CAMELET: Salute e campi elettromagnetici -...

CAMELET: "Salute e campi elettromagnetici"

Meccanismi di interazione

M. Liberti, F. Apollonio, G. d’Inzeo, F. Maggio, P. Marracino, C. Merla, A. Paffi

Centro InterUniversitario per lo Studio dei Campi Elettromagnetici e i Sistemi Centro InterUniversitario per lo Studio dei Campi Elettromagnetici e i Sistemi BiologiciBiologici

Dip. Ingegneria Elettronica, Università di Roma“La Sapienza”Dip. Ingegneria Elettronica, Università di Roma“La Sapienza”

Convegno finale del progetto CAMELETRoma, 29-30 ottobre 2009

/42CAMELET,29-30 Ottobre 2009

Il problema scientifico

mec

can

ism

im

ecca

nis

mi

Bassa frequenza (ELF): 50 Hz

Alta frequenza (RF): ~ GHz

safety safety

guidelinesguidelines

medical medical applicationsapplications

EFFETTIBiologici

E, JE, J

E, SARE, SAR


Classificazione degli effetti a ELF

EMF-NET Effects of the Exposure to Electromagnetic Fields: From Science to Public Health and Safer Workplace (2004-2008)


Classificazione degli effetti a RF

Type of biological system Evidence for effects

(Classification based on studies published in years 2000-2007)

BLOOD BRAIN BARRIER

In vitro studies Inadequate evidence

Short-term in vivo studies Evidence suggesting lack of effects

Long-term in vivo studies Evidence suggesting lack of effects

AUDITORY SYSTEM

In vitro studies Inadequate evidence

In vivo studies Evidence suggesting lack of effects

Human studies Evidence suggesting lack of effect

BEHAVIOUR

In vivo studies: Spatial memory and place learning Limited evidence of an effect

In vivo studies: Effects on immature animals Inadequate evidence

NERVOUS SYSTEM

Human studies: EEG and Neurophysiology Limited evidence of an effect

Human studies: Cognition and Sleep Limited evidence of lack of effecst

In vivo studies Inadequate evidence

CARDIOVASCULAR SYSTEM

Human studies: Blood pressure Limited evidence of an effect

Human studies: ECG and HRV Inadequate evidence

In vivo studies Inadequate evidence

EM

F-N

ET:

Eff

ects

of t

he

Exp

osu

re

to E

lect

rom

agne

tic F

ield

s:

Fro

m S

cien

ce t

o P

ublic

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lth

and

Saf

er W

ork

pla

ce (

200

4-20

08)


Exposure of 5-HT1B to B (50 Hz ; 0÷ 2.5 mT)

receptor desensibilization

Massot et al., 1999Espinosa et al., 2006

Exposure of A2A and A3 to pulsed B (75 Hz; 0.2÷ 3.5 mT)

Varani et al., 2002,2003

modification in receptor functionality

In vitro experimental results

Exposure of chicken brain to modulated and ELF fields

Blackman, 1982-1989

increase in Calcium efflux

Azione specifica di ben definiti campi magnetici su alcuni recettori di membrana

Evidenza di ‘effetti a finestra’ in frequenza e ampiezza

frequency

ampl

itude

frequency

Specificità di alcuni effetti


Il dibattito internazionale

IPOTESI

PLAUSIBILITA’

TESTABILITA’/VALIDAZIONE SPERIMENTALE

SOGLIASpecificità del segnale applicato

kT/dumping e Rumore biologico (i.e 1/f) (REALISMO)

Def. of Plausibility

- [..] For a mechanism to be plausible it should link electric- and magnetic-field exposure by means of a biophysical mechanism to the beginning of a chain of events of the sort shown in Figure. [..]

- [..] The term “mechanism of interaction” is generally considered to include the full chain of events, although the term is sometimes used to refer only to the initial transduction step or to the initial biological signal after that first step.


La scatola nera dei meccanismi?

Campi EM Effetticome?

Sistema Biologico

mec

can

ism

im

ecca

nis

mi


Complessità biologica? (1967)

“Biologists can be divided into two classes: experimentalists who observe things that cannot be explained, and theoreticians who explain things that cannot be observed.”

A. Katchalsky, Noneq. Proc. in Bioph., 1967

Uguale per il Bioelettromagnetismo?


Complessità biologica (2000)

There is now a golden opportunity for system level analysis to be grounded in molecular-level understanding, resulting in a continuous spectrum of

knowledge.H. Kitano, Science, 2002


Complessità biologica (2003-2008)

Hunter & Borg, Nature Rev., 2003


L’approccio dell’OMS (1997)



Transduzione del campo EM

(comprensione del livello molecolare)

F. Apollonio et al., IEEE Trans MTT, 2000

Analisi al livello del sistema




Primo passo di interazione

Meccanismo di trasduzione del segnale EM, a livello atomico e

molecolare, in variazioni di un parametro fisico/biologico

e.g.: processo di ion binding

+K

−K




Catena/successione di modelli biofisici che

includono la presenza di un campo

elettromagnetico

Ad ogni livello di complessità, i modelli sono testabili sperimentalmente

e contengono sufficiente realismo per studiare

l’interazione con il campo EM


++

+

+

-+

+

+ - -

-

-

-

-

+

+

-

k12

k21

k23

k32

S + E ES E + P

k12

k21

k23

k32

S + E ES E + P

Chiabrera et al. 1984, Weaver et al. 2000

ki ⇐ campi EM

Moto e [ ] ligandi ⇐ campi EM

Binding ⇐ campi EM

I ions⇐ campi EM

Funzioni celluari ⇐ campi EM

Trasduzione del campo EM

Reazioni enzimatiche nell’ambiente extracellulare:

Binding degli ioni al loro specifico sito recettore

Prodotti extracellulari (i.e. ioni liberi)

Flussi ionici attraverso la membrana

Reazioni enzimatiche interne alla cellula


Lo ione viene considerato

come una particella

puntiforme polarizzabile di

massa M e carica Q.

Lo ione viene considerato

come una particella

puntiforme polarizzabile di

massa M e carica Q.1) Leggi della fisica classica

2) Meccanica quantistica

In passato… target biologico semplificato

Quando sono coinvolte reazionichimiche è necessario

considerare la distribuzione elettronica

del target. Modelli semplificati potrebbero

non essere adeguati


QM (Meccanica Quantistica)

• DFT methods (Density Functional Theory)• post HF methods

• HF (Hartree Fock theory)

• semiempirical methods

ab initio

Estremamente accurati ma in grado di gestire sistemi semplici

dinamica del sistema

• SD (Stochastic Dynamic)

• BD (Brownian Dynamic)

• MD (Molecular Dynamic)

MM(Meccanica Molecolare)

Meno accurati ma in grado di gestire sistemi complessi

Metodi per l’analisi di strutturemolecolari: chimica computazionale


Calcolo delle proprietà elettroniche del sistema attraverso la diagonalizzazione della matrice

Hamiltoniana associata all’ambiente perturbato(es., campo elettrico)

Metodi Ibridi (QM/MM)

Perturbed Matrix Method (PMM*)combinano accuratezza e complessità

*Aschi et al. Chem. Phys. Lett. 2002, Spezia et al., Chem. Phys. Lett. 2002, Aschi et al., J.Comp. Chem. 2004

Metodi: chimica computazionale


Sito attivo

Dove avviene la reazione

Intera Proteina

Rappresenta una perturbazione del

sito attivo

myoglobin ~ 1360 atoms

PMM MethodPMM Method

Campo EM

Rappresenta una perturbazione del sito

attivo

Metodi: chimica computazionale


** Daidone et al., JACS, 2005; Schmidt et al., PNAS, 2005.

Intensità molecolari: Intensità molecolari: 108-109 V/m

Centro di reazioneCentro di reazioneTransizioni stati

elettronici:

(<<fs, sub-fs) (<<fs, sub-fs) *

Intera proteinaIntera proteinaVariazioni lente delle

catene aminoacidi

(da 100 ps a ns) (da 100 ps a ns) *

Azione indiretta di un campo campo MWMW sul sito di reazione

attraverso un accoppiamento con i moti quasi diffusivi

della proteina

Ipotesi di accoppiamento con MW


MIOGLOBINA

Ligand binding

Lega O2 o CO

Esempi di target molecolari

reaction center

QuickTimeﾪ and aTIFF (Uncompressed) decompressor

are needed to see this picture.

SOD

Electron transfer


unbindingenergy barrier

bindingenergy barrier

dFe-CO

Fe2+ CO

Osservabile: barriere di energia libera

/42CAMELET,29-30 Ottobre 2009 *(unpaired t-student test, hyp of Gaussian distributed noise)

ΔABinding

(kJ/mol)ΔAUnbinding

(kJ/mol)

mean std.dev.

mean std.dev.

Unexposed(n=5)

42.9 0.83 73.8 0.51

Exp. 103 V/m (n=7) 43.2 1.62 73.7 0.69

Exp. 104 V/m (n=3) 42.9 0.93 73.8 0.58

Nessuna differenza significativa tra i non esposti e gli esposti (CW, 1 GHz, 103 e 104 V/m) *

Risultati CO-Mioglobina

Statistiche

Apollonio et al, 2008


Length (ns)

Free Energy (kJ/mol)

Residual dipole (Cu-O2 bond) ( 10-19 C￡ﾁ )

Residual dipole (Cu-His48 bond) ( 10-19 C￡ﾁ )

unexp # 1 30 -60.2 2.18 -2.4 unexp # 2 30 -50.1 2.33 -2.77 unexp # 3 30 -65.3 2.23 -2.6 unexp # 4 30 -73.9 2.15 -2.7 unexp # 5 20 -72.5 2.68 -1.22 10^3 # 1 30 -73.2 2.21 -2.96 10^3 # 2 30 -73.17 2.17 -2.87 10^3 # 3 43 -18.6 2.16 -2.75 10^4 # 1 30 -58.8 2.32 -2.4 10^4 # 2 30 -70.59 2.2 -2.9 10^4 # 3 20 -48.48 2.18 -2.38 10^4 # 4 20 -76.84 2.38 -1.47 10^5 # 1 30 -57.82 2.14 -1.29 10^5 # 2 36 -60.4 2.17 -2.88 10^5 # 3 26 -60.69 2.14 -2.26 10^6 # 1 30 -55.19 2.2 -2.96 10^6 # 2 30 -89 2.55 -2 10^6 # 3 24 -66.6 2.18 -1.99 10^6 # 4 27 -40.7 2.2 -1.54

E field (V/m)f=1 GHz

E field=0

Risultati sulla reazione SOD

Apollonio et al, 2009


Risultati livello molecolare

(International School of Bioelectromagnetics on Interaction Mechanisms, Erice, 2006)

Campi CW ad 1 GHz Campi CW ad 1 GHz non perturbanonon perturbano né il né il processo di binding CO-Fe binding nella processo di binding CO-Fe binding nella

mioglobina né il processo di electron transfer mioglobina né il processo di electron transfer nella SOD in una scala temporale dei nsnella SOD in una scala temporale dei ns

Suggerimenti per studi futuri:Valutare l’azione di campi EM su proteine inserite in membrana attraverso simulazioni molecolari

Apollonio et al, 2008-2009


Su cosa si sta lavorandoSu cosa si sta lavorando

~80.000 atoms

Proteine di membrana

N,N Dimetil-Dodecyl-Oxide: zwitterionic micelle

Strutture micellari

5 HT - 1B


Modelli “data-driven”: i canali proteici

CAN channelPre-field

Time (ms)16200 16400 16600 16800 17000 17200 17400 17600 17800

Ionic current (pA)

-0.5

0

Traccia di corrente sperimentale“…one cannot specify the exact behaviour of an ion

channel, but only statistical descriptors of its behaviour”

(White et al., 2000)

Stochastic Channel Model (Markov state machine)


Voltage-gated K+ channel

Modelli di canali ionici di membranaModelli di canali ionici di membrana

'T80

60Vexp125.0n �

��

�� −−=β

( )'T

110

50Vexp

50V01.0n

-

￨￦ --

--=a

( )'T

110

35Vexp

35V1.0m

-

￨￦ --

--=a 'T

18

60Vexp0.4m �

��

�� −−=β

'T20

60Vexp07.0h �

��

�� −−=α 'T

110

30Vexp

11.0h

+��

�� −−

=β

Hodgkin & Huxley, 1952Voltage-gated Na+ channel

Voltage-gated Ca2+ L-type channel

( )1

10

V5.81exp

V5.8169.15e

-

￨￦ -

-=a �

��

�� −=

86.10

Vexp29.0eb

Aradi & Holmes, 1999

Hodgkin & Huxley, 1952

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-----------

-----------

----

----

K +

Na +

Ca++

+-

External medium

Internal medium

K +

Na +

Ca++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-----------

-----------

----

----

K +

Na +

Ca++

K +

Na +

Ca++

+-

External medium

Internal medium

K +

Na +

Ca++

K +

Na +

Ca++

EX

TR

AC

EL

LU

LA

R

SPA

CE

INT

RA

CE

LL

UL

AR

SPA

CE


Osservabili a livello di canaleOsservabili a livello di canale

Spettro di densità di potenza delle tracce di corrente

cross-correlazione

Nel tempo: tracce di corrente come da registrazioni sperimentali

In frequenza:

I risultati sono direttamente testabili:

esiste una corrispondenza 1:1 con l’osservabile

sperimentale


I(t) sin(2⋅ � ⋅ 50⋅ t)**

Pellegrino et al., BEMS 2006

Voltage-gated Na+ channel

Vm=-40mV , duration=60 s, n° runs=8, CW (1mV, 50Hz)

CROSS-CORRPSD

Risultati a 50 HzRisultati a 50 Hz


Segnale EMCW, fEM=50Hz

Canale (K+)

Wilcoxon Mann-Whitney test:Wilcoxon Mann-Whitney test: 0.01<P<0.05; 0.001<P<0.01; P<0.001************

Channel type Vm (mV) Minimumion current duration

Minimumnumber of runs

EM signal amplitude ΔVEM

K+ -40 60 s 8 1 mV

Na+ -40 40 s 8 0.8 mV

Ca2+ L-type 0 10 s 4 0.7 mV

Soglia dell’effetto per i canali ioniciSoglia dell’effetto per i canali ionici

Pellegrino et al., BEMS 2006


Modello di nerone HH

Questo modello riproduce l’attività di firing di un neurone eccitabile ed è il riferimento fondamentale per la modellistica neuronale

�

Cm dV dt = - gNa V - VL( ) - gK V - VK( ) - gL V - VL( ) + I0

gNa V( ) = � g NA m3h gK V( ) = � g kn4

dm dt = m� - m( ) t m

dh dt = h� - h( ) t h

dn dt = n� - n( ) t n

Hodgkin & Huxley, J Physiol, 1952


Modelli HH stocastici

CAN channelPre-field

Time (ms)16200 16400 16600 16800 17000 17200 17400 17600 17800

Ionic current (pA)

-0.5

0

Traccia di corrente sperimentale“…one cannot specify the exact behaviour of an ion

channel, but only statistical descriptors of its behaviour”

(White et al., 2000)

Stochastic Channel Model (Markov state machine)

Introduzione del rumore dei canalinel modello HH

Apollonio et al., 2000-2002


Introduzione del campo EM

Inserimento del Campo EM nel modello

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-----------

-----------

----

----

K +

Na +

Ca++

+-

External medium

Internal medium

K +

Na +

Ca++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-----------

-----------

----

----

K +

Na +

Ca++

K +

Na +

Ca++

+-

External medium

Internal medium

K +

Na +

Ca++

K +

Na +

Ca++

EX

TR

AC

EL

LU

LA

R

SPA

CE

INT

RA

CE

LL

UL

AR

S

PAC

E

V gNa(V) gK(V) gL(V)Cm

Iin

∆ VEM

Microdosimetria:

1V/m nel tessuto

10-6 V tensione di membrana

Liberti et al. 2009


Codifica neuronale di un campo EM

SR observedSR not observedSR observedSR not observed

M. Gianni et al., Biol. Cyb., 2006

Un singolo neurone, sfruttando anche il suo rumore intrinseco, è in grado di ottimizzare la codifica di un segnale EM di bassa frequenza

ed elevata intensità (kV/m nel tessuto)

di interesse più delle applicazioni medicali che ai fini protezionistici


Nei diversi neuroni il rumore dipende dal numero di canali

pyramidal

Nodo di Ranvier

interneuron

gc

COMPARTIMENTODENDRITICO

Modellizzazione delle diverse forme neuronali

COMPARTIMENTOASSO-SOMATICO


If=2µ A/cm2 neurons in resting state,just below the bursting threshold

bursting

3% noise

resting

Giannì et al., 2005

Pyramidal neuron

Stellate neuron

Soglie di transizione tra regimi neuronali

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1 10 100 1000

pyramidal neuron

stellate neuron

EM signal amplitude (mV)

EM signal frequency (Hz)

EM

sig

nal a

mpl

itud

e (m

V)

Un segnale EM a 50 HZ ed elevata intensità (kV/m nel tessuto) può agire in modo diverso sulla soglia di transizione dei regimi neuronali in dipendenza della

loro morfologia


Topologie Feedforward •Reti sensoriali•Strati corticali

Topologie Feedforward •Reti sensoriali•Strati corticali

Connessioni sinaptiche

[T ] j = 1mM Vi ≥ -20 mV

[ ]( ) wrgrrT

dt

dr ~1 +--= ba

( )synsynsyn EVrgI -=

Sinapsi stocastiche a dinamica di recettore

Tranquilli et al., 2004

�

C +Tb

� � �

a� � � O

Connessioni tra più cellule


Esperimenti dry (simulazioni)IN

PU

T S

IGN

AL

:E

M f

ield

, 50

Hz,

50

µV

25 primary neurons

25 primary neurons

25 primary neurons

25 gruppo di25 neuroni connessi

2nd layer neurons (25)

25 neuroni secondari connessi

3nd layer neuron

1 neurone terziario con 25 secondari

∆ VEM= 50 Hz, 50 µ VIin=I0+INOISE

⇒ Gaussian process, <Iin>= 4 µ A/cm2,D ∈ [0.2÷60] µ A2/cm4

VgNa(V) gK(V) gL(V)

Cm

Iin

∆ VEM

625 neuroni primari

VgNa(V) gK(V) gL(V)

Cm

Isyn

INOISE = 0,Isyn⇐ 25 pre-synaptic neurons

coincidence neurons(25⇒ 2nd and 1⇒ 3rd layers)

Sequenza di uscita


625 ⇒ 25 ⇒ 1Campo EM : 50 Hz, 100 µ V

Noise: [0.2÷60] µ A2/cm4

Coss Power Spectrum su 200 realizzazioni

Results: Stochastic Resonance

Gianni et al. 2007


Conclusioni

• I meccanismi di interazione devono soddisfare condizioni di plausibilita e testabilità, ed identificare delle soglie.

• I meccanismi devono individuare il passo di trasduzione e tutta la catena di eventi che possa condurre all’identificazione di un effetto.

• Attraverso l’uso di appropriate tecniche (es: simulazioni atomistiche per il livello molecolare) è possibile creare un percorso quantitativo attraverso la scala biologica di complessità.

• Campi CW ad 1 GHz ad intensità inferiori di quelle molecolari non perturbano le reazioni esaminate in una scala temporale dei ns.

• Valutare l’azione di campi EM su proteine inserite in membrana attraverso simulazioni molecolari (ad intensità elevate).

• Un singolo neurone, sfruttando anche il suo rumore intrinseco, è in grado di ottimizzare la codifica di un segnale EM a 50 Hz ed elevata intensità (kV/m nel tessuto).

• Può esistere un effetto cooperativo tra cellule neuronali che abbassa la soglia dei segnali rilevabili (100 V/m nel tessuto).

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