Características Diferenciales de Identificación

Mlgo. Eric Rodriguez

Es posible efectuar una identificación preliminar de Enterobacteriaceae sobre la base de las características de las colonias y reacciones químicas en medios de aislamiento primario.

Para una mayor identificación de especie requiere la determinación de otras características fenotípicas que reflejan el código genético e identidad única del microorganismo en estudio.

Las pruebas más ampliamente usadas para evaluar aquellas características metabólicas por las que identifican a las Enterobacteriaceae, excepto unas pocas especies raras o atípicas.

ONPG (ortonitrofenilgalactosidasa)Producción de IndolRojo de MetiloPrueba de VP (p. de acetilmetilcarbinol)

Utilización de CitratoProducción de UreasaDescarboxilación de lisina, ornitina y arginina

Producción de Fenilalanina deaminasa

Producción H2SMotilidad

Producción de IndolEl indol es un compuesto que se genera

mediante la desaminación reductiva del triptófano.

Esta reacción es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen la enzima triptofanasas, produciendo Indol, ácido pirúvico y amoniaco (NH3)

El indol puede detectarse en un medio de prueba con triptófano, observando la aparición del color rojo al adicionar el reactivo de Ehrlich o Kovac que contiene p-dimetilaminobenzaldehido

Siendo el reactivo más sensible el de Ehrlich y preferible cuando se evalúa bacilos no fermentadores o anaerobios

Medios con TriptófanoCaldo con triptófanoAgar sulfuro indol

motilidad (SIM)Agar ornitina indol

motilidad (MIO)

P-dimetilaminobenzaldehido

Caldo con Triptófano

Reacción Indol positivo

SIM

SH2+ Ind+ Mot+

SH2+ Ind- Mot-

SH2- Ind+ Mot+

SH2- Ind- Mot-

Determinar habilidad de las bacterias para producir ácidos estables por fermentación de la glucosa.

ROJO DE METILO

FUNDAMENTO Una de las pruebas bioquimicas que se

utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa.

Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: primero la metabolizarán aeróbicamente (respiración oxidativa) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia (fermentación).

Esta diferencia en el metabolismo bacteriano podría ser reconocida por la adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos,

y por la adición de Alfa-Naftol e Hidróxido de Potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros.

Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.

El rojo de metilo es un indicador de pH. Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato.

Una reacción positiva indica que el microorganismo realiza una fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta.

MEDIOS DE CULTIVOEl Medio es el Caldo RMVP o Caldo de

Clark y Lubs.Disuelva los ingredientes en agua destilada

y esterilice en autoclave por 15 minutos a 121°C a 15 libras de presión.

Solución indicadora de Rojo de Metilo: Se prepara disolviendo 0.1 gr de este indicador en 300 ml de Etanol al 95% y diluyendo luego con agua hasta 500 ml.

Inocule con el asa de platino transfiriendo una porción de cultivo puro. Incube a 37°C por 24 a 48 hrs.

Incubar a 35°C durante 48 horas. Finalizado el tiempo de incubación transfiera

5ml de cultivo a un tuboAgregar 5 gotas del reactivo de rojo de metilo a

uno de los tubos y al otro añadir los Reactivos A y B (0,6ml del KOH y 0,2ml del Alfa-Naftol).

INTERPRETACION

La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta.

Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

EJEMPLOS:

(+) Escherichia coli ( - ) Enterobacter aerógenes