CARA MEMPELAJARI SELDR. Restu Syamsul Hadi,M.Kes

Penemuan Mikroskop telah membuka cakrawala dunia tentang selRobert Hooke (1665)the 1st cytologistBagaimana mempelajari sel?

Cara mempelajari selSel dalam keadaan hidupSel dalam keadaan MatiCara mempelajari selSel dalam keadaan hidup cara : kultur sel alat/bahan : media kultur cawan kultur mikroskop inverted

Kultur sel bukan suatu teknik baruMerupakan metode untuk mempelajari perubahan fungsi sel/jaringan tanpa pengaruh sistemikMula-mula merupakan fragmen jaringan yang diletakkan di cawan kulturDimulai dengan menanam sel-sel embrionik.Kultur Sel

Sel yang dapat hidup secara in vitro dan masih mempunyai sifat-sifat mirip dengan sel intak/sel asalnyaLepas dari pengaruh sistemikSel-sel tertentu mengadakan proliferasi tetapi masih dalam keadaan tidak terdiferensiasiApa yang dinamakan kultur sel?

Penggunaan kultur sel memiliki beberapa kekurangan dan kerugian, antara lain:Memerlukan keahlian, mempunyai peneliti yang sangat menyenangi kultur sel, selalu menjaga aseptis, tertib dan sabarGambaran histologis sudah tidak nampakTidak atau sukar untuk mengedentifikasi sifat-sifat seperti pada in vivo, misalkan akibat pengaruh sistemik

Kultur sel sel yang terpisah-pisah, sel mudah dihitung, sel dapat hidup satu lapis (monolayer)sel mudah dihitung baik sebelum dikultur maupun setelah dikultur (pada penyelesaian penelitiannya)harus memakai inkubator CO2 untuk campuran udara, digunakan untuk hidupkultur primer, setelah mendapat sel yang sudah terpisah-pisah langsung ditanam di dalam cawan kulturkultur sekunder atau subkultur setelah kultur primer konfluen dilepas dari cawan dan ditanam kembali dilain cawan kultur

2. Sel dalam keadaan mati cara : teknik pewarnaan alat/bahan : sejumlah/beberapa macam zat pewarna sel mikrotom mikroskop cahaya/binokuler Bagian sel yang diamati : - permukaan sel - internal sel (organel sel dll)

Ada interaksi pewarnaan Sel :Antara basofilik dg asidofilikAntara asam dan basaPewarnaan dasar/kationik - komponen jaringan akan terwarnai basofilik

Contoh pewarnaan dasar :Pewarnanya : Hematoksilin, metylen blue,toluidin blueKomponen jaringan yang terwarnai : inti, anak inti,

II. Pewarnaan anionik/asam - komponen jaringan akan terwarnai asidofilik

Contoh pewarnaan dasar :Pewarnanya : Eosin, anailin blue,fast green, orange GKomponen jaringan yang terwarnai : sitoplasma, kolagen, Hb, keratinIII. Pewarnaan khusus: komponen jaringan akan terwarnai asidofilikContoh pewarnaan dasar :Pewarnanya : Fuelgen untuk DNA, Sudan black untuk lipid,Romanowsky : pewarnaan campuran asam dan basa untuk apus darah seperti : giemsa, wright Komponen jaringan yang terwarnai : sitoplasma, kolagen, Hb, keratin

MicroskopcahayaElectron transmission electron microscopes (TEM) scanning electron microscopes (SEM)

Macam-macam jenis mikriskop

Resolusi 0.2 m ~sampai ukuran bakteridapat digunakan untuk mempelajari sel hidupMikroskop cahaya

Microskop ElektronResolusi 2,0 nm 100 kali > kuat dari light microscopedapat melihat organelleshanya untuk mempelajari sel yang telah mati

Transmission electron microscopesTEMdigunakan terutama untuk mempelajari struktur internal seldengan sayatan yang tipisScanning electron microscopesSEMUntuk mengkaji struktur permukaan sel

Staining Cells for Microscopic ObservationFigure 2.3

Staining Cells for Microscopic ObservationFigure 2.3

Staining Cells for Microscopic ObservationFigure 2.3

Microskop Fase KontrasDitemukan oleh 1936 by Frits ZernikeDigunakan untuk melihat sel hidupan see some internal featuresGambaran sel tampak dengan background terang dan sel gelapFigure 2.5

Electron MicrographsFigure 2.10a

Electron MicrographsFigure 2.10bc

TEKNIK PEMBUATAN SEDIAAN Untuk dapat dipelajari dengan baik sel/ jaringan harus dibedakan warnanya dengan pengecatan/ cell stainingMacam staining tergantung dari : jenis sel dan analisisnyaStaining yang umum dilakukan:

H&E (hematoxylin and eosin)

- Trichrome: - PAS (periodic acid Schiff): - Silver Stains: -Pewarnaan lain

Inti sel terwarnai biru sedangkan sitoplasma, Otot, dan jaringan penyambung warna pink/merah. H&E (hematoxylin and eosin)

- Trichrome: Mewarnai jaringan otot, fibrin, kolagen dg warna berbeda

Pewarnaan Trichrome untuk membedakan jaringan fibrosa dan jaringan normal

Cocok untuk deteksi liver cirrhosis

Mewarnai polysaccharidesglomeruli pada ginjal, glycogen pada hepar- PAS (periodic acid Schiff): Pewarnaan jaringan retikuler, jamurMembran basalis- Silver Stains: - Giemsa or Wright's pewarnaan sel hematopoietic

Teknik dasar dari Cell staining1. Fixation 5. Staining 2. Dehydration and clearing.3.Infiltration and embedding.4.Sectioning and mounting

Fiksasi :Tujuannya agar sel/jaringan tidak rusak dan memiliki sifat seperti sebelumnya ketika masih dalam keadaan hidup

Contoh larutan fiksatif :(10% formalin: formaldehydedissolved in an aqueous or buffered medium) atauLarutan kompleks ( Bouin fixative: picricacid, acetic acid, formalin).

Dicuci dengan larutan etanol secara bertingkat (50, 70, 95, 100%).2. Dehydration and clearing.3.Infiltration and embedding. sediaan ditanam dalam lilin yang dicairkan4.Sectioning and mountingSediaan dipotong dengan mikrotom dengan ketebalan < 6 mikron Dilekatkan pada gelas obyek

5. Staining

Ultracentrifuge spins up to 130,000 rpm forces > 1 million X gravity (1,000,000g)

Microcentrifuge Biotechnology researchstudy cells at protein & genetic level

Micromanipulator

Stereo Microscope

Inverted dan Phase contras Microscopedilengkapi kamera dan monitor

Examples of Hooke's detailed drawings can be seen in the illustration of cork & flea above. It was in his description of cork that he first used the term "cell" even though he did not kno how important his discovery would become. The cell wasn't really understood until 1839 when scientists began to discover its importance.As it turned out, the flea, Ceratophyllus faciatus in this illustration was the carrier of the Bubonic Plague that was sweeping through Europe at time. However, this was not known by Hooke.Bubonic plague was a bacterial disease carried by fleas of infected Old English rats. At its worst, it killed two million people a year. Those that caught the disease had a 90% chance of dieing from it.Microscopes provide windows to the world of the cell

While a light microscope can resolve individual cells, it cannot resolve much of the internal anatomy, especially the organelles.

To resolve smaller structures we use an electron microscope (EM), which focuses a beam of electrons through the specimen or onto its surface.to enhance contrast, the thin sections are stained with heavy metals

Ultracentrifuge: really fast, but really big. 1 foot thick lead wallsWhy? And why dont we have one?Because every now and then one of these things disintegrates while its spinning.When they blow, they really blow!!A real lot of energy in something spinning 100,000 rpm & the rotor is made of titaniumTitanium shrapnel!