Canlı Legionella pneumophila Tespiti ve MLST için Gerçek...

T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu

Canlı Legionella pneumophila Tespiti ve MLST için Gerçek Zamanlı PCR ve HRM Analizi Tabanlı Yöntemlerin

Geliştirilmesi

Selin Nar Ötgün, Meral Turan, Mustafa Kolukırık, Esra Arslan Ganiler, Nuriye Ünal,Betül Gümüşlüoğlu, Canan Ketre, Selçuk Kılıç

Türkiye Halk Sağlığı Kurumu, Ulusal Solunum Yolu Patojenleri Referans Laboratuvarı, AnkaraBioeksen Ar-Ge Teknolojileri Ltd Şti, İstanbul Teknik Üniversitesi Arı Teknokent, İstanbul

137. TMC Kongresi 16-20 Kasım 2016, Antalya

http://en.wikipedia.org/wiki/File:BellevueStratford.jpg

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Gorman_and_Feeley.jpg


LEJYONER HASTALIĞI

1) Legionella bakterileri doğada yaygın2) İnsan yapımı su sistemlerine geçer3) Kaynaktan aerosol inhalasyonu veya

aspirasyon ile yayılır4) Toplum / hastane kaynaklı LH

Epidemiyoloji

Legionella bakterilerinin oluşturduğu akut enfeksiyon


Klinik1) Duyarlı bireylerde pnömoni2) Yüksek ateş, bradikardi3) Beta laktam ab’e yanıtsızlık4) Vaka ölüm oranı %10, hastane kaynaklı

vakalarda ise %30-40


LEJYONER HASTALIĞI

1) Ülkemizde “Lejyoner Hastalığı Kontrol Programı”2) Yönetmelik ve Rehber (2015)3) Bildirimi zorunlu hastalık4) Sağlık Bakanlığı ELDSNet işbirliği

Korunma ve kontrol

3

Legionella bakterileri, çevresel kaynaktan yayılarak salgın yapma potansiyeli nedeniyle önemli bir HALK SAĞLIĞI sorunu


Tanı Klinik örneklerin tanısı1) Üriner antijen 2) Kültür3) PCR4) Seroloji

Çevresel örneklerin tanısı1) Kültür2) PCR


Amaç1) Legionella tespiti için kantitatif gerçek zamanlı

PCR (qPCR) ile

2) Çoklu bölge DNA tiplendirmesi için yüksek çözünürlükte erime (HRM) analizi tabanlı yöntemlerin geliştirilmesi

Suda Legionella spp, Legionella pneumophila,Legionella pneumophila SG1’in qPCR ile tespiti

Legionella pneumophila’daki moleküler epidemiyolojikfarklılıkların tespiti

Halk sağlığının korunması, olası salgınların öngörülmesi

Kullanım alanı



GEREÇ VE YÖNTEM-1

Legionella pneumophila SG 1Legionella pneumophila SG 3Legionella pneumophila SG 6Legionella micdadeiLegionella bozemanii

Legionella türleriHedef dışı mikroorganizmalar

A.hydrophila, B.subtilis, C.jejuni, E.faecalis, E.coli, Klebsiella sp, L.monocytogenes, S.enterica, S.aureus, V.vulnificus, Y.enterocolitica

Duyarlılık Özgüllük



GEREÇ VE YÖNTEM-2

DNA’ların konsantrasyon ve saflık ölçümleri*

1. İkisinin ortalamasının alınması2. Genom kopya sayısı belirlenen

stoklardan dilüsyonların hazırlanması(105 – 101 genomik DNA/µl)

Genomik DNA kopya sayılarının belirlenmesi

16S rRNA hedefli qPCR**


*Green MR, Sambrook J, 2012. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory,**Stoddard SF, Smith BJ, Hein R, Roller BRK, Schmidt TM, 2015; 43:D593–D598.


Legionella spp

ssr A

Legionella pneumophila

mip

Legionellapneumophila

serogrup 1

wzm

7

GEREÇ VE YÖNTEM-3: qPCR


Collins et al . Real time PCR to supplement gold standard culture based detection of Legionella in environmental samples.Journal of Applied Microbiology 2015; 119: 1158-1169

Hedef

Gen

DNA Dizisi Ürün (bp)

ssrA 5’-GGCGACCTGGCTTC -3’ 101

5’-GGTCATCGTTTGCATTTATATTTA -3’

FAM-5’-ACGTGGGTTGCAA -3’-BHQ-1

mip 5’-TTGTCTTATAGCATTGGTGCCG -3’ 115

5’-CCAATTGAGCGCCACTCATAG -3’

FAM-5’-CGGAAGCAATGGCTAAAGGCATGCA-3’-BHQ-1

wzm 5’-TGCCTCTGGCTTTGCAGTTA -3’ 70

5’-CACACAGGCACAGCAGAAACA -3’

FAM-5’-TTTATTACTCCACTCCAGCGAT -3’-BHQ-1

Reaksiyon karışımı• 6 mg/ml BSA, • 11 mg/ml betaine,• 20 mg/ml PEG 400, • %0.2 Tween 20, • 20 mM Tris–HCl pH 8.0, • 50 mM KCl, • 1.5 mM MgCl2, • 0.2 mM dNTP mix, • 1U Hot-Start Taq DNA

Polymerase, • 1 μl kalıp DNA ve • her bir oligonükleotidten 0.5 μM

içeren toplam 10 µl’lik hacim

Amplifikasyon• 15 s 950C (ilk

döngüde 10 dk)• 15 s 530 C• 30 s 720 C


GEREÇ VE YÖNTEM-4: HRM-MLST

Primerlerin seçimi*

• 6 mg/ml BSA, • 11 mg/ml betaine,• 20 mg/ml PEG 400, • %0.2 Tween 20, • 20 mM Tris–HCl pH 8.0, • 50 mM KCl, • 1.5 mM MgCl2, • 0.2 mM dNTP mix, • 1U Hot-Start Taq DNA Polymerase, • 1 μl kalıp DNA• 1x Eva Green ve • her bir oligonükleotidten 0.5 μM

içeren toplam 10 µl’lik hacim

qPCR15 s 950C (ilk döngüde 10 dk), 15 s 530 C, 30 s 720 C

8

HRM ile MLST analizi**

fla A, pilE, asd, mip,momps, proA, neuA

• Erime eğrileri, 65-950C ‘de 0.10C/sn rampa hızıyla elde edildi.

• qPCR verileri CFX Manager Software 3.1’de analiz edildi.

*Mentasti M, Fry NK. 2012. Sequence-Based Typing protocol for epidemiological typing of Legionella pneumophila, Version 5. ESCMID Study Group for Legionella Infections

** Reja V, Kwok A, Stone G, Yang L, Missel A, Menzel C, Bassam B. ScreenClust: Advanced statistical software for supervised and unsupervised high resolution melting (HRM) analysis. Methods 2010; 50:S10-4



BULGULAR-1


* Tüm hedefler için tespit limiti 101 genomik DNA/ μl


BULGULAR-2

10


asd_Raw Data:

Serogroup 1

Serogroup 3

Serogroup 6

asd_Normalized

Data:

Serogroup 1

Serogroup 3

Serogroup 6

mip_Raw Data:

Serogroup 1

Serogroup 3

Serogroup 6

mip_Normalized

Data:

Serogroup 1

Serogroup 3

Serogroup 6

asd_Difference

Graph:

Serogroup 1

Serogroup 3

Serogroup 6

mip_Difference

Graph:

Serogroup 1

Serogroup 3

Serogroup 6


BULGULAR-3


Şekil. Legionella pneumophila MLST profilleri benzerlik dendrogramı


BULGULAR-4

Yöntem İşlem Süresi

Canlı ölü hücre eliminasyonu: filtrelerin

DNase ile ön işlemi, guanidyum tiyosiyanat işlemi)15 dk

DNA izolasyonu: silika kolonlar ile saflaştırma 15 dk

qPCR ile L spp, Lp, Lp SG1 tarama 90 dk

qPCR (7 hedef gen) – HRM ile MLST 160 dk

37. TMC Kongresi 16-20 Kasım 2016, Antalya 12


ÖZET…

Hedefler

Avantajlar

Sonuç & Yorum

Çevresel örneklerde L spp, Lp, Lp SG’in saptanmasında qPCR ve kültür yönteminin karşılaştırılması

qPCR ve/veya kültürdeki pozitiflikler için HRM-MLST uygulanması

qPCR: Çevresel örneklerde L spp, Lp, Lp SG1’in hızlı, doğruve güvenilir bir şekilde saptanması,

HRM-MLST: Moleküler epidemiyolojik farklılıkların basit,kolay uygulanabilir ve hızlı bir yöntemle tespiti


Lejyoner Hastalığı: Erken uyarı ve yanıt sisteminiilgilendiren çok önemli bir halk sağlığı sorununda hızlamüdahale olanağı

Canlı Legionella pneumophila Tespiti ve MLST için Gerçek...

Documents

Transcript of Canlı Legionella pneumophila Tespiti ve MLST için Gerçek...