a distintos compuestos antitumorales.

En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuyen al estudio de la terapia endocrina del cáncer de mama, presentando evidencia que se suma a los trabajos que plantean el uso de los antiprogestágenos en el tratamiento de esta patología, y demostrando por primera vez el beneficio potencial, para determinado grupo de tumores, de una terapia combinada de antiprogestágenos con inhibidores de vías de señalización como la vía PI3K/Akt.

Palabras clave: Parénquima tumoral, estroma tumoral, terapia endocrina, vía PI3K/Akt,

regresión tumoral.

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Characterization of the cellular mechanisms involved in tumor regression using mammary carcinomas with different stages of hormone dependence

The morphological and phenotypic similarities among the most frequent mammary

carcinomas in women (ductal carcinomas, positive for estrogen (ER) and progesterone receptors (PR)) and the medroxyprogesterone acetate (MPA)- induced mammary tumor model in mice, make this model suitable for the evaluation of mechanisms associated with endocrine treatment (ER and PR antagonists), and protein kinase inhibitors, among others.

In this Thesis we evaluated for the first time cellular mechanisms of early tumor regression after antiprogestin therapy in combination with PI3K inhibitors. In light of the current clinical evidence, showing that combination therapies with endocrine agents and PI3K/Akt inhibitors are beneficial for ER and PR positive patients, and based on recent studies pointing to PR as a valid target for breast cancer treatment, we believe that these results may shed light to choose which patients may be selected for this kind of adjuvant therapies.

Evaluating tumor variants from the MPA–induced breast cancer model that represent different stages of breast cancer progression (from hormone dependency to endocrine resistance), we found that the antiprogestin mifepristone (MFP) and the PI3K inhibitor, wortmannin (WORT) inhibit tumor growth affecting both the parenchyma and the tumor stroma. However, different type of tumors showed a differential sensitivity to both agents and their combination resulted to be effective in certain tumor variants and not in others. In agreement with the increasing evidence supporting that the tumor microenvironment exerts a pivotal role regulating tumor growth and influencing their response to therapies, we have demonstrated that tumor stroma plays an active role during the early stages of endocrine and PI3K inhibition-induced regression. According to our results, stromal reaction (defined as the increase in the stromal compartment that occurs during tumor regression), may act as a biological marker for antitumor therapy’s effectiveness.

Furthermore, we have also confirmed that three-dimensional culture on Matrigel is an effective tool to evaluate in vitro, tumor cell differential responses to several agents, and thus supports the use of this system to predict neoplastic cell behavior after anti-tumor treatment.

In conclusion, this Thesis contributes to the study of endocrine therapy, by presenting evidence that supports the use of antiprogestins in breast cancer treatment, and by showing for the first time the potential benefit in certain type of tumors of combined therapies of antiprogestins together with signaling pathway inhibitors such as those of the PI3K/Akt pathway.

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Keywords: Tumor parenchyma, tumor stroma, endocrine therapy, PI3K/Akt pathway, tumor regression.

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ÍNDICE

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AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………………………………. 1

RESUMEN- ABSTRACT……………………………………………………………………………… 3

INDICE………………………………..…………………………………………………………………. 8

ABREVIATURAS……………………………………………………..………………………………... 13

INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………….. 17

Estructura de la glándula mamaria…………………………………………………………………... 18

Cáncer de mama……………………………………………………………………………………….. 20

Terapia hormonal en el cáncer de mama……………………………………………………………. 23

Antiprogestágenos en el tratamiento del cáncer de mama………………………………………... 26

La vía PI3K/Akt en el tratamiento del cáncer de mama……………………………………………. 28

Microambiente tumoral………………………………………………………………………………… 32

Modelo de carcinomas mamarios inducidos con acetato de medroxiprogesterona (MPA)…… 34

OBJETIVOS E HIPÓTESIS…………………………………………………………………………… 37

MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………………………….. 40

Experimentos in vivo…………………………………………………………………………………. 41

Animales…………………………………………………………………………………………………. 41

Tumores…………………………………………………………………………………………………. 41

Pasaje singeneico de tumores………………………………………………………………………… 42

Valoración del crecimiento tumoral…………………………………………………………………… 42

Remoción del depot de MPA………………………………………………………………………….. 42

Tratamientos antitumorales……………………………………………………………………………. 43

Extirpación de tumores………………………………………………………………………………… 43

Western blot…………………………………………………………………………………………….. 44

Inmunofluorescencia…………………………………………………………………………………… 44

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Inmunohistoquímica……………………………………………………………………………………. 45

Determinación del área estromal y necrótica en cortes histológicos de tumores……………….. 46

Análisis de expresión génica………………………………………………………………………….. 47

Cuantificación de inmunohistoquímicas para caspasa 3 activada………………………………… 48

Experimentos in vitro…………………………………………………………………………………. 48

Cultivos primarios………………………………………………………………………………………. 48

Tratamientos…………………………………………………………………………………………….. 50

Tinción con naranja de acridina-bromuro de etidio………………………………………………… 50

Inmunofluorescencia de cultivos tridimensionales………………………………………………….. 51

Ensayo de proliferación de CAFs: IF para Ki67……………………………………………………... 51

Ensayo de proliferación de CAFs: Incorporación de timidina tritiada…………………………….. 52

Medio condicionado de cultivos epiteliales C4-HD…………………………………………………. 52

Anticuerpos utilizados……………………………………………………………………………….. 52

Análisis estadístico…………………………………………………………………………………… 53

RESULTADOS…………………………………………………………………………………………. 55

CAPÍTULO I: TUMOR HORMONO-DEPENDIENTE…………………………………………….... 56

I.A. Antecedentes………………………………………………………………………………………. 57

I.B. Regresión tumoral temprana en la variante C4-HD luego del tratamiento con diversos agentes endocrinos…………………………………………………………………………………… 58

I.C. Caracterización de los mecanismos celulares involucrados en la regresión tumoral inducida por el antiprogestágeno mifepristona……………………………………………………… 68

I.D. Participación de la vía PI3K/Akt en la regresión tumoral C4-HD inducida por MFP……… 79

I.E. Análisis in vitro de la respuesta celular al tratamiento con diversos agentes antitumorales. 86

ANEXO CAPÍTULO I…………………………………………………………………………………… 93

CAPÍTULO II: TUMOR HORMONO-INDEPENDIENTE…………………………………………... 98

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II.A. Antecedentes……………………………………………………………………………………… 99

II.B. Regresión tumoral temprana en la variante C4-HI, respuesta al tratamiento con diversos agentes antitumorales………………………………………………………………………………….. 101

II.C. Mecanismos de regresión asociados al tratamiento conjunto MFP y WORT: parénquima tumoral…………………………………………………………………………………………………... 109

II.D. Mecanismos de regresión asociados al tratamiento conjunto MFP y WORT: estroma tumoral. 117

II.E. Estudio in vitro de la respuesta al tratamiento con los antagonistas hormonales TAM y MFP, y del inhibidor de PI3K WORT………………………………………………………………..... 119

CAPÍTULO III: TUMORES RESISTENTES ENDÓCRINOS………………………………………. 124

III.A. Antecedentes……………………………………………………………………………………... 125

III.B. Efecto de la inhibición de la vía PI3K/Akt en tumores con sensibilidad reducida a antiprogestágenos………………………………………………………………………………………. 126

III.C. Modelado in vitro de la respuesta a MFP, WORT, o MFP+WORT en tumores con sensibilidad reducida a antiprogestágenos……………………………………………………….….. 130

III.D. Efecto de la inhibición de la vía PI3K/Akt en una variante resistente al tratamiento con antiprogestágenos………………………………………………………………………………………. 132

III.E. Efecto estromal de la inhibición de la vía PI3K/Akt en una variante resistente…….……… 140

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES…………………………………………………………………….. 142

Regresión tumoral en la variante C4-HD………………………………………………………….. 145

Compartimiento epitelial de los tumores C4-HD…………………………………………………….. 145

Compartimiento estromal de los tumores C4-HD…………………………………………………… 146

Participación de la vía PI3K/Akt en la regresión de los tumores C4-HD…………………………. 148

Regresión tumoral en la variante C4-HI…………………………………………………………… 151

Reorganización tisular y diferenciación ductal durante la regresión de los tumores C4-HI……. 151

La MFP produce citostasis, el WORT apoptosis y necrosis tumoral. El tratamiento combinado favorece la regresión tumoral C4-HI………………………………………………………………….. 152

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Reacción estromal en tumores C4-HI……………………………………………………………….. 154

Regresión tumoral en la variante C4-2-HI………………………………………………………… 155

Conclusiones finales…………………………………………………………………………………. 157

Implicancia de los resultados obtenidos…………………………………………..…………………. 157

Perspectivas a futuro…………………………………………………………………………………… 158

APENDICE………………………………………………………………………………………………. 159

REFERENCIAS…………………………………………………………………………………………. 167

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ABREVIATURAS

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ADN Ácido desoxirribonucleico

AIs Inhibidores de aromatasa

AMPc Adenosin monofosfato cíclico

ARN Ácido ribonucleico

ATP Adenosin trifosfato

CAFs Fibroblastos asociados al tumor

DCIS Carcinoma ductal in situ

DMSO Dimetil Sulfoxido

DOXO Doxorrubicina

EGF Factor de crecimiento epidérmico

EMT Transición epitelio-mesenquimal

ER Receptor de estrógenos

ERE Elemento respondedor a estrógenos

EGFR Receptor del factor de crecimiento epidérmico humano

ERK1/2 Quinasas reguladas por señales extracelulares 1 y 2

ERα Receptor de estrógenos alfa

FGF Factor de crecimiento fibroblástico

FSP Proteína fibroblástica específica

HD Hormono-dependiente

HER-2 Factor de crecimiento epidérmico humano 2

HGF Factor de crecimiento de hepatocitos

HI Hormono-independiente

ICI Fulvestrant

IDC Carcinoma ductal invasivo

IF Inmunofluorescencia

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IGF-1R Receptor del factor de crecimiento insulínico tipo 1

IHQ Inmunohistoquímica

IL Interleuquina

ILC Carcinoma lobulillar invasivo

IP Ioduro de propidio

IRS-1 Sustrato del receptor de insulina 1

LCIS Carcinoma lobulillar in situ

MAPK Proteínas quinasas activadas por mitógenos

MFP Mifepristona

MPA Acetato de medroxiprogesterona

MUC-1 Mucina 1

NA-BE Naranja de acridina-Bromuro de etidio

PDGF Factor de crecimiento derivado de plaquetas

PH Dominio de homología a plecstrina

PI(3,4,5)P3 Fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato

PI(4,5)P2 Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato

PI3K Fosfoinositol 3-quinasa

PKA Proteína quinasa A

PR Receptor de progesterona

RTK Receptor tirosina quinasa

SDF-1 Factor derivado de células estromales 1

SERMs Moduladores selectivos del receptor de estrógenos

SFB Suero fetal bovino

SFBch Suero fetal bovino charcolizado

SPRMs Moduladores selectivos del receptor de progesterona

TAM Tamoxifeno

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TAMs Macrófagos asociados al tumor

TGF-β Factor de crecimiento transformante beta

TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa

VEGF Factor de crecimiento del endotelio vascular

WB Western blot

WORT Wortmanin

α-SMA Actina de musculo liso alfa

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INTRODUCCIÓN

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ESTRUCTURA DE LA GLÁNDULA MAMARIA

Las mamas son glándulas de secreción externa presentes únicamente en mamíferos, encargadas de producir y secretar la leche que será el alimento de las crías recién nacidas. A lo largo de la vida de la mujer, la glándula mamaria experimenta cambios drásticos en su composición, arquitectura y funcionalidad. Las etapas claves en el desarrollo de la mama comprenden el desarrollo fetal, la expansión en la pubertad, la remodelación asociada al embarazo y a la lactancia, y los cambios involutivos que ocurren luego de la lactancia, y la menopausia (Russo y Russo, 2004). A diferencia de la mayoría de los órganos que alcanzan su madurez durante la vida embrionaria, la glándula mamaria se desarrolla completamente durante el ciclo del embarazo y la lactancia.

En la mujer el desarrollo de la glándula mamaria se inicia durante la sexta semana de vida embrionaria, a partir de cordones ectodérmicos bilaterales que se extienden longitudinalmente en la superficie ventral del embrión, en la denominada “línea de la leche”. A partir de dichas estructuras, hacia el final de la gestación se generan de 15 a 20 túbulos mamarios primitivos que pueden presentar cierto grado de ramificación (Hassiotou y Geddes, 2013). Durante la niñez la glándula mamaria permanece en un estado de reposo, con un mínimo desarrollo adicional y prácticamente no es posible encontrar diferencias estructurales entre hombres y mujeres (Russo y Russo, 2004).

La ovulación y el establecimiento de los ciclos menstruales en la pubertad, inducen un rápido crecimiento de la glándula mamaria. Dicho crecimiento se debe principalmente a un incremento en la abundancia del tejido adiposo mamario. Asimismo, se produce la elongación y ramificación de los ductos preexistentes, y en las terminales de los mismos se desarrollan acinos secretores o alvéolos. Durante la adolescencia el desarrollo mamario se caracteriza por cambios cíclicos que reflejan las variaciones hormonales asociadas a los ciclos menstruales. Los estrógenos estimulan la proliferación del epitelio mamario promoviendo la formación y ramificación de los conductos. La progesterona en la fase lútea favorece la dilatación de los conductos y la diferenciación de las células alveolares. Respondiendo a este patrón cíclico, el desarrollo de la mama continúa gradualmente durante la adolescencia hasta una edad aproximada de 35 años. En su estado adulto la glándula mamaria está formada por acinos secretores, conductos excretores y tejido conjuntivo intersticial, siendo en conjunto una glándula túbulo-acinar. Los lobulillos mamarios (unidades estructurales básicas de la glándula mamaria) están formados por acinos secretores agrupados en torno a un conducto colector. Los acinos están conformados por células epiteliales de tipo secretor, rodeadas por células mioepiteliales que proveen un mecanismo contráctil para

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expulsar la leche producida en los acinos. Los lobulillos mamarios se reúnen formando lóbulos. Dentro de la glándula mamaria pueden distinguirse de quince a veinte lóbulos mamarios, cada uno con un conducto excretor propio que desemboca en el pezón (Fig.1).

Figura 1: Anatomía de la glándula mamaria en la mujer. A. Dentro de la mama pueden distinguirse de quince a veinte lóbulos mamarios. Cada lóbulo mamario está formado por numerosos lobulillos, inmersos en un estroma fundamentalmente conectivo-adiposo. Los lobulillos a su vez están formados por acinos, estructuras conformadas por células secretoras, rodeadas por células mioepiteliales. El acino mamario se vacía a través de un conducto terminal, el cual converge con sus congéneres formando el conducto lobulillar, que recoge la secreción láctea de todos los acinos de un lobulillo. Los distintos conductos lobulillares se reúnen para formar un conducto interlobulillar, que al reunirse con otros conductos de este tipo forman los conductos lobulares o galactóforos, que se dirigen al pezón. En la base del pezón los conductos lobulares se agrandan para formar los senos lactíferos, los cuales se dilatan y sirven de depósito para la leche del amamantamiento. B.

Representación tridimensional de un corte de tejido mamario normal a nivel de las terminaciones. LEP: células epiteliales luminales, MEP: células mioepiteliales, BM: membrana basal (Adaptado de Nelson y Bissell, 2006).

Como hemos mencionado, si bien la mama sufre cierto grado de remodelación durante

cada ciclo menstrual, la completa madurez se alcanza en la preñez y la lactancia. Los elevados niveles de estrógenos, progesterona y prolactina asociados al embarazo inducen la síntesis de novo de nuevos ductos, la elongación de los ductos preexistentes y la diferenciación de las células alveolares a un fenotipo secretorio.

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Luego del cese de la lactancia, la glándula mamaria regresa a un estado de reposo mediante un proceso denominado involución. Al comienzo de la involución, la activación de mecanismos apoptóticos conduce a la muerte de gran parte del epitelio mamario. Sin embargo, a pesar de que al inicio de la involución la muerte de las células epiteliales es masiva, no se registran cambios significativos en la arquitectura de la glándula mamaria. La sobreexpresión de proteasas que degradan componentes de la matriz extracelular, como las metaloproteinasas 2, 3, 9 y 11 (MMPs 2, 3, 9 y 11), marca el comienzo de una segunda etapa en el proceso involutivo. Esta etapa se caracteriza por una marcada remodelación del estroma mamario, por el infiltrado de macrófagos y otras células del sistema inmune que remueven las células muertas, y la diferenciación de nuevos adipocitos que regeneran el tejido graso de la glándula mamaria (Watsony Kreuzaler, 2011). Si bien no se conocen con exactitud los mecanismos involucrados en la regulación del comienzo de la segunda fase involutiva, se cree que hormonas sistémicas como los glucocorticoides y la prolactina jugarían un papel preponderante (Thompson, 1996); (Zettl et al., 1992). Además de la involución asociada al final de la lactancia, la glándula mamaria atraviesa una segunda fase de involución durante la menopausia. Este proceso se encuentra asociado a la disminución de la función ovárica, y se caracteriza por una reducción del tejido glandular mamario, acompañado por un aumento en el tejido adiposo adyacente.

Como señalamos, el tejido mamario es un tejido altamente dinámico y diferenciado donde cada componente está especializado en una función particular en un estadío determinado. Alteraciones tanto en la interacción entre los componentes del tejido, como en la homeostasis endócrina, pueden provocar inflamación, hiperplasia mamaria y en algunos casos la aparición de tumores.

CÁNCER DE MAMA El cáncer de mama es la neoplasia más frecuentemente diagnosticada en mujeres en el

mundo entero. De acuerdo a las estimaciones realizadas en el año 2008 por la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer (IARC), a nivel mundial el cáncer de mama constituyó el 23% del total de neoplasias diagnosticadas y representó el 14% del total de muertes registradas por cáncer (ubicándose en primer lugar, por encima del cáncer de pulmón, colorrectal y útero, entre otros) (Jemal et al., 2011). Para el año 2014, la Sociedad Americana del Cáncer estima que en los Estados Unidos se diagnosticarán 232.670 nuevos casos de cáncer de mama en mujeres (29% del total de casos diagnosticados) y 40.000 defunciones debido a dicha causa. A pesar de que el cáncer de mama continua siendo la neoplasia más frecuente en mujeres, ya no representa

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la primera causa de muerte por cáncer. Las estimaciones para el 2014 lo posicionan segundo, luego del cáncer del pulmón (15% contra el 26% del total de las muertes estimadas, respectivamente), (Fig. 2) (Siegel et al., 2014). En nuestro país la situación es similar. La Republica Argentina, luego de Uruguay, es el país de América Latina con mayor tasa de mortalidad por cáncer de mama (20,1 y 24,3 defunciones cada 100.000 mujeres respectivamente, estadísticas tomadas del INC, Argentina, 2012).

Figura 2: Números estimados de nuevos casos de cáncer y de muertes asociadas a los distintos tipos de cáncer

para el año 2014. La Sociedad Americana del Cáncer estima que en el año 2014 el cáncer de mama continuará siendo la neoplasia más frecuentemente diagnosticada en mujeres, y representará la segunda causa de muerte por cáncer luego del cáncer de pulmón. Adaptado de Siegel et al, 2014.

Biológica y clínicamente, el cáncer de mama es una enfermedad sumamente heterogénea.

Con el objetivo de estandarizar el diagnóstico, y constituir una herramienta para el tratamiento y la prognosis de la patología, se han diseñado sistemas de clasificación que permiten catalogar los diversos tumores mamarios. En los últimos años los avances alcanzados en la investigación del

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cáncer de mama han permitido clasificar a las distintas neoplasias mamarias de acuerdo a su histología, a la presencia de marcadores moleculares, y al patrón de expresión génica.

En base al análisis de la histología tumoral, los carcinomas mamarios pueden ser divididos en dos grandes categorías, los carcinomas in situ y los invasivos o infiltrantes. Se considera que un carcinoma es infiltrante cuando las células tumorales han adquirido la capacidad de atravesar la capa de células mioepiteliales y la membrana basal que separa al epitelio del estroma mamario. A su vez, los carcinomas in situ pueden ser clasificados en ductales (DCIS) o lobulillares (LCIS) según su apariencia histológica. Se estimó para el año 2013 que el 85% de los carcinomas in situ, corresponderían a DCIS (Siegel et al., 2013). Los carcinomas invasivos también se clasifican en numerosos subtipos histológicos entre los que se encuentran los carcinomas ductales invasivos (IDC), y lobulillares invasivos (ILC). De éstos, los carcinomas ductales invasivos constituyen la clase más extensamente representada. En el año 2013, cerca del 80% de las lesiones invasivas diagnosticadas resultarían IDCs (Siegel et al., 2013). Adicionalmente los IDCs pueden catalogarse como bien diferenciados (grado 1), moderadamente diferenciados (grado 2) y pobremente diferenciados (grado 3), en base al grado de pleomorfismo nuclear, el índice mitótico y la formación de túbulos o estructuras de tipo glandulares (Lester et al., 2009).

Además de aludir a las características histológicas de los tumores, las clasificaciones actuales se valen de la utilización de marcadores moleculares con valor pronóstico y/o predictivo (Allred et al., 1998), (Malhotra et al., 2010). Rutinariamente el cáncer de mama se clasifica en 3 categorías en base a la presencia o ausencia de 3 receptores presentes en las células mamarias, los receptores de estrógenos (ER) y de progesterona (PR) y el factor de crecimiento humano 2 (HER-2) (Carlson et al., 2009). Se ha descripto que aproximadamente el 70% de los tumores mamarios diagnosticados expresan los receptores ER y PR (Hurvitz y Pietras, 2008). Por otro lado, cerca del 20% de los tumores presentan sobreexpresión del receptor para HER-2 (Buzdar, 2009). Finalmente, el 10% de los casos restantes, no expresan ni ER, PR, o HER-2 y por esto son conocidos como tumores triple negativos (Anders y Carey, 2009).

En los últimos años, el análisis de los perfiles de expresión génica realizados mediante la tecnología de microarrays, ha permitido detectar la presencia de diversos subtipos moleculares dentro de la patología mamaria. En dos estudios paradigmáticos realizados por Perou y colaboradores (Perou et al., 2000), (Sorlie et al., 2001) se demostró que las variaciones existentes en las tasas de crecimiento, en la actividad de vías de señalización, así como también en la composición celular de los tumores mamarios se encuentran reflejadas en los patrones de expresión de diversos grupos de genes. Estos y otros estudios han posibilitado estratificar al cáncer de mama en los subtipos moleculares luminal A, luminal B, basal-like, normal-like, HER-2-

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enriched y claudin-low (Perou et al., 2000), (Sotiriou y Pusztai, 2009), (Prat et al., 2010), (Herschkowitz et al., 2007). Estos grupos de tumores presentan diferencias críticas en incidencia (Millikan et al., 2008), (Anders y Carey, 2009), supervivencia (Perou et al., 2000), (Sorlie et al., 2001), (Cheang et al., 2009) y respuesta al tratamiento (Nielsen et al., 2010). Es de esperar que a medida que los estudios genómicos progresen, nuevas entidades moleculares sean identificadas. Es importante destacar que la información obtenida por medio del análisis molecular ha logrado complementar y expandir a la obtenida a través de los marcadores clínico-patológicos clásicos (Parker et al., 2009).

TERAPIA HORMONAL EN EL CÁNCER DE MAMA

Como ya hemos mencionado, cerca del 70% de los tumores mamarios diagnosticados, son positivos para ER y PR. El crecimiento y desarrollo de estos tumores se encuentra estimulado principalmente por los estrógenos (Johnston y Dowsett, 2003). Por lo tanto, la terapia endocrina dirigida a bloquear la función estrogénica constituye el tratamiento por excelencia para los pacientes con tumores ER y PR positivos. Puede administrarse prequirúrgicamente (como tratamiento neoadyuvante), postquirúrgicamente (adyuvante) y en el estadio avanzado o metastásico (como tratamiento paliativo).

Inicialmente, la deprivación de estrógenos se conseguía mediante técnicas quirúrgicas (ovariectomía en mujeres premenopáusicas y adrenalectomía o hipofisectomía en mujeres postmenopáusicas). Sin embargo en las últimas tres décadas la terapia endocrina ha evolucionado. La influencia de los estrógenos sobre las células tumorales es inhibida principalmente a través de la utilización de compuestos que actúan como antagonistas del ER (tamoxifeno y otros moduladores selectivos), que llevan a la degradación del ER (fulvestrant y otros disruptores selectivos), o bloquean la síntesis endógena de 17-β-estradiol utilizando inhibidores de la enzima aromatasa (como el anastrozole, entre otros) (Palmieri et al., 2013) (Fig.3). El tamoxifeno (TAM) ha funcionado hasta la actualidad como el gold standard para el tratamiento de pacientes ER positivos, independientemente del estadio tumoral y de la edad del paciente. En una revisión realizada recientemente, se ha demostrado que la administración de TAM por 5 años reduce el riesgo de recurrencia de enfermedad en aproximadamente un 50%, durante los primeros 10 años que siguen al tratamiento. En este mismo estudio se comprobó además, que la mortalidad de pacientes con tumores mamarios en estadios tempranos, disminuyó aproximadamente un 30% dentro de los 15 años siguientes a la terapia (Early Breast Cancer

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Trialists’ Collaborative Group (EBCTCG), 2011). Recientemente, una serie de estudios han demostrado que un régimen de tratamiento con TAM durante 10 años, se asocia a una reducción en la mortalidad por cáncer de mama y a una mejora en la supervivencia, en relación a la administración de TAM por 5 años. En las mujeres postmenopáusicas sin embargo, hubo un incremento en el riesgo y en la mortalidad por cáncer de endometrio (ATLAS y aTTom trials), (Davies et al., 2013), (Gray et al., 2013). El TAM y los compuestos relacionados como el raloxifeno, toremifeno y arzoxifeno son conocidos como moduladores selectivos del ER (SERMs), debido a que presentan actividad agonista y antagonista dependiente del contexto celular. El balance entre dichas actividades parece estar relacionado con la presencia en la célula blanco de coactivadores y correpresores del ER (McDonnell et al., 2002), (Girault et al., 2003), junto con la interacción con vías de transducción celular (Ali y Coombes, 2002). En las células tumorales mamarias, el TAM actúa principalmente como un antagonista, pero la adquisición de actividad agonista sería responsable de una proporción de los casos de resistencia al tratamiento. Los inhibidores de aromatasa (AIs) son compuestos que actúan sobre la enzima aromatasa; enzima encargada de convertir los andrógenos testosterona y androstenediona, a los estrógenos estradiol y estrona, respectivamente. La enzima aromatasa se expresa en altos niveles en las células de la granulosa de los folículos ováricos y en la placenta. Aunque en menor intensidad, también está presente en hígado, musculo, cerebro, tejido mamario y adiposo subcutáneo (Nelson y Bulum, 2001). Es justamente el tejido adiposo, el responsable de la síntesis de los estrógenos residuales luego de la menopausia. De acuerdo al orden cronológico en que fueron desarrollados, los AIs se clasifican en primera, segunda y tercera generación. A su vez, los AIs de tercera generación pueden subdividirse en dos grupos, los inhibidores de tipo esteroideo (letrozole y anastrozole) y no esteroideo (examestano). La terapia con los AIs de tercera generación, es utilizada rutinariamente en la clínica en mujeres postmenopáusicas con tumores mamarios en estado avanzado (Van Asten et al., 2014). En diversos ensayos clínicos realizados con pacientes postmenopáusicas con tumores metastásicos, letrozole, anastrazole y examestano, han demostrado superioridad clínica en comparación al TAM, como terapias de primera línea (Bonneterre et al., 2000), (Mouridsen et al., 2003), (Paridaens et al., 2008). Asimismo, en la última década se ha evaluado el uso de los AIs como terapia única o de administración secuencial al tratamiento con TAM, en mujeres postmenopáusicas con cáncer de mama en estadio temprano (Palmieri et al., 2013). Estos estudios han demostrado que el tratamiento de primera línea con los AIs letrozole y anastrazole, fue ligeramente superior al TAM en términos de tiempo libre de enfermedad y beneficio de

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supervivencia global (Cuzick et al., 2010), (Regan et al., 2011). Diversos ensayos clínicos han mostrado también que la administración de AIs luego de una terapia inicial con TAM por 2 a 3 años, se encuentra asociada a una reducción del riesgo de enfermedad (Jonat et al., 2006). A pesar de que la evidencia señala que los AIs muestran una leve superioridad en comparación al TAM, muchas veces la elección de la terapia se ve influenciada por los costos de las drogas (superiores en el caso de los AIs) y por factores relativos a cada paciente.

Figura 3: Mecanismo de acción del TAM y AIs: La unión del estradiol al ER, lleva a la dimerización y al cambio conformacional del mismo. Los dímeros se unen a elementos respondedores a estrógenos (EREs), en los genes de respuesta a estrógenos. El TAM compite con el estradiol mientras que los AIs reducen su síntesis. Adaptado de Johnston et al., 2003.

El fulvestrant fue desarrollado como un antagonista del ER, que se une al receptor y

previene su dimerización, llevando a la degradación del mismo (Osborne et al., 2004). La terapia con fulvestrant se utiliza en mujeres postmenopáusicas con cáncer de mama avanzado, que no

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han respondido a la administración de terapias hormonales previas, como TAM o AIs (Johnston y Cheung, 2010), (Croxtall y McKeage, 2011).

A pesar de que la terapia endocrina ha sido una herramienta exitosa en el tratamiento del cáncer de mama, una alta proporción de tumores desarrollan resistencia a la terapia (resistencia adquirida), (Abe et al., 2005), (Cuzick et al., 2010), o no responden desde el inicio (resistencia de novo o constitutiva). Uno de los mecanismos de resistencia a antiestrógenos es la sobreexpresión o amplificación de HER-2, (Arpino et al., 2004), (De Laurentiis et al., 2005), (Ellis et al., 2006), (Puglisi et al., 2012). Sin embargo, solo el 10% de los tumores ER positivos presentan la vía HER-2 sobreactivada. En los últimos años evidencia clínica y experimental ha asociado a la hiperactivación de la vía PI3K/Akt con el fenómeno de resistencia endocrino (Miller et al., 2011), (Fox et al., 2012). Cerca de un 40% de los tumores mamarios ER y PR positivos presentan alteraciones en al menos algún componente de dicha vía que llevan a la desregulación de la misma, y a la generación de resistencia endócrina. Nos dedicaremos a la participación de la vía PI3K/Akt en cáncer de mama con más detalle posteriormente.

ANTIPROGESTÁGENOS EN EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER DE MAMA

Tradicionalmente se ha considerado que uno de los factores más importantes en el desarrollo del cáncer de mama está relacionado con la acción que ejercen los estrógenos sobre las células mamarias, y que los progestágenos poseen un papel escaso en la etiología de la enfermedad. Esta visión fue sostenida en parte, por los efectos que mostraba la progesterona en el tejido endometrial. Está aceptado que la progesterona inhibe la proliferación y promueve la diferenciación de las glándulas del endometrio (Fernandez-Valdivia et al., 2005). Sin embargo, numerosas publicaciones han puesto en evidencia en diversos modelos experimentales que los progestágenos actúan como hormonas proliferativas, y promueven el desarrollo de tumores mamarios (Haslam y Woodward, 2001) (revisado en Obr y Edwards, 2012 y en Lange et al., 2008).

Dentro de la evidencia clínica que vinculó a los progestágenos con la patología del cáncer de mama, se encuentran los estudios paradigmáticos publicados por el grupo del Women’s Health Initiative (WHI) y del Million Women Study. En estos estudios se demostró que el progestágeno sintético acetato de medroxiprogesterona (MPA), constituye un factor de riesgo para mujeres postmenopáusicas sometidas a un régimen de reemplazo hormonal (Beral, 2003), (Lee et al., 2006), (Rossouw et al., 2002). En comparación a la monoterapia con estrógenos, la terapia combinada de estrógenos y progestágenos se asoció con un aumento en el riesgo y la mortalidad por cáncer de mama (Chlebowski et al., 2010). Por los motivos mencionados anteriormente es

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razonable considerar a la inhibición del PR como una estrategia válida para el tratamiento del cáncer de mama (Moore, 2004).

Los moduladores selectivos del PR (SPRMs) se clasifican en tres grupos. Los SPRMs pertenecientes al grupo I se unen al PR, e impiden que éste se una al ADN. Como ejemplo podemos citar a la onapristona (ZK 98299, Leonhardt et al., 2003). Los SPRMs del grupo II, entre los que se encuentra la mifepristona (MFP, RU 486) se unen al PR, y el complejo ligando-receptor se une al ADN. Los SPRMs tipo II pueden actuar como agonistas si las células son estimuladas con activadores de la vía AMPc/PKA. Este efecto parecería ser tejido-especifico especialmente en tejidos con alta expresión de la isoforma B del PR (Beck et al., 1993). Los moduladores de tipo III, permiten la unión del PR al ADN y presentan un efecto puramente antagonista, aun en la presencia de la vía AMPc/PKA activada. Como ejemplo podemos citar al lonaprisan (ZK 230211; Afhuppe et al. 2009).

La MFP fue el primer SPRM aprobado para uso en humanos, utilizándose hace casi treinta años para inducir la terminación del embarazo (Chabbert-Buffet et al., 2005). Este compuesto induce la dimerización del PR, y la unión al ADN con una afinidad mayor a la que presenta la progesterona (DeMarzo et al., 1991), (Skafar, 1991). Su potencial inhibitorio se relaciona con la capacidad de reclutar correpresores transcripcionales al complejo de iniciación de la transcripción de los genes blanco (Jackson et al., 1997). Se ha descripto que a concentraciones bajas, la MFP puede presentar efectos agonistas a través de mecanismos no genómicos (Bottino y Lanari, 2010). Además, presenta efectos antiglucocorticoides a concentraciones mayores a las necesarias para ejercer actividad antiprogestágena (Gaillard et al., 1984).

Hasta el momento, la utilidad de la MFP en el tratamiento del cáncer de mama fue evaluada en pacientes con estadios avanzados de cáncer mama, muchos de ellos con tumores resistentes a terapias previas como hormonoterapia o quimioterapia (Romieu et al., 1987), (Klijn et al., 1989), (Perrault et al., 1996). En este contexto la respuesta obtenida fue parcial, con pocos efectos adversos, relacionados principalmente con la activación del eje hipofisiario-adrenal debido a la actividad antiglucocorticoide de la MFP (Klijn et al., 2000). Actualmente se encuentra abierto un ensayo clínico en el que se está evaluando a la MFP como terapia neoadyuvante en pacientes con estadios tempranos de cáncer de mama (ClinicalTrials.gov, Identificación: NCT01138553).

Otros compuestos ensayados fueron onapristona y lonaprisan. Onapristona fue evaluado como droga de primera línea en pacientes con tumores locales avanzados. El reclutamiento de pacientes para el ensayo con onapristona fue interrumpido debido a que los pacientes presentaron anormalidades hepáticas (Robertson et al., 1999). Este compuesto fue recientemente adquirido por Arno Therapeutics, Flemington, NJ, y será desarrollado para el tratamiento del cáncer de

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mama y endometrio. Lonaprisan fue evaluado como terapia de segunda línea, pero el ensayo fue interrumpido debido a resultados negativos (Jonat et al., 2013).

Es importante señalar que los resultados presentados anteriormente derivan de ensayos realizados en pacientes con tumores mamarios en estado avanzado y que ya han fracasado a una terapia endocrina. Sería interesante determinar la efectividad de la terapia con antiprogestágenos en etapas tempranas de la enfermedad. Además, el desarrollo de nuevos antiprogestágenos con menores efectos colaterales posibilitaría la utilización de estos agentes en el tratamiento del cáncer de mama.

LA VÍA PI3K/Akt EN EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER DE MAMA

La vía de señalización de la fosfoinositol 3-quinasa (PI3K)/Akt regula numerosos procesos celulares, incluyendo la supervivencia, el metabolismo, la motilidad, etc. Asimismo, es una de las vías más frecuentemente desreguladas en cáncer humano (Cantley et al., 2002), (Samuels et al., 2005), (Liu et al., 2011).

Las PI3Ks son una familia de enzimas cuya función principal es fosforilar el grupo hidroxilo ubicado en la posición 3’ de los fosfatidilinositoles. Las PI3Ks se agrupan dentro de tres clases (I a III) de acuerdo a su estructura y a su preferencia por el sustrato. La clase IA está frecuentemente desregulada en cáncer. Las quinasas que pertenecen a esta categoría son heterodímeros compuestos por una subunidad regulatoria (denominada p85) y una subunidad catalítica (p110). Las PI3Ks tipo IA son activadas por receptores de factores de crecimiento de tipo tirosina-quinasa (RTK), y por receptores asociados a proteína G. Los RTK incluyen a miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), al receptor de insulina y al receptor del factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1R), entre otros. Una vez que el receptor se encuentra activado, interactúa directamente con la subunidad p85, liberando a la subunidad p110 de su efecto inhibitorio. Como consecuencia de esto, la PI3K se activa. De manera alternativa, una molécula adaptadora puede actuar de intermediaria entre el RTK y p85, tal como ocurre con el sustrato del receptor de insulina 1 (IRS-1) downstream del IGF-1R. Una vez activa, PI3K cataliza la fosforilación del fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PI (4, 5) P2) a fosfatidilinositol-3, 4, 5-trifosfato (PI (3, 4, 5) P3). Este último compuesto actúa como sitio de anclaje para proteínas que contienen dominios de homología a plecstrina (PH) como Akt y PDK1. Una vez que ambas proteínas están localizadas en la membrana celular, Akt es fosforilada por PDK1 en la treonina 308 (Fig. 4).

En su forma activa, Akt (que posee tres isoformas Akt 1, 2 y 3) estimula la síntesis de proteínas fosforilando al complejo tuberous sclerosis 2 (TSC2), lo cual en última instancia conduce a la activación del complejo mammalian target of rapamacyn (mTOR)/Raptor (TORC1). El

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complejo TORC1 fosforila a diversas proteínas, regulando la síntesis proteica y el crecimiento celular (Dowling et al., 2010). Una de las proteínas fosforiladas por TORC1 es la quinasa S6K, encargada de fosforilar a su vez a la proteína S6 en alguno de sus múltiples residuos serina (Meyuhas O, 2008). Por otro lado, mTOR también se asocia a Rictor, para formar el complejo TORC2, el cual fosforila a Akt en la serina 473. Asimismo Akt estimula el metabolismo celular regulando la glicógeno sintasa quinasa GSK, y estimula la proliferación celular (induciendo la transición G1-S) por medio de la inactivación de inhibidores del ciclo celular como p27Kip1 y p21, regulando a las proteínas ciclina D1 y c-Myc (Xu et al., 2009), y a los factores de transcripción FOXO (Brunet et al., 1999). La vía PI3K/Akt también juega un papel crítico en la regulación de la supervivencia celular a través de la inhibición de genes proapoptóticos como Fas ligando, Bim y BAD y la degradación de la proteína p53, entre otros.

Figura 4: Señalización a través de la vía PI3K/Akt. La vía PI3K/Akt regula procesos celulares claves, entre los que se encuentran el crecimiento celular, la supervivencia, la proliferación y el metabolismo. Las estrellas señalan componentes de

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la vía frecuentemente mutadas. Las fechas en rojo señalan puntos modulados farmacológicamente. Adaptado de Miller et al, 2011.

El sistema se regula principalmente a través de PTEN, una fosfatasa considerada supresor

tumoral que actua desfosforilando al PI (3, 4, 5) P3 formando PI (4, 5) P2. Otro mecanismo de control es el feedback negativo que ejerce S6K sobre ciertos activadores de PI3K como el IRS-1. La activación de la quinasa S6K por TORC1 lleva en ciertas condiciones, a la fosforilación del IRS-1 en residuos serina, promoviendo su degradación y por lo tanto la inactivación de PI3K (Shah y Hunter, 2006).

Los inhibidores de la vía PI3K/Akt más ampliamente estudiados son wortmanin y LY294002. Wortmanin es un metabolito fúngico aislado de penicillium wortmanni en 1957 (Powis et al., 1994), (Cleary y Shapiro, 2010). LY294002 (aproximadamente 500 veces menos potente que wortmanin), producido por primera vez hace alrededor de 25 años, es un compuestos sintético derivado de la quercetina, un inhibidor de quinasas de alto espectro (Stein, 2001). Ambas drogas, que tienen como blanco el dominio de unión de ATP de la PI3K, inhiben el crecimiento de numerosas líneas celulares tumorales, especialmente en un contexto de exceso de actividad de PI3K. Sin embargo, ninguna de ellas llegó a la instancia de ensayo clínico. Wortmanin posee una baja estabilidad y presenta una alta toxicidad en modelos animales, aun cuando es administrada a bajas dosis. Si bien LY294002 comparte las mismas características de selectividad que wortmanin y presenta una estabilidad superior, es muy poco soluble (Marone et al., 2008).

La vía PI3K/Akt se encuentra frecuentemente sobreactivada en cáncer de mama. Cerca del 70% de los tumores mamarios presentan mutaciones en algún componente de la vía (López-Knowles et al., 2010). La mayoría de estas mutaciones se encuentran en el gen PIK3CA, que codifica para la subunidad catalítica p110α. Como resultado de dichas mutaciones la actividad enzimática de PI3K se ve incrementada (Zhao et al., 2008). Actualmente, se encuentran en desarrollo clínico para el tratamiento de leucemias, linfomas y diversos tumores sólidos, drogas que atacan distintos niveles de la vía PI3K/Akt (esto es PI3K, Akt o mTOR). El primer grupo de drogas está formado por compuestos que mimetizan la estructura del ATP, y que se unen competitiva e irreversiblemente a la subunidad p110α de la PI3K. Algunos de estos compuestos también presentan actividad contra mTOR. Un segundo grupo de compuestos incluye a inhibidores alostéricos de las tres isoformas de Akt. Muchos de estos inhibidores han demostrado actividad antitumoral en modelos preclínicos, entre ellos el GSK690693, y otros como el MK-2206 han sido analizados en ensayos clínicos con humanos (Pal et al., 2010). La última clase de inhibidores tiene como blanco a mTOR. Los inhibidores de mTOR mas extensamente estudiados

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son la rapamicina y sus análogos, que inhiben la actividad quinasa de TORC1 pero no de TORC2 (Dowling et al., 2010). En la actualidad además, han sido ensayados en modelos preclínicos y clínicos, inhibidores de mTOR puros, con actividad dual TORC1 y TORC2 (Bhagwat et al., 2011), (Mita et al., 2003).

Asimismo, numerosos trabajos han asociado a la sobreactivación de la vía PI3K/Akt con el desarrollo de resistencia endocrina en cáncer de mama. Estos hallazgos llevaron a evaluar el efecto de la administración de inhibidores de la vía PI3K/Akt en combinación con agentes endócrinos. Se ha demostrado por ejemplo, que la combinación de everolimus (un inhibidor de TORC1) con letrozole como terapia neoadyuvante, incrementa la respuesta tumoral en pacientes postmenopáusicas, en estadios tempranos de cáncer de mama (Baselga et al., 2009). Se ha demostrado también que en pacientes con tumores metastásicos resistentes a los AIs letrozole y anastrazole, la combinación everolimus-examestano incrementa el tiempo libre de progresión, en comparación al examestano como terapia única (Yardley et al., 2013). Recientemente, la terapia combinada everolimus-examestano fue aprobada para el uso en este tipo de pacientes. Un estudio posterior, incluso sostiene que dicha terapia podría resultar beneficiosa como tratamiento de primera línea (Beck et al., 2013).

Si bien se obtuvieron resultados satisfactorios, en algunos casos la inhibición de TORC1 está asociada a la supresión del feedback negativo que ejerce S6K sobre PI3K, induciendo de esta manera la sobreactivación de misma (O’Reilly et al., 2006). En este sentido, inhibidores de PI3K podrían resultar más efectivos. En línea con esto, se ha demostrado en pacientes con cáncer de mama avanzado que han progresado al tratamiento con AIs, que la combinación de letrozole con el inhibidor de PI3K BKM120 se vio asociada a un beneficio clínico de aproximadamente 30% (incluyendo pacientes con respuestas completas, parciales o enfermedad estable) (Mayer et al., 2012).

En la actualidad, dos ensayos clínicos se encuentran reclutando pacientes para evaluar la combinación de BKM120 y fulvestrant en pacientes postmenopáusicas con tumores mamarios en estado avanzado cuya enfermedad ha progresado luego del tratamiento con AIs (BELLE-2, ClinicalTrials.gov, Identificación: NCT01610284), y que además recibieron inhibidores de TORC1 (BELLE-3, Identificación: NCT01633060). En estos ensayos, los pacientes son estratificados de acuerdo a su estado de activación de PI3K, para investigar la eficacia de los tratamientos planteados en la población total y en aquellos pacientes que presenten alteraciones en la vía PI3K/Akt.

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MICROAMBIENTE TUMORAL

En los tumores sólidos, las células neoplásicas coexisten con un estroma tumoral complejo, compuesto por una gran variedad de células de origen mesenquimal, entre ellas fibroblastos, células endoteliales, pericitos y células asociadas a la respuesta inmune e inflamatoria. Estas células, junto con la matriz extracelular que las rodea, componen el microambiente tumoral (Bissell y Radisky, 2001).

Los fibroblastos asociados al tumor o CAFs son el tipo celular más abundante en el estroma de diversos tumores sólidos, especialmente en los carcinomas de mama y páncreas (Kalluri y Zeisberg, 2006). Se ha descripto en estudios realizados en distintos tumores, que los CAFs constituyen una población heterogénea que se caracteriza por la expresión de marcadores de activación como α-SMA (actina de musculo liso alfa) y FSP (proteína especifica de fibroblastos). En adición a los marcadores de expresión generalizada, se ha descripto la expresión de ciertas proteínas como anhidrasa carbónica 9 en adenocarcinomas de pulmón (Nakao et al., 2009), o periostina en colangiocarcinomas (Utispan et al., 2010), entre otros. Algunos autores sostienen que la heterogeneidad en cuanto a la expresión de marcadores, podría explicarse en parte por el origen diverso que pueden tener los CAFs. Como se ha revisado en el trabajo de Haviv y colaboradores, diversos modelos tumorales indican que los CAFs se pueden originar a partir de fibroblastos residentes, de progenitores derivados de la medula ósea, o incluso de células epiteliales o endoteliales transdiferenciadas (Haviv et al., 2009).

Es importante destacar que entre los tipos celulares presentes en el estroma tumoral, los CAFs han sido estudiados activamente como blancos de señales tumorales y como productores de señales protumorigénicas. Numerosas publicaciones han permitido determinar que diversos factores producidos por las células epiteliales son capaces de estimular a los CAFs, y que los CAFs en respuesta secretan factores y citoquinas que contribuyen al crecimiento y a la progresión tumoral (Fig. 5).

Los CAFs estimulan la proliferación de las células tumorales por medio de la secreción de varios factores de crecimiento y citoquinas. Entre los factores de crecimiento más frecuentemente estudiados, se encuentran el HGF, EGF y FGF (Cirri y Chiarugi, 2011). En particular, en nuestro laboratorio se ha demostrado que el FGF-2 o bFGF secretado por el estroma tumoral, estimula el crecimiento de tumores pertenecientes al modelo de carcinomas inducidos por acetato de medroxiprogesterona (Giulianelli et al., 2008). Se ha demostrado también que las citoquinas SDF-1α (CXCL12) y la IL-6 son expresadas por los CAFs en diferentes tipos tumorales (Bhowmick et al., 2004).

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Además de las células neoplásicas, muchos otros tipos celulares son influenciados por los factores y citoquinas producidos por los CAFs. Se ha publicado por ejemplo que el factor SDF-1-α tiene la capacidad de reclutar precursores endoteliales, promoviendo de esta manera el fenómeno de angiogénesis tumoral (Goh et al., 2007). Por otro lado, las interleuquinas IL-6 e IL-1β secretadas por fibroblastos de tumores de piel, de mama y de páncreas, inducen el reclutamiento de macrófagos promoviendo de esta manera la generación de un microambiente inflamatorio (Erez et al., 2010). En línea con esto, se ha descripto que una vez que llegan al tumor, los macrófagos se diferencian a macrófagos asociados al tumor (TAMs), que secretan citoquinas como VEGF, HGF, MMP-2, IL-8 influyendo sobre las células endoteliales e incrementando el crecimiento y la metástasis de las células tumorales (Leek y Harris, 2002).

Figura 5: Interacción entre células tumorales y CAFs: Las células tumorales inducen y mantienen la activación de los CAFs, que a la vez producen una serie de factores de crecimiento y citoquinas que promueven el crecimiento y la progresión tumoral. Adaptado de Cirri et al, 2011.

Además de participar en el crecimiento tumoral, los CAFs contribuyen a la progresión de los tumores promoviendo la invasión y la metástasis de las células neoplásicas. Muchas de las

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citoquinas, quemoquinas y mediadores inflamatorios producidos por los CAFs incrementan la capacidad invasiva de las células cancerosas, entre ellas TGFβ, HGF, VEGF, FGF y SDF-1 (Karagiannis et al., 2012) Asimismo, los CAFs tienen la capacidad de remodelar la matrix extracelular, secretando diversas metaloproteinasas, catepsinas y activadores de plasminógeno (Joyce y Pollard, 2009), (De Wever et al., 2008). En algunos modelos tumorales como los carcinomas de mama y próstata, también se ha demostrado que los CAFs contribuyen al fenómeno de invasión y metástasis, induciendo la transición epitelio-mesenquimal (EMT) de las células neoplásicas (Yu et al., 2013), (Giannoni et al., 2010).

Dado el grado de influencia que ejerce el estroma sobre el crecimiento y la progresión de los tumores, es de esperar que la respuesta tumoral frente a una terapia dada se vea afectada por el mismo. De hecho, se ha demostrado que el patrón de expresión del estroma tumoral de carcinomas mamarios se asocia con resultados clínicos, actuando de esta manera como factor pronóstico (Finak et al., 2008). Por otro lado, estudios preclínicos sugieren que los CAFs podrían participar en la resistencia a terapias antiangiogénicas, a quimioterapéuticos y a inhibidores de tirosina quinasas, entre otros (Crawford et al., 2009), (Wang et al., 2009), (Castells et al., 2012). Todos estos hallazgos hicieron que el microambiente tumoral sea postulado en los últimos años como un potencial blanco terapéutico sobre el cual poder actuar para acelerar la respuesta antitumoral o incluso prevenir la resistencia a la terapia.

MODELO DE CARCINOMAS MAMARIOS MURINOS INDUCIDOS POR LA ADMINISTRACIÓN DE ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA (MPA)

El laboratorio de Carcinogénesis Hormonal (IBYME) ha desarrollado hace varios años un modelo experimental de adenocarcinomas mamarios murinos por administración prolongada del progestágeno sintético MPA, a ratones hembra BALB/c.

Los tumores generados presentaron una incidencia actuarial del 76% y una latencia media de 52 semanas (Lanari et al., 1986), (Lanari et al., 2009). Los carcinomas mamarios son en su mayoría de histología ductal y tienen la capacidad de dar metástasis en pulmón y nódulos linfáticos (Lanari et al., 1989). Poseen inicialmente, un comportamiento progestágeno-dependiente u hormono-dependiente (HD) con altos niveles de expresión de receptores de estrógenos (ERα y ERβ) (Soldati et al., 2010) y de progesterona (PR), bajos o no detectables para prolactina y EGF (Molinolo et al., 1987) y además expresan HER-2 (Elizalde et al., 2000). De acuerdo a la clasificación molecular actual (Perou et al., 2000) se trata de carcinomas luminales, ya que

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además de expresar alto contenido de receptores hormonales expresan las citoqueratinas 8 y 18 (Giulianelli et al., 2011)

Tanto el FGF-2 (Giulianelli et al., 2008) como el TNFα (Rivas et al., 2008) estimulan el crecimiento de los tumores HD, en ausencia de MPA. El 17-β-estradiol (Kordon et al., 1991), los antiestrógenos (Lamb et al., 2003), (Giulianelli et al., 2012) y los antiprogestágenos (Simian et al., 2006) inhiben el crecimiento tumoral HD.

En presencia de progestágenos los tumores pueden ser mantenidos por pasajes singeneicos en ratones hembra vírgenes de la cepa BALB/c. Asimismo, se logró seleccionar en ratones sin MPA, variantes progestágeno-independientes u hormono-independientes (HI) que conservan altos niveles de expresión del ER y del PR (Kordon et al., 1991), (Lanari et al., 1989), (Molinolo et al., 1987) y activación de la vía PI3K/Akt (Polo et al., 2010). Los tumores HI crecen en forma similar en animales tratados con MPA, no tratados, ovariectomizados y con operación

simulada. A su vez, los tumores HI se han subdividido en respondedores (sensibles) y resistentes a la

terapia con antiprogestágenos (Helguero et al., 2003), (Wargon et al., 2009), (Vanzulli et al., 2002) y estos últimos a su vez se clasifican en resistentes constitutivos y resistentes adquiridos (Fig. 6). Los resistentes constitutivos presentan resistencia de novo, mientras que los resistentes adquiridos fueron obtenidos luego de someterlos a presión selectiva con antiprogestágenos (Helguero et al., 2003), (Wargon et al., 2009).

Figura 6: Modelo de adenocarcinomas mamarios murinos inducidos por administración prolongada de MPA en

ratones hembra BALB/c. Los tumores HI se clasifican en respondedores (sensibles) y resistentes a la terapia con antiprogestágenos (RU 486 y ZK 230211), y estos últimos a su vez se subdividen en resistentes constitutivos y resistentes adquiridos a los antiprogestágenos.

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En este modelo, el PR juega un papel esencial en el crecimiento tumoral. Los tumores de crecimiento HI respondedores al tratamiento endocrino, tienen el mismo patrón de expresión de isoformas del PR que los tumores HD. La importancia de este receptor en el crecimiento tumoral fue determinada mediante ensayos con nucleótidos antisentido para el PR (asPR). Mediante esta estrategia se redujeron los niveles de expresión del PR, causando una inhibición en la proliferación celular in vitro (Lamb et al., 1999), y una inhibición el crecimiento tumoral HI in vivo (Lamb et al., 2005).

Las variantes tumorales del modelo experimental inducido con MPA sensibles a la terapia hormonal, se caracterizan por expresar mayores niveles de la isoforma A del PR (PRA) que de la isoforma B (PRB) (Helguero et al., 2003), mientras que las variantes con resistencia constitutiva (C4-2-HI, 59-HI) y la variante con resistencia adquirida a los antiprogestágenos (C4-HIR), expresan mayores niveles de PRB que de PRA (Wargon et al., 2009). Por otra parte, la expresión del ERα es menor en los tumores resistentes que en los sensibles, mostrando cierto paralelismo con la expresión de PRA. Estos resultados, muestran que existe una correlación entre la resistencia a los antiprogestágenos, bajo nivel de PRA y mayor de PRB.

Como hemos señalado entonces, los antiprogestágenos constituyen una alternativa como tratamiento endocrino del cáncer de mama, que merece ser estudiada en profundidad.

El modelo de carcinomas mamarios inducidos con MPA es una herramienta experimental de gran utilidad para analizar mecanismos celulares y moleculares asociados al tratamiento con diversos agentes antitumorales, entre los que se encuentran los antiprogestágenos e inhibidores de la vía PI3K/Akt. Creemos además, que este modelo murino puede resultar adecuado para estudiar el efecto de la combinación de dichos agentes, posibilidad que no ha sido explorada aún en ningún modelo experimental.

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OBJETIVOS E HIPÓTESIS

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OBJETIVO GENERAL E HIPÓTESIS DE TRABAJO

El objetivo general de este trabajo de Tesis fue analizar mecanismos de regresión tumoral tempranos asociados al tratamiento endocrino con antiprogestágenos y a la inhibición de la vía PI3K/Akt, en el modelo de carcinomas mamarios inducidos con MPA. Los tumores elegidos dentro del modelo murino representan distintos estadios en la progresión de la enfermedad del cáncer de mama. Comenzamos nuestro análisis en una variante tumoral hormono-dependiente, luego analizamos tumores que han adquirido la independencia hormonal, y finalmente estudiamos tumores hormono-independientes, que además presentan resistencia al tratamiento endocrino.

Como hipótesis nos hemos planteado que los mecanismos moleculares y celulares que se desencadenan al inicio del proceso de regresión, serían particulares a cada tipo tumoral y no necesariamente dependen del tipo de terapia utilizada. Dichos mecanismos dependerán, entre otros factores, de la etiología del tumor y de la interrelación que se genera entre el estroma y el parénquima tumoral.

Nos avocamos entonces a estudiar en un modelo murino que reproduce los distintos estadios de la progresión del cáncer de mama en la mujer, cómo se inicia el proceso de regresión tumoral en respuesta a inhibidores endocrinos y a inhibidores de PI3K, ya sea como terapia única o como tratamiento combinado, y el grado de participación del estroma en la regresión de cada una de esas variantes tumorales. Los resultados obtenidos en este análisis nos permitirán dilucidar mecanismos de respuesta asociados al régimen combinado, mecanismos que en un futuro, podrán ayudar a identificar qué pacientes serían beneficiados con una terapia con antiprogestágenos e inhibidores de PI3K, y en cuáles dicha terapia seria inocua, o incluso perjudicial.

En este contexto nos planteamos los siguientes objetivos específicos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Luego de un tratamiento breve con diversos agentes terapéuticos, analizamos en cada variante tumoral del modelo los siguientes parámetros: Regulación de la proliferación y de la muerte celular en el parénquima tumoral

Participación del estroma en la regresión tumoral

Estado de activación de la vía PI3K/Akt y expresión de los receptores hormonales

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Efectividad de la administración de tratamientos combinados (antagonistas hormonales e

inhibidores de proteínas quinasas)

Modelado de la respuesta in vitro, en un sistema de cultivo tridimensional en Matrigel.

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MATERIALES Y MÉTODOS

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ENSAYOS IN VIVO

ANIMALES Se utilizaron ratones hembras BALB/c vírgenes de dos meses de edad provenientes del Bioterio de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de La Plata y criadas en el Bioterio del IBYME. Los animales fueron mantenidos con una dieta a base de alimento balanceado ad libitum, bajo condiciones controladas de luz (12 horas de luz, 12 horas de oscuridad) a una temperatura entre 20 y 23ºC. Los animales fueron manipulados según normas internacionales acordes con la Guía de Cuidados y Uso de Animales de Laboratorio (Institute of Laboratory Animal Resources, 1996), aprobadas por el Comité de Ética Institucional.

Los experimentos in vivo fueron realizados al menos por duplicado, con un mínimo de 3 ratones por grupo experimental en cada caso.

TUMORES

En este trabajo de Tesis utilizamos variantes tumorales pertenecientes al modelo de carcinomas mamarios murinos inducidos por la administración prolongada de MPA (Lanari et al., 2009). Los tumores utilizados (pertenecientes a la familia C4) varían en cuanto a su dependencia hormonal y su respuesta al tratamiento con antiestrógenos y antiprogestágenos.

Variante tumoral C4-HD: Dependiente de la administración de MPA para crecer. Responden al tratamiento hormonal con antiestrógenos y antiprogestágenos.

Variante tumoral C4-HI: Independiente del agregado de MPA para crecer. Responden al tratamiento hormonal con antiestrógenos y antiprogestágenos. De esta variante derivan los tumores C4-Hir desarrollados durante esta Tesis, que presentan menor sensibilidad al tratamiento con el antiprogestágeno MFP. Variante tumoral C4-2-HI: Independiente del agregado de MPA para crecer. Presentan resistencia constitutiva al tratamiento con antiestrógenos y antiprogestágenos.

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Cabe destacar también que mientras que la variante C4-HD presenta un numero diploide de cromosomas (2n=40), las variantes C4-HI y C4-2-HI son aneupoides (Fabris et al., 2005).

PASAJE SINGENEICO DE TUMORES

Los pasajes de las variantes tumorales se realizaron utilizando un trocar. Para ello, porciones de tumor de aproximadamente 5 mm2 se colocaron subcutáneamente en el flanco inguinal derecho de los animales. En el caso de los tumores C4-HD, los animales se inocularon con 0,1 ml (20 mg) de un depot subcutáneo de MPA (Laboratorios Craveri, Buenos Aires) simultáneamente al trasplante tumoral.

Luego de realizado el pasaje, se monitoreó el largo y el ancho de los tumores utilizando un calibre Vernier.

VALORACIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL

Al momento de comenzar con los experimentos de regresión tumoral, los tumores C4-HD, C4-HI y C4-HIr presentaron un tamaño aproximado de 50 mm2 (largo x ancho, determinado con un calibre Vernier). En el caso de los tumores C4-2-HI, el tamaño fue de 15 mm2, debido a la alta tasa de crecimiento de dichos tumores. Iniciados los tratamientos, se monitoreo el tamaño tumoral día por medio.

REMOCIÓN DEL DEPOT DE MPA

En los experimentos de regresión realizados en la variante C4-HD en algunos grupos experimentales fue necesario remover el depot subcutáneo de MPA. Para esto, los ratones fueron anestesiados con una combinación de ketamina (50mg/ml, Laboratorios Holliday Scott S.A.): xilacina (20mg/ml, Laboratorios Richmond División Veterinaria, Buenos Aires) en una proporción 5:1, aplicada por medio de una inyección intraperitoneal. Una vez inconscientes, se les realizó un corte subcutáneo ventral y se removió el depot con ayuda de tijera y pinza. Al finalizar, la incisión fue cerrada con puntos de sutura.

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TRATAMIENTOS ANTITUMORALES Mifepristona, RU 486 o MFP (Sigma Aldrich): Administrada de forma subcutánea en dosis de 12 mg/kg/día. Para inocularlo se preparó una solución madre de concentración 16,2 mg/0,4 ml de etanol absoluto, y diariamente se preparó la dilución de trabajo 1/100 en solución fisiológica, inyectándose 0,6 ml/ratón.

Citrato de tamoxifeno o TAM (Laboratorios Gador, Buenos Aires): Administrado de forma subcutánea en dosis de 5 mg/kg/día. Se preparó una solución madre de concentración 20 mg/ml de etanol absoluto, y diariamente se preparó la solución de trabajo 1/100 en solución fisiológica, inyectándose 0,5 ml/ratón.

Wortmanin o WORT (Sigma Aldrich): Administrada de forma intraperitoneal en dosis de 1 mg/kg/día. Para inocularlo se preparó una solución madre de concentración 66,6 mg/ml en dimetil sulfóxido (DMSO), y diariamente se preparó la solución de trabajo 1/100 en solución fisiológica, inyectándose 0,15 ml/ratón. Fulvestrant, ICI182780 o ICI (Faslodex): Administrada de forma de depot subcutáneo en dosis semanales de 10 mg. Se inocularon 0, 1 ml/ratón

Doxorrubicina o DOXO (Laboratorios Raffo, Buenos Aires): Administrada de forma intravenosa en dosis semanales de 4,5 mg. Se inocularon 0,1 ml/ratón.

EXTIRPACIÓN DE TUMORES

Una vez finalizados los experimentos in vivo los ratones fueron sacrificados. A continuación, los tumores se extirparon mediante un corte subcutáneo ventral, con ayuda de tijera y pinza. Las muestras destinadas a estudios de inmunofluorescencia y western blot se guardaron inmediatamente a -80ºC, y las destinadas a estudios de inmunohistoquímica se fijaron en formaldehido al 4% en PBS 1X (ver Apéndice) para ser luego incluidos en parafina según técnicas de rutina del laboratorio.

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WESTERN BLOT (WB)

Para preparar extractos proteicos totales, los tumores se pesaron y luego se agregó 4 veces su peso de buffer RIPA, junto con inhibidores de proteasas y fosfatasas al 0,1% (ver Apéndice). A continuación, los tumores se homogeneizaron con un homogeinizador (Polytron, Teckmar), de manera de obtener un homogenato que se dejó reposar en hielo durante 40 minutos. Concluida la incubación, se realizó una centrifugación a 12.000 rpm (Centrifuga 5415 R, Eppendorf), a 4ºC durante 15 minutos. Como resultado de la centrifugación se obtuvieron dos fracciones, un pellet y un sobrenadante. Este último constituyó el extracto proteico tumoral total. Los extractos fueron inmediatamente congelados a -70ºC previa determinación de la concentración proteica por el Método de Lowry (ver Apéndice). Los extractos proteicos se separaron en un gel de poliacrilamida discontinuo utilizando el sistema de buffers discontinuos de Laemmli (Laemmli et al., 1970). Previo a la separación, las proteínas se diluyeron en solución desnaturalizante (cracking buffer, ver Apéndice) y se incubaron a 100ºC durante 5 minutos. En cada gel se sembraron las muestras correspondientes (100 µg de proteína/calle) junto con un marcador de pesos moleculares conocidos. La separación se realizó durante 20 minutos a 20 mA/gel hasta que las muestras pasaran el gel concentrador, y por aproximadamente 120 minutos a 25 mA/gel, en el gel separador. Concluida la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa durante 1 hora a 100 V. A continuación, las membranas se bloquearon en solución de bloqueo (ver Apéndice), toda la noche (ON). Al terminar el bloqueo, las membranas se lavaron con TBST

(ver Apéndice) y luego se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes, a 4C, ON, en agitación. Al día siguiente el anticuerpo primario fue lavado con TBST, y se agregó el anticuerpo secundario conjugado con la enzima peroxidasa. Las bandas inmunoreactivas fueron reveladas mediante el agregado de un sustrato que genera una señal quimioluminiscente al ser modificado por la enzima peroxidasa. Para visualizar la señal, las membranas se expusieron a una placa radiográfica. Finalmente, las placas fueron escaneadas utilizando un escáner digital, y las bandas se cuantificaron utilizando el programa ImageJ.

INMUNOFLUORESCENCIA (IF)

Los tumores conservados a -80C se incluyeron en O.C.T. Compound (Tissue-Tek, Sakura), y luego se cortaron utilizando un crióstato, de manera de obtener secciones tumorales de

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18 µm de espesor. Las mismas fueron montadas en portaobjetos silanizados para aumentar la adhesión.

Los cortes histológicos se fijaron en PFA-Sacarosa al 4% en PBS 1X durante 20 minutos a temperatura ambiente y se lavaron en PBS 1X (ver Apéndice). A continuación se realizó una

permeabilización con Tritón X100 0,25% en metanol, durante 20 minutos a 4C. Luego de una serie de lavados con PBS 1X, se bloquearon durante 1 hora con SFB 10% en PBS 1X (ver Apéndice), en cámara húmeda, a temperatura ambiente. Concluido el bloqueo, las secciones tumorales se incubaron con los anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo, ON, a 4º C. A continuación los cortes fueron lavados con PBS 1X, e incubados durante 1 hora a temperatura ambiente y en oscuridad, con el anticuerpo secundario fluoresceinado (diluido en solución de bloqueo). Luego de varios lavados con el buffer salino, se contrastaron los núcleos con ioduro de propidio (IP) (1/1000 de la solución madre, ver Apéndice) durante 10 minutos, para finalmente montar los cortes con Vectashield (VECTOR) y sellar con esmalte.

Los preparados se conservaron a -20ºC y se observaron con un microscopio confocal Nikon Eclipse E800. Las fotos correspondientes fueron tomadas con el software EZ-C1 2.10. En todos los casos, al determinar la intensidad a la que se tomaron las fotografías, se restó el background ocasionado por el anticuerpo secundario. Como control de especificidad de la señal se omitió el anticuerpo primario, reemplazándolo por PBS 1X. Para cada anticuerpo se procesaron las muestras a comparar entre sí, en el mismo momento y en iguales condiciones de procedimiento.

INMUNOHISTOQUÍMICA (IHQ)

Los cortes tumorales se desparafinaron en xileno durante 30 minutos y se rehidrataron por pasajes sucesivos en soluciones de etanol/agua destilada, de concentración decreciente (etanol 100%, 96% y 70%). A continuación, se inhibió la actividad de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 10% en etanol /agua destilada al 70%, durante 20 minutos. Luego de una serie de lavados con PBS 1X (ver Apéndice) se bloqueó con SFB al 10% en PBS 1X, durante 1 hora a temperatura ambiente, en cámara húmeda. Los cortes histológicos se incubaron con los anticuerpos primarios diluidos en SFB al 10% en PBS 1X, ON, a 4ºC en cámara húmeda. Luego, se realizaron una serie de lavados en PBS 1X y se incubó con el anticuerpo secundario biotinilado diluido en solución de bloqueo, durante 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda. Finalmente, se realizaron una serie de lavados con PBS 1X y se procedió a revelar los anticuerpos. Las reacciones antígeno–anticuerpo fueron detectadas utilizando el Complejo Avidina

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Biotina (ABC kit Vectastain VECTOR) y revelando con 3-3´diaminobencidina (DAB, DAKO). Para contrastar la marca positiva, los núcleos fueron teñidos con hematoxilina (Biopur). Los cortes se deshidrataron pasándolos por alcoholes de graduación creciente, y se incubaron en xileno, para luego montarlos en medio sintético (DPX, Sigma Aldrich). Como control de especificidad de la señal se omitió el anticuerpo primario, reemplazándolo por PBS 1X.

Los cortes histológicos se observaron con un microscopio óptico Nikon Eclipse E800. Las fotos se tomaron con una máquina digital Nikon asociada a este microscopio utilizando el software ACT-2U. Para cada anticuerpo se procesaron las muestras a comparar entre sí, en el mismo momento y en iguales condiciones de procedimiento.

DETERMINACIÓN DEL AREA ESTROMAL Y NECRÓTICA EN CORTES HISTOLÓGICOS DE TUMORES

Para determinar el área ocupada por el estroma y por las zonas necróticas dentro de cada tumor, fotografiamos con un aumento de 200X, cortes histológicos correspondientes a cada uno de los tumores analizados, teñidos con hematoxilina/eosina (Fig. 7 izquierda). Las fotos fueron tomadas de manera tal que al superponerse y ensamblarse, se obtuviera una única foto representativa de la totalidad del área del corte tumoral, para cada tumor (Fig. 7 centro). El ensamblado de las fotos para cada tumor se realizó por medio del programa PanaVue Image Assembler.

A continuación, con el programa Image J se delimitó el área ocupada por el estroma y las zonas necróticas dentro de cada tumor, así como también el área total de cada corte tumoral (Fig. 7 derecha). Este programa permite además, medir el área delimitada obteniendo de esta manera un valor numérico para cada uno de los parámetros analizados. Finalmente, calculamos en cada tumor, los cocientes área estromal/área tumoral total y área necrótica/área tumoral total.

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Figura 7: Determinación del área estromal y necrótica, a partir de cortes histológicos teñidos con

hematoxilina/eosina. Para cada uno de los tumores pertenecientes a los distintos grupos experimentales, se tomaron fotos con un aumento de 200X, de modo de cubrir el área total de la sección tumoral teñida con hematoxilina/eosina (izquierda). Estas fotos fueron luego ensambladas con el programa PanaVue Image Assembler, de manera de obtener una única imagen que abarcara todo el corte tumoral (centro). A continuación, con el programa Image J se delimitó el área estromal (amarilla) y necrótica (verde) dentro de cada corte, así como también el área tumoral total.

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA

Para realizar un análisis de la expresión génica, se aisló el ARN total a partir de 2 muestras independientes por grupo experimental, incluidas en tacos de parafina. A partir de cada una de las muestras, se generaron 6 secciones tumorales de 15 µm de espesor, y se siguió el protocolo del kit RNeasy FFPE (Qiagen), de manera de obtener alrededor de 0,4 µg de ARN por muestra. A continuación, las muestras de ARN fueron marcadas e hibridizadas con el microarray comercial Gene Chip Mouse Genome 430 2.0 (Affimetrix), en el Departamento de Expresión Génica de la Clínica Mayo, Rochester Minnesota. El procesamiento, normalización y corrección de background de los datos crudos del microarray fueron analizados utilizando la función GCRMA del software GeneSpring (Agilent).

Aquellos transcriptos cuya expresión varió en más de 1,5 veces con respecto al grupo control (+MPA), fueron filtrados y analizados por ANOVA utilizando tests paramétricos (Welch t-test) y de corrección multiple (Benjamini and Hochberg False Discovery Rate).

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CUANTIFICACIÓN DE INMUNOHISTOQUÍMICA PARA CASPASA 3 ACTIVADA

Para cuantificar la marca obtenida en la inmunohistoquímica para caspasa 3 activada, se escanearon los preparados con una magnificación de 200X, utilizando el microscopio Aperio ScanScope AT (Aperio Technologies). Las imágenes digitales obtenidas, se analizaron a continuación utilizando el software ImageScope, desde la plataforma Spectrum (Aperio Technologies). Utilizando este programa se determinó la intensidad de marca positiva por corte tumoral, utilizando el algoritmo Positive Pixel Count.

ENSAYOS IN VITRO

CULTIVOS PRIMARIOS

Los cultivos primarios se realizaron utilizando tumores de un tamaño aproximado de 100 mm2. Los mismos se extirparon en esterilidad y se disgregaron, primero en forma mecánica con tijera y bisturí y luego por incubación con una solución enzimática (ver Apéndice), a 37°C durante 40 minutos. La suspensión celular obtenida está compuesta principalmente por dos poblaciones, una de estirpe epitelial y otra de estirpe fibroblástica. Para separarlas se utilizó la técnica de Pandis y colaboradores con algunas modificaciones (Pandis et al., 1992). El protocolo final se encuentra publicado en (Dran et al., 1995). Brevemente, la técnica se basa en la velocidad de sedimentación diferencial que presentan los cúmulos de células epiteliales y los fibroblastos. Las células epiteliales al disponerse en forma de agregados sedimentan más rápido que los fibroblastos aislados y permiten de esta manera, la separación de ambas poblaciones luego de varias decantaciones. Sucintamente, se colocó a la suspensión celular en un tubo de centrífuga junto con 15 ml de medio de lavado (ver Apéndice) y se centrifugó a 1000 rpm durante 10 min. Se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en medio de cultivo con 10% SFB (ver Apéndice). La suspensión se dejó sedimentar durante 20 minutos; el sedimento constituye la fracción enriquecida en cúmulos de células epiteliales y el sobrenadante la fracción fibroblástica. A la fracción enriquecida en células epiteliales se le agregó 15 ml de medio de lavado, y se resuspendió. Este procedimiento se repitió aproximadamente 12 veces, descartándose en cada una de ellas el sobrenadante. Luego de la última decantación las células fueron resuspendidas en

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medio de cultivo con 10% SFB y se sembraron en placas de cultivo o en chambers-slides, según fue requerido por los distintos experimentos (Fig. 8).

Cultivos en dos dimensiones: Los cúmulos o agregados epiteliales se sembraron en placas de cultivo y se dejaron adherir durante 48 horas en medio de cultivo con 10% SFB. Cada 48 horas se reemplazó por medio fresco hasta alcanzar confluencia. Cultivos en tres dimensiones: Los cúmulos o agregados epiteliales se sembraron en chambers-slides de 8 hoyos (LabTek, NUNC), con un coating previo de Matrigel (BD Biosciences, ver Apéndice). Los cúmulos se dejaron adherir durante 48 horas en medio de cultivo con 10% SFB.

La fracción fibroblástica fue sembrada en placas de cultivo de 6 hoyos, y se incubó en

estufa de cultivo durante 90 minutos, de forma de permitir la adhesión de los fibroblastos a la superficie de la placa. Cabe destacar que las células epiteliales, en general, no son capaces de adherirse a la placa en ese corto tiempo. A continuación, se retiró el medio de cultivo y se realizaron 3 lavados con PBS 1X con el objeto de descartar las células que no se hubieran pegado al plástico, es decir, células epiteliales aisladas, células endoteliales y células inmunes. Finalmente, se agregó medio de cultivo fresco con 10% de SFB, y se incubó hasta alcanzar la confluencia. Los cambios de medio se realizaron cada 48 horas, reemplazándolo por medio fresco con 10% SFB.

Figura 8: Protocolo de cultivo utilizado para separar las poblaciones tumorales epitelial y fibroblástica. En la figura se resumen los pasos a seguir para obtener las poblaciones epitelial y fibroblástica puras.

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TRATAMIENTOS

Para los análisis in vitro, se utilizaron una serie de drogas, que fueron diluidas en medio de cultivo con 2% SFB charcolizado (SFBch) (ver Apéndice), y se añadieron a la placa durante 48 horas. Antes de comenzar los distintos tratamientos las células fueron ayunadas durante 24 horas con medio de cultivo con 2% SFBch, excepto en el caso de los cultivos C4-HD que no fueron ayunados previamente para preservar su viabilidad al ser tratadas posteriormente con los inhibidores. MFP (Sigma Aldrich): Se obtuvo una concentración final de 10 nM a partir de una solución madre de 10 µM preparada en etanol absoluto. 4-hidroxitamoxifeno o TAM (Sigma Aldrich): Se obtuvo una concentración final de 1 μM, a partir de una solución madre 1mM preparada en etanol absoluto. WORT (Sigma Aldrich): Se obtuvo una concentración final de1 μM, a partir de una solución madre 1 mM preparada en DMSO.

TINCIÓN CON NARANJA DE ACRIDINA-BROMURO DE ETIDIO (NA-BE)

Para realizar esta tinción, luego de realizados los tratamientos lavamos los cúmulos celulares con PBS 1X, y a continuación los incubamos con una solución de naranja de acridina (4µg/ml) y bromuro de etidio (4µg/ml) en PBS 1X durante 1 minuto. Inmediatamente después, observamos los cúmulos en fresco (sin fijar) con un microscopio confocal Nikon Eclipse E800. Las fotos correspondientes fueron tomadas con el software EZ-C1 2.10.

El protocolo de NA-BE emplea la tinción diferencial con los colorantes fluorescentes, para determinar células viables y no viables en una dada población. La NA se intercala en el ADN dando una apariencia verde. El BE es captado sólo por las células no viables. Este colorante también se intercala en el ADN, dándole apariencia naranja. Por lo tanto una célula muerta tendrá núcleo naranja-rojo brillante, mientras que una célula viable aparecerá de color verde.

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INMUNOFLUORESCENCIA DE CULTIVOS TRIDIMENSIONALES

Concluidos los distintos tratamientos, los cúmulos celulares fueron lavados con PBS 1X, y fijados en PFA-Sacarosa al 4% en PBS 1X, durante 20 minutos. A continuación se realizó una serie de lavados con PBS 1X, y se permeabilizó con Tritón X100 al 0,5% en PBS 1X durante 20 minutos. Luego de la permeabilización, se realizó un bloqueo con 10% SFB en PBS 1X durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubó con los anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo, ON a 4ºC. Concluida la incubación con el anticuerpo primario, se lavó con PBS 1X y se incubó durante 1 hora con el anticuerpo secundario fluoresceinado diluido en solución de bloqueo. Luego de varios lavados con el buffer salino, se contrastaron los núcleos con IP (1/1000 de la solución madre, ver Apéndice) durante 10 minutos, para finalmente montar los cortes con Vectashield (VECTOR) y sellar con esmalte.

Los preparados se conservaron a -20ºC y se analizaron con un microscopio confocal Nikon Eclipse E800. Las fotos correspondientes fueron tomadas con el software EZ-C1 2.10. En todos los casos, al determinar la intensidad a la que se tomaron las fotografías, se restó el background ocasionado por el anticuerpo secundario. Como control de especificidad de la señal se omitió el anticuerpo primario, reemplazándolo por PBS 1X. Para cada anticuerpo se procesaron las muestras a comparar entre sí, en el mismo momento y en iguales condiciones de procedimiento.

ENSAYO DE PROLIFERACIÓN DE FIBROBLASTOS: IF PARA Ki67

Los cultivos enriquecidos en fibroblastos se repicaron en chamber-slides de 8 hoyos (LabTek, NUNC) y se incubaron durante 24 horas en medio de cultivo con 10% SFB, para permitir la adhesión. Antes de comenzar los distintos tratamientos las células fueron ayunadas durante 24 horas con medio de cultivo con 2% SFBch.

Las drogas ensayadas se diluyeron en medio de cultivo con 2% SFBch, y se añadieron a la placa durante 48 horas. Finalizada la incubación, las células se fijaron con PFA-Sacarosa 4% en PBS 1X, durante 20 minutos. A continuación se procedió como se indicó anteriormente para la IF en cultivos tridimensionales.

Los preparados se conservaron a -20ºC y se observaron con un microscopio confocal Nikon Eclipse E800. Las fotos correspondientes fueron tomadas con el software EZ-C1 2.10. En todos los casos, al determinar la intensidad a la que se tomaron las fotografías, se restó el background ocasionado por el anticuerpo secundario. Como control de especificidad de la señal se omitió el anticuerpo primario, reemplazándolo por PBS 1X. Para cada anticuerpo se procesaron

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las muestras a comparar entre sí, en el mismo momento y en iguales condiciones de procedimiento.

ENSAYO DE PROLIFERACIÓN DE FIBROBLASTOS: INCORPORACIÓN DE TIMIDINA TRITIADA

Los cultivos enriquecidos en fibroblastos se repicaron en placas de 96 hoyos (sembrando 2.000 células por hoyo) y se incubaron durante 24 horas en medio de cultivo con 10% SFB, para permitir la adhesión. Antes de comenzar con los distintos tratamientos, las células fueron ayunadas durante 24 horas con medio de cultivo con 2% SFBch.

Las drogas ensayadas se diluyeron en medio de cultivo con 2% SFB ch, y se añadieron a la placa. Se realizaron octuplicados para cada grupo experimental. Luego de 24 horas, se renovó el medio con los distintos tratamientos, y se aplicó un pulso de 0,4 µCi de 3H-timidina (NEN, actividad específica 20 Ci/mmol) en cada hoyo. Concluidas las 48 horas de incubación con las drogas y la timidina, las células fueron tripsinizadas y se cosecharon en un cosechador para células. La radioactividad incorporada se midió en un contador de centelleo liquido beta, durante 2 minutos.

MEDIO CONDICIONADO DE CULTIVOS PRIMARIOS EPITELIALES C4-HD

Cultivos primarios C4-HD fueron repicados en placas de 6 hoyos, e incubados por 48 horas en medio de cultivo con 10% de SFB. Una vez confluentes, las células fueron ayunadas durante 24 horas con medio de cultivo con 2% SFBch. A continuación, este medio fue retirado y se agregó medio de cultivo con 2% SFBch por 48 horas. Al cabo de las 48 horas el medio fue recolectado, centrifugado a 1.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se conservó a -20 ºC.

ANTICUERPOS UTILIZADOS

Anticuerpos 1º Característica Dilución

pSer473Akt Monoclonal, Cell Signalling #4060 1/1000

pSer240/244S6 Policlonal, Cell Signalling, # 2215 1/1000

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Akt1/2/3 total Policlonal, Santa Cruz H-136, sc-8312 1/500

S6 total Monoclonal, Cell Signalling, #2217 1/1000

PR Policlonal, Santa Cruz H-190, sc-7208 1/500 (WB), 1/100 (IHQ)

ER Policlonal, Santa Cruz MC-20, sc-542 1/100

ERK1/2 Policlonal, Santa Cruz K-23, sc-94 1/1000

Laminina 1 Policlonal, Ly Laboratories 1/100

E-Cadherina Monoclonal , Cell Signalling, #3195 1/1000

MUC-1 Monoclonal, Abcam, ab- 45167 1/100

Integrina β1 Policlonal, Santa Cruz M-106, sc-8978 1/100

Integrina α6 Policlonal, Abcam, ab-19765 1/100

Ki67 Policlonal, Abcam, ab- 15580 1/500 (IHQ), 1/100 (IF)

Caspasa 3 activada Policlonal, Abcam, ab- 2302 1/100

Bax Policlonal, Santa Cruz P-19, sc-526 1/100

Bcl-Xl Policlonal, Santa Cruz S-18, sc-634 1/100

Aif Policlonal, Santa Cruz H-300, sc-5586 1/100

Colágeno 1 Monoclonal, Abcam , ab-6308 1/500

FGF-2 Policlonal, Santa Cruz 147, sc-79 1/200

MMP-9 Policlonal, Cell Signalling, #3852 1/100

Cilclina D1 Policlonal, Santa Cruz H-295, sc-753 1/100 (IHQ), 1/500 (WB)

c-MYC Policlonal, Santa Cruz N-262, sc-764 1/100 (IHQ), 1/500 (WB)

α-SMA Policlonal, Abcam, ab-5694 1/100

CD31 Monoclonal, BD Pharmigen, #550274 1/250

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Las diferencias entre medias de múltiples tratamientos se evaluaron con una prueba ANOVA de una vía. Las medias de cada grupo se compararon entre sí mediante el test de Tukey y

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con el grupo control con el test de Dunnet. Las diferencias entre medias de dos tratamientos se evaluaron con una prueba “t” de Student, utilizando el programa GraphPad Prism (versión 5.0 para Windows, GraphPad Software Inc.). En las curvas de regresión tumoral se calcularon las pendientes de las mismas y se analizó si diferían significativamente entre sí, con el programa GraphPad Prism (versión 5.0 para Windows, GraphPad Software Inc.).

Cada experimento se repitió al menos dos veces, con un tamaño de muestra mínimo de 3 en cada réplica. En las figuras se muestra un experimento representativo.

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RESULTADOS

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CAPÍTULO I

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CAPITULO I: TUMOR HORMONO-DEPENDIENTE C4-HD

I.A. ANTECEDENTES

El tumor C4-HD es un carcinoma mamario de tipo luminal (ER/PR positivos) compuesto por grupos cohesivos de células epiteliales de tipo glandular, rodeadas por escaso estroma fibroblástico (Fig. I.1). Como se mencionó en la Introducción, estos tumores requieren de la administración exógena de MPA para crecer. Una vez establecidos, la remoción del MPA lleva a una regresión parcial, es decir que los tumores disminuyen su tamaño pero no desaparecen. Cuando además de remover el MPA se adiciona un tratamiento hormonal como el antiprogestágeno MFP o el 17-β-estradiol, los tumores regresionan completamente (Simian et al., 2006), (Lamb et al., 2003).

Figura I.1: Regresión en la variante tumoral C4-HD. Izquierda: Hematoxilina/eosina de un corte histológico del tumor C4-HD en donde se observan los grupos cohesivos de células epiteliales, rodeados por el estroma predominantemente fibroblástico. Barra: 100 μm. Derecha: Curva de crecimiento tumoral de la variante C4-HD. En presencia de MPA los tumores crecen alcanzando un tamaño aproximado de 100m2 al cabo de 20 días. La remoción del MPA (flecha negra) acompañada o no de la aplicación de un tratamiento hormonal, lleva a la regresión completa o parcial, según corresponda, en aproximadamente 15 días. En este grafico se nombra al antiprogestágeno MFP como RU 486 y al 17-β-estradiol como E2. Extraído de Simian et al, 2006.

Como describieron Simian y colaboradores (Simian et al., 2006), durante las primeras 72 horas de tratamiento con MFP o 17-β-estradiol se observa una fuerte remodelación de la arquitectura tumoral. Mientras que el compartimiento epitelial desaparece progresivamente, el compartimiento estromal se expande. La caracterización de los tumores en regresión demostró principalmente una disminución en el índice mitótico del tejido epitelial tumoral así como también un aumento en la apoptosis. Dichos fenómenos se ven acompañados por una fuerte actividad

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proteolítica, mediada por las metaloproteinasas 9 y 2 (MMP-9 y MMP-2), y por la invasión de un estroma de tipo fibroblástico, rico en proteínas de matriz como colágeno IV, y laminina.

En relación a la respuesta a diferentes terapias, trabajos realizados en el laboratorio han permitido determinar que en adición a la MFP y al 17-β-estradiol, los tumores pertenecientes a la variante C4-HD responden al tratamiento con los antiestrógenos TAM, raloxifeno (Lamb et al., 2003) y fulvestrant (Giulianelli et al., 2012). Asimismo, hemos demostrado que el crecimiento de la variante tumoral C4-HD no se ve afectado por el tratamiento prolongado con el inhibidor de la quinasa PI3K, LY294002, ni con el inhibidor de la vía MAPK/ERK1/2 PD98059 (Polo et al., 2010).

El objetivo general de esta parte del trabajo fue caracterizar los eventos celulares tempranos relacionados con la respuesta a diferentes terapias, analizando para ello el parénquima y el estroma tumoral. A lo largo de este capítulo analizaremos fenómenos celulares y moleculares asociados al tratamiento con agentes endocrinos dirigidos a bloquear la señalización a través de los receptores ER y PR, y a la inhibición de la vía PI3K/Akt. I.B. REGRESIÓN TUMORAL TEMPRANA EN LA VARIANTE C4-HD LUEGO DEL TRATAMIENTO CON DIVERSOS AGENTES ENDOCRINOS

En primer lugar nos propusimos caracterizar y comparar mecanismos celulares asociados a la regresión tumoral C4-HD, en respuesta al tratamiento breve con diversos agentes endocrinos. Para ello trabajamos con el antiprogestágeno MFP y dos antiestrógenos utilizados ampliamente en la clínica, TAM e ICI. Como se mencionó anteriormente analizando la respuesta a la MFP y 17-β-estradiol (Simian et al., 2006), los fenómenos de regresión se manifiestan dentro de las primeras horas de comenzados los tratamientos hormonales, por ello decidimos que la duración de los tratamientos se extienda hasta las 48 horas.

Para realizar este experimento se utilizaron hembras vírgenes BALB/c portadoras de tumores C4-HD de un tamaño aproximado de 50 mm2. Un grupo de estos ratones fue sometido a una intervención quirúrgica para remover el depot de MPA que sostuvo el crecimiento tumoral hasta el momento de iniciado el experimento. Dentro de este grupo, además, algunos ratones fueron tratados durante 48 horas con MFP, TAM o ICI (Fig. I.2). Otro grupo de ratones fue sometido a la intervención, pero se les conservó el depot de MPA (operación simulada), y constituye el control del experimento. Finalizados los tratamientos, los ratones fueron sacrificados y los tumores se conservaron en formaldehido al 4% o a -80˚C.

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Figura I.2: Diseño experimental. El experimento fue realizado con tumores C4-HD de un tamaño aproximado de 50 mm2. El grupo control está compuesto por ratones portadores de tumores C4-HD sometidos a una intervención quirúrgica simulada de remoción del depot subcutáneo de MPA, por lo cual mantienen la presencia de MPA. En el grupo –MPA, se removió el depot subcutáneo de MPA durante la intervención quirúrgica. Los grupos ICI, TAM, y MFP están compuestos por ratones a los que se les removió el depot de MPA y además se les administró ICI182780 (5 mg), tamoxifeno (10 mg/kg/día) o MFP (12 mg/kg/día) respectivamente durante 48 horas. Todas las drogas se aplicaron mediante una inyección subcutánea al momento de iniciar el experimento (0 horas). La administración de TAM y MFP se repitió a las 24 y 47 horas, sacrificando los animales una hora luego de la última inyección.

Considerando que el tamaño inicial de todos los grupos era de aproximadamente 50 mm2, comprobamos que al cabo de 48 horas de tratamiento los tumores del grupo control (+MPA) crecieron, mientras que en el resto de los grupos experimentales el crecimiento tumoral se detuvo. En particular, los tumores tratados con MFP disminuyeron drásticamente su tamaño (Fig. I.3). Por ende, fue posible evidenciar una diferencia en la sensibilidad frente al tratamiento con antagonistas hormonales luego de un período breve de exposición a los mismos. Comparando el efecto ejercido por cada uno de las drogas administradas, el tratamiento con el antiprogestágeno MFP resultó ser el agente más eficaz en interferir con el crecimiento de la variante C4-HD y en inducir la regresión temprana de estos tumores.

Figura I.3: Tamaño tumoral final en función de los distintos tratamientos

endocrinos. Teniendo en cuenta que se partió de un tamaño tumoral inicial de 50 mm2, luego de 48 horas de tratamiento, los tumores del grupo control (+MPA) aumentaron su tamaño, mientras que en el resto de los grupos experimentales el crecimiento tumoral se detuvo. En el caso de la MFP, el tamaño tumoral se redujo significativamente. n=4 para cada grupo experimental. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Tukey, * p<0,05; *** p<0,001 con respecto a los valores +MPA (control).

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Con el objetivo de verificar que los antagonistas utilizados en el experimento funcionaron

correctamente, analizamos la expresión del ER, en particular la isoforma alfa (ERα), y del PR (las isoformas PRA y PRB) por inmunohistoquímica, a partir de cortes histológicos de tumores pertenecientes a cada grupo experimental. Como fue descripto con anterioridad en el laboratorio, la exposición continua al MPA regula negativamente la expresión de las isoformas A y B del PR. Al discontinuar el suministro de la hormona, se produce un aumento en la expresión de ambas isoformas tanto por inmunohistoquímica como por western blot (Giulianelli et al., 2012). Por otro lado, se ha descripto en otros modelos murinos de cáncer de mama, que la regresión tumoral inducida con MFP se encuentra asociada a una disminución en los niveles de PR (Bakker et al., 1989). En cuanto al ER, se ha comprobado que la administración de TAM regula positivamente la expresión de la isoforma ERα (Noguchi et al., 1993), (Horner-Glister et al., 2005), mientras que el ICI lleva a la degradación del receptor por medio de la vía ubiquitina-proteasoma (Osborne et al., 2004).

Como se observa en la Fig. I.4, y tal como se mencionó en la Introducción, la variante C4-HD presenta abundante expresión de receptores hormonales ER y PR. Ambos receptores se expresan en un alto porcentaje de células tumorales, y presentan localización nuclear. Al analizar la intensidad de la marca obtenida para el ERα observamos que, tal como se describe en la literatura, el tratamiento con ICI provocó una disminución en la expresión del receptor. Por el contrario, el tratamiento con TAM la aumentó.

Con respecto al PR, observamos un aumento en el número de células PR positivas al remover el depot de MPA, y una disminución luego del tratamiento con los antagonistas del ER. Cabe señalar que dado que la regresión tumoral inducida con MFP fue tan drástica, prácticamente no quedó epitelio tumoral remanente sobre el cual analizar la expresión de los receptores hormonales en este grupo experimental.

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Figura I.4: Expresión de los receptores hormonales (ER y PR) en los tumores C4-HD sometidos a los distintos

tratamientos endocrinos. Imágenes representativas de cortes histológicos pertenecientes a los distintos grupos experimentales analizados por inmunohistoquímica para los receptores hormonales ER y PR. Los anticuerpos utilizados reconocen específicamente la isoforma alfa del ER (ERα) y las isoformas A y B del PR. En azul se observan los núcleos celulares, contrateñidos con hematoxilina. Barra 100 μm.

Luego de verificar que las drogas hubieran actuado sobre sus blancos específicos, analizamos la histología de los tumores pertenecientes a cada grupo experimental por medio de la observación de cortes teñidos con hematoxilina/eosina. La tinción de hematoxilina/eosina es uno de los métodos más utilizados en el diagnóstico histológico. En la misma, los núcleos celulares se tiñen fuertemente de azul, mientras que los citoplasmas se colorean de rosa (Fischer et al., 2008). Como se observa en las Fig. I.4 y I.5, los tratamientos utilizados no solo afectaron diferencialmente el tamaño alcanzado por los tumores C4-HD, sino también el grado de remodelación tisular de los mismos. Luego de 48 horas de iniciado el experimento, todos los tratamientos (exceptuando al grupo -MPA) produjeron una disminución del área tumoral epitelial, y la expansión del estroma. Sin embargo, la remodelación tisular observada en el caso de la MFP fue significativamente mayor en comparación al efecto logrado luego de la administración de los antagonistas del ER. En el caso de la MFP, tal como se mencionó en el análisis de los receptores hormonales por inmunohistoquímica (Fig. I.4), el epitelio tumoral se necrosó completamente.

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Figura I.5: Histología de los tumores C4-HD sometidos a los distintos tratamientos endócrinos. Imágenes representativas de cortes histológicos de los tumores de cada grupo experimental, teñidos con hematoxilina/eosina (H/E). En las imágenes se distinguen dos compartimientos; el parénquima tumoral (flecha) compuesto por las células epiteliales, y el estroma tumoral (punta de flecha), formado principalmente por fibroblastos. Barra 100 μm.

Para caracterizar los eventos tempranos que llevan a la regresión de la variante tumoral C4-HD decidimos evaluar distintos parámetros relacionados con la supervivencia y la muerte celular. En primer lugar determinamos el porcentaje de células mitóticas en el epitelio tumoral de cada grupo experimental. Validamos estos resultados además, mediante inmunohistoquímica para un marcador de proliferación extensamente utilizado en el diagnóstico clínico, Ki67 (Urruticoechea et al., 2005). En primer lugar, y como se observa en la Fig. I.6 A y B, se obtuvo una buena correlación entre el número de células proliferativas por conteo de mitosis y por análisis del marcador Ki67. Al igual que lo descripto en trabajos previos del laboratorio (Giulianelli et al., 2012), el análisis de dicho parámetro evidenció que el número de células epiteliales que se encuentran

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en proceso de división disminuyó significativamente al remover el MPA. Este efecto se profundiza luego de los tratamientos endócrinos ICI, TAM y MFP (Fig. I.6).

Es interesante destacar que en las imágenes correspondientes a la inmunohistoquímica para el marcador Ki67 se observa que en los tumores que fueron tratados (inclusive en los que solamente se removió el depot de MPA), las células epiteliales Ki67 positivas se encuentran próximas al estroma tumoral. En el caso de los tumores sometidos a las terapias endocrinas, especialmente luego del tratamiento con la MFP, se ve además una gran proporción de fibroblastos Ki67 positivos en el estroma periférico que ingresa al tumor (Fig.I.6. D). Esta observación, sumada a la ausencia de marca para Ki67 en el estroma del interior del tumor en regresión, sugiere que el aumento en la proporción de estroma tumoral seria resultado de la proliferación y la migración de un estroma periférico proveniente, por ejemplo, de la medula ósea.

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Figura I.6: Proliferación celular en los tumores C4-HD sometidos a los distintos tratamientos hormonales. A: Índice mitótico expresado como la media ± SEM de la proporción de células mitóticas/células totales en el parénquima de los tumores de cada grupo experimental. La proporción de células mitóticas/células totales en cada tumor es la media del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). B: Índice Ki67 expresado como la media ±SEM de la proporción de células Ki67 positivas (determinadas por inmunohistoquímica)/células totales en el parénquima tumoral de cada grupo experimental. Dicha proporción es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x) en cada uno de los tumores de los distintos grupos experimentales. n=4 para cada grupo experimental. C: Imágenes representativas de cortes histológicos de cada grupo experimental, analizados por inmunohistoquímica para Ki67. Los núcleos celulares fueron contrateñidos de azul con hematoxilina. D: Detalle de la marca para Ki67 en el centro y en la periferia de los grupos +MPA y MFP. Las puntas de flechas señalan fibroblastos Ki67 positivos en el estroma que ingresa al

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interior del tumor y las flechas señalan células epiteliales Ki67 positivas. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Dunnet, ** p<0.01; *** p<0,001. Barra 100 μm.

A continuación, determinamos el número de células apoptóticas en los tumores pertenecientes a cada tratamiento (Fig. I.7). Dado que la muerte del epitelio tumoral resultó un fenómeno masivo, cuantificamos además la superficie de las áreas necróticas presentes en cada tumor. Como se observa en la Figura I.7, los distintos tratamientos indujeron la apoptosis de las células tumorales. En especial, la administración de MFP indujo mayor índice de apoptosis de las células del parénquima tumoral que los antagonistas del ER. Al analizar las áreas necróticas tumorales, se observó un patrón similar. Observando en detalle cortes histológicos teñidos con hematoxilina/eosina se distingue que las células tumorales que persisten luego del tratamiento hormonal son las que se encuentran en contacto con el estroma tumoral, confirmando lo que señalamos anteriormente con la marcación de Ki67 en la Figura I.6. C. Asimismo es posible observar que el espesor del epitelio remanente se reduce conforme a la severidad del tratamiento antitumoral empleado.

Figura I.7: Muerte celular en los tumores C4-HD sometidos a los distintos tratamientos hormonales. A, Izquierda:

Índice apoptótico expresado como la media ± SEM de la proporción de células apoptóticas/células totales en el parénquima

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de los tumores de cada grupo experimental. La proporción de células apoptóticas/células totales en cada tumor es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). Derecha: Índice necrótico expresado como la media ± SEM de la proporción de área necrótica/parénquima tumoral total en cada uno de los tumores de los distintos grupos experimentales. Para determinar este parámetro se tomaron fotos de hematoxilinas/eosinas de cada uno de los tumores a bajo aumento (200x). A continuación dichas fotos se ensamblaron con el programa PanaVue Image Assembler de modo de obtener una foto única para cada corte tumoral. Sobre esta foto ensamblada y con el programa Image J se delimitó el área necrótica total, en relación al área ocupada por el parénquima tumoral (para mayor detalle ver Materiales y Métodos). B: Imágenes representativas de hematoxilinas/eosinas de cada grupo experimental en donde se muestra especialmente zonas necróticas tumorales (flecha). La línea punteada negra en ICI y TAM señala el espesor del epitelio remanente luego de la terapia. El epitelio tumoral remanente es casi inexistente luego del tratamiento con la MFP. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Dunnet, **p<0,01; *** p<0,001. Barra 100 μm.

Como se mencionó con anterioridad, un aspecto distintivo de la regresión de la variante C4-HD es la remodelación que sufre el tejido tumoral. Al cuantificar el área ocupada por el estroma en los tumores pertenecientes a cada grupo experimental observamos que conforme aumenta la severidad de la regresión, la proporción de estroma/área tumoral total se incrementa significativamente (Fig.I.8. A). Para visualizar más claramente el estroma de los tumores utilizamos la tinción con Tricrómico de Masson. En esta técnica el estroma tumoral se colorea de azul, debido a la abundante presencia de fibras colágenas (Fig.I.8. B).

A continuación analizamos mediante inmunohistoquímica, marcadores característicos del estroma tumoral. Como se mencionó en la Introducción, los fibroblastos son la población celular más abundante en el estroma de los tumores sólidos. Debido a que se encuentran en estrecha asociación con las células tumorales, reciben el nombre de CAFs. Numerosos marcadores de CAFs se han documentado, entre ellos actina de músculo liso alfa (α-SMA) (Ostman y Augsten, 2009). Como se observa en la Fig. I.8. B, el estroma de los tumores control y -MPA presenta una alta proporción de células positivas para el marcador α-SMA. En los tumores tratados con los diversos antagonistas hormonales podemos observar que se produce un aumento en la población de fibroblastos estromales, tanto α-SMA positivos como negativos. Curiosamente, los fibroblastos

-SMA positivos se concentran mayoritariamente en áreas de contacto con el parénquima

tumoral. Sería interesante determinar en el futuro, si la expresión aumentada de -SMA en los fibroblastos localizados en estas áreas está relacionada de alguna manera con el mayor índice de Ki67 que presentan las células epiteliales en contacto con el estroma luego de la terapia endocrina (Fig. I.6. C).

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Figura I.8: Reorganización tisular en los tumores C4-HD sometidos a los distintos tratamientos hormonales. A: Índice estromal expresado como la media ± SEM de la proporción de área estromal/área tumoral total correspondiente a cada grupo experimental. Para determinar este parámetro se analizaron fotos de hematoxilinas/eosinas de cada uno de los tumores a bajo aumento (200x) como lo indicado en la Figura I.7.A para el área necrótica. B. Imágenes representativas de cortes histológicos de cada grupo experimental teñidos con la tinción Tricrómico de Masson. El Tricrómico de Masson es una técnica para la coloración de fibras colágenas y elásticas. En la misma el citoplasma de las células epiteliales se tiñe de color rojo oscuro y el estroma rico en fibras colágenas de color azul. Por otro lado se realizó una inmunohistoquímica para el marcador α-SMA. Los núcleos celulares fueron contrateñidos de azul con hematoxilina. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Dunnet, *p<0,05; *** p<0,001. Barra 100 μm.

En base a resultados previos de nuestro laboratorio y luego del análisis de los experimentos presentados hasta aquí, podemos postular que la desaparición progresiva del epitelio tumoral junto con la expansión y la invasión del compartimiento estromal, forman parte de

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un mecanismo de regresión temprano característico de la variante C4-HD. Los distintos tratamientos ensayados han inducido en estos tumores, aunque con distinta intensidad, patrones de respuesta similares. Luego de 48 horas de tratamiento hemos registrado, en todos los casos, una fuerte inhibición de la progresión del ciclo celular y de la consiguiente división de las células tumorales, junto con una potente inducción de la muerte celular por mecanismos apoptóticos y necróticos. Asimismo, hemos podido detectar en todos los casos un abundante estroma tumoral, que parecería estar acompañando el proceso de regresión. Si bien más estudios son necesarios para determinar el origen de dicho estroma, los resultados obtenidos indicarían que la proliferación y la migración de los fibroblastos desde la periferia del tumor serían responsables de la intensa reacción estromal observada tempranamente en la regresión de los tumores C4-HD. I.C. CARACTERIZACIÓN DE LOS MECANISMOS CELULARES INVOLUCRADOS EN LA REGRESIÓN TUMORAL INDUCIDA POR EL ANTIPROGESTÁGENO MIFEPRISTONA.

Como mencionamos anteriormente y como vamos a mostrar en los capítulos posteriores, la invasión estromal que acompaña la regresión de los tumores C4-HD parecería ser una característica distintiva de dicho tumor. A continuación, nos propusimos analizar la progresión temporal de este fenómeno. Elegimos analizar la invasión estromal inducida por la administración de MFP, ya que este tratamiento resultó ser el más efectivo tanto en la inducción de la muerte del epitelio tumoral como en la expansión del compartimiento estromal.

Para realizar este experimento se utilizaron hembras vírgenes BALB/c portadoras de tumores C4-HD de un tamaño aproximado de 50 mm2. Mientras que un grupo de ratones conservó el depot subcutáneo de MPA (grupo control), otro grupo fue sometido a la remoción del depot (-MPA), de forma similar a lo realizado en I. A. Dentro del segundo grupo, analizamos el efecto de la MFP luego de 6,12, 24 o 48 horas de tratamiento. Al cabo de cada tiempo, los ratones fueron sacrificados (Fig. I.9).

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Figura I.9: Diseño experimental. Tumores C4-HD de un tamaño aproximado de 50 mm2 fueron utilizados para realizar el experimento. El grupo +MPA, está compuesto por tumores creciendo en presencia de MPA. Los grupos –MPA corresponden a ratones a los que se les removió el depot subcutáneo de MPA. Los grupos MFP 6, 12, 24 y 48 horas corresponden a ratones a los que se les removió el depot de MPA, y además se les administro MFP (12mg/kg/día) durante 6, 12, 24 o 48 horas, según lo indicado. En todos los casos, 1 hora antes de sacrificar a los ratones se aplicó una dosis de MFP.

Tal como esperábamos, la administración de MFP produjo una disminución en la expresión

de las isoformas A y B del PR (Fig.I.10). Como se observa en el western blot realizado a partir de los extractos tumorales totales, luego de 48 horas de tratamiento con MFP los niveles de expresión de ambas isoformas son casi indetectables. Asimismo, mediante inmunohistoquímica pudimos comprobar que la proporción de células que expresan PR en el compartimiento epitelial disminuye al extenderse la duración del tratamiento con MFP (no mostrado). De esta manera descartamos que la caída en el nivel de expresión del receptor (determinado por western blot) responda simplemente a la desaparición del parénquima tumoral. Por el contrario, y tal como describimos anteriormente para PR total por IHQ (Fig. I.4), la remoción de MPA llevó a un aumento en la expresión de ambas isoformas.

En los resultados observados en la Figura I.10 y en los resultados posteriores, no podemos descartar que el efecto mayor observado a las 48 horas de tratamiento con MFP se deba a que este grupo experimental recibió un refuerzo de MFP a las 24 horas.

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FiguraI.10: Regulación de la expresión del PR en función del tiempo de tratamiento con MFP. Imágenes representativas de western blots realizados a partir de extractos proteicos totales de tumores de cada grupo experimental, revelados con anticuerpos para PR y ERK1/2, este último como control de carga. El grupo –MPA corresponde a ratones a los cuales se les removió el depot de MPA 48 horas antes del sacrificio. El anticuerpo para PR reconoce ambas isoformas, la A de 83 kDa (PRA) y la B de 115 kDa (PRB). Las bandas fueron cuantificadas densitométricamente y relativizadas a ERK1/2. n=4 en cada grupo experimental. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Dunnet, *p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001 con respecto a los valores +MPA (control).

Como era de esperar, la duración del tratamiento con MFP también influyó en el tamaño

final que presentaron los tumores (Fig. I.11). Como se observa en la Figura I.11, cuanto más prolongado fue el tratamiento con MFP, mayor fue la reducción obtenida en el tamaño tumoral. Como hemos mostrado anteriormente (Fig. I. 3), la reducción del tamaño tumoral no se debió a la remoción del depot de MPA, ya que luego de 48 horas de removida la hormona (grupo –MPA), el tamaño tumoral no se vio afectado respecto al tamaño tumoral al iniciar el tratamiento.

Figura I.11: Tamaño tumoral residual en función de la duración del

tratamiento con MFP. Al finalizar los distintos tratamientos medimos el tamaño de los tumores de cada grupo experimental y los expresamos como porcentaje del tamaño al iniciar cada tratamiento. Como se observa, si se mantiene el depot de MPA los tumores crecen aproximadamente un 20% en 48 horas. A partir de 12 horas de administrada la MFP el tamaño tumoral se reduce un 10%, alcanzando una reducción del 40% a las 48 horas. En cada grupo experimental se comparó el tamaño tumoral antes y después del tratamiento, mediante un t de Student, **p<0,01, *** p<0,001.

A continuación analizamos la histología de los tumores tratados con MFP, por medio de la tinción con hematoxilina/eosina. Mediante este análisis pudimos observar que el efecto progresivo del tratamiento correlaciona con el grado de remodelación tisular de cada grupo experimental. Al evaluar la proliferación y la muerte celular por medio de la determinación del índice mitótico y

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apoptótico, respectivamente, observamos que ya a partir de las 6 horas de tratamiento con MFP el epitelio tumoral entra en citostasis y apoptosis (Fig. I.12. A y B). Este efecto se incrementa, conforme aumenta el tiempo de tratamiento con MFP. Al analizar el área ocupada por el estroma tumoral, el aumento comienza a ser significativo a las 12 horas de iniciado el tratamiento (Fig. I.12. C). Podemos estimar entonces que la expansión del estroma se dispara entre las 6 y 12 horas de exposición a la MFP. Como observamos anteriormente, la remoción de la MPA, incluso luego de 48 horas, no modificó la proporción estroma/área tumoral total con respecto al grupo control (Fig. I.12. D).

Figura I.12: Reorganización tisular en los tumores C4-HD sometidos a distinto tiempo de tratamiento con MFP. A y B: Índices mitótico y apoptótico expresados como la media ± SEM de la proporción de células mitóticas o apoptóticas/células totales en el parénquima de los tumores de cada grupo experimental. La proporción de células mitóticas o apoptóticas/células

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totales en cada tumor es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). C: Índice estromal expresado como la media ± SEM de la proporción de área estromal/área tumoral total correspondiente a cada grupo experimental. D: Imágenes representativas de Hematoxilinas/eosinas correspondientes a los tumores de cada grupo experimental. El grupo –MPA está conformado por ratones a los cuales se les removió el depot de MPA 48 horas antes del sacrificio. Barra 100 μm. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Dunnet, *p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001.

A continuación analizamos la expresión génica de los tumores sometidos a los tratamientos descriptos anteriormente. Con el objetivo de identificar patrones de regulación asociados al fenómeno de regresión, extrajimos ARN total a partir de muestras de tumores incluidos en parafina, y enfrentamos dichas muestras con el microarray de expresión comercial Affimetrix Mouse 430.2 (para mayor detalle, ver Materiales y Métodos). El análisis de los resultados fue realizado con el programa GeneSpring GX. Brevemente, la expresión de cada gen fue relativizada a la correspondiente al grupo +MPA, y se realizó un ANOVA para discriminar aquellos genes que mostraran un cambio en la expresión superior a 1.5 veces.

Luego de realizado el análisis pudimos determinar que la remoción del depot de MPA produjo un cambio significativo en la expresión de 186 genes, mientras que la adición de MFP por 6, 12, 24 y 48 horas modificó la expresión de 897, 1604, 1497 y 1799 genes, respectivamente. Si bien los genes identificados se encontraban asociados a funciones diversas, fue posible definir ciertas categorías relacionadas con la regulación de procesos celulares específicos. En primer lugar, genes relacionados con la regulación del ciclo celular se encontraron regulados negativamente con respecto al grupo +MPA a lo largo de los distintos grupos experimentales. Por otro lado, encontramos que la expresión de genes asociados a la inducción de apoptosis se encontraba aumentada luego del tratamiento con MFP. Otros procesos que se encontraron positivamente regulados por el tratamiento con MFP fueron aquellos relacionados con la coagulación, trombosis, angiogénesis, remodelación de la matriz extracelular, respuesta inflamatoria e inmune. En las Tablas I. 1 y 2 (Anexo del Capítulo I), se detallan genes regulados positiva y negativamente a las 24 y 48 horas de tratamiento con MFP.

Los resultados del microarray mostraron que en los tumores tratados con MFP se produce, entre otros procesos, un aumento importante en la expresión de genes relacionados con la angiogénesis o neovascularización. Nos propusimos verificar entonces si los tumores en regresión se encontraban diferencialmente vascularizados. Analizamos la abundancia de vasos sanguíneos en los tumores de los distintos grupos experimentales, mediante inmunofluorescencia para el marcador de células endoteliales CD31. Como se observa en la Fig.I.13, pudimos detectar un gran número de focos positivos para dicho marcador dentro del estroma tumoral. Como mencionamos

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anteriormente, el área ocupada por el estroma aumenta significativamente a partir de las 12 horas de tratamiento con MFP. Contabilizando el número de focos positivos para el marcador CD31 pudimos observar que a partir de las 12 horas de tratamiento se observa un aumento en el número de vasos, respecto de los tumores control (+MPA). Debemos indicar además que la remoción del pellet de MPA, 48 horas antes de sacrificar a los animales, no tuvo efecto sobre este parámetro (no mostrado). Experimentos en curso, en donde inyectamos a los animales una lectina fluoresceinada que se une a glicoproteínas de las células endoteliales, nos permitirán determinar la funcionalidad de los pequeños vasos que se originan luego del tratamiento con MFP.

Figura I.13: El tratamiento con MFP induce la formación de vasos en el estroma tumoral. Izquierda: Imágenes representativas de cortes tumorales pertenecientes a los distintos grupos experimentales, analizados por inmunofluorescencia para el marcador CD31. Tumores pertenecientes a cada grupo experimental fueron procesados utilizando un criostato, de manera de obtener secciones de 18 μm de espesor. Dichas secciones fueron utilizadas para realizar una Inmunofluorescencia para el marcador CD31. Los núcleos fueron teñidos con ioduro de propidio y se observan en color rojo. Derecha: Índice CD31 expresado como la media ± SEM del número de focos CD31 positivos por campo de bajo aumento (200X) en cada grupo experimental. Para determinar este parámetro se tomaron al menos 5 fotos por muestra

y se contabilizo el número de focos CD31 positivos, independientemente del tamaño de cada foco. Barra 50 m. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Dunnet, *p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001.

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Otro de los procesos que aparecen altamente regulados por el tratamiento con MFP según el microarray es el de la remodelación tisular. Como se observa en las Tablas I. 1 y 2 (Anexo Capítulo I), genes de metaloproteinasas y proteínas de matriz como colágeno, se encuentran sobre-expresados luego del tratamiento con MFP, con respecto a los tumores control. En base a resultados previos del laboratorio, sabemos que luego de 48 horas de tratamiento con MFP la actividad de las metaloproteinasas 9 y 2 (MMP-9 y 2) aumenta (Simian et al., 2006). Asimismo, como mostramos en la Fig. I.8.B, el estroma de los tumores en regresión está compuesto por abundantes fibras colágenas.

Por otro lado, encontramos que la expresión de genes vinculados a la regulación de procesos inflamatorios y/o inmunes también aumenta. Entre ellos, genes vinculados a la fisiología de neutrófilos y macrófagos. Por medio de una inmunohistoquímica para MMP-9 (Fig. I.14. A) observamos que luego de 48 horas de tratamiento con MFP hay una mayor cantidad de células MMP-9 positivas en el estroma periférico que ingresa a los tumores. Por medio del estudio de la morfología celular, y en base a experiencia previa con el anticuerpo utilizado, podemos atribuir la marca obtenida a células polimorfonucleares (PMN). La expresión de MMP-9 ha sido descripta en otros tipos celulares como por ejemplo mastocitos (Kanbe et al., 1999) o incluso en CAFs por lo que no podemos descartar la presencia de este tipo de células, positivas para MMP-9.

Finalmente, elegimos validar los resultados obtenidos con respecto al factor FGF-2, factor cuya expresión se vio aumentada luego del tratamiento con MFP (Tabla I. 1, Anexo Capítulo I). En relación a los mecanismos de regresión tumoral, este factor resulta interesante ya que sido vinculado con procesos angiogénicos (Cross y Claesson-Welsh, 2001) y fibróticos (Inoue et al., 1996), (Bishen et al., 2008). Mediante western blot, confirmamos que la expresión del factor aumenta luego del tratamiento con MFP (Fig. I.14. B).

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Figura I.14: Validación de algunos de los resultados del microarray realizado a partir de tumores C4-HD tratados con

MFP por distintos tiempos. A: Presencia de neutrófilos: Imágenes representativas de cortes de tumores pertenecientes a los grupos control y MFP por 48 horas, analizados por inmunohistoquímica para la metaloproteinasa MMP-9, que funciona como marcador de neutrófilos activados. Los núcleos celulares se contratiñeron con hematoxilina. Barra 200 µm. B:

Expresión de FGF-2: Imágenes representativas de western blots realizados a partir de extractos proteicos totales de tumores de cada grupo experimental, revelados con anticuerpos para FGF-2 y ERK1/2, este último como control de carga. El grupo –MPA corresponde a ratones a los cuales se les removió el depot de MPA 48 horas antes del sacrificio. El anticuerpo para FGF-2 reconoce una banda de aproximadamente 18 KDa que corresponde a la fracción soluble del FGF-2. Las bandas fueron cuantificadas densitométricamente y relativizadas a ERK1/2. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Dunnet, *p<0,05; **p<0,01.

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Uno de los genes que aparece regulado en mayor proporción por MFP (cerca de 12 veces) en el microarray, es el factor de crecimiento insulinico-1 (IGF-1) (Tabla I.1, Anexo del Capítulo I). Estudios previos del laboratorio han demostrado que este factor participa en la inducción del crecimiento de los tumores C4-HD por MPA (Elizalde et al., 1998). Además, se encuentra ampliamente aceptado que el IGF-1 es un inductor de vías de señalización intracelular, fundamentalmente de la vía PI3K/Akt (Cheng et al., 2008). Esta vía de señalización es una de las más importantes en lo que se refiere a la regulación de la supervivencia, la proliferación, el crecimiento y la migración celular (Manning y Cantley, 2007). Decidimos evaluar entonces el efecto del tratamiento con MFP sobre el estado de activación de la vía PI3K/Akt. Para ello determinamos por western blot los niveles de expresión de la quinasa Akt y de la proteína ribosomal S6 (un sustrato downstream TORC1), y sus correspondientes formas activas, fosforiladas en los residuos serina 473 y 240/244, respectivamente. Como se observa en la Figura I.15, luego de una breve exposición a la MFP (6 horas), la vía PI3K/Akt se reprime significativamente. Sin embargo, a partir de este momento y conforme aumenta el tiempo luego de la primer dosis de MFP, se observa una recuperación en el nivel de fosforilación de ambas proteínas.

Figura I.15: Estado de activación de la vía PI3K/Akt en los tumores C4-HD sometidos al tratamiento con MFP.

Imágenes representativas de western blots realizados a partir de extractos proteicos totales de tumores de cada grupo experimental, revelados con los anticuerpos pSer473Akt, pSer240/244S6 y sus correspondientes formas totales Akt y S6, respectivamente. El grupo –MPA corresponde a ratones a los cuales se les removió el depot de MPA 48 horas antes del

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sacrificio. Las bandas obtenidas fueron cuantificadas densitométricamente y se graficaron las proporciones pAkt/Akt total y pS6/S6 total. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Tukey, *p<0,05;**p<0,01.

Nos preguntamos a continuación, si la regulación de la activación de PI3K/Akt/S6 por MFP

se producía indistintamente en el estroma y en el parénquima de los tumores o por el contrario, podía suscribirse a uno de los compartimientos en particular.

Mediante inmunohistoquímica para la proteína S6 fosforilada, observamos que conforme avanza la regresión tumoral inducida por MFP, la marca de pS6 disminuye en el parénquima y aumenta en el estroma de los tumores C4-HD (Fig. I.16). Por lo tanto, los resultados observados en el western blot de la Fig.I.15 corresponden a la inactivación de la vía PI3K/Akt en el epitelio, y a la activación en el compartimento estromal. Es importante mencionar que luego de 48 horas de removido el pellet de MPA se observa un aumento en la activación de la vía PI3K/Akt/S6 (Fig. I.15). Sin embargo en este caso, el aumento se atribuye exclusivamente al epitelio tumoral (Fig. I.16). En las imágenes correspondientes a la inmunohistoquímica para S6 fosforilada, se observa que en ausencia de MPA el epitelio presenta una marca intensa para pS6 mientras que el estroma presenta una señal prácticamente nula (Fig. I.16). Sólo luego del agregado de MFP, el estroma aumenta la reactividad para S6 fosforilada (Fig.I.16). En estos resultados consideramos que la regulación de pS6 ocurre principalmente a través de la activación de PI3K/Akt, sin embargo no descartamos que algún mecanismo independiente de Akt pueda estar involucrado.

Por lo presentado hasta aquí, podemos postular que el fenómeno de reacción estromal

asociado al tratamiento con MFP sigue inmediatamente a la injuria del epitelio tumoral C4-HD. El hecho de que el epitelio muestre signos de regresión previos a la expansión del compartimiento estromal sugiere que la reacción estromal observada es una consecuencia del daño celular inducido en el epitelio a causa del tratamiento con MFP. A diferencia de lo que se observa en el estroma de los tumores C4-HD en crecimiento, hemos demostrado que el estroma asociado al fenómeno de regresión presenta una mayor cantidad de vasos sanguíneos, y mayor activación de la vía PI3K/Akt.

Los patrones de regulación génica aportados por el estudio del microarray, sumados a resultados previos del laboratorio, sugieren que la regresión de la variante C4-HD presenta muchas similitudes con el proceso de cicatrización de cierre de heridas o wound healing. En este proceso participan fenómenos angiogénicos, remodelado tisular, respuestas de tipo inflamatoria e inmune, y fenómenos de coagulación o trombosis.

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Experimentos en curso en el modelo de xenotransplante de la línea celular humana T47D nos indican que este fenómeno de reacción estromal a modo de cicatrización luego del tratamiento antitumoral se manifiesta de manera similar a lo observado en la variante C4-HD. Estudios posteriores en el modelo T47D nos permitirán analizar en mayor profundidad este fenómeno luego del tratamiento con MFP y con TAM.

Figura I.16: Localización de pS6 activada en tumores C4-HD tratados por distintos tiempos con MFP. Imágenes representativas de cortes histológicos pertenecientes a los distintos grupos experimentales, analizados por inmunohistoquímica para S6 fosforilada en los residuos serina 240 y 244. Los núcleos celulares se contratiñeron con hematoxilina. Nótese que tanto en los tumores control como en los que se removió el MPA 48 horas antes (-MPA), la marca de pS6 es fundamentalmente epitelial, mientras que en los tumores tratados con MFP la marca es fundamentalmente estromal. En ambos casos pS6 se localiza principalmente en el citoplasma. Barra 100 μm.

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I.D. PARTICIPACIÓN DE LA VIA PI3K/Akt EN LA REGRESIÓN TUMORAL C4-HD INDUCIDA POR MFP

Como hemos demostrado en los resultados anteriores, durante la regresión tumoral se produce una activación de la vía PI3K/Akt en el estroma de los tumores C4-HD. Es posible entonces que la participación de dicha vía afecte funciones celulares importantes en los fibroblastos que forman parte del estroma tumoral, favoreciendo de esta manera la reacción estromal observada. Quedó demostrado que uno de los factores que se encuentra regulado durante la regresión tumoral C4-HD, es el factor FGF-2 (Tabla I.2 Anexo Capítulo I y Fig. I.14). Se ha demostrado por ejemplo que la inhibición de la quinasa PI3K con LY294002 inhibe significativamente la migración de cultivos primarios de fibroblastos murinos (Kanazawa et al., 2010). Por lo tanto, a continuación, nos propusimos evaluar el papel de la activación de la vía PI3K/Akt en la reacción estromal inducida por MFP. Para ello, estudiamos algunos parámetros asociados al tratamiento con MFP en un contexto de inhibición de la vía de señalización en cuestión. La inhibición de la vía PI3K/Akt se alcanzó por medio del tratamiento con wortmanin (WORT), un inhibidor de la enzima PI3K que es utilizado ampliamente tanto en estudios in vitro como en modelos preclínicos por su alta efectividad y bajo costo (Cleary y Shapiro, 2010).

Para realizar estos experimentos se utilizaron hembras BALB/c portadoras de tumores C4-HD de un tamaño aproximado de 50 mm2. Mientras que un grupo de ratones conservó el depot subcutáneo de MPA (grupo +MPA), otro grupo fue sometido a la remoción del depot (-MPA), de manera similar a lo realizado en I.A. Dentro del segundo grupo, analizamos el efecto de la MFP, el WORT o una combinación simultánea de MFP y WORT por 12 horas (Fig. I.17).

Figura I.17: Diseño experimental. Tumores C4-HD de un tamaño aproximado de 50 mm2 fueron utilizados para realizar el experimento. El grupo control está compuesto por tumores creciendo en presencia de MPA. El grupo –MPA corresponde a ratones a los que se les removió el depot subcutáneo de MPA 12 horas antes del sacrificio. Los grupos MFP, WORT Y

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MFP+WORT corresponden a ratones a los que se les removió el depot de MPA, y se les administro MFP (12mg/kg/día), WORT (1 mg/kg/día) o ambos simultáneamente, 12 horas antes del sacrificio. Los tratamientos fueron repetidos 1 hora antes de sacrificar a los animales.

Al analizar los tamaños tumorales finales al cabo de los distintos tratamientos comprobamos que luego de 12 horas, la administración de WORT no produjo un cambio significativo en las medidas de los tumores (Fig. I.18). Por otro lado, tal como se mostró en la Fig. I.11, el tratamiento con MFP produjo una reducción de aproximadamente el 10% del tamaño tumoral. Asimismo, en comparación al tratamiento con MFP como droga única, la combinación MFP+WORT no resultó más efectiva en inducir la regresión de los tumores C4-HD.

Figura I.18: Tamaño tumoral residual en C4-HD tratados con MFP,

WORT o una combinación de ambos. Luego de 12 horas de administradas las drogas, se midió el tamaño de los tumores correspondientes a cada grupo experimental, y se expresaron como porcentaje del tamaño tumoral previo al tratamiento. Como se observa, en presencia o ausencia del depot de MPA el tamaño tumoral no se ve afectado. Luego de 12 horas de administrada la MFP el tamaño tumoral se reduce un 10%, y este efecto no se modifica por la administración conjunta de WORT. n=4 en cada grupo experimental. En cada grupo experimental se comparó el tamaño tumoral antes y después del tratamiento, mediante una prueba t de Student, **p<0,01.

Para comprobar que la vía de PI3K/AKT se encontrara efectivamente inhibida realizamos western blots a partir de extractos proteicos totales de los tumores pertenecientes a cada grupo experimental. Como se observa en la Fig. I.19. A, la administración de WORT, sólo o en combinación con MFP, reduce cerca de un 70% la fosforilación de la proteína S6. Por otro lado, y como demostramos en la Fig.I.10., la administración de MFP disminuye significativamente la expresión de las isoformas PRA y PRB.

Asimismo, como se aprecia en imágenes correspondientes a la determinación de S6 fosforilada por inmunohistoquímica (Fig. I.19.B) y como se mostró en la Figura I.16, en los tumores tratados con MFP la proteína se encuentra activa fundamentalmente en el estroma. Por el contrario, en el caso del tratamiento combinado, la activación de S6 desaparece. El hecho de que

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la fosforilación de S6 sea inhibida por el tratamiento con WORT, nos confirma que la regulación de S6 en los tumores es dependiente de la activación de PI3K.

Figura I.19: Estado de activación de la vía PI3K/AKT en los tumores C4-HD sometidos al tratamiento con MFP, WORT

o una combinación de ambos. A: Western blots realizados a partir de extractos proteicos totales de los tumores de cada grupo experimental, revelados con los anticuerpos pSer240/244S6, S6 total y PR (PRA y PRB). Las bandas obtenidas fueron cuantificadas densitométricamente y se graficó la proporción pS6/S6 total. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Tukey, ** p<0.01; *** p<0,001. B: Cortes de tumores pertenecientes a los distintos grupos experimentales fueron utilizados para realizar una inmunohistoquímica para la proteína S6 fosforilada (pS6). Los núcleos celulares se

contratiñeron con hematoxilina. Barra 100 m.

Como mencionamos anteriormente, la reducción del tamaño tumoral es similar en los

grupos MFP y MFP+WORT. Sin embargo, en el contexto de inhibición de la vía PI3K/Akt, la reacción estromal inducida por el tratamiento con MFP se ve significativamente afectada (Fig. I.19. B). Luego de analizar inmunohistoquímicas para la proteína de matriz extracelular colágeno I (COL-I) y de cuantificar el área estromal en cada uno de los tumores pertenecientes a los distintos tratamientos, pudimos observar que los tumores tratados con MFP+WORT poseen una menor proporción de estroma tumoral que los tumores tratados únicamente con MFP (Fig. I.20). Estos resultados muestran que la vía I3K/Akt se encuentra íntimamente relacionada con la regulación de la expansión del compartimiento estromal durante la regresión de los tumores C4-HD.

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Figura I.20: Análisis de la reacción estromal inducida por MFP, en un contexto de inhibición de la vía PI3K/Akt.

Izquierda: Imágenes representativas de cortes histológicos pertenecientes a los diferentes grupos experimentales, analizados por inmunohistoquímica para colágeno I (COL-I). Los núcleos fueron contrateñidos con hematoxilina. Derecha:

Índice estromal expresado como la media ± SEM de la proporción de área estromal/área tumoral total correspondiente a cada grupo experimental. Barra 50 μm. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Tukey, *p<0,05;**p<0,01.

Por otro lado, diversas publicaciones han mostrado que inhibidores de la vía PI3K/Akt presentan actividad antiangiogénica en modelos animales, disminuyendo por ejemplo la secreción de factores angiogénicos como VEGF (Karar y Maity, 2011). Nos preguntamos entonces si la inhibición de dicha vía podría interferir con el aumento en el número de vasos intratumorales observados durante la regresión C4-HD por efecto de la MFP.

Para analizar la abundancia de vasos sanguíneos en los tumores C4-HD realizamos nuevamente una inmunofluorescencia para el marcador CD31 (Fig. I.21). Como ya mostramos (Fig. I.13), luego de 12 horas de tratamiento con MFP se observa un aumento significativo en el número de focos positivos para dicho marcador. Pero en combinación con WORT este efecto desaparece. Como puede observarse en la Figura I.21, los tumores tratados con la terapia combinada MFP+WORT presentan un número de focos CD31 positivos similar a los grupos +MPA, -MPA o WORT.

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Figura I.21: Análisis de la formación de vasos inducida por MFP, en un contexto de inhibición de la vía PI3K/Akt.

Izquierda: Imágenes representativas de cortes tumorales pertenecientes a los distintos grupos experimentales, analizados por inmunofluorescencia para el marcador CD31 (verde). Tumores pertenecientes a cada grupo experimental fueron procesados utilizando un criostato como lo indicado en la Figura I.13. Los núcleos fueron teñidos con ioduro de propidio y se observan en color rojo. Derecha: Índice CD31 expresado como la media ± SEM del número de focos CD31 positivos por

campo de bajo aumento (200X), en cada grupo experimental. Barra 50 m. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Dunnet, *p<0,05.

Se considera que tanto la presencia de un estroma reactivo como el restablecimiento de la irrigación sanguínea es vital para lograr la cicatrización eficiente de las heridas. Fenómenos angiogénicos insuficientes han sido implicados en la patología de heridas crónicas, pobremente cicatrizadas, como ocurre en las personas diabéticas o de edad avanzada (Brem et al., 2003). Dado que la regresión tumoral en la variante C4-HD presenta similitudes con el proceso de cierre de heridas, nos propusimos evaluar si parámetros relacionados con la supervivencia de las células tumorales se encontraban modificados en el contexto de una reacción estromal y de una angiogénesis disminuida. Como hemos mencionado anteriormente (Fig. I.6, I.7 y I.12), el

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tratamiento con MFP induce la citostasis y la apoptosis del parénquima tumoral. Evaluamos entonces si dichos parámetros se veían modificados al inhibir la vía PI3K/Akt.

Al analizar la proliferación y la muerte celular en los tumores tratados con MFP, WORT o la terapia combinada MFP+WORT, encontramos resultados llamativos. En primer lugar, como se observa en la inmunohistoquímica para el marcador Ki67 y en la cuantificación correspondiente (Fig. I.22. A, izquierda y B, arriba), a diferencia de MFP, la administración de WORT no disminuyó la proliferación celular. La administración conjunta de WORT y MFP, no alteró el efecto citostático ejercido por MFP como monodroga. Por el contrario, si bien WORT demostró ejercer cierto efecto proapoptótico (medido como la capacidad de inducir la activación de la caspasa 3), en los tumores tratados con la terapia combinada MFP+WORT la apoptosis fue significativamente menor que en los tumores tratados solamente con MFP (Fig.I.22. A, derecha y B, abajo). Estos resultados indicarían que al menos durante las primeras 12 horas de tratamiento, la administración de WORT disminuiría el efecto proapoptótico de la MFP, y no mejoraría el efecto citostático ejercido por ésta. Actualmente nos encontramos realizando tratamientos combinados prolongados, durante 7 días, de MFP+WORT con el objetivo de determinar si las tendencias observadas durante las primeras 12 horas de administradas las drogas se mantienen a lo largo de la terapia. De verificarse, estaríamos en condiciones de afirmar que la combinación de un inhibidor de la vía PI3K/Akt como WORT disminuye significativamente la eficacia del tratamiento con el antiprogestágeno MFP en estos tumores.

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Figura I.22: Análisis de la proliferación y muerte celular en los tumores C4-HD sometidos al tratamiento con MFP, en

un contexto de inhibición de la vía PI3K/Akt. A, Izquierda: Índice Ki67 expresado como la media ± SEM de la proporción de células Ki67 positivas/células totales en el parénquima de los tumores de cada grupo experimental. Dicha proporción es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). Derecha: Índice caspasa 3 expresado como la media ± SEM de la intensidad de la marca para caspasa 3 activada obtenida por inmunohistoquímica, en los tumores de cada grupo experimental. Para la determinación de dicho índice, se cuantificó la intensidad de la marca de caspasa 3 activada utilizando el software Aperio, a partir de imágenes correspondientes a secciones tumorales totales obtenidas con el microscopio ScanScope (para más detalle ver Materiales y Métodos). B, Arriba: Imágenes representativas de cortes histológicos de los distintos grupos experimentales analizados por inmunohistoquímica para el marcador Ki67. Los núcleos celulares fueron contrateñidos de azul con hematoxilina. Las fotografías corresponden a zonas centrales de los tumores correspondientes. Abajo: Imágenes representativas de cortes histológicos analizados por inmunohistoquímica para caspasa 3 activada (caspasa 3). Barra 100 μm. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Tukey, **p<0,01;***p<0,001.

En conclusión hemos demostrado que la vía PI3K/Akt participa activamente en la reacción

estromal observada durante la regresión de los tumores C4-HD tratados con MFP, regulando tanto la proporción de estroma activado, como la generación de nuevos vasos. Los resultados obtenidos plantean la posibilidad de que, al menos tempranamente, la reacción estromal modula la

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respuesta a la terapia influyendo directamente sobre la proliferación y la supervivencia de las células tumorales.

I.E. ANÁLISIS IN VITRO DE LA RESPUESTA CELULAR AL TRATAMIENTO CON DIVERSOS AGENTES ANTITUMORALES.

A continuación evaluamos el efecto del tratamiento endocrino y la inhibición de la vía PI3K/Akt sobre células epiteliales C4-HD aisladas. Dicha evaluación fue realizada in vitro, utilizando células epiteliales obtenidas a partir de cultivos primarios C4-HD (para más detalle ver Materiales y Métodos).

Numerosas publicaciones han puesto de manifiesto las falencias que posee el sistema de cultivo sobre plástico o cultivo en dos dimensiones, como herramienta para el estudio in vitro de células provenientes de tejidos que poseen una compleja organización espacial, como lo es por ejemplo la glándula mamaria (Kenny et al., 2008). Como han demostrado Bissell y colaboradores, el cultivo en tres dimensiones utilizando matrices extracelulares como el Matrigel, logra recapitular exitosamente ex vivo aspectos claves de la fisiología de tejidos, como lo son la polarización de las células epiteliales glandulares, y la comunicación con los componentes de la matriz extracelular (Kleinman y Martin, 2005).

El sistema de cultivo tridimensional en Matrigel ha sido utilizado exitosamente en el modelo de carcinomas mamarios inducidos por MPA. Cuando células epiteliales purificadas de tumores C4-HD y C4-HI son cultivadas en plástico, ambas presentan niveles similares de activación de la vía de PI3K/Akt. Sin embargo, cuando son cultivadas sobre una fina capa de Matrigel, los cultivos C4-HI mantienen un nivel de activación mayor que los cultivos C4-HD, tal como ocurre con los tumores in vivo (Polo et al., 2010).

Por otro lado hemos demostrado que en este sistema de cultivo las células epiteliales tumorales se encuentran polarizadas. Dicha aseveración surge del análisis de proteínas que se encuentran diferencialmente localizadas en las células que forman parte de los epitelios (Bryant y Mostov, 2008). Las proteínas que participan en el contacto con el lumen glandular presentan una clara localización apical (entre ellas MUC-1) mientras que aquellas que se encuentran implicadas

en el contacto célula-célula (entre ellas E-caderina) o célula-matriz (entre ellas integrina-6) se encuentran lateral o basalmente expresadas, respectivamente. Tal como se observa en la Fig. I.23, las células tumorales C4-HD se disponen formando cúmulos tridimensionales de morfología cilíndrica y compacta, de un tamaño aproximado de 100 μm. Los cúmulos C4-HD presentan una

localización basal de las proteínas laminina 1 (LAM-1), integrina 6 (INT6), y lateral de E-caderina (E-CAD). A diferencia de los cúmulos celulares provenientes de tumores C4-HI (ver

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Capítulo II), los cúmulos provenientes de tumores C4-HD no desarrollan lumen central, y en concordancia con esto, la localización de MUC-1 es difusa. Para más detalles sobre los tumores C4-HI ver Capítulo II de esta Tesis.

Figura I.23: Expresión de proteínas de polarización epitelial en cultivos primarios de células epiteliales C4-HD.

Cultivos primarios de células epiteliales C4-HD fueron sembrados sobre una fina capa de Matrigel. Dos días después de realizado el cultivo, las células fueron fijadas, y se realizó una inmunofluorescencia para las proteínas E-CAD, MUC-1, integrina α6 (INTα6) y laminina 1 (LAM 1). En rojo se observan los núcleos celulares teñidos con IP. Barra 100 μm.

A continuación analizamos el efecto del tratamiento endocrino in vitro, en cultivos primarios tridimensionales C4-HD. Luego de dos días de cultivo sobre Matrigel, las células epiteliales fueron tratadas con los antagonistas hormonales TAM, ICI y MFP durante 24 horas. Finalizados los tratamientos pudimos comprobar que las drogas utilizadas inducen en las células epiteliales aisladas efectos similares a los observados in vivo. En primer lugar, el aspecto general de los cúmulos celulares tratados con TAM e ICI, y en mayor medida con MFP, se vio claramente afectado. En una gran proporción de los cúmulos sometidos al tratamiento endocrino, se observaron células desprendidas. La tinción con naranja de acridina y bromuro de etidio (NA-BE), una técnica que permite distinguir por tinción diferencial a las células vivas en color verde de las células muertas en color rojo (para mayor detalle ver Materiales y Métodos), mostró que los tratamientos antiestrogénicos, y el antiprogestágeno principalmente, indujeron con respecto al control un aumento significativo en la muerte de las células C4-HD (Fig.I.24). Diversas publicaciones señalan que la tinción con NA-BE es un método indicativo de apoptosis (Renvoizé et al., 1998). Para corroborar efectivamente que las células muertas se encontraran en un proceso apoptótico realizamos una determinación de caspasa 3 activada por inmunofluorescencia (Fig. I.24). Como se observa en la Figura I.24, los distintos tratamientos incrementaron la marca para caspasa 3 activada con un patrón muy similar al obtenido por el análisis de la tinción con NA-BE.

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Finalmente, analizamos el estado proliferativo de las células que formaban parte de los cúmulos realizando una inmunofluorescencia para el marcador Ki67 (Fig.I.24). Analizando la marca obtenida, podemos afirmar que los tratamientos endocrinos ejercieron un claro efecto citostático. Nuevamente, el tratamiento con MFP resultó ser el más efectivo.

Figura I.24: Efecto del tratamiento con antagonistas hormonales ICI, TAM y MFP sobre la proliferación y la apoptosis

de cultivos primarios C4-HD creciendo en Matrigel. Cultivos primarios de células epiteliales C4-HD fueron sembrados sobre una fina capa de Matrigel. Dos días después de realizado el cultivo, las células se trataron durante 24 horas con ICI (1 μM), TAM (1μM), MFP (10 nM) o vehículo a modo de control. A: Imágenes en campo claro representativas de cúmulos C4-HD sometidos a los distintos tratamientos experimentales. Las flechas indican células desprendidas, o en proceso de

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desprendimiento. B: Imágenes representativas de cúmulos pertenecientes a los distintos grupos experimentales teñidos con NA-BE. Las células vivas se ven de color verde, mientras que las muertas aparecen de color rojo. C: Índice apoptótico expresado como la media ± SEM del número de cúmulos celulares con desprendimiento de células muertas determinadas por NA-BE, en relación al número de cúmulos totales observados por campo a bajo aumento (200X). D y F: Imágenes representativas de cúmulos celulares pertenecientes a cada grupo experimental analizados por inmunofluorescencia para caspasa 3 activada (D) y Ki67 (F), ambos en verde. En rojo se observan los núcleos teñidos con IP. E: Índice Ki67 expresado como la media ± SEM del número de células Ki67 positivas en relación a las células totales por cumulo. Para las determinaciones en C y E se contaron como mínimo 5 campos a bajo aumento (200X), con un promedio de 10 cúmulos celulares en cada uno. n=4 en cada grupo experimental. Cabe aclarar que durante los lavados que requieren las técnicas de tinción con NA-BE e inmunofluorescencia, la mayoría de las células muertas desprendidas se pierde y por ende no pueden ser visualizadas en B y en D. Barra 100 μm. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, *p<0,05;*** p<0,001, con respecto al control (vehículo).

Por otro lado, evaluamos el efecto del tratamiento con MFP en cultivos de fibroblastos aislados C4-HD. Para ello, realizamos cultivos primarios de CAFs C4-HD, los sometimos a distintas concentraciones de MFP y analizamos la proliferación celular por medio de la técnica de incorporación de timidina tritiada y por inmunofluorescencia para el marcador Ki67 (Fig.I.25).

Luego de 48 horas de tratamiento con MFP (en un rango de 1 a 100 nM), comprobamos que la proliferación de los fibrolastos aislados no se vio modificada con respecto al control (Fig.I.25 A y B). Verificamos que los fibroblastos respondieran a un estímulo proliferativo incubándolos con medio condicionado proveniente de cultivos primarios de células epiteliales C4-HD. Como se observa en la Figura I.25, la incubación con dicho medio condicionado indujo un aumento notable en la proliferación de los fibroblastos. En el caso del tratamiento con MFP 10 nM, confirmamos mediante inmunofluorescencia para Ki67 que los fibroblastos aislados son refractarios al antiprogestágeno (Fig.I.25 B).

Figura I.25: Proliferación celular en fibroblastos derivados de cultivos primarios C4-HD expuestos al tratamiento con

MFP. Cultivos primarios de fibroblastos C4-HD fueron sembrados en placas de cultivo. Un día después de sembradas, las

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células fueron tratadas durante 48 horas con MFP (1 nM, 10 nM o 100 nM), o vehículo a modo de control. A: Determinación de la proliferación celular mediante el ensayo de incorporación de timidina tritiada. El índice representa el valor de cpm relativo al control, obtenido a partir de octuplicados para cada muestra. El MC se recolectó luego de 48 horas de un cultivo epitelial C4-HD y fue agregado a los fibroblastos aislados. B: Fibroblastos C4-HD fueron fijados, y se realizó una inmunofluorescencia para el marcador Ki67. En rojo se observan los núcleos teñidos con IP. Barra: 100 µm.

A continuación utilizamos el sistema de cultivo tridimensional en Matrigel para analizar el efecto de la administración de WORT, ya sea solo o en combinación con MFP, sobre la proliferación y la muerte de las células epiteliales C4-HD. Nuevamente, para realizar estos experimentos aislamos células epiteliales tumorales de cultivos primarios C4-HD y las sembramos sobre una fina capa de Matrigel. Luego de dos días de cultivo, las células epiteliales fueron tratadas con MFP, WORT o una combinación de ambos por 24 horas. Como se observa en las imágenes en campo claro (Fig.I.26), en comparación al WORT el efecto proapoptótico de la MFP es más severo. Como se observa en las imágenes correspondientes a la tinción con NA-BE, y en la inmunofluorescencia para caspasa 3 activada, el tratamiento con MFP incrementa la apoptosis de manera más potente que el WORT. Es interesante señalar que a diferencia de lo que observamos in vivo, la administración de WORT no interfiere con el efecto proapoptótico de la MFP sobre las células C4-HD. Los cúmulos celulares tratados con la combinación de MFP y WORT presentan un índice apoptótico similar al que presentan los cúmulos tratados únicamente con MFP. Además, en estas condiciones de cultivo, por inmunofluorescencia para el marcador Ki67 no detectamos diferencias en cuanto a la proliferación de las células tumorales tratadas con MFP, WORT o la combinación de ambos (Fig.I.26).

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Figura I.26: Efecto del tratamiento con MFP, WORT, o del tratamiento combinado MFP+WORT sobre la proliferación y

la apoptosis de cultivos primarios C4-HD creciendo en Matrigel. Cultivos primarios de células epiteliales C4-HD fueron sembrados sobre una fina capa de Matrigel. Dos días después de realizado el cultivo, las células fueron tratadas durante 24 horas con MFP (10 nM), WORT (1μM), una combinación de ambos (en las dosis especificadas) o vehículo a modo de control. A: Imágenes en campo claro representativas de cúmulos C4-HD sometidos a los distintos tratamientos experimentales. Las flechas indican células desprendidas, o en proceso de desprendimiento. B: Imágenes representativas de cúmulos pertenecientes a los distintos grupos experimentales teñidos con NA-BE. C: Índice apoptótico expresado como en la Figura I.24. D y F: Imágenes representativas de cúmulos celulares pertenecientes a cada grupo experimental analizados por inmunofluorescencia para caspasa 3 activada (D) y Ki67 (F), ambos en verde. En rojo se observan los núcleos teñidos con IP. E: Índice Ki67 expresado como en la Figura I.24. Barra 100 μm. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, **p<0,01;*** p<0,001. n=4 en cada grupo experimental.

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En resumen, el sistema de cultivo en Matrigel permitió analizar ex vivo, la respuesta directa de células epiteliales C4-HD a diversos agentes antitumorales. Utilizando este sistema verificamos la superioridad del tratamiento con el antiprogestágeno MFP tanto en la inducción de apoptosis como en la inhibición de la proliferación celular, en comparación al tratamiento con los antagonistas del ER, ICI y TAM y del inhibidor de PI3K, WORT.

La utilidad de este sistema, como herramienta para analizar la respuesta celular aislada del efecto del microambiente tumoral, quedó evidenciada en el caso de la terapia combinada MFP+WORT. De manera aislada, las células tumorales C4-HD responden de forma similar al tratamiento con MFP o con MFP+WORT, mostrando un incremento en la apoptosis y un descenso en la mitosis. En el experimento in vivo por el contrario, la administración de WORT interfiere en la apoptosis inducida por MFP, probablemente alterando el microambiente tumoral. Estos resultados sugieren que el efecto antitumoral de la MFP que se observa in vivo es el resultado final del efecto proapoptótico directo de la droga sobre las células epiteliales y del efecto inductor de la reacción estromal sobre el microambiente tumoral.

Conforme con esto, los CAFs C4-HD aislados parecerían ser refractarios al efecto de la MFP, lo cual indicaría que para ocurrir la reacción estromal, fibroblastos periféricos al tumor u otros componentes del microambiente tumoral, deben entrar en juego en este proceso.

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ANEXO CAPÍTULO I

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Tabla I. 1: Selección de genes regulados en los tumores C4-HD tratados con MFP por 48 horas.

Genes regulados positivamente en los tumores C4-HD tratados con MFP por 48 horas, agrupados de acuerdo a funciones celulares reportadas.

Veces de cambio Gen Descripción

Angiogénesis

2,05 Ang1 angiogenin, ribonuclease A family, member 1 1,60 motl2 angiomotin like 2 5,55 Nrp1 neuropilin 1 7,52 Lipg lipase, endotelial 3,06 Efnb2 ephrin B2

Respuesta inmune e inflamatoria

11,42 Cd36 CD36 antigen 3,06 Cd44 CD44 antigen 2,26 Cd44 CD44 antigen 2,57 Cd47 CD47 antigen (Rh-related antigen, integrin-associated signal transducer) 2,12 Cd97 CD97 antigen 8,63 Ccl3 chemokine (C-C motif) ligand 3 3,98 Ccl9 chemokine (C-C motif) ligand 9 4,89 Cxcl15 chemokine (C-X-C motif) ligand 15 2,93 Cxcl9 chemokine (C-X-C motif) ligand 9 3,14 Csf2rb2 colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage) 4,13 Ebf1 Early B-cell factor 1 (Ebf1), Mrna 2,86 Ebf3 early B-cell factor 3 4,28 Elmo2 engulfment and cell motility 1, ced-12 homolog (C. elegans) 1,80 Gcap14 granule cell antiserum positive 14 1,56 Gcap8 granule cell antiserum positive 8 4,06 Il4ra interleukin 4 receptor, alpha 6,02 Il7r interleukin 7 receptor 1,86 Ly96 lymphocyte antigen 96 1,71 Mpa2 macrophage activation 2 ; similar to guanylate binding protein

11,80 Clec4e C-type lectin domain family 4, member e 4,63 Clec4n C-type lectin domain family 4, member n 2,33 Clec1a C-type lectin domain family 1, member a 1,64 Clec1a C-type lectin domain family 1, member a 3,56 Clec4a2 C-type lectin domain family 4, member a2 1,86 Klra5 killer cell lectin-like receptor, subfamily A, member 5

13,57 Ela2 elastase 2

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Cascada de coagulación

2,06 F2r coagulation factor II (thrombin) receptor 1,87 Capn2 Calpain 2 (Capn2), mRNA

Factores de crecimiento celular

2,20 Tgfb2 transforming growth factor, beta 2 2,48 Fgf18 fibroblast growth factor 18 2,97 Hgf hepatocyte growth factor 4,35 Ngfb nerve growth factor, beta

Apoptosis

2,10 Bcl2l11 BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) 1,57 Cflar CASP8 and FADD-like apoptosis regulator

Remodelación de la matriz extracelular

2,39 Lamb1-1 laminin B1 subunit 1 1,64 Lepre1 leprecan 1 2,16 Fbn2 fibrillin 2 3,16 Fmod Fibromodulin 3,35 Col6a1 procollagen, type VI, alpha 1 3,02 Col6a2 procollagen, type VI, alpha 2 3,27 Col11a1 procollagen, type XI, alpha 1 2,15 Col18a1 procollagen, type XVIII, alpha 1 2,65 Timp2 tissue inhibitor of metalloproteinase 2 2,50 Timp2 tissue inhibitor of metalloproteinase 2 5,25 Timp3 tissue inhibitor of metalloproteinase 3 3,55 Timp3 tissue inhibitor of metalloproteinase 3 7,25 Mmp8 matrix metallopeptidase 8

3,29 Adamts12 a disintegrin-like and metallopeptidase (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif, 12

2,72 Adamts5 a disintegrin-like and metallopeptidase (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif, 5 (aggrecanase-2)

Selección de genes regulados negativamente en los tumores C4-HD tratados con MFP por 48 horas, agrupados de acuerdo a funciones celulares reportadas.


Ciclo celular

1,68 Ccna2 cyclin A2 3,43 Ccnb1 cyclin B1, related sequence 1 ; cyclin B1 1,53 Ccne1 cyclin E1

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1,78 Ccne1 cyclin E1 2,61 Ccnh cyclin H 2,29 Ccnt2 cyclin T2 1,83 Cdk4 cyclin-dependent kinase 4 1,71 Cdk4 cyclin-dependent kinase 4 1,70 Ccar1 cell division cycle and apoptosis regulator 1 2,60 Ccar1 cell division cycle and apoptosis regulator 1 1,70 Cdca5 cell division cycle associated 5 2,45 Cdca7l cell division cycle associated 7 like 3,98 Cdca8 cell division cycle associated 8 1,70 Cdc14a CDC14 cell division cycle 14 homolog A (S. cerevisiae) 2,60 Cdc14a CDC14 cell division cycle 14 homolog A (S. cerevisiae), mRNA

Tabla I. 2: Selección de genes regulados en los tumores C4-HD tratados con MFP por 24 horas.

Selección de genes regulados positivamente en los tumores C4-HD tratados con MFP por 24 horas, agrupados de acuerdo a funciones celulares reportadas.


Angiogénesis 21,36 Ang1 angiogenin, ribonuclease A family, member 1 6,72 Vcam1 vascular cell adhesion molecule 1 2,29 Edg8 endothelial differentiation, sphingolipid G-protein-coupled receptor, 8

Respuesta immune e inflamatoria

11,22 Cd1d1 CD1d1 antigen 2,28 Cd244 CD244 natural killer cell receptor 2B4 1,82 Cd44 CD44 antigen 3,03 Cd47 CD47 antigen (Rh-related antigen, integrin-associated signal transducer) 2,60 Ccl4 chemokine (C-C motif) ligand 4 2,74 Ly6d lymphocyte antigen 6 complex, locus D 2,64 Mmd monocyte to macrophage differentiation-associated 1,93 Gcap14 granule cell antiserum positive 14

Cascada de coagulación

7,05 F2 coagulation factor II 8,12 F5 coagulation factor V 3,12 F12 coagulation factor XII (Hageman factor) 6,39 Fgb fibrinogen, B beta polypeptide 5,48 Fgg fibrinogen, gamma polypeptide

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Factores de crecimiento celular

2,33 Fgf2 fibroblast growth factor 2 12,01 Igf1 insulin-like growth factor 1 1,95 Bcl2l11 BCL2-like 11 (apoptosis facilitator)

Apoptosis

1,73 Bcl2l11 BCL2-like 11 (apoptosis facilitator), transcript variant 1, mRNA 2,34 Bcl2l14 Bcl2-like 14 (apoptosis facilitator) 2,04 Cflar CASP8 and FADD-like apoptosis regulator 2,25 Casp1 caspase 1 4,69 Casp12 caspase 12

Remodelación de la matriz extracelular

2,50 Mmp14 matrix metallopeptidase 14 (membrane-inserted) 1,99 Mxra8 matrix-remodelling associated 8

Selección de genes regulados negativamente en los tumores C4-HD tratados con MFP por 24 horas, agrupados de acuerdo a funciones celulares reportadas.


Ciclo Celular 4,94 Cdc20 cell division cycle 20 homolog (S. cerevisiae) 6,05 Cdc7 cell division cycle 7 (S. cerevisiae) 1,59 Ccar1 cell division cycle and apoptosis regulator 1 6,50 Cdca2 cell division cycle associated 2 2,52 Cdca3 cell division cycle associated 3 2,07 Cdca4 cell division cycle associated 4 4,72 Cdca5 cell division cycle associated 5 7,17 Cdca8 cell division cycle associated 8 5,50 Ccnb1 cyclin B1, related sequence 1 ; cyclin B1 2,21 Ccnd1 cyclin D1 2,00 Ccne1 cyclin E1 1,79 Ccnf cyclin F 2,82 Ccnh cyclin H 1,62 Cnnm3 Cyclin M3 (Cnnm3), mRNA 1,86 Ccnt2 cyclin T2 1,71 Cdk4 cyclin-dependent kinase 4 2,98 Ccnb1 cyclin B1

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CAPÍTULO II

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CAPITULO II: TUMOR HORMONO-INDEPENDIENTE C4-HI

II.A. ANTECEDENTES

La variante tumoral C4-HI se originó hace varios años en el laboratorio, durante los procedimientos de rutina para chequear la dependencia hormonal de la variante C4-HD (revisado en Lanari et al., 2009). Para verificar la dependencia hormonal de las variantes hormono-dependientes, los tumores son trasplantados en hembras vírgenes BALB/c tratadas o no con MPA. Las variantes hormono-dependientes son incapaces de crecer en animales no tratados, sin embargo ocasionalmente algunos tumores comienzan a crecer en ausencia del MPA. En este punto se considera que la variante en cuestión se ha convertido en un tumor hormono-independiente y empieza a mantenerse por medio del trasplante singeneico a ratones no tratados con MPA.

Los tumores C4-HI están compuestos por grupos cohesivos de células epiteliales rodeados por escaso estroma de tipo fibroblástico. A diferencia de los tumores C4-HD, el parénquima presenta estructuras de tipo glandular, por lo que se dice que el tumor presenta un mayor grado de diferenciación (Fig.II.1).

Trabajos previos realizados en el laboratorio demostraron que las variantes hormono-independientes como la C4-HI, responden al tratamiento endócrino con antagonistas del PR como la MFP, a antagonistas del ER TAM e ICI y con 17-β-estradiol (Wargon et al., 2009), (Soldati et al., 2010), (Cerliani et al., 2011). Como mencionamos en el Capítulo I, el tratamiento hormonal conduce a la rápida desaparición de los tumores C4-HD. En el caso de los tumores C4-HI la respuesta es más lenta, y aún luego de tratamientos prolongados la masa tumoral no se reduce totalmente (al menos en los pasajes con los cuales trabajamos en esta Tesis doctoral).

Publicaciones previas del laboratorio han analizado los fenómenos asociados a la respuesta luego del tratamiento antitumoral. Wargon y colaboradores (Wargon et al., 2009) demostraron que el tratamiento con MFP o con 17-β-estradiol induce en los tumores C4-HI una regresión significativa. Los cambios asociados al proceso de regresión comienzan a manifestarse tempranamente, de manera que es posible detectar alteraciones en la histología de los tumores luego de 48 horas de administradas las drogas. En respuesta a los tratamientos mencionados, en el parénquima tumoral se observa una mayor formación de estructuras de tipo glandular, es decir que incrementa el grado de diferenciación (Fig.II.1). En el caso de la MFP, este fenómeno se encuentra asociado a una reducción significativa en el índice mitótico, no así en el índice apoptótico tumoral (Wargon et al., 2009).

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Con respecto al efecto del 17-β-estradiol, se ha demostrado que luego de 48 horas de tratamiento tanto el índice mitótico como apoptótico aumentan en el parénquima tumoral (Soldati et al., 2010). Este fenómeno está acompañado por un incremento en la proteína proapoptótica Bax y una disminución en las proteínas antiapoptóticas Bcl-XL y Bcl-2. Asimismo la expresión del factor inductor de apoptosis Aif, y de la caspasa 9 activada se encuentran elevadas luego del tratamiento (Soldati et al., 2010). En otras variantes hormono-independientes del modelo experimental inducido con MPA también se ha verificado que la caída en el índice mitótico y el aumento en el índice apoptótico están acompañados por un incremento en las proteínas regulatorias del ciclo celular p21, p27 y p53 (Vanzulli et al., 2002), (Vanzulli et al., 2005),.

Figura II.1: Regresión tumoral en la variante C4-HI. Izquierda: Los experimentos de regresión fueron realizados con tumores C4-HI de un tamaño aproximado de 50 mm2. La administración de 17-β-estradiol (E2 en la figura) se realizó mediante la aplicación de un pellet subcutáneo de 5mg. El tratamiento con MFP (RU en la figura) se realizó diariamente, por medio de inyecciones subcutáneas de 12mg/kg de peso corporal. Se determinó el largo y el ancho de los tumores y el área tumoral resultante fue graficada en función del tiempo. Derecha: Cortes histológicos de tumores C4-HI tratados con MFP (RU en la figura) o vehículo (control) durante 48 horas, fueron teñidos con hematoxilina/eosina. En el grupo control se observan numerosas estructuras de tipo glandular, y luego del tratamiento con MFP el grado de diferenciación tisular del tejido se incrementa. Extraído de Wargon et al, 2009.

Recientemente, hemos demostrado que los tumores C4-HI presentan una mayor activación

de la vía PI3K/Akt en comparación con los tumores C4-HD (Polo et al., 2010), (Riggio et al., 2012). Cuando los tumores C4-HI son tratados con el inhibidor de PI3K LY294002 o el inhibidor de mTOR rapamicina, el crecimiento tumoral se ve afectado significativamente, no así al tratar los tumores C4-HD (Polo et al., 2010), (Riggio et al., 2012).

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Entonces, el objetivo general de este capítulo fue analizar mecanismos celulares y moleculares asociados a la regresión temprana de la variante C4-HI luego del tratamiento con diversos agentes antitumorales. Analizamos modificaciones en el parénquima y en el estroma tumoral, centrándonos principalmente en el estudio de los efectos del antiprogestágeno MFP y del inhibidor de la vía PI3K/Akt, wortmanin (WORT). Dado que resultados previos del laboratorio mostraron que en estos tumores la inhibición de la vía PI3K/Akt inhibe significativamente el crecimiento tumoral evaluamos además el posible beneficio del tratamiento conjunto MFP+WORT para estos tumores. II.B. REGRESIÓN TUMORAL TEMPRANA EN LA VARIANTE C4-HI, RESPUESTA AL TRATAMIENTO CON DIVERSOS AGENTES ANTITUMORALES.

En primer lugar nos propusimos caracterizar los fenómenos de regresión asociados al tratamiento con el antiprogestágeno MFP, los antagonistas ICI y TAM y el inhibidor de la quinasa PI3K WORT en tumores C4-HI. Dado que los cambios tisulares asociados al proceso de regresión comienzan a manifestarse tempranamente, para realizar dichos estudios se llevaron a cabo tratamientos de 48 horas de duración. Para los experimentos se utilizaron hembras vírgenes BALB/c portadoras de tumores C4-HI de un tamaño aproximado de 50 mm2, a los que se trató con MFP, TAM, ICI, WORT o vehículo a modo de control (Fig.II.2). Al finalizar los tratamientos, los ratones fueron sacrificados y los tumores se conservaron en formaldehido al 4% o a -80˚C.

Figura II.2: Diseño experimental. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de 50 mm2 se inició el experimento. La administración de fulvestrant (ICI) se realizó mediante la aplicación de un depot subcutáneo de 5 mg. Los tratamientos con tamoxifeno (TAM) y mifepristona (MFP) se realizaron por medio de inyecciones subcutáneas de 10 mg/kg y 12 mg/kg de peso corporal, respectivamente. La administración de wortmanin (WORT), se realizó por medio de inyecciones intraperitoneales de

102

1 mg/kg de peso corporal. Todos los tratamientos se extendieron por 48 horas, renovándose las dosis de cada tratamiento (con excepción de ICI) a las 24 horas, y una hora antes de sacrificar a los animales.

Al medir los tamaños finales de los tumores pertenecientes a cada grupo experimental, comprobamos que en comparación con el grupo control, el crecimiento de los tumores tratados se vio significativamente inhibido (Fig.II.3). Considerando que el tamaño inicial de todos los grupos era de 50 mm2, los tumores del grupo control crecieron al cabo de las 48 horas, mientras que en el resto de los grupos experimentales el crecimiento tumoral se detuvo.

Figura II.3: Tamaño tumoral final en función del tratamiento endocrino (ICI,

TAM o MFP), y de la inhibición de PI3K (WORT). Al cabo de 48 horas de iniciados los tratamientos se determinó el largo y el ancho de los tumores de cada grupo experimental, y se graficó el área tumoral resultante. n=4 en cada grupo experimental. El análisis estadístico de los datos se realizó por un ANOVA seguido de Test de Tukey, ** p<0,01 respecto al control (vehículo).

Para comprobar que los tratamientos ensayados ejercieran el efecto esperado, evaluamos la expresión de los receptores hormonales ER y PR, y el estado de activación de la vía PI3K/Akt (Fig.II.4). Como se observa en la figura, los antagonistas del ER produjeron los efectos descriptos en la literatura y en el Capítulo I (Fig.I.4). Analizando el parénquima tumoral remanente, observamos que la administración de ICI disminuyó notablemente la expresión del ER mientras que el TAM, al actuar como un agonista parcial, la aumentó. Por otro lado, la determinación del PR por inmunohistoquímica, no evidenció diferencias significativas entre los grupos control y MFP. Sin embargo al realizar western blots con extractos proteicos totales de dichos tumores, observamos en el caso de la MFP, bandas con una movilidad electroforética retardada por encima de las isoformas A y B del PR (Fig.II.4 B). Este fenómeno ha sido descripto anteriormente en el laboratorio (Wargon et al., 2009) y al menos en los tiempos evaluados, no se observa en la variante tumoral C4-HD (Fig.I.10).

En los tumores C4-HI la determinación de Akt fosforilada por inmunohistoquímica mostró una clara localización nuclear (Fig.II.4 A). En esta figura también es posible observar, que el tratamiento con WORT disminuyó efectivamente la fosforilación de dicha proteína. Por el contrario, y llamativamente, la administración de MFP indujo en el parénquima tumoral un fuerte aumento en

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la intensidad de la marca para Akt fosforilada. Estos últimos resultados fueron corroborados además mediante western blot (Fig.II.4 B).

Figura II.4: Análisis de la expresión de los receptores hormonales (ER y PR), y del estado de activación de la vía

PI3K/Akt, en función del tratamiento endocrino (ICI, TAM o MFP) y de la inhibición de PI3K (WORT). A: Imágenes

representativas de cortes histológicos de tumores pertenecientes a los distintos grupos experimentales, analizados por inmunohistoquímica para ER, PR, y Akt en su forma fosforilada. Los anticuerpos utilizados reconocen específicamente la isoforma alfa del ER (ERα), las isoformas A y B del PR (PRA y PRB) y la quinasa Akt fosforilada en el residuo serina 473. Los núcleos celulares fueron contrateñidos de azul con hematoxilina. Barra: 50 µm. B: Imágenes representativas de western blots realizados a partir de extractos proteicos totales de tumores tratados con MFP, WORT o solución fisiológica a modo de control, revelados con anticuerpos para pSer473AKT, PR (PRA y PRB) y ERK1/2, este último como control de carga. Las

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bandas obtenidas fueron cuantificadas con el programa Image J y se graficó la relación pAkt/Akt total. El análisis estadístico se realizó por medio de un ANOVA seguido de un test de Dunnet, *p<0,05.

Como mostramos anteriormente (Fig.II.3), el crecimiento tumoral fue inhibido de forma

similar por los distintos tratamientos. Sin embargo, a nivel histológico se observaron diferencias notables. Tal como mencionamos, los tumores C4-HI son carcinomas ductales semidiferenciados. Al cabo de 48 horas de tratamiento con ICI, TAM, MFP o WORT se observa una mayor cantidad de estructuras de tipo glandular. Sin embargo, como se observa en las hematoxilinas/eosinas (Fig. II.5) los tratamientos con MFP y con WORT indujeron los cambios más significativos. En las imágenes correspondientes a inmunohistoquímicas para las proteínas de adhesión y polarización, integrina β1 y MUC-1, (Fig.II.6) confirmamos la característica ductal de este tumor. El análisis del marcador de fibroblastos activados α-SMA mostró (Fig.II.6) que la expansión y la invasión del compartimiento estromal acompañan la remodelación del parénquima tumoral.

Figura II.5: Remodelación tisular en función del tratamiento endocrino (ICI, TAM o MFP) y de la inhibición

de PI3K (WORT). Imágenes representativas de cortes histológicos de tumores de cada grupo experimental,

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teñidos con hematoxilina/eosina. Como se observa en las imágenes, pueden distinguirse dos compartimientos; el parénquima tumoral (flecha) compuesto por las células epiteliales tumorales y el estroma tumoral (punta de flecha), formado principalmente por fibroblastos. Los asteriscos en el parénquima tumoral señalan estructuras de tipo ductal que incrementan su número luego del tratamiento con MFP o con WORT.

Figura II. 6: Análisis de la expresión de proteínas de adhesión y polarización epitelial, junto con el marcador α-SMA

en los grupos control, MFP y WORT. Imágenes representativas de cortes histológicos de tumores pertenecientes a los distintos grupos experimentales, analizados por H/E (detalle de figura anterior) e inmunohistoquímica para integrina β1 (INT β1), MUC-1 y α-SMA. Los núcleos celulares fueron contrateñidos de azul con hematoxilina. Barra 50 m.

Por otro lado, al analizar las hematoxilinas/eosinas correspondientes a cada grupo

experimental, observamos que si bien todos los tratamientos disminuyeron significativamente el número de células mitóticas (Fig.II.7), únicamente WORT fue capaz de inducir un incremento en el índice apoptótico tumoral (Fig.II.7). En los tumores tratados con WORT además, es posible visualizar algunas áreas necróticas (no mostrado).

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Figura II.7: Supervivencia y muerte celular en función del tratamiento endocrino (ICI, TAM o MFP) y de la inhibición

de PI3K (WORT). Índice mitótico (izquierda) y apoptótico (derecha) expresados como la media ± SEM de la proporción de células mitóticas o apoptóticas /células totales en el parénquima de los tumores de cada grupo experimental. La proporción de células mitóticas/células totales en cada tumor es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Tukey, **p<0,01; *** p<0,001.

Teniendo en cuenta que el incremento en la diferenciación glandular del tejido tumoral fue

observada en distinto grado en todos los tratamientos utilizados (Fig.II.5), y lo mismo ocurre luego del tratamiento con 17-β-estradiol (Wargon et al., 2009), nos preguntamos si dicho fenómeno podría tratarse de un mecanismo de regresión característico de la variante C4-HI. Para descartar que los tratamientos hormonales, y que la inhibición de la vía PI3K/Akt compartieran un mecanismo de acción común que lleve a la diferenciación del tejido C4-HI, estudiamos la respuesta tumoral frente a un agente quimioterapéutico con otro mecanismo de acción diferente. El agente elegido fue doxorrubicina (DOXO), una antraciclina que al intercalarse en el ADN interfiere con la enzima topoisomerasa II, y con la progresión de la replicación celular (Thorn et al., 2011).

Para realizar el experimento se utilizaron hembras vírgenes BALB/c portadoras de tumores C4-HI de un tamaño aproximado de 50 mm2. Los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con DOXO o solución fisiológica a modo de control (Fig.II.8). Al cabo de 96 horas, los ratones fueron sacrificados y los tumores se conservaron en formaldehido al 4%.

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Figura II.8: Diseño experimental. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de 50 mm2 se inició el experimento. La administración de Doxorrubicina (DOXO) se realizó mediante la aplicación de una inyección intravenosa de 4,5 mg/kg de peso corporal, mientras que los animales control fueron inyectados subcutáneamente con solución fisiológica (vehículo).

A lo largo del experimento pudimos observar que mientras que los tumores del grupo

control crecían, los tumores tratados con DOXO detenían su crecimiento, e incluso algunos reducían su tamaño. Al comparar los tamaños tumorales finales de cada grupo experimental encontramos que la administración de DOXO tuvo un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de los tumores C4-HI (Fig.II.9).

0 1 2 3 40

50

100

150

200control

DOXO

***

Días

Ta

ma

ño

tu

mo

ral (m

m2)

Figura. II.9: Crecimiento tumoral en respuesta al tratamiento con DOXO. Una vez que los tumores C4-HI alcanzaron un tamaño de 50 mm2, los ratones fueron inoculados por vía intravenosa con DOXO o solución fisiológica a modo de control. Se determinó el largo y el ancho de los tumores, y el área tumoral resultante fue graficada en función del tiempo. Luego de 96 horas de inoculados, los ratones fueron sacrificados. n=4 en cada grupo experimental. El análisis estadístico fue realizado por medio de un ANOVA de medidas repetidas. ***p<0,001.

El análisis histológico de tumores C4-HI mostró en primer lugar que el tratamiento con DOXO indujo una fuerte caída en el índice mitótico así como también un aumento en el número de

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células apoptóticas y de áreas necróticas (Fig.II.10 B y C). Por otro lado, pudimos comprobar que el parénquima de los tumores en regresión mostraba signos de diferenciación glandular incrementada, similar a lo observado en el caso del tratamiento con MFP o WORT durante 48 horas (Fig.II.10 A). El análisis de proteínas de adhesión y de polarización epitelial E-caderina (E-CAD), MUC-1 e integrina β1 (Fig.II.10 D) nos permitió corroborar la característica ductal de estas estructuras glandulares. Asimismo, al igual que en el caso de los tratamientos endocrinos o de la inhibición de la vía PI3K/Akt, la regresión tumoral por DOXO se vio acompañada por un aumento en la abundancia de estroma tumoral. Este fenómeno se evidencia con la inmunohistoquímica para el marcador α-SMA (Fig. II.10 D).

Figura II.10: Regresión tumoral inducida por el quimioterápico DOXO. A: Imágenes representativas de cortes histológicos de los tumores de los grupos control y DOXO, teñidos con hematoxilina/eosina. B y C: Índice mitótico y apoptótico, expresados como la media ± SEM de la proporción de células mitóticas o apoptóticas/células totales en el parénquima de los tumores de cada grupo experimental. La proporción de células mitóticas/células totales en cada tumor es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). D: Imágenes representativas de cortes histológicos de tumores pertenecientes a los distintos grupos experimentales, analizados por inmunohistoquímica para E-caderina (E-CAD), MUC-1 e integrina β1 (INT β1) y α-SMA. Barra 100 um. El análisis estadístico se realizó por un t-Test, ** p<0,01 y *** p<0,001.

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Por lo presentado hasta aquí, hemos demostrado que la variante C4-HI responde de manera temprana tanto al tratamiento con antagonistas hormonales, como a la inhibición de la vía PI3K/Akt y a un agente quimioterapéutico. A las 48 horas de tratamiento, los tumores responden más efectivamente a la administración del antiprogestágeno MFP, del inhibidor de PI3K WORT y del quimioterápico DOXO. Estos tratamientos comparten la característica de inducir un fuerte efecto citostático sobre las células tumorales, y una evidente remodelación del parénquima tumoral. Los tratamientos con WORT o con DOXO además, presentan la capacidad de inducir la apoptosis de las células epiteliales C4-HI y necrosis tumoral.

El hecho que los tumores tratados con DOXO muestren una reorganización tisular similar a la obtenida con los tratamientos endocrinos y con el inhibidor de PI3K, sugiere fuertemente que el incremento en la diferenciación glandular asociada a la regresión tumoral C4-HI representa un mecanismo de regresión propio, que ocurre independientemente del tipo de tratamiento utilizado. II. C. MECANISMOS DE REGRESIÓN ASOCIADOS AL TRATAMIENTO CONJUNTO MFP Y WORT: PARÉNQUIMA TUMORAL

Como ya hemos demostrado, la administración de MFP induce la citostasis y la remodelación del tejido tumoral C4-HI, pero carece de efectos proapoptóticos y necróticos luego de 48 horas de tratamiento (Fig.II.7). WORT en cambio, es capaz de producir en estos tumores todos los efectos mencionados. En base a estas observaciones nos propusimos estudiar el efecto de la terapia combinada, es decir, la administración simultánea del inhibidor de PI3K y del antiprogestágeno MFP.

Para esto, repetimos el esquema experimental utilizado anteriormente en la sección II.A. Ratones portadores de tumores C4-HI de un tamaño aproximado de 50 mm2 fueron tratados durante 48 horas con WORT, MFP, MFP+WORT o solución fisiológica a modo de control. Al término del experimento los ratones fueron sacrificados y los tumores se conservaron en formaldehido al 4%, o a -80˚C (Fig.II.11).

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Figura II.11: Diseño experimental. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de 50 mm2 se inició el experimento. Los tratamientos con MFP y/o WORT se aplicaron diariamente, el primero en forma subcutánea en dosis de 12 mg/kg y el segundo en forma intraperitoneal en dosis de 1 mg/kg de peso corporal. Todos los tratamientos se extendieron por 48 horas, renovándose las dosis de cada tratamiento cada 24 horas Una hora después de la última inyección, los animales fueron sacrificados.

Como demostramos anteriormente, en comparación con el grupo control, el crecimiento de

los tumores C4-HI se detuvo tanto por el tratamiento con MFP como por el tratamiento con WORT. Sin embargo, cuando las drogas se administraron de forma conjunta el tamaño tumoral se redujo aproximadamente en un 20% (Fig.II.12).

Figura II.12: Tamaño tumoral final en función del

tratamiento con MFP, WORT o de la terapia

combinada MFP+WORT. Partiendo de un tamaño inicial de 50 mm2, los tumores del grupo control aumentaron su tamaño, mientras que en los grupos MFP y WORT el crecimiento tumoral se detuvo. Cuando los tratamientos se administran de forma conjunta, el tamaño de los tumores se redujo significativamente. n=4 en cada grupo experimental. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Tukey, *** p<0,001.

En la histología de los tumores, también se refleja la mayor efectividad del tratamiento

combinado. Como se observa en las hematoxilinas/eosinas (Fig.II.13), el tratamiento combinado produjo una mayor reorganización tisular, y generó grandes áreas necróticas.

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Figura. II.13: Histología tumoral en función del tratamiento con MFP, WORT o de la terapia combinada MFP+WORT. Imágenes representativas de cortes histológicos de los tumores de cada grupo experimental, teñidos con hematoxilina/eosina. Uno de los rasgos distintivos del tumor C4-HI es la diferenciación tisular, la que en menor o mayor medida se manifiesta también luego de la terapia. Es posible observar que una gran proporción (50% o más) del tejido remanente en el grupo MFP+WORT está constituido por tejido necrótico (flecha). Barra 100 µm.

Analizamos a continuación, el estado de activación de la vía PI3K/Akt en los tumores C4-HI

tratados con cada una de las drogas por separado así como también con el tratamiento combinado. Para ello estudiamos la fosforilación de Akt y S6 mediante inmunohistoquímica y western blot (Fig.II.14).

Como ya hemos demostrado en la Figura II.4, en comparación a los tumores control, el tratamiento con MFP incrementa la fosforilación de Akt en el parénquima tumoral, mientras que la administración de WORT la disminuye (Fig.II.14 A, centro, y B). Al analizar el patrón de fosforilación de S6, obtuvimos resultados similares (Fig.II.14 A, derecha y B). En el caso de la administración conjunta MFP+WORT, prevalece el efecto inhibitorio del WORT por sobre la estimulación ejercida con la MFP.

Cabe destacar que como se observa en las imágenes correspondientes a la inmunohistoquímica para S6 fosforilada (Fig.II.14 B) en todos los grupos experimentales es posible distinguir células estromales con marca citoplasmática para pS6. Esta marca citoplasmática persiste en el estroma incluso luego del tratamiento con WORT y con la terapia combinada MFP+WORT. Esta observación representaría una diferencia con respecto a los tumores C4-HD analizados en el Capítulo I, donde el tratamiento MFP+WORT inhibe pS6 en el epitelio así como también en el estroma (Fig. I.19 B).

Finalmente, cabe destacar que el tratamiento con WORT, ya sea solo en combinación con MFP, no alteró la expresión de las isoformas A y B del PR (Fig.II. 14 A, izquierda). Como mostramos en la Figura II.4, en los grupos MFP y MFP+WORT se observan las bandas con

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movilidad electroforética retardada, típicas del tratamiento con MFP. Proximamente analizaremos el estado de activación del PR luego de los tratamientos, mediante anticuerpos para las formas fosforiladas Ser190 y Ser294 que ya mostramos es afectado por inhibidores de la vía PI3K/Akt en este y en otro modelo experimental de cáncer de mama (Riggio et al., 2012).

Figura II.14: Estado de activación de la vía PI3K/Akt en función del tratamiento con MFP, WORT o de la terapia

combinada MFP+WORT. A, Izquierda: Imágenes representativas de western blots realizados a partir de extractos proteicos totales de los tumores pertenecientes a cada grupo experimental, revelados con anticuerpos anti pSer473Akt, Akt total, pSer240/244S6, S6 total, PR y ERK 1/2. Las bandas obtenidas fueron cuantificadas con el programa Image J y se graficaron las relaciones pAkt/Akt total (centro) y pS6/S6 total (derecha). B: Imágenes representativas de cortes histológicos de tumores pertenecientes a los distintos grupos experimentales, analizados por inmunohistoquímica para pSer473AKT y pSer240/244S6. Las flechas señalan los fibroblastos pS6 postivos en el estroma de los tumores C4-HI. Barra 100 μm. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Dunnet, *p<0,05; *** p<0,001.

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Al analizar el estado proliferativo del epitelio tumoral remanente, comprobamos que la coadministración de WORT fue capaz de intensificar el efecto citostático ejercido por MFP. Como se observa en la Figura II.15 A, el índice mitótico correspondiente a la terapia combinada MFP+WORT es significativamente menor al correspondiente al tratamiento sólo con MFP, o sólo con WORT. Este mismo patrón de respuesta puede observarse en una inmunohistoquímica para el marcador de proliferación Ki67 (Fig. II.15 B)

Figura II.15: Proliferación del epitelio tumoral en función del tratamiento con MFP, WORT o de la terapia combinada

MFP+WORT. A: Índice mitótico, expresado como la media ± SEM de la proporción de células mitóticas /células totales en el parénquima de los tumores de cada grupo experimental. La proporción de células mitóticas/células totales en cada tumor es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). B: Imágenes representativas de cortes

histológicos de cada grupo experimental, analizados por inmunohistoquímica para el marcador Ki67. Barra 50 m. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, * p<0,05, **p<0,01 y *** p<0,001.

En las células epiteliales mamarias, los estrógenos y la progesterona regulan la progresión del ciclo celular a través de la regulación transcripcional de genes claves como c-Fos, c-Jun, c-Myc y ciclinas, en particular la ciclina D1 (Musgrove et al., 1993), (Cicatiello et al., 2004). A continuación analizamos mediante western blot e inmunohistoquímica la expresión de c-Myc y ciclina D1 en los tumores de cada grupo experimental (Fig.II.16). En dicha Figura podemos observar que la disminución de la proliferación celular inducida por MFP o WORT está acompañada por una disminución en la expresión de c-Myc y ciclina D1. En el caso de la terapia combinada la regulación es máxima, y en comparación al tratamiento con MFP, los tumores tratados con MFP+WORT presentan niveles de expresión de c-Myc y ciclina D1 significativamente menores (Fig.II.16 A y B).

Los resultados anteriores fueron confirmados por inmunohistoquímica (Fig.II.16 C). Por esta técnica además pudimos detectar un cambio en la localización subcelular de c-Myc. Mientras que en el grupo control c-Myc presenta localización nuclear, en los tumores tratados con MFP o WORT se observa una localización mixta, ya que grandes áreas tumorales presentan marca

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citoplasmática para dicha proteína. En el caso de la terapia combinada la localización subcelular de c-Myc es exclusivamente citoplasmática. En relación a estos resultados, existen antecedentes que vinculan la localización de c-Myc con el estado fisiológico celular. En fibroblastos deprivados de suero, Vriz y colaboradores (Vriz et al., 1992) demostraron que c-Myc se acumula en el citoplasma. Sin embargo en respuesta a la estimulación con suero se observa una rápida translocación al núcleo celular (Vriz et al., 1992).

Figura II.16: Expresión de las proteínas regulatorias del ciclo celular ciclina D1 y c-Myc en función del tratamiento

con MFP, WORT o de la terapia combinada MFP+WORT. A y B: Imágenes representativas de western blots realizados a partir de extractos proteicos totales de los tumores de cada grupo experimental, revelados con anticuerpos para ciclina D1 (CD1), c-Myc (MYC) y ERK1/2 como control de carga. Las bandas obtenidas se cuantificaron con el programa Image J, y se graficó la relación CD1/ ERK1/2 y MYC/ERK1/2. C: Imágenes representativas de cortes histológicos de cada grupo

experimental analizados por inmunohistoquímica para CD1 y c-Myc. Barra 50 m. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, * p<0,05, **p<0,01 y *** p<0,001.

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Para analizar el efecto de las drogas sobre la supervivencia celular, determinamos en

primer lugar el número de células apoptóticas en cada uno de los grupos experimentales C4-HI (Fig.II.17 A). Como demostramos previamente (Fig.II.7), el tratamiento con MFP por 48 horas no indujo apoptosis del epitelio tumoral. En cambio, el índice apoptótico fue incrementado significativamente por el tratamiento con WORT. Cuando las drogas fueron administradas conjuntamente, el índice apoptótico fue significativamente mayor en comparación a cada uno de los tratamientos por separado (Fig.II.17 A). Estos resultados fueron confirmados con una inmunohistoquímica para las proteínas involucradas en la regulación del fenómeno apoptótico, Bax, Aif y Bcl-Xl (Fig.II.17 B). Como se ve en la Figura, la intensidad de la marca correspondiente a las proteínas proapoptóticas Bax y Aif es mayor en los tratamientos WORT y MFP+WORT. En el caso de Bcl-Xl se observa lo contrario.

Además de ejercer un fuerte efecto proapoptótico, el tratamiento con WORT indujo en los tumores C4-HI la necrosis de algunas áreas del parénquima tumoral. Dicho efecto se vio intensificado en el caso del tratamiento combinado MFP+WORT. Al cuantificar el área correspondiente al parénquima necrosado en relación al área tumoral total, podemos observar que los tumores tratados con la terapia combinada poseen un área necrótica significativamente mayor que los tumores a los que se les administró solamente WORT (Fig.II.17 C).

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Figura II.17: Supervivencia celular en función del tratamiento con MFP, WORT o de la terapia combinada

MFP+WORT. A: Índice apoptótico, expresado como la media ± SEM de la proporción de células apoptóticas /células totales en el parénquima de los tumores C4-HI de cada grupo experimental. La proporción de células apoptóticas/células totales en cada tumor es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). B: Imágenes representativas de cortes histológicos de tumores pertenecientes a cada grupo experimental, analizados por inmunohistoquímicas para las proteínas proapoptóticas Bax y Aif, y la proteína antiapoptótica Bcl-Xl. C, Izquierda: Índice necrótico expresado como la media ± SEM de la proporción de área necrótica/parénquima tumoral total en cada uno de los tumores de los distintos grupos experimentales. Derecha: Imágenes representativas de fotos ensambladas sobre cortes

tumorales totales teñidos con hematoxilinas/eosina, en donde se observan áreas necróticas en color rosa. Barra 50m. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, *p<0,05, ** p<0,01 y *** p<0,001.

Por lo que demostramos hasta aquí, en comparación a los tratamientos por separado, la

combinación de MFP y WORT resultó ser más efectiva en la inducción de los fenómenos que inician la regresión de los tumores C4-HI. La mayor eficacia antitumoral se debe por un lado, a la intensificación del efecto citostático que presentan tanto MFP como WORT de manera individual.

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Por otra parte, la administración de WORT provoca un efecto apoptótico y necrótico sobre el parénquima tumoral.

Como ha sido ampliamente descripto, la vía PI3K/Akt regula entre otras funciones la supervivencia celular y la apoptosis. En el caso del tratamiento con WORT o de la terapia combinada, los bajos niveles de activación de dicha vía correlacionan con el descenso en la proliferación celular y el incremento en la apoptosis y en la necrosis tumoral. En los tumores tratados con MFP en cambio, la vía PI3K/Akt se encuentra activa. En este último caso, si bien se registra un fuerte efecto citostático, no hay un aumento de la apoptosis ni necrosis con respecto a los tumores control. Por ende, la inhibición de la proliferación celular mediada por el antiprogestágeno MFP ocurriría por mecanismos propios que no involucran la inactivación de la vía PI3K/Akt. Estos efectos, sumados a los derivados de la inhibición de la señalización PI3K/Akt con WORT darían como resultado en el tratamiento combinado, el beneficio de un mayor efecto antitumoral. II. D. MECANISMOS DE REGRESIÓN ASOCIADOS AL TRATAMIENTO CONJUNTO MFP Y WORT: ESTROMA TUMORAL

Al igual que en los tumores C4-HD, la regresión en los tumores C4-HI involucra la participación del estroma tumoral. Como mencionamos anteriormente, se pudo evidenciar una

mayor reactividad para -SMA en el estroma luego de los tratamientos endócrinos, de la inhibición de la vía PI3K/Akt (Fig.II.6) e incluso luego del tratamiento con DOXO (Fig.II.10).

En el siguiente experimento, luego de cuantificar el área ocupada por el estroma tumoral comprobamos que efectivamente tanto MFP como WORT, así como también el tratamiento combinado, indujeron un incremento significativo en el área estromal (Fig.II.18 A). En los tumores tratados con la terapia combinada, donde la regresión fue máxima, el estroma tumoral ocupa el doble del área en comparación a los tumores del grupo control. Como se ve en la Figura II.18 B, el estroma en regresión es rico en proteínas de matriz como laminina 1 y presenta mayor proporción de fibroblastos activados, positivos para el marcador α-SMA. Asimismo, los tumores tratados con MFP+WORT presentan una mayor cantidad de focos de células positivas para el marcador CD31, comparado con los tumores control e incluso a los distintos tratamientos por separado (Fig.II.18 C).

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Figura II.18: Remodelación tisular en función del tratamiento con MFP, WORT o de la terapia combinada MFP+WORT.

A: Índice estromal expresado como la media ± SEM de la proporción de área estromal/área tumoral total correspondiente a cada grupo experimental. B, Arriba: Imágenes representativas de cortes histológicos de tumores pertenecientes a los distintos grupos experimentales analizados por una inmunohistoquímica para el marcador α-SMA. En azul se observan los

núcleos celulares contrateñidos con hematoxilina. Abajo: Secciones tumorales de 18 m de espesor fueron utilizadas para realizar una inmunofluorescencia para laminina 1 (LAM 1). C, Izquierda: Índice CD31 expresado como la media ± SEM del número de focos CD31 positivos por campo de bajo aumento (200X), en cada grupo experimental. Derecha: Imágenes representativas de una inmunofluorescencia para el marcador de células endoteliales, CD31. En rojo se observan los núcleos

celulares teñidos con IP. Barra 50 m. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, *p<0,05, ** p<0,01 y *** p<0,001.

Estos últimos resultados constituyen una diferencia notable con respecto a lo observado en

los tumores C4-HD en el Capítulo I luego de la terapia combinada con MFP+WORT. En el caso de la variante C4-HI la inhibición de la vía PI3K/AKT con WORT no solo no interfiere con la reacción estromal inducida con MFP, sino que la intensifica. Como hemos demostrado, en los tumores C4-HI tratados con la terapia combinada MFP+WORT se observa una mayor proporción de estroma tumoral y junto con esto, una mayor cantidad de vasos sanguíneos. Es probable que este

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comportamiento diferencial responda a la existencia de mecanismos que regulan la expansión e invasión del estroma tumoral particular a cada variante tumoral.

En resumen, además de incrementar el efecto antitumoral en el parénquima, la incorporación de WORT al tratamiento con MFP incrementó la reacción estromal y la neovasculatura tumoral asociadas a la regresión de los tumores C4-HI. Este efecto es contrario a lo observado en los tumores C4-HD, donde la inhibición de la vía PI3K/Akt afecta el desarrollo de la reacción estromal e interfiere con la regresión tumoral. Al analizar el comportamiento del estroma en los tumores C4-HI y C4-HD sometidos a los distintos tratamientos, podemos postular entonces, que en ambas variantes tumorales, la reacción estromal temprana refleja la efectividad de la terapia utilizada en inducir la regresión tumoral. II. E. ESTUDIO IN VITRO DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO CON LOS ANTAGONISTAS HORMONALES TAM y MFP, y DEL INHIBIDOR DE PI3K WORT.

Finalmente nos propusimos evaluar el efecto de los distintos tratamientos sobre las células epiteliales C4-HI aisladas. Como mencionamos en el capítulo anterior, elegimos un sistema de cultivo tridimensional en Matrigel para poder preservar de esta manera la capacidad de las células epiteliales de adherirse entre sí y con la matriz extracelular. En estas condiciones los cultivos de células C4-HI se disponen formando cúmulos celulares de aproximadamente 100 μm de diámetro. Una gran proporción de estos cúmulos desarrollan un lumen central, que recapitula las estructuras ductales que presentan los tumores in vivo (Fig.II.5). Por medio del análisis por inmunofluorescencia de las proteínas E-caderina (E-CAD), MUC-1, integrina α6 (INT α6) y laminina 1 (LAM 1) (Fig.II.19), pudimos determinar que las células epiteliales C4-HI se organizan formando estructuras polarizadas, con una localización lateral de E-caderina, apical de MUC-1 y basal de laminina 1 e integrina α6.

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Figura II.19: Expresión de proteínas de adhesión y polarización epitelial en cultivos primarios de tumores C4-HI. Cultivos primarios de células epiteliales C4-HI fueron sembrados sobre una fina capa de Matrigel. Dos días después de realizado el cultivo, las células fueron fijadas, y se realizó una inmunofluorescencia para las proteínas E-caderina (E-CAD), MUC-1, integrina α6 (INT α6), laminina 1 (LAM 1). En rojo se observan los núcleos celulares teñidos con IP. En varios cúmulos es posible observar un lumen central, característico de este tipo celular. Barra 100 µm.

Para analizar el efecto del tratamiento endocrino (TAM y MFP), y de la inhibición de la vía PI3K/AKT (WORT) sobre las células tumorales, realizamos cultivos primarios de tumores C4-HI y sembramos las células epiteliales purificadas sobre una fina capa de Matrigel. Luego de dos días de cultivo, las células tumorales fueron ayunadas durante 24 horas. A continuación, se administraron los antagonistas hormonales TAM y MFP, el inhibidor WORT, o solución vehículo a modo de control, por otras 48 horas (Fig.II.20). Finalizados los tratamientos observamos el aspecto general de los cultivos utilizando un microscopio de campo claro. Pudimos comprobar que los cúmulos tratados con los antagonistas hormonales y con el inhibidor de PI3K presentaban un aspecto poco saludable. En los distintos tratamientos visualizamos células desprendidas, y cúmulos con células periféricas en proceso de desprendimiento (Fig.II.20 A). El análisis de la muerte celular por medio de la tinción con NA-BE y por inmunofluorescencia para caspasa 3 activada demostró que, tal como se observó in vivo, las células C4-HI presentan una mayor susceptibilidad a la inhibición de la vía PI3K/Akt que a los antagonistas hormonales (Fig. II.20 B, C y D).

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Figura II.20: Efecto del tratamiento con los antagonistas hormonales TAM y MFP, y del inhibidor de PI3K, WORT

sobre la sobrevida y la muerte celular de cultivos primarios C4-HI creciendo en Matrigel. Cultivos primarios de células epiteliales C4-HI fueron sembrados sobre una fina capa de Matrigel. Dos días después de realizado el cultivo, las células fueron ayunadas por 24 horas. A continuación las células fueron tratadas durante 48 horas con TAM (1μM), MFP (10 nM), WORT (1μM) o vehículo a modo de control. A: Imágenes en campo claro representativas de cúmulos C4-HI sometidos a los distintos tratamientos experimentales. Las flechas indican células desprendidas, o en proceso de desprendimiento. B:

Imágenes representativas de cúmulos pertenecientes a los distintos grupos experimentales teñidos con NA-BE. Las células vivas se ven de color verde, mientras que las muertas aparecen de color rojo. C: Índice apoptótico expresado como la media ± SEM del número de cúmulos celulares con desprendimiento de células muertas (determinadas por NA-BE), en relación al número de cúmulos totales observados por campo a bajo aumento (200X). Para las determinaciones se contaron como mínimo 5 campos con un promedio de 10 cúmulos celulares en cada uno. D: Imágenes representativas de cúmulos celulares pertenecientes a cada grupo experimental analizados por inmunofluorescencia para caspasa 3 activada. En rojo se observan los núcleos teñidos con IP. Cabe aclarar que durante los lavados que requieren las técnicas de tinción con NA-BE e inmunofluorescencia, la mayoría de las células muertas desprendidas se pierde y por ende no pueden ser visualizadas en B y en D. Barra: 100 µm. n=4 en cada grupo experimental. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, *p<0,05, *** p<0,001.

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En otra serie de experimentos, los cultivos fueron tratados durante 48 horas con MFP, WORT, MFP+WORT o solución vehículo a modo de control. Al finalizar los tratamientos observamos al microscopio de campo claro que los cúmulos que fueron incubados con MFP, WORT o la combinación de ambas, presentaban abundante cantidad de células desprendidas (Fig.II.21 A). Por medio de la tinción con NA-BE pudimos comprobar que la muerte celular fue mayor luego del tratamiento combinado (Fig.II.21 B y C). Asimismo, estos resultados fueron comprobados mediante una inmunofluorescencia para caspasa 3. En las imágenes obtenidas con el microscopio confocal (Fig.II.21 D) puede distinguirse que aquellas células que se desprenden de los cúmulos, son células positivas para caspasa 3. Estos resultados demostraron que tal como se observó in vivo, las células C4-HI presentan una mayor susceptibilidad a la inhibición conjunta de la vía endócrina y de la vía PI3K/Akt.

Figura II.21: Efecto del tratamiento con MFP, WORT, o de la terapia combinada MFP+WORT sobre la sobrevida y la

muerte celular de cultivos primarios C4-HI creciendo en Matrigel. Cultivos primarios de células epiteliales C4-HI fueron sembrados sobre una fina capa de Matrigel. Dos días después de realizado el cultivo, las células fueron ayunadas por 24 horas. A continuación las células fueron tratadas durante 48 horas con MFP (10 nM), WORT (1μm), MFP+WORT (en las

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dosis indicadas), o vehículo a modo de control. A: Imágenes en campo claro representativas de cúmulos C4-HI sometidos a los distintos tratamientos experimentales. Las flechas indican células desprendidas, o en proceso de desprendimiento. B:

Imágenes representativas de cúmulos pertenecientes a los distintos grupos experimentales teñidos con NA-BE. Las células vivas se ven de color verde, mientras que las muertas aparecen de color rojo. C: Índice apoptótico expresado como la media ± SEM del número de cúmulos celulares con desprendimiento de células muertas (determinadas por NA-BE), en relación al número de cúmulos totales, como se indicó en la Figura II.20.C. D: Imágenes representativas de cúmulos celulares pertenecientes a cada grupo experimental analizados por inmunofluorescencia para caspasa 3 activada. En rojo se observan los núcleos teñidos con IP. Cabe aclarar que durante los lavados que requieren las técnicas de tinción con NA-BE e inmunofluorescencia, la mayoría de las células muertas desprendidas se pierde y por ende no pueden ser visualizadas en B y en D. Barra: 100 µm. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, *p<0,05, **p<0,01 y *** p<0,001.

En resumen, el análisis in vitro del efecto del tratamiento endocrino y de la inhibición de la vía PI3K/Akt demuestra que los distintos tratamientos utilizados ejercen en un sistema de células epiteliales aisladas, efectos similares a los observados in vivo. Por lo tanto, las características principales de la respuesta a cada tratamiento serian el resultado de la acción directa de las drogas sobre el parénquima tumoral. No podemos descartar sin embargo, que la reacción estromal que acompaña la regresión C4-HI favorezca dicho proceso, a través de la formación de microvasculatura, del aporte de células del sistema inmune, y de factores parácrinos que actúan en definitiva, sobre el compartimento epitelial.

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CAPÍTULO III

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CAPITULO III: TUMORES RESISTENTES A LA TERAPIA HORMONAL CON ANTIPROGESTÁGENOS.

III.A. ANTECEDENTES Dentro del modelo de carcinomas mamarios inducidos con MPA, existen numerosas

variantes hormono-independientes, algunas de ellas sensibles y otras resistentes al tratamiento con antiestrógenos y antiprogestágenos. A su vez, el grupo resistente puede subdividirse en dos grandes subgrupos, los tumores con resistencia adquirida y los tumores con resistencia constitutiva (revisado en Lanari et al., 2009).

La variante tumoral C4-2-HI es una variante hormono-independiente, resistente constitutiva, derivada del tumor C4-HD. Presenta una histología pobremente diferenciada, con grandes grupos de células epiteliales y escaso estroma tumoral. Como se mencionó anteriormente, estos tumores no responden al tratamiento con MFP (Fig.III.1), incluso en algunos casos la administración del antiprogestágeno aumenta el crecimiento del tumor (Wargon & Riggio et al, 2013, manuscrito en revisión). A diferencia de otras variantes resistentes, los tumores C4-2-HI conservan la resistencia in vitro, lo que los hace una herramienta útil para evaluar la sensibilidad a agentes antitumorales ya sea in vitro como in vivo.

Figura III.1: Respuesta al tratamiento con MFP y 17-β-estradiol en la variante tumoral resistente endócrina C4-2-HI:

Los tratamientos hormonales se iniciaron cuando los tumores C4-2-HI alcanzaron un tamaño aproximado de 20 mm2. La administración de 17-β-estradiol (E2 en la figura) se realizó mediante la aplicación de un pellet subcutáneo de 5mg. El tratamiento con MFP (RU en la figura) se realizó diariamente, por medio de inyecciones subcutáneas de 12mg/kg de peso corporal. Se determinó el largo y el ancho de los tumores y el área tumoral resultante fue graficada en función del tiempo. Extraído de Wargon et al, 2009.

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El objetivo general de este capítulo fue evaluar la posible utilidad de la inhibición de la vía de PI3K/Akt como herramienta para el tratamiento de variantes tumorales que presentan una menor sensibilidad al tratamiento endocrino con MFP, o que directamente no responden a dicho tratamiento. III.B. EFECTO DE LA INHIBICIÓN DE LA VIA PI3K/Akt EN TUMORES CON SENSIBILIDAD REDUCIDA A ANTIPROGESTÁGENOS

Mientras realizábamos los experimentos descriptos en el Capítulo II, notamos que con los sucesivos pasajes singeneicos, los tumores C4-HI comenzaban a mostrar una menor sensibilidad al tratamiento con MFP. Por tal motivo, se descongelaron nuevos tumores C4-HI para poder continuar con el trabajo de Tesis. Aquellos tumores C4-HI que perdieron parcialmente la respuesta a la MFP se utilizaron en experimento específicos, como una herramienta para estudiar la progresión tumoral y el efecto de diversas terapias antitumorales, en un modelo que se aproxima a la adquisición de resistencia hormonal. Llamamos a esta variante tumoral, C4-HIr.

En comparación a la variante C4-HI (Fig.II.1 y II.3), la variante tumoral C4-HIr muestra una respuesta parcial al tratamiento con MFP (12 mg/kg/día). Luego de 6 días de tratamiento con la droga mencionada, se consigue una leve disminución de la tasa de crecimiento tumoral C4-HIr (Fig.III.2 A). Al analizar la histología de los tumores en un grupo experimental que se sacrificó luego de 48 horas de administrada la droga (Fig.III.2 B), no se observa la reorganización tisular típica descripta en los tumores C4-HI (ver Capitulo II para más detalle). De hecho, incluso en ausencia de tratamiento, los tumores C4-HIr presentan una histología menos diferenciada que los tumores C4-HI, de los cuales derivan (Fig. II.12). Como se observa en la Fig.III.2 B, el parénquima tumoral C4-HIr está formado por grupos cohesivos de células epiteliales que muestran una escasa a nula formación de estructuras de tipo ductal.

Como mencionamos anteriormente, la ausencia de respuesta a antiprogestágenos en el modelo experimental inducido con MPA se encuentra asociada a un cambio en el nivel de expresión de las isoformas del PR (Wargon et al., 2009). Sin embargo, los tumores C4-HIr presentan un patrón de expresión de isoformas idéntico al de los tumores C4-HI (no mostrado). Por lo tanto, puede que nos encontremos en un estadio en el que todavía no se ha producido la alteración del patrón de expresión de las isoformas, o que otros mecanismos se encuentren involucrados en la perdida de la sensibilidad al antiprogestágeno MFP de la variante C4-HIr.

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Figura III.2: Respuesta a la MFP en los tumores C4-HIr. A: El experimento se inició cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 50 mm2. La administración de MFP se realizó diariamente, por medio de inyecciones subcutáneas de 12mg/kg de peso corporal. Se determinó el largo y el ancho de los tumores y el área tumoral resultante fue graficada en función del tiempo. B: Imágenes representativas de hematoxilinas/eosinas de tumores C4-HIr tratados con MFP o vehículo (control) durante 48 horas.. n=3 en cada grupo experimental. El análisis estadístico se realizó por medio de un ANOVA de medidas repetidas, a: p<0,001 con respecto al control. Barra: 100 μm

A pesar de mostrar una menor sensibilidad al tratamiento con MFP, los tumores C4-HIr

retuvieron la respuesta a la inhibición de la vía PI3K/Akt (Fig.III.3 A) característica de los tumores C4-HI. Puede observarse que a lo largo de los seis días de tratamiento con WORT, el crecimiento tumoral estuvo inhibido, y que de hecho los tumores tratados con WORT disminuyeron levemente su tamaño. Cabe destacar que los tumores C4-HIr presentan un nivel de actividad de PI3K/Akt semejante a los tumores C4-HI (no mostrado).

En función de las numerosas publicaciones que vinculan a la vía PI3K/Akt con el desarrollo de resistencia a las terapias antitumorales, entre ellas a la terapia endocrina (Miller et al., 2011), y en función del cross-talk entre la vía de PI3K y los receptores hormonales (Fox et al., 2012), nos preguntamos si el tratamiento con WORT podría alterar de alguna manera la respuesta de los tumores C4-HIr al tratamiento con MFP. Sin embargo, como se observa en la Fig.III.3A, la curva de crecimiento del grupo MFP+WORT es similar a la de los tumores tratados únicamente con WORT.

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Figura III.3: Efecto de la inhibición de la vía PI3K/Akt sobre el crecimiento de los tumores C4-HIr que presentan una

menor sensibilidad a la MFP. A: Curvas de crecimiento tumoral. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño aproximado de 50 mm2 se inició el tratamiento con MFP (inyecciones subcutáneas diarias de 12 mg/kg), WORT (inyecciones intraperitoneales diarias de 1mg/kg), MFP+WORT (en las dosis mencionadas en forma simultánea), o solución fisiológica a modo de control. Se graficó el área tumoral obtenida a partir de las medidas del ancho y largo de los tumores, en función del tiempo. Las curvas se analizaron por medio de la comparación de las pendientes obtenidas luego de la regresión lineal de los datos. Se utilizó para ello un test de ANOVA. a: p<0,001 vs control, b: p<0,01 vs. MFP. B: Las tasas de crecimiento (pendiente positiva) y de regresión (pendiente negativa) tumoral correspondientes a cada grupo, representan las pendientes obtenidas a partir de la regresión lineal de los datos en cada curva.

A continuación evaluamos la histología de los tumores sometidos al tratamiento con MFP,

WORT o la terapia combinada MFP+WORT. Como se observa en las imágenes correspondientes a hematoxilinas/eosinas de cada grupo experimental (Fig.III.4 A), en los tumores C4-HIr el tratamiento con MFP y con WORT, indujo fenómenos histológicos similares a los descriptos en la variante C4-HI (Fig.II.13). Tal como ocurre en los tumores C4-HI, la administración de MFP y de WORT inhibió la proliferación celular e indujo la reorganización del tejido tumoral C4-HIr al cabo de 6 días de tratamiento (Fig. III.4 B). Además, la administración de WORT indujo un aumento en la apoptosis (Fig.III.4 C) y en la necrosis del parénquima tumoral (Fig.III.4 D).

Cuando en los tumores C4-HI analizamos los índices apoptóticos y necróticos correspondientes a los grupos MFP, WORT y MFP+WORT (Fig.II.17), observamos que a pesar de que la MFP no ejerce un efecto proapoptótico o de inducción de necrosis per se, los índices correspondientes al tratamiento combinado MFP+WORT son significativamente mayores a los pertenecientes al grupo WORT. Por ende, al menos durante las primeras 48 horas de tratamiento, la administración de MFP intensifica el efecto proapoptótico e inductor de necrosis del WORT en los tumores C4-HI. En el caso de los tumores C4-HIr, luego de 6 días de tratamiento, este efecto de la MFP se ve fuertemente disminuido.

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Figura III.4: Fenómenos asociados a la respuesta al tratamiento con MFP, WORT, y a la terapia combinada

MFP+WORT, en tumores C4-HIr que presentan una menor sensibilidad a la MFP. A: Imágenes representativas de hematoxilinas/eosinas de los tumores de los distintos grupos experimentales, luego de 6 días de tratamiento. B y C: Índice mitótico y apoptótico, respectivamente, expresados como la media ± SEM de la proporción de células mitóticas y apoptóticas en el parénquima tumoral de cada grupo experimental. La proporción de células mitóticas/células totales o apoptóticas/células totales en cada tumor es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). D: Índice necrótico expresado como la media ± SEM de la proporción de área necrótica/parénquima tumoral total en

cada uno de los tumores de los distintos grupos experimentales. Barra 100 m. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, ** p<0,01 y *** p<0,001.

Por lo presentado hasta aquí, hemos demostrado que en una variante que ha disminuido su sensibilidad al tratamiento con el antiprogestágeno MFP (variante que denominamos C4-HIr), la inhibición de la vía PI3K/Akt con WORT continúa siendo una terapia efectiva en inhibir el crecimiento tumoral. En estos tumores, la administración de WORT ejerce un importante efecto proapoptótico e inductor de la necrosis del parénquima tumoral.

La pérdida de sensibilidad al antiprogestágeno no es modificada en un contexto de inhibición de la vía PI3K/Akt, por lo que no se obtienen mejores resultados utilizando una terapia de combinación MFP+WORT en estos tumores.

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III.C. MODELADO IN VITRO DE LA RESPUESTA A MFP, WORT, o MFP+WORT EN TUMORES CON SENSIBILIDAD REDUCIDA A ANTIPROGESTÁGENOS

En un sistema in vitro en donde se analizó la respuesta de las células tumorales epiteliales aisladas a los distintos tratamientos, se obtuvieron resultados similares a los observados in vivo. Como ya hemos mencionado en los Capítulos I y II, para analizar la respuesta in vitro realizamos cultivos primarios y sembramos células epiteliales aisladas sobre una fina capa de Matrigel. En estas condiciones las células epiteliales C4-HIr se disponen formando agregados esféricos, pero a diferencia de las células C4-HI (Fig.II.19), la formación de un lumen central es practicamente inexistente en los cúmulos C4-HIr (Fig.III.5).

Dos días después de realizado el cultivo, ayunamos a los cúmulos epiteliales por 24 horas y procedimos a realizar los tratamientos con MFP, WORT, o el tratamiento combinado MFP+WORT en forma simultánea, durante 48 horas.

Al finalizar los distintos tratamientos observamos un aumento significativo en la apoptosis, únicamente en los casos en los que la vía de PI3K/Akt se encontraba inhibida (Fig. III.5 C). En las imágenes correspondientes a los cúmulos celulares teñidos con NA-BE (Fig.III.5 B) y en la inmunofluorescencia para caspasa 3 activada (Fig. III.5 D), se observa que los cúmulos tratados con WORT (sólo o en combinación) presentan en su mayoría, células muertas en su interior, desprendidas, o en proceso de desprendimiento. De forma similar a los observado in vivo, la terapia combinada MFP+WORT no produjo mejores resultados que la administración de WORT, por lo que también in vitro, la sensibilidad al antiprogestágeno permanece inalterada en un contexto de inhibición de la vía PI3K/Akt.

En base a los resultados presentados aquí podemos concluir que incluso en un sistema

constituido por células epiteliales aisladas es posible reproducir la sensibilidad reducida al antiprogestágeno MFP de la variante tumoral C4-HIr. Es probable entonces que la sensibilidad endócrina disminuida tenga su manifestación en las células tumorales per se, relativizando de esta manera la influencia del microambiente tumoral en este fenómeno.

Finalmente, en el sistema de cultivo tridimensional en Matrigel se pudo observar que tal como ocurre in vivo, los tumores C4-HIr responden eficientemente a la inhibición de la vía PI3K/Akt.

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Figura III.5: Supervivencia celular en cultivos primarios tridimensionales de tumores C4-HIr. Cultivos primarios de células epiteliales C4-HIr fueron sembrados sobre una fina capa de Matrigel. Dos días después de realizado el cultivo, las células fueron ayunadas por 24 horas. A continuación las células fueron tratadas durante 48 horas con MFP (10 nM), WORT (1μm), MFP +WORT (en las dosis indicadas), o vehículo a modo de control. A: Imágenes en campo claro representativas de cúmulos C4-HIr sometidos a los distintos tratamientos experimentales. Las flechas indican células desprendidas, o en proceso de desprendimiento. B: Imágenes representativas de cúmulos pertenecientes a los distintos grupos experimentales teñidos con NA-BE. Las células vivas se ven de color verde, mientras que las muertas aparecen de color rojo. C: Índice apoptótico expresado como la media ± SEM del número de cúmulos celulares con desprendimiento de células muertas (determinadas por NA-BE), en relación al número de cúmulos totales observados por campo a bajo aumento (200X). Para las determinaciones se contaron como mínimo 5 campos con un promedio de 10 cúmulos celulares en cada uno. n=4 en cada grupo experimental. D: Imágenes representativas de cúmulos celulares pertenecientes a cada grupo experimental analizados

por inmunofluorescencia para caspasa 3 activada. En rojo se observan los núcleos teñidos con IP. Barra 100 m. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, ** p<0,01 respecto al control.

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III. D. EFECTO DE LA INHIBICIÓN DE LA VIA PI3K/Akt EN UNA VARIANTE RESISTENTE AL TRATAMIENTO CON ANTIPROGESTÁGENOS

A continuación, evaluamos el efecto de inhibir la vía PI3K/Akt en la variante resistente constitutiva C4-2-HI. Por estudios previos sabemos que los tumores C4-2-HI presentan un nivel alto de actividad de dicha vía, similar a la variante sensible C4-HI (no mostrado). Dado que no contábamos con evidencia previa acerca del efecto que podría tener la inhibición de la vía PI3K/Akt en esta variante, evaluamos en primer lugar la respuesta a WORT in vitro. Para analizar también si en un contexto de inhibición de la vía de PI3K/Akt se modifica la respuesta al antiprogestágeno MFP, realizamos tratamientos conjuntos de MFP+WORT.

Cuando son cultivadas en Matrigel, las células tumorales C4-2-HI se disponen formando cúmulos de gran tamaño, de aspecto desorganizado y sin lumen central (Fig.III.6). Tal como ocurre con los tumores in vivo, el crecimiento de las células C4-2-HI aisladas es mayor al correspondiente a las células derivadas de los tumores C4-HD o C4-HI (ver Capítulo I y II, respectivamente). Mediante la técnica de inmunofluorescencia se puede observar que proteínas como integrina α6 y laminina 1 se encuentran basalmente localizadas en los cúmulos C4-2-HI. Sin embargo, respecto a lo observado en los cultivos C4-HI (Fig.II.19), la presencia de E-caderina y MUC-1 es menor y la marca es más difusa. Esto último coincide con la ausencia de estructuras de tipo luminal, y con la desorganización de los cúmulos C4-2-HI (Fig.III.6 y III.7 A).

Figura III.6: Expresión de proteínas de adhesión y polarización epitelial en cultivos primarios de tumores

C4-2-HI. Cultivos primarios de células C4-2-HI fueron sembrados sobre una fina capa de Matrigel. Dos días después de realizado el cultivo, las células fueron fijadas, y se realizó una inmunofluorescencia para las proteínas E-caderina (E-CAD), MUC-1, integrina α6 (INTα6) y laminina 1 (LAM 1). En rojo se observan los núcleos celulares teñidos con ioduro de propidio. Los cúmulos C4-2-HI son desorganizados y carecen de lumen central. Barra 50 μm.

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Como se observa en las imágenes tomadas en campo claro (Fig.III.7 A), los cultivos primarios de tumores C4-2-HI no se ven alterados por el tratamiento con MFP pero sí responden a la inhibición de la vía PI3K/Akt. Los cúmulos tratados con WORT o con la terapia combinada MFP+WORT son más pequeños que los correspondientes a los grupos control o MFP, y presentan una mayor cantidad de células desprendidas.

La disminución en el tamaño de los cúmulos tratados con WORT puede explicarse en base a dos mecanismos. Por un lado, por una disminución en la proliferación celular, tal como lo demuestra la determinación del marcador Ki67 por inmunofluorescencia (Fig.III.7 C), y por otro por un aumento en la muerte celular por apoptosis, tal como lo evidencia la tinción con NA-BE y la inmunofluorescencia para caspasa 3 activada (Fig.III.7 B y D). Los tratamientos con WORT y MFP+ WORT no mostraron diferencias respectivas en cuanto a los parámetros analizados, por lo que podemos concluir que in vitro, la sensibilidad al antiprogestágeno no se modifica en un contexto de inhibición de la vía PI3K/Akt.

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Figura III.7: Supervivencia celular en cultivos primarios tridimensionales de tumores C4-2-HI tratados con MFP,

WORT o MFP+WORT. Cultivos primarios de células C4-2-HI fueron sembrados sobre una fina capa de Matrigel. Dos días después de realizado el cultivo, las células fueron ayunadas por 24 horas. A continuación las células fueron tratadas durante 48 horas con MFP (10 nM), WORT (1μm), MFP +WORT (en las dosis indicadas y en forma simultánea), o vehículo a modo de control. A: Imágenes representativas de cúmulos C4-2-HI sometidos a los distintos tratamientos experimentales. B:

Imágenes representativas de cúmulos teñidos con NA-BE. Las células vivas se ven de color verde, mientras que las muertas aparecen de color rojo. C, Izquierda: Índice mitótico expresado como la media ± SEM del número de núcleos positivos para

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Ki67 en relación al número total de células por cúmulo. Para las determinaciones se contaron como mínimo 5 campos con un promedio de 10 cúmulos en cada uno. Derecha: Imágenes representativas de cúmulos celulares de los distintos grupos experimentales analizados por inmunofluorescencia para el marcador de proliferación KI67. D: Índice apoptótico expresado como se indicó en la Figura III.5.C. E: Imágenes representativas de cúmulos celulares analizados por inmunofluoerescencia para el marcador de apoptosis caspasa 3 activada (caspasa 3). En rojo se observan los núcleos celulares teñidos con IP.

Barra 100 m. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, ** p<0,01 y *** p<0,001.

Para trasladar los resultados obtenidos in vitro a un modelo in vivo, repetimos el mismo

esquema experimental utilizado anteriormente. Ratones portadores de tumores C4-2-HI de un tamaño aproximado de 15 mm2 fueron tratados durante 48 horas con WORT, MFP, MFP+WORT o solución fisiológica a modo de control. Al término del experimento los ratones fueron sacrificados y los tumores se conservaron en formaldehido al 4%, o a -80˚C (Fig.III.8). Cabe destacar que iniciamos el experimento con un tamaño tumoral menor al que utilizamos generalmente (50 mm2) debido a que la variante C4-2-HI presenta un crecimiento tumoral acelerado.

Figura III.8: Diseño experimental. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de 15 mm2 se iniciaron los tratamientos. Los tratamientos con mifepristona (MFP) y wortmanin (WORT) se aplicaron diariamente, el primero en forma subcutánea en dosis de 12 mg/kg y el segundo en forma intraperitoneal en dosis de 1 mg/kg de peso corporal. Todos los tratamientos se extendieron por 48 horas, renovándose las dosis de cada tratamiento a las 24 horas, y una hora antes de sacrificar a los animales.

Como se observa en el gráfico correspondiente a los tamaños tumorales luego de 48 horas

de tratamiento (Fig.III.9 A), los tumores pertenecientes a los grupos WORT o MFP+WORT fueron significativamente más pequeños que los del grupo control o MFP. Asimismo, como ya fue mostrado (Wargon et al., 2009) el tratamiento con MFP indujo un leve aumento en el crecimiento tumoral. Para comprobar que la inhibición del crecimiento tumoral ejercida por el tratamiento con WORT (ya sea sólo en combinación) se mantuviera por más de 48 horas, repetimos el esquema experimental administrando las drogas diariamente por 6 días. Como se observa en la Fig.III.9 B, el efecto de la inhibición de la vía PI3K/Akt se mantiene por al menos una semana. Es interesante

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destacar que en esta variante tumoral si bien la inhibición de PI3K con WORT no logra reducir el tamaño de los tumores, sí fue capaz de detener su crecimiento. En este sentido otros inhibidores más potentes de la vía PI3K/Akt podrían tener un efecto mayor (experimento en elaboración con rapamicina, un inhibidor de mTOR, y con BEZ235, un inhibidor dual de PI3K y mTOR).

Figura III.9: Respuesta in vivo a la inhibición de la vía PI3K/Akt en la variante tumoral C4-2-HI. A: Tamaño tumoral final en función de los distintos tratamientos. Al finalizar los tratamientos (48 horas) se midió el ancho y el largo de los tumores, y se graficó el área tumoral resultante. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, ** p<0,01, versus control. B: Curva de crecimiento tumoral de los tumores C4-2-HI tratados durante 6 días con las drogas mencionadas. n=3 en cada grupo experimental. El análisis estadístico se realizó por medio de un ANOVA de medidas repetidas, ***p<0,001 versus control.

A continuación evaluamos el estado de activación de la vía PI3K/Akt en los tumores C4-2-

HI al cabo de 48 horas de tratamiento. Para ello analizamos el nivel de fosforilación de las proteínas Akt y S6 mediante western blot e inmunohistoquímica (Fig. III.10).

Tal como demostramos por western blot en la variante C4-HI (Fig.II.14), el tratamiento con WORT inhibió eficazmente la fosforilación de Akt y por consiguiente de S6 (Fig.III.10 A). Por otro lado, observamos que en los tumores C4-2-HI tratados con MFP, hay una tendencia a aumentar los niveles de Akt y S6 fosforilados (Fig.III.10 A). Cuando MFP y WORT fueron administrados en conjunto, prevaleció el efecto inhibitorio de WORT por sobre la estimulación de la MFP.

Al analizar la fosforilación de Akt y S6 por inmunohistoquímica (Fig.III.10 B) obtuvimos resultados similares a los obtenidos por western blot. Cabe destacar que como se observa en la Fig.III.10 B, en los tumores C4-2-HI la marca de pAkt y pS6 se localiza fundamentalmente en el citoplasma de las células tumorales. Esta observación constituye una diferencia con respecto a los

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tumores C4-HI (Fig.II.14) en donde si bien la marca para pS6 era citoplasmática, la marca de pAkt era fundamentalmente nuclear.

En la Figura III.10 también se puede observar que la expresión de las isoformas PRA y PRB no se ven alteradas por los distintos tratamientos empleados. Como se ha demostrado en trabajos previos del laboratorio, la reversión de la resistencia a antiprogestágenos en las variantes resistentes constitutivas, entre las que se encuentra la variante C4-2-HI, está asociada a la reexpresión de la isoforma PRA (Wargon et al., 2011), (Wargon & Riggio et al, manuscrito en revisión). Por los resultados presentados en la Figura III.10, podemos concluir que la inhibición de la vía PI3K/Akt no modifica la expresión de dicha isoforma del PR.

Figura III.10: Estado de activación de la vía PI3K/AKT en los tumores C4-2-HI tratados con MFP, WORT y MFP+WORT.

A, Izquierda: Imágenes representativas de western blots realizados a partir de extractos proteicos totales de los tumores pertenecientes a cada grupo experimental, revelados con anticuerpos anti pSer473 AKT, AKT total, pSer240/244 S6, S6 total, PR y ERK1/2. Las bandas fueron cuantificadas con el programa Image J y se graficaron las relaciones pAKT/AKT total

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(centro) y pS6/S6 total (derecha). B: Imágenes representativas de cortes histológicos de los distintos grupos experimentales analizados por inmunohistoquímicas con anticuerpos para pSer473 AKT y pSer240/244 S6. En los insertos se nota

claramente que la marca para pAKT y pS6 es fundamentalmente citoplasmática. Barra 100 m. El análisis estadístico se realizó por un test de ANOVA, seguido por un test de Tukey, *p<0,05, ** p<0,01 y *** p<0,001.

Con el objetivo de caracterizar la respuesta al WORT (ya sea a modo de terapia única o combinada con MFP), y de identificar mecanismos celulares que permitan explicar el fenómeno de inhibición del crecimiento C4-2-HI, evaluamos la proliferación y la supervivencia en el parénquima tumoral luego del tratamiento con el inhibidor de PI3K.

Al cabo de 48 horas de iniciados los distintos tratamientos observamos en primer lugar, que la administración de WORT disminuyó significativamente el índice mitótico de los tumores C4-2-HI (Fig.III.11 A). En los tumores en los que la proliferación celular se encuentra inhibida se registró una menor proporción de células positivas para ciclina D1 y c-Myc, y la marca de ésta última fue fundamentalmente citoplasmática (Fig.III.11 B). Como esperábamos, la MFP no logró afectar el índice proliferativo de estos tumores.

Figura III.11: Proliferación en tumores C4-2-HI luego de 48 horas de tratamiento con MFP, WORT o la terapia

combinada MFP+WORT. A: Índice mitótico expresado como la media ±SEM de la proporción de células mitóticas/células totales en el parénquima de los tumores de cada grupo experimental. La proporción de células mitóticas/células totales en cada tumor es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). B: Imágenes representativas de cortes histológicos de los tumores de cada grupo experimental, analizados por inmunohistoquímicas para las proteínas ciclina D1 (CD1) y c-Myc (MYC). En los insertos se nota claramente que la marca para MYC luego del

tratamiento con WORT es fundamentalmente citoplasmática. Barra 50 m. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Tukey, *** p<0,001.

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Por otro lado, el WORT incrementó el índice apoptótico en los tumores C4-2-HI (Fig.III.12 A), y tal como esperábamos, la administración de MFP no afectó dicho parámetro. Estos resultados fueron confirmados por medio de una inmunohistoquímica para la proteína proapoptótica Bax y antiapoptótica Bcl-Xl (Fig.III.12 B).

Figura III.12: Apoptosis en tumores C4-2-HI luego de 48 horas de tratamiento con MFP, WORT o de la terapia

combinada MFP+WORT. A: Índice apoptótico expresado como la media ± SEM de la proporción de células apoptóticas /células totales en el parénquima de los tumores de cada grupo experimental. La proporción de células apoptóticas/células totales en cada tumor es un promedio del valor obtenido luego de contar 10 campos de alto aumento (1000x). B: Imágenes representativas de cortes histológicos de los tumores de cada grupo experimental, analizados por inmunohistoquímica para

las proteínas Bax y Bcl-Xl. Barra 100 m. El análisis estadístico se realizó por un ANOVA seguido de Test de Tukey, *p<0,01, *** p<0,001.

Es interesante destacar que en la variante tumoral sensible a la terapia endócrina C4-HI el

tratamiento combinado MFP+WORT tiene un efecto antitumoral mayor que el de cada agente por separado. En cambio, en la variante resistente endócrina C4-2-HI el tratamiento combinado MFP+WORT no incrementa la citostasis ni la apoptosis del parénquima tumoral provocado por el WORT sólo, incluso luego de una semana de tratamiento. Asimismo, contrario a lo observado en los tumores C4-HI (Capítulo II) y C4-HIr (Capítulo III, sección A), donde el tratamiento con WORT induce la necrosis tumoral, en los tumores C4-2-HI la necrosis tumoral está ausente (ver Figura III.13). Esto muestra que la familia tumoral C4 es un buen modelo experimental que representa distintos estadios de la progresión a la resistencia endócrina en cáncer de mama ER/PR+.

En base a los resultados presentados hasta aquí, hemos demostrado tanto in vitro como in vivo que la variante tumoral C4-2-HI responde tempranamente a la inhibición de la vía PI3K/Akt

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con una disminución en la proliferación celular y un aumento en la apoptosis. Evaluando el efecto del tratamiento combinado MFP+WORT pudimos comprobar que la administración conjunta de WORT no revierte la falta de respuesta a la MFP. Los índices mitótico y apoptótico del grupo MFP+WORT son similares a los del grupo WORT.

Experimentos en curso con la línea T47D, a partir de la cual generamos por presión

selectiva una variante resistente a la MFP (T47D-MR) y otra variante resistente al TAM (T47D-TR), intentarán extrapolar los resultados obtenidos con el inhibidor de PI3K en los tumores C4-2-HI, en otro modelo experimental.

III. E. EFECTO ESTROMAL DE LA INHIBICIÓN DE LA VIA PI3K/Akt EN UNA VARIANTE RESISTENTE

En base a los resultados obtenidos con las variantes C4-HD y C4-HI en los capítulos I y II respectivamente, nos preguntamos si en el caso de los tumores C4-2-HI existía también una asociación entre la respuesta al tratamiento antitumoral y la remodelación en el compartimiento estromal. Como ya hemos mencionado, y como se evidencia en la Figura III.13, los tumores C4-2-HI presentan un estroma realmente escaso. A pesar de detectar cambios en la proliferación y en la apoptosis del tejido epitelial, la abundancia y reactividad del estroma no se vio afectada luego de los tratamientos.

Figura III.13: Histología de los tumores C4-2-HI tratados con MFP, WORT, o la terapia combinada MFP+WORT,

durante 48 horas. Imágenes representativas de hematoxilinas/eosinas de los tumores pertenecientes a cada grupo experimental. Barra 100 µm

Por otro lado, evaluamos el grado de vascularización del estroma tumoral. Como se

observa macroscópicamente, los tumores C4-2-HI son tumores muy irrigados (Fig.III.14 A). A

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través del análisis del marcador CD31 por inmunofluorescencia pudimos determinar que en presencia de MFP, la cantidad de vasos aumenta. Asimismo, si bien la inactivación de la vía PI3K/Akt no provoca por sí misma un cambio en la vasculatura intratumoral, cuando es administrada en conjunto con MFP es capaz de inhibir el efecto proangiogénico de ésta (Fig.III. 14 B). Este último resultado, guarda una gran similitud con lo observado en la variante C4-HD, en donde también se demostró que la administración de WORT era capaz de bloquear el efecto proangiogénico de la MFP (Fig.I.21).

Figura III.14: Vasculatura de los tumores C4-2-HI tratados con MFP, WORT o MFP+WORT por 48 horas. A, Arriba: Imágenes de tumores representativos de cada grupo experimental. Abajo: Inmunofluorescencia para el marcador CD31, en rojo se observan los núcleos teñidos con ioduro de propidio. B: Índice CD31 expresado como la media ± SEM del número de focos CD31 positivos por campo de bajo aumento (200X), en cada grupo experimental. Para determinar este parámetro se tomaron al menos 5 fotos por muestra y se contabilizo el número de focos CD31 positivos, independientemente del tamaño

de cada foco. Barra 100 m.

En resumen, la inhibición del crecimiento tumoral C4-2-HI con WORT no se encuentra asociada a un fenómeno de remodelación tisular o de reacción estromal.

Si bien el crecimiento tumoral de la variante C4-2-HI no se modifica luego de 48 horas de administración de MFP, suponemos que la droga accede al tejido tumoral ya que vemos que incrementa la formación de vasos sanguíneos. Al igual que lo que ocurre en la variante C4-HD, la administración de WORT interfiere con los efectos proangiogénicos de la MFP.

142

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

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A lo largo de este trabajo de Tesis se ha evidenciado que la regresión tumoral es un fenómeno complejo que involucra la participación activa tanto del parénquima como del estroma tumoral. En base a los resultados presentados, podemos concluir que cada variante tumoral del modelo experimental de carcinomas mamarios murinos inducidos con MPA posee mecanismos de regresión propios y distintivos. La inducción de un fenómeno apoptótico masivo, de un proceso de necrosis tisular y el incremento en la diferenciación del parénquima tumoral, son ejemplos de mecanismos diferenciales de respuesta tumoral que también se encuentran en la clínica.

Analizar la respuesta de los tumores luego de una breve exposición a las drogas ensayadas nos permitió trabajar en una ventana temporal adecuada para estudiar cómo se desencadena la regresión en cada tipo de tumor, así como también detectar diferencias en los mecanismos de respuesta a cada tratamiento utilizado. Si bien el estudio de los fenómenos de regresión tempranos cuenta con la limitación de representar un punto único de análisis, desconociendo cómo evoluciona a largo plazo la respuesta a los distintos tratamientos, creemos que este análisis resulta interesante ya que permite caracterizar cómo se desencadena la respuesta e identificar blancos susceptibles a la modulación. Por otro lado, sabemos por experiencia previa del laboratorio que ciertos mecanismos celulares evidenciados dentro de las 48 horas de tratamiento se mantienen a lo largo del tiempo, como por ejemplo el incremento en la diferenciación de los tumores C4-HI. Incluso se mantiene la sensibilidad diferencial hacia distintos tratamientos, como es el caso de la mayor susceptibilidad que presentan los tumores C4-HI a la inhibición de la vía PI3K/Akt en comparación con el tratamiento endocrino. Por lo tanto es posible que la respuesta temprana a una droga refleje cómo se comportará dicho tumor a lo largo del tratamiento.

Discutiremos primero los resultados más relevantes en cada variante tumoral por separado, (resumidos en la Tabla a continuación), para luego finalizar con una conclusión general sobre las implicancias del estudio de los mecanismos tempranos de regresión tumoral y de nuestro trabajo en particular.

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REGRESIÓN TUMORAL EN LA VARIANTE C4-HD Compartimento epitelial de los tumores C4-HD

La variante tumoral C4-HD responde al tratamiento con antagonistas de los receptores hormonales de estrógenos y progesterona (ER y PR), mostrando una inhibición evidente del crecimiento tumoral. En este trabajo mostramos además, que los tumores C4-HD responden pobremente a la inhibición de la vía PI3K/Akt. Incluso, estos tumores no se verían beneficiados con una terapia combinada de inhibidores de PI3K y antiprogestágenos.

Luego de 48 horas de tratamiento con ICI, TAM o MFP detectamos en el parénquima tumoral C4-HD una disminución en la proliferación, así como también un aumento en la apoptosis y en la necrosis tisular. En todos estos parámetros, el tratamiento con MFP resultó ser el más efectivo. Hemos comprobado también en un sistema in vitro que las células epiteliales C4-HD aisladas, presentan mayor sensibilidad hacia el tratamiento con antiprogestágenos en comparación a los antiestrógenos. Esta respuesta diferencial podría estar relacionada a la etiología de los tumores C4-HD. Como mencionamos a lo largo de esta Tesis, los tumores C4-HD surgieron luego de la administración prolongada del progestágeno sintético MPA. Este podría ser el motivo por el cual dichos tumores responden mejor a la administración de antiprogestágenos, que a antiestrógenos.

Analizando en detalle la histología de los tumores C4-HD luego de los distintos tratamientos hormonales, observamos que las células tumorales que se encontraban próximas al estroma tumoral, mostraban una mayor resistencia al efecto de las drogas utilizadas. Pudimos comprobar que mientras las células tumorales que estaban en contacto con el estroma mantenían la expresión del marcador Ki67, las células del centro de los paquetes epiteliales se encontraban en proceso de apoptosis y/o necrosis. En los últimos años ha tomado gran relevancia el estudio del rol del microambiente en la promoción, el crecimiento y la invasión tumoral (Radisky, 2012). Se ha demostrado que el estroma de los tumores es fuente de quemoquinas, proteínas de adhesión celular y factores de crecimiento como EGF, TGFβ, HGF, entre otros (Kalluri y Zeisberg, 2006). Por otro lado, el estroma es un compartimento vascularizado que provee de oxígeno y nutrientes al tumor en crecimiento. Es probable que por estas razones, las células epiteliales cercanas al estroma tumoral posean mayor resistencia a las terapias ensayadas. Hemos detectado además, que los fibroblastos en contacto con el epitelio presentan una intensa expresión del marcador α-SMA. Sumado a lo que mencionamos anteriormente, existen diversas publicaciones que señalan que fibroblastos activados, con alta expresión de α-SMA, interaccionan activamente con las

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células tumorales promoviendo el crecimiento de tumores sólidos (Chuaysri et al., 2009), (Cirri y Chiarugi, 2011), (Parikh et al., 2014).

Compartimento estromal de los tumores C4-HD

Como mencionamos anteriormente, el compartimento estromal también es modificado por el tratamiento endócrino. Luego de 48 horas de la administración de ICI, TAM o MFP, el área ocupada por el estroma tumoral aumenta significativamente con respecto a los tumores que están creciendo (+MPA). En particular en los tumores tratados con MFP, en donde la regresión fue máxima, el área estromal se incrementa cerca de 4 veces. En este sentido, el grado de invasión estromal refleja la efectividad del tratamiento antitumoral utilizado. Cabe destacar que el fenómeno de invasión del estroma tumoral ha sido descripto previamente en tumores mamarios humanos sometidos a quimioterapia (Divya Sethi et al., 2012), y al tratamiento antiestrogénico con letrozole y TAM (Miller et al., 2003).

Con el objetivo de caracterizar la progresión del fenómeno de remodelación tisular asociado al tratamiento con MFP, administramos dicha droga por distintos tiempos y analizamos la histología de los tumores, la expresión génica global, y proteínas particulares que estuvieran involucradas en vías de señalización de interés, o que funcionaran como marcadores de tipos celulares específicos. Como fue descripto anteriormente (Simian et al., 2006) y como pudimos comprobar en este trabajo, luego de sólo 6 horas de administrada la MFP es posible detectar una disminución en el índice mitótico y un aumento en el índice apoptótico del epitelio tumoral C4-HD. A su vez, el área ocupada por el estroma aumenta significativamente a las 12 horas de tratamiento. Esta observación sugiere que el efecto de las drogas se inicia en el epitelio y que la reacción estromal sería una consecuencia de la muerte del parénquima tumoral. Podemos especular entonces, que factores secretados por el epitelio en regresión conducirían a la expansión y a la invasión del estroma.

En base a los resultados obtenidos podemos postular además, que la progresión de dicho fenómeno presentaría muchas similitudes con el proceso de cicatrización de cierre de heridas, o wound healing. Cuando las células epiteliales o endoteliales son dañadas, se liberan mediadores inflamatorios que inician la cascada de coagulación que culmina con la formación de un coagulo sanguíneo, y una matriz extracelular provisional (Wynn, 2008). En línea con esta información, en los tumores tratados con MFP hemos encontrado sobreexpresados genes de diversos factores de coagulación como los factores I, II, V y VII. La degranulación de las plaquetas atrapadas en la red de fibrina, y el entorno del tejido dañado producen una serie de factores de crecimiento, citoquinas

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y quemoquinas que favorecen la proliferación y el reclutamiento de leucocitos al sitio de la herida. De esta manera se dispara una fase inflamatoria, caracterizada por la infiltración secuencial de neutrófilos, macrófagos y linfocitos (Guo y Dipietro, 2010). Paralelamente, la secreción de MMPs por parte del epitelio y del endotelio dañado degrada la matriz extracelular, permitiendo el acceso de las células del sistema inmune a la zona de la herida. De acuerdo con esto, los resultados del microarray de expresión en tumores C4-HD tratados con MFP, mostraron que numerosas citoquinas y quemoquinas asociadas a la diferenciación de células del sistema inmune, así como también receptores y proteínas propias de dichas células, se encontraban sobreexpresadas durante la regresión tumoral. Con respecto a las MMPs encontramos sobreexpresadas las MMP-8, 11 y 14. Además, como ha sido demostrado en el trabajo realizado por Simian y colaboradores, la regresión tumoral C4-HD se encuentra asociada a un incremento en la actividad de las MMP-2 y 9 (Simian et al., 2006).

Por otro lado, se ha descripto que durante la fase inflamatoria en un proceso de cicatrización, macrófagos, linfocitos, y células de la zona dañada, secretan citoquinas, quemoquinas y factores de crecimiento, que dirigen la migración de fibroblastos y células endoteliales hacia el sitio de la herida. Entre los factores solubles con propiedades profibróticas y proangiogénicas se encuentran miembros de la familia de TGF-β (Li et al., 2006), (Pardali et al., 2010), y el factor FGF-2 (Chaudhary et al., 2007), (Lieu et al., 2011). En línea con esta información, tanto el FGF-2 como el TGF-β2 resultaron sobreexpresados en los tumores en regresión, de acuerdo al análisis de los datos arrojados por el estudio de microarray. Es interesante destacar que estudios realizados en el laboratorio han demostrado que el FGF-2 secretado por los CAFs es capaz de promover la proliferación de las células tumorales a través de la activación del PR, tanto en variantes pertenecientes al modelo de carcinomas inducidos por MPA como en la línea celular T47D (Giulianelli et al., 2008), (Cerliani et al., 2011). En vista de los resultados obtenidos, es posible que el FGF-2 posea un rol dual, estimulando la proliferación de las células neoplásicas durante el crecimiento de los tumores y regulando mecanismos asociados a la regresión de los mismos.

Como resultado del microarray detectamos durante la regresión C4-HD la regulación de genes adicionales relacionados con los fenómenos fibrótico y angiogénico, y ambos procesos fueron verificados histológicamente. Por medio de la tinción con el Tricrómico de Masson y de

inmunohistoquímica para las proteínas SMA y COL-1, verificamos en los tumores en regresión, la presencia de un estroma fibroblástico de tipo activado, rico en fibras colágenas. Al analizar la abundancia de vasos sanguíneos por medio de la detección del marcador de células endoteliales CD31, observamos que el estroma de los tumores en regresión esta profundamente irrigado. Se

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sabe que la neovasculatura en los tumores ayuda a mantener la alta tasa de crecimiento. Sin embargo, la regresión tumoral tambien parece requerir la formación de nuevos vasos sanguineos para permitir el acceso de los factores involucrados en el proceso de cicatrización y remodelado tisular.

El origen celular de los fibroblastos activados que forman parte del proceso de cicatrización, ha sido investigado ampliamente en los últimos años. Inicialmente se creía que los fibroblastos presentes en áreas de injuria tisular derivaban de poblaciones locales, o del reclutamiento desde el tejido conectivo periférico (Wynn, 2008). Más recientemente sin embargo, se ha demostrado que los fibroblastos que forman parte de diversos procesos fibróticos pueden originarse a partir de células epiteliales en un proceso conocido con el nombre de transición epitelio-mesenquimal (Willis et al., 2006), de progenitores derivados de la medula ósea (Brittan et al., 2002), de células endoteliales por medio de una transición endotelio-mesenquimal (Zeisberg et al., 2007) o de células adiposas (Bochet et al., 2013). En la variante C4-HD, hemos mostrado que la proliferación de los fibroblastos residentes dentro del tumor no parece ser la responsable de la expansión del compartimiento estromal que se observa durante la regresión. Estos fibroblastos aislados tampoco respondieron al tratamiento con MFP como lo demuestran los cultivos de CAFs C4-HD. Por el contrario, es probable que la migración de fibroblastos desde la periferia del tumor constituya la fuente primaria de fibroblastos activados. Como mostramos en la Figura I.6 D, en los tumores tratados con MFP por 48 horas, se observa una gran proporción de fibroblastos Ki67 positivos en el estroma periférico que ingresa a los tumores. Resultados preliminares obtenidos por el Lic. Gonzalo Sequeira demuestran además que durante el crecimiento de los tumores con MPA es posible detectar en el compartimiento estromal, fibroblastos derivados de progenitores de la medula ósea. Actualmente nos encontramos realizando experimentos para determinar si estos fibroblastos de médula ósea, marcados en este caso con GFP+, forman parte del estroma tumoral también durante la regresión inducida por el tratamiento con MFP. Participación de la vía PI3K/Akt en la regresión de los tumores C4-HD

Al analizar el estado de activación de la vía PI3K/Akt, descubrimos una característica distintiva de los tumores C4-HD. Mediante inmunohistoquímica observamos que los niveles de activación de Akt y S6 varían diferencialmente en el parénquima y en el estroma tumoral entre las 6 y 48 horas luego del tratamiento con MFP. Mientras que la marca para Akt y S6 fosforiladas disminuye en el epitelio tumoral, aumenta en el estroma de los tumores tratados.

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Como se ha demostrado en numerosas publicaciones la quinasa S6K es activada por la fosforilación del complejo TORC1 (Magnuson et al., 2012). Una vez activa, S6K fosforila diversos sustratos, entre ellos a la proteína S6 (Meyuhas, 2008). Entonces, la activación de la vía PIK3/AKT/TORC1/S6 en el compartimento estromal podría reflejar un aumento en el metabolismo celular de tipo anabólico, y en particular de la síntesis proteica. Como ya mencionamos anteriormente, por diversas técnicas inmunológicas detectamos que los tumores C4-HD en regresión poseen un estroma tumoral abundante, rico en proteínas de matriz extracelular como laminina y colágeno. En línea con estos resultados, trabajos de la literatura demostraron que la vía PI3K/AKT/mTOR juega un papel importante en procesos fibróticos de diferentes órganos como el pulmón, riñones, piel e hígado. En estos trabajos se ha demostrado que citoquinas como PDGF y TGF-β activan cascadas de señalización entre las que se encuentra la cascada PI3K/Akt/TORC1/S6, regulando la expresión de marcadores como colágeno tipo I (Parsons et al., 2007), colágenotipo III , fibronectina (Gao et al., 2013) y α-SMA (Liang et al., 2013). Además de participar en dichos mecanismos, se ha descripto que la vía PI3K/Akt se encuentra implicada en la regulación de procesos claves durante la cicatrización de heridas, como lo son la formación de nuevos vasos sanguíneos (Abid et al., 2004), (Gratton et al., 2001), (Zheng et al., 2008) y en la respuesta inflamatoria e immune (Koyasu, 2003). Algunos de estos fenómenos fueron estudiados en nuestro modelo experimental, donde vimos que conforme la regresión tumoral C4-HD avanza

luego del tratamiento con MFP, el estroma se hace reactivo para SMA, colágeno I, CD31, pS6, quemoquinas y células del sistema inmune.

Sin embargo, la participación distintiva de la vía PI3K/Akt durante la regresión tumoral C4-HD quedó demostrada en los experimentos en los que se combinó el antiprogestágeno MFP con el inhibidor de PI3K, WORT. Sorprendentemente, al menos durante las primeras 12 horas de regresión, la inhibición de la vía PI3K/Akt interfirió con la magnitud de la reacción estromal inducida por el tratamiento con MFP. En los tumores sometidos a la terapia combinada se observó

una menor proporción de estroma tumoral, menor reactividad -SMA, y una menor cantidad de vasos, en comparación a los tumores tratados únicamente con MFP. De manera similar, y siguiendo esta tendencia, la apoptosis de las células tumorales sometidas al tratamiento combinado se vio disminuida. En este sentido, debemos destacar además que los tumores C4-HD son prácticamente refractarios a la inhibición de la vía PI3K/Akt/mTOR (Polo et al., 2010), (Riggio et al., 2012) y que los niveles de actividad de dicha vía son relativamente bajos, en comparación con la variante tumoral C4-HI.

Haciendo un paralelismo con el fenómeno de reparación de tejidos dañados, en donde una respuesta de cicatrización insuficiente no logra resolver eficazmente el cierre de una herida,

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podríamos suponer que en un contexto de inhibición de la reacción estromal, la regresión de los tumores se ve perjudicada. Esta teoría, plantea el hecho de que el estroma tendría una participación activa, al menos en esta variante tumoral, contribuyendo per se, con la muerte de las células tumorales. En línea con esto, se ha descripto que fenómenos de cicatrización asociados a la toma de biopsias en pacientes con carcinomas escamosos inducen en un alto porcentaje de pacientes, la regresión de los tumores (Swetter et al., 2003). Uno de los mecanismos por los cuales el fenómeno de cicatrización afectaría a dichos tumores seria por medio del aporte de un contexto inflamatorio e inmune. Por otro lado, utilizando esquemas de tratamientos combinados se ha demostrado que el aumento en la vasculatura intratumoral asociada a la administración de MFP incrementa la llegada de agentes quimioterápicos doxorrubicina y paclitaxel al parénquima de los tumores C4-HI y 59-2-HI (Sequeira et al., no publicado). En base a estos resultados existe la posibilidad de que el tratamiento con WORT interfiera con el efecto de la MFP, alterando en primer lugar la vascularización y por lo tanto la llegada de las drogas al tumor.

Finalmente, creemos que es necesario realizar estudios adicionales utilizando otros modelos experimentales y biopsias de pacientes, para confirmar que la reacción estromal temprana es capaz de modular la regresión de los tumores de mama. Experimentos en curso en el modelo de xenotransplante T47D y un estudio de 30 biopsias de pacientes con cáncer de mama obtenidas previo y post tratamiento con agentes antiestrogénicos, nos permitirán extrapolar los resultados obtenidos en el modelo experimental murino con un estudio piloto. Dichas muestras fueron obtenidas de un banco de muestras de la Clínica Mayo en Jacksonville, FL, en colaboración con el Dr. Derek Radisky. En este sentido, sería interesante plantear al fenómeno de la reacción estromal como un posible biomarcador para predecir la regresión tumoral, hacer un seguimiento de la terapia, o incluso utilizarlo en el futuro como un nuevo blanco terapéutico.

Por otro lado, en vista de las diferentes terapias que combinan el uso de inhibidores de la vía PI3K/Akt con antagonistas del ER en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama (Fox et al., 2012), los resultados obtenidos en esta Tesis podrían tener implicancias clínicas interesantes. Según nuestros resultados, en las variantes tumorales donde la vía PI3K/Akt no se encuentra fuertemente activada, la terapia con inhibidores de PI3K podría no ser beneficiosa, o incluso ser perjudicial.

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REGRESIÓN TUMORAL EN LA VARIANTE C4-HI

La variante tumoral C4-HI, responde al tratamiento con antiestrógenos y antiprogestágenos (Vanzulli et al., 2002), (Vanzulli et al., 2005), (Wargon et al., 2009). En adición a la terapia endocrina, la inhibición de la vía PI3K/Akt representa una herramienta eficaz para inhibir el crecimiento de esta variante tumoral. En un trabajo realizado en el laboratorio, hemos demostrado que la administración del inhibidor de PI3K, LY294002, disminuye significativamente el crecimiento C4-HI sin afectar a la variante C4-HD (Polo et al., 2010). Como mencionamos con anterioridad, al comparar el estado de activación de la vía PI3K/Akt en los tumores C4-HD y C4-HI, determinamos que en estos últimos la vía se encontraba más activa (Polo et al., 2010), (Riggio et al., 2012).

En este trabajo de Tesis demostramos que es posible detectar diferencias en cuanto a los mecanismos moleculares y celulares involucrados en la respuesta al tratamiento endocrino y de un inhibidor de la vía PI3K/Akt en los tummores C4-HI, incluso luego de una breve exposición a los mismos. Reorganización tisular y diferenciación ductal durante la regresión de los tumores C4-HI

Como mostramos en el Capítulo II, luego de 48 horas de tratamiento hormonal (ICI, TAM y MFP), o de inhibición de PI3K (WORT), el crecimiento tumoral de la variante C4-HI se vio significativamente inhibido. El análisis de la histología tumoral demostró que en los grupos tratados, la arquitectura tisular estaba modificada. En comparación con el grupo control, los tumores tratados presentaron una mayor cantidad de estructuras de tipo ductal, junto con una mayor proporción de estroma. Este fenómeno, denominado diferenciación ductal o glandular, es propio de esta variante tumoral y estuvo presente en todos los tratamientos, pero fue en los grupos MFP y WORT en donde se visualizó con mayor intensidad. Con excepción del trabajo realizado por Michna y colaboradores, en donde se demostró que los antiprogestágenos onapristona y ZK 112993 inducían la diferenciación de tumores mamarios murinos experimentales (Michna et al., 1992), no existen registros que asocien al fenómeno de diferenciación glandular con la regresión tumoral en cáncer de mama. Creemos que en el caso de los tumores C4-HI la diferenciación del parénquima tumoral podría representar un mecanismo de regresión propio, indicativo del grado de respuesta luego de una terapia dada. El hecho de que dos terapias con diferente blanco de acción hayan inducido la diferenciación del tejido C4-HI, y que dicho patrón de respuesta se haya observado de manera similar incluso luego del tratamiento con DOXO, avala que el incremento en la diferenciación sea un fenómeno inherente al tipo de tumor.

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Si bien se encuentra aceptado que el grado de diferenciación de los tumores mamarios correlaciona positivamente con un mejor pronóstico y respuesta a las terapias (Cianfrocca y Goldstein, 2004), existen trabajos que postulan que en algunos casos la formación de estructuras de tipo ductal estaría relacionada con la evasión de la apoptosis inducida por agentes terapéuticos antitumorales (Weaver et al., 2002). Sería muy interesante determinar en los tumores C4-HI entonces, si las estructuras diferenciadas que permanecen luego de la terapia poseen este carácter “resistente”. Estudios a futuro en tumores C4-HI intentarán caracterizar y analizar el comportamiento de dichas estructuras remanentes luego de la terapia. La MFP produce citostasis, WORT produce además apoptosis y necrosis tumoral. El tratamiento combinado favorece la regresión tumoral C4-HI

Como ya hemos mencionado, luego de un periodo de 48 horas de tratamiento, la

administración conjunta de MFP y WORT mostro mayor eficacia antitumoral. Ambos agentes comparten la capacidad de inducir un fuerte efecto citostático. El tratamiento con WORT además, es capaz de inducir la apoptosis y la necrosis del epitelio tumoral C4-HI.

Con respecto a la regulación de la proliferación celular, detectamos en los tumores C4-HI tratados sólo con MFP o sólo con WORT, una caída en el índice mitótico tumoral y una menor proporción de células Ki67 positivas. Estos resultados estuvieron acompañados además por una disminución en la expresión de ciclina D1 y c-Myc, dos proteínas implicadas en el control del ciclo celular. En línea con estos resultados, en un trabajo reciente del laboratorio se ha descripto que el tratamiento con antiprogestágenos está asociado a la regulación negativa de dichas proteínas, fenómeno que involucra al correpresor génico SMRT (Wargon & Riggio et al, manuscrito en preparación). Además está demostrado que la vía PI3K/Akt a través de la inactivación de GSK3β y 4EBP1 regula positivamente tanto a ciclina D1 como a c-Myc, respectivamente (Manning y Cantley, 2007), por lo que los resultados obtenidos con WORT fueron los esperados. Otro fenómeno asociado al tratamiento con MFP y con WORT fue el cambio en la localizacion subcelular de c-Myc. Mediante una inmunohistoquímica para dicha proteína comprobamos que mientras que en los tumores control c-Myc se localizaba preferentemente en el núcleo, luego de la administración de MFP o de WORT la marca para dicha proteína era preferentemente citoplasmática. Como mencionamos en el Capítulo II, se ha descripto que la localización citoplasmática de c-Myc se asocia con un estado celular no proliferativo (Vriz et al., 1992).

Es importante destacar que el fenómeno citostático asociado al tratamiento con MFP, se da en un contexto de activación de la vía PI3K/Akt/S6. Mediante las técnicas de western blot e

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inmunohistoquímica pudimos determinar que en los tumores tratados con MFP, el parénquima tumoral presentaba un leve aumento en el nivel de activación de la vía PI3K/Akt/S6. Además sabemos por resultados previos del laboratorio, que la administración de MFP induce en los tumores C4-HI, la activación de la vía MAPK/ERK1/2 (Bottino y Lanari, 2010). Pese a que se encuentra ampliamente aceptado que la activación de dichas vías de señalización regula positivamente el fenómeno de división celular, se ha descripto en algunos sistemas experimentales que la inhibición de la proliferación puede estar asociada a incrementos en la activación de Akt (Wempe, 2013) así como también de ERK1/2 (Park et al., 2003).

Entonces, nuestros resultados muestran que si bien la inhibición de la proliferación celular C4-HI se da tanto en un contexto de inhibición como de activación de la vía PI3K/Akt, la inducción de la apoptosis y necrosis tumoral requiere que PI3K esté inhibida. Luego de 48 horas de administrado el inhibidor WORT, registramos por inmunohistoquímica una mayor expresión de la proteína proapoptótica Bax y una disminución de la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-Xl. De esta manera, confirmamos que la inhibición de la vía PI3K/Akt induce la apoptosis de las células tumorales regulando componentes de la vía intrínseca de la apoptosis. En estos tumores también fue posible registrar un aumento en la expresión de Aif, una flavoproteína mitondrial vinculada con la inducción de apoptosis de manera caspasa-independiente (Candé et al., 2004) e incluso con el fenómeno de necrósis (Boujrad et al., 2007). Cabe destacar que en un sistema in vitro compuesto por células epiteliales C4-HI aisladas se reprodujeron los resultados obtenidos in vivo. Por medio de la tinción con NA-BE y la determinación por inmunofluorescencia de caspasa 3 activada, registramos que a diferencia de los tratamientos hormonales, la inhibición de la vía PI3K/Akt fue capaz de inducir la apoptosis de las células C4-HI aisladas.

Las diferencias en cuanto a los mecanismos de acción de la MFP y del WORT posibilitan que la terapia combinada MFP+WORT resulte beneficiosa para la variante tumoral C4-HI, en comparación a la administración de cada droga por separado. Mientras que la administración de MFP y de WORT detuvo el crecimiento de los tumores, la terapia combinada indujo la regresión de los mismos, reduciendo de esta manera el tamaño tumoral. El análisis de la proliferación y de la supervivencia de las células tumorales, sugiere que en el caso del tratamiento combinado se suman los efectos que posee cada droga por separado, aumentando de esta manera la eficacia de la terapia antitumoral. Los resultados de algunos experimentos sugieren además, una posible interacción entre las vías de PI3K/Akt y PR. Si bien se conoce la existencia de mecanismos que vinculan a la vía de PI3K/Akt con el ER (Miller et al., 2010), (Polo et al., 2010), poco se sabe acerca de los mecanismos de interacción entre PI3K/Akt y el PR. En los últimos años, se han publicado algunos trabajos que presentan evidencias al respecto. Por ejemplo, se ha demostrado

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en células T47D que el aumento en la migración e invasión celular inducida por progesterona, involucra la activación de la vía PI3K/Akt (Fu et al., 2010). Por otro lado, en el laboratorio se demostró que la sobreexpresión de una forma constitutivamente activa de Akt1 induce la fosforilación del PR en los modelos de xenotransplante IBH-6 e IBH-7 (Riggio et al., 2012). Reacción estromal en tumores C4-HI Finalmente, podemos afirmar que en adición a la remodelación del parénquima tumoral, la reacción estromal es un componente importante de la regresión de la variante C4-HI. Como ya hemos mencionado, acompañando el proceso de diferenciación glandular en estos tumores, es posible detectar un incremento en la proporción de estroma. Dicho estroma, está compuesto principalmente por fibroblastos de tipo activado, como pudo observarse por medio de una

inmunohistoquímica para el marcador SMA. Además de incrementar el efecto antitumoral y la necrosis en el parénquima, la

incorporación de WORT al tratamiento con MFP incrementó la neovasculatura tumoral y la reacción estromal asociada a la regresión de los tumores C4-HI. Este efecto es contrario a lo observado en los tumores C4-HD, donde la inhibición de la vía PI3K/Akt interfiere con el desarrollo de la reacción estromal.

Hemos mencionado anteriormente, que la vía PI3K/Akt se encuentra vinculada a la regulación de numerosos fenómenos que tienen lugar durante el proceso de cicatrización de heridas. Es posible que en el estroma de la variante C4-HI existan mecanismos alternativos a la activación de la quinasa PI3K, que permitan eludir o sobreponerse rápidamente a la inactivación de la misma. Es interesante mencionar que en el estroma de los tumores C4-HI tratados con la terapia combinada MFP+WORT es posible observar fibroblastos positivos para la proteína S6 fosforilada. La presencia de estos fibroblastos, a pesar de un entorno de inactivación de la vía PI3K/Akt, podría ser indicativa de mecanismos de activación de S6 independientes de la actividad de PI3K/Akt. En línea con esto, existen numerosas publicaciones que han descripto mecanismos de activación de la secuencia de la vía mTORC1/S6 de manera independiente de PI3K/Akt (Hornberger et al., 2004), (Salmond et al., 2009), (Goodman et al., 2010), (Jegg et al., 2012). Por otro lado, por trabajos previos del laboratorio sabemos que el estroma C4-HI, no así el estroma C4-HD, presenta altos niveles de FGF2 (Giulianelli et al., 2008), (Giulianelli et al., 2011), por lo que sería interesante analizar si este factor está regulado luego del tratamiento con MFP y WORT en los tumores C4-HI y esto podría explicar la fuerte reacción estromal en esas condiciones experimentales.

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A pesar de presentar características diferenciales, podemos postular que tanto en la variante C4-HD como en la variante C4-HI, la reacción estromal refleja la efectividad de la terapia utilizada. En línea con esto, en un estudio en donde se evaluaron biopsias de metástasis hepáticas colorrectales sometidas a un tratamiento quimioterapéutico neoadyuvante, se reportó que el grado de fibrosis que presentaban las muestras podía utilizarse como un indicativo de la eficacia del tratamiento antitumoral (Rubbia-Brandt et al., 2007).

Entonces, como demuestran los experimentos realizados en las variantes C4-HD y C4-HI, en la respuesta diferencial a una terapia antitumoral pueden estar involucrados tanto el parénquima como el estroma tumoral. Es probable que características intrínsecas del estroma asociado a ambas variantes, así como también de la interacción que establezca éste con el parénquima, determinen el comportamiento del estroma frente a la injuria del epitelio tumoral.

Las variantes tumorales C4-HD y C4-HI manifiestan una profunda reacción estromal, acompañada por un proceso de neovascularización. Ambos fenómenos son indicativos de la eficacia del tratamiento antitumoral. Sin embargo, sólo la variante tumoral C4-HI, que presenta la vía PI3K/Akt fuertemente activada, sería beneficiada con una terapia con inhibidores de la vía PI3K/Akt.

REGRESIÓN TUMORAL EN LA VARIANTE C4-2-HI

En el modelo de carcinomas mamarios murinos inducidos por MPA, la adquisición de resistencia a antiprogestágenos no se encuentra asociada necesariamente a una sobreactivación de la vía PI3K/Akt. Los tumores C4-HIR, por ejemplo, presentan en comparación a los tumores C4-HI, menor nivel de PI3K/Akt. Sin embargo, en la variante tumoral C4-2-HI, e incluso en los tumores C4-HI que presentan menor sensibilidad a la MFP (tumores C4-HIr obtenidos durante el transcurso de esta Tesis) el nivel de actividad de PI3K/Akt es alto, similar a los tumores C4-HI. En estos tumores donde el nivel de actividad de PI3K/Akt es alto, la inhibición de la vía PI3K/Akt con WORT disminuyó significativamente el crecimiento tumoral.

Hemos demostrado en los tumores C4-HIr que la inhibición de la vía PI3K/Akt con WORT, disminuyó significativamente la proliferación celular y aumentó la apoptosis y la necrosis del parénquima tumoral. En los tumores C4-2-HI la administración de WORT inhibió la proliferación celular, y la expresión de las proteínas ciclina D1 y c-Myc. En el caso de c-Myc pudimos determinar además, que el tratamiento con WORT modificó la localizacion subcelular de c-Myc, tal como habíamos detectado en los tumores C4-HI. Con respecto a la supervivencia, el tratamiento

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con WORT también indujo la apoptosis del parénquima tumoral, fenómeno que estuvo acompañado por una mayor expresión de la proteína proapoptótica Bax, y una disminución en la proteína antiapoptótica Bcl-Xl. Estos resultados sugieren que pese a haber perdido la sensibilidad al tratamiento endocrino, en los tumores menos sensibles o incluso en los resistentes al antiprogestágeno, los mecanismos de respuesta a la inhibición de la vía PI3K/Akt se conservan.

En estudios in vitro con células epiteliales aisladas obtuvimos resultados similares, comprobando que la pérdida de sensibilidad al tratamiento con MFP, o incluso el fenómeno de resistencia a dicho tratamiento, puede suscribirse a las células tumorales.

A lo largo de esta Tesis se ha mencionado en numerosas ocasiones la asociación existente entre la vía PI3K/AKT y el fenómeno de resistencia endocrina. En modelos de cáncer de endometrio por ejemplo, se ha descripto que la administración del inhibidor de PI3K LY294002 es capaz de revertir la resistencia al tratamiento con antiprogestágenos (Gu et al., 2011). La administración de MFP y WORT a tumores con escasa o nula sensibilidad a antiprogestágenos, nos permitió analizar si la inhibición de PI3K modificaba de alguna manera la respuesta al tratamiento hormonal. Luego de tratar a tumores C4-HIr y C4-2-HI con la terapia combinada MFP+WORT por 6 días, obtuvimos resultados similares al tratamiento con WORT sólo. Por lo tanto, en un contexto de inhibición de la vía PI3K/Akt, la sensibilidad al antiprogestágeno no fue modificada.

Finalmente, al analizar la histología de los tumores C4-2-HI sometidos al tratamiento con WORT, ya sea solo en combinación con MFP, comprobamos que la inhibición del crecimiento tumoral no se vio acompañada por cambios en la arquitectura tisular de los mismos. A diferencia del resto de los tumores analizados, la variante C4-2-HI es indiferenciada y presenta un escaso componente estromal. En respuesta a la terapia, este compartimiento no se vio modificado. Al analizar la abundancia de vasos sanguíneos mediante una inmunofluorescencia para el marcador CD31, comprobamos que en respuesta al tratamiento con MFP, la irrigación intratumoral C4-2-HI aumenta. Tal como observamos en la variante C4-HD, la administración conjunta de WORT evidenció un efecto antiangiogénico, disminuyendo significativamente el aumento registrado en el número de focos positivos para CD31 luego de la administración de MFP.

Sabemos en base a evidencia previa del laboratorio, que luego de una semana de tratamiento con el quimioterápico paclitaxel (en dosis mayores a 30 mg/kg), los tumores C4-2-HI comienzan a regresionar (Sequeira et al., manuscrito en revisión) y en estas condiciones es posible evidenciar en los tumores una mayor proporción de estroma. Estos resultados sugieren que al igual que lo que ocurre en las variantes C4-HD y C4-HI, el fenómeno de reacción estromal se encuentra asociado a la regresión de los tumores C4-2-HI. Por lo tanto, es posible que la

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ausencia de reacción estromal en los tumores C4-2-HI tratados WORT responda al hecho de que en estos tumores inhibición de la vía PI3K/Akt detiene el crecimiento de los tumores pero no induce una clara regresión tumoral. Experimentos en curso con inhibidores más potentes de la vía de PI3K/Akt, nos permitirán determinar si es posible inducir la regresión tumoral y por ende, la respuesta de reacción estromal en la variante C4-2-HI.

Por lo tanto, hemos demostrado que la inhibición de la vía de PI3K/Akt sería beneficiosa como herramienta para el tratamiento de variantes tumorales que presentan una menor sensibilidad al tratamiento endocrino con MFP (tumores C4-HIr), o que directamente no responden a dicho tratamiento (tumores C4-2-HI). Sin embargo en estos tumores la pérdida de sensibilidad al antiprogestágeno no se modifica con un inhibidor de la vía PI3K/Akt, por lo que no se obtienen mejores resultados utilizando una terapia combinada MFP+WORT. Experimentos en curso con modelos de xenotransplante de células T47D resistentes a tamoxifeno (T47D-TR-tr) y células T47D resistentes a la MFP (T47D-MR), nos permitirán extrapolar los resultados obtenidos en el modelo murino, a otro modelo experimental de resistencia endócrina. En el modelo T47D evaluaremos además, el efecto de combinar inhibidores de PI3K con TAM. De esta manera, trataremos de extrapolar lo observado con el antiprogestágeno MFP a otra terapia endócrina.

CONCLUSIONES FINALES

Implicancia de los resultados obtenidos

Como hemos mencionado en la Introducción, con el objetivo de incrementar la respuesta

en pacientes con cáncer de mama ER y PR positivo, en los últimos años se han ensayado esquemas de combinación de agentes endocrinos con inhibidores de vías de señalización intracelular como la vía PI3K/Akt. También hemos citado numerosas evidencias que señalan al PR como un target posible para la terapia endocrina. En base a estos antecedentes nuestro trabajo de Tesis resulta valioso ya que constituye el primer estudio realizado en un modelo experimental de cáncer de mama en donde se analiza el efecto de una terapia combinada con un antiprogestágeno como la MFP y un inhibidor de PI3K como el WORT.

A lo largo de esta Tesis presentamos resultados in vitro e in vivo, que avalan la utilización de la MFP como terapia endocrina, y demostramos por primera vez el beneficio potencial de una terapia combinada con inhibidores de la vía PI3K/Akt en cáncer de mama. Los resultados más

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relevantes en el estudio de los mecanismos tempranos de regresión tumoral en las variantes pertenecientes al modelo de carcinomas mamarios murinos inducidos con MPA se encuentran detallados a continuación: 1) Abundancia del estroma como indicador del grado de respuesta al tratamiento antitumoral en cáncer de mama: Hemos demostrado que a pesar de presentar distinta sensibilidad a los agentes antitumorales utilizados, en los tumores C4-HD y C4-HI la abundancia del estroma tumoral luego de la terapia refleja la efectividad de la misma.

2) Determinación del nivel de actividad de la vía PI3K/Akt para definir la terapia con inhibidores de PI3K: Hemos demostrado que el nivel de actividad de la vía PI3K/Akt puede relacionarse con el beneficio o perjuicio que produce un inhibidor de dicha vía.

3) Rol de la vía PI3K/Akt en el estroma tumoral durante el fenómeno de regresión inducido por el tratamiento con MFP: Hemos demostrado que la inhibición de la vía PI3K/Akt no afecta el efecto directo de la MFP sobre las células epiteliales tumorales, pero sí modifica la participación del estroma regulando el crecimiento tumoral a través de la formación de microvasculatura, del aporte de células del sistema inmune, y de factores parácrinos que actúan, en definitiva, sobre el compartimento epitelial.

4) Eficacia del sistema de cultivo tridimensional en Matrigel para modelar la respuesta a diversos agentes antitumorales: Hemos demostrado utilizando 4 variantes tumorales distintas, que la respuesta que presentan los tumores a las distintas terapias in vivo, puede ser reproducida utilizando un sistema de cultivo que preserve la estructura tridimensional que poseen las células del tejido que dio origen a la neoplasia. Perspectivas a futuro

El desafío será determinar en forma anticipada qué pacientes se podrían beneficiar con una terapia combinada entre agentes endócrinos e inhibidores de la vía de PI3K y qué pacientes no. Nuestro proyecto a futuro será realizar un análisis histopatológico exhaustivo, donde analizaremos el nivel de actividad de la vía PI3K/Akt en biopsias previas y posteriores a la terapia adyuvante, y haremos un seguimiento de las pacientes luego de la terapia, para poder hacer un estudio poblacional sobre el beneficio o no de incorporar la terapia con inhibidores de la vía PI3K/Akt en cáncer de mama.

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APÉNDICE

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CULTIVO CELULAR: MEDIOS Y SOLUCIONES

MEDIO DE CULTIVO Se preparó según las instrucciones del fabricante con agua bidestilada y se esterilizó por filtración. DMEM/F12 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium: Ham’s F12, 1:1) (Sigma Aldrich) sin rojo fenol…………

15,6 g/l

Bicarbonato de sodio (Sigma Aldrich)........................... 1,2 g/l Sulfato de gentamicina (Calbiochem) ………………… 50 mg/l

SUERO FETAL BOVINO (SFB) DECOMPLEMENTADO SFB (Gibco) calentado en baño térmico a 56°C durante treinta minutos.

MEDIO DE LAVADO El medio con el que se realizaron las decantaciones para separar las células tumorales epiteliales de los fibroblastos se preparó en base a la siguiente proporción: 98% DMEM/F12 2% SFB decomplementado

SFB CHARCOLIZADO Se incubó el SFB decomplementado con carbón activado (5%; Mallinckrodt) durante 1 hora a 4°C con agitación permanente. Luego de la adsorción, el suero se centrifugó dos veces a 12000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se volvió a incubar con 5% de carbón activado pero esta vez durante toda la noche y, finalmente, el suero se centrifugó 6 o 7 veces hasta eliminar completamente el carbón y se esterilizó por filtración.

MEDIO DE CULTIVO PARA CÉLULAS EPITELIALES Y CAFs El medio de cultivo en el que se crecieron las células epiteliales se preparó en base a la siguiente proporción: 90% DMEM/F12 10% SFB decomplementado

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SOLUCIÓN ENZIMÁTICA La solución utilizada para disgregar enzimáticamente los tumores, en el procedimiento de cultivo primario se preparó disolviendo en PBS 1X, los siguientes componentes: Tripsina (Gibco, 1:250)……………………………….. 0,25% p/v Colagenasa Tipo II (Gibco)....................................... 0,25% p/v Albúmina sérica bovina (Sigma Aldrich).…………… 0,5% p/v

MATRIGEL Para los ensayos de cultivo tridimensional se utilizó Matrigel reducido en factores de crecimiento y libre de rojo fenol (BD Biosciences).

INMUNOHISTOQUIMICA/INMUNOFLUORESCENCIA PBS 10X El buffer utilizado en el protocolo de inmunohistoquímica (para la solución de trabajo se diluyó 1:10) se preparó de la siguiente manera, utilizando agua bidestilada: Na2HPO4.12H2O (Anedra)......................................... 30,06 g/l NaH2PO4.H2O (Anedra)………………………………… 2,56 g/l NaCl (Gibco)………………………..…………………. 87,6 g/l

SOLUCIÓN PARA FIJAR TUMORES PARA IHQ La solución se preparó en el momento disolviendo Formaldehido (Merck) al 10% en PBS 1X.

SOLUCIÓN PARA FIJAR LOS CORTES TUMORALES Y LOS CULTIVOS TRIDIMENSIONALES PARA IF La solución se preparó en el momento disolviendo Parafolmaldehido PFA (Sigma Aldrich) y Sacarosa (Sigma Aldrich) al 4% en PBS 1X.

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IODURO DE PROPIDIO (SOLUCIÓN MADRE) El colorante utilizado para teñir los núcleos celulares durante el procedimiento de inmunofluorescencia se realizó diluyendo 1 mg de IP (Sigma Aldrich) en 1 ml de agua destilada.

SOLUCIÓN DE BLOQUEO La solución utilizada durante el bloqueo de las inmunofluorescencias o las inmunohistoquímicas se preparó realizando una solución de SFB al 10% en PBS 1X.

WESTERN BLOT EXTRACTOS PROTEICOS El buffer de extracción de proteínas utilizado para realizar los extractos proteicos tumorales fue el Buffer RIPA: NP-40……………………………………………………. 1 % EDTA (Sigma Aldrich)…………………………………… 1 mM SDS (Sigma Aldrich) …………………………………. 0,1% Tris-HCl ph 7.4 ………………………………………….. 50 mM NaCl ……………………………………………………. 150 mM Deoxicolato de Sodio …………………………………... 0,5%

INHIBIDORES DE PROTEASAS Los inhibidores de proteasas utilizados en la preparación de los extractos proteicos totales tumorales fueron: PMSF (Sigma Aldrich. …………………………………… 0.5 mM ZPCK (Sigma Aldrich)……………………………………. TLC (Sigma Aldrich)..…………………………………….. TPCK (Sigma Adrich) ………………………………….... TAME (Sigma Aldrich)……………………………………

0,025 mM 0,025 mM 0,025 mM 0,025 mM

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MÉTODO DE LOWRY Curva standard de albúmina (Sigma Aldrich) con valores en un rango desde 0-80 g (por duplicado). Sc1: CuSO4 1%, tartrato de Na2K 1% en buffer Na2CO3 2% NaOH 0,1N

Se diluyen 3 l de cada muestra en 100 l de agua destilada (por duplicado), y se le agregan 0,9

ml de Sc1. Se agitan las muestras en un vortex y luego de 10 min se agregan 100 l del reactivo de Folin (Folin-Ciocalteu) diluido 1:2. Se esperan 30 minutos y se mide la absorbancia a 750 nm en un lector de ELISA.

A partir de la curva de calibración obtenida se averigua la concentración proteica de las muestras incógnitas.

TBS 10X Para la técnica de western blot se prepara disolviendo las sales en 1L de agua destilada (Llevar a pH 7,2 con HCl). NaCl………………………………………………………. 87,66 g Tris………………………………………………………... 24,22 g

TBST 0,1% Para prepar TBST 0,1% se disuelve 1 ml de Tween 20, en 1L de TBS 1X.

ACRILAMIDA 30% Se filtra y se conserva a 4º C protegida de la luz.

Acrilamida (Gibco)………………………………………. 29 g Bisacrilamida (Gibco)……………………………………. 1 g Agua destilada c.s.p…………………………………….. 100 ml

Tris-HCl 1,5 M pH 8,8. (Llevar a pH con HCl) Tris…………………………………………………………. 90,85 g

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Agua destilada c.s.p…………………………………….. 500 ml Tris-HCl 1,0 M pH 6,8. (Llevar a pH con HCl) Tris……………………………………………………… 60,57 g Agua destilada c.s.p…………………………………... 500 ml SDS 10% SDS (Gibco)…………………………………………… 10 g Agua destilada c.s.p………………………………….. 100ml

PERSULFATO 10% (APS) APS (Gibco)…………………………………………… 1 g Agua destilada c.s.p………………………………….. 10 ml BUFFER DE SIEMBRA (LOADING BUFFER) 4X El buffer utilizado para craquear y sembrar las muestras en el gel se preparó de la siguiente manera: SDS……………………………………………………. 6 %

-mercaptoetanol……………………………………... 15 % V/V

Glicerol………………………………………………… 60 % Tris 0,18 M pH 6,8 …………………………………… 0,18 M Azul de Bromofenol …………………………………. 0,006 % p/v

MARCADORES DE PESO MOLECULAR Rainbow prestained molecular weight markers (Amersham).

BUFFER DE CORRIDA 10X

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Para transferir la corrida electroforética se utilizó una dilución 1:10 en agua destilada de la siguiente preparación: Tris……………………………………………………. 30 g/l Glicina…………………………………………………. 144 g/l SDS……………………………………………………… 10 g/l

BUFFER DE TRANSFERENCIA Para transferir las proteínas a las membranas de nitrocelulosa se utilizó la siguiente preparación, en 1L de agua destilada: Buffer de corrida 10X ………………………………… 100 ml Metanol………………………………………………. 200 ml

MEMBRANA DE NITROCELULOSA Hybond C (0,45 m; Amersham).

SOLUCIÓN DE BLOQUEO Para bloquear las membranas de nitrocelulosa se utilizó, según lo indicaran los distintos anticuerpos utilizados: Leche descremada en polvo al 5% en PBS 1X/tween 0.1% BSA (Sigma Aldrich) al 5% en TBS 1X/tween 0,1%

SOLUCIÓN DE REVELADO Se mezclan las soluciones A y B y se coloca la resultante sobre la/s membrana/s de nitrocelulosa durante 2 min aproximadamente antes de exponer las películas fotográficas.

A) 4,6 ml agua destilada + 333l Tris pH 8.8 + 50 l luminol (Sigma) + 22l ácido cumárico (Sigma Aldrich).

B) 4,6 ml agua destilada + 333l Tris pH 8.8 + 3.2 l H2O2 (Merck).

Luminol: 22 mg de luminol en 500 l de DMSO

166

Cumárico: 7,5 mg de ácido cumárico en 500 l de DMSO.

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